ES2572764T3 - Proceso de biodegradación y composición - Google Patents

Abstract

Una composicion que comprende los microbios en la Patent Deposit Designation de la ATCC PTA-10861.

Description

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DESCRIPCION

Proceso de biodegradacion y composition Campo tecnico

Se describen una composicion microbiana novedosa y procesos microbianos para tratar subproductos de animales marinos y en algunos casos el animal marino completo para producir fracciones solidas, Kquidas y lip^dicas que contienen compuestos utiles.

Antecedentes de la invencion

El procesamiento de peces y artropodos marinos, tales como camaron, cangrejo y cangrejo de rio, produce grandes cantidades de subproductos marinos. La mayoria, se usan en productos finales de gama baja tales como fertilizantes, ensilaje de pescado y alimento para mascotas pero los subproductos no usados poseen una carga economica para las industrias de procesamiento de productos marinos a causa de la necesidad de desechar dichos residuos de un modo ambientalmente racional. Algunos estiman que dichos subproductos representan el 25 % de la produccion total capturada por pesadores.

Por ejemplo, durante el proceso del camaron para su posterior congelado y comercializacion, se genera una gran cantidad de restos ya que el 35 % del animal no es comestible y debe desecharse. Estos remanentes o subproductos estan compuestos del cefalotorax y exoesqueleto del camaron. Sin embargo, estos subproductos de camaron son ricos en sustancias de alto valor, tales como quitina, proteina, lipidos, pigmentos carotenoides (astaxantina) y minerales. La mayoria de los subproductos no comestibles se desechan en vertederos o se devuelven al oceano, causando de ese modo graves problemas ambientales y considerables perdidas a la industria de procesamiento del camaron. Actualmente, solamente una pequena cantidad de estos subproductos se usan como suplemento para piensos de animales.

La tecnica mas comun para la utilization de subproductos de camaron es secado al sol. Esta tecnica tiene bajo control higienico y los productos se usan principalmente para consumo por animales. Otros metodos emplean acidos quimicos y alcalis a diferentes concentraciones, temperaturas y tiempos para la extraction de quitina y recuperation de hidrolizados proteicos. Sin embargo, estos metodos causan una despolimerizacion y desacetilacion parcial de la quitina. Ademas, estos metodos complican la recuperacion de otros productos, tales como proteinas y pigmentos.

Se han desarrollado metodos enzimaticos para la extraccion de quitina, hidrolizados liquidos y pigmentos. Dichos metodos usan extractos enzimaticos o aislados enzimaticos. Otros estudios han informado del uso de enzima microbiana, tales como alcalasa comercial, para la extraccion de proteinas para subproductos de camaron y animales marinos. Se ha informado de la combination de alcalasa y pancreatina para la extraccion de quitina, proteina hidrolizada y lipidos pigmentados.

Se han usado procesos de fermentation lactica como sustituto para los anteriores procesos quimicos y enzimaticos. La fermentacion representa una tecnica rentable que estabiliza y retiene la calidad nutricional de los subproductos. Las condiciones optimas para la fermentacion dependen de varios factores, incluyendo la election y concentration de carbohidratos, pH, temperatura, tiempo, y la eleccion de condiciones aerobicas o anaerobicas. Otro factor importante es la eleccion de microorganismo y la concentracion inicial del inoculo. Para facilitar el proceso de fermentacion de subproductos de camaron, se han usado cultivos puros de bacterias acidolacticas (LAB). Dicha LAB incluye Lactobacillus plantarum (Rao, M.S., Stevens, W.F., 2006, "Fermentation of shrimp biowaste under different salt concentrations with amylolytic and non-amylolitic Lactobacillus strains for chitin production," Food Technology and Biotechnology 44, 83-87; Rao, M.S., Munoz, J., Stevens, W.F., 2000, "Critical factors in chitin production by fermentation of shrimp biowaste," Applied Microbiology and Biotechnology 54, 808-813; Bhaskar, N., Suresh, P.V., Sakhare, P.Z., Sachindra, N.M., 2007, "Shrimp biowaste fermentation with Pediococcus acidolactici CFR2182: optimization of fermentation conditions by response surface methodology and effect of optimized conditions on deproteination/demineralization and carotenoid recovery," Enzyme and Microbial Technology 40, 1427-1434), Lactobacillus sp. B2 (Cira, L.A., Huerta, S., Hal, G.M., Shirai, K., 2002, "Pilot scale lactic acid fermentation of shrimp waste for chitin recovery," Process Biochemistry 37, 1359-1366; Shirai, K., Guerrero, I., Huerta, S., Saucedo, G., Castillo, A., Gonzalez, R.O., Hall, G.M., 2001, "Effect of initial glucose concentration and inoculation level of lactic acid bacteria in shrimp waste ensilation," Enzyme and Microbial Technology 28, 446-452), Lactobacillus casei (Shirai 2001), Lactobacillus paracasei (Jung, W.J., Jo, G.H., Kuk, J.H., Kim, Y.J., Oh, K.T., Park, R.D., 2007, "Production of chitin from red crab shell waste by successive fermentation with Lactobacillus paracasei KCTC-3074 and Serratia marcescens FS-3," Carbohydrate Polymers 68, 746-750), Lactobacillus pentosus (Bautista, J., Jover, M., Gutierrez, J.F., Corpas, R., Cremades, O., Fontiveros, E., Iglesias, F., Vega, J., 2001, "Preparation of crayfish chitin by in situ lactic acid production," Process Biochemistry 37, 229-234; Shirai 2001), Lactobacillus acidophilus B4495 and Lactobacillus lactis (Bhaskar 2007), Lactobacillus salvarus (Beaney 2005), Enteroccus faecium (Beaney 2005), Pedioccoccus acidilactici (Bhaskar 2007) y Pedioccoccus sp. L1/2 (Choorit, W., Patthanamanee, W., Manurakchinakorn, S., 2008, "Use of response surface method for the determination of demineralization efficiency in fermented shrimp shells," Biores. Technol. 99, 6168-6173). Ademas, se ha usado una mezcla de cuatro LAB

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(Bhaskar 2007) y existen informes del uso de Lactobacillus en combinacion con Serratia marcescens FS-3 (Jung 2007) o Staphylococcus carnosus (Shirai 2001). Sin embargo, la industrialization de dichos procesos de fermentation no ha sido satisfactoria debido al mal rendimiento de los inoculantes comerciales.

La fermentacion lactica de subproductos de camarones produce hidrolizados proteicos, quitina, minerales, y Kpidos. La quitina y sus derivados desacetilados tienen muchas aplicaciones en agricultura, biomedicina, alimentos y la industria del papel, mientras que el hidrolizado liquido es una fuente excelente de aminoacidos esenciales que pueden usarse para consumo humano o animal. La pasta lipidica contiene esteroles, vitamina A y E, y pigmentos carotenoides tales como astaxantina que puede usarse en pienso para salmonidos o como colorante natural en la industria alimentaria.

La quitina es un polisacarido natural encontrado particularmente en el exoesqueleto de crustaceos, las cuticulas de insectos y las paredes celulares de hongos. Como la quitina es uno de los biopolimeros mas abundantes, se ha puesto mucho interes en sus aplicaciones biomedicas, biotecnologicas e industriales. Las quitosanas son compuestos de poli-(p-1-4)-N-acetil-D-glucosamina producidos por la desacetilacion de quitina (p-1-4)-N-acetil-D- glucosamina. La glucosamina es un aminomonosacarido obtenido por despolimerizacion de quitosana. Participa en la constitution de glucosaminoglicanos, una clase principal de polisacaridos complejos extracelulares. El sulfato de glucosamina, clorhidrato de glucosamina y N-acetil-glucosamina se usan habitualmente solos o como parte de una mezcla.

En lineas generales, el hidrolizado liquido tiene un alto contenido de aminoacidos esenciales, que indica un alto valor nutritivo que justifica su uso como suplemento para nutrition animal y acuicola o como fuente de nitrogeno en medios de cultivo para microorganismos. Adicionalmente, estos hidrolizados son una fuente de aminoacidos libres y pueden usarse para la nutricion en plantas como bioestimulante.

La astaxantina (3,3'-dihidroxi-p,p-caroteno-4,4'-diona), un cetocaroteno oxidado a partir de p-caroteno, existe de forma natural en una amplia diversidad de organismos marinos y acuaticos. Debido a su atractivo color rosa, sus funciones biologicas como precursor de vitamina A, y actividad antioxidante, la astaxantina puede usarse como colorante en alimentos y en medicina. En la estructura de la astaxantina, se encuentran dos atomos identicos de carbono asimetrico en C3 y C3'. Sin embargo, la trans-astaxantina es el carotenoide cuantitativamente mas prevalente en especies de crustaceos.

Referencias que describen estos y otros productos de la fermentacion lactica incluyen: Sanchez-Machado et al. "Quantification of organic acids in fermented shrimp waste by HPLC" Food Technology and Biotechnology, volumen 46, 456 (2008); Sanchez-Machado et al. "High-performance liquid chromatography with fluorescence detection for quantitation of tryptophan and tyrosine in a shrimp waste protein concentrate", Journal of Chromatography B, volumen 863, 88 (2008); Lopez-Cervantes et al., "Quantitation of glucosamine from shrimp waste using HpLC" Journal of Chromatographic Science, volumen 45, 1 (2007); Lopez-Cervantes et al., "Quantification of astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by HPLC" Biomedical Chromatography, volumen 20, 981 (2006); Lopez-Cervantes et al., "High-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of retinol, alpha-tocopherol, and cholesterol in shrimp waste hydrolysate" Journal of Chromatography A, volumen 1105, 1-2 (2006); Lopez-Cervantes et al., "Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatography", Journal of Chromatography A, volumen 1105, 1 (2006).

El documento CN 101 564 081 describe un metodo para la production de un sustituto de harina de pescado, donde se mezclan bacterias de las especies Bacillus subtilis y Lactobacillus casei y se cultivan en un medio de cultivo liquido. Este cultivo se anade a un medio de expansion solido tal como camarones y se fermenta durante 12 a 15 dias a 30 °C a 35 °C a un pH de 5 a 6.

El documento CN 101 139 223 describe la produccion de un fertilizante de plantas por fermentacion de, por ejemplo, harina de pescado usando una mezcla de bacterias que comprende Bacillus subtilis y Lactobacillus.

El documento CN 101 422 210 describe la preparation de un aditivo de pienso para fermentacion solida de proterna vegetal y residuos que contienen quitina tales como cabezas y carcasas de camarones. La fermentacion se realiza a traves de una mezcla de bacterias que comprende Bacillus sp, Lactobacillus sp, y Streptococcus a un pH de 6,5 a 7,0 y una temperatura de 30 °C a 50 °C. El documento KR 2009 0085754 describe una composition probiotica para el ganado que comprende, por ejemplo, quitosana de carcasas de cangrejo y una mezcla de bacterias que comprende, por ejemplo, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Lactobacillus casei y/o Lactobacillus acidophilus.

Bueno-solano et al. (2009) describe la fermentacion de subproductos de camaron a una temperatura de 30 °C a 36 °C y un pH de 6,5 usando un "inoculo comercial" y la posterior centrifugation del caldo de fermentacion para obtener, entre otros, una fraction rica en quitina.

Se describen una composicion microbiana y procesos de biodegradacion.

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Una composicion microbiana descrita comprende (a) una o mas bacterias acidolacticas (LAB) y (b) uno o mas o dos o mas microorganismos seleccionados del grupo de generos que consiste en Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces., Micrococcus, Nitrobacter y Proteus. En realizaciones preferidas al menos uno de los Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces., Micrococcus, Nitrobactery Proteus es una cepa quitinolitica que produce una quitinasa (por ejemplo, endoquitinasa y/o exoquitinasa). En algunas composiciones microbianas la LAB se selecciona de los generos que consisten en Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, y Streptococcus. Cuando la LAB es Lactobacillus, la LAB puede ser Lactobacillus acidophilus y/o Lactobacillus casei tal como Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008).

El Bacillus en esta composicion puede seleccionarse del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis y Bacillus thuringiensis tales como Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) y Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® BT).

El Azotobacter en esta composicion puede ser Azotobacter vinelandii tal como Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008).

El Trichoderma en esta composicion puede ser Trichoderma harzianum tal como Trichoderma harzianum (TRICHOSIL).

El Rhizobium en esta composicion puede ser Rhizobium japonicum tal como Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008).

El Clostridium en esta composicion puede ser Clostridium pasteurianu tal como Clostridium pasteurianu (Bioderpac, 2008).

Las Pseudomonas en esta composicion pueden ser Pseudomonas fluorescens tal como Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008).

Otra composicion microbiana descrita comprende un o mas o dos o mas microorganismos seleccionados del grupo que consiste en Bacillus subtilis ((SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® Bt), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008).

Una composicion microbiana descrita puede comprender Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y/o Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008).

Otra composicion microbiana descrita mas puede comprender Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD-73, Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008).

La presente composicion microbiana es HQE. HQE se deposito en la American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA, Estados Unidos el 27 de abril de 2010 y se le dio la Patent Deposit Designation PTA-10861.

Tambien se describen microorganismos aislados seleccionados del grupo que consiste en Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® bT), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008).

El presente proceso de biodegradacion comprende mezclar un animal marino o subproducto de animal marino con HQE para formar una mezcla; fermentar la mezcla; y separar la mezcla en fracciones solidas, acuosas y lipidicas. A diferencia de los procesos de biodegradacion de la tecnica anterior, el proceso de biodegradacion descrito produce quitosana y glucosamina que puede encontrarse en la fraccion acuosa. El animal marino es preferiblemente un artropodo marino, tal como, camaron, cangrejo de rio, cangrejo o kril. En algunas realizaciones, el animal marino es un pez o un subproducto de pescado tal como piel, musculo u organo de peces.

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Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra esquematicamente un proceso de degradacion preferido para subproductos de camaron.

La Figura 2 representa el pH y la acidez titulable total durante la fermentacion lactica de los subproductos de camaron.

Descripcion detallada de la invencion

Como se usa en este documento, la expresion "animal marino" se refiere a cualquier animal que vive en oceanos, mares o agua dulce. Los animales marinos incluyen peces y artropodos marinos.

Como se usa en este documento, la expresion "artropodo marino" se refiere a un animal marino invertebrado que tiene un exoesqueleto que vive en oceanos, mares o agua dulce. Generalmente los artropodos marinos tienen un cuerpo segmentado, y apendices unidos. Los artropodos marinos son miembros del subfilo Crustacea. Clases preferidas de Crustacea incluyen Branchiopoda (por ejemplo, camarones de salmuera, Cladocera y Triops), Cephalocardia (por ejemplo, camaron de herradura), Maxillopoda (por ejemplo, barnacles y copepodos (zooplancton)), Ostracoda (por ejemplo, ostracodos) y Malacostraca (por ejemplo, cangrejos, langostas, camaron, kril, etc.).

Como se usa en este documento, el termino "subproducto" se refiere a cualquier parte de un animal marino. En algunas realizaciones el subproducto se produce mediante el procesamiento comercial del animal marino. Por ejemplo, en la industria del camaron, el cefalotorax y el exoesqueleto son subproductos de camaron. En la industria del procesamiento de cangrejos y langostas el exoesqueleto (carcasa) es un subproducto.

En algunas realizaciones, puede usarse el artropodo completo en el proceso de biodegradacion. Por ejemplo, mucho kril es de aproximadamente 1-2 centimetros (0,4-0,8 in) de longitud como adultos pero unas pocas especies crecen hasta tamanos del orden de 6-15 centimetros (2,4-5,9 in). El aceite de kril contiene al menos tres componentes: (1) acidos grasos omega-3 similares a los del aceite de pescado, (2) acidos grasos omega-3 conjugados con fosfolipidos y (3) el antioxidante astaxantina. Ademas, el exoesqueleto, contiene fluoruro. Por consiguiente, estos componentes pueden separarse en el proceso de biodegradacion con los componentes oleosos que se estan aislando en la fraccion lipidica y el fluoruro en la fraccion liquida.

Como se usa en este documento, la expresion "composicion microbiana" se refiere a un medio liquido, solido o gelatinoso que contiene o soporta fisicamente uno o mas microorganismos, preferiblemente dos o mas. Las composiciones microbianas incluyen, aunque sin limitacion, caldos de fermentacion que contienen uno o mas microorganismos e inoculos que se usan generalmente para iniciar un caldo de fermentacion y que contiene mayor concentracion de los microorganismos que lo que esta presente en el caldo de fermentacion. Las composiciones microbianas que contienen especies/cepas a veces se mencionan como "composiciones microbianas Bioderpac" que se refiere a una composicion que contiene uno o mas de los microorganismos o una combinacion de uno o mas microorganismos con otros microorganismos.

Como se usa en este documento, la expresion "microorganismo aislado" se refiere a un medio liquido, solido o gelatinoso que contiene o soporta fisicamente un microorganismo.

Las composiciones microbianas descritas o microorganismos aislados pueden combinarse con otros microorganismos para formar una nueva composicion microbiana que puede usarse para procesos diferentes a los descritos especificamente en este documento.

Una composicion microbiana descrita puede comprender (a) una o mas bacterias acidolacticas (LAB) y (b) uno o mas o dos o mas microorganismos seleccionados del grupo de generos que consiste en Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces., Micrococcus, Nitrobacter y Proteus. Por ejemplo, al menos uno o mas, dos o mas o tres o mas de los Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces., Micrococcus, Nitrobactery Proteus es una cepa quitinolitica que produce una quitinasa (por ejemplo, endoquitinasa y/o exoquitinasa). En algunas composiciones microbianas, la LAB puede seleccionarse de los generos que consisten en Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, y Streptococcus. Cuando la LAB es Lactobacillus, la LAB puede ser Lactobacillus acidophilus y/o Lactobacillus casei tal como Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008).

El Bacillus es esta composicion puede seleccionarse del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis y Bacillus thuringiensis tal como Bacillus subtilis (SILoSil® BS), - , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) y Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD- 73 (SILoSil® BT).

El Azotobacter en esta composicion puede ser Azotobacter vinelandii tal como Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008).

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El Trichoderma en esta composition puede ser Trichoderma harzianum tal como Trichoderma harzianum (TRICHOSIL).

El Rhizobium en esta composicion puede ser Rhizobium japonicum tal como Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008).

El Clostridium en esta composicion puede ser Clostridium pasteurianu tal como Clostridium pasteurianu (Bioderpac, 2008).

Las Pseudomonas en esta composicion pueden ser Pseudomonas fluorescens tal como Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008).

Otra composicion microbiana descrita puede comprender uno o mas o dos o mas microorganismos seleccionados del grupo que consiste en Bacillus subtilis ((SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® BT), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008).

Otra composicion microbiana descrita comprende Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y/o Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008).

Otra composicion microbiana descrita mas comprende Bacillus subtilis ((SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil®BT), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008).

La composicion microbiana para su uso en el proceso de biodegradation es HQE. HQE se deposito en la American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA, Estados Unidos el 27 de abril de 2010 y se le dio la Patent Deposit Designation PTA-10861. HQE es un consorcio microbiano compuesto por microorganismos derivados de suelos fertiles y microorganismos de fuentes comerciales. Los microorganismos de fuentes comerciales incluyen Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus thuringiensis cepas ND-1 y HD-73 (SILoSil® BT) y Trichoderma harzianum cada uno obtenido de Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Morelia, Michoacan, Mexico Microorganisms denominado "Bioderpac 2008" por la cepa o especie y la cepa puede obtenerse de HQE. Sin embargo, tambien pueden usarse subconjuntos de los microorganismos en HQE. Los microorganismos Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus thuringiensis (SILoSil® BT) y Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) producen enzimas quitinoliticas que son especialmente importantes al inicio de la biodegradacion. Las enzimas quitinoliticas ayudan a degradar solidos que contienen quitina que pueden constituir una barrera para la digestion posterior. Estos organismos tambien producen proteasas, lipasas y otras enzimas que facilitan la descomposicion de proteinas, lipidos y carbohidratos.

Como se usa en este documento, el termino "HYTb" se refiere a una fraction acuosa obtenida del proceso de biodegradacion. HYTb contiene normalmente aminoacidos (aproximadamente el 3 % en peso al 12 % en peso, habitualmente aproximadamente el 12 % en peso) quitosana (aproximadamente el 1,2 % en peso) glucosamina (aproximadamente el 1 % en peso) y elementos traza (aproximadamente el 6 % en peso) incluyendo calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro y manganeso. La cantidad de quitosana puede variar entre aproximadamente el 0,5 % en peso y el 1,5 % en peso, mas preferiblemente entre aproximadamente el 1,0 % en peso y el 1,5 % en peso. La cantidad de glucosamina puede variar entre aproximadamente el 0,5 % en peso y el 1,5 % en peso, mas preferiblemente entre aproximadamente 1,0 % en peso y el 1,5 % en peso. El total de quitosana y glucosamina es de aproximadamente el 2,0 al 2,5 % en peso. HYTb tambien contiene enzimas tales como enzimas lacticas, proteasas, lipasas quitinasas, acido lactico, polipeptidos y otros carbohidratos. La gravedad especifica de HYTb es normalmente de aproximadamente 1,050-1,054. El contenido promedio de aminoacidos en HYTb para ciertos aminoacidos se expone en la Tabla 1.

Tabla 1

Aminoacido

Hidrolizados en polvo seco

Acido aspartico

38

Acido glutamico

39

Serina

16

Histidina*

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Glicina

28

Treonina*

14

Alanina

36,1

Prolina

25,8

Tirosina*

70

Arginina

22,2

Valina*

20

Metionina*

16,4

Isoleucina*

18,3

Triptofano*

3,1

Leucina*

23

Fenilalanina*

39

Lisina*

13

Total

431

*Aminoacidos esenciales

226

HYTb se produce normalmente por la centrifugacion del producto de fermentacion formado por el producto de biodegradacion. Segun procede el proceso de biodegradacion, los nutrientes para los microorganismos HQE usados para el proceso de biodegradacion, por ejemplo, se agotan y el pH baja debido al acido producido durante la fermentacion. Esto causa que los microorganismos en el producto de fermentacion mueran o queden inactivos. Dependiendo de la fuerza g y el tiempo de la centrifugacion del producto de fermentacion, dichos microorganismos pueden encontrarse en HYTb. Por consiguiente, HYTb puede incluir uno cualquiera o mas de los componentes identificados anteriormente, por ejemplo, quitosana y glucosamina, en combinacion con todos o parte de los componentes microbianos del proceso de fermentacion que estan presentes cuando se detiene. Como alternativa, la centrifugacion puede proceder hasta un punto donde estan agotados sustancialmente todos los componentes microbianos de HYTb. En dichos casos, el componente microbiano puede centrifugarse en la fraccion HYTc. Como alternativa, HYTc puede separarse de HYTb por centrifugacion de baja g. La HYTb entonces puede centrifugase para formar un sedimento de microorganismos y una solucion acuosa HYTb libre de microorganismos.

Como se usa en este documento, el termino "HYTc" se refiere a la fraccion solida obtenida del proceso de biodegradacion. El componente principal de HYTc es quitina. Normalmente tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2300 dalton y constituye aproximadamente el 64 % en peso de la composicion. Aproximadamente el 6 % de HYTc contiene minerales que incluyen calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro y manganeso, aproximadamente el 24 % en peso de proteina y el 6% de agua. Tiene una gravedad especifica de aproximadamente 272 kg/m3. La quitina en HYTc normalmente tiene microorganismos del producto de fermentacion asociado con el mismo. Los microorganismos quitinoliticos tienen una propension a asociarse con quitina solida. Esto se basa en la afinidad de los microorganismos quitinoliticos por el sustrato quitina. Por consiguiente, HYTc tambien puede contener microorganismos quitinoliticos salvo que se emprendan etapas para retirarlos. En el caso de HQE, dichos microorganismos quitinoliticos incluyen uno o mas de los microorganismos productores de quitinasa y/o exoquitinasa analizados en este documento. Dichos microorganismos incluyen Bacillus subtilis (SILoSil® BS) Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® BT), y Trichoderma harzianum (TRICHOSIL). Los microorganismos quitinoliticos pueden retirarse de la quitina solida por esterilizacion, pasteurization o lavado de la quitina con compuestos antimicrobianos tales como jabones o cloro. HYTc tambien puede contener microorganismos adicionales presentes al final del proceso de biodegradacion a causa de la presencia de producto de fermentacion residual o la centrifugacion de HYTb.

Consorcio HQE

Los siguientes son los microorganismos en HQE que se cree que estan implicados en el proceso de biodegradacion y sus propiedades conocidas. En algunos casos la cepa se identifica como "Bioderpac, 2008". Cuando no se conoce la especie, se identifica la especie y la cepa como "Bioderpac, 2008".

HQE se deposito en la ATCC el 27 de abril de 2010 y se le dio la Patent Deposit Designation PTA-10861.

Bacillus subtilis (SILoSil® BS) es una bacteria Gram positiva que es mesofila y crece a una temperatura optima entre 25 y 35 °C. Es aerobica y puede crecer en condiciones anaerobicas y utiliza una amplia diversidad de fuentes de carbono. Contiene dos nitratos reductasas, una de las cuales se utiliza para la asimilacion del nitrogeno. Es capaz de secretar amilasa, proteasas, pululanasas, quitinasas, xilanasas y lipasas.

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Bacillus thuringiensis (Cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® BT)) son bacterias anaerobicas facultativas Gram positivas, en forma de un flagelo peritricoso. Las cepas HD-1 y HD-73 sintetizan cristales con diversas formas geometricas de actividad proteica e insecticida durante el periodo de esporas. Las cepas HD-1 y HD-73 secretan exoquitinasas cuando estan en un medio que contiene quitina y pueden utilizarse para la degradacion de los restos de crustaceo durante produccion de quitoligosacaridos.

Bacillus cereus (Bioderpac, 2008) es una bacteria aerobica facultativa, Gram positiva, y formadora de esporas. Es mesofila y crece a una temperatura optima entre 20 y 40 °C. Produce los antibioticos zwittermicina A y kanosamina.

Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) es una bacteria Gram positiva, movil, formadora de esporas y anaerobica facultativa. Produce bacitracina, alfa-amilasas, lactamasas, proteasas, y fosfatasas alcalinas. Este es un microorganismo no patogenico que esta asociado con plantas o materiales vegetales.

Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008) es una bacteria aerobica Gram positiva. Se considera un saprofito. Produce glucosa deshidrogenasa, penicilina amidasa, beta-amidasa y proteasas neutras.

Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) es un miembro de una de las ocho especies de bacterias acidolacticas. Es Gram positiva, no es porulante y produce acido lactico durante la fermentacion que utiliza lactosa como fuente principal de carbono para producir energia. Crece con o sin la presencia de oxigeno en un medio acido (pH 4-5). Produce las bacteriocinas llamadas lactacina B, acidos organicos, diacetilos y peroxido de hidrogeno.

Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) es un aerobico facultativo, mesofilo que es Gram positivo y que no forma esporas. Tiene la capacidad de adaptarse a temperaturas frias. El pH optimo para su crecimiento es 5,5. Fermenta galactosa, glucosa, fructosa, manosa, manitol, y acetilglucosamina. Esta especie puede crecer sobre un amplio intervalo de pH y temperatura. Produce enzimas amilasa. Inhibe el crecimiento de bacterias patogenicas tales como H. Pylori reduciendo el pH a traves de la produccion de (1) acidos organicos tales como acido acetico, propionico o lactico o (2) peroxido de hidrogeno. Este microorganismo secreta bacteriocinas.

Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) es una bacteria con multiples flagelos, aerobico forzado y su temperatura optima para el crecimiento es entre 25 y 35 °C. Produce lipasas y proteasas termoestables. Es antagonista hacia una gran cantidad de cepas fungicas del suelo. Produce metabolitos secundarios tales como antibioticos, quelatos de hierro, y cianuros. Produce endoquitinasa y celulasa en medios con diferentes concentraciones de glucosa.

Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) es un hongo saprofito. Muestra accion antibiotica y competicion biologica y por esta razon tiene propiedades de control biologico. Produce enzimas que degradan las paredes celulares o una combinacion de dichas actividades. Produce clucanasas, quitinasas, lipasas y proteasas extacelulares cuando interacciona con algunos hongos patogenicos, tales como Fusarium.

Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) es una bacteria de fijacion del nitrogeno. Sintetiza un sistema hidrogenasa que participa en el reciclado del hidrogeno para evitar su perdida durante la fijacion del nitrogeno.

Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) es una bacteria aerobica. Produce nitrogenasas y es capaz de fijar el nitrogeno.

Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008) es una bacteria Gram positiva, anaerobica obligada. Produce ferroxina (una proteina transportadora de electrones) que actua como donante directo de electrones en la reduccion de hierro proteico.

Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008) es una bacteria Gram positiva, anaerobica, facultativa que crece a temperaturas cercanas a 23 °C. Degrada de forma proteolitica proteinas en aminoacidos libres por las enzimas que produce.

Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008) es una bacteria el suelo Gram positiva. Produce multiples enzimas que metabolizan diversos nutrientes. Puede sobrevivir a cambios significativos en temperatura, humedad y fuentes de nutrientes. Las enzimas extracelulares producidas por estas bacterias utilizan quitina y quitosana como sustratos a un pH de 4,5 a 6,5 y a 60 °C. Estas son condiciones generadas al inicio y en las fases finales de la fermentacion lactica en el proceso de biodegradacion.

Nitrobacter sp. (Bioderpac, 2008) es una bacteria Gram negativa, aerobica, que convierte nitritos en nitratos. Crece a un pH entre 6 y 9 y a temperaturas entre 10 a 34 °C. Las bacterias degradan polimeros organicos tales como quitina en compuestos que se utilizan por otros organismos, tales como Pseudomonas fluorescens () y Rhizobium japonicum (Bioderpac2008).

Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008) es una bacteria Gram positiva esferica. Este microorganismo en asociacion con Streptomyces sp () es capaz de degradar derivados coloidales de quitina.

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Grupos y actividad enzimatica de microorganismos en HQE

La biodegradacion de los componentes de animales o subproductos marinos requiere enzimas hidrolfticas tales como proteasas, lipasas, y quitinasas. La composicion microbiana descrita contiene una o mas de dichas enzimas.

El grupo principal de microorganismos en HQE es Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008), Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Pseudomonas fluorescens (Biodepac 2008), Bacillus licheniformis (Biodepac 2008) y Trichoderma harzianum (TRICHOSIL). Estos microorganismos son capaces de biodegradar artropodos o subproductos de artropodos. Uno o mas de los miembros de este grupo principal tambien tienen accion sinergica cuando se combinan con otros microorganismos de HQE.

El primer grupo de microorganismos incluye microorganismos que causan la reduccion del pH y que estabilizan la fermentacion debido a la produccion de acidos organicos y peroxido de hidrogeno. Este grupo incluye Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008) y Lactobacillus casei (Biodepac 2008). Su actividad es importante al inicio de la fermentacion y durante las fases finales de la fermentacion para producir el pH optimo para las enzimas hidroliticas. Su actividad tambien crea un entorno de cultivo que evita el crecimiento de microorganismos indeseados y favorece la desmineralizacion de los restos de quitina. Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008) es un miembro del grupo principal.

El segundo grupo de microorganismos incluye microorganismos que producen enzimas extracelulares. Este segundo grupo incluye Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus cereus (Biodepac 2008), Trichoderma harzianum (Biodepac 2008), Rhizobium japonicum (Biodepac 2008) y Azotobacter vinelandii (Biodepac 2008). Las cadenas de quitina en artropodos o subproductos de artropodos estan asociadas con moleculas proteicas. La separation de dichos polimeros requiere la accion hidrolitica obtenida de las enzimas quitinoliticas y proteoliticas producidas por estos microorganismos. Ambos tipos de enzimas descomponen las cadenas en la parte interna del polimero para producir oligomeros de diversos tamanos. La accion de esas enzimas sucede de un modo sucesivo dentro de las fases intermedias y finales del proceso de fermentacion cuando se consiguen las condiciones apropiadas de pH. Los microorganismos en este grupo y las condiciones ambientales que producen facilitan la liberation de pigmentos y la fraction lipidica adherida a esos restos. Bacillus subtilis (SILoSil® BS) y Trichoderma harzianum (Biodepac 2008) son miembros del grupo principal.

El tercer grupo de microorganismos incluye los microorganismos Bacillus licheniformis (Biodepac 2008), Pseudomonas flourescens (Biodepac 2008), Sptreptomyces, (Biodepac 2008) y Clostridium (Biodepac 2008). Estos microorganismos hidrolizan oligomeras (quito-oligosacaridos y peptidos) para producir quitobiosas, glucosamina, y aminoacidos libres. Bacillus licheniformis (Biodepac 2008) y Pseudomonas flourescens (Biodepac 2008) son miembros del grupo principal.

Un cuarto grupo de microorganismos incluye Bacillus thuringiensis (cepas HD-1 y/o HD-73), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008).

Cada uno de estos grupos, incluyendo el grupo principal, puede ser util por separado y puede combinarse con composiciones microbianas de la tecnica anterior para potenciar su rendimiento. A este respecto, el cuarto grupo esta particularmente indicado.

La Tabla 2 expone algunas de las combinaciones mencionadas anteriormente. La columna 1 es una lista de los microorganismos conocidos en HQE que se cree que son activos en el proceso de biodegradacion. La columna 2 enumera los microorganismos de la columna 1 sin los microorganismos en el cuarto grupo de microorganismos. La columna 3 muestra la combination de los microorganismos principales mientras que las columnas 4, 5 y 6 identifican la combinacion de microorganismos del primer, segundo y tercer grupo. La columna 4 es la combinacion de los grupos 1 y 2; la columna 5 de los grupos 1 y 3 y la columna 6 de los grupos 2 y 3. Otras combinaciones utiles se exponen en las columnas 7-10.

Tabla 2 Composicion de cultivo

Microorganismo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bacillus subtilis

X X X X X X X X

Bacillus cereus

X X X X X X

Bacillus megaterium

X X

Azotobacter vinelandii

X X X X X X

Lactobacillus acidophilus

X X X X X X X X

Lactobacillus casei

X X X X X X

Trichoderma harzianum

X X X X X X X X

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Rhizobium japonicum

X X X X X X

Clostridium pasteurianum

X X X X X X

Bacillus licheniformis

X X X X X X X X

Pseudomonas

X X X X X

fluorescens

Bacillus thuringiensis

X X X X X X

Streptomyces

X X X X X X X

Nitrobacter

X X X X X

Micrococcus

X X X X X

Proteus vulgaris

X X X X X

La actividad de los extractos enzimaticos producidos por los microorganismos en HQE es compleja, pero ha permitido la degradacion de los restos quitinosos de artropodos tales como crustaceos. Los microorganismos en HQE se activan de un modo sucesivo de acuerdo con el entorno generado por los organismos usados.

Metodos para la identificacion y aislamiento de microbios en HQE

Es importante obtener aislados puros antes de intentar caracterizar o identificar una especie. Unas pocas bacterias son morfologicamente unicas y pueden identificarse sin aislamiento, pero casi todas requieren aislamiento. Lo siguiente describe el aislamiento de cultivos puros de una mezcla de especies contenida en HQE para Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (cepas HD-1 y HD-73), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis (SILoSil® Bt), Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008), Nitrobacter sp. (Bioderpac, 2008) y Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008).

Las primeras etapas incluyen:

(1) Siembra en estrias de diluciones e incubaciones diferenciales

(2) Identificacion y separacion de tipos de colonias

(3) Reduction de la coleccion, y

(4) Determination de las caracteristicas iniciales de colonias especificas y la conservation de aislados.

Siembra en estrias de diluciones e incubaciones diferenciales

Una vez se retira un especimen de la muestra HQE debe cultivarse inmediatamente. Cualquier muestra liquida debe agitarse con vortice minuciosamente antes de la preparation de las placas porque las bacterias no moviles pueden asentarse en el fondo de una muestra si estan asociadas con materia particulada. Desafortunadamente, las bacterias no segregan de forma homogenea y muestras replicadas de la misma mezcla pueden contener diferentes cantidades de bacterias. El objeto de la agitation con vortice minuciosa y la posterior siembra en estrias de diluciones es propagar CFU (unidades formadoras de colonias) individuales para obtener colonias concretas que puedan sub-cultivarse.

Todos los microorganismos mencionados anteriormente pueden someterse por separado a los siguientes procedimientos para la identificacion y aislamiento con la exception de Nitrobacter sp. que se explicara por separado.

Se obtiene una carga completa de muestra agitada con vortice minuciosamente de HQE de forma aseptica y se aplica a un borde de la superficie de agar. Con movimientos hacia atras y hacia delante debe hacerse el estriado a aproximadamente una cuarta parte de la superficie mientras se extrae el asa hacia el centro de la placa. El estriado no debe romper la superficie del agar, y deberia ser de (20 o mas) lineas estriadas producidas. Para diluir o propagar la muestra, el asa debe quemarse para destruir todo el material viable, tocarse en una parte limpia del agar para enfriarlo, despues hacer estrias perpendiculares al inoculo original, solapando la parte de la placa una vez o dos veces. La segunda section debe cubrir una mitad de la superficie esteril restante. Esto propaga una pequena parte del inoculo original posiblemente diluyendolo suficientemente para provocar la aparicion de colonias individuales despues de incubation. Una tercera seccion despues se estria perpendicular a la segunda seccion, quemando y enfriando el asa y solapando la seccion previa como anteriormente, para diluir adicionalmente el inoculo.

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En la preparacion de aislados de cada lote de producto, la siguiente fase es preparar placas estriadas replicadas e incubarlas en condiciones diferentes en una posicion invertida, para maximizar las oportunidades de diferenciacion de los tipos de colonias para Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis (cepas Hd-1 y HD-73, SILoSil® BT), Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008), y Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008). La temperatura de incubacion se varia (normalmente 25, 30, y 37 °C) y se incuba en condiciones tanto aerobicas como anaerobicas. Este enfoque aumenta las posibilidades de separacion de especies individuales, ya que diferentes especies/bacterias tienen diferentes intervalos de temperatura optima para el crecimiento y diferentes necesidades de oxigeno. Los organismos aerobicos deben comprobarse despues de un dia de incubacion, ya que algunas de nuestras bacterias caracterizadas que se estan ensayando crecen muy rapido y excluyen a las otras.

Enfoques para la identificacion y separacion de tipos de colonias

Puede usarse un microscopio de diseccion con un iluminador posterior para distinguir colonias individuales. Las placas deben permanecer invertidas durante el examen. Las colonias son distinguibles por tamano, forma, opacidad y textura respecto a los microorganismos mencionados anteriormente. Tras el examen, es mejor indicar las colonias a muestrear poniendo una pequena marca al lado de ellas en la parte inferior de la placa. Sera necesario dar la vuelta a la tapa de la placa para recoger el material de las colonias. Debe tenerse cuidado de insertar cuidadosamente el asa esteril solamente el tiempo que lleva obtener un inoculo.

Para color, caracteristicas superficiales y perfil (elevado, plano, etc.), es necesario examinar las colonias con luz incidente, a traves de la tapa transparente. Las tapas deben dejarse encima porque de otro modo las placas quedaran contaminadas. Antes de girar la placa hay que retirar e invertir la tapa para retirar la humedad. La tapa antigua debe remplazarse con una nueva para la vision.

En el caso de que dos colonias solapen y aun puedan distinguirse, entonces estan presentes al menos dos colonias. Las colonias habitualmente tienen una textura bastante simple, uniforme. Si un area parece un mosaico, probablemente hay al menos dos especies. Cada tipo unico de colonia debe muestrearse tomando un inoculo en aguja y realizando una siembra en estrias de diluciones de factor tres en una placa nueva. Debe tenerse cuidado de muestrear solamente la colonia de interes. Se incuba cada nueva placa estriada en condiciones aerobicas a la temperatura que se incubo la placa original.

Las especies mostraran optimos de temperatura, indicados por colonias de crecimiento mas rapido y/o mas grande a temperaturas cercanas a la ideal. Cualquier colonia que se muestree a partir de una placa incubada de forma anaerobica probablemente sera un anaerobio facultativo.

Reduccion de la coleccion

Probablemente tienen que aislarse duplicados de la misma especie y cepa a partir de diferentes placas estriadas. Muchas especies diferentes y diferentes cepas de la misma especie producen tipos de colonias muy similares. Para reducir la cantidad de aislados a especies/cepas unicas, se cultivan aislados duplicados sospechosos en la misma placa. En dos tercios de la superficie se realizan dos "mini-diluciones" para obtener colonias individuales para cada cultivo, y en el tercio restante se mezclan. Despues de incubacion, si los dos aislados crecen en la misma placa y/o el inoculo mixto produce dos tipos de colonias distinguibles, se han identificado dos aislados unicos.

Caracterizacion inicial de colonias y conservacion de aislados

La mayoria de las caracteristicas de los organismos en consideration deben determinarse usando luz incidente, no transmitida.

Una vez obtenido un aislado y establecida la pureza por examen de colonias y examen microscopico, debe inocularse un tubo inclinado de agar e incubarse a una temperatura apropiada con el tapon flojo para permitir el intercambio de gases. Despues de que aparezca crecimiento, el cultivo debe describirse, apretarse el tapon, y mantenerse el tubo a temperatura ambiente como fuente de cultivo puro para ensayos.

Ademas de la caracterizacion descriptiva global, debe tenirse con gram un cultivo joven (<18 h) y registrarse los resultados incluyendo la forma y tamano de las celulas, vainas o capsulas si fueran evidentes, y cualquier evidencia de esporas o estructuras similares. La relation al oxigeno es la siguiente etapa con la que reducir las posibles categorias. Despues de eso, es esta combination particular de resultados de tincion gram, tipo celular, y relacion a oxigeno lo que determina las siguientes series de etapas hacia la caracterizacion del aislado.

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Deteccion y recuento de poblacion de Nitrobacter sp. en el producto

Hay varios estudios sobre el metabolismo, supervivencia, y crecimiento de oxidantes de nitrito en cultivos puros y en su actividad nitrificante en diversos entornos, pero pocos estudios han tratado con la poblacion Nitrobacter natural. Aunque la conversion biologica de nitrito en nitrato es un proceso bien conocido, los estudios y procedimientos de la poblacion Nitrobacter actualmente se ha visto impedida por metodos inadecuados de deteccion y recuento.

Este fallo se debe en parte a las caracteristicas fisiologicas desfavorables de estas bacterias, concretamente crecimiento lento, biomasa pequena, y susceptibilidad de los cultivos a contaminacion. No hay modo de contar la poblacion de Nitrobacter en el suelo porque consume mucho tiempo y es selectiva.

Descripcion detallada del proceso de crecimiento de Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Bacillus subtilis (SILoSil® BS) y Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008)

Ingrediente del medio: agua purificada y agar nutriente de medio de placa.

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de la placa es agar nutriente, (4) incubar las placas a 37 °C durante 24-48 horas, (5) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Pseudomonas fluorescens y Proteus vulgaris

Ingrediente del medio: agua purificada y agar nutriente de medio de placa.

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de la placa es agar nutriente, (4) incubar las placas a 37 °C durante 24-48 horas, (5) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei

Se desarrollo el agar M.R.S. por Man, Rogosa y Sharpe para proporcionar medios que pudieran demostrar un buen crecimiento de lactobacilos y otras bacterias acidolacticas. El medio de cultivo permite un desarrollo abundante de todas las especies de lactobacilos. La peptona y la glucosa constituyen la fuente de nitrogeno, carbono y de otros elementos necesarios para el crecimiento bacteriano. El monooleato de sorbitan, magnesio, manganeso y acetato, contribuyen a los cofactores y pueden inhibir el desarrollo de algunos microorganismos. El citrato de amonio actua como un agente inhibidor del crecimiento de bacterias Gram negativas. Vease la Tabla 3.

Tabla 3

Formula (en gramos por litros)

Instrucciones

Proteosa peptona n.° 3

10,0

Extracto de carne

8,0

Extracto de levadura

4,0

Glucosa

20,0

Monooleato de sorbitan

1 ml Suspender 64 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando hasta el punto de ebullicion durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en esterilizador durante 15 minutos a 121 °C.

Fosfato dipotasico

2,0

Acetato sodico

5,0

Citrato de amonio

2,0

Sulfato de magnesio

0,2

Sulfato de manganeso

0,05

Agar

13,0

pH final: 6,4 ± 0,2

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Ingrediente del medio: agua purificada y sustrato M.R.S. de agar nutriente de medio de placa.

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra Kquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar en camara aerobica con CO2 al 5-10 % una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de la placa es agar M.R.S., (4) incubar las placas a 33-37 °C durante 72 horas o 30 °C durante 5 dias, (5) las unidades formadoras de colonia deben ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Resultados. Las unidades formadoras de colonia deben ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Caracteristicas de las colonias: generalmente pequenas, blanco-grisaceas, lisas o rugosas.

Caracteristicas del medio: el medio preparado es amarillo.

Identificacion de lactobacilos:

Tabla 4

Crecimiento a Acido NH3 Arginina Crecimiento en caldo de NaCl al 4 %

15 °C

45 °C la su sal mn so xi

L. acidophilus

- + + + + - - - - -

L. casei

+ V +/- +/- + + + - - +

Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008)

Ingrediente del medio: agua purificada y sustrato de agar nutriente de medio de placa (Burk's, Asbhy, Jensen's).

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) incubar esta solucion a 25 °C durante 48 horas, (3) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (4) incubar una placa de replica, con sustrato de agar nutriente, serie con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de placa es agar nutriente, (5) incubar las placas a 25 °C durante 48-72 horas, (6) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008)

Ingrediente del medio: agua tamponada con fosfato y sustrato de agar de metodos convencionales de medio de placa (TYG).

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua tamponada con fosfato, (2) preparar diluciones apropiadas en serie, (3) sembrar una alicuota apropiada para dilucion deseada en placas Petri, (4) anadir agar de metodos convencionales templado y mezcla de placa, (5) colocar placas secadas invertidas en camara anaerobica, (6) incubar las placas a 35-37 °C durante 48-72 horas, (7) despues del periodo de incubacion, retirar las placas de la camara anaerobica y contar las placas, registrar las diluciones usadas y contar la cantidad total de colonias para cada dilucion, (8) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

La identificacion de esta especie de Clostridium usa una morfologia microscopica tipica de una colonia que permite una identificacion rapida y especulativa de algunas especies de Clostridium frecuentemente aisladas. Ademas, junto con el uso de ensayos bioquimicos simples tales como el estudio de la produccion de lecitinasa y lipasa en yema de huevo en agar, la hidrolisis de la gelatina y urea y la produccion de indol a traves del metodo rapido (p-dimetil-amino- cinamaldehido), constituyen un metodo facil y barato para la identificacion, incluso definitivo, de algunas de ellas.

Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008)

Ingrediente del medio: agua purificada y agar nutriente de medio de placa.

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de la placa es agar nutriente, (4) incubar las placas a 37 °C durante 24 horas, (5) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Si se encuentran cocos Gram positivos, realizar ensayos de sensibilidad a antibioticos. Micrococcus es sensible a Bacitracina y resistente a furazolidona.

Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008)

Ingrediente del medio: agua purificada y medio ALM de placa (agar con manitol de extracto de levadura).

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Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de placa es ALM (agar con manitol de extracto de levadura), (4) incubar las placas a 28 °C durante 96 horas, (5) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Para confirmar Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), la colonia aislada se usa para infectar una leguminosa de forma aseptica para causar la formacion de nodulos.

Trichoderma harzianum (TRICHOSIL)

Ingrediente del medio: agua purificada y sustrato de medio de agar de extracto de malta (2 % p/vol) suplementado con cloranfenicol, sulfato de estreptomicina, y nistatina. Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de placa es agar de extracto de malta, (4) incubar las placas a 25 °C durante 4 dias, (5) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Bacillus thuringiensis (Cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® BT))

Ingrediente del medio: agua purificada y sustrato de agar de medio Superbroth de placa suplementado con 2 g/litro de D-glucosa y 50 |jg/ml de eritromicina.

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de placa es agar Superbroth, (4) incubar las placas a 28 °C durante 10-14 dias, (5) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008)

Ingrediente del medio: agua purificada y medio de agar de aislamiento de actinomicetes de placa.

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de placa es agar de aislamiento de actinomicetes, (4) incubar las placas a 28 °C durante 2-3 dias, (5) las unidades formadoras de colonia deben de ser 1.000.000 por 1 ml de producto.

Nitrobacter sp. (Bioderpac, 2008)

Ingrediente del medio: agua purificada y sustrato de agar nutriente de medio de placa.

Procedimiento: (1) colocar 0,1 ml de muestra liquida de HQE en 9,9 ml de agua purificada, (2) comenzar un intervalo de dilucion en serie hasta 1-10, (3) incubar una serie de placas de replica con 1 ml del intervalo de dilucion, el medio de placa es sustrato de agar nutriente de placa, (4) incubar las placas a 30 °C durante 10-14 dias.

Proceso de biodegradacion

En una realizacion preferida, el artropodo marino es un crustaceo y el crustaceo preferido es camaron. El subproducto de camaron comprende cefalotorax y/o exoesqueleto de camaron.

En el proceso de biodegradacion, se prefiere que la fermentacion sea fermentacion aerobica facultativa. Tambien se prefiere que la fermentacion se realice a una temperatura de aproximadamente 30 °C a 40 °C. El pH es preferiblemente menor de aproximadamente 6, mas preferiblemente menor de aproximadamente 5,5. Sin embargo, el pH debe mantenerse por encima de aproximadamente 4,3. La fermentacion se realiza durante aproximadamente 24-96 horas. En algunas realizaciones, la fermentacion se realiza durante aproximadamente 24-48 horas y mas preferiblemente 24-36 horas. Estos tiempos de fermentacion son mucho mas cortos que los tiempos de fermentacion tipicos de la tecnica anterior de 10 a 15 dias para conseguir sustancialmente la misma cantidad de digestion, aunque sin formacion detectable de quitosana y glucosamina.

La separation de la mezcla es preferiblemente por centrifugation (por ejemplo, aproximadamente 920 g). Tambien puede usarse separacion por gravedad, pero no es preferida a causa del tiempo necesario para conseguir la separacion.

La mezcla se separa en tres fracciones: solida, acuosa y lipidica. La fraction solida comprende quitina y se denomina HYTc. La fraccion acuosa comprende hidrolizado de proteina, aminoacidos, quitosana y glucosamina y se denomina HYTb. La fraccion lipidica comprende esteroles, vitamina A y E y pigmentos carotenoides tales como astaxantina.

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Tiene que usarse HQE en el proceso de biodegradacion. En otras realizaciones, se prefiere anadir HYTb a HQE o el caldo de fermentacion. Como se ha descrito anteriormente, HYTb contiene aminoacidos, quitosana, glucosamina y elementos traza incluyendo calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro y manganeso. HYTb tambien contiene enzimas tales como enzimas lacticas, proteasas, lipasas, quitinasas, acido lactico, polipeptidos y otros carbohidratos. HYTb tambien puede contener microorganismos inactivos de un proceso previo de biodegradacion. Dichos microorganismos pueden volver a reactivarse y, en combinacion con HQE, contribuyen a un proceso de biodegradacion mas robusto en comparacion con cuando se usa HQE en si mismo, como se describe de otro modo en este documento.

Mas particularmente, el proceso incluye las siguientes etapas:

a. Activacion de las celulas microbianas en una solucion basica de azucar para potenciar su crecimiento y la formacion de biomasa.

b. Molienda de los subproductos de camaron (cefalotorax y exoesqueleto) para preparar una pasta homogenea.

c. Mezcla homogenea de la pasta de subproducto de camaron con al menos un 10 % del inoculo activado.

d. Ajuste de los valores de pH a menos de 6,0 en la mezcla usando una solucion de acido citrico para inhibir el crecimiento de microorganismos y para promover el desarrollo de celulas microbianas que constituyen el inoculo.

e. Fermentacion de la mezcla en un sistema agitado de forma no continua a temperaturas dentro de un intervalo de 30 a 40 °C durante al menos 96 horas manteniendo el pH a menos de 5,0. El pH se contrala periodicamente. Si el pH sube por encima de 5,0, se anade un tampon acido citrico en una cantidad para mantener el pH por debajo de 5,0.

f. Centrifugacion del fermento para separar las tres fracciones principales: quitina, hidrolizado liquido y pasta pigmentada.

g. Aclarado de la quitina en bruto y recogida del agua de aclarado para recuperar los solidos finos o minerales.

h. Secado de la quitina y almacenamiento.

i. Secado y almacenamiento del hidrolizado liquido.

j. La pasta pigmentada (fraccion lipidica) se almacena en recipientes cerrados para su conservacion.

El proceso y fundamentos operativos se entienden mejor con referencia a la Figura 1 y la siguiente descripcion de tallada.

Activacion de celulas microbianas

El inoculo de HQE tiene una concentracion de microbios de aproximadamente el 2,5 al 3,0 % (p/v). HQE se activa por dilucion hasta el 5 % en solucion de cana de azucar (concentracion final del 3,75 % de cana de azucar), y se incuba a 37 °C durante 5 dias. Se anade preferiblemente HYTb (10 ml por litro de cultivo) para proporcionar una fuente de minerales y aminoacidos obtenidos de forma natural. El crecimiento celular de los microorganismos se estimo por densidad optica medida a 540 nm. La activacion esta completa a una densidad optica de aproximadamente 1,7. La concentracion de microbios despues de la activacion es de aproximadamente el 1,9 al 3,0 % (p/v).

Preparacion de muestras

Las muestras de subproductos de camaron se obtienen de plantas de procesamiento de camaron. Se mezcla residuo ligeramente descongelado y picado (1500 g por lote) con 99 gramos de cana de azucar (concentracion final del 6,6 % en peso) y 85,5 ml de HQE activado al 5 % (v/p) (densidad optica de celula = 1,7). Despues se ajusta el pH a 5,5 usando acido citrico 2 M.

Control de fermentacion

La mezcla se incuba a 36 °C con agitacion no continua durante 96 h. Durante el proceso de fermentacion, se controla el pH usando un potenciometro, y se determina la acidez titulable total (TTA, %) por titulacion con NaOH 0,1 N hasta que se obtiene un pH de 8,5. La TTA se expresa como un porcentaje de acido lactico.

Condiciones de separacion

El producto de fermentacion es un ensilaje viscoso que tiene un color naranja intenso, debido a la presencia de astaxantina. El ensilaje se centrifuga (5 °C) a 1250 rpm (930 g) durante 15 min para obtener la quitina, los hidrolizados liquidos, y la pasta pigmentada. La fase superior (pasta pigmentada) se separa manualmente. Los hidrolizados liquidos se separan por decantacion, y el sedimento que constituye la quitina sin procesar se lava con agua destilada para separar los solidos finos. El liquido resultante se recoge y seca. La quitina sin procesar, los hidrolizados liquidos y los solidos finos se secan a 60 °C. Todas las fracciones se almacenan para protegerlas de la luz.

El protocolo anterior se realizo usando HQE en tres lotes de fermentacion por duplicado como se expone en los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 1

Control de fermentacion por medicion de pH y acidez titulable total (TTA, %).

Los valores iniciales promedio de pH y TTA fueron 7,31 ± 0,10 y 0,53 ± 0,09, respectivamente. Como se muestra en la Figura 2, el pH se redujo inicialmente hasta 6,5 mediante la adicion de acido dtrico 2M. Despues, debido a la proteolisis y la liberacion de amonio, el pH aumento de nuevo hasta 7,11 ± 0,08 durante las primeras 2 h, y despues, el pH disminuyo en un 28 % (hasta 5,28 ± 0,01) durante las 12 horas de fermentacion. A aproximadamente 24 horas de fermentacion, el pH final fue 4,57 ± 0,15. En paralelo a la disminucion en el pH se observo un comportamiento similar en los valores medios de la TTA. Durante las 2 primeras horas, los valores promedio de TTA fueron del 1 %, y despues estos valores aumentaron gradualmente hasta un valor promedio de 3,33 ± 0,23 a las 24 horas, como se muestra en la Fig.2.

Ejemplo 2

Productos de la fermentacion y composicion quimica.

Despues del proceso de fermentacion, se centrifugo el ensilaje para separar los tres productos principales (quitina, hidrolizado liquido, y pasta pigmentada). El otro producto, los solidos finos, se retuvieron con el lavado de quitina sin procesar. La Tabla 5 muestra la proporcion recuperada en cada fraccion. En peso seco, la fraccion mas grande correspondia al hidrolizado liquido (55 %), despues los solidos finos (29 %), quitina sin procesar (10 %) y pasta pigmentada (5 %). En el lote fermentado, el valor promedio de peso seco fue del 32 % (481,1 ± 5,6 g).

La Tabla 6 muestra la caracterizacion quimica de cada uno de los cuatro productos principales que se obtuvieron a traves de fermentacion. El producto quitinoso (quitina) muestra una desmineralizacion parcial reflejada como ceniza. Esto tambien revela alto contenido de proteina (42,34 %) cuantificada en los hidrolizados liquidos. Esto facilito la recuperacion de una pasta pigmentada consistente principalmente de lipidos totales (42,67 %), y produjo una fraccion abundante en ceniza (16,72 %) en los solidos finos.

Tabla 5. Productos separados de la fermentacion

Materia seca (g)

Quitina sin procesar (g) Hidrolizado Hquido (g) Pasta lip^dica (g) Solidos finos (g)

480,0

48,0 264,4 22,9 141,2

487,5

50,2 268,8 24,0 140,8

475,7

51,0 265,7 23,7 131,7

481,1 ± 5,6

49,5 ± 2,4 266,3 ± 4,6 23,3 ± 0,5 141,9 ± 5,5

Tabla 6. Composicion quimica (peso seco) de los productos de fermentacion

Productos % Proteina % Ceniza % Lipido total

Quitina sin procesar

18,12 ± 0,15 4,36 ± 0,26 2,02 ± 0,46

Hidrolizado liquido

42,34 ± 0,03 7,96 ± 0,16 4,28 ± 0,28

Pasta lipidica

30,80 ± 0,25 5,11 ± 0,16 42,67 ± 0,63

Solidos finos

31,62 ± 0,10 16,72 ± 0,37 Nd

Ejemplo 3

Perfil de aminoacidos en los hidrolizados en polvo seco

El contenido de aminoacidos del hidrolizado seco se determino como se describe por Lopez-Cervantes et al., "Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatography", Journal of Chromatography A, volumen 1105, 1 (2006). La Tabla 6 muestra el perfil total de aminoacidos de los hidrolizados en polvo seco. La proporcion de aminoacidos esenciales fue del 52,5 % a los hidrolizados en polvo seco.

Tabla 7. Perfil de aminoacidos de los hidrolizados en polvo seco (mg por g de peso seco)

Aminoacido

Hidrolizados en polvo seco

Acido aspartico

38

Acido glutamico

39

Serina

16

Histidina*

9

Glicina

28

Treonina*

14

Alanina

30

Prolina

8

Tirosina*

70

Arginina

18

Valina*

20

Metionina*

4

Isoleucina*

15

Leucina*

23

Fenilalanina*

39

Lisina*

13

Total

394

*Aminoacidos esenciales

207

Ejemplo 4

Cuantificacion de glucosamina en quitina sin procesar

5

En la quitina, el contenido de glucosamina se cuantifico como un mdice de pureza. Los contenidos de glucosamina en quitina fueron de 516, 619 y 640 mg por g (peso seco), correspondiendo estos valores a los resultados de los tres lotes de fermentacion realizados por duplicado. Por lo tanto, la cantidad promedio de glucosamina en este estudio fue de 591 mg por g de peso seco de quitina. Se informo del metodo para la cuantificacion de glucosamina por 10 Lopez-Cervantes et al., "Quantitation of glucosamine from shrimp waste using HPLC" Journal of Chromatographic Science, volumen 45, 1 (2007).

Ejemplo 5

15 Contenidos de astaxantina y perfil de acidos grasos en la pasta pigmentada

La astaxantina es el pigmento principal en la pasta lipidica obtenida de los residuos fermentados de camaron. El contenido de astaxantina vario de 1,98 a 2,25 mg g-1 de pasta lipidica seca, y el promedio es de 2,11 mg g-1 de pasta lipidica seca. La astaxantina se determino por una version del metodo de Lopez-Cervantes et al., "Quantification of 20 astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by HPLC" Biomedical Chromatography, volumen 20, 981 (2006).

En la pasta pigmentada, se identificaron catorce acidos grasos. El acido palmitico (C16:0), y el acido oleico (C18:1 n9) se encontraron en mayor cantidad.

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una composition que comprende los microbios en la Patent Deposit Designation de la ATCC PTA-10861.
2. 2. Un proceso de biodegradation que comprende:

   mezclar un animal marino o un subproducto de animal marino con una composicion que comprende los microbios en la Patent Deposit Designation de la ATCC PTA-10861 para formar una mezcla; fermentar dicha mezcla; y

   separar dicha mezcla en fracciones solidas, acuosas y lipidicas.
3. 3. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que dicho animal marino es un artropodo marino.
4. 4. El proceso de la reivindicacion 2, en el que dicho artropodo marino se selecciona del grupo que consiste en camaron, cangrejo y kril.
5. 5. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que dicho animal marino es un pez.
6. 6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicha fermentation es por fermentation aerobica facultativa.
7. 7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que dicha separation es por centrifugation.
8. 8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que dicha fermentacion es a una temperatura de aproximadamente 30 °C a 40 °C.
9. 9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dicha fermentacion se realiza a un pH entre aproximadamente 4,3 y 5,0.
10. 10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que dicha fermentacion se realiza durante aproximadamente 24-96 horas.
11. 11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que dicha fraction acuosa comprende aminoacidos, quitosana y glucosamina.
12. 12. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicha fraccion acuosa comprende adicionalmente elementos traza.
13. 13. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en el que dicha fraccion solida comprende quitina.