TW201137128A

TW201137128A - Biodegradation process and composition

Info

Publication number: TW201137128A
Application number: TW099145506A
Authority: TW
Inventors: Jaime Lopez-Cervantes; Dalia Isabel Sanchez-Machado; Karl Reiner Fick-Rochin
Original assignee: Agrinos AS
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2011-11-01
Also published as: AR079582A1; US8748124B2; EP2515674A1; CN102665436B; MX2012007293A; BR112012015501A8; EP3075842A1; US20120315668A1; CN102665436A; EP2515674B1; UY33146A; ES2572764T3; BR112012015501A2; WO2011076759A1; US20110151508A1

Description

201137128 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明揭示供處理海洋動物副產物，且在某些情況下 ’處理整個海洋動物以製造含有有用之化合物的固體、液體及脂質部分之新穎微生物組成物及微生物方法。【先前技術】 0 魚類及海洋節肢動物（諸如蝦、蟹及小龍蝦）之加工過程產生大量之海洋副產物。大部分係用在低端產品，諸如肥料、魚貯飼料或寵物食品，但該未使用之副產物造成海洋產品加工業之經濟負擔，因爲要需要以對環境無害的方式處理這些殘留物。估計這類副產物佔總漁獲量之25 %。例如，在爲蝦類加工以供隨後冷凍及營銷期間將產生大量之殘餘物，因爲該動物有3 5 %不能食用，必須丟棄〇。這些剩餘物或副產物係由蝦之頭胸部和外骨骼所組成。然而’這些蝦副產物富含高價値物質，諸如甲殼素、蛋白質、脂類、類胡蘿蔔素色素（蝦青素（astaxanthine )) 及礦物質。大部分不可食用之副產物傾倒棄置於堆塡區或倒回海洋’從而造成嚴重之環境問題和蝦加工業之大量損失。目前’這些副產物中只有少量被作爲動物飼料之補充品。最常用於蝦副產物利用之技術爲日曬乾燥。此技術具有較低之衛生控制且產品主要係供動物食用。其他方法係 201137128 採用用於萃取甲殼素及回收蛋白水解產物之不同濃度的化學酸和鹼、溫度及時間。然而，這些方法導致甲殻素之解聚及部分去乙醯化。此外，這些方法使其他產品（諸如蛋白質和色素）之回收複雜化。用於萃取甲殻素、液態水解產物及色素之酶方法已發展出來。這類方法係使用酶萃取物或酶分離物。其他硏究已報導使用微生物之酶，諸如用於萃取來自蝦及海洋動物副產物之蛋白質的鹼性蛋白酶商品。鹼性蛋白酶及胰酶之組合已有報導可用於萃取甲殼素、水解之蛋白質及經染色之脂質。乳酸醱酵法已被用來作爲上述化學和酶方法之替代。醱酵代表一種符合成本效益之技術，其穩定並保留副產物之營養品質。醱酵之最佳條件取決於幾個因素，包括碳水化合物之選擇及濃度、pH値、溫度、時間及有氧或厭氧條件之選擇。另一個重要因素爲微生物及初始接種濃度的選擇。爲了促進蝦副產物之醱酵過程，已使用乳酸菌（ LAB )之純培養。這類LAB包括植物乳桿菌（Rao, M.S.， Stevens, W.F.， 2006, “Fermentation of shrimp biowaste under different salt concentrations with amylolytic and non-amylolitic Lactobacillus strains for chitin production,” Food Technology and Biotechnology 44, 8 3 -87; Rao, M.S., Munoz, J., Stevens, W.F., 2000, "Critical factors in chitin production by fermentation of shrimp biowasteApplied Microbiology and Biotechnology 5 4, 201137128 8 08-8 1 3; Bhaskar， N” Suresh， P. V., S akhar e, P.Z.， S achindra, N.M·， 2007， “Shrimp bio waste fermentation with P edio co ecus acidolactici CFR2182: optimization of fermentation conditions by response surface methodology and effect of optimized conditions on deproteination/ demineralization and carotenoid recovery，，’ Enzyme and Microbial Technology 40， 1427-1434)、学 L 桿菌屬 B 2 (

Cira，L.A.，Huerta，S·，Hal，G.M·，Shirai，K·，2002，“Pilot scale lactic acid fermentation of shrimp waste for chitin recovery,” Pro cess Biochemistry 37， 1359-1366; Shirai， K., Guerrero, I., Huerta, S.， Saucedo, G., Castillo, A.,

Gonzalez, R.O·， Hall， G_M., 2001， “Effect of initial glucose concentration and inoculation level of lactic acid bacteria in shrimp waste ensilation，” Enzyme and Microbial Technology 28, 446-452 )、乾酷乳桿菌（

Shirai 200 1 )、畐!J 乾酪乳桿菌（Jung，W. J .，Jo，G ·H ·， Kuk5 J.H·， Kim， Y.J., Oh， K.T., Park， R.D·， 2007, “Production of chitin from red crab shell waste by successive fermentation with Lactobacillus paracasei KCTC-3074 and Serratia marcescens FS-3，” Carbohydrate Polymers 6 8, 746-7 50 )、戊糖乳桿菌（B au t i s t a，J .， J over, M., Gutierrez, J.F.， Corpas， R.， Cremades, 0.， F ontiveros, E., Iglesias 5 F.，Vega, J.，2001, “Preparation of crayfish chitin by in situ lactic acid production,” 201137128

Process Biochemistry 37, 229-234; Shirai 2001 )、嗜酸乳桿菌B4495及乳酸乳桿菌（Bhaskar 2007 )、沙瓦瑞斯乳桿菌(Lactobacillus s a Ivarus ) ( Beaney 2 0 0 5 )、冀腸球菌（Beaney 2005 )、乳酸片球菌（ acidilactici ) ( Bhaskar 2007 )和片球菌屬 Ll/2 (

Choorit, W” P atthanamanee, W., Manurakchinakorn, S.， 2008, “Use of response surface method for the determination of demineralization efficiency in fermented shrimp shells,” Bior es, Technol, 99， 6168-6173 ) 〇此外，已使用四種LAB之混合物（Bhaskar 2007 )且有組合使用乳桿菌與黏質沙雷氏菌FS_3 ( Jung 2007 )或肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus ) (Shirai 2 0 0 1 )之幸g 導。然而，這類醱酵法之工業化至今並沒有成功，因爲商業接種劑之效能不佳。蝦副產物乳酸醱酵時會產生蛋白質水解產物、甲殼素、礦物質及脂質。甲殻素及其去乙醯化之衍生物在農業、生物醫學、食品及造紙業中有很多種應用，而液態水解產物爲可供人類或動物食用之必須胺基酸的優越來源。該脂漿含有固醇、維生素A和E’以及類胡蘿蔔素色素，諸如可用於鮭科魚之飼料的蝦青素或作爲食品工業中之天然色素。甲殼素爲一種天然多醣’尤其是可在甲殼類之外骨骼、昆蟲之角質層及真菌之細胞壁中發現。由於甲殻素爲含量最豐富的生物聚合物之一，其生物醫學、生物技術和工 -8 - 201137128 業應用已引起廣大之興趣。殼聚醣爲經由將甲殼素（冷_ 1-4 ) -N-乙醯基-D-葡糖胺去乙醯化所產生之聚（冷_1_4 )-N -乙醯基-D-葡糖胺化合物。葡糖胺爲一種經由將殻聚醣解聚所取得之單糖。其參與構成葡糖胺聚糖，此爲胞外複合多醣之主要類別。硫酸葡糖胺、鹽酸葡糖胺及N-乙醯基-葡糖胺通常係單獨使用或作爲混合物之一部分。一般而言，液態水解產物之必需胺基酸含量高，表示 0 其具有高營養價値，證明其可作爲動物及水產養殖營養之補充品或作爲微生物生長介質之氮源。此外，這些水解產物爲游離胺基酸之來源且可用於植物之營養中作爲生物刺激劑。蝦青素（3，3’-二羥基-沒，/3-胡蘿蔔素-4,4’ -二酮）（此爲一種從胡蘿蔔素氧化之酮基類胡蘿蔔素）天然產生於各種各樣之海洋和水生生物中。由於其誘人之粉紅色、其作爲維生素A先質之生物學功能及抗氧化活性，蝦 Q 青素可作爲食品和藥物中之著色劑。在蝦青素之結構中可在C3和C3’處發現兩個同等之不對稱碳原子。然而，反式蝦青素爲甲殻類物種中數量上最普遍之類胡蘿蔔素。揭示這些和其他來自乳酸醱酵之產品的參考文獻包括 : Sanchez-Machado et al. “Quantification of organic acids in fermented shrimp waste by HPLC” Food Technology and Biotechnology， volume 46, 45 6 (2008);

Sanchez-Machado et al. 66 High-performance liquid chromatography with fluorescence detection for 201137128 quantitation of tryptophan and tyrosine in a shrimp waste protein concentrate”， Journal of Chromatography B, volume 863， 88 (2008); Lopez-Cervantes et al., “Quantitation of glucosamine from shrimp waste using Η P L C ” Journal of Chromatographic Science, volume 45, 1 (2007); Lopez-Cervantes et al., “Quantification of astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by Η P L C，’ Biomedical Chromatography, volume 20， 981 (2006); Lopez-Cervantes et al., “High-performance liquid chromatogr aphy method for the simultaneous quanti fi cation of retinol, alpha-tocopherol， and cholesterol in shrimp waste hydrolysate” Journal of Chromatography A, volume 1105， 1-2 (2006); Lopez- Cervantes et a 1.， “Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatogr aphy’ ’，Journal of Chromatography A， volume 1105, 1 (2006)= 【發明內容】此處揭示微生物組成物及生物降解方法。一種微生物組成物’其包含（a ) 一或多種乳酸菌（ LAB )及（b) —或多種，或二或多種選自下列菌屬之微生物：桿菌、固氮菌、木黴、根瘤菌、梭狀芽孢桿菌、假單胞菌、鏈黴菌、微球菌、硝化桿菌及變形桿菌屬。於較 -10- 201137128 佳之體系中，至少一種桿菌、固氮菌、木黴、根瘤菌、梭狀芽孢桿菌、假單胞菌、鏈黴菌、微球菌、硝化桿菌及變形桿菌屬爲產生甲殼素酶（如：內甲殻素酶及/或外甲殼素酶）之甲殼素分解菌株。於一些微生物組成物中，該 LAB係選自下列菌屬：乳桿菌、片球菌、乳球菌及鏈球菌。當該LAB爲乳桿菌時，較佳地，該LAB爲嗜酸乳桿菌及/或乾酪乳桿菌’更宜爲嗜酸乳桿菌（仏Merpac， 20M)及乾酪乳桿菌（以。本組成物中之桿菌宜選自下列群組：枯草桿菌（ Saci/Zw·? 、繼狀桿菌cerews)、巨大桿菌（Bacillus megateriu )、地衣桿菌（//Μλ /icAewi/ormi·?)及蘇雲金桿菌（5ac!·//!/·? thuri n giensis ) ，更宜爲枯草桿菌（SIL〇Sil®BS )、蠟狀桿菌（ B ioderpac，2 008 )、地衣桿菌(Bioderpac，2008 )及蘇雲金桿菌 HD-1 及 HD -73 菌株（SILoSil®BT)。

本組成物中之固氮菌宜爲棕色固氮菌（ Wne/a«dz‘〇，更宜爲棕色固氮菌（，2005)。本組成物中之木黴宜爲哈茨木黴（TWcAoi/ermfl hrz/anMm)，更宜爲哈茨木黴（TRICHOSIL)。本組成物中之根瘤菌宜爲大豆根瘤菌（ japonicum )，更宜爲大豆根瘤菌（5 ac，2005)。本組成物中之梭狀芽孢桿菌宜爲巴斯德梭狀芽孢桿菌 (C/oiir/i/iww pasiewrianM)，更宜爲巴斯德梭狀芽孢桿菌(Bioderpac，2008)。 -11 - 201137128 本組成物中之假單胞菌宜爲螢光假單胞菌（ Pseudomonas fluores cens )，更宜爲螢光假單胞菌（ Bioderpac > 2008)。另一微生物組成物包含一或多種、或二或多種選自下列群組之微生物：枯草桿菌（SIL〇Sil®BS )、蠟狀桿菌（ Bioderpac，2 008 )、巨大桿菌(Bioderpac ’ 2 008 )、棕色固氮菌、嗜酸乳桿菌，)、乾酪乳桿菌（以、哈茨木黴 (TRICHOSIL )、大豆根瘤菌（仏〇心7以，2005 )、巴斯德梭狀芽孢桿菌（)、地衣桿菌（ Bioderpac，2 0 0 8 )、螢光假單胞菌(Bioderpac » 2008 ) 、蘇雲金桿菌HD-1及HD -73菌株（SILoSil®BT ))、鏈黴菌(Bioderpac ' 2 0 0 8 )、微球菌(Bioderpac > 2008 )、硝化桿菌（A’oderpac，) 及變形桿菌（ Bioderpac ， 2008 )。另一微生物組成物之體系包含嗜酸乳桿菌（ Bioderpac，2 008 )及 / 或乾酷孚 L 桿菌(Bioderpac » 2 008 )° 特佳之微生物組成物包含枯草桿菌（SILoSil®BS)、蠟犬桿菌(Bioderpac > 2008 )、巨大桿菌（5/ot/erpac ， 2005)、榇色固氮菌（5/〇心7^£；，20£>8)、嗜酸乳桿菌 (Bioderpac » 2008 )、車乞酪学L 桿菌(Bioderpac > 2008 ) 、哈茨木黴（TRICHOSIL)、大豆根瘤菌（化 2005)、巴斯德梭狀芽孢桿菌（5iot/er/?ac，20〇<§)、地 -12- 201137128 衣桿菌（5i〇i/erpac，2(9t>5)、螢光假單胞菌（_g/o<ierpac ，2008、、蘇雲金桿菌 HD-1 及 HD -73 菌株（ SILoSil®BT) > Μ M ® ( Bioderpac > 2008 )、微球菌 r Bioderpac，2008 )、石肯化桿菌(Bioderpac > 2 0 08 )及變形桿菌)。較佳之微生物組成物爲HQE。HQE在2010年4月27 曰存放於美國維吉尼亞州馬納薩斯，美國菌種保藏中心（ 0 ATCC)，指定之專利寄存編號爲PTA- 1 086 1。此處亦揭示選自下列群組之經分離的微生物：枯草桿菌（SILoSil®BS)、繼狀桿菌{Bioderpac，2008 )、巨大桿菌 C B i o d e rp a c，2 0 0 8 )、掠色固氮菌 MM )、嗜酸乳桿菌（，200S )、乾酪乳桿菌 (Bioderpac，2 008 )、哈茨木黴（TRICHOSIL)、大豆根瘤菌（5/〇i/erpac，206>S)、巴斯德梭狀芽孢桿菌（ Bioderpac，2 008 )、地衣桿菌(Bioderpac > 2008 )、螢 Q 光假單胞菌（，200«?)、蘇雲金桿菌HD-1及 HD -73 菌株（SILoSil®BT)、鏈黴菌{ Bioderpac，2 008 )、微球菌(Bioderpac f 2008 )、硝化桿菌(Bioderpac ’2008 )及變形桿菌，2005 )。該生物降解方法包含使海洋動物或海洋動物副產物與任一前述微生物組成物混合以形成混合物；令該混合物醱酵；並令該混合物分離成固體、水性及脂質部分。不像先前技藝中之生物降解方法，此處揭示之生物降解方法產生可在水液部分找到之殻聚醣和葡糖胺。該海洋動物宜爲海 -13- 201137128 洋節肢動物’諸如蝦、小龍蝦、螃蟹或磷蝦。於一些體系中’該海洋動物爲魚類或魚類副產物，諸如魚皮、肌肉或器官。【發明之詳細說明] 本文中所使用之“海洋動物，，一詞係指任何生活在海洋、海水或淡水之動物。海洋動物包括魚類及海洋節肢動物 0 本文中所使用之“海洋節肢動物” 一詞係指生活在海洋、海水或淡水，具有外骨骼之海洋無脊椎動物。一般而言’海洋節肢動物具有分節之身體及有關節之附屬肢體。海洋節肢動物爲甲殼動物亞門之成員。較佳之甲殼動物類別包括總足綱(如：鹽水锻、枝角類及恐龍嘏（Triops))、頭嘏綱（CepAa/ocarirfa)(如：馬蹄蝦）、顎足綱（）（如：藤壺及橈足類（浮游動物））、介形蟲綱（如：介形蟲）和軟甲綱（ Ma/acoWraccO (如··螃蟹、龍蝦、蝦、磷蝦，等）。本文中所使用之“副產物”一詞係指海洋動物之任何部分。於一些體系中，該副產物係藉由將海洋動物商業加工製造。例如：在蝦工業中，頭胸部及外骨骼爲蝦副產物。在螃蟹和龍蝦加工業中’外骨骼（外殼）爲一種副產物〇於一些體系中，整個節肢動物均可用於生物降解方法中。例如：許多成齡磷蝦長約丨_2厘米（0·4·0.8英寸） -14- 201137128 ，但也有些品種長到6 _ 1 5厘米（2.4 - 5.9英寸）之大小。磷蝦油含有至少有三種成分：（i )類似於魚油中之ω - 3 脂肪酸’ （2 )與磷脂共軛結合之ω - 3脂肪酸及（3 )抗氧化劑蝦青素。此外’該外骨骼含有氟化物。因此，這些成分可在生物降解方法中令油成分隨著脂質部分被分離出來而氟化物係在液體部分中被分離出。本文中所使用之“微生物組成物”一詞係指含有或生理 0 上支持—或多種（宜爲二或多種）微生物之液態、固態或凝膠狀介質。微生物組成物包括，但不限於含有一或多種微生物之醱酵肉湯及接種物，該接種物一般係用於啓動醱酵肉湯且含有較存在於醱酵肉湯中者高之微生物濃度。含有菌種/菌株之微生物組成物有時候被稱爲“Bioderpac微生物組成物”，其係指含有一或多種微生物，或一或多種微生物與其他微生物之組合的組成物。本文中所使用之“經分離之微生物”一詞係指含有或生〇理上支持一種微生物之液態、固態或凝膠狀介質。該揭示之微生物組成物或經分離之微生物可與其他微生物組合以形成一種新微生物組成物，其可用於除了此處具體揭示者以外之方法中。揭示之微生物的選擇將取決於其生物屬性（如：產製蛋白質或碳水化合物或甲殼素降解酶），其他選定之微生物及其中欲使用該組合物之方法。熟習本技藝之人士依照此處之揭示內容將可清楚明白如何而選擇這類成分及方法。一種微生物組成物，其包含（a) —或多種乳酸菌（ -15- 201137128 LAB )及（b) —或多種，或二或多種選自下列群組之微生物：桿菌、固氮菌、木黴、根瘤菌、梭狀芽孢桿菌、假單胞菌、鏈黴菌、微球菌、硝化桿菌及變形桿菌屬。於較佳之體系中，至少一或多種、二或多種或三或多種桿菌、固氮菌、木黴、根瘤菌、梭狀芽孢桿菌、假單胞菌、鏈黴菌、微球菌、硝化桿菌及變形桿菌屬爲製造甲殼素酶（如 :內甲殼素酶和/或外甲殼素酶）之甲殼素分解菌。於某些微生物組成物中，該LAB係選自下列菌屬：乳桿菌、片球菌、乳球菌及鏈球菌。當LAB爲乳桿菌時，該LAB 宜爲嗜酸乳桿菌和/或乾酪乳桿菌，更宜爲嗜酸乳桿菌（ Bioderpac，2008 )禾口乾酪学 L 桿菌(Bioderpac > 2008 )。本組成物中之桿菌宜選自下列群組：枯草桿菌、躐狀桿菌、巨大桿菌、地衣桿菌及蘇雲金桿菌，更宜爲枯草桿菌（SILoSil®BS)、繼狀桿菌(Bioderpac ' 2008 )、地衣桿菌及蘇雲金桿菌HD-Ι及HD -73 菌株（SILoSil®BT)。本組成物中之固氮菌宜爲粽色固氮菌，更宜爲棕色固氮菌(Bioderpac > 2008)。本組成物中之木黴宜爲哈茨木黴’更宜爲哈茨木黴（ TRICHOSIL )。本組成物中之根瘤菌宜爲大豆根瘤菌’更宜爲大豆根瘤菌(Bioderpac y 2008)。本組成物中之梭狀芽孢桿菌宜爲巴斯德梭狀芽孢桿菌，更宜爲巴斯德梭狀芽孢桿菌（)。 -16- 201137128 本組成物中之假單胞菌宜爲螢光假單胞菌，更宜爲螢光假單胞菌（，2005)。另一微生物組成物包含一或多種、或二或多種選自下列群組之微生物：枯草桿菌（SIL〇Sil®BS )、蠟狀桿菌（ Bioderpac ， 2 0 0 8 )、巨大桿菌(Bioderpac ， 2008 )、掠色固氮菌、嗜酸乳桿菌，)、乾酪乳桿菌（以)、哈茨木黴 0 ( TRICHOSIL )、大豆根瘤菌（以〇心rpac , )、巴斯德梭狀芽孢桿菌（以，20以）、地衣桿菌（ Bioderpac，2 0 0 8 )、螢光假單胞菌(Bioderpac，2008 ) 、蘇雲金桿菌HD-1及HD -73菌株（SILoSil®BT))、鏈黴菌(Bioderpac > 2 0 0 8 )、微球菌(Bioderpac，2008 )、硝化桿菌（，20以）及變形桿菌（ Bioderpac > 2008)。另一微生物組成物體系包含嗜酸乳桿菌（ac ❹ ，及 / 或乾酪乳桿菌。特佳之微生物組成物包含枯草桿菌（SILoSil®BS )、蠟狀桿菌（5z'oder;?ac，2005)、巨大桿菌（， )、棕色固氮菌（5/orfe/^ac，20以）、嗜酸乳桿菌 (Bioderpac > 2 008 )、乾酪乳桿菌（、哈茨木黴（TRICHOSIL )、大豆根瘤菌（， 2 0以）、巴斯德梭狀芽孢桿菌oderpac，2⑹〇、地衣桿菌（户ac，200S)、蛋光假單胞菌（_gf〇i/er；7ac ^ 2008 )、蘇雲金桿菌 HD-1 及 HD -73 菌株（ -17- 201137128 SILoSil®BT) ' Μ ® ( Bioderpac > 2008 )、微球菌 f Bioderpac ， 2 0 0 8 )、石肖化桿菌(Bioderpac ’ 2008 )及變开多桿菌(Bioderpac > 2008 )。用於生物降解方法中之較佳的微生物組成物爲HQE 〇HQE在2010年4月27日存放於美國維吉尼亞州馬納薩斯，美國菌種保藏中心（ATCC )，指定之專利寄存編號爲PTA-10861。HQE爲由來自肥沃土壤之微生物及商業來源之微生物所組成之微生物群。商業來源之微生物包括枯草桿菌（SILoSil®BS)、蘇雲金桿菌 ND-1和 HD -73 菌株（SIL〇Sil®BT))及哈茨木黴係各來自以菌株或菌種命名爲 “ Bioderpac 2008 ” ，墨西哥微生物中心， Michoacan，Morelia > Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V.’菌株可來自HQE。然而，亦可使用HOE中之微生物亞群。枯草桿菌（SILoSil®BS )、蘇雲金桿菌（ SILoSil®BT))及哈茨木黴（TRICHOSIL)微生物製造生物降解開始時特別重要的甲殼素酶。甲殻素酶協助降解可構成屏障之含有甲殼素的固體，以進一步消化。這些有機體亦產生蛋白酶、脂肪酶及其它促進蛋白質、脂類和碳水化合物分解之酶。本文中所使用之“HYTb” 一詞係指自生物降解方法取得之水液部分。H YTb通常含有胺基酸（約3重量％至12 重量％，通常約爲12重量％)、殻聚醣（約1.2重量％ )、葡糖胺（約1重量％)及微量元素（約6重量％)( 包括鈣、鎂、鋅、銅、鐵和錳）。殼聚醣之量係在約0.5 -18- 201137128 重量％至1.5重量％之範圍內，更宜爲約1.0重量％至 1.5重量％。葡糖胺之量可在約0.5重量％至1.5重量％之範圍內，更宜爲約1.0重量％至1.5重量％。殼聚醣和葡糖胺之總量約爲2.0至2.5重量％。HYTb亦含有酶，諸如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、甲殼素酶、乳酸、多肽及其他碳水化合物。HYTb之特定比重通常爲約 1.050-1 .054。H YTb中某些胺基酸之平均胺基酸含量列於表1中 201137128 表1 乾粉水解產物之胺基酸槪況 (每克乾燥重量之毫克數）胺基酸雛7iC解產物天門冬胺酸 38 麩胺酸 39 絲胺酸 16 組胺酸* 9 甘胺酸 28 蘇胺酸* 14 丙胺酸 36.1 脯胺酸 25.8 mm* 70 精胺酸 22.2 纈胺酸* 20 蛋胺酸* 16.4 異白胺酸* 18.3 色胺酸* 3.1 白胺酸* 23 苯丙胺酸* 39 賴胺酸* 13 全部 1 431 *必須胺基酸 226 HYTb通常係經由將該由生物降解產物形成之醱酵產物離心來產生。當生物降解方法進行時，用於生物降解方法用之微生物（如：HQE )的營養物質被耗盡，且由於醱酵過程中產生之酸而使pH値下降。這將導致醱酵產物中之微生物死亡或成爲休眠狀態。根據醱酵產物離心力之g 及離心之時間’這類微生物可在HYTb中找到。因此， -20- 201137128 HYTb可包括任何一或多種上述鑑別之成分，例如：殼聚醣及葡糖胺，加上醱酵方法停止時存在之全部或部分微生物成分。另外，離心可能進行至其中幾乎所有的微生物成分均從HYTb竭盡之點。在此種情況下，該微生物成分可離心成HYTc部分。另外，HYTc可藉由低g離心從HYTb 分開。然後，HYTb可經離心以形成一個微生物沉澱小九及不含微生物之HYTb水溶液。 0 本文中所使用之“HYTc”一詞係指從生物降解方法取得之固體部分。HYTc之主要成分爲甲殼素。其平均分子量通常爲約2300道耳吞且構成該組成物之約64重量％。 HYTc包含約6%之礦物質（包括鈣、鎂、鋅、銅、鐵、錳），約24重量％之蛋白質及6%的水》其特定比重爲約 272公斤/米3。HYTc中之甲殼素通常具有來自醱酵產品中與其聯結之微生物。甲殻素分解微生物傾向與固體甲殼素聯結。此係基於甲殼素分解微生物對甲殼素基質之 Q 親和力。因此，HYTc亦可能包含甲殼素分解微生物，除非採取步驟將其移除。在HQE之情況中，這類甲殼素分解微生物包括此處所討論之一或多種製造甲殼素酶及/或外甲殼素酶之微生物。這類微生物包括，但不限於枯草桿菌（SIL〇Sil®BS)、蘇雲金桿菌HD-1及HD -73菌株（ SIL〇Sil®BT)及哈茨木黴（TRICHOSIL)。甲殻素分解微生物可經由消毒、巴斯德滅菌或以抗微生物化合物（諸如肥皂或氯氣）清洗甲殼素而自固體甲殼素移除。HYTc 亦可包含在生物降解方法結束時由於存有殘餘之醱酵產物 -21 - 201137128 或HYTb離心而出現之其他微生物。 HQE群下列爲HQE中之咸信涉及生物降解方法之微生物及其已知之性質。於某些情況中，該菌株被鑑別爲 “Bioderpac，2008”。當不知道菌種時，該菌種和菌株被鑑別爲 “Bioderpac ， 2008” HQE於2010年4月27日存放於ATCC，指定之專利存放名稱爲PTA- 1 086 1。枯草桿菌（SILoSil®BS)爲一種嗜溫且生長在25至 3 5 °C間之最佳溫度的革蘭氏陽性菌。其爲需氧菌且可生長在無氧條件下，並利用各式各樣的碳來源。其含有二種硝酸還原酶，其中之一係用於氮同化作用。其可分泌澱粉酶、蛋白酶、普魯藍多糖酶（puiluianases)、甲殼素酶、木聚糖酶和脂肪酶。蘇雲金桿菌（HD-1及HD -73菌株（SILoSil®BT) )爲周生鞭毛形之革蘭氏陽性兼性厭氧菌。HD-1及HD -73菌株在孢子期間合成具有蛋白質及殺蟲活性之不同幾何形狀的晶體。HD-1及HD -73菌株在含有甲殼素之介質中會分泌外甲殼素酶且可在製造殼寡糖期間用於降解甲殼動物之殘留物。纖狀桿菌（Bioderpac，2008)爲一種革蘭氏陽性兼性需氧菌’且會形成孢子。其爲嗜溫性且生長於20至 40。(：間之最佳溫度下。其產製抗生素雙效菌素A( -22- 201137128

Zwittermicin A)和卡那黴素糖胺（Kanosamine)。地衣桿菌（Bioderpac ’ 2008 )爲一種能動性且形成孢子之革蘭氏陽性兼性厭氧細菌。其產製桿菌素、α澱粉酶、內醯胺酶、蛋白酶及鹼性磷酸酶。此爲與植物或植物物質聯結之非致病性微生物。巨大桿菌（Bioderpac，2008 )爲革蘭氏陽性需氧菌。其被視爲腐物寄生菌。其產製葡萄糖脫氫酶、青黴素澱 ^ 粉酶、β -醯胺酶和中性蛋白酶。嗜酸乳桿菌（Bioderpac，2008)爲8種乳酸菌之一員。其爲革蘭氏陽性、無孢子且在利用乳糖作爲主要碳來源以產生能量的醱酵期間產生乳酸。其可在有氧或無氧之存在下生長在酸性介質中（pH値4-5 )。其產製稱爲乳酸桿菌素B之細菌素、有機酸、雙乙醯及過氧化氫。乾酪乳桿菌（Bioderpac，2008 )爲一種嗜溫、不形成孢子之革蘭氏陽性兼性厭氧菌。其可適應低温。其生長〇之最佳pH値爲5.5。其醱酵半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇及乙醯葡糖胺。此菌種可在廣泛之pH値和溫度範圍下生長。其可產製澱粉酶。其透過製造（1)有機酸，諸如醋酸、丙酸或乳酸，或（2)過氧化氫來降低 PH値以抑制病原菌生長（諸如幽門螺旋桿菌）。此微生物分泌細菌素。營光假單胞菌（Bioderpac，2008)爲具有多鞭毛、強制需氧之細菌且其最佳生長溫度爲25至35。(：。其產製耐熱脂肪酶及蛋白酶。其爲許多土壤真菌菌株之拮抗劑。 -23- 201137128 其製造次生代謝物’諸如抗生素、鐵蟹合物及氰化物。其在具有不同葡萄糖濃度之介質中製造內甲殼素酶及纖維素酶。哈茨木黴（TRICHOSIL)爲一種腐生真菌。它表現出抑菌作用及生物競爭’因此’具有生物控制屬性。其製造能降解細胞壁或這類活性之組合的酶。當與某些致病真菌（諸如鐮刀菌）交互作用時’其產製葡聚醣酶、甲殼素酶、脂肪酶及胞外蛋白酶。大豆根瘤菌（Bioderpac，2008)爲一種固氮菌。其合成參與氫氣再循環之氫酶系統’以避免在固氮期間損失之。棕色固氮菌（Bioderpac，2008)爲一種好氧菌。其產製固氮酶，並可固定氮。巴斯德梭狀芽孢桿菌（Bioderpac，200 8 )爲革蘭氏陽性專性厭氧菌。其產製在蛋白鐵還原作用中作爲直接電子供體之ferroxine (—種電子轉運蛋白）。普通變形桿菌（Bioderpac，2008)爲一種兼性厭氧革蘭氏陽性菌，其生長在接近2 3 °C之溫度下。其藉由其製造之酶以蛋白質水解方式將蛋白質降解成游離胺基酸。鏈徽菌屬（Bioderpac，2〇〇8)爲一種革蘭氏陽性土壤細菌。其產製代謝不同營養素之酶。其可在溫度、濕度和養分來源明顯改變時存活下來。由這些細菌製造之胞外酶係在pH値4.5至6·5，60 °C下利用甲殼素和殻聚醣作爲受質。這些爲生物降解方法中乳酸醱酵開始和結束階段產 -24- 201137128 生的情況。硝化桿菌屬（Bioderpac ’ 2〇〇8 )爲革蘭氏陰性好氧菌，其將亞硝酸鹽轉化成硝酸鹽。它生長在pH値6至9 及1 0至3 4 °C之溫度間。此細菌降解有機聚合物（諸如甲殻素）成可被其他有機體（諸如螢光假單胞菌及大豆根瘤菌（Bioderpac 2008 ))利用之化合物。微球菌屬（Bioderpac，2008 )爲球狀革蘭氏陽性菌。此種微生物結合鏈黴菌屬可降解膠狀甲殻素衍生物。 HQE中之微生物群體及酶活性生物降解海洋動物或副產物之成分需要水解酶，諸如蛋白酶、脂肪酶和甲殻素酶。該揭示之微生物組成物包含一或多種這類酶。 HQE中之主要微生物群爲嗜酸乳桿菌（Biodepac 2008 )、枯草桿菌（SIL〇Sil®BS )、螢光假單胞菌（ Bioderpac，2 008 )、地衣桿菌(Bioderpac ' 2008 )及哈茨木黴（TRICHOSIL)。這些微生物可降解節肢動物或節肢動物副產物。當與來自 HQE之其他微生物組合時，此主要群體之一或多個成員亦具有協同作用》該第一組微生物包括使pH値降低反由於其製造有機酸和過氧化氫因而可穩定醱酵之微生物。此組包括嗜酸乳桿菌（5/orfepac 2 008 )和乾酪乳桿菌（⑴odepac 200S) 。其活性在醱酵開始時及醱酵之最後階段對產生最佳之水解酶pH値是很重要的。其活性亦創造防止有害微生物生 -25- 201137128 長的培養環境，且有利於甲殼素殘留物脫礦。嗜酸乳桿菌 (Biodepac 2008)爲該主要群體之一員。第二組微生物包括產製胞外酶之微生物。此第二組包括枯草桿菌（SILoSil®BS )、蠘狀桿菌（， 2008 )、哈茨木黴（TRICHOSIL )、大豆根瘤菌（ Bioderpac > 2 0 08 )、巴氏梭菌(Bioderpac > 2008 )及棕色固氮菌（)。節肢動物或節肢動物副產物中之甲殼素鏈係與蛋白質分子聯結。分開這類聚合物需要取得由這些微生物製造之甲殼素和蛋白水解酶的水解作用。這兩種類型之酶均切斷聚合物內部部分之鏈以產生不同大小之寡聚物。來自這些酶之作用係在醱酵過程之中間和最後階段中當達到適當之pH條件時以連續的方式發生。此組微生物及其產製之環境條件促進色素及黏附於這些殘留物之脂質部分釋出。枯草桿菌（SIL〇Sil®BS )及哈茨木黴（TRICHOSIL)爲主要群體之成員。第三組微生物包括地衣桿菌（，2(?以）、螢光假單胞菌、鏈黴菌，20M)及梭狀芽孢桿菌（5/oc/^pac 20以）等微生物。這些微生物水解寡聚物（甲殼寡聚糖及肽類）以製造甲殼二碳糖、葡糖胺及游離胺基酸。地衣桿菌（Biodepac 2008 )及螢光假單胞菌（Biodepac 2008 )爲主要群體之成員。於較佳之體系中，該第一、第二及第三組微生物之一或兩個成員可組合在一起。或者，該第一、第二及第三組 -26- 201137128 微生物之所有成員可組合在一起。第四組微生物包括蘇雲金桿菌（HD-1及HD -73菌株 )、鏈黴菌（e/oderpac，2005)、微球菌， 2 0以）、硝化桿菌（仏oderpac , 2 ）及普通變形桿菌 (5 ί 〇 i/ e π a c，2 0 0 S )。第四組微生物可與下列各組組合 :(1)微生物之主要群體（2)該第一、第二及第三組微生物之任一組（3 )該第一、第二及第三組微生物之一或 0 兩個成員之組合，或者（4)該第二及第三組之所有成員的組合。加入此第四組可產生增強生物降解過程之協同效應。這些群體中之每一組（包括主要群體）可分別使用且可與先前技藝之微生物組成物組合，以提高其性能。在這方面，第四組爲特佳者。表2提出一些上述組合。第1欄爲已知之咸信在生物降解方法中具有活性之HQE中之微生物的列表。第2欄〇列出來自第1欄而不含第四組微生物的微生物。第3欄顯示主要微生物之組合，而第4、5和6欄確定來自第一、第二和第三組之微生物的組合。第4欄爲第一和二組之組合；第5欄爲第一和三組之組合而第6欄爲第二和三組之組合。其他有用之組合提供於第7-1 0欄中。 -27- 201137128 表2培養組成

微生物 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 枯草桿菌 X X X X X X X X 蠟狀桿菌 X X X X X X 巨大桿菌 X X 棕色固氮菌 X X X X X X 嗜酸乳桿菌 X X X X X X X X 乾酪乳桿菌 X X X X X X 哈茨木黴 X X X X X X X X 大丑根瘤菌 X X X X X X 巴斯德梭狀芽孢桿菌 X X X X X X 地衣桿菌 X X X X X X X X 螢光假單胞菌 X X X X X 蘇雲金桿菌 X X X X X X 鏈黴素 X X X X X X X 硝化桿菌 X X X X X 微球菌 X X X X X 普通變形桿菌 X X X X X -28- 201137128 由HQE內之微生物所製造之酶萃取物的活性是複雜的’但已可降解節肢動物（諸如甲殼類動物）之甲殼素殘留物。該HQE中之微生物係根據所環境所使用之有機體產生之環境以連續的方式活化。用於鑑別及分離在HQE中之微生物的方法在嘗試決定一種物種之特徵或鑑別物種前重要的是先 0 取得純分離株。一些細菌在形態上獨特且可不需分離即進行鑑別，但幾乎所有細菌均需要分離。下文描述自包含在 HQE中之菌種的混合物中分離出下列菌株之純培養：枯草桿菌（SILoSil®BS )、蠟狀桿菌（) 、地衣桿菌（5z_〇i/erpac，2005)、巨大桿菌（，）、嗜酸乳桿菌（Woderpac，20以）、乾酪乳桿菌(Bioderpac ， 2 0 0 8 )、螢光假單月包菌(Bioderpac ， 20以）、哈茨木黴（11〇-1及11〇-73菌株）、大豆根瘤菌 0 (Bioderpac > 2 0 0 8 )、棕色固氮菌(Bioderpac ^ 2008 ) 、巴斯德梭狀芽孢桿菌（化〇心，MM )、普通變形 # W ( Bioderpac > 2008 )、蘇雲金桿菌（SILoSil®BT) 、鏈黴菌屬、硝化桿菌屬（ Bioderpac，2008 )及微球菌屬(Bioderpac，2008 )。第一個步驟包括： (1 )將稀釋液劃線及差別培育 (2 )鑑別及分離株落類型 (3 )縮小收集範圍，及 -29- 201137128 (4 )測定該特定株落之初始特性並保存該分離株。稀釋液劃線及差別培育一旦自HQE樣本中移出一種標本應當將其立即培養。在製備平板培養前必須將任何液態樣本徹底震盪混合，因爲非能動性細菌若與粒狀物質結合可能會沉澱在樣本底部。不幸的是，細菌不會被均勻分隔而來自相同混合物之複製樣本可能含有不同量之細菌。徹底震盪混合和隨後之稀釋液劃線之目的係將個別C F U s (菌落形成單位）塗佈開，以取得可進行繼代培養之離散菌落。除了硝化桿菌屬外，所有提及之微生物可分別進行將分Sli解說於下之程序以進行鑑別和分離。以無菌方式取得一整圈徹底震盪混合之來自 HQE的樣本，並將其施放在瓊脂表面之一角。隨著來回移動，約四分之一的表面應被劃上線同時將環朝向盤之中央劃。劃線不應該使瓊脂表面破裂且應有（20條或更多）劃線產生。爲了將樣本稀釋或塗佈開，接種環必須經火焰燃燒以破壞所有可存活之物質，將環接觸瓊脂之乾淨部分以冷卻之，然後以垂直於原始接種物之方向劃線，重疊劃在平板培養盤上該部分一次或兩次。第二部分應涵蓋剩餘之無菌表面的一半。如此將一小部分原始接種物塗佈散開將可能充分稀釋該原始接種物以在培育後出現個別株落。接著’ 第三部分係以垂直於第二部分之方向劃線’以火焰燃燒再冷卻該環，依前述重疊在前一部分上’以進一步稀釋該接 -30- 201137128 種物。製備來自各批產品之分離株時，下一階段是製備複製之劃線平板培養盤並將其倒置培養在不同條件下，以盡可能區分下列株落類型：枯草桿菌（S IL 〇 S i 1 ® B S )、蠟狀桿菌(Bioderp ac > 2 00 8 )、地衣桿菌(Bioderpac > 2 008 ) 、巨大桿菌、嗜酸乳桿菌（

Bioderpac ’ 2008 )、乾酷学L 桿菌(Bioderpac > 2 00 8 )、〇登光假單胞菌（尸ac，、哈茨木黴（ TRICHOSIL )、大豆根瘤菌（仏〇心7<2〇，2005)、棕色固氮菌（bioderpac，、巴斯德梭狀芽孢桿菌（，2005)、普通變形桿菌（以 odeaac，mm )、蘇雲金桿菌（HD-1 及 HD -73 菌株，SILoSil®BT )、鏈黴菌屬（⑽）及微球菌屬（， 2〇05」。培養之溫度各不相同（通常爲25、3〇及37。(：）且係在有氧和無氧條件下培養。此方法增加分開個別物種〇之機會，因爲不同物種/細菌具有不同之最佳生長溫度範圍且對氧氣之需求不同。好氧有機體應在培養一天後檢查，因爲有些吾人測試之特別細菌生長得非常快而排擠到其他細菌。鑑別及分離株落類型之方法具有透射照明燈之解剖顯微鏡可用來區分個別株落。檢查期間平板培養盤應該保持倒置。參考先前提及之微生物可藉由大小、形狀、透明度和質地區分株落。檢查時， -31 - 201137128 最好藉由在欲採樣之株落旁邊的平板培養盤底部放置小標記以指明欲採樣之株落。爲了收集株落物質有需要翻轉培養盤蓋。僅在欲取得接種物時小心謹慎地插入無菌環。在顏色、表面特徵及外觀（凸起，扁平，等）方面，需要以入射光透過透明的蓋子來檢查株落。蓋子應留在上面否則培養盤將受到污染。在反轉培養盤前先移開並反轉蓋子’以除去濕氣。應以新蓋子替換原有之蓋子以供觀看 0 在兩個株落重疊且仍然可以區分的情況中，則至少有兩個株落存在。株落通常具有相當單純、均勻之質地。若有一區像拼貼式’則可能有至少兩種菌種。各獨特之株落類型應藉由接種針來採樣，並在新鮮平板培養盤上進行三向稀釋劃線。應謹慎取樣以僅採取所欲之株落。將每一個新的劃線平板培養盤在原始平板培養盤之培養溫度下，於有氧條件下培育。菌種在最接近理想溫度時將生長較快及/或株落較大而顯示出其最適溫度。任何從厭氧培養之平板盤中採樣的株落將可能爲兼性厭氧菌。縮小收集範圍元全一樣之相问囷種和菌株有可能從不同之劃線平板盤中分離出。許多不同菌種及相同菌種之不同菌株會產生非常類似之株落類型。爲了減縮分離株之數目至獨特之菌種/菌株’在相同平板盤上培養所懷疑之完全一樣的分離 -32- 201137128 株。在三分之二的表面上進行兩次“小稀釋，’以取得用於各次培養之個別株落，並在剩餘之三分之一表面上將其混合。培育後’若該兩個分離株生長在同一平板盤上及/或混合之接種物產生兩種可區別之株落類型，則鑑別出兩種獨特之分離株。株落之初步特徵鑑別及分離株之保存 0 考量之有機體的大部分特徵應使用入射光，而非透射光測定。一旦取得分離株且經由株落檢查和顯微鏡檢查建立純度後，應將其接種在瓊脂斜面管上並在適當之溫度下培養，培養時將帽蓋鬆開以允許氣體交換。開始出現生長後，應記述該培養，將瓶蓋旋緊並將試管保持在室溫下作爲分析之純培養來源。除了粗略描述特性，應將一年輕（<1 8小時）培養進〇行革蘭氏染色並記錄結果，包括細胞形狀及大小、鞘套或莢膜（若明顯），以及孢子或類似結構之任何證據。與氧氣之關係爲縮小可能類別之下一個步驟。然後’由革蘭氏染色結果、細胞類型和與氧之間的關係之特殊組合來決定用於測定該分離株之特性之接下去的一系列步驟。刪除和計算產物中之硝化桿菌靥族群對純培養中之亞硝酸鹽氧化菌的代謝、生存和生長，以及其在不同環境中之硝化活性的硏究有許多’但很少有 -33- 201137128 硏究涉及天然硝化桿菌族群。雖然亞硝酸鹽生物轉化爲硝酸鹽爲一種眾所周知之過程，目前對硝化桿菌族群之硏究和程序受到不適當之偵測和計數方法阻礙。此失敗部分係由於這些細菌之不利的生理特點’亦即生長緩慢、生物質量小及培養對污染之易感性。有一種方法可用來計算土壤中之硝化桿菌族群’但其費時且有選擇性。生長方法之詳細描述蠛狀桿菌（、巨大桿菌， 2008 )、枯草桿菌（SILoSil®BS )及地衣桿菌（ Bioderpac > 2 0 0 8 ^ 介質成分：純水和平板培養介質營養瓊脂。程序：（1 )將〇 · 1毫升H Q E之液態樣本置於9.9毫升之純水中，（2)開始從1至10倍之系列稀釋’ （3) 以1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養，複製二份進行培育，（4)將該平板盤在37°C培育24-48小時’（5) 株落形成單位應爲每毫升產物1，〇〇〇,〇〇〇。螢光假單胞菌和普通變形桿菌介質成分：純水和平板培養介質營養瓊脂。程序：（1)將 0.1毫升HQE之液態樣本置於9.9毫升之純水中，（2 )開始從1至1 〇倍之系列稀釋，（3 ) 以1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養，複製二份進 -34- 201137128 行培育，該平板培養介質爲營養瓊脂（4 )將該平板培養在37°C培育24-48小時，（5 )株落形成單位應爲每毫升產物 1,000,000。嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌瓊脂M.R.S.係由Man、Rogosa及Sharpe硏發以提供可證明乳桿菌及其他乳酸菌生長良好的工具。該培養介質 0 容許所有乳桿菌種大量生長。蛋白腺及葡萄糖構成供細菌生長之氮、碳及其他必要元素的來源。該山梨醇酐單油酸酯、鎂、錳及醋酸鹽提供輔助因子且可抑制某些微生物生長。檸檬酸銨之作用如同抑制革蘭氏陰性菌生長的抑制劑 ° 見表 3 ° 表3 配方（以每升之克數表示） 3號蛋白腺 10.0 肉萃取物 8.0 酵母萃取物 4.0 葡萄糖 20.0 將64克介質懸浮於一升蒸餾水山梨醇酐單油酸酯 1 ml 中。令其靜止5分鐘，再在1 磷酸二鉀 2.0 或2分鐘內混合加溫至沸點。 5.0 在滅菌器中於15分鐘內在121 檸檬酸銨 2.0 。(：下滅菌。硫酸鎂 0.2 硫酸錳 0.05 瓊脂 13.0 最終 pH : 6.4 ± 0.2 -35- 201137128 介質成分：純水和平板培養介質營養瓊脂M.R.S.基質。程序：（1 )將〇.1毫升HQE之液態樣本置於9.9毫升之純水中，（2 )開始從1至1 0倍之系列稀釋，（3 ) 將複製二份之以1毫升稀釋範圍的樣本製作之系列平板培養置入具5-10%之二氧化碳的有氧室進行培育，該平板培養介質爲瓊脂M.R.S.，（4)將該平板盤在3 3 -3 7 °C培育72小時或在3 0°C培育5天，（5 )株落形成單位應爲每毫升產物1，〇〇〇,〇〇〇。結果。株落形成單位應爲1，000,000/毫升產物。株落之特點：普遍偏小、白灰色，平滑或粗糙。介質之特性：製備之介質爲黃色。乳桿菌之鑑別：表4

生長在酸 NH3 在4%NaCI 15°C 45°C la su sal mn so xi半冃胺酸肉湯中生長嗜酸乳桿菌 - + +++--I-I - - 蠟狀乳桿菌 I + V +/-+/-+'++ ' - - + 棕色固氮菌（Bioderpac，2008) 介質成分：純水和平板培養介質營養瓊脂基質（ Burk’s ， Asbhy ， Jensen’s) 。 -36- 201137128 程序：（1 )將0」毫升HQE之液態樣本置於9.9毫升之純水中，（2 )將此溶液在25 °C下培養48小時，（3 )開始從1至1 0倍之系列稀釋，（4 )以營養瓊脂基質， 1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養，複製二份進行培育，該平板培養介質爲營養瓊脂，（5 )將該平板盤在 2 5 °C培育48-72小時，（6)株落形成單位應爲每毫升產物 1,0000,000° 〇巴斯德梭狀芽孢桿菌（Bioderpac，2008 ) 介質成分：磷酸鹽緩衝液及平板培養介質標準方法瓊脂基質（TYG )。程序：（1 )將0 · 1毫升H Q E之液態樣本置於9 · 9毫升之磷酸鹽緩衝液中，（2 )製作合適之系列稀釋液，（3 )將所需之稀釋倍數的正確等份樣本平皿接種於培養皿上，（4 )添加經調和之標準方法瓊脂及平皿混合物，（5 ) D 將乾燥平板盤倒置於厭氧室中，（6)將該平板盤在35-37 °C下培養48-72小時，（7)培養期之後，自厭氧室移出平板盤並開始計算此平板培養盤，記錄所使用之稀釋倍數並計算各稀釋液之總株落數，（8 )株落形成單位應爲每毫升產物1,000,000。鑑別梭狀芽孢桿菌之菌種係採用典型之株落微觀形態學，該株落微觀形態學可允許快速鑑別且據以推定某些經常分離出之梭狀芽孢桿菌的菌種。此外，藉著利用簡單之生化檢測（諸如在蛋黃瓊脂中產製卵磷脂和脂肪酶之硏究 -37- 201137128 、明膠和尿素之水解及透過快速方法（對-二甲基-胺基肉桂醛）產製吲哚）可建構用於鑑別，甚至確認，其中某些成員之容易且不昂貴之方法。微球菌屬（Bioderpac，2008 ) 介質成分：純水和平板培養介質營養瓊脂。程序：（1 )將0 · 1毫升H Q E之液態樣本置於9.9毫升之純水中，（2 )開始從1至10倍之系列稀釋，（3 ) 以1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養，複製二份進行培育，該平板培養介質爲營養瓊脂，（4 )將該平板盤在3 7°C培育24小時，（5 )株落形成單位應爲每毫升產物 1，000,000。若發現革蘭氏陽性球菌，執行藥敏試驗。微球菌對枯草桿菌素敏感，對呋喃唑酮具抗性。大豆根瘤菌（Bioderpae，2008) 介質成分：純水和平板培養介質ALM (酵母萃取物甘露醇瓊脂）。程序：（1 )將〇.1毫升HQE之液態樣本置於9.9毫升之純水中，（2 )開始從1至1 0倍之系列稀釋，（3 ) 以1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養，複製二份進行培育，該平板培養介質爲 ALM (酵母萃取物甘露醇瓊脂），（4)將該平板盤在28 °C培育96小時，（5)株落形成單位應爲每毫升產物1,000,000。 -38- 201137128 爲了確認大豆根瘤菌（Bioderpac，2008年），使用該分離株以無菌方式感染豆科使其形成結節。哈茨木徽（TRICHOSIL) 介質成分：純水及輔以氯黴素、硫酸鏈黴素和制黴胃素之麥芽萃取物瓊脂介質（2%重量/體積）基質。程序：（1 )將0.1毫升HQE之液態樣本置於9.9毫 0 升之純水中，（2 )開始從1至1 0倍之系列稀釋，（3 ) 以1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養，複製二份進行培育，該平板培養介質爲麥芽萃取物瓊脂，（4 )將該平板盤在2 5 °C培育4天，（5 )株落形成單位應爲每毫升產物 1，000,000。蘇雲金桿菌（HD-ι及HD -73菌株（SIL〇Sil®BT)) 介質成分：純水和輔以2克/升D-葡萄糖及5〇微克/ Q 毫升紅黴素之平板培養Superbroth介質瓊脂基質。程序：（1)將0.1毫升HQE之液態樣本置於9.9毫升之純水中，（2 )開始從1至1 〇倍之系列稀釋’（3 ) 以1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養’複製二份進行培育，該平板培養介質爲SuPerbroth瓊脂’ （4 )將該平板盤在2 8 °C培育1 〇-1 4天’（5 )株落形成單位應爲每毫升產物1,〇〇〇,〇〇〇。鏈黴菌屬（Bioderpac，2008 ) -39- 201137128 介質成分：純水和平板培養放線菌分離瓊脂介質。程序：（1)將〇·1毫升HQE之液態樣本置於9.9毫升之純水中，（2 )開始從1至1 〇倍之系列稀釋，（3 ) 以1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養，複製二份進行培育，該平板培養介質爲放線菌分離瓊脂，（4)將該平板培養在2 8 °C培育2 - 3天，（5 )株落形成單位應爲每毫升產物1,000,000。硝化桿菌屬（Bioderpac，2008 ) 介質成分：純水和平板培養介質營養瓊脂基質。程序：（1 )將0.1毫升HQE之液態樣本置於9.9毫升之純水中’（2 )開始從1至1 0倍之系列稀釋，（3 ) 以1毫升稀釋範圍之樣本製作系列平板培養，複製二份進行培育’該平板培養介質爲平板營養瓊脂基質，（4)將該平板盤在30 °C培育10-14天。生物降解方法於一較佳體系中，該海洋節肢動物爲甲殼類動物，且該較佳之甲殼類動物爲蝦。蝦副產物包含蝦之頭胸部和/ 或外骨骼。在生物降解方法中，較佳地，該醱酵爲兼性好氧醱酵。醱酵亦宜在約30至40 °C之溫度下進行。該pH値宜低於約ό ’更宜爲低於約5 · 5。然而’該ρ Η値應保持在約 4·3以上。醱酵係進行約24_96小時。於一些體系中，酸 -40 - 201137128 酵係進行約24-48小時，更宜爲24-36小時。這些醱酵時間遠短於先前技藝中典型之1〇至15天的醱酵時間即可達到大致相同之消化量，儘管沒有檢測到形成殼聚醣和葡糖胺。分離混合物宜藉由離心（例如：約 92 0g )。亦可使用重力分離，但由於達到分離所需要的時間因素較不推薦〇 ζ) 該混合物分成3種部分：固體、水液和脂質。該固體部分包含甲殼素且定名爲H YTc。該水液部分包含蛋白質水解產物、胺基酸、殼聚醣及葡糖胺且定名爲HYTb。該脂質部分包含固醇、維生素A和E以及類胡蘿蔔素色素，諸如蝦青素。任何此文中確認之微生物組成物均可用於生物降解方法中。於一些體系中，生物降解方法中宜使用HQE。於其它體系中，宜將HYTb加入HQE或醱酵肉湯中。如上〇述，HYTb含有胺基酸、殼聚醣、葡糖胺和微量元素（包括鈣、鎂、鋅、銅、鐵和錳）。Η Y T b亦含有酶（諸如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、甲殼素酶）、乳酸、多肽及其他碳水化合物。HYTb亦可包含來自先前生物降解方法中之休眠微生物。這類微生物可被再活化且與HQE組合可促成一種與單獨使用HQE之生物降解方法（如本文中他處所描述者）相較下更強之生物降解方法。更特別地，此方法包括下列步驟： a ·在糖基溶液中活化微生物細胞以增進其生長及形 -41 - 201137128 成生物團。 b.硏磨蝦副產物（頭胸部及外骨骼），以製造均勻之漿。 c_將蝦副產物漿與至少1 〇%之活化的接種物均勻混合。 d. 使用檸檬酸溶液將混合物之pH値調整至低於6.0 ’以抑制微生物生長，並促進構成接種物之微生物細胞生長。 e. 將混合物在非連續攪拌系統中，於30至40。(：之溫度範圍內醱酵至少9 6小時且p Η値維持在低於 5_〇。定期監控pH値。若pH値上升超過5.0，則添加能將pH値維持在低於 5.0之量的檸檬酸緩衝液。 f. 將醱酵物離心以分成三種主要部分：甲殻素、液態水解產物及染色之漿。 g. 沖洗甲殼素原料且重新收集沖洗之水以回收細固體或礦物質。 h. 將甲殼素乾燥並儲存。 i. 將液態水解產物乾燥並儲存。 j. 將染色之漿（脂質部分）儲存在密閉之容器中以供保存。參考第1圖和下列之詳細說明可更理解此方法及操作基本原則。 -42- 201137128 微生物細胞之活化使用此處揭示之微生物組成物作爲接種物。HQE之接種物的微生物濃度爲約2.5至3 · 0 % (重量/體積）。經由在甘蔗溶液（甘蔗之最終濃度爲3.75%)中稀釋成5% 並在3 7°C培育5天來活化HQE。較佳地’加入H YTb (每升培養添加10毫升）以提供礦物質及自然衍生之胺基酸來源。經由在540nm測量光密度來估計微生物之細胞生 0 長。光密度約1 · 7時活化完全。活化後微生物之濃度爲約 1.9至3.0% (重量/體積）。樣本之製備方法自蝦加工廠取得蝦副產物樣本。稍微解凍，將碎殘留物（一批1 500克）與99克甘蔗（最終濃度爲6.6%重量 %)及85.5毫升活化之HQE 5% (體積/重量）混合（細胞之光密度=1 . 7 )。然後，使用2M檸檬酸將pH値調整〇至 5.5 。醱酵控制將混合物在36°C培育並伴隨非連續性攪拌96小時。在醱酵方法中，使用電位計監控pH値，以〇.1N氫氧化鈉滴定直至pH値達到8.5來測定總滴定酸度（TTA，％ )。該TTA係以乳酸之百分比表示。分離條件 -43- 201137128 由於蝦青素之存在，該醱酵產物爲一種濃橙色之黏性青貯飼料。將該青貯飼料在1 25 0rpm ( 93 0g )離心（5°C )1 5分鐘以取得甲殻素、液態水解產物和色漿。將上方部分（色漿）以手工分開。藉由傾注將液態水解產物分開，以蒸餾水沖洗構成甲殻素原料之沈積物以分離出細固體。收集並乾燥由此產生之液體。將甲殻素原料、液態水解產物和細固體在60°C乾燥。將所有部分儲存避光。使用HQE，以三個醱酵批次依下列實例中所提出者進行上述議定計劃，一式兩份。【實施方式】實例1 經由測量pH値和總滴定酸度（TTA，％ )來控制醱酵。口11値之平均初始値和1'丁八分別爲7.31±0.10和〇.53± 0.09。如第2圖所示，最初先藉由添加2M檸檬酸來將pH 値降至6.5。然後，由於蛋白質水解及釋出銨，pH値在前 2小時之間回升到7 . 1 1 ±0 · 〇 8，稍後，在1 2小時的醱酵期間內pH値降低28% (達到5.28±0.01 )。大約醱酵24小時後，最終pH爲4.5 7±0. 15。類似於pH値降低’ TT A之平均値亦可觀察到類似情形。如第2圖所示，在前2小時期間，TTA之平均値爲1 %，24小時後，這些値逐漸上升至平均値爲3.33±0_23。 -44- 201137128 實例2 醱酵產物及化學組成物在醱酵過程後，將青貯飼料離心以將三種主要產物（甲殻素、液態水解產物和色漿）分開。另一產物，細固體係保留在甲殼素原料清洗液中。表5顯示各部分之回收比例。在乾燥重量中，較大之部分係對應於液態水解產物（ 55%) ’接下來爲細固體（29% )、甲殻素原料（1〇%) 0 和色漿（5%)。在醱酵批中，乾重之平均値爲32% ( 481.1±5.6 克）。表6顯示該四種透過醱酵取得之主要產物各自的化學特性。該幾丁質產物（甲殼素）顯示之部分脫礦表現有如灰一般。其亦揭露在液態水解產物中具高蛋白質含量（ 42.34% )。這有助於回收色發’其主要由總脂質（42.67 % )所組成，且產生富含灰（16.72%)之細固體部分。 ❹ 表5.從醱酵分離出之產物_ 乾燥物質 (克）甲殼素原料 (克）液態水解產物 (ϊ£) 脂筧糊狀物 (克）細固體 m 480.0 48.0 264.4 22.9 141.2 487.5 50.2 268.8 24.0 140.8 475.7 51.0 265.7 23.7 131.7 481.1 ±5.6 49.5 ± 2.4 266.3 ±4.6 23-3±〇.5 141.9 ±5.5 -45- 201137128 表6.醱酵產物之化學組成（乾重）產物 %蛋白質 %灰 %總脂質甲殼素原料 18.12 ±0_15 4.36 ± 0_26 2.02 ± 0.46 液態水解產物 42_34 ± 0_03 7.96 ±0.16 4_28±0_28 脂質糊狀物 30.80 ± 0.25 5.11 ±0_16 42.67 ± 0.63 細固體 31.62 ±0_10 16.72 ±0.37 未測定實例3 在乾粉水解產物中之胺基酸槪況依 Lopez-Cervantes et a 1., “Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatography’’， Journal of Chromatography A， volume ll〇5，1 (2〇〇6)中之描述測定乾燥水解產物中之胺基酸含量。表6中顯示乾粉水解產物之總胺基酸槪況。必須胺基酸之比例爲乾粉水解產物之52.5%。 -46- 201137128 表7.乾粉水解產物中之胺基酸槪況

(毫克/克乾燥重量）胺基酸乾粉水解產物天門冬胺酸 38 麩胺酸 39 絲胺酸 16 組胺酸* 9 甘胺酸 28 蘇胺酸* 14 丙胺酸 30 脯胺酸 8 酪胺酸* 70 精胺酸 18 纈胺酸* 20 蛋胺酸* 4 異白胺酸+ 15 白胺酸Λ 23 苯丙胺酸+ 39 賴胺酸* 13 394 Α必須胺基酸 207 胺基酸乾粉水解產物 -47- 201137128 實例4 定量甲殻素原料中之葡糖胺定量甲殻素中之葡糖胺的含量作爲純度指標。甲殼素中之葡糖胺的含量爲每克（乾燥重量）甲殼素含有516、，619及64〇毫克，這些數値對應於以一式兩份進行之三個醱酵批次的結果。因此，這項硏究中葡糖胺之平均量爲每克重之乾燥甲殼素含有591毫克。用於定量葡糖胺的方法報導於 Lopez-Cervantes et al.， “Quantitation of glucosamine from shrimp waste using HPLC,5 Journal of Chromatographic Science, volume 45， 1 (2007)中。實例5 色漿中之蝦青素含量和脂肪酸之槪況蝦青素爲自醱酵之蝦廢物取得之脂質漿中的主要色素。蝦青素之含量爲每克乾燥之脂質漿中含有1.98到2.25 毫克，平均爲每克乾燥之脂質漿含2 · 1 1毫克。蝦青素係藉由 Lopez-Cervantes et al., “Quantification of astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by HPLC” Biomedical Chromatography, volume 20， 9 8 1 (2006)之方法的一種版本測定。鑑別色漿中之1 4種脂肪酸。結果發現該棕櫚酸（C 16: 0)及油酸（C18: 1η9)之含量較高。【圖式簡單說明】 -48- 201137128 第1圖圖表顯示蝦副產物之較佳降解方法。第2圖描述在蝦副產物之乳酸醱酵期間的pH値和總滴定酸度。

❹ -49 -

Claims

201137128 七、申請專利範圍： 1. 一種微生物組成物，其包含ATCC專利寄存編號 PTA-10861 〇 2. —種微生物組成物，其包含（a ) —或多種乳酸菌 (LAB )及（b) —或多種選自下列菌屬之微生物：桿菌、固氮菌、木黴、根瘤菌、梭狀芽孢桿菌、假單胞菌、鏈黴菌、微球菌、硝化桿菌及變形桿菌屬。 3. 如申請專利範圍第2項之微生物組成物，其中該 LAB係選自下列菌屬：乳桿菌、片球菌、乳球菌及鏈球菌〇 4. 如申請專利範圍第2項之微生物組成物，其中該 LAB係選自下列群組：嗜酸乳桿菌及乾酪乳桿菌。 5. 如申請專利範圍第2項之微生物組成物，其中該 LAB係選自下列群組：嗜酸乳桿菌（仏derpc，20以）及乾酪乳桿菌。 6. 如申請專利範圍第2項之微生物組成物，其中該桿菌係選自下列群組：枯草桿菌（）、蠘狀桿菌（cerews )、巨大桿菌（ wegiiieWi/ )、地衣桿菌 Q Bacillus licheniformis )及_ 镑雲金桿菌i/zwrz'ngz'ewh·?)，該固氮菌爲棕色固氮菌（Jzoiohcier ，該木黴爲哈茨木黴（ /iarz/anww)，該根瘤菌爲大豆根瘤菌（ Α ί ζ 〇 w w _;· α /? 〇 d c w m )，該梭狀芽孢桿菌爲巴斯德梭狀芽孢桿菌pasiewrianw)且該假單胞菌爲螢光 -50- 201137128 假單胞菌(Pseudomonas flu o r e s c ens 。 7. 如申請專利範圍第2項之微生物組成物，其中該桿菌係選自下列群組：枯草桿菌（SILoS il®BS )、蠟狀桿菌(Bioderpac，2 0 0 8 )、巨大桿菌{ Bioderpac，2008 ) 、地衣桿菌及蘇雲金桿菌（HD-1及 HD -73菌株（SILoSil®BT))，該固氮菌爲棕色固氮菌 (Bioderpac ^ 2008 )，該木黴爲哈茨木黴(TRICHOSIL Q )，該根瘤菌爲大豆根瘤菌（)，該梭狀芽孢桿菌爲巴斯德梭狀芽孢桿菌（) 且該假單胞菌爲螢光假單胞菌（以)。 8. 如申請專利範圍第2項之微生物組成物，其中該桿菌、固氮菌、木黴、根瘤菌、梭狀芽孢桿菌、假單胞菌、鏈黴菌、微球菌、硝化桿菌及變形桿菌屬中至少一種爲甲殼素酶菌株。 9. 一種生物降解方法，其包含： .〇使海洋動物或海洋動物副產物與如申請專利範圍第1 至8項中任—項之微生物組成物混合以形成混合物；令該混合物醱酵；及令該混合物分離成固體、水性及脂質部分。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該海洋動物爲海洋節肢動物。 11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該海洋節肢動物係選自下列群組：蝦、蟹及磷蝦。 I2·如申請專利範圍第9項之方法，其中該海洋動物 -51 - 201137128 爲魚。 13. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該微生物組成物包含ATCC專利寄存編號PTA-10861。 14. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該醱酵係經由兼性好氧醱酵進行。 15. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該分離係經由離心進行。 16. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該醱酵係在約3 0 °C至4 (TC之溫度下進行。 17. 如申請專利範圍第1 6項之方法，其中該醱酵係在約p Η 4.3至5.0之間進行。 18. 如申請專利範圍第1 6項之方法，其中該醱酵係進行約2 4 - 9 6小時。 19. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該水性部分包含胺基酸、殼聚醣和葡萄糖胺。 20. 如申請專利範圍第1 9項之方法，其中該水性部分進一步包含微量兀素。 2 1.如申請專利範圍第9項之方法，其中該固體部分包含甲殼素。 22. —種水性部分，其係自如申請專利範圍第1 9或 2 〇項之方法製作。 23. 一種固體部分，其係自如申請專利範圍第2 1項之方法製作。 24. —種組成物，其包含HYTb。 -52- 201137128 25. —種組成物，其包含HYTc。