RU2601122C2 - СМЕШАННАЯ КУЛЬТУРА Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА НА ДРЕВЕСНЫХ ОПИЛКАХ - Google Patents

СМЕШАННАЯ КУЛЬТУРА Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА НА ДРЕВЕСНЫХ ОПИЛКАХ Download PDF

Info

Publication number
RU2601122C2
RU2601122C2 RU2014124505/10A RU2014124505A RU2601122C2 RU 2601122 C2 RU2601122 C2 RU 2601122C2 RU 2014124505/10 A RU2014124505/10 A RU 2014124505/10A RU 2014124505 A RU2014124505 A RU 2014124505A RU 2601122 C2 RU2601122 C2 RU 2601122C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
vkpm
sawdust
mixed culture
growing
hydrolyzate
Prior art date
Application number
RU2014124505/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2014124505A (ru
Inventor
Галина Ивановна Воробьёва
Александра Ивановна Заикина
Анатолий Егорович Сычёв
Валентин Бабкенович Акопян
Андрей Юрьевич Ступин
Original Assignee
Открытое акционерное общество "ГосНИИсинтезбелок"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Открытое акционерное общество "ГосНИИсинтезбелок" filed Critical Открытое акционерное общество "ГосНИИсинтезбелок"
Priority to RU2014124505/10A priority Critical patent/RU2601122C2/ru
Publication of RU2014124505A publication Critical patent/RU2014124505A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2601122C2 publication Critical patent/RU2601122C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве кормов для животных, птиц и рыб. Смешанная культура микроорганизмов содержит бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 в соотношении 1:1:1 соответственно. Смешанная культура является технологичной, так как способна расти в широком диапазоне аэрации, перемешивания и длительности процесса культивирования. Изобретение позволяет получать кормовой белок из древесных опилок с высоким содержанием сырого протеина в готовом продукте. 8 табл., 6 пр.

Description

1. Область техники
Изобретение относится к области микробиологического производства кормовых белковых продуктов.
2. Уровень техники
Известно, что успешное развитие животноводства, птицеводства и рыболовства возможно при создании прочной кормовой базы.
Основой кормов является растительное сырье. Однако оно имеет низкое содержание белка, неполный набор незаменимых аминокислот.
Обогащение растительного сырья необходимым количеством белка и аминокислот возможно путем добавления в него биомассы микроорганизмов.
Интенсивное развитие производства кормового микробного белка в России началось еще в 20-30 гг. 20-го столетия. Тогда было создано гидролизное производство по получению спирта и кормового белка из гидролизатов древесины и различных отходов сельскохозяйственных растений. Гидролиз древесины и растительных отходов проводили в специальных гидролиз-аппаратах путем обработки сырья концентрированной серной кислотой при высокой температуре и давлении.
В 80-90-е годы интенсивное изучение и широкое распространение получили разработки по обогащению микробным белком крахмалсодержащего сырья (отходов мукомольного производства - отрубей и некондиционного зерна), а также древесных опилок, содержание которых может составлять 50-90%. В отличие от гидролизных производств, новые технологии основаны на проведении гидролиза и ферментолиза растительного сырья, которые протекают в щадящих условиях термической обработки и рН среды с использованием амилолитических и целлюлолитических ферментов в зависимости от вида сырья. Процесс выращивания на полученной питательной среде осуществляется с использованием микроорганизмов, способных разлагать крахмал или целлюлозу. Последние являются основными компонентами растительного сырья, и их содержание может составлять 50-90%.
Согласно литературным данным разложение целлюлозы осуществляется в основном грибами, способными синтезировать целлюлолитические ферменты. К ним относятся следующие виды грибов: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma. Однако нам неизвестны процессы биоконверсии древесных опилок с получением кормового белкового продукта с помощью перечисленных микроорганизмов. Кроме того, перечисленные высшие грибы образуют конидии, которые легко распространяются в окружающей среде, что недопустимо для процессов нестерильного культивирования. Проработка патентной литературы также не выявила каких-либо способов и технологий по обогащению древесных опилок микробным белком. Таким образом, аналогов предлагаемому способу культивирования смешанной культуры микроорганизмов на древесных опилках нам неизвестно.
В связи с изложенным, цель настоящего изобретения заключалась в подборе и испытании штаммов микроорганизмов, способных расти на древесных опилках с получением готового продукта, обогащенного микробным белком.
3. Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в создании и интенсификации производства кормового белкового продукта на отходах древесины, в частности на древесных опилках, за счет следующих нововведений:
- подбора и селекции новых активных штаммов микроорганизмов, обладающих целлюлолитической активностью;
- создания нового состава смешанной культуры микроорганизмов, включившей бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y- 3585, которые находятся в трофической (метаболической) взаимозависимости друг от друга, что обеспечивает им устойчивость и доминирование в биоценозе на стадии выращивания в нестерильных условиях;
- подготовки исходного сырья, включающей размалывание древесных опилок с размером частиц до 100 мкм, что повышает эффективность их последующей биоконверсии и осахаривания;
- приготовления водной суспензии древесных опилок с концентрацией 5% для улучшения условий ее последующей обработки;
- проведения щелочного гидролиза водной суспензии древесных опилок для разрушения лигноцеллюлозного комплекса;
- проведения ферментолиза водной суспензии древесных опилок для разложения целлюлозы, входящей в состав древесных опилок, до образования редуцирующих веществ (Рв) - глюкозы с помощью жидких ферментов нового поколения - целлюлаз и целлобиаз. Увеличение содержания глюкозы в питательной среде в результате разложения целлюлозы (клетчатки) обеспечивает повышение прироста биомассы микроорганизмов смешанной культуры на стадии выращивания и повышение содержания белка в готовом продукте.
4. Реализация изобретения
Настоящее изобретение направлено на селекцию и подбор штаммов микроорганизмов, обладающих целлюлолитическими ферментами, за счет которых происходит разложение целлюлозы, входящей в состав древесных опилок, с образованием глюкозы, которую потребляют эти же микроорганизмы, что в конечном результате позволяет получить готовый белковый кормовой продукт.
Селекцию осуществляли методом накопительных культур из биоценоза древесных опилок, в результате которой был получен штамм бактерий Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 и штамм дрожжеподобного гриба Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975.
Штамм Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 является сапрофитным непатогенным микроорганизмом. Грамположительный. Морфологические свойства: клетки представляют собой короткие подвижные прямые палочки или в виде укороченных неправильной формы палочек размером 1,0-0,5 мкм, обладают плеоморфизмом, не образуют эндоспор. Физиологические свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, ауксогетеротроф, нуждается в витаминах и ростовых факторах, метаболизм окислительный и бродильный, факультативный аэроб, не кислотоустойчивый, расщепляет целлюлозу, ассимилирует глюкозу. Биохимические свойства: образует комплекс целлюлолитических ферментов, способных разлагать целлюлозу до целлобиозы и глюкозы. Параметры роста: рН среды 6,0-8,0, температура 25-40°С. Разлагает остатки животного и растительного происхождения, содержащие клетчатку (пиломатериалы, телеграфные столбы, бумагу, волокна льна, джута, табака).
Помимо бактерий Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 способность роста на целлюлозе была проверена у штамма дрожжеподобного гриба Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, который активно растет на древесных опилках.
Штамм Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 является дрожжеподобным сапрофитным, непатогенным несовершенным грибом, у которого половой способ размножения неизвестен. Морфологические свойства: клетки крупные, цилиндрические размером 4-6×8-12 мкм, образует псевдомицелий, размножается делением, образует артроспоры, не образует конидий и пигментов, аскоспоры отсутствуют. Физиологические свойства: гетеротроф, аэроб, ассимилирует глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, а также различные органические кислоты и спирты. Биохимические свойства: образует амилолитические (амилазы, глюкоамилазы) и целлюлолитические ферменты (целлюлазы и целлобиазы). Активно растет на древесных опилках и крахмалсодержащем сырье. Параметры роста: рН 3,5-6,5, температура 26-43°С.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 относятся к совершенным грибам пищевого назначения, непатогенны, нетоксичны. Морфологические свойства: клетки округло-овальной и овальной формы размером 4-6×5-8 мкм, размножаются почкованием, образуют аскоспоры, мицелий или псевдомицелий отсутствуют. Физиологические свойства: ассимилируют глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, декстрины. Не усваивают лактозу, ксилозу, арабинозу. Биохимические свойства: образуют амилолитические ферменты, растут на крахмалсодержащем сырье. Параметры роста рН 3,5-6,5, температура 26-43°С. Применяют в хлебопечении, пивоварении и виноделии.
Проверку смешанной культурой микроорганизмов на способность к биоконверсии целлюлозы проводили путем приготовления питательной среды, содержащей древесные опилки масличной пальмы. Для этого был изучен химический состав древесных опилок масличной пальмы, который представлен в таблице №1:
№№ пп Показатель Партия №1 Партия №2 Партия №3
1. Влажность, % 7,57 8,3 9,6
2. Массовая доля протеина, % 2,7 2.0 3,9
3. Общие углеводы, % 72,4 79,5 79,0
4. Зольность, % 7,2 2,4 3,1
5. Крахмал, % Отс. Отс. Отс.
6. Клетчатка, % 38,8 35,75 35,8
7. Жир, % 0,6 0,9 0,3
Таким образом, из всех веществ, входящих в состав опилок масличной пальмы, углеводы, в том числе клетчатка, являются основными компонентами, составляющими 72%-79% и 35%-38% соответственно. Эти вещества являются основными источниками углерода для роста микроорганизмов.
Подготовку питательной среды осуществляли в несколько стадий. Сначала опилки размалывали с помощью мельницы с деформационным сдвигом под давлением для образования частиц размером до 100 мкм. Затем из опилок готовили 5% водную суспензию, которую далее подвергали щелочному гидролизу при температуре 90°С для разрушения лигноцеллюлозного комплекса, входящего в состав древесных опилок. Для этого в суспензию при перемешивании вносили 12% раствор едкого калия (KОН) для достижения рН среды, равной 12, и выдерживали при 90°С в течение 2-х часов. В результате щелочного гидролиза получили суспензию с содержанием редуцирующих веществ 0,48-0,57%. Полученный гидролизат использовали самостоятельно в качестве питательной среды либо подвергали ферментолизу. По первому варианту в щелочной гидролизат вносят источники азота и фосфора в виде сульфата аммония (NH2SO4) и однозамещенного фосфата калия (KН2РО4) из расчета, что на 1 г биомассы требуется 90 мг азота и 45 мг фосфора, устанавливают рН, равный 6,0, допустимый одновременно для роста бактерий, дрожжей и грибов. Таким образом получали питательную среду для выращивания смешанной культуры. По второму варианту щелочной гидролизат подвергали ферментолизу. Для этого устанавливали рН 6,0, вносили в гидролизат термоустойчивый жидкий фермент «вискоферм» (Дания) в количестве 0,2 г/кг сырья и выдерживали при 85°С в течение одного часа. Далее проводили вторую стадию ферментолиза с использованием жидкого фермента целлюлазы («целлюлокласт» Дания) в количестве 0,6 г/кг сырья и жидкой целлюлобиазы (Дания) в количестве 1,0 г/кг сырья при температуре 50-55°С в условиях слабого перемешивания в течение одного часа. Содержание рВ в ферментолизате составило 1,2%-1,7%. Для приготовления питательной среды из ферментолизата в нее вносили источники азота и фосфора в виде сульфата аммония (NH2SO4) и однозамещенного фосфата калия (KН2РО4) из расчета, что на 1 г биомассы требуется 90 мг азота и 45 мг фосфора.
Процесс периодического выращивания смешанной культуры осуществляли в аппарате «Biotec» объемом 5 и 15 л (рабочий объем 2,5-2,8 л и 5,8-7,0 л соответственно) при изменении следующих условий: температуры выращивания 30°С, 38°С, 43°С; состава питательной среды гидролизата или ферментолизата неразмолотых и размолотых опилок; аэрации интенсивной (максимальная подача воздуха и перемешивание 700 об/мин, принятых за 100 отн. ед.) и низкой аэрации (без подачи воздуха при перемешивании 300 об/мин, принятых за 1 отн. ед.); продолжительности процесса выращивания от 1 до 9 суток. Поддержание заданных значений рН 6,0 и температуры осуществляли автоматически. В аппарат вносили питательную среду в количестве 70% от общего объема аппарата и засевную биомассу смешанной культуры в количестве 10% от рабочего объема аппарата. Засевную биомассу готовили путем выращивания каждого штамма отдельно в течение суток в термостатированной качалке 160 об/мин при температуре 30-34°С. Для бактерий использовали мясо-пептонный бульон, для дрожжей и дрожжеподобного гриба использовали 6°Б жидкое сусло (солодовый экстракт).
Критерием оценки роста в аппарате служил показатель содержания сырого протеина в готовом продукте. Для этого суспензию из аппарата выращивания, обогащенную биомассой микроорганизмов, подвергали лиофилизации с последующим определением химического состава.
Результаты процессов выращивания представлены в таблице:
№ пп Питательная среда Длительность процесса, сутки Температура, °С Аэрация, условные Содержание сырого
        единицы протеина, %
  Опилки масличной пальмы - - - 2-4
1. Гидролизат неразмолотых опилок 1 32 100 22,2
2. Гидролизат неразмолотых опилок 2 32 100 29,5
3. Гидролизат неразмолотых опилок 3 32 100 33,0
4. Гидролизат неразмолотых опилок 5 32 100 37,3
5. Гидролизат неразмолотых опилок 7 32 100 39,1
6. Гидролизат неразмолотых опилок 9 32 100 40,1
7. Гидролизат неразмолотых опилок 1 38 100 26,1
8. Гидролизат неразмолотых опилок 1 43 100 25,5
9. Гидролизат размолотых опилок 1 32 100 26,3
10. Ферментолизат неразмолотых опилок 1 32 100 24,4
11. Ферментолизат размолотых опилок 1 32 100 29,8
12. Ферментолизат размолотых опилок 1 34 100 30,9
13. Ферментолизат размолотых опилок 1 34 1 32,4
Как видно из таблицы, содержание сырого протеина зависит от подготовки древесных опилок. Так на гидролизате и ферментолизате неразмолотых опилок оно составило 22,2% и 24,4% соответственно. На гидролизате и ферментолизате размолотых опилок содержание сырого протеина составило 26,3% и 32,4% соответственно. Из таблицы также следует, что содержание сырого протеина зависит от продолжительности процесса выращивания. Так через сутки процесса выращивания оно составило 25,2%, через двое суток 29,5, через 3, 5, 7 и 9 суток 33,0%, 37,3%, 39,1% и 40,1% соответственно. Содержание сырого протеина практически не зависит от температуры выращивания. Так в интервале температур 30-43°С через сутки процесса выращивания на гидролизате неразмолотых опилок оно составило 25,2%- 26,1%. Содержание сырого протеина также практически не зависит от интенсивности аэрации. Так через сутки выращивания на ферментолизате размолотых опилок при интенсивности аэрации 100,0 и 1,0 относительных единиц оно составило 30,9 и 32,4%.
5. Примеры реализации заявленного способа
Пример 1
Штаммы дрожжеподобного гриба Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 были изучены на способность наличия целлюлолитических ферментов, которые необходимы для разложения клетчатки древесных опилок до глюкозы. Для этого штаммы выращивали на минеральной среде следующего состава (г/л): NH4H2PO4 -10, K2НРО4 10, MgSO4×7 Н2O- 0,7; рН среды 5,0. В среду в качестве источника углерода вносили отдельно опилки масличной пальмы и аморфную химически чистую целлюлозу в количестве 1,0%. Выращивание проводили в аэробных условиях в колбах на качалке (150 об/мин) при температуре 30-34°С в течение 5 суток.
Оценку роста проводили путем определения сухого веса, а также методом фазово-контрастного микроскопирования до и после выращивания:
Штамм микроорганизма Источник углерода Сухой вес до выращивания, г Сухой вес
после выращивания, г		 Число клеток в поле зрения до и после выращивания
Trichosporon mycotoxinivorans целлюлоза 5,1 2,5 до 10/60
ВКПМ Y-3975        
Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 опилки масличной пальмы 6,0 3,4 до 10/50
Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 целлюлоза 5,1 5.0 до 10/10
Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 опилки масличной пальмы 6,0 5,8 до 10/10
Согласно полученным данным дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 активно растет как на чистой целлюлозе, так и на опилках масличной пальмы, так как обладает целлюлолитическими ферментами. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 не растут на целлюлозе и древесных опилках, так как целлюлолитические ферменты отсутствуют.
Пример 2
Изучена способность роста бактерий Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 в виде монокультуры и в смеси с дрожжеподобным грибом Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 по примеру №1:
штамм микроорганизма Источник углерода Сухой вес до выращивания, г Сухой вес после выращивания, г Число клеток в поле зрения до выращивания Число клеток в поле зрения после выращивания
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 целлюлоза 5,0 4,7 единичные единичные
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 опилки масличной пальмы 6,0 5,8 единичные единичные
Cellulosimic- целлюло- 5,0 3,8 единичные до 50
robium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxini-vorans ВКПМ Y-3975 за        
Cellulosimic-robium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxini-vorans ВКПМ Y-3975 опилки масличной
пальмы		 6.0 3,0 единичные до 30
Согласно полученным данным бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 в виде монокультуры не способны расти на целлюлозе и древесных опилках; в составе смешанной культуры с Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 штамм бактерий растет практически так же, как монокультура Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 (см. пример 1).
Пример 3
Изучена способность смешанной культуры Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 + Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 на способность роста на гидролизате неразмолотых древесных опилок масличной пальмы и проведена сравнительная оценка скорости роста отдельно каждой из составляющих смешанную культуру на минеральной среде с 1% глюкозы.
Критерием оценки роста на гидролизате неразмолотых древесных опилок масличной пальмы было определение сухого веса и количества клеток в поле зрения. Скорость роста определяли по остаточному содержанию глюкозы в среде модифицированным методом Бертрана.
Штаммы отдельно выращивали на минеральной среде по примеру №1 с добавлением 1% глюкозы, рН среды 6,0. При выращивании на гидролизате древесных опилок в приготовленный гидролизат вносили сульфат аммония и калий фосфорнокислый двузамещенный из расчета, что на 1 г биомассы требуется 90 мг азота и 45 мг фосфора, рН среды 6,0. В обоих вариантах выращивание осуществляли в аэробных условиях в колбах на качалке (150 об/мин) при температуре 32°С в течение 1 суток.
Рост моно- и смешанной культур на целлюлозе и гидролизате немолотых древесных опилок:
Штамм
микроорганизма		 Источник углерода Сухой вес до выращивания, г Сухой вес после выращивания, г Число клеток в поле зрения до выращивания Число клеток в поле зрения после выращивания
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 целюлоза 5,0 4,7 до 10 единичные
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 опилки масличной пальмы 6,0 5,8 до 10 до 10
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans
ВКПМ Y-3975		 целлюлоза 5,0 3,3 до 10 до 50
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 опилки масличной пальмы 6.0 3,8 до 10 до 30
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans целлюлоза 5,0 3,0 до 10  
BKITMY-3975+ Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585          
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975+ Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 опилки масличной пальмы 6,0 3,5 до 10  
Согласно полученным данным, монокультура Cellulosimicrobium funkei AC-1948 плохо растет на целлюлозе и гидролизате древесных опилок: сухой вес снижается с 5% и 6% до 4,7% и 5,8% соответственно, число клеток практически не меняется. Смешанная культура в составе двух и трех компонентов активно растет как на целлюлозе, так и на гидролизате древесных опилок: сухой вес снижается с 5% и 6% до 3,0% - 3,8% соответственно, число клеток увеличивается с 10 до 30-60.
Рост монокультур на минеральной среде с глюкозой:
Штамм микроорганизма Содержание глюкозы после выращивания, %
Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 0,7
Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 0,5
Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 0,4
Согласно полученным данным наибольшей скоростью роста и потребления глюкозы обладают дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585, далее гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и меньшей - бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948.
Таким образом, учитывая различный характер роста монокультур на целлюлозе, гидролизате древесных опилок и глюкозе, можно заключить, что монокультуры в составе смешанной культуры находятся в трофической зависимости. Это делает смешанную культуру технологичной, так как две монокультуры Cellulosimicrobium funkei ВКПМ AC-1948 и Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, обладающие целлюлолитической активностью, разлагают чистую целлюлозу и целлюлозу в составе древесных опилок до глюкозы и активно растут на этих субстратах. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae Y-3585 более активно, чем Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 и Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, потребляет глюкозу. В результате между ними происходит конкуренция за глюкозу, в которой преимущество получают дрожжи-сахаромицеты, что вынуждает бактерию и гриб разлагать целлюлозу.
Пример 4
Смешанную культуру выращивали на гидролизате нативных (неразмолотых) и размолотых древесных опилок. Для этого опилки размалывали с помощью мельницы, принцип действия которой основан на высоком давлении и деформационном сдвиге (ВДиДС), с образованием частиц размером до 100 мкм. Далее нативные (неразмолотые) и размолотые опилки подвергали гидролизу для разрушения лигноцеллюлозного комплекса. Для этого в 5% суспензию древесных опилок вносили 10% едкий калий (КОН) до получения рН, равного 12, после чего суспензию выдерживали без перемешивания в термостате при 90°С в течение 2-х часов. Содержание рВ после щелочного гидролиза составило 0,57%. В полученный гидролизат вносили в качестве источников азота и фосфора сульфат аммония и однозамещенный фосфат калия из расчета, что на 1 г биомассы требуется 90 мг азота и 45 мг фосфора. Для получения засевного материала монокультуры Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 отдельно выращивали на мясо-пептонном бульоне (бактерии) и на жидком сусле (дрожжи и грибы) в колбах на качалке (180 об/мин) при температуре 30°С в течение суток. Для получения смешанной культуры суспензии выросших монокультур смешивали в соотношении 1:1:1. Количество внесенного засевного материала составляло 10% от рабочего объема (2,5 или 2,8 л) аппарата «Biotec», в котором проводили выращивание в периодическом режиме в течение суток при максимальной подаче воздуха и перемешивании 700 об/мин, температуре 30°С, рН 6,0, которые поддерживали автоматически.
Критерием оценки роста в аппарате служил показатель содержания сырого протеина в готовом продукте. Для этого суспензию из аппарата выращивания, обогащенную биомассой микроорганизмов, подвергали лиофилизации. Химический состав полученных образцов готового продукта определяли на приборе с инфракрасным излучением, предназначенном для изучения состава кормов.
В результате проведенных исследований было установлено, что при выращивании смешанной культуры на гидролизате неразмолотых древесных опилок содержание сырого протеина составило 22,2%, на гидролизате размолотых опилок 26,3%, то есть на 4,1% больше.
Таким образом, при подготовке питательной среды необходимо проводить размалывание древесных опилок.
Пример 5
Смешанную культуру выращивали в периодическом режиме в течение одних суток по примеру 4 на ферментолизате нативных (неразмолотых) и размолотых древесных опилок в аппарате «Biotec» объемом 15 л (рабочий объем 7,0 л). Для этого древесные опилки подвергали размалыванию по примеру 4. Далее готовили 5% водную суспензию неразмолотых и размолотых опилок (по 350 г), которые подвергали гидролизу по примеру 4. Для получения ферментолизата устанавливали рН 6,0 в приготовленные гидролизаты вносили термоустойчивый жидкий фермент «вискоферм» (Дания) в количестве 0,07 г и выдерживали при температуре 85°С в течение одного часа. Содержание рВ составило 0,9%. Последующую стадию ферментолиза проводили при рН 5,0 и температуре 55°С в течение одного часа с использованием жидкого фермента «целлюлокласт» (Дания), который вносили в количестве 0,21 г и целлобиазы в количестве 0,35 г. Содержание рВ составило 1,7%.
Содержание сырого протеина в полученном продукте в зависимости от температуры роста представлено в таблице:
Вариант опыта Длительность процесса, сутки Температура выращивания, °С Аэрация, у.е. Содержание сырого протеина, %
Ферментолизат неразмолотых опилок 1 32 100 24,4
Ферментолизат размолотых опилок 1 32 100 29,8
Ферментолизат неразмолотых опилок 1 34 100 30,9
Ферментолизат размолотых опилок 1 34 100 32,4
В результате проведенных исследований было установлено, что при выращивании смешанной культуры при температуре 32°С на ферментолизате неразмолотых и размолотых древесных опилок содержание сырого протеина составило 24,4% и 29,8%, соответственно, при температуре 34°С - 30,9% и 32,4% соответственно, то есть на 1,5% и 5,4% больше.
Таким образом, для приготовления питательной среды необходимо проводить ферментолиз размолотых отрубей. Кроме того, выявлено, что смешанная культура обладает термотолерантными свойствами, так как содержание сырого протеина в готовом продукте при выращивании на ферментолизатах двух вариантов при температуре 34°С было больше на 6,5% и 2,6%, чем при температуре 32°С.
Пример 6
Смешанную культуру выращивали по примеру 4 на гидролизате неразмолотых древесных опилок при температуре 32°С в течение 5 и 7 суток:
Питательная среда Продолжительность процесса выращивания, сутки Содержание сырого протеина, %
Гидролизат неразмолотых опилок 1 22,2
Гидролизат неразмолотых опилок 5 37.3
Гидролизат неразмолотых опилок 7 39,1
Согласно полученным данным продолжительность процесса выращивания существенно влияет на содержание сырого протеина в готовом продукте. Так при увеличении времени выращивания с 1-х суток до 5 и 7 суток содержание сырого протеина увеличивалось с 22,2% до 37,3% и 39,1% соответственно.
6. Выводы:
- Разработан состав смешанной культуры микроорганизмов в качестве культуры-продуцента для получения кормового белкового продукта на древесных опилках масличной пальмы, которая включает бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585.
- Монокультуры микроорганизмов, которые входят в состав смешанной культуры, находятся в трофической (метаболической) взаимозависимости, что обеспечивает устойчивость, стабильность и доминирование культуры-продуцента в составе биоценоза в условиях длительного процесса культивирования. Штаммы бактерий Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 и дрожжеподобного гриба Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 обладают целлюлолитической активностью, разлагая целлюлозу до декстринов и глюкозы, дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 обладают большей скоростью потребления глюкозы по сравнению с бактериями и грибом.
- Смешанная культура является технологичной, способна расти при температуре 30-43°С, рН 6,0, в условиях низкой аэрации на гидролизате и ферментолизате неразмолотых и размолотых древесных опилок масличной пальмы.
- Разработан способ приготовления питательной среды путем предварительного размалывания древесных опилок масличной пальмы с образованием частиц до 100 мкм, приготовления 5% суспензии, которая подвергается щелочной термообработке с образованием гидролизата с содержанием редуцирующих веществ до 0,7%, в который добавляют соли аммония и фосфора. Гидролизат может быть подвергнут ферментолизу с использованием целлюлаз и целлобиаз с образованием ферментолизата с содержанием редуцирующих веществ до 2%, в который добавляют соли аммония и фосфора.
- Разработан способ периодического культивирования смешанной культуры микроорганизмов при широком диапазоне температуры 30-43°С, интенсивности аэрации от 1 до 100 у.е., продолжительности от 1 до 7 суток. Содержание сырого протеина в готовом продукте составляет 25-40% в зависимости от условий культивирования.

Claims (1)

  1. Смешанная культура Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 в соотношении 1:1:1 соответственно - продуцент кормового белкового продукта на древесных опилках.
RU2014124505/10A 2014-06-16 2014-06-16 СМЕШАННАЯ КУЛЬТУРА Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА НА ДРЕВЕСНЫХ ОПИЛКАХ RU2601122C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014124505/10A RU2601122C2 (ru) 2014-06-16 2014-06-16 СМЕШАННАЯ КУЛЬТУРА Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА НА ДРЕВЕСНЫХ ОПИЛКАХ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014124505/10A RU2601122C2 (ru) 2014-06-16 2014-06-16 СМЕШАННАЯ КУЛЬТУРА Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА НА ДРЕВЕСНЫХ ОПИЛКАХ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014124505A RU2014124505A (ru) 2015-12-27
RU2601122C2 true RU2601122C2 (ru) 2016-10-27

Family

ID=55023206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014124505/10A RU2601122C2 (ru) 2014-06-16 2014-06-16 СМЕШАННАЯ КУЛЬТУРА Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА НА ДРЕВЕСНЫХ ОПИЛКАХ

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2601122C2 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2090614C1 (ru) * 1995-03-21 1997-09-20 Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Способ получения белково-витаминного продукта из крахмалсодержащего сырья
RU2159287C1 (ru) * 2000-04-03 2000-11-20 Государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ" Способ получения белковой кормовой добавки
RU2376865C1 (ru) * 2008-05-29 2009-12-27 Галина Ивановна Воробьева Кормовая добавка и ее применение
RU2478701C2 (ru) * 2011-03-16 2013-04-10 Открытое акционерное общество "Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ" (ОАО "ГосНИИсинтезбелок") ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae, ОБЛАДАЮЩИЙ АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА, И СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2090614C1 (ru) * 1995-03-21 1997-09-20 Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Способ получения белково-витаминного продукта из крахмалсодержащего сырья
RU2159287C1 (ru) * 2000-04-03 2000-11-20 Государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ" Способ получения белковой кормовой добавки
RU2376865C1 (ru) * 2008-05-29 2009-12-27 Галина Ивановна Воробьева Кормовая добавка и ее применение
RU2478701C2 (ru) * 2011-03-16 2013-04-10 Открытое акционерное общество "Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ" (ОАО "ГосНИИсинтезбелок") ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae, ОБЛАДАЮЩИЙ АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА, И СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ВОРОБЬЕВА Г.И., ЗАИКИНА А.И., СЫЧЕВ А.Е., КОВАЛЬСКИЙ Ю.В., Получение кормового продукта из отходов древесины, Международная научная конференция "Достижения и перспективы развития биотехнологии", 3-5 октября 2012, Саранск, с. 50. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2014124505A (ru) 2015-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101248845B (zh) 一种利用发酵处理水产饲料原料的方法
KR101918732B1 (ko) 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법
Ezekiel et al. Protein enrichment of cassava peel by submerged fermentation with Trichoderma viride (ATCC 36316)
RU2613493C2 (ru) Способ получения белково-витаминной добавки из крахмалсодержащего зернового сырья
CN108130295B (zh) 一种生物有机肥发酵菌剂
CN102286413B (zh) 一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法
Bhosale et al. Production of xylanase by Streptomyces rameus grown on agricultural wastes
CN106434404A (zh) 产高活性角蛋白水解酶的菌株及其应用
WO2007083746A1 (ja) エタノール生産発酵法
Aziz et al. Bioconversion of acid-and gamma-ray-treated sweet potato residue to microbial protein by mixed cultures
KR101075602B1 (ko) 브레타노마이세스 쿠스테르시이 변이 균주 및 이를 이용한 에탄올 제조 방법
CN101638645A (zh) 一种固态机械发酵生产木聚糖酶方法
CN100379355C (zh) 微生物固体发酵水生植物生产蛋白饲料的方法
RU2601122C2 (ru) СМЕШАННАЯ КУЛЬТУРА Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА НА ДРЕВЕСНЫХ ОПИЛКАХ
Kahil et al. Economic co-production of cellulase and αamylase by fungi grown on agro-industrial wastes using solid-state fermentation conditions
RU2560987C2 (ru) Способ получения белковой кормовой добавки из древесных отходов
CN105859357A (zh) 利用粉丝生产过程中产生的副产物制备微生物肥料的方法
CN110835607B (zh) 一种含酿酒酵母菌的低温高效降解秸秆复合菌及其应用
CN113273641A (zh) 一种甘蔗汁发酵生产饲料的方法
CN101880634A (zh) 以玉米浸泡水生产饲料酵母的方法
Ling Ho et al. Bioprocessing of agro-residual wastes for optimisation of xylanase production by Aspergillus brasiliensis in shake flask culture and its scaling up elucidation in stirred tank bioreactor
KR101856849B1 (ko) 배추 폐기물로부터 포도당을 생산하는 방법 및 포도당을 포함하는 미세조류 배양액
Sedanza et al. Development of aquafeed ingredient by solid state fermentation of the crinklegrass, Rhizoclonium riparium on a laboratory scale
Shahzad et al. Addition of molasses, corn steep liquor, and rice polish as economical sources to enhance the fungal biomass production of wheat straw by Arachniotus sp.
RU2696036C1 (ru) Штамм гриба penicillium verruculosum ее-105 продуцент комплекса высокоэффективных эндоглюканаз и ферментный препарат на его основе для использования в качестве кормовой добавки в зерновых кормах

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160914