TWI841127B - 包含有椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物的組合及其用途 - Google Patents
包含有椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物的組合及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本發明揭示一種組合，其包含有一椰棗核(
Phoenix dactyliferaseed)的水萃物，以及一胚芽乳桿菌(
Lactobacillus plantarum)的培養物。本發明亦揭示該組合可被用來延緩皮膚老化(skin aging)。
Description
本發明是有關於一種組合，其包含有一椰棗核(
Phoenix dactyliferaseed)的水萃物，以及一胚芽乳桿菌(
Lactobacillus plantarum)的培養物。本發明亦有關於該組合在延緩皮膚老化(skin aging)上的應用。
皮膚是保護人類個體的最大屏障，它具有對抗病原菌以及各種環境損害之功能。在皮膚老化(skin aging)的過程中，會合成細胞外基質(extracellular matrix, ECM)[包括膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白(elastin)、透明質酸(hyaluronic acid)等]而可發揮皮膚修復(skin repair)與皮膚再生(skin regeneration)效用的纖維母細胞之數量會逐漸變少，而可分解細胞外基質的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的表現會增加，進而產生皮膚萎縮(skin atrophy)、皮膚彈性(skin elasticity)變差、皮膚質地(skin texture)變粗糙、皮膚保水力(skin water-holding capacity)變差以及皺紋產生(wrinkle formation)等情形。
近年來，人類對於抗皮膚老化等醫學美容的需求與日俱增，特別是使用不會對皮膚產生非所欲的不利副作用之天然成分，已成為現今市場的趨勢。因此，相關研究人員嘗試從微生物或植物中來尋找安全並且具有醫學美容效用的活性組分(active components)以供廣大的市場所需。
目前已有文獻是有關於椰棗核(
Phoenix dactyliferaseed)的水萃物在皮膚美白上的應用。例如，在H.C. Huang
et al., (2020),
Antioxidants, 9(12): 1270中，H.C. Huang等人對小鼠黑色素瘤細胞處理以椰棗核的水萃物而發現到，椰棗核的水萃物能夠抑制黑色素生成(melanogenesis)。
在一先前的研究中，申請人使用胚芽乳桿菌(
Lactobacillus plantarum)的培養物來處理皮膚纖維母細胞而發現到，胚芽乳桿菌的培養物不僅會抑制膠原蛋白的表現，還會促進基質金屬蛋白酶的表現。
發明概要
經研究，申請人意外地發現，組合使用椰棗核(
Phoenix dactyliferaseed)的水萃物與胚芽乳桿菌
(Lactobacillus plantarum)的培養物可以協同地促進皮膚纖維母細胞的增生、抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的表現，以及促進膠原蛋白(collagen)的表現。
於是，在第一個方面，本發明提供一種組合，其包含有一椰棗核的水萃物，以及一胚芽乳桿菌的培養物。
在第二個方面，本發明提供一種如上所述的組合供應用於製備一用來延緩皮膚老化(skin aging)之組成物的用途。
在第三個方面，本發明提供一種用於延緩皮膚老化的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的組合。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種組合，其包含有一椰棗核(
Phoenix dactyliferaseed)的水萃物，以及一胚芽乳桿菌(
Lactobacillus plantarum)的培養物。
較佳地，該椰棗核的水萃物與該胚芽乳桿菌的培養物是呈一範圍落在1：5至1：51的重量比。在本發明的一個較佳具體例中，該椰棗核的水萃物與該胚芽乳桿菌的培養物之重量比是1:10。在本發明的另一個較佳具體例中，該椰棗核的水萃物與該胚芽乳桿菌的培養物之重量比是1:26。
依據本發明，椰棗核的水萃取可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。在此方面，可以參照，例如，H.C. Huang
et al., (2020)(同上述)以及臺灣專利申請案第110119516號。
可瞭解到的是，有關萃取方法的操作條件會進一步隨著所使用的椰棗核的處理方式以及水與椰棗核的用量比例等因素而被變動，以便達致最佳的萃取效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。
依據本發明，椰棗核的水萃取可以使用新鮮的椰棗核來進行，或者可使用預先經過一選自於由下列所構成之群組中的加工處理的椰棗核來進行：乾燥處理、研磨處理、切碎處理、粉碎處理，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，所使用的椰棗核有預先經過乾燥處理以及研磨處理。
依據本發明，椰棗核與水的重量比是介於1：2至1：10之間。在本發明的一個較佳具體例中，椰棗核與水的重量比是1：5。
依據本發明，椰棗核的水萃取是在一範圍落在25℃至35℃內的溫度下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該水萃取是在30℃下被進行。
依據本發明，該胚芽乳桿菌的培養物是藉由將胚芽乳桿菌菌株培養於一適於生長的培養基中而被獲得。適用於本發明的培養基可以是熟習此項技藝者自行配製的，或者是商業上可購得的產品，這包括，但不限於：乳桿菌MRS瓊脂(Lactobacilli MRS agar)(Difco)以及乳桿菌MRS肉湯培養基(Lactobacilli MRS broth)(Difco)。
如本文中所使用的，術語“胚芽乳桿菌”意欲涵蓋那些為熟習此項技術人士可易於獲得的胚芽乳桿菌菌株(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的胚芽乳桿菌菌株。在本發明的一個較佳具體例中，該胚芽乳桿菌菌株是胚芽乳桿菌BCRC 10069。
如本文中所使用的，術語“培養(culturing)”、“發酵(fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交換地使用。
有關培養胚芽乳桿菌的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該培養是在一範圍落在30℃至37℃內的溫度下被進行歷時12至48小時。在本發明的一個較佳具體例中，該培養是於37℃下被進行歷時24小時。
依據本發明，該胚芽乳桿菌的培養物可經固液分離處理(solid-liquid separation)而實質上不含有菌體(substantially free of cells)。
依據本發明，該固液分離處理是選自於由下列所構成的群組：離心處理(centrifugation treatment)、過濾處理(filtration treatment)、濃縮處理(concentration treatment)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該固液分離處理是依序進行的離心處理與過濾處理。
如本文中所使用的，術語“實質上不含有(substantially free of)”意指一被具體指明的組分缺少有意義的含量。較佳地，該組分的含量對於該胚芽乳桿菌的培養物的性質不具有可測量的影響(measurable effect)。更佳地，該胚芽乳桿菌的培養物完全不含有該組分。
如本文中所使用的，術語“組合(combination)”意指將兩種以上的活性成分合併使用以供共投藥(co-administering)給一個體。換言之，該等活性成分可被合併為一單一劑型(single dosage form)或者以分開的劑型(separate dosage forms)來同時地(simultaneously)投藥。另擇地，該等活性成分亦可以分開的劑型而被交替地(alternately)或依序地(sequentially)投藥，且彼此間隔一段預定時間。較佳地，該預定時間的長度可視需求來進行調整，而使得該等活性成分在一個體中的藥理效用(pharmacological effect)在時間上重疊或不重疊。在本發明的一個較佳具體例中，該椰棗核的水萃物與該胚芽乳桿菌的培養物是被同時地投予。
本發明亦提供一種如上所述的組合供應用於製備一用來延緩皮膚老化(skin aging)之組成物的用途。
如本文中所使用的，術語“皮膚老化”意欲涵蓋自然發生的內在皮膚老化(intrinsic skin aging)，以及由環境因素所引起的外在皮膚老化(extrinsic skin aging)。皮膚老化的症狀包括，但不限於：毛細血管擴張(telangiectasia)、表皮變薄、皮膚萎縮(skin atrophy)、膠原纖維(collagen fiber)與彈性纖維(elastic fiber)的減少、彈性組織變性(elastosis)、皮膚彈性(skin elasticity)變差、皮膚質地(skin texture)變粗糙、乾燥(dryness)、皺紋產生(wrinkle formation)以及色素改變(pigmentary change)[例如，雀斑(lentigines)、斑點(freckles)、色素過少(hypopigmentation)或色素過多(hyperpigmentation)]等。
依據本發明，該組成物可以是一藥妝品組成物(cosmeceutical composition)。
依據本發明，該藥妝品組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於化妝品製造技術之化妝品上可接受的佐劑(cosmetically acceptable adjuvant)。例如，該化妝品上可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、膠凝劑(gelling agent)、活性劑(active agent)、抗氧化劑(antioxidant)、遮蔽劑(screening agent)、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料(fragrances)以及氣味吸收劑(odor absorbers)。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥妝品組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、面膜(mask)、貼片(patch)、貼布(pack)、繃帶(bandage)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、分散液(dispersion)、懸浮液(suspension)、滴劑(drop)、慕斯(mousse)、油膏(salve)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、眼影(eyeshadow)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。
依據本發明，該組成物可以是一藥學組成物(pharmaceutical composition)。
依據本發明，該藥學組成物可呈一適合於非經腸道投藥(parenteral administration)、口服投藥(oral administration)或局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)。
依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道投藥的劑型[包括注射品(injection)，例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液]，且以一選自於由下列所構成的群組中的途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
依據本發明，該藥學組成物亦可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。
此外，本發明亦提供一種用於延緩皮膚老化的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的組合。
如本文中所使用的，術語“投予”以及“投藥(administration)”可被交換地使用，並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類動物，諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheep)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依據本發明，該組合的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被改善的病況之嚴重性，投藥途徑，以及要被改善的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，該組合可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被投藥。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 一般實驗材料： 1. 小鼠皮膚纖維母細胞(mouse skin fibroblast cells) L929的來源與培養：
在下面的實施例中所使用的小鼠皮膚纖維母細胞L929是購自於食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC)。
L929細胞是使用高葡萄糖之杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(DMEM/High Glucose, HyClone, SH30003.02)並在培養條件設定為37℃、5% CO
2的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，進行細胞繼代培養(subculture)。
2. 胚芽乳桿菌(
Lactobacillus plantarum)培養物的製備：
在下面實施例中所使用的胚芽乳桿菌培養物是使用購自於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心的胚芽乳桿菌BCRC 10069來進行製備。
首先，將0.1 mL的胚芽乳桿菌BCRC 10069均勻塗佈於乳桿菌MRS瓊脂(Lactobacilli MRS agar)(Difco)上，並於37℃下進行培養隔夜。接著，從該乳桿菌MRS瓊脂上刮取適量的新鮮菌體，繼而以5 mL乳桿菌MRS肉湯培養基(Lactobacilli MRS broth)(Difco)來懸浮菌體並於37℃下進行培養隔夜。然後，將所得到的菌液以2% (v/v)的接種量接種至100 mL乳桿菌MRS肉湯培養基中，並於37℃下進行培養歷時24小時，繼而在4℃下以8,000 rpm進行離心歷時10分鐘使菌體沉澱。之後，收取上澄液並將之pH值調整至7，繼而以孔徑為0.45 μm的濾膜(Sartorius)予以過濾，藉此而得到胚芽乳桿菌培養物。
3. 椰棗核水萃物(water extract of
Phoenix dactyliferaseed)的製備：
首先，從購自於沙烏地阿拉伯麥地那市的椰棗果實(Sultan Al tumoor)中取出椰棗核，繼而予以清洗並進行日曬與風乾歷時24小時，然後於80℃下進行烘乾歷時2小時。接著，使用一離心式研磨機(Centrifugal Mill)(Retsch, Type ZM1)來對所得到的乾燥椰棗核進行研磨(grinding)與過篩，以獲得平均粒徑為50網目的椰棗核粉末。接著，將2 g的椰棗核粉末添加10 mL的二次水(ddH
2O)並予以充分混合，繼而在30℃下使用一超音波處理器(ultrasonicator)(ChromTech, UC-10200BDT)並以一為45 KHz的頻率來進行超音波萃取(ultrasonic extraction)歷時30分鐘。接著，將所形成的混合物在25℃下以1600 rpm進行離心歷時5分鐘，繼而收取上澄液並以孔徑為0.45 μm的濾膜予以過濾，藉此而得到椰棗核水萃物。
一般實驗方法： 1. 蛋白質樣品的分析：
在下面的實施例中，蛋白質樣品是採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析與西方墨點分析(Western blotting)，而所使用的儀器與試劑分別如下所述：
(1) SDS-PAGE分析是使用垂直式電泳槽(Bio-Rad)來進行。
(2) 蛋白質轉印(protein transfer)是使用蛋白質轉印套組(Bio-Rad)以及聚二氟乙烯(PVDF)膜[polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane](PerkinElmer)來進行。
(3) 在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體(primary antibody)以及二次抗體(secondary antibody)分別被顯示於下面表1中。
表1. 用於進行西方墨點分析的一次抗體與二次抗體
(4) 化學發光染色(chemiluminescence staining)是使用增強化學發光(ECL)受質[enhanced chemiluminescence (ECL) substrate](Clarity Western ECL Substrate, Bio-Rad)來進行，並使用一冷光影像系統(luminescence imaging system)(ChemiDoc XRS+, Bio-Rad)來偵測訊號。
2. 統計學分析(statistical analysis)：
| 蛋白質 | 一次抗體 | 二次抗體 |
| 基質金屬蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1, MMP1) | 小鼠抗-MMP-1抗體(mouse anti-MMP-1 antibody) (sc-58377, Santa Cruz Biotechnology) | 山羊抗-小鼠IgG-辣根過氧化酶(HRP)抗體[goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) antibody](sc-2005, Santa Cruz Biotechnology) |
| 基質金屬蛋白酶3 (matrix metalloproteinase 1, MMP3) | 小鼠抗-MMP-3抗體(mouse anti-MMP-3 antibody)(sc-21732, Santa Cruz Biotechnology) | 山羊抗-小鼠IgG- HRP抗體(sc-2005 , Santa Cruz Biotechnology) |
| 第1型膠原蛋白(type I collagen) | 山羊抗-COL1A1抗體(goat anti- COL1A1 antibody)(sc-8784, Santa Cruz Biotechnology) | 驢抗-山羊IgG-HRP抗體(donkey anti-goat IgG-HRP antibody)(sc-2020, Santa Cruz Biotechnology) |
| 甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) | 小鼠抗-GAPDH抗體(mouse anti-GAPDH antibody)(sc-32233, Santa Cruz Biotechnology) | 山羊抗-小鼠IgG- HRP抗體(sc-2005, Santa Cruz Biotechnology) |
在下面的實施例中，所得到的實驗數據是以“平均值(mean)±標準偏差(standard deviation, SD)”來表示。各組實驗數據之間的差異是藉由史徒登氏t-試驗(Student’s t-test)而被評估。若所得到的分析結果是
p＜0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。
實施例 1. 椰棗核水萃 物與胚芽乳桿菌培養物的組合在促進皮膚纖維母細胞的增生 (proliferation) 上之效用評估 實驗方法：
首先，將依照“一般實驗材料”的第1項來進行繼代培養的皮膚纖維母細胞分成11組，其中包括1個空白對照組、3個培養物比較組(亦即培養物比較組1至3)、3個水萃物比較組(亦即水萃物比較組a至c)以及4個實驗組(亦即實驗組1a、2a、2b與3c)。將各組細胞分別以一為5×10
4細胞/井的數量分別培養於含有1 mL的高葡萄糖DMEM培養基[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)(HyClone)以及1%盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)(HyClone)]的96-井培養盤的各井中，並在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行培養歷時24小時。接著，依據下面表2將各組的細胞培養物分別更換以含有依照“一般實驗材料”的第2項與第3項所得到的胚芽乳桿菌培養物和/或椰棗核水萃物的培養基，繼而在37℃下培養歷時24小時。
表2. 各組所處理之胚芽乳桿菌培養物與椰棗核水萃物的濃度
| 組別 | 胚芽乳桿菌培養物(mg/mL) | 椰棗核水萃物(mg/mL) |
| 空白對照組 | - | - |
| 培養物比較組1 | 0.25 | - |
| 培養物比較組2 | 1.25 | - |
| 培養物比較組3 | 2.5 | |
| 水萃物比較組a | - | 0.0245 |
| 水萃物比較組b | - | 0.049 |
| 水萃物比較組c | - | 0.245 |
| 實驗組1a | 0.25 | 0.0245 |
| 實驗組2a | 1.25 | 0.0245 |
| 實驗組2b | 1.25 | 0.049 |
| 實驗組3c | 2.5 | 0.245 |
之後，移除各井中的液體並以0.1 M PBS清洗細胞，繼而加入適量的0.5 mg/mL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]溶液，並於37℃下進行培育歷時30分鐘。接著，移除各井中的液體，繼而加入適量的二甲亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)，然後於570 nm的波長下以分光光度計來讀取各井的吸光值(OD
570)。
各組皮膚纖維母細胞的細胞生長百分比(%)是藉由將所測得的吸光值(OD
570)代入下列公式(1)而被計算出：
公式 (1) ： A ＝ (B/C)×100其中：A＝細胞生長百分比(%)
B＝各組所測得的OD
570吸光值
C＝空白對照組所測得的OD
570吸光值
之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果：
圖1顯示各組皮膚纖維母細胞在被處理以胚芽乳桿菌培養物與椰棗核水萃物後所測得的細胞生長百分比。從圖1可見，與空白對照組相較之下，除了水萃物比較組c，各個培養物比較組與水萃物比較組的細胞生長百分比皆無呈現出明顯的差異，而各個實驗組則呈現出明顯的提升，並且顯著地高於對應的培養物比較組與水萃物比較組所具者，這表示：單獨使用椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物幾乎無法促進皮膚纖維母細胞的增生，而組合使用椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物可以協同地促進皮膚纖維母細胞的增生。
實施例 2. 椰棗核水萃 物與胚芽乳桿菌培養物的組合在減低基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase) 的表現量上之效用評估 實驗方法：
首先，將依照“一般實驗材料”的第1項來進行繼代培養的皮膚纖維母細胞分成4組，其中包括1個空白對照組、1個培養物比較組、1個水萃物比較組以及1個實驗組。將各組細胞分別以一為5×10
5細胞/井的數量分別培養於含有10 mL的高葡萄糖DMEM (添加有10%FBS以及1%盤尼西林/鏈黴素)培養基的10-公分培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行培養歷時24小時。接著，依據下面表3將各組的細胞培養物分別更換以含有依照“一般實驗材料”的第2項與第3項所得到的胚芽乳桿菌培養物和/或椰棗核水萃物的培養基，繼而在37℃下培養歷時24小時。
表3. 各組所處理之胚芽乳桿菌培養物與椰棗和水萃物的濃度
| 組別 | 胚芽乳桿菌培養物(mg/mL) | 椰棗核水萃物(mg/mL) |
| 空白對照組 | - | - |
| 培養物比較組 | 1.25 | - |
| 水萃物比較組 | - | 0.0245 |
| 實驗組 | 1.25 | 0.0245 |
之後，移除各組的培養基並以PBS清洗細胞，繼而加入500 μL RIPA溶解緩衝溶液(RIPA lysis buffer)(Sigma-Aldrich)[添加有5% 2-巰乙醇(2-mercaptoethanol, 2-Me)(Sigma-Aldrich)、5 µL/mL亮抑肽酶(leupeptin)(Amresco)、5 µL/mL抑肽酶(aprotinin)(Amresco)、0.2 mM苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)(Amresco)以及10%磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)(Sigma-Aldrich, SI-P0044)]並予以混合均勻後置於冰上進行溶解反應歷時30分鐘。將所形成的細胞溶胞產物(cell lysates)在4℃下以12000 ×g進行離心歷時30分鐘並收集上澄液以供作為蛋白質樣品。所得到的蛋白質樣品是依照“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來進行MMP1與MMP3的西方墨點分析，並且選用GAPDH作為內部對照組(internal control)。
所得到的影像是使用ImageJ軟體來進行分析，藉此蛋白質帶(protein band)能夠被半-定量地計算出所對應的蛋白質表現量，蛋白質表現量接而以其所對應的GAPDH的蛋白質表現量來予以標準化(normalized)，然後將空白對照組之經標準化的蛋白質表現量當作100%，藉此而計算出各組相對於空白對照組的蛋白質表現量百分比。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果：
表4顯示各組皮膚纖維母細胞在被處理以胚芽乳桿菌培養物與椰棗核水萃物後所測得之MMP1與MMP3的蛋白質表現量百分比。
表4. 各組的MMP1與MMP3的蛋白質表現量百分比
*：當與培養物比較組作比較，
p＜0.05。
##：當與水萃物比較組作比較，
p＜0.01。
| 組別 | 空白對照組 | 培養物比較組 | 水萃物比較組 | 實驗組 |
| MMP1 | 100±0% | 46±6% | 111±1% | 11±6% *## |
| MMP3 | 100±0% | 41±18% | 105±13% | 31±24% |
從表4可見，與空白對照組相較之下，培養物比較組的MMP1與MMP3的蛋白質表現皆有明顯地降低，水萃物比較組所具者卻皆呈現出明顯地提升。而實驗組的MMP1與MMP3的蛋白質表現不僅顯著低於空白對照組所具者，亦明顯低於培養物比較組與水萃物比較組所具者。這個實驗結果表示：單獨使用椰棗核水萃物會促進基質金屬蛋白酶的表現，但組合使用椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物可以意外地協同抑制基質金屬蛋白酶的表現。
實施例 3. 椰棗核水萃 物與胚芽乳桿菌培養物的組合在提升膠原蛋白 (collagen) 表現量上之效用評估 實驗方法：
本實驗大體上是參照實施例2當中所述方法來進行，不同之處在於：所得到的蛋白質樣品是依照“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來進行第1型膠原蛋白的西方墨點分析，並且選用GAPDH作為內部對照組。
結果：
表5顯示各組皮膚纖維母細胞在被處理以胚芽乳桿菌培養物與椰棗核水萃物後所測得之第1型膠原蛋白的蛋白質表現量百分比。
表5. 各組的第1型膠原蛋白的蛋白質表現量百分比
“*”：當與培養物比較組作比較，
p＜0.05。
“#”：當與水萃物比較組作比較，
p＜0.05。
| 組別 | 空白對照組 | 培養物比較組 | 水萃物比較組 | 實驗組 |
| 第1型膠原蛋白 | 100±0% | 163±33% | 37±12% | 350±52% *# |
從表5可見，與空白對照組相較之下，培養物比較組的第1型膠原蛋白的蛋白質表現有明顯地提升，水萃物比較組所具者卻呈現出明顯地降低。而實驗組的第1型膠原蛋白的蛋白質表現不僅顯著高於空白對照組所具者，亦明顯高於培養物比較組與水萃物比較組所具者。這個實驗結果表示：單獨使用椰棗核水萃物會抑制第1型膠原蛋白的表現，但組合使用椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物可以意外地協同促進第1型膠原蛋白的表現。
綜合以上的實驗結果可知，組合使用椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物可以有效地促進皮膚纖維母細胞的增生而有助於皮膚再生(skin regeneration)與皮膚修復(skin repair)，抑制基質金屬蛋白酶的表現來避免膠原蛋白與彈性纖維蛋白的降解，並且提升膠原蛋白的表現。因此，申請人認為：含有椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物的組合具有發產成為用於延緩皮膚老化的產品之高潛力。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：
圖1顯示實施例1中的各組所測得之皮膚纖維母細胞的細胞生長百分比；其中“*”、“**”與“***”分別表示：當與對應的培養物比較組作比較，
p＜0.05、
p＜0.01與
p＜0.001；以及“#”、“##”與“###”分別表示：當與對應的水萃物比較組作比較，
p＜0.05、
p＜0.01與
p＜0.001。
Claims (7)
- 一種組合，其包含有一椰棗核(Phoenix dactylifera seed)的水萃物，以及一胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的培養物，其中該胚芽乳桿菌是胚芽乳桿菌BCRC10069，該胚芽乳桿菌的培養物實質上不含有菌體，該椰棗核的水萃物與該胚芽乳桿菌的培養物是呈一範圍落在1：5至1：51的重量比。
- 一種如請求項1的組合供應用於製備一用來延緩皮膚老化之組成物的用途。
- 如請求項2的用途，其中該皮膚老化的延緩包括延緩皺紋產生。
- 如請求項2的用途，其中該皮膚老化的延緩包括下列的至少一者：促進皮膚纖維母細胞的增生、提升膠原蛋白的表現，以及抑制基質金屬蛋白酶的表現。
- 如請求項2的用途，其中該組成物是一藥妝品組成物。
- 如請求項2的用途，其中該組成物是一藥學組成物。
- 如請求項6的用途，其中該藥學組成物是呈一供非經腸道投藥、口服投藥或局部投藥的劑型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW111148784A TWI841127B (zh) | 2022-12-19 | 2022-12-19 | 包含有椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物的組合及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW111148784A TWI841127B (zh) | 2022-12-19 | 2022-12-19 | 包含有椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物的組合及其用途 |
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|---|---|
| TWI841127B true TWI841127B (zh) | 2024-05-01 |
| TW202426028A TW202426028A (zh) | 2024-07-01 |
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ID=92077267
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| TW111148784A TWI841127B (zh) | 2022-12-19 | 2022-12-19 | 包含有椰棗核水萃物與胚芽乳桿菌培養物的組合及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI841127B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113925822A (zh) * | 2020-07-09 | 2022-01-14 | 佐登妮丝国际股份有限公司 | 用于修护皮肤的萃取物、含此萃取物的组成物及其用途 |
-
2022
- 2022-12-19 TW TW111148784A patent/TWI841127B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113925822A (zh) * | 2020-07-09 | 2022-01-14 | 佐登妮丝国际股份有限公司 | 用于修护皮肤的萃取物、含此萃取物的组成物及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 期刊 A.Y. Tamime, R.K. Robinson (Eds.) Yoghurt: Science and Technology (2nd ed.) 1999 7-8 * |
| 期刊 Ahmed M. Abdel-Salam et al. Consolidating probiotic with dandelion, coriander and date palm seeds extracts against mercury neurotoxicity and for maintaining normal testosterone levels in male rats Toxicology Reports Volume 5 2018 1069-1077;期刊 E Bauza et al. Date palm kernel extract exhibits antiaging properties and significantly reduces skin wrinkles Int J Tissue React . 24(4) 2002 131-6; * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202426028A (zh) | 2024-07-01 |
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