TW201139462A - Hyaluronic acid purification method and production method - Google Patents

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201139462 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種玻尿酸類之純化方法及製造方法。 【先前技術】 玻尿酸除作為化妝品之保濕劑以外，亦於眼科、整形外 科、皮膚科等中作為醫藥品而使用。雖然玻尿酸可由來自 動物組織，例如雞之雞冠、牛眼之玻璃體等之萃取物而製 造，但由於混入作為夾雜物之硫酸軟骨素等、或因組織内 所含之玻尿酸酶（hyalUr〇nidase)等而易低分子量化，故亦 進行培養具有玻尿酸生產能力之微生物而由培養液製造玻 尿酸之方法（醱酵法）（非專利文獻i及專利文獻〗）。 於藉由萃取法或醋酵法而製造之玻尿酸中，由於蛋白質 或發熱性物質等以雜質形式存在，故正研究將該等分離去 除以獲得高純度之製品之方法。特別是製造之初始階段之 雜質的去除能減輕以後之純化步驟之負荷，而期待開發獲 得亦可作為醫藥品使用之高純度製品的方法。作為其例， 例如揭示有藉由於礙酵液中加人醇等有機溶劑而析出玻尿 酸並與雜質分離之純化法，或使用陰離子交換樹脂自酸酵 液中去除發熱性物質及蛋白質等之玻尿酸之純化法(專利 文獻2)。 [非專利文獻 1]1。咖1 of General Microbiology，85, 372-375, 1976 [專利文獻1]曰本專利特公平4_1296〇號公報 [專利文獻2]曰本專利特開昭63_12293號公報 154808.doc 201139462 【發明内容】 然而，於以工業規模獲得可作為注射液等醫藥品使用之 高純度之玻尿酸類時，存在以下期望進一步改善之問題： ⑴由於初始階段中之雜質之去除不充分，對後續步驟之負 荷較大，（2)操作繁雜，且玻尿酸類之回收率較低等。 本發明係鑒於上述情況而完成者，其目的在於提供一種 簡便且高產率、以工業規模純化高純度之玻尿酸類之方 法。另外’本發明之目的亦在於提供其純化方法令所使用 之吸附劑。 本發明者等人為達成上述目的，對自含有玻尿酸類溶液 中冋效地分離去除雜質、將高純度之玻尿酸類簡便且高效 地純化之方法進行了各種研究，結果發現藉由使玻尿酸類 溶液與活性碳接觸可高效地吸附去除雜質，從而完成了本 發明。 即，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之純化方 法其包括以下步驟·使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質之 玻尿酸類溶液接觸於選自由（1)活性碳、（2)無機吸附劑、 (3)無機吸附劑及有機吸附劑、（4)無機吸附劑及活性碳、 (5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、有機吸附劑、 及（7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑。根據該純 化方法，可高效地吸附去除雜質。 另外，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之純化 方法，其包括以下步驟：使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質 之玻尿酸類溶液接觸於選自由（1)活性碳、（句無機吸附劑 154808.doc 201139462 及活性碳、（5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、及（7) 有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑。根據該純化方 法’可高效地吸附去除雜質。 另外’根據本發明’提供一種玻尿酸及/或其鹽之製造 方法’其包括以下步驟：使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質 之玻尿酸類溶液接觸於選自由（1)活性碳' (2)無機吸附 劑、（3)無機吸附劑及有機吸附劑、（4)無機吸附劑及活性 碳、（5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、（6)有機吸附 劑、及（7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑，藉此 純化玻尿酸及/或其鹽。根據該製造方法，可藉由將雜質 高效地吸附去除而有效地製造純度較高之玻尿酸。 另外，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之製造 方法，其包括以下步驟：使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質 之玻尿酸類溶液接觸於選自由（1)活性碳、（4)無機吸附劑 及活性碳、（5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、及（7) 有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑，藉此純化玻尿 酸及/或其鹽。根據該製造方法，可藉由將雜質高效地吸 附去除而有效地製造純度較高之玻尿酸。 【實施方式】 • [術語之說明] 本說明書中之「玻尿酸類」包括：游離之玻尿酸、及於 無損本發明之目的之範圍内可使用的任意之玻尿酸鹽（並 不限夂於此，但可為例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋰鹽等金屬 鹽，或鹽酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等酸加成物等）或水合 154808.doc 201139462 物、其等之混合&。於此，所謂玻尿酸，係指N_乙醜心 葡萄糖胺與D-葡糖醛酸鍵結之二糖單元重銘、击μ 玉吸遇趟而成之高 分子量多糖類，各種鹽主要係指葡糖醛酸部分成為幽 , 態者。玻尿酸藉由可摺疊之鏈部分與D·葡糖醛酸部 基之負電荷的相互作用而易於空間中展開，藉此可與大量 的水結合而形成凝膠。另外，即便為低濃度，但分子間力 亦較強，因此具有相對較高之黏性。由於此種作用，=如 具有濕潤關節之作用、柔軟皮膚之作用等，於生理上亦發 揮該等作用。 已知於玻尿酸類中，分子量約200萬〇&之玻尿酸鈉盘分 子量約80萬Da者相比，作為醫藥品，對治療變形性膝關節 病、肩周炎、慢性類風濕性關節炎等發揮出優異之效果 (藥理與治療、V()L22、Ng 9、289 (1994);藥理與治療、 ν〇1·22、Νο.9、319 (1994))。另外，除此之外還已知作為 外科手術後之防止黏連用之效果、進而亦於皮膚科領域、 眼科領域中作為醫藥品之效果，—部分於臨床上普遍使 用。於作為醫藥品使用之情形時，較理想為使用平均分子 f為100萬以上之玻尿酸類。進而，若考慮獲取或處理的 合易性，較理想為平均分子量100萬〜500萬1^之玻尿酸類 作為醫藥品，尤其理想為平均分子量15G萬〜彻萬以之玻 尿酸類。另外’此種高分子量之玻尿酸類於作為化妝品用 途使用時’亦因其較高之保濕力而發揮優異之效果。 /合解玻尿酸類作為醫藥品之注射用溶解液，可適當使用 於;主射用水、生理鹽水等中加入含有酸、鹼、磷酸鹽之類 154808.doc 201139462 之緩衝劑的pH值調節劑等 w寻心逋㊉所使用之注射用溶解液 (例如，於各國藥典中所認可者卜 J等玻尿酸類可為藉由自動物組織中萃取之萃取法而製 造/亦可為藉由使用玻尿酸生產微生物菌株使其撥酵而 獲于之醱酵法而製造者。然而，於自動物組織所萃取者 中，其他點多糖等雜質相對較多，且分子量亦較小，故較 理想為使用藉由酸酵法而獲得者。於適於本發明之礙酵法 之例中例如可使用鏈球菌屬之微生物以已知之方法獲 得玻尿酸類。 Λ 於將藉由醱酵法而獲得之礙酵液用力本發明之方法等之 情形時，較理想為使用藉由已知方法、例如離心分離或過 遽處理等除菌之溶液者。視情況，亦可實施藉由透析處 理、超濾等之低分子化合物之去除，藉由微濾處理之水不 溶微粒子之去除等操作；亦可使用添加醇等水溶性有機溶 劑而將玻尿酸析出純化者。另外’亦可使用經氧化铭等處 理者。 本說明書中之「鏈球菌」包括：可生產玻尿酸之鏈球菌 (Streptococcus)屬之任意的細菌•其變異株。尤其較理想 為使用如專利文獻2中所揭示之馬鏈球菌（Strept〇c〇ceus equi)FM-100(微工研菌寄第9027號）、曰本專利特開平2_ 234689说公報中所揭示之馬鍵球菌fm_3〇〇(微工研菌寄第 23 19號）之高產率且穩定地生產玻尿酸之變異株。作為適 合生產玻尿酸之鍵球菌屬之細菌之例，其他例如可列舉. 馬鏈球菌（Streptococcus equi)、動物流行鏈球菌 154808.doc 201139462 (Streptococcus zooepidemicus)、類馬鍵球菌（Streptococcus equisimilis)、壞乳鍵球菌（Streptococcusdysgalactiae)、酿 膿鍵球菌（Streptococcus pyogenes)及該等之變異株等，但 並不限定於此。 關於本說明書中之「平均分子量」，只要無特別敍述， 於表示玻尿酸類之平均分子量時，係指黏度平均分子量。 黏度平均分子量可藉由業者通常所實施之方法而求出。較 佳為可藉由各國之藥典等中通常所使用之測定方法而求 出’更佳為可藉由曰本藥典中所使用之測定方法而求出。 作為一例，例如其平均分子量可使用極限黏度[η]，藉由 下式而求出’但並不限定於此。 [式1] 平均分子量 "22.8 本說明書中之「活性碳」係指市售、通常所使用之分 離•去除•純化用之多孔狀碳，+_於煤或木材等原料 之來源或化學活化或水蒸氣活化等製法，進而，亦不限定 於粉末活性碳、粒狀活性碳等形狀或乾式、濕式等性狀。 於本發明之方法等中，較理想為使用源自木材之活性碳， 但並不限定於此。另外，同樣， ^ ^ m 季乂里α為使用藉由水蒸氣 她,… ⑸更理想為進行煮彿等預處理 活性碳。 π樣’較理想為使用粉末 作為活性碳之具體例，例如 夕J 舉· Tsurumi Coal GL- 154808.doc 201139462 30S、Tsurumi Coal HC-30S[以上為粒狀，鹤見煤炭 (Tsurumi Coal)(股）製造];白鷺 WH5C8/32、白鷺 LH2C20/48、白鷺WH2C8/32SS[以上為粒狀，武田藥品工 業（股）製造];白鷺A、白鷺P、純化白鷺、特性白鷺' Carbonraffin[以上為粉狀，武田藥品工業（股）製造];北越 SD、北越GSA[以上為粉狀，北越碳素工業（股）製造]; SLIVER A、花F、雪A[以上為粉狀，大三工業（股）製造] 等，但並不限定於此。 本說明書中之「無機吸附劑」係指例如包含ai2o3、 Si02、MgO、CaO、Al(OH)3等無機化合物之吸附劑，其調 配比或製法、水合物之有無等並無限定。但本說明書中之 「無機吸附劑」不包括活性碳。 作為無機吸附劑之具體例，可列舉：包含蒙脫石 (montmorillonite)之酸處理物之活性白土、例如Nikkanite GHC-36、Nikkanite G-36、Nikkagel M-30 ;包含 Si02· AI2O3之吸附劑、例如Nikkagel S-6、Nikkagel S-65[以上為 曰本活性白土（股）製造];包含八1203.108丨0211120之吸附 劑、例如Tomix AD-700NS ;包含Α12〇3·χΗ2〇之吸附劑、 例如 Tomix AD-200NS;包含 Al(0H)3.NaHC03 之吸附劑、 例如 Tomix AD-400NS;包含 6MgOAl203.C02.H20 之吸附 劑、例如Tomix AD-500NS ;包含Mg0.3Si〇2.xH20之吸附 劑、例如Tomix AD-600NS ;包含MgO之吸附劑、例如 Tomix AD-100G、Tomix AD-100GG ;包含 MgO*Al2〇3· 2Si〇2之吸附劑、例如Tomix AD-300NSS、Tomix AD-800 154808.doc 201139462 顆粒、Q-Fiae2000、Q-Fiae3000[以上為富田製藥（股）製 造]；合成沸石A_4、合成沸石F-9[以上為東洋曹達工業 (股）製造];天然沸；6 [日本活性白土（股）製造];膨潤土[和 光純藥工業（股）製造]等，但並不限定於此。 本說明書中之「有機吸附劑」係指包含有機化合物之吸 附劑，其結構並無限定。 作為有機吸附劑之具體例，可列舉··包含纖維素衍生物 系樹脂之吸附劑，例如DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、 ECTEOLA-纖維素[以上為 Serva Finebiochemica Gmb H&Co 製造];包含聚胺基酸衍生物系樹脂之吸附劑，例如 PMLG 、PMLG-ED 、PMLG-PD 、PMLG-BD ；包含 SePHadex衍生物系樹脂之吸附劑，例如DEAE-Sephadex、 QAE-Sephadex[以上為Pharmacia(股）製造];包含殼聚糖衍 生物系樹脂之吸附劑，例如Kurimba[以上為粟田工業（股） 製造];作為反相層析法用填充劑之使辛基與矽膠化學鍵 結之反相層析法用填充劑、例如YMC.GEL CO-300-S5 ;使 十八烷基與矽膠化學鍵結之反相層析法用填充劑，例如 YMC-GEL ODS-AQ60-S50 ' DS-AM-120-S50 > YMC · GEL ODS-A120-S30/50、YMC.GEL ODS-AQ60-S50、YMC· GEL ODS-AD120-S50[以上為YMC製造];使十八烷基與合 成樹脂化學鍵結之反相層析法用填充劑，例如ODP-400[以 上為旭化成（股）製造]、OP-4PW[以上為Tosoh(股）製造] 等，但並不限定於此。 本說明書中之「雜質」係指玻尿酸類、水以外之溶劑成

lS4808.doc -10- S 201139462 分、無機鹽以外之物f，尤其係指於使用作為最終製 玻尿酸類時可帶來不利之物質（發熱性物質等）。作為主 雜質源’可列舉：於破尿酸類之生產階段中源自組織、微 生物或培養液（培養基）者、或者於其後之純化階段等中混 入者。作為本說明書中之雜質之例，可列舉組織或菌體、 蛋白質、核酸、多糖類、低分子化合物、或内毒素等，作 f不限定於此。作為雜質之組織或菌體分別包括：源自於 萃取法_所使用之作為萃取原料之组織的組織片等，或於 酵法中所使用之微生物之菌體或菌體片冑，但並不限定 於此。作為雜質之蛋白質包括：源'自上述組織、菌之蛋白 質或於生產後之步驟中所混人之蛋白料，但並不限定於 此。作為雜質之内毒素包括源自上述菌之脂多糖類等，但 並不限定於此。 本說月書中t i分子化合物」係指與玻尿酸類相比分 子量相對較小之化合物，例如分子量2〇〇〇Da以下、或分子 量lOOODa或分子量500Da以下之化合物，但並不限定於 此。此種低分子化合物包括各種胺基酸' 有機酸⑼如乳 酸）、糖（例如葡萄糖）等。 本說明書中之「無塵環境」係指藉由空氣調節管理，源 自環境之菌或内毒素等雜質污染製品之可能性極低之環 境’尤其指相當於醫藥(無菌、無内毒素)之製品之製造環 境。 作為無塵環境之-例，例如可列舉按以下方式規定對象 物質之環境。 154808.doc 201139462 [表i] 一般環境 無鹿提培 微粒子數[個/m3] >2900 /3S： yg. <29〇〇 <50 微生物數[cfii/90 mmf/4 hrl 含50 本說明書中之「去除中，除 昧时對象物質完全去除之 外’亦包括部分去除(減少其物質之量）。本說明書中之 純化」包括去除任意或特定之雜質。 關於本說明書中之各個數值範圍，分別包含「〜」所示 之上限值及下限值。例如「A〜B」之記載係指A以上且8以 下。另外，「含有」包括「實質上由形成」及「包含」 者。 [實施形態] 本發明，例如係關於以下之實施態樣，但並不限定於 此。 實施態樣1 : 一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括以下步驟： 使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選 自由（1)活性碳、（2)無機吸附劑、（3)無機吸附劑及有機吸 附劑、（4)無機吸附劑及活性碳、（5)無機吸附劑、有機吸 附劑及活性碳、（6)有機吸附劑 '及（7)有機吸附劑及活性 碳所組成群中之吸附劑。 實施態樣2 : 一種玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其包括以下步驟： 使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選 154808.doc 201139462 自由（1)活性碳、（2)無機吸附劑、（3)無機吸附劑及有機吸 附劑、（4)無機吸附劑及活性碳、（5)無機吸附劑、有機吸 附劑及活性碳、⑹#機吸_、及⑺有機吸賴及活性 碳所組成群中之吸附劑，藉此純化玻尿酸及/或其鹽。 實施態樣3: & 如實施態樣1或2之方法，其中上述玻尿酸類溶液之阳值 為2〜5 〇 實施態樣4 : 其中包括使上述玻尿 如實施態樣1至3中任一項之方法 酸類溶液與活性碳接觸之步驟。 實施態樣5 : 其t上述活性碳為濕 如實施態樣1至4中任一項之方法 潤化處理活性碳。 實施態樣6 : 其中包括於上述接觸 如實施態樣1至5中任一項之方法 步驟之刖將氯化納添加至上ijfi； Jtife 上4坡尿酸類溶液中之步驟。 實施態樣7 : 如貫施態樣1至6中任一項之大 唄之方法，其中上述雜質包括菌 體、蛋白質、核酸、低分子化合物、或内毒素。 實施態樣8 ·· 如實施態樣1至7中任一項之 法，其中上述雜質包括蛋 白質或内毒素。 實施態樣9 : 如實施態樣1至8中任一 jg夕+ 項之方法，其中純化後之上述玻

S 154808.doc 201139462 尿酸及/或其鹽之平均分子量為35〇萬〜7〇〇萬Da。 實施態樣1 〇 : 如實施態樣1至9中任-項之方法，其十上述玻尿酸類溶 液中之玻尿酸及/或其鹽之濃度為〗〜〗〇 g/L。 實施態樣11 ·· 如實施態樣1至1 〇中任一 Jg夕* ^ „ r 項之方法，其中上述步驟係於 無塵環境下實施。 以下’就本發明之態樣進行說明。 本發明之第一態樣（例如實施態樣υ為玻尿酸及/或其鹽 之純化方法，其包括以下步驟：使包含玻尿酸及/或其鹽 及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由（1)活性碳、（2)無機 吸附劑、（3)無機吸附劑及有機吸附劑、（4)無機吸附劑及 活性碳、（5)無機吸附劑、有機吸附劑及活性碳、（6)有機 吸附劑、及（7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑。 於該純化方法中，可藉由使用特定之吸附劑而將雜質高效 地吸附•去除。 於上述第一態樣中，所使用之吸附劑較佳為選自由（” 活性碳、（4)無機吸附劑及活性碳、（5)無機吸附劑及有機 吸附劑及活性碳、及（7)有機吸附劑及活性碳所組成之群， 更佳為（1)活性碳。 本發明之第二態樣（例如實施態樣2)係玻尿酸及/或其鹽 之製造方法’其包括以下步驟：使包含玻尿酸及/或其鹽 及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由（1)活性碳、（2)無機 吸附劑、（3)無機吸附劑及有機吸附劑、（4)無機吸附劑及 154808.doc •14- 201139462 活性碳、（5)無機吸附劑、有機吸附劑及活性碳、（6)有機 吸附劑、及（7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑， 藉此純化玻尿酸及/或其鹽。於該製造方法中，可藉由使 用特定之吸附劑將雜質高效地吸附•去除，而有效地製造 純度較尚之玻尿酸。 上述第二態樣中’所使用之吸附劑較佳為選自由活 性碳、（4)無機吸附劑及活性碳、（5)無機吸附劑及有機吸 附劑及活性碳、及（7)有機吸附劑及活性碳所組成之群，更 佳為（1)活性碳。 上述態樣之方法中，於使複數種吸附劑與玻尿酸類溶液 接觸時，可使其同時接觸，亦可使其分開接觸。另外，亦 可使用混合複數種吸附劑之混合吸附劑。 上述態樣之方法中，於使吸附劑與玻尿酸類溶液接觸 後，可將吸附劑分離，該情形下，例如可藉由過濾或離心 刀離專來回收遽液。就分離之效率及操作之繁雜等方面而 言，作為分離方法’較理想為進行過濾。 於將過滤作為分離之方法之情形時，只要可分離吸附劑 及吸附於其上之雜質，則並不限定過濾方法或過濾介質， 例如’使用膜、濾光片、管;I：主、濾紙等於常壓下(自然過 濾）或加壓實施。過濾介質之材質，例如可列舉聚丙烯製 等各種不織布、陶究、纖維素（渡紙）等，但並不限定於 此。另外’雖亦可使用矽藻土等過濾助劑，但就防止雜質 (尤其金屬/重金屬)混入之觀點而言，更理想為不使用過濾 ㈣。關於過遽介質之孔徑’若能將吸㈣及吸附於其上 154808.doc •15· 201139462 之雜質分離，則並無限定，例如可使用0 2〜50 μιη之孔徑 者。 上述態樣之方法等中所使用之無機吸附劑之量較理想為 相對於玻尿酸類溶液1〇〇重量％為0.5〜2〇.〇重量％，更理拽 為5·0〜20.0重量％，但並不限定於此。於該等範圍内可 期望更高之純化（吸附）作用。 上述態樣之方法等中所使用之有機吸附劑之量較理想為 相對於玻尿酸類溶液100重量％為〇 5〜20 0重量％，更理想 為5.0〜20.0重量％，但並不限定於此。於該等範圍内可 期望更高之純化（吸附）作用。 上述態樣之方法中所使用之活性碳之量較理想為相對於 玻尿酸類溶液100重量％為0 5〜20 〇重量％，更理想為 5.0-20.0重量％，但並不限定於此 期望更高之純化（吸附）作用。 。於該等之範圍内，可 進而較理想為活性碳係於水性液t實施加熱處理等預處

中’發揮優異之效果。

就分散性或吸附效率之觀點 ’尤其就應用於生物體時可成 ’較理想為源自木材；其形狀 而言，較理想為粉末狀。 134808.doc •16- 201139462 另外’將活性碳與無機吸附劑及有機吸附劑中任意一種 或兩種混合，製成混合吸附劑使用之情形時，較理想為活 性碳之量為適合上述態樣之範圍内；混合吸附劑之總量較 理想為相對於玻尿酸類溶液1 〇〇重量％不超過20 0重量0/〇， 更理想為0.5〜20.0重量。/◦，最理想為5 〇〜2〇 〇重量％，但並 不限定於此。於該等範圍内，可期望更高之純化（吸附）作 用。 另外，若考慮其後所必須之分離•純化步驟等，則較理 想為避免需要追加之純化步驟之成分的混入。_,為避免 混入新雜質之本發明之其他態樣，係於上述第一態樣中包 括使用活性碳作為吸附劑，使上述玻尿酸類溶液與活性碳 接觸之步驟的純化方法或對應之製造方法；進而係不包括 將上述玻尿酸類溶液與活性碳接觸之同時與無機吸附劑或 有機吸附劑接觸之步驟的純化方法或對應之製造方法。即 便單獨使用活性碳亦可取得充分的吸附•分離效果，故於 重視避免新雜質混人3» ^入之清形下，較理想為單獨以活性碳作 為吸附劑來處理。告妙 ^ y 母然，该情形亦與藉由活性碳之吸附處 理相不同，可實施其他純化處理等之步驟。 於使上述活性碳、無機吸_、㈣吸 附劑與純化對象之祕s及 一次，可— 破尿酸浴液接觸時，將該等吸附劑懸浮 人可直保持原樣，但較理想為持續懸浮於 =:Γ時，較理想為㈣10分鐘〜2小時，更理想 為攪拌0刀鐘〜1小時，但並不限定於此。 於上述態樣之方，土 ，關於先前難以處理之相對較高濃 154808.doc -17- 201139462 度（例如1 g/L〜1 0 g/L)之玻尿酸類溶液’亦可有效地處理β 玻尿酸類濃度就因玻尿酸類溶液之溶液黏度之高度引起的 處理之困難程度及玻尿酸類之溶解度之觀點而言，較理想 為0.1〜20 g/L，更理想為〇.5〜15 g/L，最理想為iqo g/L， 但並不限定於此。 另外’於上述態樣之方法中，為了降低玻尿酸類溶液之 黏度，亦可使氯化鈉等鹽類共存於玻尿酸類溶液中。該情 形下，為了不損及純化效果，較理想為避免高濃度之鹽之 共存。作為此種鹽之共存之具體例，可列舉將〇丨“重量％ 之氯化鈉添加於玻尿酸類溶液者。 於使用述態樣之方法時之玻尿酸類溶液之溫度較理想 為〇〜80°C，但並不限定於此。若溫度為8〇t以下則可強 力抑制處理中之玻尿酸類之分解及分子量之降低。 本發明之其他態樣係玻尿酸類溶液之pH值為2〜5之上述

態樣之方法。於該純化方法或製造方法中，藉由於特定pH 值條件下使用吸附劑、尤其是活性碳，而可將玻尿酸類之 低分子量化抑制在較低水平，並可將雜質高效地吸附·去 除。關於PH值之調節’可使用處於適合之pH值範圍内之 玻尿酸類溶液’亦可使用酸·驗調整至適合之pH值範圍 2 ’或者亦可於吸附•過渡之操作步驟中，將作業溶液調 整至特定卩：《值。 :而’根據上述態樣之方法，藉由於特定pH值條件下在 尤其是活性碳，而可將玻展酸類之消失抑㈣ 水平’並且亦可有效地分離·去除作為雜質之不僅— 154808.doc 201139462 般藉由活性碳可去除之高分子化合物（例如菌體、蛋白 貝、核酸、内毒素），甚至低分子化合物（例如胺基酸、 糖、有機酸）。另外，上述態樣之方法藉由於特定pH值條 件下使用吸附劑、尤其是活性碳，而發揮優異之去除活 菌、蛋白質、胺基酸、及/或内毒素之效果，尤其於去除 蛋白質及/或内毒素時能取得更優異之效果。 進而’根據上述態樣之方法，藉由使吸附處理於特定pH 值範圍内進行’而可減少純化時之玻尿酸類之分子量之降 低’尤其於高分子量（例如純化後（例如繼吸附處理之過渡 後）之平均分子量為350萬〜700萬Da)之玻尿酸類之純化中 發揮優異之效果。 本發明之其他態樣係玻尿酸類溶液之pH值為4〜5之上述 態樣之方法。於該純化方法或製造方法中，由於吸附劑或 活性碳與菌體之吸附變得更加良好，因此可提高純化之精 度’並且即便於使用相對較大孔徑（例如較菌之尺寸（約1 μηι)大之孔徑等）之過濾介質進行過濾之情形時，亦可徹底 過濾菌體（防止菌漏），通液亦變得容易。 另外’於本發明之進一步態樣中，於上述態樣中，玻尿 酸類係由馬鏈球菌FM-100(微工研條寄第9027號）或馬鏈球 菌FM-300(微工研條寄第2319號）而生產。藉由使用由該等 微生物生產之玻尿酸類作為純化對象，雜質會更少，可獲 得向分子量之玻尿酸類純化物’尤其於作為醫藥使用時會 發揮優異之效果。 糟由使用上述態樣之純化方法可減輕玻尿酸類之分離. 154808.doc •19· 201139462 純化步驟之負荷，因此有關上述態樣之純化方法於玻尿酸 類製造之工業製程之較初始階段中使用尤為有效。 進而，藉由將上述態樣之純化方法於無塵環境下實施， 而可實現先前難以實現之醫藥品所要求的高品質之玻尿酸 類之工業規模的有效之純化。此種純化方法於醫藥品用之 玻尿酸類之生產中，具有極高之產業有用性。 另外，藉由上述實施態樣、上述態樣而說明之純化方法 荨並非係限疋本發明者，係旨在舉例說明而揭示者。本發 明之技術範圍係由申請專利範圍之揭示所規定，業者可於 申請專利範圍所揭示之發明之技術範圍中進行各種設計變 更。 上述純化方法亦可為進而包括其他步驟 例如 上述純化方法之後進而實施其他步驟·方法，而製造玻义 酸類等之方法。作為此種步驟•方法，例如可列舉：培与 玻尿酸生產微生物菌株之步驟、由玻尿酸產生微生物❹ 培養液製造培m之步驟、離,。、分離純化對象液之与 驟、中和對象液之步驟、微遽純化對象液之步驟、透析肩 理對象液之步驟、於純化對象液中添加芳香族系吸附樹用 並授拌及超濾之步驟、藉由層析法將對象液純化之步驟、 將活性碳自對象液中分離之步驟、將活性碳自對象液^ 除之步驟、添加有機溶劑使玻尿酸類沈殺之步驟、將玻肩 酸類結晶化之步驟、使玻尿酸類乾燥之步驟等。 [實施例] 以下，藉由實施例更加具體地說明本發明，但本發明孟 154808.doc

•20- 201139462 不限定於該等。 將使用馬鏈球菌FM-100(微工研菌寄第9027號）而培養之 醱酵液150 ml(玻尿酸鈉濃度3.5 g/1、pH值4.0)採集至3〇〇 ml之玻璃燒杯中，於表【或2所示之條件下進行吸附劑處 理’使用磁力攪拌器以400 rpm懸浮攪拌處理3 〇分鐘。使 用遽紙將§亥處理液加壓過遽，於渡液15〇 mi中添加氯化納 4.5 g(3.0重量％)後，以乙醇600 mi使玻尿酸鈉析出。將該 析出玻尿酸鈉用乙醇3〇〇 ml清洗後，使其於4〇下真空乾 燥而獲得玻尿酸鈉0.5 g。 使用表4所示之評價項目 '評價基準，對如此獲得之玻 尿酸鈉進行評價。將純化條件及評價結果示於表2及3。 另外，於吸附處理時之溶液之pH值為丨時，含有作為純 化對象之玻尿酸之培養液會凝膠化，而無法實施純化步驟 (吸附處理等）。 154808.doc -21 - 201139462 ©N «Λ fW § H •0 « *Λ * • < <ΰ •Λ 寒 ο 1 •δ- e- 〇 VD § 00 »〇 rn 〇 Tomix AD700N »η *s * • «Λ» 8 »Λ 轺 1 ** -6- B- S VD g ί >r> r^t P- <rj ro § 〇 1 2 ά *Λ ,s I! *n • > S rr *Λ Ο « \ ♦ 〇 VD 1 vi ίϊ SO *n ίΛ Tf § & L· *〇 > i «η • s TT •Ο Ο 隹 1 ♦ 〇 V( 1 VD *r> r*i ΙΛ «〇 ί*·ί 〇 Μ «i tt *r\ Kurimba (殼聚嫌衍生物） *Λ r*' * * s Ο 钼 1 *#κ 〇 VB I να ίϊ Tj- *Λ Γ"ί § < <〇 »〇 • * • • § «Λ Ο 琪 1 •Ον S VD 1 vi r> «r> <η § |z w» 卜’ • • • * 8 •Λ Ο \ μ VD i vi «/> «Ν »Λ r*i β Μ •0 * *rj • • • 1 ν> Ο 1 *〇\ ο VD 1 vi »Λ ΓΛ ♦ο m. ' • • • • ' * «? «? ($ 扫 ο 1 Λ •Λ 餐 i I I ί m # » g 1 g « 1 «拌轉速 irpm] 1 Ε 亩 * ef 涵 •0 6Μ ¥ 妹 C Ί i 在 £ « £ « «1 ift * £ «Κ 。5

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Claims (1)

1. 201139462 七、申請專利範圍： 1. 一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括以下步驟：使 包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自 由（1)活性碳、（2)無機吸附劑、（3)無機吸附劑及有機吸 附劑、（4)無機吸附劑及活性碳、（5)無機吸附劑、有機 吸附劑及活性碳、（6)有機吸附劑、及（7)有機吸附劑及 活性碳所組成群中之吸附劑。 2. 一種玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其包括以下步驟：使 包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自 由（1)活性碳、（2)無機吸附劑、（3)無機吸附劑及有機吸 附劑、（4)無機吸附劑及活性碳、（5)無機吸附劑、有機 吸附劑及活性碳、（6)有機吸附劑、及⑺有機吸附劑及 活性碳所組成群中之吸附劑，藉此純化玻尿酸及/或其 鹽0 3.如清求項1或2之方法，其中上述玻尿酸類溶液之pH值為 2〜5。 其申包括使上述玻尿酸 其中上述活性碳為濕潤 4.如請求項1至3中任一項之方法 類溶液與活性碳接觸之步驟。 5·.如請求項！至4中任—項之方法 化處理活性碳。 6.

   如請求項1至5中任一瑁夕古土 ^ ^ ^ _ 項之方法，其中包括於上述接觸步 驟之則將氯化納添加至上述玻尿酸類溶液中之步驟。 如請求項1至6中任一頊 .,L x 項之方法，其中上述雜質包括菌 、蛋白質、核酸、低分子化合物、或内毒素。 I54808.doc 201139462 8. 如請求項!至7中任一項之方法，其中上述雜質包括蛋白 質或内毒素。 9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中純化後之玻尿酸及/ 或其鹽之平均分子量為350萬~700萬Da。 10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中上述玻尿酸類溶液 中之玻尿酸及/或其鹽之濃度為1~10 g/L。 11. 如請求項1至1〇中任一項之方法，其中上述步驟係於無 塵環境下進行。 154808.doc 201139462 四、指定代表圖·· (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 154808.doc