WO2017052298A1 - 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법 - Google Patents

곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법 Download PDF

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grain powder
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enzyme
fermentation
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서효정
홍영호
조성준
강경일
류제훈
박승원
한성욱
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씨제이제일제당(주)
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Definitions

  • the present invention relates to a feed additive comprising a method for concentrating a protein in grain powder, a grain powder in which the protein produced by the method is concentrated, and a grain powder in which the protein is concentrated.
  • the method for concentrating the protein in the grain powder relates to a method for concentrating the protein in the grain powder, comprising the step of decomposing the structure carbohydrate by treating the grain powder with an enzyme.
  • Grains have high energy content and high feed efficiency and low crude fiber content, so they have good digestibility, so they are widely used for livestock feed.
  • grain feeds are low in protein and amino acid composition, so supplementation is essential for balanced nutrition.
  • animal protein sources such as fish meal, skim milk powder, meat meal, blood meal, and vegetable protein sources such as soybean, rapeseed, flax are used.
  • Corn gluten one of the plant protein sources, is a by-product of corn starch manufacturing process, and is widely used as a protein source for feed because it is similar in content to fish meal with a high protein content (about 3 times as much as a general vegetable protein source) and inexpensive.
  • the peptide of the corn gluten protein is achieved through the protease or commercial enzyme of the microorganism.
  • the inoculation of the microorganisms into corn gluten degrades the protein into low molecular peptides and at the same time increases the protein content ratio.
  • the present invention contributes to improving the protein content ratio of corn gluten by removing non-protein components contained in corn gluten through enzyme treatment and microorganisms, and a method for producing a high protein material capable of replacing commercially available fish meal. Presented.
  • One aspect of the present invention is to provide a method for concentrating a protein in grain powder comprising the step of enzymatically treating the grain powder to break down structural carbohydrates.
  • One aspect of the present invention comprises the steps of enzymatically processing grain powder to decompose structural carbohydrate (structural carbohydrate); And it provides a method for concentrating the protein in the grain powder comprising the step of inoculating bacteria to the grain powder.
  • grain powder used in the present invention means grains, specifically maize, sorghum, rice, soybeans, sugar beet, cottonseed, perilla, etc., dried and pulverized, using pure grains in other processes The remaining residue after drying, specifically, corn gluten, cotton seed meal, kapok seed meal, perilla meal, dehulled soybean meal And the like, but are not limited thereto.
  • the grain powder used in the present invention it is preferable to use the same kind of grain powder produced in the same region, but the quality difference of the grain powder does not greatly affect the result of the present invention.
  • the grain powder may be corn gluten.
  • the corn gluten is a yellow powder dehydrated and dried after extracting most of the starch and embryos from the raw material in the process of manufacturing starch from corn, and separating the corn bran, which corresponds to the residue generated during the production of corn starch.
  • the corn gluten contains about 35% to 65% of protein, and contains about three times as much protein as a general feed and is used as a protein source of feed.
  • enzyme means an enzyme that plays a role in degrading structural carbohydrates in grain powder, preferably starch degrading enzyme, cellulose degrading enzyme (cellulase, cellulase), hemicellulose degrading enzyme (hemicellulase, hemicellulase) and pectinase (pectinase).
  • the starch degrading enzyme is an enzyme selected from the group consisting of amylase or glucoamylase, specifically ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, isoamylase and glucoamylase. May be preferably ⁇ -amylase or glucoamylase, more preferably glucoamylase.
  • the enzyme may be selected through enzyme screening.
  • Enzyme screening is given by fermenting each enzyme by varying (i) the type of enzyme, (ii) the time of addition of the enzyme, and (iii) the reaction temperature during the course of the experiment, and measuring the amount of crude protein in the sample at regular time intervals. Under the conditions, it may proceed by selecting an enzyme having the highest concentration effect of the final protein.
  • the enzyme is preferably treated by 0.1 to 1 parts by weight based on 100 parts by weight of the grain powder.
  • structural carbohydrate refers to low-availability carbohydrates such as starch, cellulose, hemicellulose, pectin, etc., which constitute the cell wall of plant cells. And preferably starch.
  • the type of structural carbohydrate present in the grain powder is detected by hydrolyzing the structural carbohydrate using an acid or the like to form the structural carbohydrate in the form of a monosaccharide, and using the result as the monosaccharide. It can be found by inversely guessing the type of the structural carbohydrate composed of (s).
  • the term "fermentation” refers to a process in which a bacterium or yeast decomposes an organic material, specifically, glucose, etc. using an enzyme it has.
  • the fermentation includes solid fermentation, liquid fermentation and the like, preferably solid fermentation.
  • solid fermentation means a method of propagating bacteria using the surface or the inside of the grain powder. Solid fermentation does not cause serious contamination like liquid fermentation because the growth of contaminating bacteria is limited by low water vitality.In case of enzyme production by liquid fermentation and solid fermentation with the same strain, enzyme by solid fermentation with high substrate affinity High activity.
  • the solid fermentation proceeds by using microorganisms, preferably bacteria or yeast, in the grain powder.
  • microorganisms preferably bacteria or yeast
  • the term “bacteria” refers to microorganisms of 0.1 mm or less that ferment as described above, and include Bacillus, Aspergilluls, and Leukonostock ( Leuconostoc genus, Lactobacillus genus, Weisella genus, Streptococcus genus, including but not limited to.
  • the bacterium may be a strain of the genus Bacillus.
  • the strain in the above Bacillus used in the solid-state fermentation preferably, non-pathogenic Bacillus be uniform, and, even more preferably Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Bacillus Lee Kenny Po Ms (Bacillus licheniformis), Bacillus toyoyi (Bacillus toyoi), Bacillus core tangerine balance (Bacillus coagulans), Bacillus poly flops mentee kusu (Bacillus polyfermenticus) and Bacillus amyl Lowry kwope sieon switch (Bacillus amyloliquefaciens)
  • Bacillus strain is selected from the group consisting of a K2G days Can be.
  • the fermentation may be carried out at a temperature of 30 °C to 45 °C, preferably 30 °C to 40 °C, most preferably 37 °C.
  • the bacteria used for solid fermentation may be lactic acid bacteria.
  • lactic acid bacteria refers to a bacterium that collectively obtains energy by fermenting sugars and generates a large amount of lactic acid.
  • lactic acid bacteria refers to the genus Lactobacillus and the genus Lactococcus. , The genus Leuconostoc, the genus Pediococcus and the genus Bifidobacterium (Bifidobacterium).
  • the term lactic acid bacteria may be included in the lactic acid bacteria even if the microorganisms belonging to other genera because they are not a term indicating the taxonomic location of the bacteria.
  • the lactic acid bacteria may be a strain of the genus Lactobacillus.
  • the strain of the genus Lactobacillus is Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ), Lactobacillus vulgaricus ( Lactobacillus bulgaricus ), Lactobacillus casei ( Lactobacillus casei ) and Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis ) may be at least one Lactobacillus strain selected from the group consisting of.
  • the fermentation may be carried out at a temperature of 30 °C to 45 °C, preferably 30 °C to 40 °C, most preferably 37 °C.
  • the method may further include adjusting the acidity to optimally grow bacteria in the grain powder by adding a basic solution to the grain powder prior to the enzyme treatment.
  • the acidity for optimal growth of the bacterium may be pH 6-7, and the acidity for optimal growth may be pH 5-7 if the bacterium is Lactobacillus, a lactic acid bacterium. have.
  • the basic solution may be an aqueous solution having a pH greater than 7, for example, NaOH solution, KOH solution, NH 4 OH solution, and the like, and preferably NaOH solution.
  • the concentration of NaOH solution used in the present invention may preferably be 1% to 2%.
  • the NaOH solution used in the present invention is a suitable amount such that the moisture of the grain powder, preferably corn gluten, is about 40% to 50%, preferably 41% to 45%, most preferably 43% after the solution is added. Can be used.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of enzymatically treating grain powder to decompose structural carbohydrates; And it provides a method for concentrating the protein in the grain powder comprising the step of inoculating the grain powder with yeast.
  • yeast used in the present invention is a microorganism used for various fermentations, Saccharomyces, Pichia, Candida, and Schizosaccharomyces. ) Genus and the like, but is not limited thereto. According to one embodiment of the invention, the yeast may be yeast of the genus Saccharomyces.
  • Saccharomyces genus yeast used for solid fermentation is Saccharomyces Carlsbergensis
  • the fermentation can be carried out at a temperature of 20 °C to 40 °C, preferably 25 °C to 35 °C, most preferably 30 °C, yeast 24 because the growth rate is slow compared to bacteria
  • the fermentation can take place from hours to 72 hours, preferably from 36 hours to 60 hours, most preferably from 48 hours.
  • the enzyme treatment and fermentation process may be performed without adjusting the pH of the grain powder.
  • the step of enzymatically treating the grain powder to decompose the structural carbohydrate proceeds prior to the step of inoculating the grain powder with bacteria, yeast or lactic acid bacteria or fermentation, or the grain
  • the powder may proceed at the same time as the step of inoculating bacteria, yeast or lactic acid bacteria and fermentation, whether or not at the same time does not significantly affect the results of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides a grain powder in which the protein is prepared by the method of concentrating the protein in the grain powder.
  • the "protein-enriched grain powder” may be interpreted to mean a grain powder having an increased protein content ratio compared to the grain powder before fermentation through the enzyme reaction and fermentation using bacteria or yeast.
  • Another aspect of the invention provides a feed additive comprising a grain powder wherein the protein is concentrated.
  • the "feed additive” refers to a substance added to the feed for improving the productivity or health of the target organism.
  • the feed additives may be prepared in various forms known in the art, and may be used individually or in combination with conventionally known feed additives.
  • the feed additive may be added to the feed at an appropriate composition ratio, the composition ratio may be easily determined in view of the common knowledge and experience in the art.
  • the feed additive of the present invention may be added to animal feeds such as chickens, pigs, monkeys, dogs, cats, rabbits, cows, sheep, goats, but is not limited thereto.
  • the method of concentrating the protein in the grain powder by increasing the water-soluble sugar content in the raw material by enzymatic treatment of the grain powder, the increased water-soluble sugar is removed through inoculation and fermentation process of bacteria or yeast As a result, the protein is concentrated, thereby increasing the effect of increasing the protein content ratio, and improving the performance of the grain powder as a protein source.
  • Figure 2 shows sugar analysis HPLC chromatograms of corn gluten for enzyme treated and untreated groups.
  • Figure 3 shows the time-dependent proteolysis confirmed by SDS-PAGE in the enzyme treatment group and the non-treatment group inoculated with Bacillus.
  • Figure 4 shows the proteolytic degree confirmed by SDS-PAGE in the enzyme treatment group and the non-treatment group at the time of fermentation of yeast.
  • Figure 5 shows the proteolytic degree confirmed by SDS-PAGE in the enzyme treatment group and non-treatment group at the time of inoculation of lactic acid bacteria.
  • the present inventors intended to use corn gluten as a raw material for solid fermentation, and to this end, the level of water-soluble sugar content available for microbial fermentation was measured.
  • Corn gluten was dissolved in water to make a 10% solution and extracted for 3 hours at 60 °C. The obtained extract was centrifuged (8000 rpm, 10 minutes), the supernatant was collected and filtered through a filter paper (Whatman No. 2). Activated carbon was treated in the filtrate and reacted at 60 ° C. for 30 minutes, filtered through a filter paper, and the ionic substance was removed through ion exchange (cation, anion) resin treatment. HPLC analysis determined the water soluble sugar content of the final sample.
  • the water-soluble sugar content in the corn gluten was very low, about 0.4%, and thus, the synergistic effect of the protein content ratio due to the microbial fermentation was estimated to be very small (see Table 1 below).
  • Example 1 After confirming that the microbial content in the corn gluten raw material is available through Example 1 is very small, through the enzyme treatment was to increase the components available for the microorganism. Prior to enzyme screening, the structural carbohydrates in corn gluten were decomposed to identify the major monosaccharides of the carbohydrates of corn gluten and to estimate the target substrate of enzyme.
  • Structural carbohydrates of corn gluten are standard substances (glucose, xylose, galactose, arabinose, mannose) according to the NREL (National Renewable Energy Laboratory) component analysis method. ), Fructose) and corn gluten raw material (3 iterations of the same raw material) were prepared, 0.3 g of each glass tube was added, and 3 ml of 72% sulfuric acid was added, followed by a 30 ° C. water bath. Acid hydrolysis was carried out for 2 hours. Stir with a glass rod at 10-20 minute intervals. 4 ml of distilled water was added to the acid hydrolyzate test tube, and distilled water was added to another container so that the total weight was 80 g.
  • the primary hydrolyzate as secondary hydrolysis was hydrolyzed for 1 hour in an autoclave at 121 ° C.
  • the secondary hydrolyzate was cooled and neutralized by addition of calcium carbonate.
  • Repeated acid hydrolyzed corn gluten samples were analyzed by the same method as described above.
  • the main monosaccharide is the glucose component (see Table 2 and FIG. 1 below), which can be assumed that most of the structural carbohydrate constituting the corn gluten is starch or cellulose.
  • the amount of water soluble sugars available to microorganisms in corn gluten is very low. Therefore, when the pre-treatment of glucoamylase that can decompose the main carbohydrate component of the corn gluten was confirmed the sugar component change of the corn gluten, the experimental method was the same as in Example 1.
  • Example 4 Composition of solid fermentation environment
  • the pH of corn gluten is less than 4, so the bacillus strain cannot grow.
  • the optimal pH of Bacillus growth was to be titrated to 6-7.
  • starch degrading enzyme treatment increased the water-soluble sugar content in corn gluten.
  • starch degrading enzymes in the market differ in enzyme activity and reaction conditions, there are differences in starch decomposition effects, water soluble sugar content levels, and protein elevation due to solid fermentation.
  • starch degrading enzymes suitable for protein concentration in corn gluten were selected through enzyme screening.
  • Enzyme screening was performed by varying the enzyme addition time and reaction temperature according to the characteristics of each enzyme.
  • Glucoamylase treated group and mesophilic ⁇ -amylase treated group was added to 2% NaOH solution to corn gluten to adjust the moisture to about 43%, and then heat-treated at 100 °C for 30 minutes. After the heat-treated corn gluten was allowed to cool, each enzyme was treated with 0.1% and reacted at 60 ° C. for 1 hour.
  • thermophilic ⁇ -amylase treated group was adjusted to about 43% moisture by adding 2% NaOH solution to corn gluten, 0.1% of enzyme, and then heat-treated at 100 ° C. for 30 minutes, and a separate enzyme reaction time after heat treatment Did not leave.
  • Bacillus amyloliquefaciens K2G Bacillus amyloliquefaciens , Accession No. KCCM11471P, Patent Registration No. 10-1517326
  • Bacillus amyloliquefaciens K2G Bacillus amyloliquefaciens , Accession No. KCCM11471P, Patent Registration No. 10-1517326
  • the dried fermented product was ground and then pulverized to determine the amount of protein using a Kjeldahl digestor (see Table 5 below).
  • Example 5 the synergistic effect of protein by glucoamylase and solid fermentation after 24 hours of fermentation was evident.
  • the growth pattern, water change, protein elevation, protein degradation and solubility of microorganisms were measured. Fermentation was carried out in the same manner as in Example 5, and the experimental group was divided into glucoamylase 0.5% treated group and the enzyme untreated group, and the samples were analyzed every 4 hours (see Table 6 below).
  • Corn gluten without enzyme treatment resulted in an increase of about 2.5% in protein content by fermentation by microorganisms.
  • corn gluten fermented after enzyme treatment increased the protein content by about 8%. It was determined that the starch contained in the corn gluten raw material was degraded to glucose due to the enzyme treatment and the protein content ratio was increased as the protein was used as the glucose component was used during the growth of Bacillus bacteria. At this time, when the pH of the corn gluten was adjusted to the level at which the microorganisms can grow regardless of the enzyme treatment, the number of viable cells was the same level. However, in order to further increase the protein content of corn gluten enzyme treatment can be used as a useful method.
  • the crude protein (DS content) of the corn gluten raw material is 71.7%, and according to Example 1, the water-soluble sugar content used for microbial growth is 0.4%, the protein elevation is about when water-soluble sugar is used and the protein is still present. Only 0.3%.
  • the starch content in the fermented products of the enzyme-untreated group showed a clear decrease compared to the corn gluten raw material. Even if the enzyme is not treated with corn gluten, the higher protein content ratio compared to the water-soluble sugar content contained in the corn gluten is presumed to be due to the activity of amylase produced by the strain itself during microbial fermentation. This is expected to have a positive effect on raising the protein content ratio when fermented by applying a high amylase activity.
  • the present invention relates to a method of increasing the protein content of corn gluten by simultaneously performing an enzyme pretreatment and a microbial fermentation process. If the fermentation proceeds immediately after the enzyme treatment without a separate enzymatic reaction, the high protein cornification process and manufacturing process of corn gluten will not only be more simple but also reduce the manufacturing cost. In order to confirm this, the fermentation was carried out in the same manner as in Example 5, but the reaction was carried out at 60 ° C. for 1 hour after the addition of the enzyme and the necessity of a separate enzyme reaction time through inoculation of the microorganism immediately without a separate enzyme reaction time It was confirmed.
  • Enzyme Reaction Hours moisture(%) Viable cell count (CFU / g) Protein (%, ds) Protein lift (%) Enzyme reaction 0 45.86% 1.45.E + 07 72.75 - 16 37.69% 6.85.E + 09 78.88 7.93 20 33.97% 1.39.E + 10 79.36 8.41 Enzyme reaction 0 46.47% 2.95.E + 07 73.71 - 16 34.14% 7.25.E + 09 79.67 8.58 20 30.84% 6.15.E + 09 79.24 8.15
  • corn gluten is a by-product of the process of producing corn starch
  • the protein content of corn gluten may vary according to the yield of corn starch. That is, the lower the protein content of the corn gluten may be relatively higher starch content, thereby increasing the protein content ratio by the microbial fermentation as the content of glucose decomposed by the starch degrading enzyme increases.
  • Table 9 below shows the results of fermentation using corn gluten raw material having 66% and 70% protein, respectively. When fermented under the same conditions as 0.1% glucoamylase and 10% Bacillus inoculation, in addition to the raw protein, corn gluten, which is 66% of the raw protein, showed higher protein gain.
  • Lactobacillus plantarum was used for the lactic acid bacteria fermentation. Water or 2% NaOH was added to corn gluten in the same manner as Bacillus fermentation to set the moisture to about 43%. Lactic acid bacteria were originally grown under acidic and neutral conditions, but L. plantarum did not grow well with corn gluten, an acidic ingredient. Both ingredients of gluten were used for fermentation. Heat treatment was performed at 100 ° C. for 30 minutes in the same manner as Bacillus and yeast fermentation, and after cooling, glucoamylase was added to the enzyme treated group to 0.5% of the raw material and the enzyme was not added to the untreated enzyme group. L. plantarum culture was inoculated 10% compared to the raw material and anaerobic fermentation was carried out at 37 °C, lactic acid bacteria were also fermented up to 48 hours because the growth rate is slower than Bacillus.
  • the main technical value of the present invention lies in a method of converting starch present in corn gluten into water-soluble sugars through an enzymatic reaction and converting it to growth by utilizing microorganisms.
  • Bacillus and yeast consumed sugars due to the aerobic growth of microorganisms, and the protein was converted to CO 2 , and protein was concentrated.
  • lactic acid bacteria produced organic acids even when sugars were consumed and grown due to anaerobic fermentation. There was no effect of concentration.
  • lactic acid bacteria are highly valued as probiotics due to the characteristics of organic acids produced.To date, lactic acid bacteria have limited metabolism of organic acids due to the lack of water-soluble sugars available for fermentation when using corn gluten as a raw material. However, it was possible to increase the metabolism of lactic acid bacteria through starch decomposition, the core technology of the present invention.
  • Peptidation of corn gluten protein by Bacillus fermentation may facilitate digestion upon feed intake.
  • yeast and lactic acid bacteria but protein degradation did not occur, but functional components such as beta glucan present in the cell wall of the yeast has an immunological function, and lactic acid bacteria may act as probiotics, so it is estimated that the feed material may be added.

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Abstract

본 발명은 곡물 분말 내의 단백질을 농축하기 위한 방법, 상기 방법에 의하여 제조된 단백질이 농축된 곡물 분말, 및 상기 단백질이 농축된 곡물 분말을 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에 따른 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법에 따르면, 곡물 분말을 효소 처리함으로써 원료 내 수용성 당 함량이 증가하고, 박테리아 또는 효모의 접종 및 발효 과정을 통하여 증가한 수용성 당이 제거됨에 따라 단백질이 농축되어 단백질 함량비의 증가 효과를 상승시키고, 곡물 분말의 단백질원으로서의 성능을 개선할 수 있다.

Description

곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법
본 발명은 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법, 상기 방법에 의하여 제조된 단백질이 농축된 곡물 분말, 및 상기 단백질이 농축된 곡물 분말을 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법은 곡물 분말에 효소를 처리하여 구조탄수화물을 분해하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법에 관한 것이다.
곡물은 에너지 함량이 높아 사료 효율이 높고 조섬유 함량이 낮아 소화율이 좋으므로, 가축용 사료로 널리 사용되고 있다. 그러나, 곡물 사료는 단백질 및 아미노산의 조성이 낮으므로, 균형적인 영양을 위하여 이를 보충하는 급여가 필수적으로 요구된다. 이러한 단백질 공급원으로서 어분, 탈지분유, 육분, 혈분 등 동물성 단백질원과 대두, 채종, 아마 등 식물성 단백질원이 사용된다. 식물성 단백질원 중 하나인 옥수수글루텐은 옥수수전분 제조과정의 부산물로서, 단백질 함량이 높은 어분과 함량이 유사(일반 식물성 단백질원의 약 3배)하고 가격이 저렴하여 사료의 단백질 공급원으로 널리 사용되고 있다.
선행 연구에 따르면, 미생물의 단백질 분해효소(protease) 또는 시판효소를 통하여 옥수수글루텐 단백질의 펩타이드화가 이루어진다. 또한, 옥수수글루텐에 미생물을 접종함으로써 단백질이 저분자 펩타이드로 분해됨과 동시에 단백질 함량비가 미량 상승한다는 것이 개시된 바 있다.
그러나, 원료 내에 포함된 수용성 당 함량이 부족하기 때문에, 이와 같은 옥수수글루텐의 발효에서의 단백질 함량비 상승 효과는 약 2% 내지 3%에 불과하였으며, 이로 인하여 옥수수글루텐의 고체발효는 주요 단백질의 펩타이드화 이외에 큰 이점이 없었다.
따라서, 본 발명에서는 옥수수글루텐에 함유된 비단백성분을 효소처리 및 미생물을 통하여 제거함으로써 옥수수글루텐의 단백질 함량비 향상에 기여하고, 상업적으로 판매되고 있는 어분을 대체할 수 있는 수준의 고단백 소재 제조 방법을 제시하였다.
본 발명의 일 양상은 곡물 분말을 효소 처리하여 구조탄수화물을 분해하는 단계를 포함하는 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 곡물 분말을 효소 처리하여 구조탄수화물(structural carbohydrate)을 분해하는 단계; 및 상기 곡물 분말에 박테리아를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "곡물 분말(grain powder)"은 곡물, 구체적으로는 옥수수, 수수, 쌀, 대두, 사탕무, 목화씨, 들깨 등을 건조하여 분쇄한 것을 의미하며, 순수 곡물을 타 공정에 사용한 후 남은 잔여물을 건조하여 분쇄한 것, 구체적으로 옥수수글루텐(corn gluten), 면실박(cotton seed meal), 카폭박(kapok seed meal), 임자박(perilla meal), 탈피대두박(dehulled soybean meal) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 이용되는 곡물 분말은 동일한 지역에서 생산된 동일한 종류의 곡물 분말을 이용하는 것이 바람직하나, 곡물 분말의 품질 차이가 본 발명의 결과에 큰 영향을 미치는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 곡물 분말은 옥수수글루텐일 수 있다. 상기 옥수수글루텐은 옥수수로부터 전분을 제조하는 과정에서 원료에서 대부분의 전분과 배아를 뽑아내고 옥수수 겨를 분리시킨 후 남은 것을 탈수 건조시킨 황색 분말로서, 옥수수전분 제조과정에서 발생하는 잔유물에 해당한다. 상기 옥수수글루텐은 약 35% 내지 65%의 단백질을 함유하고 있으며, 일반 사료의 3배 정도의 단백질을 함유하고 있어 사료의 단백질 공급원으로 사용되고 있다.
본 발명에서 "효소(enzyme)"는 곡물 분말 중의 구조탄수화물을 분해하는 역할을 하는 효소를 의미하는 것으로, 바람직하게는 전분 분해 효소, 셀룰로오스 분해 효소(셀룰라아제, cellulase), 헤미셀룰로오스 분해 효소(헤미셀룰라아제, hemicellulase) 및 펙틴 분해 효소(펙티나아제, pectinase)로 이루어진 군으로부터 선택된 효소일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 전분 분해 효소는 아밀라아제(amylase) 또는 글루코아밀라아제(glucoamylase), 구체적으로는 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아이소아밀라아제(isoamylase) 및 글루코아밀라아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소일 수 있으며, 바람직하게는 α-아밀라아제 또는 글루코아밀라아제, 더욱 바람직하게는 글루코아밀라아제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 효소는 효소 스크리닝을 통하여 선택되는 것일 수 있다. 일반적으로, 시중에 유통되는 효소는 효소 활성 및 반응 조건 등이 상이하므로, 효소 스크리닝을 통하여 원료물질인 곡물 분말에 최적인 효소를 선택할 수 있다. 효소 스크리닝은 실험 과정 중 (i) 효소의 종류, (ii) 효소의 첨가 시점 및 (iii) 반응 온도 등을 달리하여 각 효소를 발효시키고, 일정 시간 간격으로 샘플 내 조단백질의 양을 측정함으로써, 주어진 조건에서 최종 단백질의 농축 효과가 가장 높은 효소를 선택하는 방법으로 진행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 효소는 상기 곡물 분말 100 중량부에 대하여 0.1 내지 1 중량부만큼 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "구조탄수화물(structural carbohydrate)"은 식물 세포의 세포벽을 구성하는 전분(starch), 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 펙틴(pectin) 등과 같은 이용성이 낮은 탄수화물을 의미하며, 바람직하게는 전분일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 곡물 분말 중에 존재하는 구조탄수화물의 종류는 구조탄수화물을 산(acid) 등을 이용하여 가수분해하여 구조탄수화물을 단당류 형태로 만들어 검출하고, 그 결과를 이용하여 그 단당류(들)로 구성된 구조탄수화물의 종류를 역으로 추측함으로써 알아낼 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "발효(fermentation)"는 박테리아 또는 효모가 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물, 구체적으로는 글루코오스 등을 분해시키는 과정을 의미한다. 상기 발효는 고체발효, 액상발효 등을 포함하며, 바람직하게는 고체발효이다.
상기 "고체발효"는 곡물 분말의 표면 또는 내부를 이용하여 균을 번식시키는 방법을 의미한다. 고체발효는 낮은 수분 활력에 의해 오염균의 생장이 제한되므로 액상발효처럼 심각한 오염을 유발하지 않으며, 동일 균주로 액상발효와 고체발효로 효소를 생산하는 경우 기질 친화성이 높은 고체발효에 의한 효소가 높은 활성을 나타낸다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 고체발효는 곡물 분말에 미생물, 바람직하게는 박테리아 또는 효모를 이용함으로써 진행된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "박테리아(bacteria)"는 상기와 같이 발효 작용을 하는 0.1mm 이하의 미생물(microorganism)을 의미하며, 바실러스(Bacillus) 속, 아스퍼질러스(Aspergiluls) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 바이셀라(Weisella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 박테리아는 바실러스 속의 균주일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 고체발효에 사용되는 상기 바실러스 속의 균주는, 바람직하게는, 비병원성 바실러스 균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 토요이(Bacillus toyoi), 바실러스 코어귤런스(Bacillus coagulans), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) 및 바실러스 아밀로리쿼페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) K2G로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바실러스 균주일 수 있다. 상기 발효는 30℃ 내지 45℃, 바람직하게는 30℃ 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 고체발효에 사용되는 박테리아는 유산균일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유산균(lactic acid bacteria)"은 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 젖산을 생성하는 세균을 총칭하는 용어로, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코쿠스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코쿠스(Pediococcus) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 유산균이라는 용어는 박테리아의 분류학적인 위치를 가리키는 용어가 아니기 때문에 분류학적으로 다른 속에 속하는 미생물이라고 하더라도 유산균에 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 속의 균주일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 락토바실러스 속의 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 락토바실러스 균주일 수 있다. 상기 발효는 30℃ 내지 45℃, 바람직하게는 30℃ 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 효소 처리 이전에 곡물 분말에 염기성 용액을 첨가하여 상기 곡물 분말에서 박테리아가 최적 성장할 수 있는 산도로 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 박테리아가 바실러스 균인 경우에는 상기 박테리아가 최적 성장할 수 있는 산도는 pH 6 내지 7일 수 있으며, 상기 박테리아가 유산균인 락토바실러스인 경우에 최적 성장할 수 있는 산도는 pH 5 내지 7일 수 있다.
상기 염기성 용액은 pH가 7 초과인 수용액으로서, 예를 들어, NaOH 용액, KOH 용액, NH4OH 용액 등일 수 있으며, 바람직하게는 NaOH 용액이다. 본 발명에 사용되는 NaOH 용액의 농도는 바람직하게는 1% 내지 2%일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 NaOH 용액은 용액 첨가 후 곡물 분말, 바람직하게는 옥수수글루텐의 수분이 약 40% 내지 50%, 바람직하게는 41% 내지 45%, 가장 바람직하게는 43%가 되기에 적절한 양을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 곡물 분말을 효소 처리하여 구조탄수화물을 분해하는 단계; 및 상기 곡물 분말에 효모를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "효모(yeast)"는 각종 발효에 이용되는 미생물로, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 칸디다(Candida) 속, 스키조사카로마이세스(schizosaccharomyces) 속 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 효모는 사카로마이세스 속의 효모일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 고체발효에 사용되는 사카로마이세스 속 효모는 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces Carlsbergensis)인 것이 바람직하며, 상기 발효는 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃내지 35℃, 가장 바람직하게는 30℃의 온도에서 수행될 수 있고, 효모는 생육속도가 박테리아에 비해 느리기 때문에 24시간 내지 72시간, 바람직하게는 36시간 내지 60시간, 가장 바람직하게는 48시간 발효할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 효모는 산성 조건에서 충분히 생육할 수 있기 때문에 곡물 분말의 pH를 조정하지 않고, 효소 처리 및 발효 과정을 진행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 곡물 분말을 효소 처리하여 구조탄수화물(structural carbohydrate)을 분해하는 단계는 상기 곡물 분말에 박테리아, 효모 또는 유산균을 접종하여 발효시키는 단계에 앞서 진행되거나, 또는 상기 곡물 분말에 박테리아, 효모 또는 유산균을 접종하여 발효시키는 단계와 동시에 진행될 수 있으며, 동시에 진행되는지 여부는 본 발명의 결과에 큰 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 다른 양상은 상기 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법에 의하여 제조된 단백질이 농축된 곡물 분말을 제공한다.
상기 "단백질이 농축된 곡물 분말"은 상기 효소 반응 및 박테리아 또는 효모를 이용한 발효를 통하여 발효 전 곡물 분말과 비교하여 단백질 함량비가 증가한 곡물 분말을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 단백질이 농축된 곡물 분말을 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
상기 "사료 첨가제"는 대상 생물의 생산성 향상 또는 건강 증진을 위하여 사료에 첨가되는 물질을 의미한다. 상기 사료 첨가제는 당업계에 공지된 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 개별적으로 사용되거나 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 적절한 조성비로 사료에 첨가될 수 있으며, 조성비는 당해 분야의 상식과 경험에 비추어 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제는 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 염소 등의 동물용 사료에 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따른 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법에 따르면, 곡물 분말을 효소 처리함으로써 원료 내 수용성 당 함량이 증가하고, 박테리아 또는 효모의 접종 및 발효 과정을 통하여 증가된 수용성 당이 제거됨에 따라 단백질이 농축되어 단백질 함량비의 증가 효과를 상승시키고, 곡물 분말의 단백질원으로서의 성능을 개선할 수 있다.
도 1은 옥수수글루텐 구조탄수화물 분해물의 HPLC 크로마토그램(chromatogram)을 나타낸다.
도 2는 효소 처리군 및 비처리군에 대한 옥수수글루텐의 당 분석 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 바실러스를 접종하여 발효시에 효소 처리군 및 비처리군에서 SDS-PAGE로 확인한 시간별 단백분해도를 나타낸다.
도 4는 효모를 접종하여 발효시에 효소 처리군 및 비처리군에서 SDS-PAGE로 확인한 시간별 단백분해도를 나타낸다.
도 5는 유산균을 접종하여 발효시에 효소 처리군 및 비처리군에서 SDS-PAGE로 확인한 시간별 단백분해도를 나타낸다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 옥수수글루텐 원료 분석
본 발명자들은 옥수수글루텐을 고체발효의 원료로 사용하고자 하였으며, 이를 위해 원료 내 미생물 발효에 이용가능한 수용성 당 함량의 수준을 측정하였다.
옥수수글루텐을 물에 녹여 10% 용액을 만들고, 60℃에서 3시간 동안 추출하였다. 수득한 추출액을 원심분리(8000rpm, 10분)하여 상등액을 수거하여 여과지(Whatman No.2)로 여과시켰다. 여과액에 활성탄을 처리하여 60℃에서 30분 동안 반응시키고 여과지로 여과한 후, 이온교환(양이온, 음이온) 수지 처리를 통하여 이온성 물질을 제거하였다. HPLC 분석을 통하여 최종 샘플의 수용성 당 함량을 측정하였다.
그 결과, 옥수수글루텐 내 수용성 당 함량은 약 0.4% 수준으로 매우 낮으며, 이로 인해 미생물 발효에 따른 단백질 함량비 상승효과는 매우 미미할 것으로 추정되었다(하기 표 1 참조).
성분 글루코오스 프룩토오스 수크로오스 총량
함량(%) 0.12 0.26 0.02 0.4
실시예 2. 옥수수글루텐의 구조탄수화물 추정
실시예 1을 통해 옥수수글루텐 원료 내 미생물이 활용가능한 수용성 당 함량이 매우 적다는 것을 확인한 후, 효소처리를 통하여 미생물이 활용가능한 성분을 증가시키고자 하였다. 효소 스크리닝 전, 옥수수글루텐 내 구조탄수화물을 분해하여 옥수수글루텐을 구성하고 있는 탄수화물들의 주요 단당류를 확인하고 효소의 타겟 기질을 추정하고자 하였다.
옥수수글루텐의 구조탄수화물은 NREL(National Renewable Energy Laboratory)의 성분분석 방법에 따라, 표준물질(글루코오스(glucose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose), 아라비노오스(arabinose), 만노오스(mannose), 프룩토오스(fructose))와 옥수수글루텐 원료(동일원료 3반복 분석)를 준비하여 각각의 해당 유리 시험관에 0.3g씩 넣고 72% 황산 3ml를 첨가한 후, 30℃ 수조(water bath)에 넣어 2시간 동안 산(acid) 가수분해를 시켰다. 10분 내지 20분 간격으로 유리막대로 저어주었다. 산 가수분해물 시험관에 증류수 4ml를 첨가하고, 다른 용기에 옮긴 후 총 무게가 80g이 되도록 증류수를 첨가하였다. 2차 가수분해로서 1차 가수분해물을 121℃의 오토클레이브(autoclave)에서 1시간 동안 가수분해시켰다. 2차 가수분해물을 냉각시킨 후 탄산칼슘을 첨가하여 중화시켰다. 반복하여 산 가수분해한 옥수수글루텐 샘플을 상기와 같은 방법을 통해 분석하였다.
옥수수글루텐의 구조탄수화물을 모두 분해하고 HPLC로 분석한 결과, 주요 단당류는 글루코오스 성분으로서(하기 표 2 및 도 1 참조), 이는 옥수수글루텐을 구성하고 있는 대부분의 구조탄수화물이 전분 또는 셀룰로오스라는 추측을 할 수 있었다.
단당류 반복수 함량(%) 평균(%)
Glucose 1 19.376 19.318
2 19.222
3 19.355
실시예 3. 효소 처리에 따른 원료 성분 변화
옥수수글루텐에서 미생물이 활용할 수 있는 수용성 당 함량은 매우 적다. 이로 인해 옥수수글루텐의 주요 탄수화물로 추정되는 성분을 분해할 수 있는 글루코아밀라아제를 전처리 하였을 경우 옥수수글루텐의 당 성분 변화를 확인하였으며, 실험방법은 상기 실시예 1과 동일하게 진행하였다.
옥수수글루텐에 불용성 탄수화물을 분해할 수 있는 효소 중 전분 분해 효소인 글루코아밀라아제를 처리한 군에서 글루코오스 함량이 10배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 전분 분해 효소 비처리군에서는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 성분이 매우 적은 결과를 나타내었다(하기 표 3 및 도 2 참조).
　 글루코오스(%) 프룩토오스(%) 수크로오스(%) 전체(%)
옥수수글루텐 원료 0.61 0.26 0.00 0.88
효소처리 12.57 0.27 0.00 12.83
실시예 4. 고체발효 환경 조성
효소처리를 통하여 미생물 발효에 요구되는 탄소원 확보는 가능하였으나, 일반적으로 옥수수글루텐의 pH는 4 이하 수준이기 때문에 바실러스 균주가 생육할 수 없는 pH 조건이다. 본 실시예에서는 바실러스 균주를 접종하여 옥수수글루텐을 발효시키기 위하여 바실러스 생육의 최적 pH인 6 내지 7로 적정하고자 하였다.
먼저, 옥수수글루텐의 수분을 약 43%로 맞추어 각 농도별로 NaOH 용액을 첨가하고, 100℃에서 30분 동안 열처리를 한 후 pH를 측정하였다. NaOH 용액 농도에 따른 각각의 옥수수글루텐의 pH는 하기 표 4와 같으며, 2% NaOH 용액을 첨가하였을 때 바실러스의 생육 최적 pH로 조정할 수 있었다.
NaOH(%) 증자 후 pH
0 3.85
0.1 3.85
0.2 3.97
0.4 4.3
0.5 4.23
1 4.87
2 6.17
4 8.12
실시예 5. 효소 종류별 미생물에 의한 단백상승 효과 비교
상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, 전분 분해 효소처리는 옥수수글루텐 내 수용성 당 함량을 증가시켰다. 그러나 시중에 유통되고 있는 전분 분해 효소는 효소 활성 및 반응 조건 등이 상이하기 때문에 각 효소에 따라 전분 분해 효과 및 수용성 당 함량 수준, 고체발효에 의한 단백질 상승도에 차이가 나타난다. 이에 본 실시예에서는 효소 스크리닝을 통하여 옥수수글루텐 내의 단백질 농축에 적합한 전분 분해 효소를 선별하였다.
효소 스크리닝은 각 효소의 특성에 따라 효소 첨가 시점과 반응온도를 달리하여 실시하였다.
글루코아밀라아제(glucoamylase) 처리군과 중온성 α-아밀라아제(?-amylase) 처리군은 옥수수글루텐에 2% NaOH 용액을 첨가하여 수분을 약 43%로 맞춘 후, 100℃에서 30분 동안 열처리하였다. 열처리한 옥수수글루텐을 방냉시킨 후, 각각의 효소를 0.1%씩 처리하고, 60℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
고온성 α-아밀라아제 처리군은 옥수수글루텐에 2% NaOH 용액을 첨가하여 수분을 약 43%로 맞추고, 효소 0.1%를 첨가한 후, 100℃에서 30분 동안 열처리하였으며, 열처리 후 별도의 효소 반응 시간을 두지 않았다.
효소 반응이 완료된 각각의 옥수수글루텐에 바실러스 아밀로리쿼페시언스 K2G(Bacillus amyloliquefaciens , 수탁번호 KCCM11471P, 특허등록 제10-1517326호 참조) 10%(v/w 원료)를 각각 접종하고, 온도 37℃ 및 습도 95%의 항온항습기에서 24시간 동안 발효시켰다. 발효물을 건조시킨 후 분쇄하여 킬달(Kjeldahl) 분해장치로 단백질의 양을 측정하였다(하기 표 5 참조).
발효 결과, 각 효소별 생균수는 모두 유사하게 나타나는 반면, 단백질 상승도에서 확연한 차이를 나타내었다. 2% 용액 첨가 및 열처리 공정까진 동일하나 다만 효소를 처리하지 않은, 효소 비처리군은 미생물이 생육할 수 있는 기본 환경은 충족되었으나, 원료 내 이용할 수 있는 수용성 당 성분이 부족함에 따라 단백질 상승도가 약 2% 수준이었다. 또한, 각 효소에 의한 전분 분해 효과가 다르거나 반응 온도 및 시간이 불충분했기 때문에 효소별 발효 결과가 상이한 것으로 판단되었다. 이로써, 현 조건에서 옥수수글루텐의 전분 분해에 따른 단백질 상승도가 높은 효소로서 글루코아밀라아제가 선택되었다.
효소 시간(hr) 수분(%) 생균수(CFU/g) 조단백(%) 단백질상승도(%)
효소 비처리 0 46.01% 4.2.E+07 71.7 -
16 38.17% - 73.9 2.2
20 36.32% - 74.3 2.5
24 32.81% 9.2.E+09 73.9 2.2
글루코아밀라아제0.1% 0 46.34% 5.0.E+07 71.7 -
16 39.47% - 79.5 7.8
20 35.54% - 78.9 7.1
24 32.84% 7.4.E+09 78.7 7.0
고온성 α-아밀라아제 0.1% 0 45.97% 3.0.E+07 71.7 -
16 35.90% - 75.4 3.7
20 31.38% - 75.6 3.8
24 28.42% 9.7.E+09 75.7 4.0
중온성 α-아밀라아제 0.1% 0 45.97% 5.0.E+07 71.7 -
16 34.39% - 75.1 3.4
20 30.77% - 75.3 3.6
24 27.01% 1.4.E+10 75.8 4.0
실시예 6. 효소 처리 유무에 따른 발효 패턴 및 품질 비교
상기 실시예 5의 결과와 같이, 발효 24시간 후 글루코아밀라아제 및 고체발효에 의한 단백질 상승 효과는 분명히 나타났다. 추가적으로 단백질 상승도 이외에 글루코아밀라아제 처리가 발효 과정 및 발효 품질에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 미생물의 생육패턴, 수분변화, 단백질 상승, 단백질 분해도 및 용해도를 측정하였다. 발효는 상기 실시예 5와 동일하게 진행하였으며, 실험군은 글루코아밀라아제 0.5% 처리군과 효소 비처리군으로 나누어 4시간 단위로 샘플을 취하여 분석하였다(하기 표 6 참조).
효소를 처리하지 않은 옥수수글루텐에서는 미생물에 의한 발효로 단백질 함량비가 원료 대비 약 2.5% 증가하는 결과를 보였다. 반면, 효소 처리 후 발효한 옥수수글루텐에서는 단백질 함량비가 8% 가량 증가하였다. 이는 효소 처리로 인해 옥수수글루텐 원료 내에 함유된 전분이 포도당으로 분해되고 바실러스 균이 생육하는 과정에서 글루코오스 성분이 이용됨에 따라 상대적으로 단백질이 농축되면서 단백질 함량비 상승 효과가 나타나는 것으로 판단되었다. 이때, 효소 처리와 관계 없이 미생물이 생장할 수 있는 수준으로 옥수수글루텐의 pH를 조정한 경우 생균수는 동일한 수준으로 나타났다. 하지만, 더 나아가 옥수수글루텐의 단백질 함량비를 증가시키기 위해서는 효소 처리가 유용한 방법으로 이용될 수 있다.
옥수수글루텐 원료의 조단백(DS 함량)이 71.7%이고, 상기 실시예 1에 따르면 미생물 생육에 이용되는 수용성 당 함량은 0.4%이기 때문에, 만약 수용성 당이 이용되고 단백은 그대로 존재할 경우의 단백질 상승도는 약 0.3%뿐이다. 하지만 실제 단백질 상승도는 2%를 초과할 뿐만 아니라, 하기 실시예 8에 따르면 효소비처리군의 발효물에서 전분 함량은 옥수수글루텐 원료에 비해 명백히 감소한 것을 보였다. 옥수수글루텐에 효소를 처리하지 않더라도 옥수수글루텐에 함유된 수용성 당 함량 대비 단백질 함량비 상승이 더 높은 것은 미생물 발효시 균주 자체에서 생성되는 아밀라아제의 활성에 의한 것으로 추측된다. 이는 아밀라아제 활성이 높은 균주를 적용하여 발효시킬 경우에 단백질 함량비를 상승시키는 데에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 예상된다.
실험군 시간(hr) 수분(%) 생균수(CFU/g) 단백(%, ds) 단백질상승도(%)
효소 비처리 0 45.33% 2.6.E+07 70.51 0.09
4 44.06% 5.4.E+07 71.25 0.83
8 41.54% 4.2.E+09 71.65 1.23
12 37.84% 5.6.E+09 72.1 1.68
16 33.41% 3.5.E+09 72.72 2.3
20 29.83% 6.2.E+09 72.92 2.5
24 25.75% 7.9.E+09 72.77 2.35
효소 처리 0 46.54% 2.0.E+07 71.43 1.02
4 45.03% 2.4.E+07 72.77 2.35
8 43.53% 1.7.E+09 75.86 5.45
12 40.37% 4.3.E+09 77.88 7.47
16 36.85% 3.8.E+09 78.08 7.66
20 33.67% 5.1.E+09 77.89 7.47
24 30.07% 8.6.E+09 78.43 8.01
실시예 7. 효소 반응별 실험 결과 비교
본 발명은 효소 전처리와 미생물 발효 공정을 동시에 진행하여 옥수수글루텐의 단백질 함량을 높이는 방법에 관한 것이다. 별도의 효소반응 없이 효소 처리 후 바로 발효가 진행된다면 옥수수글루텐의 고단백화 과정 및 제조공정이 더 간편해질 뿐 만 아니라 제조원가를 절감할 수 있다. 이를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 발효를 진행하되, 효소 첨가 후 60℃에서 1시간 동안 반응시킨 것과 별도의 효소 반응시간 없이 바로 미생물을 접종한 것을 통하여 별도의 효소 반응 시간의 필요성 여부를 확인하였다.
실험 결과, 별도의 효소 반응 시간을 진행한 것(하기 표 7의 효소반응 유)과 하지 않은 것(표 7의 효소반응 무)의 단백질 상승도 차이는 거의 없었으며, 이는 별도의 효소 반응 시간 없이도 발효하는 동안 효소 반응이 충분히 일어난 것으로 판단되었다(하기 표 7 참조).
효소반응 유무 시간(hr) 수분(%) 생균수(CFU/g) 단백(%, ds) 단백질상승도(%)
효소반응 무 0 45.86% 1.45.E+07 72.75 -
16 37.69% 6.85.E+09 78.88 7.93
20 33.97% 1.39.E+10 79.36 8.41
효소반응 유 0 46.47% 2.95.E+07 73.71 -
16 34.14% 7.25.E+09 79.67 8.58
20 30.84% 6.15.E+09 79.24 8.15
실시예 8. 효소 농도별 전분 함량 및 단백질 함량비 비교
각 효소 농도에 따라 옥수수글루텐의 전분 함량 감소 및 단백질 함량비 상승의 관계를 확인하였다. 원료 내 전분은 효소를 처리하지 않더라도 미생물 발효에 의하여 일정 부분 감소되는 경향을 보였다. 또한, 처리하는 효소의 농도가 높아질수록 원료 내 전분 함량은 감소하고, 이에 따라 상대적으로 단백질 함량비는 증가하는 경향성을 확인할 수 있었다(하기 표 8 참조).
한편, 옥수수글루텐은 옥수수 전분을 생산하는 과정에서는 나오는 부산물로서, 옥수수전분 수율에 따라 옥수수글루텐의 단백질 함량도 달라질 수 있다. 즉, 옥수수글루텐의 단백질 함량이 낮을수록 상대적으로 전분 함량이 높을 수 있으며, 이로써 전분 분해 효소에 의해 분해되는 글루코오스의 함량이 증가함에 따라 미생물 발효에 의한 단백질 함량비 증가 효과가 더 커질 수 있다. 하기 표 9는 각각 단백질이 66% 및 70%인 옥수수글루텐 원료를 이용하여 발효시킨 결과이다. 원료 단백질 이외에 글루코아밀라아제 0.1%, 바실러스 10% 접종 등 동일 조건 하에서 발효시켰을 때, 원료 단백질 66%인 옥수수글루텐의 단백질 상승도가 더 높게 나타났다. 본 실험 결과는 각 원료의 전분가를 측정하지 않아 전분이 절대적으로 더 많다는 것을 수치로서 증명하기는 어려우나, 단백질이 적어 전분가가 더 높다면 효소에 의해 분해된 글루코오스 함량이 더 많으므로, 단백질 상승도가 더 높게 나타날 것임을 추측할 수 있다.
실험군 효소농도(%) 시간(hr) 수분(%) 생균수(CFU/g) 단백(%, ds) 단백질상승도(%) 포도당(%) 전분(%)
원료 - - - - 70.28 - 0.14 15.86
효소 비처리 0% 0 45.76% 2.00.E+07 - - - -
16 37.11% 8.20.E+09 72.61 2.33 - -
20 33.64% 1.07.E+10 72.63 2.36 - -
24 31.05% 8.75.E+09 72.67 2.39 0.25 10.75
효소처리 0.00% 0 45.76% 5.10.E+07 - - - -
16 35.49% 6.10.E+09 71.86 1.58 - -
20 32.35% 7.70.E+09 72.03 1.76 - -
24 29.99% 7.60.E+09 72.53 2.26 0.25 11.64
0.01% 0 46.00% 2.25.E+07 - - - -
16 36.91% 1.06.E+10 75.1 4.83 - -
20 31.90% 1.16.E+10 75.3 5.03 - -
24 29.74% 1.10.E+10 75.14 4.86 0.28 7.61
0.05% 0 46.43% 2.90.E+07 - - - -
16 38.45% 9.70.E+09 76.89 6.61 - -
20 34.50% 1.18.E+10 77.73 7.46 - -
24 30.49% 1.02.E+10 77.18 6.91 0.37 4.43
0.10% 0 46.24% 2.80.E+07 - - - -
16 37.41% 8.95.E+09 77.88 7.61 - -
20 33.92% 1.15.E+10 78.41 8.14 - -
24 30.62% 1.10.E+10 78.38 8.11 0.58 2.94
실험군 시간(hr) 생균수(CFU/g) 단백(%, ds) 단백질상승도(%)
원료단백질70% 0 5.05.E+07 - -
16 1.28.E+10 77.893 7.949
20 1.04.E+10 78.601 8.657
24 1.21.E+10 78.345 8.401
원료단백질66% 0 3.65.E+07 - -
16 1.08.E+10 74.713 8.855
20 1.17.E+10 75.089 9.231
24 1.43.E+10 74.989 9.131
실시예 9. 효모에 의한 옥수수글루텐의 발효성 확인
앞의 실시예를 통해 옥수수글루텐에서 바실러스의 발효성 및 효소 첨가에 따른 단백 상승효과를 검증하였다. 본 연구자들은 추가적으로 바실러스 이외에 효모의 옥수수글루텐 발효성을 확인함으로써 각 미생물에 따른 옥수수글루텐의 발효 특징을 비교하고자 하였다.
본 실험에서는 효모인 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces Carlsbergensis)를 이용하여 발효를 진행하였다. 바실러스 발효와 동일하게 옥수수글루텐에 물을 첨가하여 수분을 약 43%로 맞추었으며, 이를 100℃에서 30분 동안 열처리를 하였다. 열처리된 옥수수글루텐을 방냉 후, 효소 처리군에는 글루코아밀라아제를 원료 대비 0.5% 첨가하였고, 효소 비처리 군에는 효소를 첨가하지 않았으며, S. carlsbergensis 배양액을 원료 대비 10% 투입하였다. 그리고 배양액 접종물은 항온항습기(온도 30℃ 및 습도 95%)에서 48시간 동안 발효하였다. 해당 효모의 최적 생육 온도가 30℃이기 때문에 바실러스와는 다른 온도에서 발효를 진행하였으며, 바실러스에 비해 생육속도가 더 느리기 때문에 이를 고려하여 48시간까지 발효하였다.
효모는 산성조건에서 충분히 생육할 수 있다는 가정하에 pH를 조정하지 않고 효소 처리 유무에 따른 발효 결과만을 비교하였다. 그 결과 효모는 옥수수글루텐의 pH 조정없이 기본적으로 생육 가능하였으나, 효소 처리 유무에 따라 단백질 상승도 차이가 나타나는 것을 확인하였다. 효소를 처리하지 않은 옥수수글루텐에서는 미생물의 생장에 필요한 수용성 당함량이 적기 때문에 상대적으로 발효에 의한 단백 농축 효과가 거의 없어 단백질 상승도가 1% 미만이었다. 반면, 효소처리를 한 옥수수글루텐에서는 단백질 상승도가 9% 이상인 것을 확인할 수 있었다(하기 표 10 참조).
실험군 시간(hr) 수분(%) pH 생균수(CFU/g) 단백(%, ds) 단백질상승도(%)
효소 비처리 0 46.0% 3.92 6.0.E+06 71.76 -
24 41.4% 4.52 1.6.E+08 72.56 0.80
48 38.5% 4.63 3.0.E+08 71.92 0.16
효소처리 0 45.4% 3.97 8.0.E+06 71.76 -
24 39.7% 3.91 8.1.E+08 81.12 9.36
48 31.2% 3.86 8.6.E+08 81.13 9.37
실시예 10. 유산균에 의한 옥수수글루텐의 발효성 확인
앞의 실시예를 통해 바실러스 및 효모 발효 모두에서 글루코아밀라아제 효소 처리에 따른 단백 상승 효과를 확인할 수 있었다. 이에 본 연구자들은 바실러스 및 효모 이외에 유산균의 옥수수글루텐 발효성을 확인함으로써 각 미생물에 따른 옥수수글루텐의 발효 특징을 비교하고자 하였다.
본 유산균 발효에서는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 이용하였다. 바실러스 발효와 동일한 방법으로 옥수수글루텐에 물 또는 2% NaOH를 첨가하여 수분을 약 43%에 맞추었다. 유산균은 본래 산성, 중성 조건에서 성장하나, L. plantarum은 산성 원료인 옥수수글루텐에서 잘 성장하지 못하는 것으로 판단되어, pH를 조절하지 않은 채 물을 첨가한 옥수수글루텐과 더불어 중성으로 pH를 조절한 옥수수글루텐 두 가지 원료를 모두 발효에 이용하였다. 바실러스, 효모 발효와 동일한 방법으로 100℃에서 30분 동안 열처리하고, 방냉 후에 효소 처리군에는 글루코아밀라아제를 원료 대비 0.5% 첨가하고 효소 비처리군에는 효소를 첨가하지 않았다. L. plantarum 배양액을 원료 대비 10% 접종하고 37℃에서 혐기발효를 진행하였으며 유산균 역시 바실러스에 비해 생육속도가 느리기 때문에 48시간까지 발효하였다.
유산균 발효 결과, 유산균은 효소 첨가 유무와 관계없이 pH를 조정하지 않은 옥수수글루텐에서는 생육하지 못하는 것을 알 수 있었다. 반면 pH를 조정한 옥수수글루텐에서는 생균수가 증가하였으며, 이를 통하여 L. plantarum이 옥수수글루텐에서 생장하기 위해서는 pH 조정이 필수적인 것을 확인할 수 있었다. 또한 pH 감소 현상을 통해 유산균 발효에 의해 유기산이 생성되었음을 추정할 수 있었다. 하지만 효소 처리, pH 조정 여부와 상관없이 모든 실험군에서 단백상승량이 거의 없는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 혐기발효에 의해 단백 농축 효과가 없는 것으로 추정된다. 효소 처리군과 효소 비처리군에서 나타난 차이점은 pH 조정군에서 pH 감소가 더 크게 일어난다는 것이다. 효소 처리군에서는 유산균이 생육하기 위한 단당류 성분들이 더 많음에 따라 대사속도가 더 빠르고 유기산 생성량도 더 많았던 것으로 추정된다. 다만, 발효 24시간에 생성된 유기산에 의해 옥수수수글루텐의 pH가 유산균이 생육하기 어려운 수준으로 감소함에 따라, 효소 처리 및 pH 조정군의 발효 48시간 생균수가 감소한 것으로 보인다(하기 표 11 참조).
효소 유무 pH 조정 유무 시간(hr) 수분(%) pH 생균수(CFU/g) 단백(%,ds) 단백질상승도(%)
효소 비처리 조정 X 0 44.9% 3.9 1.1.E+08 71.76　 -
24 45.4% 3.93 10^5이하 71.32 -0.44
48 45.1% 3.92 10^3이하 71.48 -0.28
조정 O 0 44.6% 6.96 1.3.E+08 71.76　 -
24 44.8% 5.61 1.6.E+09 70.87 -0.89
48 46.2% 5.7 2.0.E+09 71.30 -0.46
효소처리 조정 X 0 45.0% 3.9 9.8.E+07 71.76 -
24 45.5% 3.92 10^5이하 72.03 0.27
48 45.6% 3.9 8.4.E+04 72.55 0.79
조정 O 0 44.9% 6.69 1.3.E+08 71.76 -
24 46.8% 4.37 2.8.E+09 72.53 0.77
48 45.1% 4.28 3.6.E+08 72.61 0.85
본 발명의 주요한 기술적 가치는 옥수수글루텐 내에 존재하는 전분질을 효소반응을 통해 수용성 당으로 전환하고, 이를 미생물들이 활용하여 생육으로 전환하는 방법에 있다. 바실러스 및 효모는 미생물의 호기적 생육특성으로 당을 소비하고 CO2로 전환하여 단백질이 농축되는 효과가 있었으나, 유산균은 혐기적 발효특성으로 인하여 당을 소비하고 생육을 하더라도 유기산을 생성하기 때문에 단백질이 농축되는 효과가 없었다. 하지만 유산균은 생성하는 유기산의 특성에 기인하여 프로바이오틱스(probiotics)로서 매우 높은 가치를 평가받고 있으며, 현재까지 옥수수글루텐을 원료로 이용시 발효로 이용할 수 있는 수용성 당의 부족으로 유산균은 대사에 따른 유기산 생성이 제한되었으나, 본 발명의 핵심 기술인 전분분해를 통해 유산균의 대사성을 높일 수 있었다.
실시예 11. 각 미생물별 발효에 따른 단백분해도 비교
단백질 상승효과 이외에 기타 지표들에서의 차이점을 확인하기 위하여 옥수수글루텐의 단백질 분해도를 SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE 분석에 이용된 샘플은 다음과 같은 방법으로 준비하였다.
각각의 시간별 발효물 약 100㎎을 8M 요소(urea) 용매에서 현탁(suspension)시키고 초음파분해(sonication)시킨 후, 원심분리(8000rpm, 10분)하여 추출하였다. 각 추출물은 BCA 정량법에 의해 단백질 함량비를 측정하고, SDS-PAGE상 동일 단백질량을 로딩(loading)하여 시간별 단백질 분해도 패턴을 확인하였다. SDS-PAGE에 사용한 마커의 크기는 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 및 10kDa 이다.
실험 결과에 따르면, 각 미생물별 특징에 따라 단백분해도의 차이를 보였다. 구체적으로, 단백분해효소(protease)를 생성하는 바실러스 군에서는 발효에 의해서 약 20kDa 수준으로 옥수수글루텐 원료 펩타이드가 분해되는 패턴을 보였다(하기 도 3 참조). 반면, 단백분해효소 생성능이 없는 효모 및 유산균에서는 효소 처리 또는 pH 조정 유무와 관계없이 발효 중 원료 내 펩타이드를 분해하지 못하는 것을 확인할 수 있었다(하기 도 4 및 도 5 참조).
바실러스 발효에 의한 옥수수글루텐 단백질의 펩타이드화는 사료 섭취시 소화를 더욱 용이하게 할 수 있을 것이다. 한편, 효모 및 유산균에서는 단백질 분해가 일어나지 않았지만, 효모의 세포벽에 존재하는 베타글루칸 등의 기능성 성분들은 면역기능성을 가지고 있고, 유산균은 프로바이오틱스로 작용할 수 있으므로 사료 소재의 기능성을 더할 수 있을 것으로 추정된다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 곡물 분말을 효소 처리하여 구조탄수화물(structural carbohydrate)을 분해하는 단계; 및
    상기 곡물 분말에 박테리아를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 효소 처리 이전에 염기성 용액을 첨가하여 상기 곡물 분말에서 상기 박테리아가 최적 성장할 수 있는 산도로 조절하는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 바실러스 속(genus) 균주인 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 토요이(Bacillus toyoi), 바실러스 코어귤런스(Bacillus coagulans), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) 및 바실러스 아밀로리쿼페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) K2G로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 유산균(lactic acid bacteria)인 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코쿠스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코쿠스(Pediococcus) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 방법.
  7. 곡물 분말을 효소 처리하여 구조탄수화물을 분해하는 단계; 및
    상기 곡물 분말에 효모를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 속(genus) 균주인 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 곡물 분말은 옥수수글루텐(corn gluten)인 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 발효는 고체발효인 것인 방법.
  11. 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 구조탄수화물은 전분(starch), 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose) 및 펙틴(pectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 효소는 α-아밀라아제(α-amylase) 또는 글루코아밀라아제(glucoamylase)인 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 효소는 상기 곡물 분말 100 중량부에 대하여 0.1 내지 1 중량부 만큼 처리하는 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제7항의 방법에 의하여 제조된 단백질이 농축된 곡물 분말.
  15. 제14항에 따른 단백질이 농축된 곡물 분말을 포함하는 사료 첨가제.
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