TW201829775A - 穀物粉中濃縮蛋白質的方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種穀物粉中濃縮蛋白質的方法、一種包含已藉由使用所述方法濃縮的蛋白質的穀物粉、以及一種包含含有濃縮蛋白質的所述穀物粉的飼料添加劑。根據所述穀物粉中濃縮蛋白質的方法，用酶處理穀物粉以增加料源中水溶性糖含量，並且藉由接種細菌或酵母並發酵，移除所增加的水溶性糖，從而得到更高的蛋白質濃度。因而，增強了作為蛋白質源的穀物粉的蛋白質含量比值增加效果以及功能。

Description

穀物粉中濃縮蛋白質的方法

本發明是有關於一種穀物粉中濃縮蛋白質的方法、一種包含已使用所述方法濃縮的蛋白質的穀物粉、以及一種包含含有濃縮蛋白質的所述穀物粉的飼料添加劑。更具體而言，本發明是有關於一種穀物粉中濃縮蛋白質的方法，該方法包括用酶處理穀物粉以分解結構性碳水化合物。 [相關申請案的交叉參考] 本申請案主張2016年03月16日提交韓國知識產權局的韓國專利申請案第10-2016-0031463號之優先權，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

穀物被廣泛用作牲畜飼料，此乃因能量含量高，且因而飼料效率高，且粗纖維含量低，且因而消化吸收率佳。然而，穀物飼料具有低蛋白質比值以及低胺基酸比值。因此，為了獲得均衡的營養，穀物飼料需要輔以蛋白質及胺基酸。對於用作蛋白質源，使用動物蛋白質源，例如魚粉、脫脂奶粉、肉粉或血粉，以及植物蛋白質源，例如大豆、菜籽或亞麻。在植物蛋白質源中，玉米麩是在玉米澱粉的製造過程中產生的一種副產物。玉米麩的蛋白質含量類似於具有高蛋白質含量的魚粉的蛋白質含量（約是一般植物蛋白質源的3倍高），並且便宜。由於玉米麩的該些特徵，玉米麩被廣泛用作飼料的蛋白質源。

根據先前的研究，在微生物蛋白酶或市售的酶的作用下，將玉米麩蛋白質降解成肽，並且藉由將微生物接種於玉米麩中，將蛋白質降解成低分子量的肽，並且同時蛋白質含量比值略微增加。

然而，由於源材料（source material）中水溶性糖含量小，發酵期間玉米麩中的蛋白質含量比值增加效果很低，為約2%至3%。因此，玉米麩的固態發酵只是將主要蛋白（major protein）降解成肽。

根據本發明，提供一種製備具有此種蛋白質含量比值而可以代替市售魚粉的材料的方法，由於用酵母處理玉米麩中所含的非蛋白質組分並用微生物移除，因而玉米麩中的蛋白質含量比值增加。

本發明提供一種穀物粉中濃縮蛋白質的方法，包括用酶處理穀物粉，以分解結構性碳水化合物。

其他態樣將在以下說明中予以部分闡述，且該些態樣將藉由所述說明而部分地顯而易見，或者可藉由實踐所給出的實施例而得知。

根據一實施例的一態樣，一種穀物粉中濃縮蛋白質的方法包括：用酶處理所述穀物粉，以分解結構性碳水化合物；以及對所述穀物粉接種細菌以使穀物粉發酵。

本文中所用術語「穀物粉（grain powder）」指藉由研磨例如玉米、高粱、稻米、大豆、甜菜、棉籽、芝麻等穀物而獲得的產物。術語「穀物粉」包括藉由乾燥並研磨純穀物在衝壓製程中使用後的殘餘物而獲得的產物，並且此種產物可以是玉米麩、棉籽粕、木棉籽粕、紫蘇粕、去皮豆粕等，但本發明的實施例並不僅限於此。本發明中使用的穀物粉可以是同一區域中生產的同一類型的穀物粉。然而，穀物粉品質的差異並不影響根據本發明獲得的結果。

在本發明的一個實施例中，穀物粉可以是玉米麩。玉米麩指藉由以下方式獲得的黃色粉：在自玉米生產澱粉時，自玉米提取澱粉及胚芽並自所得物中分離玉米糠，隨後進行脫水及乾燥。換言之，玉米麩指在製備玉米澱粉的過程中產生的殘餘物。玉米麩中的蛋白質含量比值為約35%至65%，是一般飼料的蛋白質含量比值的3倍高。因此，將玉米麩用作飼料的蛋白質源。

本文中所用術語「酶（enzyme）」指分解穀物粉中的結構性碳水化合物的酶。酶可選自由澱粉分解酶、纖維素分解酶（纖維素酶）、半纖維素分解酶（半纖維素酶）及果膠分解酶（果膠酶）組成的群組。

在本發明的一個實施例中，澱粉分解酶可以是澱粉酶或葡糖澱粉酶（glucoamylase），或可以選自由α-澱粉酶、β-澱粉酶、異澱粉酶及葡糖澱粉酶組成的群組。在一個實施例中，澱粉分解酶可以是α-澱粉酶或葡糖澱粉酶。在一個實施例中，澱粉分解酶可以是葡糖澱粉酶。

在本發明的一個實施例中，酶可藉由酶篩選來選擇。市售的酶具有不同的酶活性以及不同的酶反應條件。因此，可藉由酶篩選來選擇對於作為源材料的穀物粉而言最佳的酶。酶篩選可以如下方式施行：使源材料與酶反應，在給定時間處對反應物進行取樣並量測每一樣品中粗蛋白質的量，並且以改變（i）酶的種類、（ii）酶添加至反應物中的時間以及（iii）反應溫度來重複所述步驟，以及最終選擇在給定樣品中產生最高的蛋白質最終濃度的酶。

在本發明的一個實施例中，以100重量份的穀物粉計，酶的量可處於0.1重量份至1重量份的範圍。

本文中所用術語「結構性碳水化合物（structural carbohydrate）」意指低利用率碳水化合物，例如澱粉、纖維素、半纖維素或果膠。在一個實施例中，結構性碳水化合物可以是澱粉。

在本發明的一個實施例中，穀物粉中的結構性碳水化合物可以如下方式鑒別：藉由使用例如酸將結構性碳水化合物水解以獲得構成所述結構性碳水化合物的單糖，並推測可基於該（些）單糖構建的結構性碳水化合物。本文中所用術語「發酵（fermentation）」指其中細菌或酵母藉由使用細菌或酵母所具有的酶來分解例如葡萄糖等有機材料的過程。發酵包括例如固態發酵及液態發酵。在一個實施例中，發酵可以是固態發酵。

「固態發酵（solid-state fermentation）」指細菌散佈在穀物粉的表面或內部的方法。在固態發酵的情形中，污染物的生長由於低水活力（water vitality）而受到限制。因此，不同於液態發酵，固態發酵不會造成嚴重的污染。當使用同一種菌株藉由液態發酵或固態發酵生產酶時，藉由固態發酵生產的酶具有高受質（substrate）親和性，顯示出高活性。

在本發明的一個實施例中，固態發酵可藉由用例如細菌或酵母等微生物處理穀物粉來執行。

本文中所用術語「細菌（bacteria）」指會進行發酵並具有0.1毫米或小於0.1毫米的長度的微生物。此種微生物的實例包括芽孢桿菌屬（genusBacillus ）、麯黴屬（genusAspergilus ）、明串珠菌屬（genusLeuconostoc ）、乳酸菌屬（genusLactobacillus ）、魏斯氏菌屬（genusWeissella ）及鏈球菌屬（genusStreptococcus ），但並不僅限於此。在本發明的一個實施例中，細菌可以是芽孢桿菌屬。

在本發明的一個實施例中，用於固態發酵的芽孢桿菌屬菌株可以是非致病性芽孢桿菌屬細菌。在一個實施例中，非致病性芽孢桿菌屬可包括選自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis ）、東洋芽孢桿菌（Bacillus toyoi ）、凝結芽胞桿菌（Bacillus coagulans ）、臘樣芽孢桿菌（Bacillus polyfermenticus ）及解澱粉芽孢桿菌K2G（Bacillus amyloliquefaciens K2G）的至少一種芽孢桿菌菌株。在此情形中，發酵可在30℃至45℃的溫度下執行，在一個實施例中為30℃至40℃，或者在一個實施例中為37℃。

在本發明的一個實施例中，用於固態發酵的細菌可以是乳酸菌。

本文中所用術語「乳酸菌（lactic acid bacteria）」指使糖發酵以獲得能量並產生大量乳酸的細菌。乳酸菌的實例包括乳桿菌屬（genusLactobacillus ）、乳球菌屬（genusLactococcus ）、明串珠菌屬（genusLeuconostoc ）、片球菌屬（genusPediococcus ）及雙歧桿菌屬（genusBifidobacterium ），但並不僅限於此。術語「乳酸菌」並不是根據細菌的分類類別進行定義的。因此，即使當一種微生物屬於其他物種時，該微生物也可為乳酸菌。在本發明的一個實施例中，乳酸菌可以是乳桿菌屬。

在本發明的一個實施例中，乳桿菌屬可以是選自由植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus ）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus ）、乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei ）及短乳桿菌（Lactobacillus brevis ）組成的群組的至少一種乳桿菌屬菌株。在此情形中，發酵可在30℃至45℃的溫度下執行，在一個實施例中為30℃至40℃，或者在一個實施例中為37℃。

在本發明的一個實施例中，所述方法可更包括在用酶進行處理前向穀物粉中添加基液，以獲得使細菌在穀物粉中生長最佳的pH程度。舉例而言，當細菌為芽孢桿菌時，細菌生長最佳的細菌pH可處於6至7的範圍；當細菌為乳桿菌屬即乳酸菌時，細菌生長最佳的細菌pH可處於5至7的範圍。

基液可以是pH大於7的水溶液。在一個實施例中，基液可以是NaOH溶液、KOH溶液、NH₄ OH溶液等。在一個實施例中，基液可以是NaOH溶液。NaOH溶液的濃度可處於1%至2%的範圍。NaOH溶液可以使在添加NaOH溶液後，例如玉米麩等穀物粉的含水量處於約40%至50%的範圍的量、以使含水量處於41%至45%的範圍的量，或者以使含水量為43%的量使用。

本發明的另一態樣提供一種穀物粉中濃縮蛋白質的方法，所述方法包括：用酶處理所述穀物粉，以分解結構性碳水化合物；以及用對所述穀物粉接種酵母以使所述穀物粉發酵。

本文中所用術語「酵母」意指用於發酵的微生物，其實例包括酵母菌屬（genusSaccharomyces ）、畢赤氏酵母菌屬（genusPichia ）、假絲酵母菌屬（genusCandida ）及裂殖酵母菌屬（genusSchizosaccharomyces ），但並不僅限於此。在本發明的一個實施例中，酵母可以是酵母菌屬。

在本發明的一個實施例中，用於固態發酵的酵母菌屬可以是卡爾酵母菌（Saccharomyces Carlsbergensis ），並且在此情形中，發酵可在20℃至40℃的溫度下執行，在一個實施例中為25℃至35℃，或者在一個實施例中為30℃。由於酵母比細菌生長慢，因而發酵時間可處於24小時至72小時的範圍，在一個實施例中為36小時至60小時的範圍，或者在一個實施例中為48小時。

在本發明的一個實施例中，酵母在酸性條件下充分生長。因此，可在不控制穀物粉的pH的情形下進行酶處理及發酵。

在本發明的一個實施例中，用酶處理穀物粉以分解結構性碳水化合物以及用對穀物粉接種細菌、酵母或乳酸菌以進行發酵可以按照該陳述順序依序進行或者同時進行。然而，順序並不影響本發明實施例的結果。

本發明的另一態樣提供一種穀物粉，該穀物粉包含已藉由使用所述穀物粉中濃縮蛋白質的方法濃縮的蛋白質。

「包含已濃縮的蛋白質的穀物粉（grain powder that includes a protein that has been concentrated）」可以理解為由於酶反應以及使用細菌或酵母的發酵而具有比發酵前高的蛋白質含量比值的穀物粉。

本發明的另一態樣提供一種包含所述具有濃縮蛋白質的穀物粉的飼料添加劑。

「飼料添加劑（feed additive）」指添加至飼料以改善目標生命有機體的生產能力或健康狀況的材料。飼料添加劑可以此項技術中習知的各種類型製備，且可單獨使用或與傳統上習知的飼料添加劑一起使用。飼料添加劑可以合適的組成比添加至飼料中。組成比可基於此項技術中的常識及經驗確定。根據一實施例的飼料添加劑可添加至例如雞、豬、猴、狗、貓、兔、牛、綿羊或山羊等動物的飼料中，但本發明的實施例並不僅限於此。

現在將詳細參照實施例，實施例的實例在附圖中示出。就此而言，本發明實施例可具有不同的形式且不應被視為限於本文中所給出的說明。因此，下文只是參照圖對所述實施例進行說明，以解釋各態樣。實例 1. 玉米麩料源（ source ）分析

本發明的發明者使用玉米麩作為固態發酵的源材料。為此，量測源材料中適於微生物發酵的水溶性糖含量的程度（level）。

將玉米麩溶於水中以製備10%溶液，並於60℃的溫度下進行3小時提取。離心所獲得的提取液（8,000 rpm，10分鐘），從中收集上清液並經由過濾片（沃特曼2號（Whatman No.2））過濾。用活性碳處理濾液，且然後使其在60℃的溫度下反應30分鐘，使用過濾片過濾，並用離子交換（陽離子、陰離子）樹脂進行處理以從中移除離子性材料。藉由高效液相層析（HPLC）分析來量測最終樣品中的水溶性糖含量。

玉米麩中的水溶性糖含量低至約0.4%。因此，推測微生物發酵對更高蛋白質含量比值的作用可以忽略不計（參見表1）。 [表1] 實例 2. 推測玉米麩中的結構性碳水化合物

在實例1中確認了被微生物利用的玉米麩料源中的水溶性糖含量極小後，執行酶處理，以增加可被微生物利用的組分的量。酶篩選之前，分解玉米麩中的結構性碳水化合物以鑒別構成玉米麩的碳水化合物的主要單糖，並基於結果來推測酶的靶受質（target substrate）。

如下般分析玉米麩的結構性碳水化合物：根據國家可再生能源實驗室（national renewable energy laboratory，NREL）的組分分析方法，製備參考物質（reference material）葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、玉米麩料源（對於每一樣品，此分析皆進行三次）。將該些材料分別以0.3克的量裝入玻璃試管中，且然後向其中添加3毫升的72%硫酸。將所得的管置於30℃水浴中以執行酸水解2小時，隨後以10分鐘至20分鐘的間隔用玻璃棒攪拌。向酸水合物試管中添加4毫升蒸餾水，並將所得的溶液裝入另一容器中，向其中加入蒸餾水，藉此使得其總重量達到80克。對於二次水解，將第一水合物在高壓釜中在121℃的溫度下水解1小時。使第二水合物冷卻，且然後向其中添加碳酸鈣以執行中和。使玉米麩樣品重複經受酸水解，並藉由使用上述方法分析所獲得的酸水合物。

徹底分解玉米麩的結構性碳水化合物，然後藉由HPLC進行分析。結果顯示，主要的單糖為葡萄糖（參見表2及圖1）。亦即，推測玉米麩的結構性碳水化合物主要為澱粉或纖維素。 [表2] 實例 3. 酶處理引起的料源組分變化

微生物所利用的玉米麩料源中的水溶性碳水化合物含量極小。然而，當用葡糖澱粉酶（其可分解推測為玉米麩的主要碳水化合物的組分）預處理玉米麩料源時，玉米麩的糖組分被改變。執行實例1中使用的實驗方法。

在此實驗中，已確認當使用葡糖澱粉酶（其為分解玉米麩中不溶的碳水化合物的酶中的一種澱粉分解酶）時，葡萄糖含量增加10倍或大於10倍。然而，當不使用澱粉分解酶時，葡萄糖、果糖及蔗糖各自的含量皆極小（參見表3及圖2）。 [表3] 實例 4. 準備適合固態發酵的條件

已藉由酶處理獲得用於微生物發酵的碳源。然而，一般而言，由於玉米麩的pH為4或小於4，芽孢桿菌菌株在其中並不生長。因此，在本實驗中，為了藉由接種芽孢桿菌菌株來使玉米麩發酵，將玉米麩的pH調整至6至7的範圍，該pH範圍為芽孢桿菌生長的最佳範圍。

首先，在將玉米麩的含水量調整至約43%的同時，向其中添加各種不同濃度的NaOH溶液。將所得物在100℃的溫度下熱處理30分鐘，然後量測其pH。不同NaOH溶液濃度下的玉米麩的pH示於表4中，結果確認當使用2% NaOH溶液時，pH對於芽孢桿菌的生長而言為最佳的。 [表4] 實例 5. 比較取決於酶的由微生物獲得的蛋白質增加效果

如實例3中所確認，當使用澱粉分解酶時，玉米麩中的水溶性糖含量增加。市售澱粉分解酶具有不同的酶活性及反應條件。因此，它們具有不同的澱粉分解效果、水溶性糖含量程度以及由固態發酵得到的蛋白質增加比值。在本實驗中，藉由酶篩選，篩選出適合於玉米麩中濃縮蛋白質的澱粉分解酶。

酶篩選是以根據酶的特性而改變酶添加點以及反應溫度的方式來執行。

在為葡糖澱粉酶處理組及嗜中溫α-澱粉酶處理組的情形中，將2% NaOH溶液添加至玉米麩中，以將所得物的含水量調整至約43%，並將所得的玉米麩在100℃的溫度下熱處理30分鐘，且然後放置在空氣中冷卻，並用各自具有0.1%濃度的相應酶處理，且在60℃的溫度下反應1小時。

在為嗜熱α-澱粉酶處理組的情形中，將2% NaOH溶液添加至玉米麩中以將其含水量調整至約43%，並向其中添加0.1%的酶，且將所得物在100℃的溫度下熱處理30分鐘。熱處理後，不進行酶反應。

將解澱粉芽孢桿菌K2G（Bacillus amyloliquefaciens ，保藏編號KCCM11471P，參見韓國專利第10-1517326號）10%（v/w料源）接種入已與酶徹底反應的玉米麩內，且然後，在溫度為37℃及濕度為95%的恆溫恆濕浴中使玉米麩發酵24小時。乾燥並研磨發酵所得物，並藉由使用克耶達（Kjeldahl）分解裝置量測其中的蛋白質的量（參見表5）。

作為發酵的結果，所有的酶皆顯示出類似的活菌總數。然而，它們顯示出實質上不同的蛋白質增加比值。在不使用酶的情形中，儘管添加所述該2%溶液並進行了熱處理，條件基本上適於微生物的生長，但是源材料中的水溶性糖含量小，使蛋白質增加約2%。並且認為，各酶由於其不同的澱粉分解效果及不充分的反應溫度及時間而顯示出變化的發酵結果。藉此，選擇葡糖澱粉酶作為促成相對高的蛋白質增加比值的酶，相對高的蛋白質增加比值藉由在該些條件下分解玉米麩中的澱粉而獲得。 [表5] 實例 6. 比較使用酶或不使用酶時的發酵方式及所獲得品質

如根據實例5獲得的結果中所示，發酵24小時後，因葡糖澱粉酶及固態發酵而產生蛋白質增加效果。除蛋白質增加效果外，為進一步鑒別葡糖澱粉酶處理對發酵過程及發酵品質的影響，量測微生物生長方式、含水量變化、蛋白質的增加及蛋白質降解率以及蛋白質溶解度。以與實例5中相同的方式進行發酵，並且將實驗組劃分為葡糖澱粉酶0.5%處理組及未經酶處理的組，並且每四小時自各組採集一次樣品（參見表6）。

不用酶進行處理時，藉由微生物而進行的發酵使玉米麩的蛋白質含量比值增加了約2.5%。然而，在為已於酶處理後經受發酵的玉米麩的情形中，蛋白質含量比值的增加高達約8%。其原因在於，由於酶處理，玉米麩材料中的澱粉分解成葡萄糖，所述葡萄糖接著在芽孢桿菌生長時被使用。結果，蛋白質被相對濃縮，從而產生蛋白質含量比值增加效果。就此而言，當將玉米麩的pH調整至微生物獨立於酶處理生長的程度時，活菌總數（viable bacteria population）處於同一程度。然而，酶處理可用於增加玉米麩中的蛋白質含量比值。

玉米麩料源中的粗蛋白質（DS含量）為71.7%，並且與實例1中同樣地，用於生長微生物的水溶性糖含量為0.4%。因此，若使用水溶性糖而蛋白質保持完整，則蛋白質增加比值原本會小至約0.3%。然而，實際上，蛋白質增加比值大於2%，並且根據實例8，當不執行酶處理時，相比玉米麩料源中的澱粉含量，發酵產物中的澱粉含量減少。在即使不用酶處理玉米麩的情況下，玉米麩中相對於水溶性糖含量的高蛋白質含量比值可能是由微生物發酵期間由菌株產生的澱粉酶的活性造成的。此結果顯示，藉由使用具有高澱粉酶活性的菌株進行的發酵對蛋白質含量比值的增加有正向的影響。 [表6] 實例 7. 比較根據酶反應獲得的實驗結果

本發明是有關於一種藉由同時執行酶預處理及微生物發酵而增加玉米麩中蛋白質含量的方法。若在酶處理後立即執行發酵而無需單獨的酶反應，則用於增加玉米麩中蛋白質比值的製程及用於生產玉米麩的製程可被簡化，而且製造成本亦可降低。為確認此推測，藉由比較以下兩個實驗的結果來確認是否需要單獨的酶反應：以與實例5中相同的方式執行發酵，並且於添加酶後，在60℃的溫度下執行1小時酶反應；以及以與實例5中相同的方式執行發酵，並且在不提供酶反應的時間的情形下，接種微生物。

結果，進行酶反應（參見表7中的進行酶反應 ）與不進行酶反應（參見表7中的不進行酶反應 ）之間在蛋白質增加比值上並無實質差異。此結果顯示，即使不進行酶反應，發酵期間也會發生充分的酶反應（參見表7）。 [表7] 實例 8. 比較根據酶的濃度的澱粉含量及蛋白質含量比值

鑒別取決於酶的濃度的玉米麩中澱粉含量降低與蛋白質含量比值增加之間的關係。即使不進行酶處理，源材料中澱粉的量亦會由於微生物發酵而降低至某一程度。而且，酶的濃度愈大，源材料中的澱粉含量愈小。結果，蛋白質含量比值相對增加（參見表8）。

同時，玉米麩是生產玉米澱粉時產生的副產物，而且玉米麩中的蛋白質含量可根據玉米澱粉產率而變化。亦即，玉米麩中蛋白質含量愈低，澱粉含量相對而言愈高。因此，藉由澱粉分解酶來分解更多葡萄糖，並且因而由於微生物發酵而產生的蛋白質含量比值增加效果可增加。表9示出當玉米麩中的蛋白質為66%及70%時藉由使用玉米麩料源而獲得的發酵結果。除了料源中的蛋白質含量外，執行發酵時使用完全相同的條件，包括葡糖澱粉酶0.1%、接種芽孢桿菌10%等。結果，當玉米麩中的蛋白質含量為66%時，蛋白質的增加更多。在此實驗中，並未量測各料源的澱粉值，因此難以證明澱粉絕對多於蛋白質。然而，可以推測，若澱粉值由於低蛋白質含量而更高，則葡萄糖會更多地被酶分解，從而導致更高的蛋白質增加比值。 [表8] [表9] 實例 9. 確認玉米麩已被酵母發酵

如以上實例中所述，已確認玉米麩已被芽孢桿菌發酵並且由於添加酶而具有蛋白質含量比值增加效果。本發明的發明者另外實施了實驗以確認除了芽孢桿菌外玉米麩是否可被酵母發酵，以比較玉米麩取決於微生物的發酵特性。

在此實驗中，使用卡爾酵母菌作為執行發酵的酵母。與用芽孢桿菌發酵相同地，將水添加到玉米麩中以調整含水量至約43%，並將所得物在100℃的溫度下熱處理30分鐘。將經熱處理的玉米麩放置在空氣中冷卻，並且在為經酶處理的組的情形中，以源材料計，以0.5%的量使用葡糖澱粉酶，而在為未經酶處理的組的情形中，不使用酶，並且向兩組中皆添加以源材料計為10%的量的卡爾酵母菌培養物。使所得物在恆溫恆濕浴（溫度為30℃，濕度為95%）中進行發酵48小時。由於酵母的最適宜生長溫度為30℃，因而發酵是在不同於芽孢桿菌的溫度下執行。由於酵母比芽孢桿菌生長得慢，因而發酵時間為48小時。

推測酵母在酸性條件下充分生長，故未調整pH。僅對在進行酶處理或不進行酶處理的情形下獲得的發酵結果進行了比較。比較結果顯示，酵母在不對玉米麩的pH進行任何調整的情形下生長，並且蛋白質增加比值根據酶處理而變化。在不進行酶處理的情形下，玉米麩中用於生長微生物的水溶性糖的量小，且因此，由發酵得到的蛋白質濃縮效果相對小且蛋白質增加比值小於1%。然而，當用酶進行處理時，玉米麩的蛋白質增加比值為9%或大於9%（參見表10）。 [表10] 實例 10. 確認玉米麩已被乳酸菌發酵

如以上實例中所述，確認玉米麩已被芽孢桿菌或酵母發酵並且由於添加葡糖澱粉酶而具有蛋白質含量比值增加效果。本發明的發明者另外實施了實驗以確認除了芽孢桿菌和酵母外，玉米麩是否可被乳酸菌發酵，以比較玉米麩取決於微生物的發酵特性。

對於由乳酸菌發酵，使用植物乳桿菌。與芽孢桿菌發酵相同地，將水或2% NaOH添加到玉米麩中以調整含水量至約43%。通常，乳酸菌在酸性或中性條件下生長。然而，植物乳桿菌並不在作為酸性源材料的玉米麩中生長。因此，使用已添加水但並未調整pH的玉米麩以及已調整pH的玉米麩二者進行發酵。與結合芽孢桿菌發酵及酵母發酵使用的同一方法相同地，將玉米麩在100℃的溫度下熱處理30分鐘，並且放置在空氣中冷卻後，在為經酶處理的組的情形中，以源材料計，以0.5%的量添加葡糖澱粉酶，而在為未經酶處理的組的情形中，不添加酶。以源材料計，以10%的量接種植物乳桿菌培養物，並且在37℃的溫度下執行厭氧發酵。由於乳酸菌亦比芽孢桿菌生長得慢，因而執行發酵48小時。

作為乳酸菌發酵的結果，確認在添加酶或不添加酶的情形中，乳酸菌不在pH未經過調整的玉米麩中生長。然而，在為pH已經過調整的玉米麩的情形中，活菌總數增加。此結果顯示，植物乳桿菌在玉米麩中的生長一定需要進行pH調整。並且，pH的降低顯示藉由乳酸菌發酵而產生了有機酸。然而，不管是否進行了酶處理及pH調整，所有的實驗組均未顯示出蛋白質含量比值增加效果，且推測厭氧發酵並不產生蛋白質濃縮效果。經酶處理的組與未經酶處理的組之間的差別在於當對pH進行控制時pH的降低大於不對pH進行控制的情形。而且，可以推測，在經酶處理的組中，由於有許多用於生長乳酸菌的單糖組分，代謝快速發生並產生更多有機酸。同時，由於玉米麩的pH因由24小時發酵所產生的有機酸而降低至乳酸菌無法生長的程度，因而發酵48小時後經酶處理的組及經pH控制的組中的活菌總數降低（參見表11）。 [表11]

本發明的主要技術價值在於將玉米麩中的澱粉藉由酶反應而轉化成水溶性糖，並且允許微生物利用水溶性糖生長。在為芽孢桿菌及酵母的情形中，由於微生物的好氧生長特性，糖被消耗並轉化成CO₂ ，從而產生濃縮蛋白質。然而，在為乳酸菌的情形中，即使糖被消耗並且微生物生長，但由於微生物的厭氧生長特性，故由於產生有機酸而不能獲得蛋白質濃縮效果。然而，由於所產生的有機酸的特性，乳酸菌作為益生菌具有極高的價值。迄今為止，當使用玉米麩作為源材料時，由於缺少能夠用於發酵的水溶性糖，藉由乳酸菌的代謝來產生有機酸受到限制。然而，澱粉的分解（其為本發明的關鍵技術）有助於乳酸菌的代謝。實例 11. 比較根據微生物由發酵產生的蛋白質降解率

為鑒別除蛋白質增加效果外其他指標是否有任何差異，藉由SDS-PAGE分析玉米麩的蛋白質降解率。用於SDS-PAGE分析的樣品藉由使用以下方法製備。

對於在不同時間點處收集的各發酵產物，將約100毫克發酵產物懸浮於8 M尿素溶劑中，並進行音波處理（sonicated），並離心（8000 rpm, 10分鐘）。使所得的提取物經受BCA定量以量測蛋白質含量比值，並且對於SDS-PAGE，裝入相同量的蛋白質以鑒別各時間點處的蛋白質降解方式。用於SDS-PAGE的標記物的大小為250千道爾頓（kDa）、150千道爾頓、100千道爾頓、75千道爾頓、50千道爾頓、37千道爾頓、25千道爾頓、20千道爾頓、15千道爾頓或10千道爾頓。

實驗結果顯示，蛋白質降解率根據微生物的特性而變化。舉例而言，在為產生蛋白酶的芽孢桿菌組的情形中，由於發酵，玉米麩料源的肽降解至約20千道爾頓的程度（參見圖3）。然而，在為不能產生蛋白酶的酵母及乳酸菌的情形中，不管是否進行了酶處理或pH調整，在發酵期間，源材料中的肽並不降解（參見圖4及圖5）。

藉由芽孢桿菌發酵而將玉米麩蛋白質降解為肽可以促進飼料的消化。同時，儘管在為酵母及乳酸菌的情形中，蛋白質降解並未發生，但是由於功能性組分例如存在於酵母細胞壁中的β-葡聚糖具有免疫功能，並且乳酸菌可用作益生菌，因而推測飼料材料的功能可以被增強。

當使用根據本發明一實施例的穀物粉中濃縮蛋白質的方法時，源材料中水溶性糖的量藉由用酶處理穀物粉而增加，並且所增加的水溶性糖藉由對穀物粉接種細菌或酵母以及發酵而移除。藉此，蛋白質含量比值增加效果增強，並且穀物粉作為蛋白質源的效能可得到改善。

應理解，本文中所說明的實施例應被視為僅具有說明意義而非用於限制。對每一實施例內的特徵或態樣的說明通常應視為可用於其他實施例中的其他類似特徵或態樣。

雖然已參照圖對一個或多個實施例進行了說明，但是此項技術中具有通常知識者可理解，可在不背離以下申請專利範圍所定義的精神及範圍的情形下在其中對形式和細節做出各種改變。

無

結合附圖閱讀以下對實施例的說明，該些及/或其他態樣將變得顯而易見且更易於理解，在附圖中： 圖1示出藉由分解玉米麩的結構性碳水化合物而獲得的產物的高效液相層析（high-performance liquid chromatography，HPLC）的層析圖； 圖2示出用以分析經酶處理的組及未經酶處理的組中玉米麩中的糖的HPLC層析圖； 圖3示出當接種芽孢桿菌以執行發酵時經酶處理的組及未經酶處理的組中藉由SDS-PAGE確認的蛋白質相對於時間的降解率； 圖4示出當接種酵母以執行發酵時經酶處理的組及未經酶處理的組中藉由SDS-PAGE確認的蛋白質相對於時間的降解率；以及 圖5示出當接種乳酸菌以執行發酵時經酶處理的組及未經酶處理的組中藉由SDS-PAGE確認的蛋白質相對於時間的降解率。

Claims (15)

1. 一種穀物粉中濃縮蛋白質的方法，所述方法包括： 用酶處理穀物粉，以分解結構性碳水化合物；以及 將細菌接種於所述穀物粉中以執行發酵。
2. 如申請專利範圍第1項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，更包括，在用酶進行處理前，向所述穀物粉中添加基液，以調整對於所述細菌在所述穀物粉中生長而言最佳的pH。
3. 如申請專利範圍第1項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述細菌為芽孢桿菌屬。
4. 如申請專利範圍第3項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述芽孢桿菌屬包括選自由枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、東洋芽孢桿菌、凝結芽胞桿菌、臘樣芽孢桿菌及解澱粉芽孢桿菌K2G組成的群組的至少一種菌株。
5. 如申請專利範圍第1項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述細菌為乳酸菌。
6. 如申請專利範圍第5項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述乳酸菌包括選自由乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬及雙歧桿菌屬組成的群組的至少一種菌株。
7. 一種穀物粉中濃縮蛋白質的方法，所述方法包括： 用酶處理穀物粉，以分解結構性碳水化合物；以及 將酵母接種於所述穀物粉中以執行發酵。
8. 如申請專利範圍第7項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述酵母為酵母菌屬。
9. 如申請專利範圍第1項或第7項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述穀物粉為玉米麩。
10. 如申請專利範圍第1項或第7項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述發酵為固態發酵。
11. 如申請專利範圍第1項或第7項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述結構性碳水化合物包括選自由澱粉、纖維素、半纖維素或果膠組成的群組的至少一種。
12. 如申請專利範圍第1項或第7項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中所述酶為α-澱粉酶或葡糖澱粉酶。
13. 如申請專利範圍第1項或第7項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法，其中以100重量份的所述穀物粉計，以0.1重量份至1重量份的量使用所述酶。
14. 一種穀物粉，包含已藉由使用如申請專利範圍第1項或第7項所述的穀物粉中濃縮蛋白質的方法濃縮的蛋白質。
15. 一種飼料添加劑，包含如申請專利範圍第14項所述的穀物粉，所述穀物粉含有濃縮蛋白質。