CN113925822A - 用于修护皮肤的萃取物、含此萃取物的组成物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于修护皮肤的萃取物、含此萃取物的组成物及其用途。该萃取物由植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)发酵物中萃取所得，具有美白及抗老化的功效，可防止皮肤细胞的黑色素生成所导致的皮肤暗沉，并防止皮肤细胞因氧化而造成的老化现象。此外，上述萃取物可与其他具有美白或抗氧化功效的物质一起作为修护皮肤的组成物，该组成物可制成化妆品、保养品、防晒品等皮肤外用产品，以供所需用户施用。

Description

用于修护皮肤的萃取物、含此萃取物的组成物及其用途
技术领域
本发明关于一种用于修护皮肤的萃取物及含有此萃取物的组成物，其萃取物为一乳酸菌发酵物中分离所得的萃取物，具体而言，关于一种植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum，BCRC Number 10069)发酵物中分离所得的萃取物，以及包含此萃取物的皮肤修护用组成物。
背景技术
人体皮肤可保护身体免于受到各种氧化物质、重金属、紫外线(UV) 及空气污染等伤害，且能防止病毒、真菌及细菌等入侵身体，并且作为防止水分流失的保护屏障。
皮肤的结构大致分为三层，表皮、真皮和皮下脂肪，其中真皮层包含90％的皮肤，其由胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白和透明质酸所组成。胶原蛋白是皮肤的主要成分，为一种重要的纤维蛋白，约占人体蛋白质总量的 25％(以重量计)。胶原蛋白构成大部分结缔组织，并扮演如细胞间基质功能、结构支持功能、诱导细胞分裂和分化功能、提供皮肤拉伸强度功能等重要角色。已知紫外线及活性氧等会造成胶原蛋白产量降低并损害其结构，因此其与皮肤老化、黑色素沉淀造成皮肤色泽暗沉形成密切相关。
近年来，恶化的环境因素(例如过量紫外线、工厂或汽车所排废的污染气体等)导致皮肤屏障的损坏，持续地促使皮肤老化及色泽暗沉。因此，必须开发一种成本效益高的材料，此材料需可防止皮肤老化及黑色素沉淀且没有副作用，并可制成方便以各种不同形式使用的组成物。
乳酸菌通过碳水化合物或纤维的发酵来产生乳酸，且其在人体中为具有益作用的细菌。截至目前为止，已发现约400种乳酸菌，并已将约18种品种开发成商业产品。
乳酸菌进入人体肠道中，其经由自身的代谢活性分泌特定的材料，由于该等材料对人体有益，因此已经对乳酸菌进行了许多研究。乳酸菌在抗菌、抗氧化及免疫活性的效果已被报导，近年来，研究集中于乳酸菌的美白和保湿效果，且用作化妆品组成物、保养品组成物或防晒组成物的可能性大幅增加。
在乳酸菌之中，已对乳酸杆菌的效果进行了许多研究，且针对免疫力、抗菌效果、皮肤美白的增强以及皮肤炎的改善等已被报导。其中，植物来源的乳酸菌(POLAB)是由植物原料的发酵食品(例如酱菜、腌菜或泡菜等) 中分离的乳酸菌，其与乳品来源的乳酸菌有所区别。
与动物性乳酸菌相较之下，植物来源的乳酸菌不仅包含至少10倍以上的类型，且其对外部环境具有极佳的适应性。特别是从泡菜分离的植物性乳酸菌，其具有高含量的盐、低pH值和高含量的天然抗菌材料，其可在极端环境下生长，因此植物来源的乳酸菌具有多种不同生理活性材料的优异生产力。
代表性的生理活性材料包括抗菌肽、免疫刺激剂及γ-胺基丁酸 (GABA)，其表现包括消炎和免疫抑制效果等各种生理功能。此外，乳酸菌是热稳定肽，且产生作为抗菌剂的细菌素，细菌素是由各种微生物产生的天然抗微生物蛋白质或蛋白质材料，通常指称具有针对细菌菌株灭菌机制的材料，该细菌菌株在形态学和谱系学上类似于产生细菌素的微生物。因此，正在积极地开发使用含有这些材料的乳酸菌培养物萃取物或经乳酸菌发酵的植物萃取物的化妆品组成物、保养品组成物或防晒组成物的材料，且可符合近期偏爱环保和安全材料的趋势。
目前，消费者不仅期望化妆品组成物、保养品组成物或防晒组成物中的一般照护效果，还需要其各种不同功能，例如，抗老化、改良细纹、抗刺激、消炎及美白效果等。近年来，基于上述目的，已经将各种植物萃取物用于化妆品中，并对以新概念为基础的产品的期望越来越高，该新概念通过组合各种特性，显示出改良的性能特征范围。
发明内容
为符合环保的时代，本发明的发明人已经努力研究乳酸菌培养物的萃取物的化妆品、保养品或防晒品的效果，其对皮肤是安全而没有任何副作用的，并且有效地使用于预防老化及改善皮肤暗沉。
此外，还要研究其在国内工业化中发展的可能性，发明人已经证实植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum，BCRC Number 10069)发酵物的萃取物具有预防老化及改善皮肤暗沉的活性，从而完成本发明的内容。
本发明的目的是提供一种用于修护皮肤的萃取物以及含此萃取物的组成物，该萃取物由植物乳酸菌培养物中萃取而得，其中，该细菌体经移除。
本发明的另一个目的是提供一种预防皮肤老化及皮肤黯沉的方法，包括给个体施用用于修护皮肤的萃取物或含此萃取物的组成物，该萃取物由植物乳酸菌发酵物中萃取而得，其中，该细菌体经移除。
附图说明
图1为蕈菇酪胺酸酶活性试验分析图；
图2为细胞内黑色素含量试验分析图；
图3为细胞内酪胺酸酶活性试验分析图；
图4为使用西方墨点法进行蛋白质定量试验分析图；
图5为细胞存活率试验分析图；
图6为IBMX(c-AMP磷酸二酯酶抑制剂)试验分析图；
图7为SP600125(JNK抑制剂)试验分析图；
图8为PD98059(MEK1/2抑制剂)试验分析图；
图9为DPPH清除能力试验分析图；
图10为ABTS+自由基清除能力试验分析图；
图11为还原能力试验分析图；
图12为亚铁离子螯合能力试验分析图；
图13为总酚含量试验分析图；
图14为纤维母细胞存活率试验分析图；
图15为纤维母细胞经H2O2处理后的存活率试验分析图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
为达到上述目的，本发明的一态样为提供一种用于修护皮肤的萃取物以及含此萃取物的组成物，该萃取物由植物乳酸菌发酵物中萃取而得，其中，该细菌体经移除。
在本文中，术语「植物乳酸杆菌」指一种乳酸杆菌属的微生物，其为一种能够产生乳酸的革兰氏阴性细菌。该细菌可在发酵食品如酸菜、腌菜及泡菜中发现。
植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其BCRC Number为 10069，采购自食品工业发展研究所菌种中心；而为验证植物乳酸杆菌发酵物的萃取物的抗老化及美白效果，所使用的实验细胞为B16F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞(Mouse melanoma cells)，其BCRC Number为60031。
在本文中，术语「发酵物」指在含有培养基中培养微生物菌株时产生的副产物的培养基，其中，该菌株可以摄入和代谢培养基所含的营养物。术语「发酵物」包括所有使用培养基所形成的调配物(例如，培养基的稀释剂或浓缩物、通过干燥培养基获得的干燥产物、培养基的粗制品或纯化产物、其混合物等)。
具体而言，发酵物可为通过培养植物乳酸杆菌菌株所获得者，其中，该细菌体在培育后经移除。也就是说，其中细菌体经移除的经培养的培养基可以使用作为发酵物。
更具体而言，用于修护皮肤的萃取物可由下述的方法获得：(a)培养种菌；(b)制备发酵物；(c)除菌离心过滤；以及(d)除水。
在(a)及(b)步骤中，培养基可以是本领域中所使用的任何培养基，只要该培养基可以培育菌株，并在培育后回收发酵物即可，优选为液体培养基，例如MRS培养基等；而培养种菌的温度为35℃，培养箱的转速为 50～150rpm，优选为80～120rpm，培养的时间为8～16小时，优选为10～14小时；而制备发酵物的温度、培养箱的转速基本上与培养种菌相同，但发酵的时间为18～36小时，优选为20～30小时。
在步骤(c)中，使用高速离心机进行离心，旋转速率为1,300rpm至 3,600rpm，优选为2,600rpm至3,100rpm；离心15至40分钟，优选为20至35分钟；离心后所获取的上清液，使用孔径0.45μm过滤膜去除细菌体。
在步骤(d)中，使用减压浓缩机进行除水，或可使用其他用于除水的仪器皆可。
本发明的用于修护皮肤的萃取物制备方法，其具体实施方式如下：
(a)培养种菌：将植物乳酸杆菌置入50mL的MRS培养基中，于35℃、 100rpm下培养12小时；
(b)制备发酵物：取1mL步骤(a)所培养的植物乳酸杆菌的种菌，加入 100mL的MRS培养基中，于35℃、100rpm下培养24小时，获得植物乳酸杆菌发酵物；
(c)除菌离心过滤：将植物乳酸杆菌发酵物在3000rpm、30min、25℃的条件下进行离心后取其上清液，再将上清液以孔径0.45μm过滤膜去除植物乳酸杆菌的菌体，获得植物乳酸杆菌的菌体经移除的上清液；
(d)除水：将步骤(c)所获得的上清液，将其水分完全抽除，获得该萃取物。
在本文中，术语「老化」指皮肤因来自内部基因遗传及外部环境的伤害所造成的氧化现象；其中，内部基因遗传所导致的氧化现象主要是由于活性氧(ROS,reactive oxygenspecies)作为细胞代谢的副产物的积累，ROS会对膜、酶和脱氧核糖核酸(DNA)等关键细胞成分造成损害。
此外，外部环境的伤害所造成的氧化现象，例如紫外线，在过量紫外线的照射下，将导致细胞DNA改变，对皮肤造成累积性损伤；或者照射过量紫外线将造成黑色素沉淀，导致肤色黯沉，或更进一步演变为黑色素瘤 (Melanoma)。
在本发明中，含有上述修护皮肤的萃取物的组成物可为化妆品、保养品、防晒品等皮肤外用产品，该等皮肤外用产品可调配为下述形式：溶液、外用软膏、乳膏、泡沫、营养护肤霜、柔软护肤霜、敷料、软水、乳液、打底霜、香精、肥皂、液体清洁剂、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳化物、糊、凝胶、洗剂、粉末、肥皂、含界面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳化粉底、蜡状粉底、贴片及喷雾，但不以上述为限。
在本发明中，含有上述修护皮肤的萃取物的组成物可进一步含有至少一种化妆品、保养品或防晒品可接受的载剂，该载剂可为一般的常规组分，例如界面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、色素、防腐剂、香料及其组合等，但该组分不以上述为限。此外，该载剂可依据该等皮肤外用产品的形式进行适当比例的调整。
当本发明的含有上述修护皮肤的萃取物的组成物为软膏、糊、乳膏或凝胶时，作为载剂组分可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、紫云英树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧树指、皂土、二氧化硅、滑石及氧化锌等，但不以上述为限。该载剂组分可以单独或以两种或更多种组合使用。
当本发明的含有上述修护皮肤的萃取物的组成物为粉末或喷雾时，作为载剂组分可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙及聚酰胺粉末等；特别在喷雾的情况，调配物可以进一步含有推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷和二甲醚，但不以上述为限。该载剂组分可以单独或以两种或更多种的组合使用。
当本发明的含有上述修护皮肤的萃取物的组成物为溶液或乳化物时，作为载剂组分可以使用溶剂、助溶剂或乳化剂(例如，水、乙醇、丙二醇、 1,3-丁二醇及丙三醇等)，优选为棉籽油、花生油、玉米籽油、橄榄油、蓖麻油及芝麻油、甘油脂肪族酯、及聚乙二醇或去水山梨醇脂肪酸酯，但不以上述为限。该载剂组分可以单独或以两种或更多种的组合使用。
当本发明的含有上述修护皮肤的萃取物的组成物为悬浮液时，作为载剂组分可以使用液体稀释剂(例如，水、乙醇或丙二醇)、悬浮剂(例如，乙氧化异硬脂醇、山梨糖醇聚氧乙烯酯和脱水山梨糖醇聚氧乙烯酯)、微晶型纤维素、羟基氧化铝、皂土、琼脂及紫云英树胶等，但不以上述为限。该载剂组分可以单独或以两种或更多种的组合使用。
当本发明的含有上述修护皮肤的萃取物的组成物为肥皂时，作为载剂组分可以使用脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸的半酯盐、脂肪酸蛋白质水解物、羟乙基磺酸、羊毛酯衍生物、脂肪族醇、植物油、甘油及醣类等，但不以上述为限。该载剂组分可以单独或以两种或更多种的组合使用。
后文中，将参考下述实施例更详细揭示本发明内容。惟，对本发明所属技术领域者，此等实施例仅用于例示性说明的目的，且本发明不欲为此等实施例所限。
美白能力测定
实施例1：蕈菇酪胺酸酶活性分析
使用蕈菇类的酪胺酸酶(Mushroom Tyrosinase)来进行初次筛选。左旋多巴(L-dopa)作为受质，其催化酪胺酸酶与左旋多巴受质作用反应后的产物降低时，可略先判定实验的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物样品也许有抑制该催化作用的效果，具有美白功效的可能性。
当角质细胞受到阳光照射，便会活化黑色素细胞中酪胺酸酶的活性，进而启动一连串化学反应，最后产生黑色素(Melanin)。此时含有大量黑色素的黑色素体便释放到角质细胞中，使皮肤变黑。因此抑制酪胺酸酶活性被视为减少黑色素产生(美白)的关键步骤。
酪胺酸酶抑制率公式(％)＝(B-A)/B×100％
酪胺酸酶相对活性公式(％)＝A/B×100％
A：样品组于OD490的吸光值B：控制组于OD490的吸光值
其中，OD490指在波长490nm下的吸光值，可通过分光亮度计测得，其吸光值指通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。
参照图1，控制组为未加任何酪胺酸酶抑制物下经公式计算所得的抑制率，接着添加浓度1.32mg/mL、6.6mg/mL及13.2mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的抑制率，以及添加曲酸(kojic acid)、熊果素 (arbutin)后的抑制率。
由图1中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后确实有抑制效果，当浓度提高至13.2mg/mL时，抑制率可达40％；虽植物乳酸杆菌发酵物的萃取物相对于曲酸、熊果素需较高浓度才可达到较高抑制率，但使用高浓度植物乳酸杆菌发酵物的萃取物对人体皮肤产生的副作用相较曲酸、熊果素轻微许多。
实施例2：细胞内黑色素含量分析
利用氢氧化钠的强碱特性和高温下将细胞内的黑色素溶出，并测定其OD405的吸光值，以此分析各种不同条件的处理对B16F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞中黑色素含量的影响。
黑色素相对含量公式(％)＝A/B×100％
A：样品组于OD405的吸光值B：控制组于OD405的吸光值
参照图2，控制组为未加任何酪胺酸酶抑制物下经公式计算所得的黑色素含量，接着添加浓度1.32mg/mL、6.6mg/mL及13.2mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的黑色素含量，以及添加曲酸(kojic acid)、熊果素(arbutin)后的黑色素含量。
由图2中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后黑色素含量确实下降，当浓度提高至13.2mg/mL时，黑色素含量下降可达40％；虽植物乳酸杆菌发酵物的萃取物相对于曲酸、熊果素需较高浓度才可达到较高的黑色素下降量，但同前文所述，使用高浓度植物乳酸杆菌发酵物的萃取物对人体皮肤产生的副作用相较曲酸、熊果素轻微许多。
实施例3：细胞内酪胺酸酶活性分析
使用冷冻解冻(Freeze-thaw cycle)的方法，将与植物乳酸杆菌发酵物的萃取物样品反应后的B16F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞置于-80℃低温冷冻，并加入裂解溶液，使细胞内的水分形成冰霜，再将细胞取出置于室温解冻，使冰霜还原成液状。此过程会使细胞破裂，进而释放出胞内物质，欲测定的酪胺酸酶即在其中。
通过加入酪胺酸酶的催化左旋多巴受质(L-dopa)的反应，分析其产物多巴色素(dopachrome)的生成量，即可推知其酪胺酸酶的相对活性。
酪胺酸酶的相对活性公式(％)＝A/B×100％
A：样品组于OD490的吸光值B：控制组于OD490的吸光值
参照图3，控制组为未加任何酪胺酸酶抑制物下经公式计算所得的酪胺酸酶活性，接着添加浓度1.32mg/mL、6.6mg/mL及13.2mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的酪胺酸酶活性，以及添加曲酸(kojic acid)、熊果素(arbutin)后的酪胺酸酶活性。
由图3中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后酪胺酸酶活性确实下降，当浓度提高至13.2mg/mL时，酪胺酸酶活性下降可达80％；虽植物乳酸杆菌发酵物的萃取物相对于曲酸、熊果素需较高浓度才可达到较高的酪胺酸酶活性下降量，但同前文所述，使用高浓度植物乳酸杆菌发酵物的萃取物对人体皮肤产生的副作用相较曲酸、熊果素轻微许多。
实施例4：蛋白质定量试验分析
与黑色素合成相关的蛋白质，诸如第一型黑色素皮质素受体 (melanocortin1receptor,MC1R)、小眼相关转录因子(microphthalmia transcription factor,MITF)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1, TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 1,TRP-2)及酪氨酸酶 (tyrosinase)等；另一方面，p38蛋白、环磷腺苷效应组件结合蛋白 (cAMP-response elementbindingprotein,CREB)经磷酸化后，会促使小眼相关转录因子(MITF)表达而促进黑色素生成；c-Jun胺基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinase,ERK) 经磷酸化后，则会促使MITF降解而抑制黑色素生成。
蛋白质定量试验分析是将蛋白质浓度以BCA方法(bicinchoninic acid assay)将该蛋白质萃取液进行定量。以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin；BSA)制作标准曲线，并吸取25μL的BSA与含二甲基亚砜(DMSO)溶剂混合的不同浓度样品的蛋白质萃取液至微量离心管，加入200μL
Figure RE-GDA0003128068750000091
BCAProteinAssay Kit(A：B＝50：1)，均匀混合，放置于37℃反应30分钟。 30分钟后吸取70μL至96孔盘，后续针对各混合样品进行西方墨点分析法(westernblotting assay)。
在该蛋白质定量试验分析中，通过添加α-黑色素细胞刺激素 (α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)，浓度0.264mg/mL、1.32mg/mL、 6.6mg/mL、13.2mg/mL及19.8mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物，以及添加熊果素(arbutin)至该等与黑色素合成相关的蛋白质中，观察该等与黑色素合成相关的蛋白质表现量。此外，因甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)会因黑色素影响而使其表现失调，故以其讯号强度作为参考基准，与该等黑色素合成相关的蛋白质在添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后的表现量作为比较。
参照图4，图中分别展示西方墨点分析法的结果图，以及该等与黑色素合成相关蛋白质以GAPDH作为参考基准的比较图表，为使图式简洁，图中均以英文缩写表示；由图4中可看出，随着植物乳酸杆菌发酵物的萃取物的浓度提高，该等与黑色素合成相关蛋白质的表现量明显下降，且针对如酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2的效果特别显著，具体数据如表1所示，为使表格简洁，表中均以英文缩写表示。
表1：
Figure RE-GDA0003128068750000101
实施例5：细胞存活率分析
细胞存活率分析通过B16F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞内粒线体的琥珀胺酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)能MTT([3-(4,5)-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)淡黄色水溶液的四唑环切断，产生蓝紫色的甲
Figure RE-GDA0003128068750000102
(formazan)结晶而分辨细胞是否存活，由于死亡细胞的粒线体中不具有活性的脱氢酶，所以MTT的颜色仍然为黄色不会产生蓝紫色的甲
Figure RE-GDA0003128068750000103
结晶。而甲
Figure RE-GDA0003128068750000104
结晶于波长570nm时具有最大吸光值，因此可经由吸光值的测定来计算细胞的存活率。
细胞存活率公式(％)＝A/B×100％
A：样品组于OD570的吸光值B：控制组于OD570的吸光值
参照图5，控制组为未加任何植物乳酸杆菌发酵物的萃取物下经公式计算所得的细胞存活率，接着添加浓度1.32mg/mL、6.6mg/mL、13.2 mg/mL、19.8mg/mL及26.4mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的细胞存活率。
由图5中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后细胞的存活率依然没有显著变化，但当植物乳酸杆菌发酵物的萃取物的浓度提高至 19.8mg/mL时，细胞的存活率开始降低；当浓度达到26.4mg/mL时，细胞的存活率仅剩40％，由此可知，使用植物乳酸杆菌发酵物的萃取物的最高浓度范围约为13.2mg/mL，而最低有效的浓度范围约为1.32mg/mL。
实施例6：美白作用机制分析
通过分别将IBMX(c-AMP磷酸二酯酶抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)、PD98059(MEK1/2抑制剂)以及植物乳酸杆菌发酵物的萃取物与细胞混合，该等抑制剂对可促进黑色素生成；另将上述各抑制剂分别与植物乳酸杆菌发酵物的萃取物混合后再与细胞混合作为对照，观察植物乳酸杆菌发酵物的萃取物对于抑制黑色素生成的机制。
首先，以细胞密度为5×104cells/well的B16F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞混合含有100nMα-MSH的培养基种入24孔培养盘中，置入37℃、5％CO2培养箱24小时；接着换置含有不同类型的10μM抑制剂的培养基(控制组的培养基不含抑制剂)，置于培养箱反应1小时；其后换置含有不同类型的10μM 抑制剂及不同浓度的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物，置于培养箱反应23小时；接着去除培养基，以PBS清洗二次，加入100μL 1N NaOH溶液(内含10％DMSO)，于60℃反应1小时；最后取70μL至96well，使用免疫酵素分析仪 (ELISA)测定OD405吸光值。
参照图6、图7及图8，单独添加IBMX、SP600125或PD98059时的吸光值相较于控制组并未出现任何明显的变化，而单独添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后，吸光值出现明显下降，表示对黑色素生成具有抑制效果；另分别将该等抑制剂分别与植物乳酸杆菌发酵物的萃取物混合的吸光值，则再度上升，代表植物乳酸杆菌的美白机制与IBMX、SP600125或PD98059等抑制剂对于黑色素生成机制相关。
抗氧化能力测定
实施例7：DPPH自由基清除能力试验分析
脂质在自行氧化的过程中会产生自由基而造成脂质酸败，常见的抗氧化物通过提供氢(Hydrogen doner)来清除脂质过氧化物自由基(Peroxyl free radical)，进而达到抑制氧化链锁反应的进行。
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)为一种稳定的自由基，与乙醇(Methanol)溶液在517nm下有较强的吸光值，故若吸光值越低，表示抗氧化物的供氢能力愈强，抗氧化能力愈好。
DPPH自由基清除率(％)＝(1-A/B)×100％
A：样品组于OD517的吸光值B：控制组于OD517的吸光值
参照图9，空白试验为未加任何抗氧化剂，接着添加浓度0.176 mg/mL、0.88mg/mL、1.76mg/mL、4.4mg/mL及8.8mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的DPPH清除能力，以及添加维生素C(Vit C)、丁基羟基茴香醚(BHA)后的DPPH清除能力，为使图式简洁，图中维生素及丁基羟基茴香醚均以英文缩写表示。
由图9中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后，DPPH 清除能力确实上升，当浓度提高至8.8mg/mL时，DPPH清除能力可达约60％；虽植物乳酸杆菌发酵物的萃取物相对于维生素C、丁基羟基茴香醚需较高浓度才可达到较高的DPPH清除能力，但使用高浓度植物乳酸杆菌发酵物的萃取物对人体皮肤产生的副作用相较维生素C、丁基羟基茴香醚轻微许多。
实施例8：ABTS+自由基清除能力试验分析
ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid))是一种化学性自由基引发剂，同时在反应中也是显色剂。ABTS经活性氧氧化后，可生成稳定的蓝绿色阳离子ABTS+。当其加入具有抗氧化活性的物质后，可与ABTS+发生反应而使颜色变淡，因此当反应后的吸光值越低时，就表示样品清除ABTS+自由基的能力越强。
ABTS+自由基清除率(％)＝(1-A-B)×100％
A：样品组于OD410的吸光值B：控制组于OD410的吸光值
参照图10，空白试验为未加任何抗氧化剂，接着添加浓度0.211 mg/mL、1.056mg/mL、5.28mg/mL、10.56mg/mL及15.84mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的DPPH清除能力，以及添加维生素C(Vit C)、丁基羟基茴香醚(BHA)后的ABTS+清除能力，为使图式简洁，图中维生素及丁基羟基茴香醚均以英文缩写表示。
由图10中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后，ABTS+清除能力确实上升，当浓度提高至5.28mg/mL时，DPPH清除能力可达约 100％；虽植物乳酸杆菌发酵物的萃取物相对于维生素C、丁基羟基茴香醚需较高浓度才可达到较高的ABTS+清除能力，但使用高浓度植物乳酸杆菌发酵物的萃取物对人体皮肤产生的副作用相较维生素C、丁基羟基茴香醚轻微许多。
实施例9：还原能力试验分析
依据普鲁士蓝Fe4[Fe(CN)6]3的生成量为指针，原理为将赤血盐 K3Fe(CN)6还原成黄血盐K4Fe(CN)6，然后黄血盐再利用Fe3+形成普鲁士蓝，通过波长700nm的吸光值变化来检测还原力的大小，吸光值越高则表示还原力越强。
还原力(％)＝(A/B)×100％
A：样品组于OD700的吸光值B：控制组于OD700的吸光值
参照图11，空白试验为未加任何抗氧化剂，接着添加浓度0.042 mg/mL、0.211mg/mL、1.056mg/mL、2.112mg/mL及3.168mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的还原能力，以及添加维生素C(Vit C)、丁基羟基茴香醚(BHA)后的还原能力，为使图式简洁，图中维生素及丁基羟基茴香醚均以英文缩写表示。
由图11中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后，还原能力确实上升，当浓度提高至3.168mg/mL时，还原能力可达约70％；虽植物乳酸杆菌发酵物的萃取物相对于维生素C、丁基羟基茴香醚需较高浓度才可达到较高的还原能力，但使用高浓度植物乳酸杆菌发酵物的萃取物对人体皮肤产生的副作用相较维生素C、丁基羟基茴香醚轻微许多。
实施例10：亚铁离子螯合能力试验分析
在金属离子中Fe2+是最具影响力的促氧化剂，利用Fe2+与菲洛嗪 (ferrozine)的鲜红色复合物在波长562nm有强吸光值的特性，可以测定样品对 Fe2+的螯合能力。当样品螯合Fe2+时，会造成OD562吸光值的降低，吸光值越低表示其螯合金属离子的能力越强。乙二胺四乙酸(EDTA)则作为正向对照组。
亚铁离子螯合能力(％)＝(1-A/B)×100％
A：样品组于OD562的吸光值B：控制组于OD562的吸光值
参照图12，空白试验为未加任何螯合剂，接着添加浓度0.053 mg/mL、0.106mg/mL、0.264mg/mL及0.528mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的螯合能力，以及添加浓度0.02mg/mL、0.04mg/mL、 0.08mg/mL的乙二胺四乙酸(EDTA)的螯合能力，为使图式简洁，图中乙二胺四乙酸以英文缩写表示。
由图12中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后，螯合能力确实上升，当浓度提高至0.528mg/mL时，螯合能力可达约90％；虽植物乳酸杆菌发酵物的萃取物相对于乙二胺四乙酸需较高浓度才可达到较高的螯合能力，但使用高浓度植物乳酸杆菌发酵物的萃取物对人体皮肤产生的副作用相较乙二胺四乙酸轻微许多。
实施例11：总酚含量试验分析
以酚类指示剂(Folin-Ciocalteu's phenol reagent)检测样品中酚类化合物的含量。样品里如果有酚类化合物，则会与酚类指示剂在波长750nm反应呈色，当吸光值越高，表示样品中所含多酚类物质越多，抗氧化能力越强。配置不同已知浓度的没食子酸与酚类指示剂反应作为标准品并制作检量线，检测未知物与指示剂反应后的吸收值，对应检量线则可测得其酚类化合物的含量。
参照图13，空白试验为未加任何植物乳酸杆菌发酵物的萃取物，接着添加浓度0.66mg/mL、3.3mg/mL、16.5mg/mL、33mg/mL及49.5mg/mL 的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的总酚含量(以没食子酸当量作为参考值)。
由图13中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后，总酚含量确实上升，当浓度提高至49.5mg/mL时，总酚含量相对于没食子酸当量可达约1当量，即表示此浓度下的总酚含量与没食子酸相近。
实施例12：纤维母细胞存活率试验分析
为确认植物乳酸杆菌发酵物的萃取物在不同浓度下对细胞所产生的毒性，使用纤维母细胞(WS1)进行试验，以判断植物乳酸杆菌发酵物的萃取物使用的适合浓度。
首先以细胞密度为5×104cells/well的纤维母细胞植入24孔培养盘中，置入37℃、5％CO2培养箱培养24小时；其后去除培养基，分别依照不同浓度的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物、特定浓度的过氧化氢(H2O2)及维生素 E(Trolox)，与DMEM培养基混合后更换24well内的培养基，置入培养箱培养 24小时；接着去除培养基，以PBS洗涤二次，每孔加入500μL稀释后的MTT 溶液(1mg/mL)，铝箔纸包覆孔盘避光处理，置入培养箱反应30分钟；最后去除培养基，以PBS洗涤二次，每孔加入500μL DMSO溶解蓝紫色的甲
Figure RE-GDA0003128068750000141
(formazan)结晶物，最后使用免疫酵素分析仪(ELISA)测定产物的OD570吸光值。
细胞存活率(％)＝(A/B)×100％
A：样品组于OD570的吸光值B：控制组于OD570的吸光值
参照图14，控制组为未添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物，接着添加浓度1.32mg/mL、6.6mg/mL、13.2mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时后的纤维母细胞存活率；由图14中可看出，当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后，纤维母细胞存活率未有明显改变，当浓度提高至13.2 mg/mL时，纤维母细胞存活率略为下降，故可知在该等浓度下，尚未对细胞产生毒性。
参照图15，控制组为未添加过氧化氢(H2O2)、植物乳酸杆菌发酵物的萃取物及维生素E(Trolox)，接着添加过氧化氢处理后，再依序添加浓度 0.264mg/mL、1.32mg/mL、6.6mg/mL、13.2mg/mL、19.8mg/mL的植物乳酸杆菌发酵物的萃取物反应24小时以及维生素E(Trolox)的细胞存活率，为使图式简洁，图中过氧化氢、植物乳酸杆菌及维生素E均以英文缩写表示。
由图15中可看出，经过氧化氢处理后的细胞存活率略为下降，但当添加植物乳酸杆菌发酵物的萃取物后，细胞存活率均明显提高，当浓度提高至6.6mg/mL时，细胞存活率最高可提高至150％，且均较控制组细胞存活率高，由此可知在该等浓度下，尚未对细胞产生毒性。
实施例13：植物乳酸杆菌发酵物的萃取物的用途
参考实施例1至12所述植物乳酸杆菌发酵物的萃取物的实验数据，其的确具有美白及抗氧化的功效，故可作为修复皮肤组成物的活性成分使用。修复皮肤组成物具体可为化妆品、保养品、防晒品等皮肤外用产品，该等皮肤外用产品可调配为下述形式：溶液、外用软膏、乳膏、泡沫、营养护肤霜、柔软护肤霜、敷料、软水、乳液、打底霜、香精、肥皂、液体清洁剂、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳化物、糊、凝胶、洗剂、粉末、肥皂、含界面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳化粉底、蜡状粉底、贴片及喷雾，但不以上述为限。
从以上结果可以证实，本发明的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum，BCRCNumber 10069)发酵物中分离所得的萃取物可以有效地防止黑色素形成，并具有良好的抗氧化能力，从而有效地美白皮肤、防止皮肤暗沉以及防止皮肤老化。
本发明所属技术领域者能够自前述内容理解，本发明可通过其他具体形式例式之而不改变本揭露内容的技术概念或本质特征。就此而言，本文中揭露的例示性态样仅用于例示性说明之用，且不应解释为限制本揭露内容的范畴。反之，本揭露内容倾向于不仅涵盖该等例示性态样，亦涵盖可包括于如后所附申请专利范围定义者的本发明内容的精神及范畴内的多种变更、修饰、均等物、及其他态样。

Claims (10)

1.一种用于修护皮肤的萃取物，其特征在于，所述萃取物由BCRC编号10069寄存的植物乳酸杆菌发酵物中萃取所得。
2.如权利要求1所述的萃取物，其特征在于，所述萃取物通过下述制备方法而得：
(a)培养种菌：将植物乳酸杆菌置入50mL的MRS培养基中，于35℃、100rpm下培养12小时；
(b)制备发酵物：取1mL步骤(a)所培养的植物乳酸杆菌的种菌，加入100mL的MRS培养基中，于35℃、100rpm下培养24小时，获得植物乳酸杆菌发酵物；
(c)除菌离心过滤：将植物乳酸杆菌发酵物在3000rpm、30min、25℃的条件下进行离心后取其上清液，再将上清液以孔径0.45μm过滤膜去除植物乳酸杆菌的菌体，获得植物乳酸杆菌的菌体经移除的上清液；以及
(d)除水：将步骤(c)所获得的上清液，将其水分完全抽除，获得所述萃取物。
3.如权利要求1所述的萃取物，其特征在于，所述萃取物可抑制酪胺酸酶的活性。
4.如权利要求1所述的萃取物，其特征在于，所述萃取物可抑制皮肤中黑色素生成。
5.如权利要求1所述的萃取物，其特征在于，所述萃取物可抑制皮肤细胞氧化。
6.一种用于修复皮肤的组成物，其特征在于，所述组成物包含如权利要求1所述的萃取物。
7.如权利要求6所述的组成物，其特征在于，所述组成物作为皮肤外用产品的原料。
8.如权利要求7所述的组成物，其特征在于，所述皮肤外用产品选自由化妆品、保养品及防晒品所组成的群组。
9.一种萃取物用于修复皮肤的用途，其特征在于，其用于制备具有抑制酪胺酸酶活性、抑制黑色素生成或抑制皮肤细胞氧化中任一者或其组合的组成物，其中，所述萃取物由BCRC编号10069寄存的植物乳酸杆菌发酵物中萃取所得。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述组成物可作为皮肤外用产品的原料，其中，所述皮肤外用产品可选自由化妆品、保养品及防晒品中所组成的群组。
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