CN104630313B - 一种低分子量壳聚糖敷料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用壳聚糖敷料领域，具体涉及一种低分子量壳聚糖敷料的制备方法。低分子量壳聚糖敷料的制备方法分为以下几个步骤：（1）以南极磷虾为原料，通过乳酸菌发酵法制备甲壳素；（2）通过碱液结合超声波技术脱除甲壳素上的乙酰基制备壳聚糖；（3）乙酸纯化提取低分子量壳聚糖；（4）用低分子量壳聚糖粉末制备低分子量壳聚糖敷料。本发明的制备方法可以大大减少酸碱对环境的污染，同时本发明选用南极磷虾利用微生物发酵和超声波技术制备得到的低分子质量壳聚糖及其敷料具有更好的抗菌、止血效果，且减少了过敏反应，可以在伤口擦伤、大量出血时，喷洒该敷料即可有效的发挥止血作用。
Description
技术领域
本发明属于医用壳聚糖敷料领域，具体涉及一种低分子量壳聚糖敷料的制备方法。
背景技术
壳聚糖在化工、食品、医疗等行业具有广泛的应用。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，在自然界中的储量非常丰富，广泛存在于虾、蟹和昆虫的外壳及藻类、菌类的细胞壁中，是年产量仅次于纤维素的第二大天然高分子，也是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖。壳聚糖是分子量通常在几十万到几百万不等，因其分子内有较强的氢键作用，只能溶于稀酸溶液中，而不能直接溶于水中，导致使用范围受到较大的限制。
目前，世界各国对低分子量壳聚糖的制备方法的研究非常多，主要制备方法有酸降解法、氧化降解法、酶降解法、合成法和物理降解法。酸降解法是制备单糖和一系列相应低分子量壳聚糖主要途径之一，但是酸降解法不好控制，选择性差、分离纯化比较困难，产率较低，在制备低分子量壳聚糖时主要得到的单糖，其次是双糖，很难得到所需活性的低分子量壳聚糖；氧化降解法是目前研究较多的方法，其中H2O2氧化法更有大量文献报道，但是氧化降解存在的最大问题是反应过程不易控制，容易发生褐变，在降解过程中引入了各种反应试剂，增加了控制降解副反应及降解产物分离纯化的难度；酶降解法是用专一性或非专一性酶对壳聚糖进行生物降解方法，能够得到平均相对分子量较低的低聚糖和单糖。在整个降解过程中无其它反应试剂加入，不至于发生其它副反应，降解条件温和，降解过程及产物分子质量分布较易控制，缺点是所使用的酶较为特殊，成本高，生产周期长。合成法的研究已经取得较大进展，但合成过程涉及基团保护和基团脱去等过程，步骤较为复杂，目前主要研究利用酶法合成，已经取得一定成果，但还停留在实验室阶段，无法实现产业化。物理降解法主要是利用微波、超声波、γ 射线等物理方式处理也可降解壳聚糖，但是物理降解法也存在一定的局限性，目前也不容易实现产业化。
在壳聚糖生产工业中，使用强酸强碱制备壳聚糖的比较多，该过程使用的强碱的浓度在40% ~ 60%，反应的温度一般在100~140℃，该方法制备壳聚糖的过程中产生大量的酸碱废液，污染环境，而且过程难控制，同时残留酸碱容易残留，导致临床过敏。在临床应用中，通常是将壳聚糖与其它功能成分的物质复合在一起制备成止血粉或是其它的医用敷料。中国专利名称为“一种止血粉及其制备方法（公开号为103690956 A）“的专利，公开了使用化学法制备壳聚糖，并将壳聚糖和抗菌物质复合制备医用敷料；另一篇中国专利名称为“一种医用壳聚糖敷料及其应用（公开号为CN 1887358A）”的专利，也是公开了将壳聚糖和其它药用成分复合制备壳聚糖敷料。单独将壳聚糖制备成粉状抗菌、止血敷料的应用目前未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种低分子量壳聚糖敷料的制备方法，该方法利用微生物发酵制备甲壳素，并用超声技术疏松甲壳素的晶体结构，然后使用低浓度的碱液可渗入甲壳素分子内部脱除甲壳素上的乙酰氨基，制备低分子量壳聚糖，该方法可以大大减少酸碱的使用量，降低对环境的污染程度，且容易工业化生产。使用该低分子量壳聚糖制备的低分子量壳聚糖敷料避免了过敏现象的产生，且使用方便，具有很好的抗菌性和止血效果。
本发明的技术方案如下：一种低分子量壳聚糖敷料的制备方法，具体制备工艺步骤如下：
（1）南极磷虾在4℃解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只虾，将捣碎后的组织液放入发酵罐中，在发酵罐中接种体积分数为10%的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS培养基，发酵的初始pH为6.0~7.5，发酵的温度为37~45℃，发酵时间为48~96h，发酵结束后，过滤滤液，收集滤渣，并用蒸馏水多次冲洗滤渣，去除蛋白质、乳酸钙、虾青素等杂质，冲洗至无色后烘干滤渣。乳酸菌在发酵罐中可以产生大量的乳酸，利用发酵过程产生的乳酸和内源性蛋白酶脱除南极磷虾中的矿物质和蛋白质，无需添加盐酸、乙酸、柠檬酸、氢氧化钠等酸碱性物质脱除南极磷虾中的矿物质和蛋白质。
（2）将步骤（1）中得到的滤渣和碱液按W/V=1：5~1：15（质量体积比）混合均匀后，在50~80℃条件下超声波处理4~12 h，为了实现在较低碱液浓度下能脱除甲壳素上的乙酰基，在碱液浸泡的时候，结合超声波疏松甲壳素的晶体结构，使碱液可渗入甲壳素分子内部脱除甲壳素上的乙酰氨基；
（3）超声结束后，用酸性溶液将混合液调至中性，然后用蒸馏水反复冲洗多次，将洗净后的固体物溶解在体积浓度为1%的乙酸中，滤去不溶物，收集滤液，并用碱液调节滤液pH=7.0后，静置0.5-1 h，再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馏水清洗固体物后烘干、粉碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖固体粉末。本发明利用微生物发酵制备甲壳素，并用超声技术疏松甲壳素的晶体结构，然后使用低浓度的碱液可渗入甲壳素分子内部脱除甲壳素上的乙酰氨基，制备低分子量壳聚糖，该方法污染小，反应温度低，操作简单，且容易生产。该方法中用1%的乙酸溶解壳聚糖，然后调节pH=7.0后析出的壳聚糖，其脱乙酰度比较均匀。
（4）将步骤（3）中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装、灭菌，即得低分子量壳聚糖敷料。
更进一步的，所述的步骤（2）中的碱液的质量浓度为15% ~ 25%，所述的碱液为NaOH溶液或KOH溶液。本发明使用的碱液的浓度明显低于工业生产中浓度为40% ~60%的碱液，减少了生产工艺中的污染情况。
更进一步的，所述的步骤（3）中的酸性溶液为4mol/L的HCl溶液。
更进一步的，所述的步骤（3）中的碱液为0.1 mol/L的NaOH溶液。
更进一步的，所述的步骤（4）中的灭菌方法为辐照灭菌，灭菌剂量为16~25 KGY，灭菌时间为5~7 h，本发明选用的灭菌剂量和灭菌时间可以确保，最终得到的低分子量壳聚糖敷料是无菌产品。
更进一步的，所述的低分子量壳聚糖的分子量为5000~10000 Da，脱乙酰度为70%~85%。本发明选用南极磷虾，利用微生物发酵和超声波技术制备得到的低分子质量壳聚糖具有更好的抗菌、止血效果，且减少了过敏反应。
本发明的有益效果为：（1）本发明制备方法中用低浓度碱液代替高浓度碱液不仅可以大大减少酸碱的使用量，降低对环境的污染程度，而且得到的敷料抗菌性能有所提高，减少了过敏现象产生；（2）本发明选用南极磷虾利用微生物发酵和超声波技术制备得到的低分子质量壳聚糖及其敷料具有更好的抗菌、止血效果，且减少了过敏反应，可以在伤口擦伤、大量出血时，喷洒该敷料即可有效的发挥止血作用；（3）本发明中用1%的乙酸溶解壳聚糖，然后调节pH=7.0后析出的壳聚糖，其脱乙酰度比较均匀；（4）本发明制备的低分子量壳聚糖敷料在临床应用中具有很好的抗菌效果，喷洒在创面可以有效的杀死创面的细菌，防止创面的二次感染；（5）本发明制备的低分子量壳聚糖敷料具有很好的生物相容性，无致敏性，无毒性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
（1）南极磷虾在4℃解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只虾，称取捣碎后的组织液100g放入发酵罐中，在发酵罐中接种体积分数为10%的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS培养基，发酵的初始pH为6.0，发酵的温度为37℃，发酵时间为48 h，发酵结束后，过滤滤液，收集滤渣，并用蒸馏水多次冲洗滤渣，去除蛋白质、乳酸钙、虾青素等杂质，冲洗至无色后烘干滤渣。乳酸菌在发酵罐中可以产生大量的乳酸，利用发酵过程产生的乳酸和内源性蛋白酶脱除南极磷虾中的矿物质和蛋白质，无需添加盐酸、乙酸、柠檬酸、氢氧化钠等酸碱性物质脱除南极磷虾中的矿物质和蛋白质。
（2）将步骤（1）中得到的滤渣和碱质量浓度为15%的NaOH溶液按质量体积比为W/V=1：5混合均匀后，在50℃条件下超声波处理4 h。为了实现在较低碱液浓度下能脱除甲壳素上的乙酰基，在碱液浸泡的时候，结合超声波疏松甲壳素的晶体结构，使碱液可渗入甲壳素分子内部脱除甲壳素上的乙酰氨基。
（3）超声结束后，用酸性溶液为4 mol/L的HCl溶液将混合液调至中性，然后用蒸馏水反复冲洗多次，将洗净后的固体物溶解在体积浓度为1%的乙酸中，滤去不溶物，收集滤液，并用碱液调节滤液pH=7.0后，静置0.5 h，再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馏水清洗固体物后烘干、粉碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖固体粉末。此方法得到的低分子量壳聚糖的分子质量为10000 Da、脱乙酰度为70%。本发明利用微生物发酵制备甲壳素，并用超声技术疏松甲壳素的晶体结构，然后使用低浓度的碱液可渗入甲壳素分子内部脱除甲壳素上的乙酰氨基，制备低分子量壳聚糖，该方法污染小，反应温度低，操作简单，且容易生产。该方法中用1%的乙酸溶解壳聚糖，然后调节pH=7.0后析出的壳聚糖，其脱乙酰度比较均匀。
（4）将步骤（3）中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装后，采用辐照灭菌，用灭菌计量为16 KGY，灭菌5 h，得到低分子量壳聚糖敷料产品。
该低分子量壳聚糖敷料的抗菌试验表明：对大肠杆菌的抑菌率为91.5%，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为92.4%；动物试验（大白兔）结果显示：该低分子量壳聚糖敷料具有很好的生物相容性，喷洒在大白兔伤口处可以快速止血，止血时间为5 min，一段时间后，大白兔伤口无红肿、斑点等致敏性现象出现，伤口处无感染、溃烂等情况发生，细胞无毒性，细胞形态正常，无过敏现象。
实施例2
（1）南极磷虾在4℃解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只虾，称取捣碎后的组织液100g放入发酵罐中，在发酵罐中接种体积分数为10%的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS培养基，发酵的初始pH为7.5，发酵的温度为45℃，发酵时间为96 h，发酵结束后，过滤滤液，收集滤渣，并用蒸馏水多次冲洗滤渣，去除蛋白质、乳酸钙、虾青素等杂质，冲洗至无色后烘干滤渣。
（2）将步骤（1）中得到的滤渣和碱质量浓度为25%的NaOH溶液按质量体积比为W/V=1：15混合均匀后，在80℃条件下超声波处理12 h。
（3）超声结束后，用酸性溶液为4 mol/L的HCl溶液将混合液调至中性，然后用蒸馏水反复冲洗多次，将洗净后的固体物溶解在体积浓度为1%的乙酸中，滤去不溶物，收集滤液，并用碱液调节滤液pH=7.0后，静置1 h，再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馏水清洗固体物后烘干、粉碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖固体粉末。此方法得到的低分子量壳聚糖的分子质量为5000 Da、脱乙酰度为85%。
（4）将步骤（3）中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装后，采用辐照灭菌，用灭菌计量为25 KGY，灭菌7 h，得到低分子量壳聚糖敷料产品。
该低分子量壳聚糖敷料的抗菌试验表明：对大肠杆菌的抑菌率为97.9%，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为98.3%；动物试验（大白兔）结果显示：该低分子量壳聚糖敷料具有很好的生物相容性，喷洒在大白兔伤口处可以快速止血，止血时间为2 min，一段时间后，大白兔伤口无红肿、斑点等致敏性现象出现，伤口处无感染、溃烂等情况发生，细胞无毒性，细胞形态正常，无过敏现象。
实施例3
实验组：
（1）南极磷虾在4℃解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只虾，称取捣碎后的组织液100g放入发酵罐中，在发酵罐中接种体积分数为10%的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS培养基，发酵的初始pH为7.0，发酵的温度为42℃，发酵时间为72 h，发酵结束后，过滤滤液，收集滤渣，并用蒸馏水多次冲洗滤渣，去除蛋白质、乳酸钙、虾青素等杂质，冲洗至无色后烘干滤渣。
（2）将步骤（1）中得到的滤渣和质量浓度为20%的NaOH溶液按质量体积比为W/V=1：10混合均匀后，在65℃条件下超声波处理8 h。
（3）超声结束后，用4 mol/L的HCl溶液将混合液调至中性，然后用蒸馏水反复冲洗多次，将洗净后的固体物溶解在体积浓度为1%的乙酸中，滤去不溶物，收集滤液，并用碱液调节滤液pH=7.0后，静置45 min，再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馏水清洗固体物后烘干、粉碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖固体粉末。此方法得到的低分子量壳聚糖的分子质量为7500 Da、脱乙酰度为80%。
（4）将步骤（3）中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装后，采用辐照灭菌，用灭菌计量为20 KGY，灭菌6 h，得到低分子量壳聚糖敷料产品。
对照组1：将实施例3的实验组步骤（1）中的试验对象南极磷虾替换为南美白对虾，作为对照组1，其他处理过程均按照实施例3中实验组的步骤（1）（2）、（3）（4）进行；按照上述方法制备的对照组1的壳聚糖的分子质量为7900 Da，脱乙酰度为75%。
对照组2：将实施例3的实验组步骤（1）中采用的乳酸菌发酵法替换为采用化学法（酸碱法）制备，即：南极磷虾在4℃解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只虾，称取捣碎后的组织液100g放入烧杯中，先加入500 mL质量浓度为6%的HCl溶液在30℃浸泡2 h脱矿物质，期间每隔15 min搅拌一次，然后过滤滤渣，并用蒸馏水反复清洗滤渣多次，再加入500 mL质量浓度为8%的NaOH溶液在90℃条件下脱蛋白2 h，期间每隔15 min，搅拌一次，然后过滤滤液，收集滤渣，并用蒸馏水多次冲洗滤渣，并烘干滤渣。其余过程均按照实施例3中实验组的步骤（2）、（3）、（4）进行；按照上述方法制备的对照组2的壳聚糖的分子质量为7300 Da，脱乙酰度为81%。
对照组3：将实施例3的实验组步骤（2）中采用低浓度碱液制备步骤替换为采用高浓度碱液制备，即：由实施例3的实验组步骤（1）中得到的滤渣和碱质量浓度为45%的NaOH溶液按质量体积比为W/V=1：10混合均匀；其他过程均按照实施例3中实验组的步骤（1）、（2）、（3）、（4）进行；按照上述方法制备的对照组3的壳聚糖的分子质量为7200 Da，脱乙酰度为87%。
对实验组和对照组中的壳聚糖敷料进行抗菌试验和动物试验，其实验结果如下所示：
实施例4
实验组：
（1）南极磷虾在4℃解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只虾，称取捣碎后的组织液100g放入发酵罐中，在发酵罐中接种体积分数为10%的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS培养基，发酵的初始pH为7.0，发酵的温度为42℃，发酵时间为72 h，发酵结束后，过滤滤液，收集滤渣，并用蒸馏水多次冲洗滤渣，去除蛋白质、乳酸钙、虾青素等杂质，冲洗至无色后烘干滤渣。
（2）将步骤（1）中得到的滤渣和碱质量浓度为20%的KOH溶液按质量体积比为W/V=1：10混合均匀后，在65℃条件下超声波处理8 h。
（3）超声结束后，用酸性溶液为4 mol/L的HCl溶液将混合液调至中性，然后用蒸馏水反复冲洗多次，将洗净后的固体物溶解在体积浓度为1%的乙酸中，滤去不溶物，收集滤液，并用碱液调节滤液pH=7.0后，静止45 min，再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馏水清洗固体物后烘干、粉碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖固体粉末。此方法得到的低分子量壳聚糖的分子质量为7800 Da、脱乙酰度为78%。
（4）将步骤（3）中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装后，采用辐照灭菌，用灭菌计量为20 KGY，灭菌6 h，得到低分子量壳聚糖敷料产品。
对照组：实验组步骤（2）的碱液质量浓度为20%的NaOH溶液，其他处理步骤均按照实验组步骤（1）、（2）、（3）（4）进行；按照上述方法制备的对照组的壳聚糖的分子质量为7500Da，脱乙酰度为80%。
对实验组和对照组中的壳聚糖敷料进行抗菌试验和动物试验，其实验结果如下所示：
实验组为使用KOH溶液作为碱液制备低分子质量壳聚糖敷料，对照组为使用NaOH溶液作为碱液制备低分子量壳聚糖敷料。从以上试验数据可以看出使用KOH溶液和NaOH溶液作为碱液，均可制备出抗菌效果好、止血效果好、生物相容性好的低分子质量壳聚糖敷料，但是使用NaOH溶液作为碱液制备出的低分子量壳聚糖敷料性能更好一些。
Claims (5)
1.一种低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
(1)南极磷虾在4℃解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎，将捣碎后的组织液放入发酵罐中，在发酵罐中接种体积分数为10％的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS培养基，发酵的初始pH为6.0～7.5，发酵的温度为37～45℃，发酵时间为48～96h，发酵结束后，过滤滤液，收集滤渣，并用蒸馏水多次冲洗滤渣，去除杂质，冲洗至无色后烘干滤渣；
(2)将步骤(1)中得到滤渣和碱液按W/V＝1：5～1：15混合均匀后，在50～80℃条件下超声波处理4～12h；所述的碱液的质量浓度为15％～25％，所述的碱液为NaOH溶液或KOH溶液；
(3)超声结束后，用酸性溶液将混合液调至中性，然后用蒸馏水反复冲洗多次，将洗净后的固体物溶解在体积浓度为1％的乙酸中，滤去不溶物，收集滤液，并用碱液调节滤液pH＝7.0后，静置0.5～1h，再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馏水清洗固体物后烘干、粉碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖；
(4)将步骤(3)中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装、灭菌，即得低分子量壳聚糖敷料。
2.根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的酸性溶液为4mol/L的HCl溶液。
3.根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的碱液为0.1mol/L的NaOH溶液。
4.根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的灭菌方法为辐照灭菌，灭菌剂量为16～25KGY，灭菌时间为5～7h。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的低分子量壳聚糖的分子量为5000～10000Da，脱乙酰度为70％～85％。
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| 提取甲壳素的乳酸菌发酵工艺优化;陈亚;《湖北农业科学》;20121020;第51卷(第20期);第4607-4609页 * |
| 甲壳素/壳聚糖的提取及其应用研究新进展;张文博 等;《福建师范大学福清分校学报》;20080320;第19页第4段第4-9行、最后一段，第20页第2段，第21页第2段 * |
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