CN117625471A - 一种两步法微生物高效降解废弃羽毛的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种两步法微生物高效降解废弃羽毛的方法。该方法是将培养至对数生长期的微生物种子液转接到羽毛降解的培养基，先在适合微生物生长的温度下培养一定时间，再调整培养温度至50℃后进行两步法继续培养，获得羽毛降解液。该方法显著提高角蛋白酶活力和羽毛降解率，操作简单，易在含角蛋白废弃物的处理工艺中推广。本发明将推动废弃羽毛的高值化及绿色生物制造，促进畜禽养殖业循环经济的发展，产生重要的环境和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于畜禽养殖废弃物资源化利用技术领域，具体涉及了一种两步法微生物高效降解废弃羽毛的方法。
背景技术
近年来，随着经济的快速发展和人们生活水平的提高，现代畜禽养殖业规模化发展快速，但也产生了大量的废弃羽毛副产物。据统计，我国废弃羽毛的年总产量约为400万吨，而世界各国的年总产量更是在1000万吨以上。羽毛中角蛋白含量在90％以上，它是一种天然的高蛋白资源。因此，废弃羽毛可广泛应用在动物饲料、肥料、生物能源和医用材料等领域。然而，废弃羽毛处理不及时或不当极易产生恶臭气味，造成生态环境的污染与蛋白资源的浪费。
废弃羽毛的高值化利用是当前研究的前沿方向。然而，羽毛含有大量的氢键、二硫键和疏水作用使其难以被降解，这也是阻碍其资源化利用的主要因素。而废弃羽毛高值化利用的关键是将其降解或部分降解为含有疏松角蛋白、氨基酸和肽段的混合物。目前，传统的物理化学方法(如强酸强碱法、高温膨化法)存在着破坏羽毛中重要的氨基酸与污染环境等问题。因此，采用微生物法降解废弃羽毛并将其转化为氨基酸基或活性肽基的高附加值产品已成为绿色生物制造的研究热点之一。尽管目前具有降解羽毛功能的微生物不断被报道出来，但大多数微生物降解羽毛的时间较长，需要5天以上(甚至10天以上)，只有少数微生物的耗时在2天左右。这主要是因为羽毛结构含有多种化学键和共价键，需要多种蛋白酶的协同作用才可完全降解，但酶法降解羽毛需要多种蛋白酶的共同参与，成本高，很难大规模推广。大量的研究发现微生物产生的角蛋白酶在羽毛降解过程中发挥着重要作用，同时角蛋白酶在50℃时具有较高的酶活力。然而，多数微生物是在中常温(37℃左右)生长与降解羽毛的。因此，微生物的适宜生长温度与其角蛋白酶的最佳酶催化温度并不一致，这也是导致微生物降解羽毛效率低的一个原因。
对相关文献检索发现，国内外学者对有关角蛋白酶的性质与高表达的研究较多，但通过改变培养微生物的温度以平衡微生物的生长、角蛋白酶的分泌与角蛋白酶的酶活力，提高微生物在降解羽毛过程中角蛋白酶的酶活力，进而增强羽毛的降解尚未见报道。因此，为了提高微生物降解废弃羽毛的效率，采用一种温度改变的两步法提升微生物降解羽毛的方法对加快废弃羽毛的降解和绿色生物制造将产生重要的环境和经济效益。
发明内容
为克服以上问题，本发明提供了一种两步法微生物高效降解废弃羽毛及其应用。
本发明通过改变培养微生物的温度，使微生物的生长、角蛋白酶的分泌与角蛋白酶的酶活力各自达到最佳状态的一种平衡，提高微生物降解废弃羽毛过程中角蛋白酶的酶活力，增强羽毛的降解。
为实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
一种两步法微生物高效降解废弃羽毛的方法，是在微生物降解废弃羽毛过程中通过改变培养温度而提高废弃羽毛的降解效率。
优选，是将微生物种子液转接到羽毛降解的培养基，先在28～37℃和160～220rpm条件下培养5～40h，再调整培养温度至50℃后进行两步法继续培养，获得羽毛降解液。
优选，所述的羽毛降解的培养基，按质量分数计，包括NaCl 0.01～0.12％、KH2PO40.02～0.14％、K2HPO40.01～0.11％，废弃羽毛1.0％，pH为7.5～10。
优选，所述的微生物种子液是将微生物涂布在LB或YPD固体培养基上，在28～37℃静置培养12～24h，挑取菌落接种至相对应的液态培养基，在28～37℃和160～220rpm条件下培养至对数生长期，制备种子液。
优选，所述的将微生物种子液转接到羽毛降解的培养基是将种子液以体积比2.0～8.0％的接种量转接到羽毛降解的培养基中。
优选，所述的微生物是芽孢杆菌。
优选，所述的芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CICC10092。
本发明比较微生物降解废弃羽毛的效率、生物量及角蛋白酶的酶活力。采用差重法检测微生物对废弃羽毛的降解效率，确定改变温度的最适培养时间。采用分光光度法检测微生物菌体的生物量OD600，确定改变温度对微生物生长的影响。采用分光光度法检测微生物在降解废弃羽毛过程中角蛋白酶的酶活力(《饲料添加剂角蛋白酶活力的测定NY/T4362-2023》[2023])，分析角蛋白酶的酶活力随降解时间及温度升至50℃后的变化，确定温度改变的两步法对角蛋白酶酶活力的影响。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)微生物降解废弃羽毛过程中改变培养温度，提高废弃羽毛的降解效率，操作简单，易于推广。
(2)角蛋白酶活力显著提高约141％，废弃羽毛的降解率提高15％左右。
(3)降解废弃羽毛的微生物为适用于生物饲料和肥料的微生物，降解废弃羽毛的混合液可直接或添加辅料用于制备饲料和肥料。
(4)该方法显著提高角蛋白酶活力，还可以应用于其它含有角蛋白的废弃物的降解处理工艺中。
附图说明
图1不同的培养时间改变培养温度对芽孢杆菌降解废弃羽毛效率的影响。
图2不同的培养时间改变培养温度对芽孢杆菌生物量的影响。
图3不同的培养时间改变培养温度对芽孢杆菌产角蛋白酶的酶活的影响。
具体实施例
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步解释，但不对本发明构成任何限定。
实施例1在不同培养时间升高温度至50℃后微生物降解废弃羽毛的比较
本实施例以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CICC10092为例进行说明，该菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
在LB固体培养基上活化CICC10092菌株，在37℃静置培养16h。挑取CICC10092菌的单菌落接种到至LB液态培养基，在37℃和200rpm条件下培养12h，获得种子液。以体积比5.0％的接种量将种子液转接到鸡羽毛降解的培养基，在37℃和200rpm条件下培养35h；期间分别在10h、15h、20h、25h、30h调整培养温度至50℃后继续培养，获得羽毛降解液。
如图1所示，地衣芽孢杆菌CICC10092在降解鸡羽毛过程中，随着改变培养温度升至50℃的时间的增加，该菌对鸡羽毛的降解效率呈先增加后下降的变化，并在25h改变温度时达到最大，为72％；与该菌株在37℃持续降解鸡羽毛的对照组相比，其在37℃培养至10h时升高温度至50℃后继续培养的鸡羽毛降解效率下降显著。而在培养时间为25h改变温度时的鸡羽毛降解效率比无温度改变的对照组提高了15％。通过分光光度法检测生物量，图2显示CICC10092菌在培养时间为25h改变温度时的生物量较对照组高，说明在25h升高温度至50℃后该菌株获得较好的生长。除了在10h时升高温度至50℃后的5h该菌株的生长加快，其它培养时间改变温度后的生物量均显著降低。
对角蛋白酶的酶活力的分析如图3所示。在培养时间分别为10h、15h、20h和25h时改变温度升至50℃后，角蛋白酶的酶活力均出现类似对照组先升高后下降的变化，其中在10h、15h改变温度时角蛋白酶的酶活力均在20h时达到最高，但都低于对照组；而在20h和25h改变温度时角蛋白酶的酶活力均在30h时达到最高且显著高于对照组。在整个鸡羽毛降解过程中25h改变温度时角蛋白酶的酶活力最高，达到6.5U/mL，较对照组提高了141％。另外，在30h改变温度时角蛋白酶的酶活力也出现了升高的变化。
综上所述，尽管通过调整培养温度可以提高角蛋白酶的酶活力，但高温总体上对微生物的生长会产生不利影响，进而阻碍角蛋白酶的分泌，影响其酶活力。在通常37℃温度下培养微生物25h时改变温度至50℃对微生物的生长、角蛋白酶的分泌及角蛋白酶的酶活力产生了较为合适的平衡，既有利于细胞生长，又促进角蛋白酶的表达与分泌、增加其酶活力，最终增强微生物降解鸡羽毛的效率。因此，温度改变的两步法能提升微生物降解鸡羽毛的效率。
所述的鸡羽毛降解的培养基，按质量分数计，包括NaCl 0.03％、KH2PO40.06％、K2HPO40.05％，废弃鸡羽毛1.0％，溶剂为水，pH为8.0，在121℃灭菌15分钟。
以上仅是本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何在本发明的思想和原理之内所做的修改、变化或者等同替换都应被认为依然落在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种两步法微生物高效降解废弃羽毛的方法，是在微生物降解废弃羽毛过程中通过改变培养温度而提高废弃羽毛的降解效率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是将微生物种子液转接到羽毛降解的培养基，先在28～37℃和160～220rpm条件下培养5～40h，再调整培养温度至50℃后进行两步法继续培养，获得羽毛降解液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的羽毛降解的培养基，按质量分数计，包括NaCl 0.01～0.12％、KH2PO40.02～0.14％、K2HPO40.01～0.11％，废弃羽毛1.0％，pH为7.5～10。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微生物种子液是将微生物菌株涂布在LB或YPD固体培养基上，在28～37℃静置培养12～24h，挑取菌落接种至相对应的液态培养基，在28～37℃和160～220rpm条件下培养至对数生长期，制备种子液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的将微生物种子液转接到羽毛降解的培养基是将种子液以体积比2.0～8.0％的接种量转接到羽毛降解的培养基中。
6.根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于，所述的微生物可以是芽孢杆菌。
7.根据权利要求1和6所述的方法，其特征在于，所述的芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CICC10092。
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