TW201102084A - Methods and compositions for immunization against virus - Google Patents

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Description

201102084 六、發明說明： 【發明相關參考文獻】 本申請案主張優先權案為美國臨時專利申請案第 61/164,385號，發明名稱為「預防流感的免疫方法及組合 物」’其係申請於2009年3月27日；美國臨時專利申請案 第61/164,387號，發明名稱為「預防人類免疫缺陷病毒的 免疫方法及組合物」’其係申請於2〇〇9年3月28日；美國 臨時專利申請案第61/164,388號，發明名稱為「預防黃熱 病毒的免疫方法及組合物」，其係申請於2009年3月28日； ^國臨時專利申請案第61/164,388號，發明名稱為「預防 頁熱病毒的免疫方法及組合物」，其係申請於2009年3月 28曰；美國臨時專利申請案第61/164,389號，發明名稱為 「預防病毒感染的疫苗製造方法」其係申請於2009年3月 28曰；美國臨時專利申請案第61/313,676號，發明名稱為 「預防流感的免疫方法及組合物」，申請於2010年3月& 入 曰，以上所有臨時專利申請之内容在此以參考方式全部併 〇 【參考序列表】 本申請案包括序列表。序列表之電腦可讀取副本 過EFS-Web以製作於2010年3月24日之ASCn槽案在 f時呈送，命名* SEQ-〇PK5〇1〇LST25，大小為4^ 字几。序列表包括的資訊在此以參考方式全部併入。 【發明所屬之技術領域】 」發明—般係關於用於產生有效對抗病毒之強力 *應性免疫原性組合物的部分糖基化病毒多肽。明媒而 4 201102084 於含有依此方法產生之糖蛋白/，的疫田。本發明侧 係關於縣糖基彳的㈣组合物，以及 染的方法。 夕肽於預防和治療流感病毒感 f先前技術】 殘接細_的胺基酸 =成連== 核姻合成該〇_連接糖。從一般前體及後 ί避接糖解已=添加Ν姻糖鏈對折疊的穩 疋避充円貨網的分解、寡聚化、生物 輸而，極為重要。添加Ν•連絲糖至蚊Asn殘基在病毒 士)色 3 :蛋白分解及強化糖蛋白溶解度卜等人， 562;1993)所必f。病毒表面糖蛋白不 Ϊ 2 it所必需’亦提供對抗中和抗體如，，聚糖屏 因此’強宿主專一性的筛選經常伴隨可能 =^^#==位置。隨後❹-連接糖化作用傾向 =^具有三種主要類型：A、B和c。A型流感病 毋可以成嚴重的疾病以及是造成人類流行病的唯一類型。 H5N1株係一種A型流感病毒。B型株為散發性和小規模爆 發的人類病例。C型株極少造成人類感染及不未造成大規 模爆發。就A型流感病毒而言.，僅H1、H2和H3亞型易於 201102084 人類之間傳染。 A型流感病毒的爆發持續造成全球廣泛的罹患率和死 亡率。據估計單是美國每年感染A型流感的族群為5至 20%，此造成約200,000人住院及36,〇〇〇人的死亡。建立綜 合性防疫政策已經成為降低流感罹患率的有效方法。然 而，病毒經常的基因漂移需每年重新配製疫苗，此將導致 疫苗内病毒株與流行之間的不匹配。因此，對抗流感病毒 的抗病毒療法為降低疾病嚴重程度及傳播的一種重要工 具。 自從2003年高病原性H5N1流感病毒已爆發於禽類和 野生鳥類(Li KS 等人(2〇〇4)jVfliwre 430 : 209〜213)。在 2010 年2月時，這些病毒已不僅感染禽類亦造成478位人類的 感染’其中 286 件造成死亡wh〇jnt/csr/disease/avian influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/index.html)。該 高病原性H5N1和2009豬源A型流感病毒已造成全球性的 爆發並且更加關注該病毒可能進一步突變而造成致命的瘟 疫(Garten RJ 等人(2009)細··^ 325 : 197〜201 ; Nemmnn G. 等人(2009)淑赃459 : 931〜939)。令人關心的是一流感病 毒將獲得有效散佈於人類之間的能力，其所造成的流行病 將成為一項威脅。因此，一流感疫苗必需為任何大流行應 變計劃的一整合部分。 〜 流感病毒為分節負鏈RNA病毒及屬於正黏液病毒科 (Orthomyxoviridae)。A型流感病毒由9個結構蛋白和密碼 加上具有調控功能的一非結構NS1蛋白所構成。該非結構 NS 1蛋白在繁殖循環期間被大量合成以及位於感染細胞的 胞漿和胞核内。該病毒基因組的分節性質可使其在一細胞 與不同病毒株混合感染期間產生基因重組的機制(交換美因 f段）。該A型流感病毒可視顯露於其表面的不同血$凝 术素(ΗΑ)和神經胺酸酶(να)病毒蛋白被進—步分類成各種 201102084 的亞^。藉由兩種病毒表面的糖蛋白，血球凝集素_或 H)和=經紐_AW)可鑑定出感病毒的亞型。 依照其Η和N蛋白的組合可鑑定各流感病毒的亞型。已有 16種已=的巧亞型和9種已知的财亞型。a型流感病 毒可感乐人、鳥、豬、馬和其他動物，但是野鳥這些病毒 的天然值主。目祕·-些A型流感亞型(即mN1、mN2 和H3N2)流行於人類之間，但是贿和佩亞型的全部組 合士被鑑定於特別指水鳥和海鳥的禽類。此外，許多證據 顯示H5和H7流感病毒亦可造成人類的疾病。 —A型流感病毒的HA含有兩個不同結構區，亦即球狀 頭部區和幹區。戎球狀頭部區含有負責病毒附著至一標的 細胞及參與HA之凝集活性的一受體結合位點。該幹區含 有病毋封套和細胞内質膜之間膜融合所必需以及與融合活 性有關的一融合肽(Wiley等人j肌^ ％ : 365〜 394(1987)) 〇 感染流行性感冒之瞭解的重要貢獻係來自對血球凝集 素(HA)的研究，一種結合至呼吸道内特異性唾液酸聚糖受 體以使病毒進入細胞的病毒外套糖蛋白(Kuiken τ等人 (2006) 312 : 394〜397 ; Maines TR 等人(2009) «SWe騰 325 ： 484-487 ； Skehel JJ, Wiley DC(2000) Ann. Rev. Biochem. 69 : 531〜569 ; van Rid D.等人(2006) 聰 312 : 399〜 399)。為穿越物種障礙及感染人類族群，禽AV必需從含〇 -2,3(禽)-連接的終端唾液酸聚糖改變其受體_結合優先性至 心2,6(人)-連接的唾液酸基序(c〇nn〇rRJ等人(194) 205 · 17〜23);以及此轉變僅經由兩次發生於1918年大流行 的突變(TumpeyTM 等人(2007)&&/^315 : 655〜659)。因 此’瞭解該影響流感結合至聚糖受體的因素為發展用於控 制任何未來具有大流行可能性交又感染流感病毒之方法的 關鍵。 201102084 針對此製造可誘發對抗H5N1流感病毒相異品系之強 效中和抗體的一候選流感疫苗需求，發展出可中和一組具 有各種H5N1支系假型HA之病毒粒子(virions)的共有 H5N1血球凝集素(HA)序列疫苗(Chen MW.等人(2008) /V%. TVfl//. Sd. USA 105 : 13538〜13543)。 HA係一種具有由一球狀頭部和一幹區組成之胞外域 的同三聚體跨膜蛋白(Kuike'n T等人(2006) (SW挪ce 312 : 394〜397)。該二區均攜帶可影響HA功能性(Chen ZY等人 (20Q8)扮⑽阳 26 : 361〜371 ; Ohuchi R 等人(1997) J·乃>6>/. 71 : 3719〜3725)的 N-連接寡糖(KeilW 等人(1985)£：MBOJ. 4 : 2711〜2720)。A型流感病毒的不同亞型之中，在頭部區 的糖基化位點有廣泛的變異，然而該幹部寡糖則更為保留 及需要融合活性(Ohuchi R等人(1997) 71 : 3719〜 3725)。接近抗原肽表位的聚糖干擾抗體的辦識(skehel JJ等 人(1984) Prac.施汉Scz·· USA 81 : 1779〜1783)，以及接 近HA之蛋白水解活化位點的聚糖調節其斷裂和影響流感 病毒的感染性(Deshpande KL等人(1987) /Voc.偷汉 5W. USA 84 : 36〜40)。HA糖基化位點的缺失突變可影響病 毒受體的結合（Gunther I等人（1993) 及队27 : 147〜160)。 改變於或接近糖基化位點的肽序列可能改變HA的立 體結構’而因此具有受體結合特異性和親和力。事實上， 來自不同H5N1亞型的HA具有不同聚糖結合模式(Stevens J等人(2008)』Μ?/.及.〇/· 381 : 1382〜1394)。已於全病毒系 統中研究Η1和Η3上糖基化位點的突變(chandrasekaran A 等人(2008)施，.及她以如/. 26 : 107〜113 ; Deom CM等人 (me)Proc. Natl. Acad. Sci, \JSA^3 .. 3ΊΊ\〜3ΊΊ5)。然、而，仍 未知糖基化的改變如何影響受體的結合特異性和親和力， 其特別指最具病原性的H5N1 HA。 8 201102084 由於HA的低南度糖基化或無糖基化區持續地發生突 ’交以逃避佰主的免疫系統，因此每年必需改變所製造的流 感疫苗。 *對抗異質性病原體之疫苗設計的目標為鑑定和設計有 效且廣泛保紐抗原。在流行輯胃的例子巾，已花費極 大努力於實證檢驗保守的雜相和區域但無成果。這些 iff可取健由為缺乏針對實喊正生產雜抗原性i ifΐ之反應以中和在建構—實際感染中之病原體上抗原 的知識。 【發明内容】 或λ在目前和未來疫苗製造中需要—種能維持 苗生產過程的交叉中和單株抗體。假設結合至= ==it，!ϊ如规化μ多肽至該疫苗加工衍 些通用交又中和潛力。為了最大化針對這 ^疫驗—姉_料些通用表位 病毒’揭示—種利用這些原則的疫苗。藉由從 以暴露出糖基化位點(其為高度保留 存ϊίϊ性突變)以及在同時保留適當糖以保 構:藉:部=基化該糖蛋白使-基化病毒_…纟一f立喊生該部分糖 蛋白或多肤可產L;分; 醫藥5::ΐ糖，Μ、ΝΑ或M2糖蛋白及 又載抓沒田。在—些實例中，該部分糖基化 201102084 =糖蛋白係選自由部分糖基化流感病毒HI、H3和H5所 在-些實例中，H5HA於一或多個位置％、 / -此⑸i、3G2、桃和5(K)的天冬舰殘基被糖基化。 二實例中，該天冬胺酸殘基係於位置177。 揭示-種包括將含有至少一去糖基化似糖蛋白及一 f樂上可接受鋪之疫苗投與至流感敏感性生物體的方 ^ °在一些實例中，該去糖基化HA糖蛋白係選自由扭、 H3和H5構成的群組。 在:些實^中該去糖基化於糖蛋白上的—或多個糖基 =位點產生-單糖基化作用（留下一個糖分子)。在一些實 Iίί糖基化於糖蛋白上的至少一個糖基化位點產生雙糖 留下兩個糖分子)。在—些實例巾該去糖基化 一 的至少一或多個糖基化位點產生三糖基化作用（留下 三個糖分子）。在-些實财該去絲化浦蛋自上的至少 =個糖基化位點產生至少一個單糖基化、雙糖基化 基化作用。 一 本發明侧於-種用於提高對病毒、細菌、真菌或其 ，來源病賴之免疫反應的免疫紐組合物，該組合物/包 二二來，病毒、細菌、真菌或其他_病原體的一抗原糖 蛋白，其中該糖蛋白被部分糖基化。 在些態樣中，該病原體係病毒以及該部分糖基化抗 原係病毒、病毒樣顆粒、病毒肽、蛋白 該病毒的=、或部分含有病毒蛋白相的—融合蛋\原自 该病毒係選自流感病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、衣原 體腺病毋科、巨大腺病毒、禽腺病毒、 皰J病毒，、單純皰療病毒卜單純皰療病毒2、單純跑療 =毋5單純皰療病毋6、光滑病毒科咖咖别狀）、輕小病 毋(lev=irus)、腸桿菌嗟菌體應2、蘿莉病毒⑽）、 痘病毒科、痘病毒脊索亞科(ch〇rd〇p〇xvirinae)、副痘病毒 201102084 ^病毒屬、山核病毒屬、兔痘病毒屬、諸痘病毒 毒屬、疫病毒昆蟲亞科、乳多瘤病毒科、多 、礼頭瘤病毒、副黏液病毒科、副黏液病毒、副流 ^ I、麻療病毒屬、麻療病毒、德國麻療病毒屬、肥腺 金姑Πΐ炎病毒亞科、肺炎病毒屬、間質肺炎病毒屬、 f、人間質肺炎病毒、小⑽八病毒科、腸病毒、 Ϊίΐ思肝炎病毒、人A型肝炎病毒、心肌炎病毒、口蹄 ί 毒科、正里奥病毒、環狀病毒、輪狀病 角體病毋屬、斐濟病毒屬、植物里奥病毒屬、水稻 c U轉錄病毒科、哺賴Β型反轉錄病毒、哺乳類 群、鳥類c型反轉錄病毒、d型反轉錄病毒 反轉錄病毒、慢病毒(lentivims)、人類免疫 二^1、人類免疫缺陷病毒2、HTLV_W_n病毒、sars 訄狀病毋、單純皰疹病毒、伊波病毒(Epstein Barr virus)、 巨細胞病毒、肝炎病毒(HCV、HAV、HBV、HDV、HEV)、 =地弓翻毒、梅毒職體病毒、人射T淋巴球病毒、 士 毒、西尼羅〉3]·病毒、登革熱病毒、水癌帶狀痕療病 :、麻疹病毒、腮腺炎病毒、德國麻疹病毒、泡沫病毒屬、 頁熱病毒科、C型肝炎病毒、嗜肝DNA病毒科、B型肝炎 病毒、彼膜病毒科、甲病毒新德比斯病毒(alphavirussindbis =r^s)、風疹病毒屬、風疹病毒、棒狀病毒科、水泡病毒屬、 莉莎病毒屬(lyssavims)、流行熱病毒屬、胞内水稻普矮炮彈 病毒(cytoyhabdovims)、核内水稻黃矮炮彈病毒、沙狀病毒 f (arenaviridae)、沙狀病毒屬、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病 毋、ippy病毋、拉薩熱病毒(iassa vims)、冠狀病毒和曲狀 病毒(torovirus)。 一該^毒胜肽、蛋白、多肽或其片段係選自流感病毒神 經胺酸I# ’流感病毒血球凝集素；人呼吸道融合病毒(RSV)_ 病毒蛋白；RSVF糖蛋白；RSV 〇糖蛋白；單純皰療病毒 11 201102084 (HSV)病毒蛋白；單純皰療病毒糖蛋白⑪、扣，和 ；核心蛋白；登革熱病毒的基 ,1病毒血球凝集素;單純皰疹病毒 ^么糖蛋白gB，小兒麻痺病毒丨νρι ; 蛋白；B浙炎表面抗原；白喉毒素；鏈球目24ί ^ 纖毛淋病雙球g;假性狂犬病_ ^ 病毒Π _ ;假性狂犬病病毒m (二=f 糖蛋白Η;假性狂犬病病毒糖蛋白^ )染性胃 ί白i9=胃腸炎病毒基質蛋白 广主蛋白；_疾蛇形螺旋體保護抗原；牛 ί毋新城疫病毒血球凝集素-神經胺酸 素；口蹄疫病毒;豬瘟病毒;豬流感 病毋，非洲豬瘟病毒；豬肺炎黴漿菌； 病毒二牛傳·鼻氣管炎病毒糖蛋白Ε、糖蛋 喉氣官炎病毒；傳紐喉氣管炎病毒糖蛋白以糖蛋白】； 拉克，病毒(La Cr〇sse ν_糖蛋白；初生仔牛下痢症病 毒，委内瑞拉馬腦脊敵病毒；靜脈病飾__^); 鼠白血病病毒；鼠乳腺軸病毒；Β型肝炎病毒核 和炎f毒表面抗原或其片段或衍生物；馬流感病毒 或馬皰療病一抗原，包括馬流感病# A雜恤㈣神經 胺酸酶、馬流感病毒A型/Miami 63神經胺酸酶、馬流感病 毒A型/ Kentucky 81神經胺酸酶、馬皰療病毒}型糖蛋白 B和馬皰？病毒1型糖蛋自D;牛呼吸道融合病毒或牛副流 感病毒的抗原；牛呼吸道融合病毒附著蛋白(BRSV⑺·，牛 呼吸道融合病絲合蛋自(BRSV F);牛呼贿融合病毒核 衣殼蛋白(BRSV N);牛副流感病毒3型融合蛋自；牛副流 感病毒3型凝集素神經魏酶；牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白 48和糖蛋白53，登革熱病毒糖蛋白E以及人c型肝炎 的糖蛋白E1或E2。 12 201102084 士在些態樣中，該糖基化病毒抗原係單_、雙·或三糖基 化流感病毒血球凝集素。在一些具體實施例中，該去糖基 ^病毒抗原係選自由流感病毒H1、H3和H5構成之群組的 單糖基化血球凝集素。在一些具體實施例中，該單糖基化 流感病毒凝集素含胺基酸序列具有天冬胺酸鹽_Xaa_絲胺酸 和天冬胺酸鹽-Xaa_蘇胺酸的乂糖化位點，該&係除脯胺 酸之外的任何胺基酸。在一些態樣中，該單糖基化凝集素 於糖化位點含有對HA受體結合呈現低特異性及較強親和 力的一單GlcNAc糖。 + +在一些具體實施例中，該糖基化病毒抗原係以N-乙醯 ，萄糖胺(GlcNAc)及/或甘露糖雙-或三糖基化的流感病毒 ，集素。在一些態樣中，該糖基化病毒抗原係以N_乙醯葡 萄糖胺(GlcNAc)單糖基化的流感病毒凝集素。 在一些態樣中，該單糖基化流感病毒凝集素含有包括 共有H5 HA序列(序列辦識編號：4)的多肽。在一些具體實 施例中’該單糖基化共有H5 HA序列(序列辦識編號：4) 係於天冬胺酸殘基的位置39、no、181、3〇2和495被糖 基化。在其他態樣中，該單糖基化流感病毒血球凝集素含 有選自由一 NIBRG-121 (2009年大流行A(H1N1)疫苗株)序 列(序列辦識編號：6)、一共有Hl-A(序列辦識編號：8)和一 共有H1-C(序列辦識編號：10)序列構成之群組的H1多肽序 列。在一些具體實施例中，修飾該HA序列使其可表現於 一適當的真核細胞内。 在一具體實施例中，該單糖基化流感病毒血球凝集素 含有一季節性H1(布里斯本)多肽。 本發明亦係關於含有包括去糖基化至單_、雙-或三糖基 化狀態之病毒糖蛋白的免疫原性多肽，及任選佐劑的疫 苗’其中該疫苗能誘發對抗呼吸道病毒的免疫反應。在一 些具體貫施例中’該呼吸道病毒係一流感病毒及該病毒糖 13 201102084 蛋白係血球凝集素(HA)。 中’該流感病毒係選自由禽流感病毒及季 性：感病毋構成之群組。在—些具體實 ^主刪。在-些具體實施例中，該流感病毒ί : 型流感病毒。 ( 在一態樣中，該病毒係呼吸道融合病毒讲sv)，以及該 乂 1基化病毒抗原係單_、雙·或三糖基化rsvf(融合〉、 (附著)或SH(低疏水性)糖蛋白，或其免疫原性片段。在一 ί具f ，該單糖基化辦奸白序列(序_識編 於表6中所示-或多個可能Ν_糖基化位點的天久胺 酸殘基被部分糖基化。 在主，該病*料翻毒，以及該部分糖基化 地毋；^、心’早-、雙-或二糖基化登革熱病毒封套糖蛋白Μ、 =白Ε ’或其免疫原性片段。在一些具體實施例中，該單 ;一土化登革熱病毒糖蛋白Ε(序列辨識編號：13)於表7中所 =或多個Ν-糖基化位點Ν67和Ν153的天冬胺酸殘 部分糖基化。 在一態樣中，該病毒係C型肝炎病毒，以及該部分糖 基化病毒抗原係單-、雙_或三糖基化C型肝炎封套糖蛋白 Ε1、糖蛋白Ε2,或其免疫原性片段。在一些具體實施例中， ，單糖基化c型肝炎封套糖蛋白E1(序列辨識編號：14)於 表8中所示一或多個N糖基化位點n196、N2〇9、沁34、 N305和N325的天冬胺酸殘基被部分糖基化。 ^在一態樣中，該病毒係人類免疫缺陷病毒(HIV)，以及 。亥。卩分糖基化病毒抗原係單_、雙_或三糖基化·HIV封套糖 蛋白gP120、跨膜糖蛋白gp41，或其免疫原性片段。在一 些具體貫施例中，該單糖基化HIV封套糖蛋白_〇 (序列 辦識編號：15)係於如表9中所示天冬胺酸殘基的一或多個 可能Ν-糖基化位點被部分糖基化。 14 201102084 本發明亦係關於一種疫苗組合物包含：流感HA多肽， 其中該流感HA多肽被去糖基化至單糖基化狀態；以及醫 藥上可接受載劑，其中當將該單糖基化HA多肽被導入生 物體時’該多肽可誘發該生物體產生結合至流感病毒的抗 體。 在一些態樣中，將該單糖基化HA多肽導入生物體可 誘發該生物體產生中和季節性和禽流感病毒的抗體。 在一具體實施例中，該單糖基化流感病毒凝集素含有 季節性H1(布里斯本)HA多肽以及當將該單糖基化HA多肽 導入一生物體時，該H1(布里斯本)HA多肽可誘發該生物體 產生中和NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)流感 病毒的抗體。 在另一具體實施例中，該單糖基化流感病毒血球凝集 素含有NIBRG-121(2009年大流行A(HINI)疫苗株)多肽以 及當將該單糖基化ΠΑ多肽導入生物體時，該 NIBRG-121(2009年大流行Α(Η1Ν1)疫苗株)多肽可誘發該 生物體產生中和季卽性H1 (布里斯本)HA流感病毒的抗體。 在一些態樣中，該疫苗進一步含有佐劑，其可被選自 氫氧化鋁、>填酸鋁、氫氧化鋁和填酸鋁、佛氏(Freund，s)不 元全佐劑(IFA)、角寬烯(squalene)、角業烧(squalane)、明蓉 和]V1F59。 本發明係關於免疫哺乳動物以對抗病毒性呼吸道感染 巧方法，該方法包含：將含有包括去糖基化病毒糖蛋白至 單-、雙-或二糖基化狀態之免疫原性多肽的疫苗投與至感染 呼吸道病毒的感受性哺乳動物，其中該疫苗能誘發對抗該 呼吸道病毒的免疫反應。在一些具體實施例中，該呼吸道 病毒係流感病毒以及該病毒糖蛋白係血球凝集素(HA)。該 疫苗可經由腸道外投藥、吸入法、鼻内被投與，以及有^ 可用於預防。 15 201102084 在一些態樣中，該疫苗可誘發對抗病毒或不同於所選 用部分糖基化病毒糖蛋白病毒之不同株相同病毒的免疫反 應。在一些具體實施例中，該去糖基化病毒糖蛋白係單糖 基化流感血球凝集素(ha)。 本發明k供可有效對抗A型流感病毒的疫苗。在一具 體實施例中，該疫苗含有功能上模擬此處所述分子之中和 表位的胜肽或多肽。在另一具體實施例中，該疫苗可有效 對抗病毒抗原其含有功能上模擬此處所述分子之中和表位 之的胜肽或多肽。在一具體實施例中，該病毒抗原係來自 流感病毒或mv-i、Hiv-2病毒或黃熱病毒，例如登革埶病 毒或C型肝炎病毒。 ’、 、在另一具體實施例中，該疫苗係一種有效對抗A型流 感病毒的疫苗，其含有功能上模擬此處所述分子之中和表 位之的胜肽或多肽。在一具體實施例中，該分子係抗體。 在=一具體實施例中，該抗體可結合抗原。在其他具 體實施例中Ί亥HA抗原係H5亞型。在其他具體實施例中、， ，HA，原係H1亞型。在一其他具體實施例中，該抗原被 王現於§亥A型流感病毒的表面。在其他具體實施例中，該 胜肽或多肽含有產生中和抗體的抗原決定部位。 從下列較佳具體實施例的描述配合下列的附圖將可更 瞭解諸如此類的祕，其軸錢化和改㈣影響但仍不 偏離該揭不之新穎概念的精神和範圍。 【實施方式】 了列，發明具體實施例的詳細說明係參相相同之元 件編號表賴似元件的關，以及其係藉由本發明可實施 的特定具體#闕進行綱。這些具體實侧被詳細描述 以使熟習本領域之技術者能實施本發明，以及必需瞭解可 利用其他具體實施例並且進行邏輯上、構造上、功能上和 其他的改變而不本發明的範s。@此，下列的詳細說 16 201102084 明不被視為具有限制性的意義。 流感病毒的血球凝集素(HA)係一種具有由球狀頭部和 幹區組成之胞外域的同三聚體跨膜蛋白。該二區均攜帶依 照一般N糖基化徑路進行生合成的N-連接寡糖。特定位置 的糖基化可影響HA的功能性。包圍該抗原肽表位的糖類 干擾與抗體的接觸，以及此效應將導致流感病毒的抗原性 漂移。先前對HA的研究亦顯示被糖基化的肽序列具有高 度保留性，以及藉由失去接近該受體結合位點的複合聚糖 鏈可影響該HA受體的結合特異性。此外，藉由接近斷裂 位點之聚糖調節該HA的蛋白水解活性可影響流感病毒的 感染性。在A型流感病毒的不同亞型中已顯示其頭部區在 糖基化位點的構造和數目上有許多的變異，反之該幹部寡 糖較為保留並且需要融合活性。全部這些發現已顯示Μ 糖基化對其活性的重要性。 病毒傳播開始於血球凝集素(ΗΑ)糖蛋白於流感病毒外 f上以及於宿主細胞表面上含聚糖之唾液酸之間的關鍵性 =作用。為說明糖基化於此重要相互作用的角色， =各種HA糖型’以及藉由利用合成SA晶片研究其結合 力和特異性。截斷HA上的N_聚糖結構可增加SA結 '親和力同時降低對不同SA配體的特異性。定量地劃分 ，體結構内各單糖和硫酸根基圑對必結合能的貢獻。 U現該硫»基團對全部糖基化私而言可增加接近1〇〇 ^刑·14·^1/ΐη〇1)的結合能，以及雙枝聚糖對單糖基化撤 :同。於各糖基化位點僅攜帶單-汴連接GlcNAc 亞_=-目Ϊ白的抗體比完全糖基化心所誘發對抗流感 喜錄佳的結合親和力及中和活性。因此，於病 感及1他人ί ΐ?除結構上私需雜在麟設計對抗流 “ΐΐί、，之疫苗上係—種極有效和通用的方法。 示有说明，否則此處使用之技術和科學名詞與熟 201102084 習本領域之技術者通常所瞭解者的意義相同。Singlet〇n等 人，微兰物學和分子兰物學柯典第二版，L Wiley & s〇ns(紐 約，紐約1994)中提供本領域技術者許多用於本申請案之名 詞的通則。 、热習本領域之技術者將瞭解可被用於本發明實務之類 似或等同於此處所述的許多方法和材料。事實h，、本發明 在任何航下雜佩於所述的方法和材、就 目的而言，下列的名詞被定義如下。 ^ 名詞”A型流感亞型”或，’A型流感病毒亞型"可互用，以 ίΪίΪί集素⑻病毒表面蛋白之特徵的A型流感病毒變 異株而被標示以Η數字舉例如m、H3和H5。此外，該亞 步數字表示之神經職酶⑼病毒表面“ 一__如mN卜Η5Ν1和Η5Ν2。此名詞特 全部病毒株(包括滅絕株)，其通料因於突變及呈 =文病毒株以離:=== 此型 毋為基礎的抗原。該抗原可 在- 白，其可分別被稱為η/；=ΓΗ5Η^型的一特定亞型蛋 意指之名詞”去糖基化"或”部分糖基化，1蛋白 i上^ f f基化蛋白實例及該蛋白實 :，糖基化位點㈣糖基化:、=== 一部分糖基化’’蛋白包括一，，去糖基化,,蛋白，其中一或 18 201102084 ====== 糖基化位點的聚糖結構而產生-..部分=: 由在-蛋白的未糖基化健引人 ==ί?:使該位置加入的糖基 糖基化位點引人糖基化胺基酸 入的聚糖結構較小於完全糖基化 中在雜置的聚聽構合成—病毒 ^】 方法產生-”部分絲化”蛋自。 ㈣林片㈣ 於此處可互用的名詞”核酸”和”多核 =:二或混合聚合物。多核包括基因= 片質f序列’以及可表現或可用於表現多肽 ^1=?酸，，係實質上分離自其他基因組譲八序列以 一天然序列核糖體和聚合酶之蛋白質或複 合物的-種核酸。該名詞包含已移除自其天 組或選仙似分離物和;^=: 成的類似物。一實質純核酸包括 型。當然’此係指原始分離的核酸以 及〇括後來猎由人工加至該分離核酸的基因或 名詞”多肽"具有習知的竟義， ^肽的產^麵祕—特定的長度。賊蛋^ 定義範㈣，以及除非另有明述否則此處 飾，例° Μ詞㈣指或排除多㈣表現後修 飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化等，以及 然和非天然的其他修飾。一多肽可為一全蛋白質/ 201102084 序^。本發败巾重制縣乡肽為対cdRs及能結合 一抗原或HIV-感染病毒的胺基酸子序列。 p r"if乡肽”係已魏定和分離及/錄獲自其天然環 ΐί 祕具體實施财，該躲錄可被純化 至(1)虽藉由Lowry法測定時大於95%重量比，以及最佳 多肽；(2) #由旋轉杯妨儀測定時至 if侍至> Ν-端或内部胺基酸序列15個殘基的程度；或 H精由SDS_PAGE時在還原或非還原條件下利用考馬斯 :(C〇omassie blue)或較佳為銀染劑至同質化。由於不呈現 的至少—成分’因此分離多肽包括原位重組 ^離多肽媒。然而’通f可藉由至少—種純化步驟製備 白天^序列"多核魏係具有相同核苷酸序列作為源 瓣。一”天然序列”多肽係具有相同胺基酸 Η^原自天然(例如來自任何品種)之多肽(例如抗體） ώ二fJ，然序形核賊和多肽可被分離自天然或可藉 由重組或合成法狨:製備。 如此處所述之名詞，一多核皆酸，，變體，，係在一或多個取 ^添加及/或插入上不同於特別揭示於此處之多核 核賊。此賴體可為天然·合成產生，例 ==修飾本發明的一或多個多_序列以及如此 驻giΐ ^彻本傾巾任何f知崎乡請評估該多核 皆酸的一或多種生物活性。 如if所述之名詞’―多肽”變體”係在一或多個取代、 夕=及/或插人上不同於_揭示於此處之多肽的-&杯日體可為天贼被合成產生，例如藉由藉由修 中杯二1 f上迷多肤序列以及如此處所述及/或利縣領域 ，白知的許多技術評估該多肽的一或多種生物活性。 可在本發明之多核微和多肽的構造内進行修飾並且 201102084 I獲得編碼一變體或具有所欲特性之衍生多肽的一功能 子。當欲改變該多肽的胺基酸序列以產生一等效物， ㈣的—改良、變異或部分多肽時，熟習本領域 技術者通常需改變該編碼DNA序列的一或多個密碼子。 例如二在蛋白結構内的某些胺基酸可以其他胺基酸被 =不嚴重損及結合其他多肽(如抗原)或細胞的能力。由 ^蛋白的結合能力及性質定義蛋白質的生物功能活性， 因此可在蛋白序列及其基本DNA編碼序列内進 基酸序列的取代作用而仍可獲得具有相同性質的蛋^。 期可在揭她合物之雌賴或編碼練肽的對應 活性列内進行各種的變化而不嚴重損及其生物學效用或 叙ίΐ行此類改變的過程中’必需考慮胺基酸的親水指 Ϊ舌胺基酸指數於授卜蛋白f之互動生物學功能上 的重要性已為技術中所習知(Kyte和D〇〇随e，⑽ 性有助於定齡蛋白與其他分子 i 成蛋的二級結構，該其他分子為例如酵 ί盆ϋ受體、DNA、抗體、抗原等。各胺基酸具有根 據八馼水性和電荷性質的親水指數(κ ⑽2)。^些值為：異白胺酸(+45)、顯胺酸(+42)、=酸 (+3.8)、本丙胺酸(+2.8)、半胱胺酸/耽胺酸 酸 (十⑼、丙胺酸(+U)、甘胺酸(·〇.4)、蘇胺酸(·〇)甲^= (-0.8)、色，酸(-0.9)、酪胺酸(_13)、脯胺酸(·16)、組胺酸 (-3.2)、$胺酸鹽(_3·5)、麩醯胺酸(_3 5)、天門冬酸鹽㈠ 天門冬胺酸(-3.5)、離胺酸(_3 9)，及精胺酸(_4.5)。技 知某些胺基酸可被具有類似親水指數或分數的 所取代亚且仍能產生具有類似生物學活性的蛋白質，= :獲得-生物學功能等效蛋白。在進行此類的改J = 基酸取代作用峨水指數較佳為在±2，更佳為在±ι，最g 21 201102084 為在±0.5的範圍内。 、技術中亦瞭解可根據親水性有效地進行類似胺基酸的 取代作用。美國專利案4,554，101宣稱受鄰近胺基酸之親水 性所支配的蛋白質最大局部平均親水性與該蛋白的生物學 性質有關。如美國專利案4,554,101所詳述，具有下列親水 值的胺基酸殘基：精胺酸(+3.〇)、離胺酸(+3 〇)、天門冬酸 鹽(+3.0±1)、麩胺酸鹽(+3.〇±1)、絲胺酸(+〇 3)、天門冬胺酸 (+〇·2)、麩酿胺酸(+0.2)、甘胺酸(〇)、蘇胺酸(-0.4)、脯胺酸 (-0·5±1)、丙胺酸(_〇.5)、組胺酸(_〇.5)、半胱胺酸㈠.〇)、曱 硫胺酸(-1.3)、纈胺酸(-1.5)、白胺酸(-a)、異白胺酸㈠8)、 酪胺酸(-2.3)、苯丙胺酸(_2.5)、色胺酸(_3.4)。已暸解一胺基 酸可被另一具有類似親水值的胺基酸所取代並且仍可獲得 生物性等效物，以及特別指一免疫等效蛋白。在此類變化 中，胺基酸的取代作用其親水值較佳為在±2，較佳為在±1， 以及最佳為在±0.5的範圍内。 如上述概述，胺基酸取代作用因此通常係根據該胺基 酸侧，取代基的相對類似性，如其疏水性、親水性、電荷、 $小等。採用上述各種特性之範例取代作用已為本領域技 術者所習知以及包括：精胺酸和離胺酸；麩胺酸鹽和天門 冬酸鹽；絲胺酸和蘇胺酸；麩醯胺酸和天門冬胺酸；以及 纈胺酸、白胺酸和異白胺酸。 多肽含有在蛋白Ν-端的一訊息(或前導)序列，苴丘棘 譯或轉譯後引導蛋自質的傳輸。該多肽亦可被餘至^接 子或易於該多肽(例如聚-His)之合成、純化或鑑定 多肽至固態載體之結合的其他序列。 將糖咖通f為N•連賊連接。队連接指 將搪基團附者至一天門冬胺酸殘基的側鏈。一”序 (—of係蛋白質内作為至一多糖(醣)之附著位點被稱為 - N-連接聚糖的三個連續絲酸序列。此係經由天門冬& 22 201102084 酸(Asn)之侧鏈的氮原子連接至該蛋白的一多糖。一序列子 可為Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr，該係除了脯胺酸之外 的任何胺基酸。因此，多肽内存在這些三肽序列可產生一 潛在的糖基化位點。〇_連接糖基化作用係指乙醯半乳糖 胺、半乳糖或木糖的其中一種糖被附著至一羥基胺基酸， 最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但是亦可使用5_羥基脯胺酸或 5-羥基離胺酸。雖然Ν-連接寡糖附著至一糖蛋白的過程中 絕對需要該 Asn-X-Ser/Thr 序列子(Marshall RD，历 办哪仍以40 : 17〜26 ; 1974)，但是其存在不必然導致 糖基化並且糖蛋白内的一些序列子可能保留未糖基化 (Curling EM 專人，万zbM飢 j^“/272 : 333〜337 ; 1990)。
聚糖晶片係用於研究糖_蛋白相互作用及提供用於流感 病毒亞型之新平台的有力工具(Blixt 〇等人(2〇〇4)尸 Natl Acad. Sci. USA 101 : 17033-17038 ； Chandrasekaran A 等人(2008)26 : 107〜113 ; Liang PH 等人 (2008)·/ 381 : 1382〜1394)。其模擬細胞表面上之 聚糖以呈現高親和力和特異性的多價相互作用。利用此技 術，具有受體特異性之各種天然和突變Has的特性可提供 用於辨別流感病毒亞型的新平台。 雖然為一種有力方法，但是藉由聚糖晶片之分析瞭解 HA-聚糖的相互作用在兩個議題上變得更為複雜：第一， HA結合特異性可受空間配置以及該陣列化聚糖之組合物 和所使用的結合偵測法的影響a等人(2〇〇8) Pmc. 此’· USA 105 : 2800〜2805)。第二，於或接 近糖基化位點的胜肽序列内變化可改變HA的三維結構， 而因此改變受體結合的特異性和親和力。事實上，來自不 同H5N1亞型的HA具有不同聚糖結合模式(Stevens j等人 (2008) J· 及W. 381 : 1382〜1394)。已於全病毒系統内研 23 201102084
^量聚糖⑼的分析法以克服傳ί 實=二 制。 丨大戈(Uiandrasekaran Α 等人 1〇7〜113 ; Deom CM 等人 A83 : 3771〜3775)。然而，仍 uA/ri則的試驗已經利用取得自昆蟲細胞之表現系統的 HA(Chandrasekaran A 等人(2008)伽.施.26 : 1〇7〜 113)。然而，昆蟲細胞與哺乳動物細胞比較具有不同的細胞 内糖基化_，其_差異在於複合型N驗終止於半乳 糖以及昆蟲細胞内不產生唾液酸。 從人類細胞表現HA糖基化變體 針對人類細胞内的糖基化變化如何影響受體結合特異 性和親和力’藉由利用流感H5N1 HA共有序列製備含有 HA -結合配體之大量構造類似物的聚糖晶片以及數種已定 義糖型的HA(Chen MW等人(2008)户亂/」⑽/.如·. USA 105 : 13538〜13543)於定量性結合分析。 藉由利用人類密碼子最適化用於表現的CHA5密碼 子。如表1中所示’為避免蛋白質被酵素切割成和 HA2將該原始病毒蛋白酶切割位點(序列 辨識編號：1)突變成PQRERG(序列辨識編號：2)。在HA 構體的 C 端以附加殘基 Lm?GSPGSGYTPEAPRDGOAYVR KnrTEWVT;『 ,‘STTT ,ΠΗ ΗΗΗΗΗ(序列辨識編號：3)取代該跨膜區(殘基：533〜555)， 斜體字為該凝血酶的切割點，劃底線者為噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列，以及粗體字者為His-標簽 (Stevens J·等人(2006) Sczhce 312 : 404〜410)。 24 201102084
表1共有H5血球凝集素序列_ 粗體字表示共有H5HA之胺基酸序列··訊號序列；以及劃底線者·· 三聚合序列和His-標簽。 MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGSHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE 50 KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN 100 PANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASSGVSSA 150 CPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA 200 AEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK 250 PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA 300 INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERGLFGAIAGF 350 IEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKM 400 NTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLD 450 FHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDY 500 PQYSEEARLKREEISGVDIRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW 550 VLLSTFLGHHHHHH (序列辨識編號：4) 共有H5HA的核苷酸序列 1 ATGGAGAAGA TCGTGCTGCT GTTCGCCATC GTGAGCCTGG TGAAGAGCGA 51 CCAGATCTGC ATCGGATCCC ACGCCAACAA CAGCACCGAG CAGGTGGACA 101 CCATCATGGA GAAGAACGTG ACCGTGACCC ACGCCCAGGA CATCCTGGAG 151 AAGACCCACA ACGGCAAGCT GTGCGACCTG GACGGCGTGA AGCCTCTGAT 201 CCTGAGAGAC TGCAGCGTGG CCGGCTGGCT GCTGGGCAAC CCTATGTGCG 251 ACGAGTTCAT CAACGTGCCT GAGTGGAGCT ACATCGTGGA GAAGGCCAAC 301 CCTGCCAACG ACCTGTGCTA CCCTGGCGAC TTCAACGACT ACGAGGAGCT 351 GAAGCACCTG CTGAGCAGAA TCAACCACTT CGAGAAGATC CAGATCATCC 401 CTAAGAGCAG CTGGAGCAGC CACGAGGCCA GCAGCGGCGT GAGCAGCGCC 25 201102084 451 TGCCCTTACC AGGGCAAGAG CAGCTTCTTC AGAAACGTGG TGTGGCTGAT 501 CAAGAAGAAC AGCACCTACC CTACCATCAA GAGAAGCTAC AACAACACCA 551 ACCAGGAGGA CCTGCTGGTG CTGTGGGGCA TCCACCACCC TAACGACGCC 601 GCCGAGCAGA CCAAGCTGTA CCAGAACCCT ACCACCTACA TCAGCGTGGG 651 CACCAGCACC CTGAACCAGA GACTGGTGCC TAAGATCGCC ACCAGAAGCA 7 01 AGGTGAACGG CCAGAGCGGC AGAATGGAGT TCTTCTGGAC CATCCTGAAG 7 51 CCTAACGACG CCATCAACTT CGAGAGCAAC GGCAACTTCA TCGCCCCTGA 801 GTACGCCTAC AAGATCGTGA AGAAGGGCGA CAGCACCATC ATGAAGAGCG 851 AGCTGGAGTA CGGCAACTGC AACACCAAGT GCCAGACCCC TATGGGCGCC 901 ATCAACAGCA GCATGCCTTT CCACAACATC CACCCTCTGA CCATCGGCGA 951 GTGCCCTAAG TACGTGAAGA GCAACAGACT GGTGCTGGCC ACCGGCCTGA 1001 GAAACAGCCC TCAGAGAGAG AGAGGCCTGT TCGGCGCCAT CGCCGGCTTC 1051 ATCGAGGGCG GCTGGCAGGG CATGGTGGAC GGCTGGTACG GCTACCACCA 1101 CAGCAACGAG CAGGGCAGCG GCTACGCCGC CGACAAGGAG AGCACCCAGA 1151 AGGCCATCGA CGGCGTGACC AACAAGGTGA ACAGCATCAT CGACAAGATG 1201 AACACCCAGT TCGAGGCCGT GGGCAGAGAG TTCAACAACC TGGAGAGAAG 1251 AATCGAGAAC CTGAACAAGA AGATGGAGGA CGGCTTCCTG GACGTGTGGA 1301 CCTACAACGC CGAGCTGCTG GTGCTGATGG AGAACGAGAG AACCCTGGAC 1351 TTCCACGACA GCAACGTGAA GAACCTGTAC GACAAGGTGA GACTGCAGCT 1401 GAGAGACAAC GCCAAGGAGC TGGGCAACGG CTGCTTCGAG TTCTACCACA 1451 AGTGCGACAA CGAGTGCATG GAGAGCGTGA GAAACGGCAC CTACGACTAC 1501 CCTCAGTACA GCGAGGAGGC CAGACTGAAG AGAGAGGAGA TCAGCGGCGT 1551 GGATATCAGA TCTCTGGTGC CAAGAGGATC TCCAGGATCT GGATACATCC 1601 CAGAGGCTCC AAGAGATGGA CAAGCTTACG TGAGAAAGGA CGGAGAGTGG 1651 GTGCTGCTGT CTACTTTCCT GGGACACCAC CACCACCACC ACTAA (序列辨識編號：5) 使用該H5共有序列以產生表現自HEK293人類細胞的 26 201102084 HA糖基化變體。為產生高甘露糖型糖基化作用(HAhnO，使 用缺少N-乙醯基葡胺糖基轉移酶I(GnlT)的HEK293S細 胞。為了進一步針對HA糖基化作用對受體結合親和力和 特異性的效應，系統性地從原始複合型N-聚糖移除HA上 的糖(第1A圖）。藉由神經胺酸酶(NA)的處理從HAfg移除 唾液酸殘基而產生去唾液酸HA(HAds)。使用内切糖苷酶 H(Endo H)將全部聚糖結構截斷成一單GlcNAc殘基而產生 單糖基化HA(HAmg)。因此，可產生總共四個糖型的ha : HAfg—來自HEK293E細胞的完全糖基化HA ;來自經神經 胺酸酶(NA)處理之HAfg的HAds*唾液酸HA ; ΗΑ^—來 自缺少人類Ν-乙醯基葡胺糖基轉移酶i(GnlT) HEK293S細 胞的高甘露糖型HA ;以及HAmg—於其糖基化位點具有來 自經内切糖苷酶H(Endo H)處理之HAhm的單N·乙醯葡萄糖 胺殘基HA(第1A和6圖)。藉由質譜分析確認該聚糖結構(第 7、8、9圖）。該變體的圓二色性(circular dichroism)證實其 具有類似的二級結構(第1C圖）。然後研究N-聚糖對不同糖 型HA的唯一效應，假設這些樣本具有類似的蛋白三維結 構以及在分析中不造成偏差(第1B圖）。應注意由於缺乏糖 基化作用而無法於大腸桿菌中表現功能性HA。 此外，質譜儀分析證實⑷HAfg優勢地含有複合型 聚糖(第7A圖）；(b)已從HAds上的複合型N-聚糖移除唾液 酸(第7B圖）；⑹ΗΑ^優勢地含有該高甘露糖型N_聚糖(第 7C圖）；以及(d) HAmg顯示HA上僅一 N-乙醯葡萄糖胺 (GlcNAc)(第 1 和 8 圖）。 HA糖基化變體的聚糖晶片輪廓 藉由利用習知的三明治法檢查HA糖基化變體HAfg、 HAds、ΗΑ^和HAmg的聚糖晶片輪廊。該合成唾液酸聚糖 陣列係由設計用於探測該流感病毒聚糖特異性之丨7 〇 27 201102084 2,3(聚糖1〜17)和7 α 2批聚糖21〜27)的唾液酸糖苦 (sialosides)所構成(請看第4圖）。製備具有終止於胺之五碳 連接子的該合成唾液酸糖苷以及藉由在室溫的含水條件下 形成一醯胺鍵而共價地附著於塗佈NHS載玻片上。該印刷 程序係根據先前所述的標準晶片機械手印刷技術(Blixt 〇 等人(2004) Λ^ί/· *Sc/. USA 101 : 17033〜17038 ;
Wang CC 等人(2008)户騰· AM. /cd. 5W. USA 105 : 11661〜11666)。將HA變體用於該唾液酸玻片然後雜合初級 抗體’接著以共輛至Cy3的次級抗體進行偵測。此分析顯 示H5N1 HA共有序列根據先前試驗可特異性地結合至α 2,3唾液酸糖苷但非α 2,6唾液酸糖苷（第2Α圖） (Chandrasekaran Α 等人(2008)她以⑽/. 26 : 107〜 113 ; Stevens J 等人(2008)Mo/.所〇/. 381 : 1382〜1394)。 意外地，藉經由相對螢光強度的定量結合、HAds和 HAhm ’至HAmg與α2,3唾液酸糖苷的結合強度成功地變得 較強(第2Α圖）。
ΗΑ被與設計用於流感病毒之含17α2_3(聚糖丨〜丨乃李 7 α2-6(聚糖21〜27)唾液酸糖苷的合成聚糖晶片接觸（第/ 圖）’然後s亥ΗΑ蛋白被雜合未標示初級抗體接著藉由Cy, 標示次級抗體進行偵測。該分析顯示共有序列的流感H5N 合至α 唾紐㈣，但非α 2— 唾液酸糖苦(第2Α圖）。意外地，與聚糖晶片分析比較^每 HAdjn HAhm，至1^吨與〇；2-3唾液酸糖苷的結合強度启 功地變得較強(第2A圖）。 定量性聚糖晶片 =於聚糖晶 >；分析僅提供相對的螢光強度而限制結合 試驗中的可定錄，以及仙者無練個職驗中分辨至 受體的結合親和力。為了能在結合試驗中進行準確地測 28 201102084 定，引用此晶片平台至測定HA-聚糖定量地相互作用的解 離常數。
没§十一種定量性晶片以測定表面解離常數(LiangPH等 人(2007)«/」所.（：/2鼠15(9(：.129:11177〜11184)。為了避免抗 體層疊造成的任何扭曲，以螢光染料Cy3直接標示HA (Srinivasan A 等人(2008) /Voc. 也以· &/· USA 105 : 2800〜2805)。藉由Cy3-標示HAs的序列稀釋進行直接結合 試驗以建立相對結合強度。藉由繪製該HA濃度對各別24 種唾液酸糖苷印於載玻片上之螢光強度測定表面上的解離 常數。根據Langmuir等溫線計算該解離常數KD,surf值(請看 第2B圖）。該單HA-唾液酸糖苷的結合力弱，顯現解離常 數為在克分子範圍内(KD^.SxU^MXSauter NK等人(1989) 及吵28 : 8388〜8396);然而，HA涉及可從定量性 晶片分析中觀察之宿主細胞表面上與唾液酸糖苷的多價相 互作用（表2)。隨著HAs上N-聚糖長度的減少而全方位地 和實質性地降低該KD，surf值(第2B圖）。 全部HA糖型顯示與受體聚糖以硫酸根基團在第三 GlcNAc殘基之第6個位置的還原端(聚糖4和7)具有強結 合力。此硫酸根基團對結合至H5 HA而言極為重要(Chandr asekaranA 等人(2008)Jto.及·她26 : 107〜113 ; Stevens J 等人(2008)』Μ?/. 5z.o/. 3811382〜1394)。此外，已觀察到 聚糖4為HAfg的最佳配體’反之對HAmg的配體而言聚糖 13〜15較聚糖6為佳，此顯示該配體結合位點内具有一可能 的多價相互作用，或更多受體結合區暴露於較大的雙枝唾 液酸糖皆(聚糖13和14)。有趣地，當其N-聚糖結構變得較 不複雜時可實質上增加HA的結合力（第2B圖）。然而，對 的該KD，surf值雖然顯示較強及類似至少數sA聚糖的 結合力’但是其他HA變體對聚糖配體則呈現較弱及更具 特異性的結合力（第2B和10圖）。因此，結合特異性及結合 29 201102084 ΐϊΐΐί—藉由受聚糖結構而調節的反向關係。此綱r 胞上聚糖受度其在μ上的糖可調節肺场: 歸因於受體唾液酸糖苷的結合能 動力學參數可被應用於熱力學參數以解釋分子内的相 互作用视相互作用的解離常數(KDsurf)可被用於計算 結合力的Gibbs自由能變化。為來自私聚 糖相互作用之穩定能的定量測量值。系統性地降低^上 N-聚糖結構的複雜性/切割度與成功地降低Δ(^伽有關 2)。 表2結合至α 2,3唾液酸糖苷1〜15之HA糖基化變體 的解離常數(KD.surf)和自由能變化(△〇) 唾液酸 Kn.,lirf, μΜ ±SD ANOVAP* AQ kcal/mol ±SD 類似物 HAfg HAf(i HAfE HAfE HAf2 HAfe HAfe HAft 1 6.99 士 0.41 2.86 土 0.93 2.09 士 0.59 0·27 士 0.16 <0.0001 一 7.03 ±0.03 -7.58 ±0.19 -7.76 士 0.17 -8.80 ±0.15 2 3.72 士 1.01 2.47 土 0.21 1.75 士 0.32 0·20 士 0.07 0.0002 -7.41 士 0.16 -7,66 ±0.06 一 7,86 土 0.11 -9.03 ± 0.07 3 4.55 土 1.85 2.34 土 0.27 0.92 士 0.16 0.26 士 0.06 0.0002 -7.31 ± 0.25 -7.68 ±0.07 -8.24 ± 0.10 -8.90 ±0.01 4 0.27 ± 0.01 0.27 土 0.05 0.33 士 0.09 0.13 土 0.06 0.0048 -8.96 ± 0.03 -8.95 ± 0.10 -8.84 ±0.16 -9.45 ±0.27 5 ND 5.20 土 1.01 9_40 土 3.20 0.54 士 0.15 ND ND -7.21 ±0.11 -6.88 ±0.21 -8.49 ±0,13 6 20.03 士 4.24 9.22 土 2.05 2.7] 士 0.53 0.80 士 0.05 <0.0001 —6.41 ±0.13 -6.87 土 0.13 一 7.65 土 0.06 -8.32 土 0.05 7 0·57 士 0.10 0.77 土 0.08 0.01 士 0.02 0.32 士 0.10 0.0010 -8.46 ±0.06 -8.36 ±0.04 -8.47 土 0.02 -8.78 ±0.14 8 2.49 士 0.58 2.48 土 0.41 1.69 土 0.53 0.36 土 0.13 0.0008 -7.65 ±0.14 -7.65 ±0.10 -7.89 士 0.21 -8.82 ±0,30 9 ND 15.34 ± 5.06 4.40 士 0.56 0.86 士 0.34 ND ND -6.58 ±0.20 -7.31 土 0.08 -8.18 ± 0.16 10 7.64 土 2.3 3.61 士 0.61 1.22 士 0.52 0.29 士 0.14 0.0003 —6.99 ±0.18 -7.43 士 0.10 -8.09 士 0·24 -8.77 ± 0.03 11 6.02 士 1.04 2.32 士 0.14 1_11 士 0.51 0.33 士 0.08 <0.0001 -7.12 ± 0.10 -7.68 土 0,04 -8.15 士 0·25 -8.91 ± 0.18 12 40.23 士 9.77 ND 2.45 土 0.52 1_41 土 0.92 ND -6.00 ± 0.15 ND -7.66 士 0.12 -7.85 ± 0.25 13 3.38 ± 1.06 1.37 士 0.30 0.31 士 0.06 0.07 土 0.01 0.0008 -7.47 士 0.19 -8.05 土 0.13 -8.88 土 0.13 -9.77 ±0.09 14 2.72 士 0.41 0.97 土 0.41 0.42 士 0.03 0_09± 0.01 <0.0001 -7.59 ± 0.09 —8.27 士 0.28 -8.69 ±0.04 -9.60 ±0.01 15 2.37 土 0.19 1.32 土 0.16 0_89 士 0.35 0.09 士 0.01 0.0002 —7.67 ± 0.05 -8.02 ±0.07 -8.29 土 0.27 -9.62 ± 0.08 30 201102084 表2顯示對於〇2,3唾液酸糖苷1〜15具有不同糖基化 HA的熱動力學參數。其顯示對於α 2,3唾液酸糖苷丨〜^之 ΗΑ-聚糖相互作用的自由能變化必⑺和KDsurf。藉由利用方 程式如涵=-RT /琳认咖·1)可從KD，sur^衍生出值。根 據KD，surf值計舁出該AG值以獲得ha-聚糖結合鍵的自由能 變化。未測定聚糖5和9的△GCHAfghND代表未測定(*來 自15個經鑑定HA-結合唾液酸糖苷，利用單因子 ANOVA(P<0.05視為具有顯著性)表示四種糖型中之 KD，surf值的統計學上顯著性差異）。 HA變體之間在自由能變化(△△〇)上的差異係導因於獨 特的聚糖結構(第10圖）’以及;^^和HAmg(AAG HAfgy HAmg，請看第1〇圖)之間具有最大的差異，此與修除大部 N-糖基至單一 GlcNAc時具有最大結合能差異的結果一 致）。應注意除了聚糖4和7之外具有類似的值(第1〇 圖），此表示HA上聚糖對硫酸化α2,3三糖結合親和力無明 顯影響(Chandrasekaran Α等人(2008)崩/.历你以如/. 26 : 107〜113)。 HA受體的結合 藉由比較不同受體唾液酸糖苷間之自由能變化(△△〇 值)的差異可說明HA-受體結合的分子細節（即貢獻自含有 一 t糖受體的各結構成分)(第4和11圖）。詳細分析該負責 HA結合之受體唾液酸糖苷的能量貢獻可揭露出用於設計 新HA抑制劑之特異性的關鍵點。以石点丨〜4)鍵結連 接至半乳糖殘基的唾液酸糖*α2,3比以GalyJl〜3鍵結者 具有較佳的結合親和力(Stevens J等人(2008) «/· 381 : 1382〜1394)。此可發現於Neu5Ac_a2,3_半乳糖 (Neu5Aca2,3Gal)雙糖主鏈的比較(第4A圖，聚糖1，紅色 箱形圖）’該三糖3和6僅在Gal和GlcNAc間鍵結上的差 31 201102084 ί 田f部似變體的MG(1，為負(穩定化ha-受 體相互^用），反之全部HA變體的MG(1—6)為正(去穩定 化^-f 2相互作用；第4A和11圖)。此觀察顯示NeusL- 伽心雜弘結合袋相互侧的核心 聚糖成为。此外，全部HA變體的△△Gd—%值為正，顯示 在第三位置具有導因於連接甘露糖的負擾動(第4a和 11圖）。因此，結合能可受至遠端Neu5Ac_a2,3Gal雙糖配 體之内糖殘基及其鍵結模式的影響(第4A圖）。此分析顯示 在第三位置的一 GlcNAc殘基有利於全部HA變體。麸而， 比較對聚糖13和14(第4E和11圖)至聚糖6的值， 明顯呈現結合位點與雙枝唾液酸糖苷的多價相互作用，以 及就HAmg而言，此分子内親和力更強於第三糖結構效應 驅動的結合力。 接著，製備受體聚糖10、11、12和15。這些具有相同 基本核心結構(聚糖8三糖)但是於第三位置具有不同伸長 (聚糖11和12)或添加的α2,6唾液酸(聚糖is ;第4B圖）。 有趣的是該具有分枝α2,6唾液酸的唾液酸糖苷可大為增加 ΗΑ親和力’反之延伸自聚糖§的較長α2,3唾液酸糖苷則 具有較弱的ΗΑ結合力11)-10)>ΔΜ}(8~^12);第 4B 和 11 圖）。 聚糖3〜5和6〜7共用相同的三糖主鏈但在第三GlcNAc 的非還原端上添加不同的硫酸基團（聚糖4)或岩藻糖殘基 (聚糖5)。該硫酸基團可穩定化HA-受體聚糖相互作用高至 2.044kcal/mol(AAG(6—7)) ’此為兩個受體唾液酸糖苷之間 最大的能隙。全部HA變體之中，完全糖基化變體在自由 能變化中具有最大差異，其值為^^(3^4)^^(-1.653 kcal/mol)和 ^0(6^7)11^(-2.044 kcal/mol)，以及更簡化的 聚糖結構可獲得較低量的自由能；亦即KCAfg> HAds> HAhm> HAmg。因此’硫酸化聚糖可戲劇性地增強HA結合力，以 32 201102084 及完全糖基化HA可最大化此對H5N1病因極為重要的效應 (第4C和D圖）。另一方面，該岩藻糖化受體類似物大為g 低糖基化HA變體的結合穩定度而呈現正4c 圖）。最大化硫酸根基團及岩藻糖立體塊之受體_結合袋内重 要的結合相互作用將導致極大差異的和ΔΔ(3(3 —5)。由於移除唾液酸對結合具些微效應以及對某些 特定唾液酸化聚糖仍呈現強的親和力’因此^每的弱結^ 力不似導因於其唾液酸化聚糖的競爭。 σ σ 利用單糖基化HA設計疫苗 一該單糖基化凝集素HAmg與其完全糖基化副本比較顯 示具有一類似次級結構以及對宿主受體具有較佳的結合親 和力。近期研究亦指出至Asn的GlcNAc殘基為用於糖蛋 白折疊和穩定化所需的最低N-聚糖成分(Hanson SR等人 (2009)/V〇c.施如·. USA106 : 3131 〜3136)。由於對 聚糖而言蛋白為優異免疫原，因此測試以該單;糖基化 作為對抗流感病毒的蛋白疫苗。比較來自HAfg* 免 疫抗血清之結合原始HAs及中和H5病毒的能力（第5圖）。 事實上，與HAfg對照之下，該來自^吨的抗血清顯示較 強的病毒中和能力。該HAmg抗血清除了 H5亞型越南/1194, H5(安徽)和 H5(ID5/2005)之外亦結合至 Hl(New Caledonia /携9)(第5D圖）。值得注意的是，該HAmg疫苗在一免疫試 驗中較HAfg疫苗更具有保護效果(第5C圖）。 第3圖中比較分離自人類之m、H3和H5的胺基酸序 列。當比較H1與H3以及H3與H5時，可觀察到全部以及 接近N-糖基化位點之胺基酸序列的差異。hi和H5顯示全 部胺基酸序列具有較高的類似度，以及接近N-糖基化位點 具有更保留的序列。季節性(A/布里斯本/59/2007)和大流行 (A/加州/07/2009)Η1株顯示约具有79%的序列一致性。H1 33 201102084 和H5之間的整體序列—致性為約，以及Η]和出、 為約4〇%。此外，H1 * H5之間的N-糖 二色箱形圖)和劃底線胜肽序列較 本發明顯示HA上N_聚糖的系統性簡化可逐步增加對 ^^^液酸糖苷但非^^唾液酸糖芽的結合力嗜明者 第-次指出HA之外和内聚糖對受體結合的效應以及定量 性地分析HA-受體相互作用的結合親和力和能量貢獻。 HA糖基化作用影響流感的功能尺等人 (2002) «/ (¾.如/. 83 : 6〇1〜6〇9)。有趣的是，自從 1968 年，於增加流感H3N2上糖基化的程度，因此已降低病毒 的惟患率、死亡率及肺部病毒力價(Vigerust Dj等人(2⑻7) 乂 胸/. 81 : 8593〜8600)。 抑在不侷泥於理論之下，發現附著至該糖基化位點之具 有單一 GlcNAc的ΗΑ顯示對α2,3唾液酸糖苷具有低特異 性及較強的親和力而認為ΗΑ上的Ν-聚糖可造成接近該 ΗΑ-受體結合區的立體障礙。對受體唾液酸糖苷的高特異性 可避免病毒結合至位於人類肺上皮細胞表面上的其他g異 性聚糖。另一方面，具有截斷聚糖的HA能以較高結合親 和力及較低特異性辨認〇；2,3受體唾液酸糖苷，而認為減少 HA上聚糖長度可能增加感染禽流感的危險。然而，仍不瞭 解經由糖基化改變HA-受體的相互作用如何影響病毒的感 染性以及病毒壽命中的NA活性。 〜 具有單一 GlcNAc的ΗΑ由於可保留ΗΑ的完整結構及 可輕易地被製備(例如經由酵素)因此係一種用於流感的理 想候選疫苗。其亦可暴露被大聚糖遮敞的保留性表位以誘 發可辨認HA變體的較高力價免疫反應。此策略伴隨其他 不同疫苗策略(Hoffin_ E等人(20〇5) /Voc.AM. 々Μ細 USA 102 : 12915〜12920 ; Huleatt JW 等人(2008) FflcczVze 26 : 34 201102084 201 〜214 ; Scanlan CN 等人(2007)·/· Μ?/ϋ 372 : 16〜22 ; Yang ΖΥ 等人(2007) &ζ·⑼ce 317 : 825〜828)以及 ΗΑ-中和抗 體的近期發現(Ekiert DC等人(2009) 5W⑼ce 324 : 246〜251 ; Kashyap AK 等人(2008) Λ^ί/. iSd. USA 105 : 5986〜5991 ; Scheid JF 等人(2009) 458 : 636-640 ;
Stevens J 等(2006) 如e 312 : 404〜410 ; Sui JH 等人(2009) 及rwci· M?/.所〇/. 16 : 265〜273)應有助於對抗病毒例如 流感、C型肝炎病毒和HIV的疫苗開發而開啟一頁疫苗設 計的新方向。 因此，測試具有單一 GlcNAc的HA是否可作為流感的 理想疫苗。就受益其與0.2〜3唾液酸糖苷的強結合力而言， 具有單一 GlcNAc的HA可誘發辨認接近RBD區的較高力 價免疫反應，顯示添加寡糖可為一種經由修飾或遮敝病毒 上抗原表位以逃避免疫的有效方法。因此，移除大部分聚 糖但保留至少單-GluNAe的策略為·未輪苗設計的 ，方向’以及此概念有助於更深人瞭解其他抗病毒疫 如MV、HBV和HIV的設計。其他迭代方法為保留具 一、二或更多聚糖的原始聚糖鏈。 、 以部分糖基化細胞表面糖蛋白作為疫苗 病，的細絲面糖蛋自為用於疫苗發展雜佳 表面蛋白常被宿主高度糖基化以«病毒 ，高度保留而因蝴用於疫苗=;:蛋力序列 而，這些高度保留區域至少部分由於然 阻斷區域而無法輕易地接近宿主的^ ^文里或其 成功製備對抗完整HIV疫苗的其% ，限制 破高度糖基化。 ’、口為病毋表面gp 120 該新疫苗更具免疫雜及__發的鋪具有對抗 35 201102084 整糖蛋白的較佳中和活性。該抗體 對突變較敏感的高度保留糖基化HU ==類抗體對蛋白較糖類具有高度親和力以及 度保留區的結合而將與標的蛋白部分Hi 醢#連接的白中’—級糖⑼·糖蛋白的N乙 及〇_糖蛋白的N-乙醯葡萄糖胺或_半 蛋白的三級結構所必需同時其餘的糖並不 酶(end〇H)處理Ν-糖蛋白將可移除糖鏈以 用;i二葡萄糖胺附著至該蛋白。甘露糖苷酶亦可被 f賊雙·或三?嫌，由於其可接近蛋白上 糸㈣ί 士位點甚至與雙_、三-和較大去糖基化蛋白之免疫 if，力’因此其於此處被預期視為可能的疫苗。其他 拥於從〇·白移雜_及使該一級糖附 者至該蛋白。 ^以endoH _表現於人類細胞内之來自禽流感(Η5) 、一元全糖基化血球凝集素以減少糖基化至一單糖基 化狀態以及用於兔之免疫時，該產生的抗血清較產生自完 ^糖基化血球凝集素的抗血清具有更高的力價(第13Α〜13Β f)。其亦能巾和來自其他禽流雜以及來自人流感之凝集 二Η1的血球凝集素’但是該來自完全糖基化私的抗血清 热法中和Η1以及對該禽流感株而言更具特異性。 單糖基化Η5抗血清能與Hl產生交又反應的可能原因 ，由於糖基化模式及H1和H5之間的相似性。利用兔抗血 /月獲得該資料(第13圖）。如第12〜14圖所示，^3血球凝集 素不具有如H5 HA對HI HA相同程度的同源性 。因此，產 生自H1和H5的抗血清無法中和H3。然而，由於H3在保 邊區與H1和H5具有其他同源性，因此產生自去糖基化凝 36 201102084 ί抗血清除了凝集素H3之外可中和凝集素H1和 單糖基化凝集素時，由於附著至該蛋白(即n_乙酿 ϊ乙m)之具有最初三個糖(甘露糖-n乙_萄糖胺 胺)或僅具有單娜·⑽㈣蛋 ϋίίί Γ ΐΐ雜㈣性因此不需從人類細胞培養 因此，可在酵母、捍狀病毒或1他直核宿 爻蛋白及以適當的糖苷酶例如用於“ 或甘露㈣猶賴糖蛋自混合_製備用作 為疫田的同質單糖基化蛋白。 在不侷泥於理論之下，假定Ν_連接聚 Πί其車if皮修剪以移除其餘糖_ Ν_連i聚糖ί 此遠〇-連接聚糖即使為完整亦不造成問題。 暴露至該免疫系統的一原始糖蛋白具有一 Ν_遠接八 系ί白田ΐ於該高度保留區的糖基化作用無法接近該i疫 變^產僅能杨高度變異區，因而當該 二 體對多重病毒感染的敏感 此ΐΐϋ "接近高度保留區時，則能引導抗體至 序列而提供一種對抗病毒的接種途 該糖及 吏現有抗體無法對抗 統。城實地織彳無法謂上接近該免疫系 兮糖===蛋域經域苗接近該免絲統，移除 ' 2 ί路出原始病毒蛋白至該免疫系統。重要的 =广I士白疋全移除該糖已顯示會造成蛋白的變性；在許 ^病毒中的糖基化糖蛋白為至三級結構糖蛋“關= j由暴紐分_錄絲蛋自至Ν__酶如end〇H 或甘路糖鶴以移除該糖，其將從該糖蛋白切=部除了 37 201102084 第厂、二或三個之外的糖而不使該蛋白失去其三級結構。 =後該去糖基化蛋白與適當醫藥載劑被配製成疫苗並且被 投Ϊ至—生物體。由於該高度保留糖基化區被去糖基化及 暴露至該免疫系統因而產生對抗該高度保留區的抗體。 /當病毒感染該經免疫生物體及該病毒糖蛋白暴露於免 疫系統時，被引導至蛋白之高度保留區的該抗體因而存在 於生物體的系統内。因此，由於抗體仍被引導至該糖蛋白 的非突變保留區而與可變區的突變無關。 ，此外，由於降低該抗體結合至蛋白的熱動力學以及該 糖被"推擠"而使該抗體結合至該高度保留區，因此糖基化無 法阻擔抗體至該高度保留區的結合。重要的是，在病毒蛋 =例如HIV之gpi2〇中，此策略提供無法產生足夠抗體力 ΐί有效對抗錢之免疫系㈣―種用於接種之方法和組 根據具體化這些原則的實施例中，一疫苗含有至一 種，糖基化凝録以及—醫藥上可接受麵。可利用表現 糖基白的任何系統例如酵母和桿狀病毒製造該疫苗。 -旦製出該蛋白，可利用適當方法例 法或能分㈣其他方法被分離。潛析 =近生物保留該糖蛋白位點的糖基化模式 (GlcNAc-GlcNAoMan)。因此’若保留最初可 接ΐΪί物以及產生該蛋白的生物)個糖時何種下游糖
;至;;個=卜Ϊ都被切斷時該模式與人類版糖IK 種的蛋白。因此，本發明提供用於 人類接 和黃熱病毒之高通量、高產量疫苗的 為生產該疫苗，分w 、伴r生地4化該糖而形成糖基化作用 38 201102084 分)去糖基化。然而，不論使用健方法切斷該糖 鏈其必需不影響劃底線蛋白的三級結構。 ，可利用合成方法製備該部分糖基化糖蛋白，或其片 於合成糖肽的方法：①逐步法：使用糖基化 職合成的結鮮元。此方法的優點為被”廣泛 ^麵概。此方法可製備具有—些寡糖基團的 。⑻收斂法：分開製備一寡糖基團或一胜肽基團，然 ί相互偶合。通常，此方法姻於製# N_概。此方法需 要用於胜肽基團内，’糖基化點，，的一特殊正交侧鏈保護基。 在一具體實施例中，利用硫酯法合成連接至該胜肽之 =;胺酸殘基的N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)以構築該多肽片 I又(MemfieldRB ; J·贏 c/zew·知· 85 : 2149(1983))以及利 用二^基硫磷酸混合酐(Mpt-MA)法併入該糖肽基團(Guo ZW 等人(i997；M«gew· CT^m. /故υ·办g/. 36:1464〜1466) 〇 產生自單糖基化HA蛋白的交叉反應流感疫苗 (A)接種季節性H1(布里斯本)單糖基化似蛋白 利用一種血球凝集抑制檢測法偵測來自H1(布里斯本） 接種的抗血清是否具有抑制NIBRG_m (2〇〇9年大流行a (H1N1)疫苗株)病毒凝集紅血球細胞的能力。如第ι5Α圖所 不二來自接種H1(布里斯本)之單糖基化η^ηα^的抗血清 與完全糖基化HA(HAfg)和未糖基化HA(HAug)相比證明具 有較佳抑制NIBRG-121(HlNl/2009)病毒凝集紅血球細胞 的能力。 利用被罝中和檢測法偵測來自H1 (布里斯本)接種的抗 血清是否具有中和NIBRG-121(2009年大流行Α(Η1Ν1)疫 苗株)病毒感染MDCK細胞的能力。如第15Β圖所示，來 自Η1(布里斯本)的單糖基化與完全糖基化ΗΑ (HAfg)和未糖基化相比證明具有較佳中和 39 201102084 NIBRG-121(HlNl/2009)病毒感染廳⑶細胞的能力。 时進行一種病毒攻毒試驗以證明接種來自m(布里斯本) 的單糖基化HA可對抗NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1) 疫苗株)病毒的攻毒。如第15C圖所示，單糖基化HA(布里 斯本)疫苗可保護BALB/c小鼠對抗1^1^(^21(2009年大 流行A(H1N1)疫苗株)病毒的攻毒。對照之下，製造自不活 化病毒之傳統流感疫苗的完全糖基化顯示無對抗H1N1 (2009年大流行a(H1N 1)疫苗株)病毒感染的交叉保護能力。 第16A〜16C圖顯示藉由產生自以單糖基tH1(布里斯 本)作為抗原的抗血清可抑制WSN(mN1)1933。第16A 圖顯，其抑制WSN(H1N1)1933病毒凝集紅血球細胞的能
力。第16B圖顯示抑制WSN(H1N1)1933病毒感染]VDDCK 細胞的能力。第16C圖顯示其可保護BALB/c小鼠對抗 WSN(H1N1)1933流感病毒的感染。該抗血清使用以布里斯 本HA蛋白（5 ug)免疫的小鼠血清以及該攻毒病毒為 WSN(Hmi)1933(l〇〇xLD5())。 如第16A圖所示，來自接種m(布里斯本)之單糖基化 HA(HAmg)的抗血清與完全糖基化和未糖基化似 (HAug)相比證明具有較佳抑制WSN(mN1)1933病毒凝集紅 ^球細胞的能力。如第16B圖所示，來自Ή1(布里斯本')的 單糖基化HACHA。與完全糖基化必（HAfg)和未糖基化 HA(HAug)相比證明具有較佳中和WSN(H1N1)1933病毒感 染MDCK細胞的能力。如第16c圖所示，單糖基化似(布 里斯本)疫田可保護BALB/c小鼠對抗WSN(H1N1)1933病 毒的攻毒。韻之下，製造自不活化病毒之傳統流感疫苗 的完全糖基化HA顯示無對抗WSN(mN1)1933病毒感染的 交叉保護能力。 〜 第17A〜>17C圖顯示藉由產生自以單糖基化H1(布里斯 本)HA作為Μ的抗血清可抑制織乡黎各/8/34田簡）： 201102084 h。$ 1TR 不其抑制PR8病毒凝集紅血球細胞的能 六。楚w f其抑制PR8病毒感染細胞的能 主二心If不其可保護BALB/G小鼠對抗PR8流感病 毋=感^該抗血清使用以布里斯本似蛋白(5㈣免疫的 小乳血清以及該攻毒病毒為pR8 (1〇〇xLD5〇)。 如第17A圖所示，來自接種H1(布里斯本)之單糖基化 HA(HAmg)的抗血清與完全糖基化和未糖基化^ pAug)相十證明具有較佳抑制pR8病毒凝集紅血球細胞的 能力。如第17B圖所示，來自m(布里斯本)的單糖基化 HA(HArag)與完全糖基化和未糖基化相 比證明具有較佳中和PR8病毒感染MDCK細胞的能力。如 第17C圖所示，單糖基化ha(布里斯本)疫苗可保護BALB/c 小鼠對抗PR8病毒的攻毒。對照之下，製造自不活化病毒 之傳統流感疫苗的完全糖基化HA顯示無對抗PR8病毒感 染的交叉保護能力。 ⑼接種新型Hl(2009年大流行α(Η1Ν1)疫苗株)單糖基化 ΗΑ蛋白 分離及修飾用於如實施例1所述之表現的流感Η1 (2009年大流行Α(Η1Ν1)疫苗株)ΗΑ編碼序列。表3顯示經 修飾2009年大流行Α(Η1Ν1)疫苗株Hl/HA del-TM-FH6的 序列其訊號肽序列被劃底線及加粗體字，斜體字為凝血酶 切割點，該噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列和His-標簽 被劃底線，以及該連接序列為粗體字和被劃底線。 表3流感Hl(2009年大流行A(H1NI)疫苗株)凝集素序列 流感Hl(2009年大流行A(HINI)疫苗株)HAdel-TM-FM6的胺基酸序 列 MKAILWLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLL 5 0 201102084
EDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETP 100 SSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVT 150 AACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPS 200 TSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTL 250 VEPGDKITFEATGNLWPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPK 300 GAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAI 350 AGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSV工 4 00 EKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLEISIER 450 TLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGT 500 YDYPKYSEEAKLNREEIDGVDIRSLVP^GSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKD 550 GEWVLLSTFLGHHHHHH (序列辨識編號：6) 流感Hl(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)HAdel-TM-FM6的核苷酸序 列 1 ATGGCGCGCC GCTAGCATGA AGGCCATCCT GGTTGTGCTG CTGTACACCT 51 TCGCTACCGC CAACGCCGAT ACCCTGTGCA TCGGCTACCA CGCCAACAAC 101 AGCACCGACA CCGTGGATAC CGTGCTGGAA AAGAACGTGA CCGTGACCCA 151 CAGCGTGAAC CTGCTGGAAG ATAAGCACAA CGGCAAGCTG TGCAAGCTGA 201 GAGGCGTGGC CCCTCTGCAC CTGGGCAAGT GCAATATCGC CGGCTGGATC 251 CTGGGCAACC CCGAGTGCGA GAGCCTGAGC ACCGCCAGCA GCTGGTCCTA 301 CATCGTGGAG ACACCCAGCA GCGACAATGG CACCTGTTAC CCCGGCGACT 351 TCATCGACTA CGAGGAACTG CGGGAGCAGC TGAGCAGCGT GTCCAGCTTC 401 GAGCGGTTCG AGATCTTCCC CAAGACCAGC TCTTGGCCCA ACCACGACAG 4 51 CAACAAGGGC GTGACCGCCG CCTGTCCTCA CGCTGGCGCC AAGAGCTTCT 501 ACAAGAACCT GATCTGGCTG GTCAAGAAGG GCAACAGCTA CCCCAAACTG 551 AGCAAGAGCT ACATCAACGA CAAGGGCAAA GAAGTGCTGG TGCTGTGGGG 601 CATCCACCAC CCTAGCACCA GCGCCGACCA GCAGAGCCTG TACCAGAACG 42 201102084 651 CCGACGCCTA CGTGTTCGTG GGCAGCAGCC GGTACAGCAA GAAGTTCAAG 701 CCCGAGATCG CCATCAGACC CAAAGTGCGG GACCAAGAGG GCCGGATGAA 751 CTACTACTGG ACCCTGGTGG AGCCCGGCGA CAAGATCACC TTCGAGGCCA 801 CCGGCAATCT GGTCGTGCCC AGATACGCCT TCGCCATGGA AAGAAACGCC 8 51 GGCAGCGGCA TCATCATCAG CGACACCCCC GTGCACGACT GCAACACCAC 901 CTGTCAGACC CCCAAAGGCG CCATCAACAC CAGCCTGCCC TTCCAGAACA 951 TCCACCCCAT CACCATCGGC AAGTGCCCTA AGTACGTGAA GTCTACCAAG 1001 CTGAGGCTGG CCACAGGCCT GCGGAACATC CCCAGCATCC AGAGCAGAGG 1051 CCTGTTTGGC GCCATTGCCG GCTTTATCGA GGGCGGCTGG ACCGGAATGG 1101 TGGATGGATG GTATGGCTAC CACCACCAGA ATGAGCAGGG AAGCGGCTAC 1151 GCCGCCGACC TGAAGTCCAC ACAGAACGCC ATCGACGAGA TCACCAACAA 1201 AGTGAACTCA GTGATCGAGA AGATGAACAC CCAGTTCACC GCCGTGGGCA 1251 AAGAATTCAA CCACCTGGAA AAGCGGATCG AGAACCTGAA CAAGAAGGTG 1301 GACGACGGCT TCCTGGACAT CTGGACCTAC AACGCCGAGC TGCTCGTGCT 1351 GCTGGAAAAC GAGCGGACCC TGGACTACCA CGACTCCAAC GTGAAGAATC 1401 TGTACGAGAA AGTTCGCTCC CAGCTGAAGA ACAACGCCAA AGAGATCGGC 1451 AACGGCTGCT TCGAGTTCTA CCACAAGTGC GACAACACCT GTATGGAAAG 1501 CGTGAAGAAC GGCACCTACG ACTACCCCAA GTACAGCGAG GAAGCCAAGC 1551 TGAACCGGGA AGAGATCGAC GGCGTGGATA TCAGATCTCT GGTGCCAAGA 1601 GGATCTCCAG GATCTGGATA CATCCCAGAG GCTCCAAGAG ATGGACAAGC 1651 TTACGTGAGA AAGGACGGAG AGTGGGTGCT GCTGTCTACT TTCCTGGGAC 1701 ACCACCACCA CCACCACTAA (序列辨識編號：7) 利用一種血球凝集抑制檢測法偵測來自Hl(2009年大 流行A(H1N1)疫苗株)接種的抗血清是否具有抑制WSN (H1N1)病毒凝集紅血球細胞的能力。如第18A圖所示，來 自接種Hl(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)之單糖基化必 43 201102084 (HAmg)的抗血清與完全糖基化和未糖基化 (HAug)相比證明具有較佳抑制WSN(mN1)病毒凝集紅血球 細胞的能力。 利用微量中和檢測法偵測來自Hl(2009年大流行A (H1N1)疫苗株)接種的抗血清是否具有中和WSN(mN1)病 毒感染MDCK細胞的能力。如第18B圖所示，來自hi(2〇〇9 年大流行A (H1N1)疫苗株)的單糖基化HA(HAmg)與完全糖 基化HA(HAfg)和未糖基化HA(HAug)相比證明具有較佳中 和wsN(mm)病毒感染mdCK細胞的能力。 利用一種病毒攻毒試驗以證明接種來自H1(2〇〇9年大 流行A (H1N1)疫苗株)的單糖基化ha可對抗WSN(mN1) 1933或A/波多黎各/8/34(HlNl) : PR8病毒的攻毒。單糖基 化HA(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)疫苗可保護balb/c 小执對抗WSN(H1N1)或PR8病毒的攻毒。對照之下，製造 自不活化病毒之傳統流感疫苗的完全糖基化HA顯示無對 抗WSN(HINI)或PR8病毒感染的交叉保護能力。 來自其他流感病毒株的部分糖基化(例如單糖基化） HA可被用於配製有效預防或降低一或多種流感病毒株或 亞型感染的強效疫苗。分離及修飾用於如實施例i所述之 表現的流感HA編碼序列。選殖該ha以及表現於一真核表 現系統内然後進行去糖基化以保留一至三個糖基(較伟A罝 糖基化)於糖基化位點。 w 表4顯示經修飾HI A del-TM-FH6的共有序列其訊號 肽序列被劃底線及加粗體字，斜體字為凝血酶切割點，該 噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列和His^簽被劃底線， 以及該連接序列為粗體字和被劃底線。 _ 表4共有HI A del-TM-FH6凝集素戽列 丨 流感HI Adel-TM-FH6凝集素的共有胺基酸序列 44 201102084
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLL 50 EDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETP 100 NPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTKGVS 150 ASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPP 200 NIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTL 250 LEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQ 300 GAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAI 350 AGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVI 400 EKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER 4 50 TLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGT 500 YDYPKYSEESKLNREKIDGVDIRSLVTi^GSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKD 550 GEWVLLSTFLGHHHHHH(序列辨識編號：8)流感HI Adel-TM-FH6凝集素的核苷酸序列 1 ATGAAGGTGA AACTGCTGGT GCTGCTGTGC ACGTTCACCG CCACCTACGC 51 CGACACCATC TGCATCGGCT ACCACGCCAA CAACAGCACC GACACCGTGG 101 ATACCGTGCT GGAAAAGAAC GTGACCGTGA CCCACAGCGT GAACCTGCTG 151 GAAGATAGCC ACAACGGCAA GCTGTGCCTG CTGAAGGGCA TTGCCCCCCT 201 GCAGCTGGGC AACTGTAGCG TGGCCGGCTG GATTCTGGGC AACCCCGAGT 251 GCGAGCTGCT GATCAGCAAA GAGTCCTGGT CCTACATCGT GGAGACACCC 301 AACCCCGAGA ACGGCACCTG TTACCCCGGC TACTTCGCCG ACTACGAGGA 351 ACTGAGAGAG CAGCTGTCCT CTGTCTCCAG CTTCGAGCGG TTCGAGATCT 401 TCCCCAAAGA GAGCAGCTGG CCCAACCACA CCGTGACAAA GGGCGTGAGC 451 GCCAGCTGCT CCCACAATGG CAAGAGCAGC TTCTACCGGA ACCTGCTGTG 501 GCTGACCGGC AAGAACGGCC TGTACCCCAA CCTGAGCAAG AGCTATGCCA 551 ACAACAAAGA GAAAGAGGTC CTCGTCCTCT GGGGCGTGCA CCACCCGCCC 601 AACATCGGCG ACCAGCGGGC CCTGTACCAC ACCGAGAACG CCTACGTGTC 45 201102084 651 CGTGGTGTCC. AGCCACTACA GCAGACGGTT CACCCCCGAG ATCGCCAAGA 701 GGCCCAAAGT GCGGGACCAG GAAGGCCGGA TCAACTACTA CTGGACCCTG 751 CTGGAACCCG GCGACACCAT CATCTTCGAG GCCAACGGCA ACCTGATCGC 801 CCCCAGATAC GCCTTTGCCC TGAGCAGAGG CTTCGGCAGC GGCATCATCA 851 CCAGCAACGC CCCCATGGAC GAGTGCGACG CCAAGTGTCA GACCCCCCAG 901 GGCGCCATCA ACAGCAGCCT GCCCTTCCAG AACGTGCACC CCGTGACCAT 951 CGGCGAGTGC CCTAAGTACG TGCGGAGCAC CAAGCTGAGA ATGGTGACCG 1001 GCCTGCGGAA CATCCCCAGC ATCCAGAGCA GAGGCCTGTT TGGCGCCATT 1051 GCCGGCTTTA TCGAGGGCGG CTGGACCGGA ATGGTGGACG GGTGGTACGG 1101 CTACCACCAC CAGAATGAGC AGGGCAGCGG CTACGCCGCC GATCAGAAGT 1151 CCACCCAGAA CGCTATCAAC GGCATCACCA ACAAAGTGAA CAGCGTGATC 1201 GAGAAGATGA ACACCCAGTT CACCGCCGTG GGCAAAGAGT TCAACAAGCT 1251 GGAACGGCGG ATGGAAAACC TGAACAAGAA GGTGGACGAC GGCTTCCTGG 1301 ACATCTGGAC CTACAACGCC GAGCTGCTGG TCCTGCTGGA AAACGAGCGG 1351 ACCCTGGACT TCCACGACAG CAACGTGAAG AACCTGTACG AGAAAGTGAA 1401 GTCCCAGCTG AAGAACAACG CCAAAGAGAT CGGCAACGGC： TGCTTCGAGT 14 51 TCTACCACAA GTGCAACGAC GAGTGCATGG AAAGCGTGAA GAACGGCACA 1501 TACGACTACC CCAAGTACAG CGAGGAAAGC AAGCTGAACC： GGGAGAAGAT 1551 CGACGGCGTG GATATCAGAT CTCTGGTGCC AAGAGGATCT CCAGGATCTG 1601 GATACATCCC AGAGGCTCCA AGAGATGGAC AAGCTTACGT GAGAAAGGAC 1651 GGAGAGTGGG TGCTGCTGTC TACTTTCCTG GGACACCAC'C ACCACCACCA 1701 CTAA(序列辨識編號：9) 表5顯示經修飾Hl-c del-TM-FH6的共有序列其訊號 肽序列被劃底線及加粗體字，斜體字為凝血酶切割點，該 噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列和His-標簽被劃底線， 以及该連接序列為粗體字和被劃底線。 46 201102084
表5共有Hl-Cdel-TM-FH6凝集素序列_流感Hl-C del-TM-FH6凝集素的共有胺基酸序列 MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTH.SVNT.L 50 EDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETP 100 NPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHDTVTGVS 150 ASCSHNGESSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPP 200 NIGDQKALYHTENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTL 250 LEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDKCDAKCQTPQ 300 GAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAI 350 AGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVI 400 EKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER 4 50 TLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGT 500 YDYPKYSEESKLNREKIDGVDIRSLyPKGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKD 550 GEWVLLSTFLGHHHHHH(序列辨識編號：10)流感Hl-C del-TM-FH6凝集素的核苷酸序列 1 ATGAAGGTGA AACTGCTGGT GCTGCTGTGC ACCTTCACCG CCACCTACGC 51 CGACACCATC TGCATCGGCT ACCACGCCAA CAACAGCACC GACACCGTGG 101 ATACCGTGCT GGAAAAGAAC GTGACCGTGA CCCACAGCGT GAACCTGCTG 151 GAAGATAGCC ACAACGGCAA GCTGTGCCTG CTGAAGGGCA TTGCCCCCCT 201 GCAGCTGGGC AACTGTAGCG TGGCCGGCTG GATTCTGGGC AACCCCGAGT 251 GCGAGCTGCT GATCTCCAAA GAGTCCTGGT CTTACATCGT GGAGACACCC 301 AACCCCGAGA ACGGCACCTG TTACCCCGGC CACTTCGCCG ACTACGAGGA 351 ACTGCGGGAG CAGCTGAGCA GCGTGTCCAG CTTCGAGCGG TTCGAGATCT 401 TCCCCAAAGA GAGCAGCTGG CCCAACCACG ATACCGTGAC CGGCGTGAGC 451 GCCAGCTGTT CCCACAACGG CGAGAGCAGC TTCTACCGGA ACCTGCTGTG 501 GCTGACCGGC AAGAACGGCC TGTACCCCAA CCTGAGCAAG AGCTATGCCA 47 201102084 551 ACAACAAAGA GAAGGAAGTC CTGGTCCTCT GGGGCGTGCA CCACCCCCCC 601 AACATCGGCG ACCAGAAGGC CCTGTACCAC ACCGAGAACG CCTACGTGTC 651 CGTGGTGTCC AGCCACTACA GCCGGAAGTT CACCCCCGAG ATCGCCAAGA 701 GGCCCAAAGT GCGGGACCAG GAAGGCCGGA TCAACTACTA CTGGACCCTG 751 CTGGAACCCG GCGACACCAT CATCTTCGAG GCCAACGGCA ACCTGATCGC 801 CCCCAGATAC GCCTTTGCCC TGAGCAGAGG CTTCGGCAGC GGCATCATCA 851 ACAGCAACGC CCCCATGGAC AAGTGCGACG CCAAGTGCCA GACACCCCAG 901 GGCGCCATCA ACAGCTCCCT GCCCTTCCAG AACGTGCACC CCGTGACCAT 951 CGGCGAGTGC CCTAAGTACG TGCGGAGCGC CAAGCTGAGA ATGGTGACCG 1001 GCCTGCGGAA CATCCCCAGC ATCCAGAGCA GAGGCCTGTT TGGCGCCATT 1051 GCCGGCTTTA TCGAGGGCGG CTGGACCGGA ATGGTGGACG GGTGGTACGG 1101 CTACCACCAC CAGAATGAGC AGGGCAGCGG CTACGCCGCC GATCAGAAGT 1151 CCACCCAGAA CGCCATCAAC GGCATCACCA ACAAAGTGAA CAGCGTGATC 1201 GAGAAGATGA ACACCCAGTT CACCGCCGTG GGCAAAGAGT TCAACAAGCT 1251 GGAACGGCGG ATGGAAAACC TGAACAAGAA GGTGGACGAC GGCTTCCTGG 1301 ACATCTGGAC CTACAACGCC GAGCTGCTGG TGCTGCTGGA AAACGAGCGG 1351 ACCCTGGACT TCCACGACAG CAACGTGAAG AACCTGTACG AGAAAGTGAA 1401 GTCCCAGCTG AAGAACAACG CCAAAGAGAT CGGCAACGGC TGCTTCGAGT 1451 TCTACCACAA GTGCAACGAC GAGTGCATGG AAAGCGTGAA GAACGGCACA 1501 TACGACTACC CCAAGTACAG CGAGGAAAGC iJVGCTGAACC： GGGAGAAGAT 1551 CGACGGCGTG GATATCAGAT CTCTGGTGCC AAGAGGATCT CCAGGATCTG 1601 GATACATCCC AGAGGCTCCA AGAGATGGAC AAGCTTACGT GAGAAAGGAC 1651 GGAGAGTGGG TGCTGCTGTC TACTTTCCTG GGACACCACC ACCACCACCA 1701 CTAA (序列辨識編號：11) 產生自本發明去糖基化HA胜肽的疫苗具有對抗呼吸 •道病毒的抗病毒活性，包括呼吸融合病毒(RSV)和各型流感 48 201102084 病毒例如A型和B型流感病毒。本發明的抗病毒胜肽具有 對抗許多流感病毒株的有益抗病毒活性，包括季節性、禽(例 如H5N1株)和諸流感病毒。根據此處揭示的一些方法可預 防或治療被這些病毒感染造成的疾病。 (C) H1/HA蛋白上的糖基化位點 該流感HI HA分子具有四個不同的抗原區：、％、
Ca 和 Cb(Luoh SM 等人(1992)Hw/· 66 : 1066〜1073)。這 些位置包括自從1918年浮現以來已產生抗體介導免疫需求 之季卽性人類H1N1病毒的HA分子内大部分可變胺基酸。 利用凝集抑制(HI)檢測法及接種/攻毒試驗，已證明 2009年大流行H1N1病毒的抗原性類似流行於1918〜1943 年的人類H1N1病毒以及傳統豬H1N1病毒。已發現對抗類 1918年或傳統豬H1N1疫苗的抗體可完全保護C57B/6小鼠 對抗流感A/紐西蘭/602/2009分離病毒的致死性攻毒。增加 對抗1918或A/加州/04/2009 HA蛋白之交叉反應單株抗體 (mAbs)的被動免疫已發現可提供降低死亡率的完全保護作 用。藉由2009H1N1病毒篩選所產生之抗體逃避突變 株的分析指出抗原區Sa係其中一保留交叉保護表位 (]\4311^58&111}^等人；/>/<95尸加/2〇取似2010年1月/第6卷/ 第 1 期/el000745)。 藉由HA結構的同源模擬法已顯示2009 H1N1和1918 大流行病毒的HAs在已知抗原位點具有大量的共同胺基酸 殘基，而認為兩種用於中和抗體交又反應的具有共同 表位(Igarashi Μ等人；尸化夕2010年1月/第5卷/第1 期/e855^)。存在於ha上Asnl77殘基的一可能糖基化位點 係在該抗原性保留Sa區内(請看第19圖）。使用攜帶在布里 斯本H1之HA内之Asnl77糖基化位點的突變蛋白免疫小 鼠。測定對抗：NIBRG-121的交叉保護作用。 49 201102084 來自接種攜帶來自HI(布里斯本)Asnl77突變之單糖基 化HA(HAmg)的抗血清與在Asnl77攜帶突變之完全糖基化 HA(HAfg)和在Asnl77攜帶突變之未糖基化HA(HAug)比較 證明具有抑制NIBRG-121病毒凝集紅血球細胞的能力。來 自H1 (布里斯本)在Asn177攜帶突變的單糖基化HA (HAmg) 與在Asnl77攜帶突變之完全糖基化HA(HAfg)和在Asnl77 攜帶突變之未糖基化HA(HAug)比較證明具有較佳中和 NIBRG-121病毒感染mDck細胞的能力。單糖基化ha(布 里斯本)疫苗可保護BALB/c小鼠對抗NIBRG-121病毒的攻 毒。對照之下’在ASnl77攜帶突變之完全糖基化HA顯示 低或無對抗NIBRG-121病毒感染的交叉保護能力。 此處”治療活性”或"活性”指其與人類，或與非人類哺乳 動物或其他屬或生物中所欲治療效果一致的活性。可於體 内或體外測定該治療活性。例如，可於細胞培養内檢測該 所欲效力。 根據本發明揭示之疫苗的”抗病毒活性，，指疫苗被接種 生物體内所產生的-免疫反應，其巾該免疫反應足以預防 或改善與病毋感染有關例如一流感病毒的全面性病毒感染 及/或症狀。產生自本發明揭示之去糖基化故胜肽的疫苗 也月八有利於對抗流感病毒的顯著抗病毒活性。此處”顯著 抗病毒活性，，可藉由麵毒觀治療樣本比較該疫苗抑制 f ^驚。的病毒性凝集作用被啦。在某些具體實施例 ^〇抗病毒胜肽當與病毒模擬治療樣本比較時可抑制至 ^，、勺60%的病毒凝集個，更料至少約7()% 少約Γ% ’更佳為至少約_，職更佳為至少
技術;S毒=!:毒複製之抑制效應的方法已為 夕广―i 4 了於貫驗動物内證明本發明作為抗病毒郝J 2疫田，治严，果’例如利用小鼠模式(請看例如 ^ 人 J -/· 2006 第 80 卷第 24 號第 11960〜11967 頁）。1 201102084 外，本發明藥理上活性肽的治療效果可經由本領域中習知 的技術被呈現於人類。 本發明的中和抗體可被附加地用作為流感A病毒抗原 決疋區之抗原表位測定的一種工具，以及被用於疫苗的發 展。事實上，如下列實施例所述，發明者已於此處鑑定出 數種可被用於引導疫苗設計的廣效反應性中和抗體。 因此’本發明的中和抗體可被用於篩選可被抗體結合 之中和表位功能性核擬肽的胜肽或多肽，亦即其可被發展 成對抗A型流感病毒感染的疫苗。在一具體實施例中，本 發明提供一種有效對抗A型流感病毒的疫苗，其含有可被 此處所述抗體結合之中和表位功能性模擬肽的一胜肽或多 肽。f一具體實施例中，該疫苗含有可結合一血球凝集素 (HA)抗原結合抗體之中和表位功能性模擬肽的一胜肽或多 肽。在另-具體實施例巾，該疫苗可被合成。在其他具體 實施例中’該疫苗含有：⑴—減毒A型流感病毒，或其一 部分；或(u) —死毒A型流感病毒，或其一部分。在一其 他具體貫施例中，該疫苗含有可結合一血球凝集素(^)抗 原結，抗體之中和表位功能性模擬肽的一胜肽或多肽。該 HA抗原可為H5亞型或H1亞型。在另一具體實施例中， 該HA抗原被展示於a型流感病毒的表面。 流感病毒疫苗 流感H5 HA的N-糖基化位點序列被高度保留。該H5 ^。具有原型相N_X_(S/T)的總共15個N•糖基化位點。 各單體於位置N27、N39、N17G、N181和N5GG具有5個 N-糖基化位點。HA結構上的聚糖可影響宿主受體的結合。 H5 HA於位置39、127、170、181和500具有糖基化位點。 可利用流感病毒任何表面蛋白的部分糖基化版產生本 發明的疫苗’包括HA、NA和M2。該A型流感病毒神經 51 201102084 胺酸酶(ΝΑ)蛋白被呈現於其表面。A型流感病毒搬 係一種97個胺基酸的整合膜蛋白，其被表現於且 23個胺基酸殘基之細胞外N_端區、約19個芙之 水區以及54 _基之C_端胞質區的絲細胞表; SL 等人；，· 1988 年 8 月；62⑻·· 2762〜2772)。 此外’藉由改變於N-或〇-糖基化位點上用作為抗原 白的糖基化模式可產生該部分糖基化流感蛋白。 ’、 在另-具體實施例中，該疫苗的胜肽或多肽含有提高A 型流感病毒中和抗體的抗原決定區。 在-更常見的態樣中’該包括但不姆限於抗體的中和 分子被有效用於預防或治療病毒感染。因此，本發明的中 和分子被用於免疫療法，例如利用一或多種此類分子的被 動免疫，以及被用於發展針對該病毒抗原靶標的疫苗。 本發明提供用於預防和治療禽流感中和病毒感染的疫 苗組合物。雖然在80年前已知免疫血清的被動免疫可用於 預防感染(Luke，T.C.等人、Kilbane E.M.、Jackson J.L.和 Hoffinan S.L.(2006)v4w2. 舱^/ 145 : 599〜609) ’ 但是 最近單株抗體的研究亦極具價值(Hans〇n，Bj•等人(2〇〇6) 心㈣細.7 : 126 ; Huang，C.C.等人(2004)Ρ脱胸.乂_ •Scz. 101 : 2706〜2711 ; Simmons C.P.等人(2007) 户/os 施4 4^178)。例如，Hanson等人指出一針對H5N1病毒的單株 抗體於接種三天之後的小鼠即具有防止致死性感染的保護 (Hans〇n，Bj.等人(2006)办职y 及以 j : 126)。 基於毁滅性大流行的可能性，已建議政府應保持例如 此處所述中和抗體的庫存。已成功地被分離自對抗病毒感 染之個體的純人源化抗體具有其價值。然而，即使已庫存 此類的抗體，但是若編碼抗體結合表位的基因產生突變， 則可能降低該抗體的效力。同樣，已有一些證據顯示細胞 免疫可能加速該病毒的清除。儘管如此，若僅利用該被動 52 201102084 免疫效應降低感染嚴重性，則必需於此時間點使用其他免 疫效應細胞，其對於降低患有免疫不全、心血管疾^、呼 吸道糸統疾病和老年的病人而言極為重要。被動免疫可預 防對抗病毋快速增殖的細胞活素風暴(cytokine st〇rm)，其在 1918年流感爆發期間甚至發生於健康的年輕成人。 呼吸道融合病毒(RSV)疫苗 人類呼吸道融合病毒(RSV)係一種導致呼吸道感染的 病毒。其主要造成下呼吸道的感染以及嬰兒和孩童的院區 感染。RSV係一種副黏液病毒科以及肺炎病毒屬的封套 RNA病毒。目前無可使用的疫苗。 RSV病毒粒子含有三種表面糖蛋白F、G和SH(微疏水 性）。於病毒表面的F蛋白造成細胞附近之細胞膜的融合而 形成融合細胞(syncytia)。F(融合)和G(附著)糖蛋白的病毒必 需進入細胞内以及其亦決定抗體的反應。已闡明RSV的構 造和組合物以及詳述於Knipe，D.M.等人編輯"臨床病毒學'， 教科書，Lippincott Williams & Wilkins 紐約(2001)，特別指 第 45 章第 1443〜1485 頁，Collins, R、Chanock，R.M.和
Murphy, B.R.所著的”呼吸道融合病毒”一章。 具有33 kDa未糖基化的RSV G蛋白當被完全糖基化 (N-和0-連接糖基化)時約為90 kDa°F和G蛋白存在於RSV 感染細胞表面上的蛋白複合物(Low K.W.等人，所〇c/2em. 及烈· Comm. 366(2) : 2008, 308〜313)。 表6指出RSV糖蛋白G的序列具有劃底線的可能N-糖基化位點。 表6 RSV糖蛋白G多肽序列___
MSKNKDQRTT KTLEKTWDTL NHLLFISSCL YKLNLKSIAQITLSILAMII STSLIIAA1I 60 F1ASANHKVT LTTAIIQDAT SQIKNTTPTY LTQNPQLGIS FSNLSETTSQ TTTILASTTP 120 SVKSTLQSTT VKTKNTTTTKIQPSKPTTKQ RQNKPPNKPN NDFHFEVFNF VPCSICSNNP 53 201102084 180 TCWAICKRIP NKKPGKXTTT KPTKKPTIKT TKKDLKPQTT KPKEVPTTKP TEKPTINTTK 240 TNIRTTLLTN NTTGNPEHTS QKGTLHSTSS DGNPSPSQVY TTSEYLSQPP SPSNTTNQ 298 (序列辨識編號：12) 部分去糖基化RSV糖蛋白f和G可被用作為更有效的 RSV疫苗。 黃熱病毒疫苗 育熱病毒係屬於黃熱病毒科。黃熱病毒係 利用節肢動物例如蚊蟲傳播至其他脊髓動物宿主的小型、 封套RNA病毒’以及包括黃熱病(Ypv)、西尼羅河病毒 (WNV)、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒(JE)和登革熱2病毒 (Weaver SC ' Barrett AD, Nat. Rev. Microbiol 2 ： 789- 801, 2004)。黃熱病毒由三種結構蛋白所構成：核心核殼蛋白c 以及封最糖蛋白Μ和E。糖蛋白e係一種介導受體結合及 融合的第II類病毒融合蛋白。第η類病毒融合蛋白被發現 於黃熱病毒和阿爾發病毒。 糖蛋白Ε包含三種區域：區域j(雙聚合區)係一 8_股万 桶狀、區域11(中心區)係一由12個0股和2個^螺旋組成 的延伸區，以及區域ΙΠ(類免疫球蛋白區)係一具有1〇個冷 股的IgC-樣模塊。區域I和;q為相互纏繞。 病毒表面上的該495 AA糖蛋白E雙聚體當暴露於」 pH時不可逆地再聚集成融合三聚體，其如同内質體於酸十 環境内所發現者。三聚體的形成導致造絲露區域π职 環_型改變，其為藉由插人動贼使細胞_ 病毒套膜相互躺之融合步撕必需(Μ— γ等人，ρ似 施//· &/· USA，10G : 6989〜91 ; 200¾。 登革熱病毒封套蛋自⑻在Asn_67和%含有兩布 54 201102084 主要N-連接的糖蛋白位點。在大部分黃熱病毒保留於位置 153的糖基化位點，同時位置67的位點為登革熱病毒所特 有。黃熱病毒E蛋白上的N-連接募糖側鏈與病毒形態形 成、感染性和趨向性有關。登革熱病毒於位置67缺少N-糖基化而顯示降低對人類細胞的感染性(Mondotte JA等人， 巧>〇/· 81(3) : 7136〜7148(2007))。 表7指出該登革熱病毒糖蛋白E的序列具有在N-67和 N-153劃底線的可能N_糖基化位點。 表7登革熱病毒糖蛋白e多肽序列 _
MRCVGIGNRD FVEGLSGATW VDVVLEHGSC VTTMAKNKPT LDIELLKTEV TNPAVLRKLC 60 IEAKISNTTT DSRCPTQGEA TLVEEQDANF VCRRTFVDRG WGNGCGLFGK GSLLTCAKFK 120 CVTKLEGKIV QYENLKYSVI VTVHTGDQHQ VGNETTEHGT IATITPQAPM SEIQLTDYGA 180 LTLDCSPRTG LDFNEMVLLT MKEKSWLVHK QWFLDLPLPW TSGASTSQET WNRQDLLVTF 240 KTAHAKKQEV WLGSQEGAM HTALTGATEI QTSGTTTIFA GHLKCRLKMD KLTLKGVSYV 300 MCTGSFKLEK EVAETQHGTV LVQVKYEGTD APCKIPFSTQ DEKGVTQNGR LITANPIVTD 360 KEKPVNIETE PPFGESYIVI GAGEKALKLS WFKKGSSIGK MFEATARGAR RMAILGDTAW 420 DFGSIGGAFT SVGKLVHQVF GTAYGVLFSG VSWTMKIGIG ILLTWLGLNS RSTSLSMTCI 480 AVGMVTLYLG VVVQA 495 (序列辨識編號：13) 因此，登革熱病毒糖蛋白E的部分去糖基化可被用於 更有效地產生和廣泛對抗黃熱病毒的疫苗。第2ia〜b圖所 述模式中顯示獲得的登革熱3型病毒E蛋白雙聚體的部分 去糖基化。第21B圖顯示單糖基化登革熱£蛋白。 C型肝炎病毒(HCV)為人類輸血後感染及社區非A、非 B型肝炎感染的主要病原菌’其大約感染1%的全世界人 口。HCV係黃熱病毒屬中的一員，其包括黃熱病毒和瘟疫 病毒(Miller RH 和 Purcell RH，prac 施以如 87 : 2057〜2061 ; 1990)。 該C型肝炎病毒(HCV)基因組編碼兩個膜相關封套糖 55 201102084 蛋白(El和E2) ’其相互作用而形成一非共價鍵異源二聚複 合體。HCV糖蛋白E1和E2被N-連接糖基化所高度地修 飾。視HCV基因型該E1蛋白由192個胺基酸所組成以及 含有5至6個N-糖基化位點。視HCV基因型該E2蛋白由 363至370個胺基酸所組成以及含有9〜Π個N-糖基化位點 (M狀rtens G和Stuyver L，C型肝炎病毒的基因型和基因變 異於··病#姓开芡的分子髻學;Harrison T.J.和Zuckerman A.J. 編輯，1977)。 … 一項最近的研究披露當以内切糖苷酶Η部分糖基化時 僅利用分別在HCV糖蛋白Ε1之胺基酸位置196、209、234、 305和325的五個可能糖基化位點中的四個。於位置Ν2(ΐ96) 和Ν3(234)的突變在組合Ε1Ε2複合體上僅具有此微的效 應，反之於位置Nl(196)以及主要於位置Ν4(305)的突變可 戲劇性地降低形成非共價鍵Ε1Ε2複合體的效率(Meunier J.C.等人，』Ge;?· F?ra/.(1999)80 : 887-896)。 表8指出C型肝炎分離HC-J6封套糖蛋白E1的序列 在劃底線的位置196、209、234、305和325具有可能的 N-糖基化位點。 表8 C型肝炎病毒封套糖蛋白E1多肽序列
AEVKNISTGY MVTNDCTNDS ITWQLQAAVL HVPGCVPCEK VGNTSRCWIP VSPNVAVQQP 252 GALTQGLRTH IDMVVMSATL CSALYVGDLC GGVMLAAQMF IVSPQHHWFV QDCNCSIYPG 312 TITGHRMAWD MMMfWSPTAT MILAYAMRVP EVIIDIIGGA HWGVMFGLAY FSMQGAWAKV 372 VVILLLAAGV DA 384 (序列辨識編號：14) 因此，HCV糖蛋白E1和E2的部分去糖基化可被用於 更有效地產生和廣泛對抗HCV的疫苗。 人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗 56 201102084 ^類免疫缺陷病毒Ηΐν]和fflv_2及相關猿猴免疫缺 陷病毋(,siv)可造成其各自宿主的CD4'淋巴球破壞，此將導 致形成後天祕缺乏麵群(AIDS)。服#由病毒封套糖 蛋白的介f進人宿主細軸，其被_成展示於病毒粒子 表面上的寡聚合或可能三聚合的棘突。這些封套複合體 由gi>41跨膜封套糖蛋白被錨固於病毒套膜内。棘突的表^ 主要係由外部封套糖蛋白、gpl2〇 ,聯合各次單位三聚合 gp41糖蛋白複合體的非共價鍵相互作用所組成。 人類免疫缺陷1型(HIV-1)封套的gpl2〇和gp41糖蛋白 ，加天冬胺酸鹽(N)-連接多糖鏈(即聚糖)不僅為校正蛋白折 疊所必需’亦可提供對抗中和抗體作為”聚糖屏障”的保護作 用(=x等人，胸咖422 :307〜312,2003)。代表病毒與宿 主環扰之間主要介面之人類免疫缺陷病毒丨封套 的表面糖蛋白(gp 120)係目前已知最高度被糖基化的蛋白， 其接近一半的分子量歸因於添加N—連接聚糖(AIlan JS等人 ，7·⑼π 228 : 1091〜1094, 1985)。HIV-1封套的跨膜糖蛋白 (gp41)亦被糖基化，但較低的糖化程度。添加N—連接聚糖 為mv-l gpl20被折疊成可結合至CD4受體的適當構形所 必需，以及影響另類輔助受體CXCR4和CCR5的結合，該 結合效應可介導融合及HIV-1進入宿主細胞内。 由於許多N-連接聚糖係mv-i封套的高度保留成分， 其本身可提供用於中和抗體的一理想標的。該廣效中和性 人類單株抗體2G12結合至一含有附著至該卽12〇糖蛋白之 N-連接聚糖的表位(Trl〇ka a等人，j阶〇/ 7〇 : n〇〇〜^⑽ 1996)。N-連接糖基化位點已被實驗室地刪除或 的 购株對中和作用變得更為敏感(Koch等1上的3
Virology^ ： 387-400) 〇 ▲、成熟gpl20含有24個用於Ν·糖基化的可能位點，其辨 硪序列為 Asn-Xaa-Ser/Thr(Komfeld 和 Komfeld， 57 201102084 J5/oc/zem. 54 : 631〜664，1985)。表 9 指出 HTV-l HXB2 序列 内的24個位點。劃底線者為可能的N-糖基化位點。 表9 HIVgpl20多肽序列__ LWVTVYYGVP VWKEATTTLF CASDAKAYDT EVHNVWATHA CVPTDPNPQE WLVNVTENF 60 NMWKNDMVEQ MHEDIISLWD QSLKPCVKLT PLCVSLKCTD LK^DTNT^JSS SGRMIMEKGE 120 IKNCSFNIST SIRGKVQKEY AFFYKLDIIP IDNDTTSYKL TSCNTSVITQ ACPKVSFEPI 180 PIHYCAPAGF AILKCNNKTF NGTGPCTNVS TVQCTHGIRP WSTQLLLNG SLAEEEWIR 24 0 SVNFTDNAKT IIVQLNTSVE INCTRPNNNT RKRIRIQRGP GRAFVTIGKI GNMRQAHCNI 300 SRAKWNNTLK QIASKLREQF GNNKTIIFKQ SSGGDPEIVT HSFNCGGEFF YCNSTQLFNS 360 TWFNSTWSTE GSNNTEGSDT ITLPCRIKQI INMWQKVGKA MYAPPISGQI RCSSNITGLL 420 LTRDGGNSNN ESEIFRPGGG DMRDNWRSEL YKYKWKIEP LGVAPTKAKR RVVQREKR 478 (序列辨識編號：15) 在HIV-1跨膜糖蛋白gp41中，該保留糖蛋白位點位於 Asn621、Asn630 和 Asn642。 因此’ HIV封套蛋白卽12〇或跨膜蛋白gp41的部分去 糖基化可被用於更有效地產生和歧對抗黃熱病毒的疫 苗。所形成的部分去糖統HIV gP12〇蛋白三聚體示於第 20A〜B ®所描述的模型巾。第施關 gpl20蛋白三聚體。 mv 製造部分糖基化細胞表面糖蛋白的方法 如同慣用的自動寡核苦酸合成儀，藉如 輕易地製備本發明的多核苦酸;t片 段或變異株。同樣，藉由運用核酸 及八片 案讽胸咖Μ技術以及藉由^利 者-般已知的其他重組膽^ 域中技術 造用的重組載體。 將&取相導入重組製 及用發明一核酸的载體和宿主細胞，以 及用於k柄明之多肽的重魄術。本發明的载^包^ 58 201102084 嗟 巧製於任何類型細胞或有機體内者，包括例如 囷體士黏質體(cosmids)，以及迷你染色體。在各種具 發適=ί 體此通载體為技術中所習知以及可取得自市售商品。、 可結合全部或部分合成的本發明多核苷ϋ =分子和細胞生物學技術插人—載體内^括忒: 適虽限嫌和限觸:欠選顏錄紐進人—線性化 Ϊ 絲合酶_反應湘與多核紐各股互補的寡 Υΐϊ引子擴增本發明的多核賊。這些引子亦包括易於 ^殖入-載_限_切触點。該可複製細通常包 ^，但不侷限於-❹種下列的成分：—信號序列、一複 製起點，以及一或多種標記或選擇基因。 ，表現本發_乡肽，編碼該多肽或功能相等物的核 魏序列被插人-適當的表現載體，即含有用於轉錄和轉 ，該插入編碼序觸需元件賴體。_本領域技術者所 習知的方法構建含有編碼重要錄及適當轉錄和轉擇控制 ，元件之序列的表現載體。這些方法包括體外重組dna技 術、合成技術，以及體内基因重組。此類技術已述於例如 Sombwok]等人(观9) Molucular Cloning實驗室手冊，紐約 Plamview市冷泉港出版及Ausubd F M等人(1989)現行分子 兰物學貫·驗手册，johnWiley^Sons，紐約紐約市。 可利用許多表現載體/宿主系統被含於及表現多核苷酸 ^列。這些包括，但不侷限於微生物例如以重組嗟菌體、 夤體或黏質體DNA表現载體轉殖的細菌；以酵母表現載體 轉殖的酵母；感染病毒表現載體(桿狀病毒)的昆蟲細胞系 統，以病毒表現載體(例如花椰菜鑲嵌病毒、CaMV、菸草 鑲嵌病毒、TMV)或以細菌表現載體(例如Ή或pBR322質 體)轉殖的植物細胞系統；或動物細菌系統。 、 59 201102084 明。實際ί全'何啟料相均可制於本發 游約25至30個具有位於從轉錄起始位點上 為任何的核芽酸 ^CNCAAr區，該Ν αατααα序列，复可A=f核細胞基因的3,端係一 信號序列。全尾部加㈣編碼序列3,端的 物基===，通常較佳為使用來自哺乳動 主細胞相容時子:若此類啟動子與宿 111^ 肽。若m入Γ控制哺乳動物宿主細胞内表現載體的多 用呈右一、南ί】有編碼一多狀的多複本序列時，較佳為使 表;見#二二選?標記之根據SV40或EBV的載體。適當 τ t載體f 一貫施例為PCDNA-3.1(加州Carlsbad市 Iimtr^n公司），其包括一 CMy啟動子。 =的病毒表現系統可用於表現哺乳動物的多狀。例 用腺病毒作為一表現載體時，編碼標的多肽的序 列p皮接合入由晚期啟動子和三聯前導序列所組成的一腺 病毋轉錄/轉複合體内^插人病毒基@組的一非必需m或 E3f可被用於獲得在感染宿主細胞内能表現該多肽的一活 病毒(Logan，J.和 Shenk，τ (1984)户霞如· 81 : 3655〜3659)。此外，轉錄增強子例如勞氏肉瘤病毒(RSV)增 強子可被用於增強哺乳動物宿主細胞内的表現。 在細菌系統中’視表現多肽的用途選擇許多表現載體 中的任一種。例如，當需要大量時，使用易於純化之可高 201102084 度表現融合蛋白的載體。此類載 能大腸㈣和表贼體限於多功
ίίΖ和1序列序列框内的載體=ΐϊί =:載體(V一，WS M 二 BioL Chem. 2.64 . 5503^5509^ * M 肽S-轉移酶(GST)使用pGEX載^^ °^亦可以麩胱苷 八主H P 戟體(威斯康辛Madis〇n市 ，a A司)表現作為融合蛋白的外源多肽。通常，此類 正合蛋白為水溶性以及藉由吸附 :$ 透析可輕易地從 麟収包括肝素、凝鱗或因子 XA蛋白_裂位點，因而可從任 選殖的重要多肽。 ㈣樟出该、匕 在釀酒酵母菌(Sacch_nyces cer_.ae)中 ΪίΪ成ΐ或誘導型啟動子例如α因子、醇氧化酶和 的，體。其他用於酵母宿主之適#啟動子序列的實施例包 括磷酸甘油酸激酶或其他糖解_啟動子，例 甘油料顧脫氯酶、已糖激酶、丙明酸脫幾酶、 Μ酉义果糖泌酶、葡萄糖_6_磷酸異構酶、3_碟酸甘油酯變位 酶、"丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、罐酸葡萄糖異構酶， ^葡萄糖激酶。就評論而言請看Ausubel等人(同上)和Grant 等人(1987)她決〇办及砂/· n 516〜544。其他酵母為具 有生長條件控制轉錄之附加優點的誘導型啟動子包括用^ 醇去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關之 降解酵素、金屬硫蛋白(metallothionein)、甘油路_3·磷酸脫 氫酶，以及負責麥芽糖和半乳糖利用之酵素的啟動子區。 用於酵母表現的適合載體和啟動子進一步說明於Ep 73,657。在酵母中糖基化HCV表面蛋白的表現已揭示於 WO 96/04385。酵母增強子亦有利地與酵母啟動子共同使 61 201102084 用。 在使用植物表現載體的實例中，可藉由任何數目的啟 動子驅動編碼多肽之序列的表現。例如，可單獨使用病毒 啟動子例如CaMV的35S和19S，或結合來自TMV的ω前 導序列(Takamatsu，N.(1987)五J· 6 : 307〜311)。或者， 使用植物啟動子例如小亞單位RUBISCO或熱休克啟動子 (Coruzzi，G·等人(1984)五Μδα 3 : 1671 〜1680 ; Broglie, R. 專人(1984) iSWewce 224 : 838〜843 ;以及"Winter, J_等人(1991) 办抓/以/VoM 洗r. 17 : 85〜105)。這些構體可藉由直 接DNA轉殖或病原介導轉染被導入植物細菌。此類技術已 述於許多常見的文獻中(請看例如Hobbs, S.或Murry, L.E.於 McGraw所//荇學和技街卒鐵1992)紐:約州紐約市McGraw Hill 第 191 〜196 頁）。 亦使用一種昆蟲系統表現一標的多肽。例如，在一此 類系統中，使用苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)作為秋 黎義(Spodoptera frugiperda)細胞氟m竣幼备(jrich〇phlsia larvae)内表現外來基因的載體。編碼該多狀的序列被選殖入 該病毒的一非必需區如多角體蛋白(polyhedrin)基因，然後 受到多角體蛋白啟動子的控制。成功插入該多肽編碼序列 使該多角體蛋白基因不活化及產生缺乏外鞘蛋白的重組病 毒。該重組病毒然後被用於感染例如表現該標的多肽的秋 黏蟲細胞或擬尺礎幼蟲(Engelhard，E.K.等人(1994)戶rac Natl. Acad. Sci.9\ .. 3224〜322Ί)。 藉由控制各種糖苷酶組合的用途完成重組表面糖蛋白 的部分去糖基化，例如以神經胺酸酶移除唾液酸、以ad· ，露糖苷酶(Sigma)切斷外部甘露糖殘基，或以可有效地切 斷N-連接高甘露糖和複合聚糖之内F_N聚糖酶(德國 Mannheim市Boehringer Mannheim生物化學公司）的處理。 藉由併入&用於胜狀合成的方法例如胺基酸殘基及/或 62 201102084 胜肽片段偶合的傳統溶液以及必需的固相技術合成本發明 的HA胜肽。可使用技術中習知的任何方法合成該胜肽， 例如Schroeder和Lubke於第1卷校園版紐約 州紐約市第2〜128頁(1965) ; ”77^尸卬妨從：分#、合成、 兰物學”(E. Gross等人編輯)校園版紐約州紐約市第1〜8卷 (1979〜1987) ; Stewart和Young於”靣初歷傲合成"第2版， Pierce Chem. Co” Rockford, 111(1984); Wild 等人，Proc. 5W. USA，89:10537(1992);以及 Rimsky 等人,阶从， 72 : 986(1998) ; Chan & White 於”厨相展風合成..實 竣入尸f'，牛津大學出版(2〇〇〇)。在一些具體實施例中，可利 用糖基化胺基酸合成該糖肽而使糖基化胺基酸如 GlcNAc-Asn(加州Covington市V-Labs)被併入該胜肽的適 當糖基化位點。 本發明所揭示的疫苗可藉由局部、鼻内或腸道外如經 由皮下注射、肌肉内注射、靜脈注射、腹腔内注射或皮内 注射至溫血動物如人、馬、其他哺乳動鉍等的投藥被用作 ，一抗病毒劑。可單獨或混合使用該抗病毒肽。此外，可 單獨投與該抗病毒肽或作為進一步含有一或多種醫藥上可 接受載劑之組合物的-部分，其混合比例視雛肽的溶解 度及化學性質、所選擇投藥和鮮生物學投藥途徑而定。 =本發_胜肽可㈣病毒及/或細絲_蛋白以確保 二藥效’ $此於此類調配物_載劑必需不含或實質上益 (=如濃度高於90、95、98或99重量％)結合至該胜肽的& 醫藥組合物
根恶樣，本發明揭示的疫苗和去糖基化蛋白可 ^==或醫用營養組合物或含有熟習 I 頃本揭不時能辨識之其他活性劑、載劑、載體、^ 63 201102084 形劑或助劑的配製物内。 劑肽本Γϊϊ，的疫苗將有利地包含有效佐劑量的一佐 適漠声本賴之技術者所瞭解，補職胜肽的最 寺定胜肽、病人的特性、所使用的免疫. 示之㈣Γ^·/σ療或獅之病毒感染性質而定15熟習本揭 二 予和樂學領域的技術者可輕易地
“=劑肽最佳為投與可產生不導致任何村或U j讀艇性的濃度。—般而言，較佳為—有效佐劑量。 肽U佐劑量指對—經投與免疫原能產生免疫反應的佐劑 ^發明組合物内所含的適合佐劑包括技術中所習知 ϋ如t用於人類的佛氏完全佐劑(cfa)、佛氏不完全佐 1 _)、角鯊烯、角鯊烷、明礬和各種的油類，其全部已 中所習知並且可供應自市f的許多來源，例如來自 諾華藥廠(如MF59佐劑）。 ，醫藥或醫用營養組合物較佳為含有至少一種醫藥上 可接文載劑。在此類醫藥組合物中，該疫苗或去糖基化蛋 白=形成的"活性化合物，’亦被稱為"活性劑，，。此處所述的，， 醫藥上可巧受載劑”包括醫藥上可相容的溶劑、分散介質、 塗料、抗菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑等。補充活性 化合巧亦可被併入該組合物内。根據所欲的投藥途徑配製 一醫藥組合物。投藥途徑的實施例包括腸道外例如靜脈 内、皮内二皮下、口服(如吸入）、經皮(局部）、經黏膜，以 及直腸投藥。胁腸道外、皮内錢下投㈣溶液或懸浮 液包括下列的成分：滅菌稀釋液例如注射用水、食鹽溶液、 固疋油、聚乙二醇、甘油、丙二醇，或其他合成溶劑；抗 菌劑例如苯甲醇或對羥基苯曱酸曱酯；抗氧化劑例如抗壞 血酸或亞硫酸氫納；螯合劑例如四醋酸乙二胺(eDTA);緩 衝劑例如醋酸鹽、擰檬酸鹽或磷酸鹽以及用於調節張力的 64 201102084 物質例如氯化鈉或右旋糖。可利用酸 ϊ或ίϋ鈉。該腸道外製劑可被置於玻璃拋ίΐ; 同，或玻璃或塑膠製成的多劑量瓶内。 桊'卞 準藥適當醫藥上可接受載劑已述於標 柿ack出版公司(199())。適# 括水 '鹽水、右旋糖、甘油巧 ίί二i合。此外，若需要時雜合物可進一步含 抗病毒效果聊或魏#卜可域組合物之 無此ί的生物觀旨人類以及非人類靈細(例如大猩獲、 = 畜動物(例如羊、牛、馬、驢和豬）；伴但 ，物^如犬，’·實驗動物(例如小鼠、兔、大鼠、天竺 :生動物(例如狐、鹿）；以及可受益於本發明 ί 1生物。受胁本發賴揭_製劑並非限 的，一生物體不論其為人類或非人類生 物均I被稱為-患者、個體、動物、宿主，或接受者。 ΛΛ、/ί腸5外投藥而言’本發明所揭示的胜肽或其所產生 ^疫备可單獨或結合其他f藥上可接受載劑經由 靜脈内、 —_肌:内、腹腔内或皮内注射被投藥。就藉由注射投 桌車交佳為使用滅細水性载劑溶液内的抗病毒肽其亦 Iiΐ ΐ他溶質例如緩衝劑或防腐劑以及產生等張溶液的 Ϊ樂上可接受鹽或葡萄糖。本發明揭示的抗病毒肽可 被乂成技術中習知的治療上可接受鹽型。 ;、適合注射用的醫藥組合物包括滅菌水溶液(可溶於水） f用f臨時製備滅菌可注射溶液或分散液的分散和滅菌粉 末。就靜脈内投藥而言，適合載劑包括生理鹽水、抑菌水、 Cr^nophor EL(紐澤西州Parsippany市BASF公司）或磷酸鹽 緩衝液(PBS)。在任何情況下，該組合物必需為無菌並且為 65 201102084 保存於無微生物例條件下以及被 水、乙醇、多元醇二 ㈣)可適當混合物的溶劑或分散介ί ^乙二 需粒經以及持散體的所 苯f酸醋、氯丁醇、苯驗、抗壞mf讀劑例如對錄 等。在許多情況下，該袓人物二抑汞鈉(thimerosal) 聚合醇如甘絲醇、山魏劑，例如糖； 合物的吸收可葬由蔣或虱化鈉。延長可注射組 加入組合物内。9 ^遲吸收的例如單硬脂酸銘和明膠
滅菌可注射溶液的製備可藉由 ==其—列舉成分或其組合的S ί物二ΪΪίί.Ι常;1散液的製備可藉由將活二匕 -滅__ / 2介質和上述列舉所需其他成分的 中末製造滅菌可注射溶液的實例 :粉末力吐來自其先前滅菌過遽溶液的任何其:所= 釋劑° 口服組合物通常含有一惰性稀 Ϊϋ二 服治療的投藥目的而言，該活 劑及被製成㈣、喉旋或膠囊如明勝 物。殺載劑亦可製備用作為漱口液的口腔組合 八。^上Ϊ各黏合劑或佐劑材料亦可為該組合物的一部 i似性Ϊ的=、勝囊、喉鍵等可含有任何下列的成分或 V明狀·的δ物：—黏合劑例如微晶纖維素、黃箸樹膠 或腾如麟錄糖；-分解劑例如褐萍酸、 Primogd或玉麵粉；—顺_如硬驗鐵％處； 66 201102084 一滑動劑例如三氧化_體；一甜味劑例域糖或糖精； 或調味劑例如薄荷、曱基水揚酸或香橙調味粉。 由於本發明的胜肽和疫苗已顯示具有對抗呼吸道病毒 的活性’因此其亦可局雜被輸送至呼吸彡統例如進入畠 腔、鼻竇、竇膜或肺臟。該含有-或多種胜肽或疫苗的胜 狀、疫苗或醫藥組合物可藉由任何適當方法例如經由口腔 的吸人被輸送対吸系統。本發明組合物可為分散 私末或液體鼻侧、料液、滴鼻劑、—凝 由：輸管或導管，其可藉由注射器、paektailj 下ίϊΐ,ΐ肽或疫苗可以噴霧劑的方式被方便地 S供ίϊϊ加f組或噴霧器及一適當的推喷劑例如， 玆:===可藉由計量= :=有1_及-適當粉 鼻⑽製物的實施例及投藥方法請看PCT公 =和5，_8。藉由引述將後;=:專:荦 可含有:二各二霧;配物的推喷劑 t明的胜肽或疫苗可藉由噴;器等的;;==便 巾’該活性成分触為倾粒化而可 ^因而麵域分較㈣財低於觸微 一具體實施例中，-或多藉^也卡耗圍内的粒徑。在 例如鼻腔噴劑或吸入器的吸或裂入可經由 裝置内。 去輸达預扠及有效量胜肽的 亦可藉由經黏膜或經皮進行全雜投藥。就經黏膜或 67 201102084 經皮投藥而言，配製物内可使用適合滲透載劑的滲透劑。 此類滲透劑通常已為技術中所習知，以及包括例如用於經 黏膜投樂的清潔劑、膽鹽及褐徽酸(fluidic)衍生物。可透過 使用鼻内喷霧或栓劑完成經黏膜的投藥。就經皮投藥而 言’該活性化合物被配製成技術中所習知的藥膏、油膏、 凝膠或乳霜。該化合物亦可被製備成栓劑(例如與習知的栓 劑基質如可可脂和其他甘油脂)或用於直腸輸送的滯留灌腸 劑0 根據實施例，利用可保護該化合物避免迅速從體内被 清除的載劑製備該活性化合物例如一控釋配製丨勿包括植入 物及微膠囊化輸送系統。可使用生物可分解、生物相容性 聚合物例如乙烯醋酸乙酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、 聚原酸酯，及聚乳酸。熟習本領域之技術者將瞭解此類配 製物的製備方法。該材料可從市面上購自Alza公司及N〇va 製，公司。亦可使用微脂粒懸浮劑(包括乾向感染細胞之具 ，單株抗體對細胞特異性抗原的脂質體〕用料醫藥上可接 受載劑。其製備可根據本領域技術者所熟知的方法，例如 述於美國專利案號4,522,811，藉由引述將其併入於此。 口服或腸道外齡物紐縫配製辟侧型以便於 投藥及劑量的-雜。此處單位翻指適合用於被治療生 物體作為單-劑量的實體上分财位；各單位含有一預役 量以及併賴需醫__產生所欲治療效應的活性化; 物。 熟習本領域之技術者將瞭解此處所述 感，症狀的治療。可治療性或投 胜肽和疫苗。治療較佳為開始於感染或 能造成呼吸道病毒感染之病毒時或之 =至病毒不再出現或活動於呼吸道内為止。 。亥〉口療亦可開始於感染後、在該哺乳動物暴露於能 68 201102084 造成呼吸道病毒感染之病毒後，或已形成感染症狀之後。 將可進一步瞭解用於治療或預防流感之本發明抗病毒 肽數量不僅視所選擇特定胜肽亦仍需視投藥途徑、被治療 疾病，性質以及該病人的年齡和狀況而定，並且最後決定 於巡5乡醫生或獸醫的判斷。然而一般而言，適當劑量的範 圍為每天每財體重摘_至，毫克/公和較佳為在 〇.1至1〇〇毫克/公斤/天的範圍，以及最佳為在至μ毫 克/公斤/天的範圍。 該胜肽或疫苗的投藥可方便地利用單位劑型，例如每 ，位劑型含有1〇至15〇〇毫克，更佳為2〇至1〇〇〇毫克， 最佳為50至700毫克的活性成分，例如1毫克/公斤即75 毫克/75公斤體重。 疫苗内所含各流感病毒株的免疫原濃度係可誘發免疫 ，應而無·副作用的數量。此數量將視所使用免疫原和 ，、類型以及含於疫苗内的佐劑肽數量而不同。通常，當 f SRD測定時疫苗崎含免疫原的數量絲毫升從約^ =〇〇〇微克，更佳為每毫升從約3至約獨微克以及最佳 升從約1G至約15微克。在初次免疫之後，生物體 °在”後的適當铜接受—絲:欠的加強免疫。 了在細胞培養或實驗動物内依照標準藥學程序測定此 f、、且5物的毒性和治療效率，例如測定其LD50(族群中50% 的劑量}和ED4族群中5〇%產生治療效應的劑量}。毒 ’ 口治療效應之間的缝比為其治療減以及其可被表示 i可佳為使用具有高治療指數的化合物。雖 ;、、7使?具有毋性副翻的化合物，但是必需小心選擇僅 的未感染細胞位置之化合物因而可降低該副作用 於，ΒιΐΐΐΓ人類料職關量可糊獲得自細胞培養 檢測法及動物試驗_料。賴化合物_量較佳為在ί 69 201102084 範圍内。該劑量視所使用的劑 合物而言内。就用於本發明方法的任何化 二定内以達到包括在=3 的一循環血ί農戶大抑制症狀的受測化合物濃度） 人類中的有以更準確地測定 態層析法。 ' 漿中濃度，例如利用高效液 叫量，縣性齡物⑽射效量(即一有效 i 至100克/公斤體重的範圍，或顯Ξί 將瞭下f術者所瞭解的其他範圍。熟練之技士 時門，J月巨影響有效治療一生物體所需的劑量和 物於該疾病或障礙的嚴重度、先前療法、 該，，健康狀態或年齡，以及其他存在的疾病。 且體發明的範圍之下，τ顺根據本發明 儀H、設備、方法及其細結果。注意， 為了項者的方便標題或副標題可被用於實例中，但是其 ，限制本發明的範圍。此外，此處已建議和揭示某些理論； 然而’在不考慮任何特定理論或行動方案之下祇要本發明 ，根據本發明而執行時料論對錯與否德_本發明的 範圍。 實施例1 :構建用於ΗΑ表現的基因 流感Η5Ν1 ΗΑ序列係來自共有序列H5、CHA5 (Chen MW 等人（2008) /W.胸/_ 也以公,.lJSA 1〇5 : 13^8〜13543)。藉由利用人類密碼子最佳化用於表現CHA5 的密碼子。原始病毒蛋白酶切割位點KRG被 突變成PQRERG以避免蛋白被酵素切割形成HA j和 HA2。在HA構體的c端以附加殘基 (LVPR GiSPGSGYIPEAPRDGOAYVU ΐΓΓ>(}Ε wv 201102084 U^TFLQHHHHHH)取代該跨膜區(殘基:533〜555)，斜體 字為該凝血酶的切割點，劃底線者為噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列，以及粗體字者為His·標簽 (Stevens J.等人(2006) 312 : 404〜410)。經修飾 HA 序 列被選殖入pTT載體以供蛋白表現(Durocher Y等人 (2002)施30 : E9)。 實施例2 :蛋白的表現和純化 藉由利用乙烯亞胺以及被培養於補充以0.5%胎牛血清 的Freestyle 293表現培養基(Invitrogen公司加州Carlsbad市) 内將編碼分泌型HA的質體轉染入HEK293 EBNA(ATCC 編號CRL-10852)或GnTI-HEK293S細胞的人類胚胎腎細胞 株(Reeves PJ 等人(2002) Proa AM jcM 細·· USA 99 : 13419〜13424)。轉染72小時之後收集上清液以及藉由離心 使其澄清。利用如先前所述的鎳螯合層析法純化HA蛋白 (Wei CJ等人(2008)·/呀ό/. 82 : 6200〜6208)以獲得完全糖基 化HAfg及南甘路糖型ΗΑ^ιη。為獲得未經唾液酸修飾的HA 蛋白一該去唾液酸HAds—a 20毫克分子梭菌神經胺酸酶 (NA ; Sigma)在37°C將該純化蛋白處理2小時。於NA處理 之後’再一次純化該蛋白而從ΝΑ被分離。以Endo Η(ΝΈΒ) 在37°C將該純化ΗΑ^處理2小時以產生在糖基化位點具 有單一 GlcNAc的HA蛋白，即為單糖基化。以SDS PAGE、聚糖晶片以及質譜法(MS)分析全部的純化ha蛋白。 實施例3 :從糖蛋白釋出用於MS分析的N-聚糖 以10毫克分子二硫代蘇糖醇(DTT ; Sigma)在371將 該純化HA糖蛋白還原1小時。以5〇毫克分子礎乙酸胺 (IAA^Merck)在黑暗中將該還原樣本烷基化1小時以及藉 由雙蒸餾(ddH2〇)被脫鹽，然後在旋轉乾燥機内進行乾燥。 首先以胰蛋白酶(Roche)於50毫克分子碳酸氫敍的pH 8 3 缓衝液内以1 : 20(重量/重量)適當酵素對蛋白比例在3yc 201102084 將該經還原和烧基化HA蛋白萃取物消化4小時，接著再 以第二胰蛋白酶(Roche)消化，然後裝載於反向C18層析管 柱(Waters公司)上。以N-糖苷酶F(Roche)於50毫克分子的 pH 8.3碳酸氫銨内在37°C進一步將該樣本培養16小時，然 後以兩倍的N-糖苷酶F培養。藉由C18層析管柱程序將從 含有N-聚糖之胜肽/糖肽所分離的釋出N-聚糖收集流通部 分於 5%醋酸(AcOH)内。以 5% AcOH 於 20%、40%和 60% 1-丙醇内透析該胜肽。 實施例4 : MALDI-MS和MS/MS分析 利用NaOH/二曱亞砜漿法過曱基化全部的聚糖樣本。 在旋蓋玻璃瓶内將NaOH/DMSO漿混合乾燥聚糖樣本然後 瓶内加入300微升蛾甲院(Merck)，以及將玻璃瓶輕微振盪 2\分，。藉由逐滴加入〜1毫升ddH2〇終止該反應，然後加 入等3：的氯仿。將過甲基化聚糖萃取入底部有機層及藉由 ，複，取移除額外Na〇H和其他親水性污染物。藉 由氮氣蒸發氣仿。就聚糖圖譜而言，在乙腈内以】：^比例 混言過曱基化糖與1()毫*/毫升之5。％乙腈_ 2,5·二經 基苯曱酸(DHB)，細於加熱標糾肚，及卩〔麟結晶於 板上。於反射模式操作的ABj 47〇〇蛋白質分析儀(Applied Biosystems)上取得所需的資料。射出雷射(5赫；每頻譜發 射1 〇次i累積至當結合及穩定肖達到滿意的訊噪比 。在 TOF/ 〇F儀器上，人工獲得高能量CID MS/MS資料以及一般包 3在5〇〇〇〜5’設定雷射能之總共125次射注雷射的4〇次 箱諸。 實施例5 :聚糖晶片的製造 田法製備24翻於W的含魏酸聚糖，以^ H J ::曰片。從一 384_孔平板於塗佈玻片（Nexteri( 固陴SCH()TT公司)上藉由自觸(SMP3;TeleChe "示么3)/b積〜ο.?奈升之各種濃度含胺聚糖於點樣溶; 72 201102084 (300毫莫耳磷酸鹽緩衝液；pii 8 5 ;含〇 〇〇5% τ·η 2〇) 内進行晶片的印刷(BioDot; Cartesian科技公司）。該用於唾 液酸糖苷的玻片從各行具有12重複以水平放置於各次陣列 内的底至頂部沾有100微克分子濃度的其一聚糖丨〜17和 21〜27 ’以及各玻片被設計成可進行其他培養試驗的16網 格。使印製玻片在80%濕度的大氣下反應一小時接著乾燥 隔夜，以及在使用前將其儲存於室溫下的防潮箱内。在結 合試驗之前，以乙醇胺(50毫克分子乙醇胺於pH 9.2的硼酸 鹽緩衝液内）阻斷這些玻片然後以水和pH 74的PBS緩衝液 清洗兩次。 實施例6 :標示以Cy3-NHS酯的血球凝集素 以PBS(pH=7.4)將各HA蛋白樣本稀釋至1毫克/毫升 的終濃度’然後標示以Cy3MonoNHS酯(5微升，0.2毫克/ 毫升)(GEHealthcare，英國）。反應於冰上進行小時之後， 各試管内加入20微升的PBS内500毫克分子甘胺酸以冷卻 該反應。然後於冰上將該溶液再培養30分鐘。藉由將各溶 液通過具有30仟道耳頓切割分子量的尺寸排阻旋轉過濾器 (Microcon YM-30 ; Milipore公司美國)移除未反應染料分 子。為了獲得染料/蛋白質的比例，藉由利用]SlanoDrop ND-IOO分光光度計(美國NanoDrop科技公司）以用於在 奈米(蛋白質)及在552奈米(Cy3 ;莫耳消光係數為在此 波長的150,00 M'm-1)雙吸光測量的PBS稀釋標示蛋白的 各樣本。校正280奈米之CyDye吸光度(約8%在552奈米 的吸光度)的計算之後，從雙吸收測量的結果產生染料/蛋白 質的比例。 實施例7 :間接結合試驗 於0.0〇5% Tween 20/PBS的pH 7.4緩衝液内製傷ha 糖基化變體’以及加入以蓋玻片覆蓋聚糖晶片上的網格。
在加濕盒内振盪培養1小時之後，以0.005% Tween 20/PBS 73 201102084 的pH 7.4緩衝液將該玻片清洗三次。接著，將兔抗 HA抗體加至該玻片並且在加濕盒内培養1小時。在以 0.005% Tween 20/PBS緩衝液清洗三次之後，將Cy3·共輛山 羊抗兔IgG抗體加至該玻片並且在加濕盒内再培養1小 時。以0.05% Tween 20/PBS的pH 7.4緩衝液將該玻片清洗 三次；以PBS緩衝液清洗三次；及以水洗清三次，然後乾 燥。以微陣列螢光晶片判讀器(GenePix Pro 6.0 ; Molecular Devices公司)在595奈米(Cy3)掃描該玻片。 實施例8 :直接結合試驗 於 0.005% Tween 20/PBS 緩衝液(pH 7.4)内製備 HA 糖 基化Cy3-標示HA蛋白，以及加入以蓋玻片覆蓋聚糖晶片 上的網格。在加濕盒内振盈培養1小時之後，以0.005% Tween 20/PBS缓衝液(pH 7.4)將該玻片清洗三次；以PBS 緩衝液(pH 7.4)清洗三次；及以水洗清三次，然後乾燥。以 微陣列螢光晶片判讀器(GenePix Pro 6.0 ;美國Molecular Devices公司)在595奈米(Cy3)掃描該玻片。 實施例9:微量中和檢測法 以半數組織培養感染劑量(tcid5())定量該新鮮製備 H5N1(NIBRG-14)病毒(英國Potters Bar市國家生物製品檢 定所）。在96-孔平板内以等量混合1〇〇倍TCID50的病毒與 2倍序列稀釋的血清儲備液，以及在37。(：培養1小時。將 該混合物置於平板的MDCK細胞(每孔内含有1.5χ1〇4個細 胞)上’然後在37 C培養16〜20小時。以PBS清洗該細胞， 於丙酮/曱醇溶液(1 : 1的體積/體積)内固定，及以5〇/0脫脂 乳阻斷。以抗流感ANP(Sui JH等人(2009) 办⑽.Mo/. 及W· 16:265〜273)的mAb藉由間接ELISA偵測該病毒抗原。 實施例10 :小鼠、接種及攻毒 雌性6至8週齡BALB/c小鼠(數目=15)在第0和2週 以肌肉内免疫於50微升pH 7.4之PBS及混合50微升之1 201102084 毫克/亳升氫氧化鋁(Alum ; Sigma公司）内的20微克純化 1^每或HAmg蛋白。在免疫後第14天收集血液，及收集各 小鼠的血清樣本。以基因改造H5N1病毒NIBRG-14經由鼻 腔刺激以致死劑量(1〇〇倍的50%小鼠致死劑量)免疫該經免 疫小鼠。刺激後14天期間.每天監控該小鼠的存活率。利用 中央研究院委員會的動物實驗管理小組評估全部動物實 驗。 、 實施例11 :血球凝集素(HA)檢測 如 Jones 等人 J： q/* 阶〇/0砂 8〇(24): 11960〜11967 (2006) 中所述’在圓底96-孔微滴定盤内藉由pBS内病毒樣本的兩 倍，釋製備雞紅血球的血球凝集素(cRBCs; Lampire生物實 驗室，賓州Pipersville市）。以每50微升(j^U/犯微升)樣 本的血球凝集素單位表示其力價。 實施例12 :病毒i球凝集素的純化 改良如Johansson等人J· 阶咖取；1989第63(3)卷 第1239〜1246頁中所述從流感病毒顆粒純化病毒粒子相關 血球凝，素(HA)。簡言之，從感染雞蛋的尿囊液及如上述 純化的蔬糖收集病毒。將病毒粒再懸浮於0.5毫升的醋酸納 緩衝液(0.05克分子醋酸鈉、2毫克分子CaC1次2、〇 2毫克 分子EDTA，至pH 7.0)内，通過18號針頭均質化，以及混 量的醋酸鋼緩衝液内15%辛烷基葡糖苷(辛基_p_d_硫代 葡萄糖苷；Fisher科技公司，喬治亞州N〇rcr〇ss市），接著 激烈攪拌5分鐘。該懸浮液在4。(：以18,400 xg離心60分鐘， 然後1、心地移除上清液及保留富含部分。將2%含水鯨 犧基二曱基〉臭化錄(CTAB，Bio-World，俄亥俄州Dublin市） 加入該HA部分至0.1% CTAB的終濃度，以及將該樣本放 置於以含0.1%辛⑨基葡糖芽之0 〇5克分子Tris·鹽酸㈣7 5) 預％脹及平衡的DEAE-葡聚糖凝膠(a_5〇 ;瑞典Uppsala市 GEHealthcare公司）離子交換管柱(床，〇 7χ6 〇釐米）。藉由 75 201102084 具有低鹽HA .沖提液(0.05克分子Tris_Ha、〇 !克
NaCl、0.1% Triton χ·薦’至pH 7习以及再一次以高鹽似 冲長:液的重力收集20個0.5毫升鶴分物。藉由在非還原 件下的SDS_聚稱麟郷電泳法麟齡縣考馬斯藍' 染色法檢1個別餾分物的HA活性及分析純度。根據 商的指示藉由BCA檢測法測定蛋白質的濃度(伊利諾 Rockford 市 Pierce 公司）。 實施例13:晶片數據分析 使用GenePkPm軟體(Axon儀器公司)於擷取數據 光分析。從信號的各觀察點減去局部背景。從分析中 =0^卿缺陷、無可伽彳錄或淨螢光的贿點。從重 ϋ晶片内的”比值中數”。相同晶片於相同條 件下進订ΗΑ結合至晶片的分析(第2Α圖)以 測定(第2Β圖)以確保數據的常態化。 子關予數的 為測定尺…旧值，利用布售非線性回歸程 PRISM(Graph-Pad)，假設配體結合至一或兩個獨立位點， 藉由適配錄據等溫(絲式收_平衡結人 料。 °。貝 -種測里表面活性糖類數量的^係其最 度；（Ρ)係總ΗΑ蛋白濃度，以及KDsurf_係表 白之間的平衡麟常數。 ’、面糖類與該蛋 重複測量各樣本的尺…“值以及至少計算4欠以 {方裎式1} {方程式2} {方程式1}
Fobs = Fmax(P)/( KD)Surf + (P)) ^D.surf — KA>surf 1 Δ Gmuhi = RT /«(KA)Surf) 76 201102084 KA’surf代表方程式⑴中的結合常數。方程 ， R=1.987cal mol·1 K·1 ; T 兔绍#+、© 危 ^ — 1马絕對溫度，以及在298 K之下進 巧該試?。藉*湘微軟優算程式計算各樣本的這些值。 藉由單因子變異數分析（ANOVA)利用GraphPad ^^(GmP^>ad)進行不同似糖型之的統計分析。 實施例14 ·藉由ELISA測定血清内的jjA-特異性抗艟 從HEKf純化HA蛋白以及於96-孔平板(5微克/毫 升)上塗佈隔仪。將小鼠灰清10〇倍稀釋以作為用於另:八結 合測定的儲備血清。該塗佈HA平板與2倍系列稀釋的血 清培養1小時。藉由利用HRP_共軛抗小鼠抗體偵測HA—特 異性IgG。藉由選擇其讀取值高於免疫前丨：5〇稀釋血清的 稀釋值计算其稀釋終點(Stevens J等人(2006) 312 : 4〇4〜410)。藉由LTK生物實驗室製備來自兔的抗血清。藉 由混合完全或不完全佐劑之約〇_25〜0.35毫克的HA蛋白免 疫兔子。在六次免疫之後從該兔子收集血液，其程序為每2 週免疫一次。 實施例15: HA的糖基化位點分析 來自HI、H3和H5流感病毒的總共297株全長HA序 列係調用自美國國家生物技術中心(NCBI)資料庫以及藉由 EMBL-EBI的ClustalW2程式進行比對(Larkin MA等人 (2007) 油b 23 : 2947〜2948)。該序列數據係來自 1918至2000年代以及係分離自人類。為減少冗餘，在一國 家内僅選定一次用於分析的病毒株。用於比對的序列包 括：Η1(ΑΑΧ56530、AAY78939、ABA18037、ABB51962、 ABC42750、ABD60867、 ABD62061、ABE11690、 ABF47869、ABF82830、 ABF82852、ABG37362、 ΑΒΙ19015ΆΒΙ21211' ABI95294 ΆΒΙ96103 ΆΒΚ39995 -ABK57092、 ABK57093、ABK79970、AB032948、 77 201102084 ABO32970、ABR15885、ABS71664 和 ABS76427); H3(AAT08000、 AAT12654、AAX11455、AAY58320、 AAZ32943 > AAZ43394、ABA26700、ABA26777、 ABB51961 > ABB71825、ABC42596、ABC42607、 ABC42629、 ABC43017、ABD15713、ABD59850、 ABD61359、ABF17954、ABG37450 和 ABG37461); H5(AAS65618、AAT39065、AAT73273、AAT73274、 AAT73275、 AAT84153、AAV32636、ABC72655、 ABD28180、 ABD28182、ABE97624、ABI16504、 ABI36144、 ABI36439、ABO10181、AB036644 和 ABP51968)。藉由生物序列分析中心預測_ (www.cbs.dtu.dk/services/)預測 N-連接糖基化 HA 序列。就 天門冬胺酸(Asn)而言，含胺基酸模式Asn-Xaa-(Ser/Thr)的序 列’該Xaa可為除了脯胺酸之外的任何胺基酸(Gavel Y等人 (1990)Pro如五喂.3 : 433〜442)，繼之以絲胺酸或蘇胺酸。 藉由利用 PRISM 程式(GraphPad)和 Jalview(Waterhouse AM 等人(2〇〇9) 油.cs 25 : 1189〜1191)製備資料分析的 結果。 實施例16 :用於合成HA糖狀的化學方法 藉由二曱基硫磷酸混合酐法(Mpt-MA)進行HA糖肽的 逐步合成(Inazu，T等人(1997)於7妙5牟避傲化學(Kitada, C 編輯)第41〜44頁，蛋白研究基金會，大阪）。藉由用於队 糖基化但無糖鏈之具有一共同序列"Asn_X_ Ser/Thr"的硫酯 法可合成HA糖蛋白。藉由利用供應b〇c策略程式的自動 化合成儀製備肽片段。藉由利用DCC/HOBt作為活化試劑 進行偶合反應。藉由Mpt-MA法利用
Boc-Asn(GlcNAc)-OH(3 當量)偶合 Asn(GlcNAc)殘基。進行 1小時的偶合反應然後在監控下再重複一次。以含1〇%苯甲 78 201102084 醚的無水HF處理之後進行HPLC純化，可獲得糖肽硫酯。 此糖肽硫酯片段被偶合其他肽片段，其係藉由硫酯片段縮 合法被分開製備。在去保護及形成雙硫鍵之後，可獲得 GlcWAc-HA 類似物。 \ 或者’藉由肽基Asn之心羧基與糖基胺的偶合反應進 行收斂法合成HA糖肽（請看Cohen-Abisfeld，S.T.和 Lansbury, P.T.(1993) J. Am. Chem. Soc. 115 * 10531- 10537) 〇 實施例Π :用於合成ha糖肽的化學酵素法 藉由利用協同化學法的酵素法製備含複合寡糖的糖 肽。利用内切-β-Ν-乙醯基葡萄糖胺酶(end〇-p_Glc NAc_ase) 的轉糖杳活性進行N-糖狀的合成(Takegawa，K等人(1995) 如/· CTzem. 270 : 3094〜3099)。内切-β-Ν-乙醯基葡萄糖胺酶 水解Ν-連接养糖之ν，Ν'-二乙醯幾丁二糖基團間的糖苷 鍵以及將釋出寡糖片段轉移至一羥基化合物。以兩步驟 ，行endo-p-GlcNAc-ase的Ν-糖肽合成。首先，藉由化學途 徑製備含GlcNAc胜肽。然後藉由end〇_p_GlcNAc_ase的轉 糖基化反應將糖基化供體的—寡糖諸轉移至作為糖基化 受體的該糖肽之GlcNAc基團。 本發明雖然已於此處描述特定具體實施例以作為說明 ^目的’但是可騎各種敝良而獨離本發明的精神及 靶圍。因此，本發明非僅侷限於申請專利範圍附件。 …本發明雖然已配合其詳細描述做為說明，但是上述y 述僅為說明之目的而並雜制本發明申請專利範圍附^ 内其他態樣、優點和修改仍屬於申請專利範 科學文 案和已 熟習本領域技術者均可取得此處引證之專利和 獻所建立的知識。藉由引述將全部引證的美國 公告或未公告美國專利申請案併入於此。 79 201102084 卿此以供參考㈣輕錄餘示基因庫和 人全部其他祕 中，料參考陳佳具體例 化而仍彻^變 201102084 【圖式簡單說明】 ，下列附圖構成本專利說明書的一部分以及被用於 進-步說明本發崎揭示的某些祕，配合此處所示特 疋具體實施例的詳細說明藉由參考一或多種這些附圖 可更加瞭解本發明。本專利或申請文件含有至少一種以 顏色區別的附圖。在被要求及繳清所需費用之下承辦人 將提巧含顏色附圖之此專利或專利申請公開案的副本。 第1A〜1C圖為示意圖及具有不同糖基化HA的圓 二色譜。（第1A圖)具有不同糖基化ha蛋白的四種變 體：HAfg，HA(—種表現於HEK293E細胞内之具有典 型複合型N-聚糖的共有序列(Chen Mw等人(2〇〇8)pwc ΛΜ_ 也以 5W. USA 105 : 13538〜13543)) ; HAds，造成 從HAfg移除唾液酸的經ΝΑ處理HA ; ΗΑ^，表現於 GnTI-HEK293S細胞内之具有高甘露糖型N_聚糖的 HA ’以及HAmg ’僅在其N-糖基化位點具有gicnac 的經内切Η處理HA(第1B圖）。具有附著至其糖基 化位點之代表不同N-聚糖HAfg、HAds、HAh^o HAmg 的構造。產生灰色之具有蛋白資料庫識別碼2FK0 (Viet04HA)以及綠色之N-連接聚糖的蛋白構造。 全部 N-聚糖被 GlyProt(Bohne-Lang A 等人(2005) 33 : W214〜W219)所模型化，以及產 生 PyMOL 的圖形(www.pymol.org)。（第 ic 圖)HAfg、 HAd^HAhm和HAmg的圓二色譜證明具有類似次級結構 的四種不同糖基化HA蛋白。 第2A〜2B圖顯示具有不同糖基化HA的聚糖晶片 分析。（第2A圖)為HA變體HAfg、HAds、HA^和HAmg 的聚糖晶片分析。以顏色分類聚糖的相關鍵結，主要為 17α2,3唾液酸糖苷(黃)或7α2,6唾液酸糖苷(藍)。晶片 上聚糖的構造被示於第2Β圖。以對應〇；2,3唾液酸糖苦 81 201102084 1〜15之HA變體的KA，surf值表示HA變體HAfg、HAds、 ΗΑκπ^σ HAmg的結合常數。 第3圖顯示布里斯本HI ;最近HAs之加州Hi、 H3和H5 ;以及自從2000年之m、H3和H5的序列比 對分析。季節性流感HA係來自A/布里斯本/59/2007。 全球性流感HA係來自A/加州/07/2009。H5係來自a/ 越南/1203/2004〇H3係來自A布里斯本/1〇/2〇〇7=Η5ΗΑ 上的Ν-糖基化位點被示於紅色框内。該比對顯示出和 Η5 HAs之間於其Ν-糖基化位置具有類似性，反之Η3 則具有不同於HI和Η5的低保留糖基化位置。 第4A〜4F圖顯示歸因於糖或修飾對應不同糖基化 HAs之HA聚糖相互作用的結合能。藉由減去指定參考 t糖之AG值(標示於紅色框内；請看表S3)可獲得這些 值。（第4A圖)聚糖2、3、6和8〜10具有僅不同於非還 原端第三糖之雙糖聚糖1的相同主键。計算值以 證明改變第三糖的結合能差異。（第4B圖)聚糖1〇〜12 和15具有雙糖聚糖8但是不同線性延伸之糖構造或添 加一分枝糖的相同主鏈。（第4C圖）聚糖4和5具有三 糖聚糖3但是與非還原端不同分枝岩藻糖或第三位置 上硫酸根的相同主鏈。（第4D圖）聚糖6和7不同於聚 糖7非還原端之第三位置上的硫酸根。（第4E圖）聚糖 13和14為具有不同内糖變化的α2,3雙枝唾液酸糖 苷。(第4F圖)聚糖16和17為極少或未結合至ha的α 2,6唾液酸糖苷(編號21〜27)。 第5Α〜5D圖顯示作為疫苗之HAfg和HAmg的比 較。（第5A圖)利用ELISA分析來自HAfj〇 HAmg抗血 清之間，以及各種HAs的結合。與HAfg抗血清的比較 中’ HAmg抗血清顯示對H5(越南1194/2004和CHA5) 有較佳的結合。此外，該HAmg抗血清亦結合至hi(加 82 201102084 州 07/2009 和 WSN)。（第诏圖）H5N1_RG-14)病毒 與HAfg和11八吨抗血清的微量中和作用。與似运抗血 清的比較中，HAmg抗血清顯示對抗感染mdck細胞的 流感病毒具有較佳的中和活性(PiO.OOOi)。（第5C圖)對 抗H5N1病毒之致死劑量攻毒的疫苗保護作用。各注射 兩劑HAfg、HAmg和對照PBS的HA蛋白疫苗以免疫 BALB/c小鼠。以致死劑量H5N1 (NIBRG-14)病毒經鼻 攻毒該經免疫小鼠。攻毒後，記錄14天的存活率。（第 5D圖)藉由ELISA測定來自HAw之兔抗血清與不同 HAs的結合力。對抗HAmg之兔抗血清證明對H5(CHA5 和越南/1194)真有強結合力。此外，亦觀察與h5(安徽 和ID5/2005)和Hl(新喀里多尼亞/1999)的相互作用。
第6A〜6C圖顯示H5 HA蛋白的構建、純化及凝膠 過濾層析。（第6A圖)將編碼改變切割位點ha之胞外 域的DNA選殖入哺乳動物表現載體、pTT(Durocher Y 等人(2002) Nucl. Acids Res. 30 : E9)内，而使 HEK293
細胞培養有效分泌HA蛋白。HA的原始蛋白酶切割位 點被突變成PQRERG以避免ΗΑ0被處理成HA1和 HA2。為穩定HA蛋白的三聚體構型，其為噬菌體三聚 合片段的”foldon”序列被轉殖入該質體構體内，以及 His-標簽亦被加入純化用的COOH端。藉由表現載體的 瞬時轉染法進行HA蛋白的表現。（第6B圖）藉由 SDS/PAGE分析該經純化HA蛋白。Μ指示標記。第1 行：HAfg ’純化自293Ε細胞的ΗΑ ;第2行：HAds， 被HA消化的HAfg ;第3行：ΗΑ^，純化自293S細胞 的 HA(Reeves PJ 等人(2002) ito/. %·. USA 99 : 13419〜13424);第4行：HAmg ’被内切h消化的 HAhm。（第6C圖)藉由凝膠過濾層析法分析該經ha純 化蛋白。洗提峰顯示在凝膠過濾之後該HAfg三聚醴 83 201102084 >200kDa(紅色線)，該HAds三聚體>2〇〇kDa(黑色線）， 該HA—三聚體>2〇〇k〇a(藍線）’以及該似吨三聚體〉 180 kDa(綠色線)。該圖形代表與蛋白標記貼合之jja蛋 白的重疊洗提曲線(虛線）。 第7A〜7C圖顯示來自不同ha蛋白之全曱基化队 聚糖的質5晋儀分析。來自不同HA蛋白之全曱基化N-聚糖的MS分析。（第7A圖)MALDI-MS譜顯示表現自 HEK293E之HA的N-聚糖如主波峰偵測和表si列舉 的註釋包含主要為核心海藻糖化、雙枝、三枝和四枝複 合型Ν-t糖構造。根據組合物進行排列，其中僅少數 進一步藉由MS/MS分析獲得證實。各種程度的唾液酸 化為其主要特徵。（第7B圖)經NA的處理，無法再偵 測出全部被指定為唾液酸化N_聚糖的信號(例如 2605、3054、3503、3864、4226)，伴隨增加無唾液酸 化三枝和四枝構造的信號強度(„么2693、3142)，此與 唾液酸被完全移除相符合。（第7C圖）源自表現於
GnTIi-缺乏 HEK293S 株 HA 之 N-聚糖的 MALDI-MS 譜顯示主要為相當於在W/Z1579之Man5GlcNAc2的信 號，以及於糖基化過程中被不完全修剪之高甘露糖型的 N-聚糖小波峰（w/z 1783 至 2396 ；
Hex6HexNAc2-Hex9HexNAc2) ° 第8A〜8D圖顯示HA變體的MALDI-TOF分析。 HAfg的分子量為75186.343(第8A圖），似扣為 75290.023(第 8B 圖），HAh^ 69314.645(第 8C 圖），以 及 HAmg 為 63314.761 (第 8D 圖）。 第9圖顯示HA三聚體之全甲基化N_聚糖的 MALDI譜中所觀察到的主要分子離子的配置。 第10圖顯示對應α 2,3唾液酸糖苷1〜15之HA糖 基化變體的ΔΜ}，仟卡/莫耳。藉由從前者ha減去後 84 201102084 者的-G值可獲得最左攔的部分(例如，MG^HAfg (HAds) -△GOHAfg))。ND 表示未被測定。 第Π圖顯示對應HA變體之不同唾液酸糖苷配體 間之結合游離能的差異。以仟卡/莫耳表示其值。 藉由從前者HA減去後者HA的AG值可獲得最左欄的 部分(例如，MG(1—2)=AG(2) - AGCl))。ND 表示未被 測定。 第12圖顯示產生自完全糖基化、高甘露糖和單糖 基化H5 HA之抗血清對抑制越南1203HA假型病毒轉 導入HEK293細胞内的能力。高甘露糖和單糖基化]^ 抗血清均可抑制病毒的侵入，但是完全糖基化HA抗血 清則否。 第13A〜13B圖顯示兔HAfg和HAmg抗血清之血球 凝集分析的結杲。第13A圖顯示對m、H3和H5血球 凝集分析中之完全糖基化共有H5 HA抗血清的結果。. 第13B圖顯示單糖基化H5 HA抗血清的結果。該單糖 基化H5 HA抗血清不僅對H5亦對H1具有良好血球凝 集抑制活性。兩者抗企清對H3的血球凝集均無影響。 第14圖顯示與H3相比(〇.9A的均方根偏差 (RMSD))H5和H1的蛋白結構較為類似(2认的均方根 偏差(RMSD))。 第15A〜15C圖顯示利用單糖基化]^(布里斯本)HA 作為抗原可產生抑制NIBRG-121(2009年大流行A型 (H1N1)疫1¾株）的抗血清。第μα圖顯示 NIBRG-121(2009年大流行A型(H1N1)疫苗株)病毒對 抑制紅血球凝集的能力。第15B圖顯示 NIBRG:121(2009年大流行A型_1；)疫苗株)病毒對 抑制感染MDCK細胞的能力。第15C圖顯示balb/c 小鼠對感染MBRG-121(2009年大流行a型(Jjini)疫苗 201102084 株)流感病毒的保護作用。所使用的抗血清係來自經布 里斯本HA蛋白(5微克)免疫的小鼠以及該用於攻毒的 病毒係 NIBRG-121 (1 OOxLD%)。 第16A〜16C圖顯示產生自作為抗原之單糖基化 H1(布里斯本)HA的抗血清對WSN(H1N1)1933的抑制 作用。第16A圖顯示WSN(H1N1)1933病毒對抑制紅血 球凝集的能力。第16B圖顯示WSN(H1N1)1933病毒對 抑制感染MDCK細胞的能力。第16C圖顯示Balb/c 小鼠對感染WSN(H1N1)1933流感病毒的保護作用。所 使用的抗血清係來自經布里斯本HA蛋白(5微克)免疫 的小鼠以及該用於攻毒的病毒係 WSN(H1N1)1933(100xLD5。）。 第17A〜17C圖顯示產生自作為抗原之單糖基化 H1(布里斯本）HA的抗血清對a/波多黎各 /8/34(HlNl) : PR8的抑制作用。第17A圖顯示PR8病 毒對抑制紅血球凝集的能力。第17B圖顯示pR8病毒 對抑制感染MDCK細胞的能力。第17C圖顯示balb/c 小鼠對感染PR8流感病毒的保護作用。所使用的抗血 清係來自經布里斯本HA蛋白(5微克)免疫的小鼠以及 該用於攻毒的病毒係PR8(1 〇〇x ld5{〇。 ^第i8A〜18B圖顯示利用單糖基化m(2009年大流 fA型(H1N1)疫苗株；示於圖中的加州/2〇〇9輝作為 抗原可產生抑制WSN(HINI)的抗血清。S 18A圖顯示 WSN(H1N1)病毒對抑制紅血球凝集的能力。第18B圖 顯不WSN(HINI)病毒對抑制感染mdck細胞的能力。 第19圖顯示HI HA蛋白上糖基化位點的結構比 較。 θ第20圖顯示完全糖基化型(第2〇A圖)和單糖基化 型(第20B圖)的第3型登革熱病毒封套糖蛋白e雙聚 86 201102084 體。產生自GlyProt服務網具有4個 之PDB碼1UZG的模型。 b货。虫N-聚糖 第21圖顯示完全糖基化型（第 型（第21B圖）的人類免疫缺陷病f圖^皁^化 聚體。產生自每單聚體具有13個^、糖蛋白_0三 PDB碼2BF1的模型。 斯*啜合型N_聚糖之 87 201102084 序列表 <110> <120>預防流威病毒的免疫方法及组合物 <130〉 <150> US 61/164,385 <151> 2009-03-27 <150> US 61/164,387 <151> 2009-03-28 <150> US 61/164,388 <151> 2009-03-28 <150> US 61/164,389 <151> 2009-03-28 <150> US 61/313,676 <151> 2010-03-12 <160> 15 <170> Patentln3.5 版 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400〉 1
Pro Gin Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 201102084 <220> <223>合成序列 <400 2
Pro Gin Arg Glu Arg Gly 1 5 <210> 3 <211> 43 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 3
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr lie Pro Glu Ala Pro 15 10 15
Arg Asp Gly Gin Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu 20 25 30
Ser Thr Phe Leu Gly His His His His His His 35 40 <210> 4 <211> 564 <212> PRT <213> A型流感病毒 <400〉 4
Met Glu Lys lie Val Leu Leu Phe Ala lie Val Ser Leu Val Lys Ser 15 10 15
Asp Gin lie Cys lie Gly Ser His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gin Val 20 25 30
Asp Thr lie Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gin Asp lie 35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 2 201102084
Pro Leu lie Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe lie Asn Val Pro Ghi Trp Ser Tyr He Val 85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg lie Asn His Phe Glu 115 120 125
Lys lie Gin lie De Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gin Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu lie Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr lie 165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190
Gly lie His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr Lys Leu Tyr Gin 195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr lie Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg 210 215 220
Leu "Val Pro Lys lie Ah Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gin Ser Gly 225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr He Leu Lys Pro Asn Asp Ala He Asn 245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe lie Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie 260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr lie Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gin Thr Pro Met Gly Ala lie Asn Ser Ser 290 295 300
Met Pro Phe His Asn He His Pro Leu Thr lie Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 201102084 325 330 335
Pro Gin Arg Glu Arg Gly Leu Phe Gly Ala He Ala Gly Phe lie Glu 340 345 350
Gly Gly Tip Gin Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser 355 360 365
Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gin Lys 370 375 380
Ala lie Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser lie lie Asp Lys Met 385 390 395 400
Asn Thr Gin Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg 405 410 415
Arg lie Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val 420 425 430
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr 435 440 445 .Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg 450 455 460
Leu Gin Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu 465 470 475 480
Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly 485 490 495
Thr Tyr Asp Tyr Pro Gin Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu 500 505 510
Glu lie Ser Gly Val Asp lie Arg Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro 515 520 525
Gly Ser Gly Tyr lie Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin Ala Tyr Val 530 535 540
Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His His 545 550 555 560
His His His His <210> 5 <211> 1695 201102084
<212> DNA <213> A型流感病毒 · <400〉5 atggagaaga tcgtgctgct gttcgccatc gtgagcctgg tgaagagcga ccagatctgc 60 atcggatccc acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccatcatgga gaagaacgtg 120 accgtgaccc acgcccagga catcctggag aagacccaca acggcaagct gtgcgacctg 180 gacggcgtga agcctctgat cctgagagac tgcagcgtgg ccggctggct gctgggcaac 240 cctatgtgcg acgagttcat caacgtgcct gagtggagct acatcgtgga gaaggccaac 300 cctgccaacg acctgtgcta ccctggcgac ttcaacgact acgaggagct gaagcacctg 360 ctgagcagaa tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ctaagagcag ctggagcagc 420 cacgaggcca gcagcggcgt gagcagcgcc tgcccttacc agggcaagag cagcttcttc 480 agaaacgtgg tgtggctgat caagaagaac agcacctacc ctaccatcaa gagaagctac 540 aacaacacca accaggagga cctgctggtg ctgtggggca tccaccaccc taacgacgcc 600 gccgagcaga ccaagctgta ccagaaccct accacctaca tcagcgtggg caccagcacc 660 ctgaaccaga gactggtgcc taagatcgcc accagaagca aggtgaacgg ccagagcggc 720 agaatggagt tcttctggac catcctgaag cctaacgacg ccatcaactt cgagagcaac 780 ggcaacttca tcgcccctga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc 840 atgaagagcg agctggagta cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc tatgggcgcc 900 ateaacegea gcatgecttt ccacaacatc caccctctga ccatcggcga gtgccctaag 960 tacgtgaaga gcaacagact ggtgctggcc accggcctga gaaacagccc tcagagagag 1020 agaggcctgt tcggcgccat cgccggcttc atcgagggcg gctggcaggg catggtggac 1080 ggctggtacg gctaccacca cagcaacgag cagggcagcg gctacgccgc cgacaaggag 1140 agcacccaga aggccatcga cggcgtgacc aacaaggtga acagcatcat cgacaagatg 1200 aacacccagt tcgaggccgt gggcagagag ttcaacaacc tggagagaag aatcgagaac 1260 ctgaacaaga agatggagga cggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc cgagctgctg 1320 gtgctgatgg agaacgagag aaccctggac ttccacgaca gcaacgtgaa gaacctgtac 1380 201102084 1695 gacaaggtga gactgcagct gagagacaac gccaaggagc tgggcaacgg ctgcttcgag 1440 ttctaccaca agtgcgacaa cgagtgcatg gagagcgtga gaaacggcac ctacgactac 1500 cctcagtaca gcgaggaggc cagactgaag agagaggaga tcagcggcgt ggatatcaga 1560 tctctggtgc caagaggatc tccaggatct ggatacatcc cagaggctcc aagagatgga 1620 caagcttacg tgagaaagga cggagagtgg gtgctgctgt ctactttcct gggacaccac 1680 caccaccacc actaa <210> 6 <211> 567 <212> PRT <213> A型流感病毒 <400〉 6
Met Lys Ala lie Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 15 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val 50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn lie Ala Gly Trp lie Leu Gly 65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr lie 85 90 95
Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 201102084
He Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin ieu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125
Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140 160
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155
Phe Tyr Lys Asn Leu lie Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro 165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr lie Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190
Leu Trp Gly lie His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gin Gin Ser Leu 195 200 205
Tyr Gin Asn Ala Asp Ala Ίγτ Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser 210 215 220 240
Lys Lys Phe Lys Pro Glu lie Ala lie Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin 225 230 235
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys 245 250 255 lie Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly lie lie lie Ser Asp Thr Pro 275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gin Thr Pro Lys Gly Ala lie Asn 290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gin Asn He His Pro lie Thr lie Gly Lys Cys 7 201102084 305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg 325 330 335
Asn lie Pro Ser lie Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly 340 345 350
Phe lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365
His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser 370 375 380
Thr Gin Asn Ala lie Asp Glu lie Thr Asn Lys Val Asn Ser Val lie 385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His 405 410 415
Leu Glu Lys Arg lie Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430
Leu Asp He Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460
Lys Val Arg Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu lie Gly Asn Gly 465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val 485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu 500 505 510 8 201102084
Asn Arg Glu Glu lie Asp Gly Val Asp lie Arg Ser Leu Val Pro Arg 515 520 525
Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr lie Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin 530 535 540
Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Yal Leu Leu Ser Thr Phe Leu 545 550 555 560
Gly His His His His His His 565 <210〉7 <211> 1720 <212> DNA <213> A型流感病毒 <400〉 7 atggcgcgcc gctagcatga aggccatcct ggttgtgctg ctgtacacct tcgctaccgc 60 caacgccgat accctgtgca tcggctacca cgccaacaac agcaccgaca ccgtggatac 120 cgtgctggaa aagaacgtga ccgtgaccca cagcgtgaac ctgctggaag ataagcacaa 180 cggcaagctg tgcaagctga gaggcgtggc ccctctgcac ctgggcaagt gcaatatcgc 240 cggctggatc ctgggcaacc ccgagtgcga gagcctgagc accgccagca gctggtccta 300 catcgtggag acacccagca gcgacaatgg cacctgttac cccggcgact tcatcgacta 360 cgaggaactg cgggagcagc tgagcagcgt gtccagcttc gagcggttcg agatcttccc 420 caagaccagc tcttggccca accacgacag caacaagggc gtgaccgccg cctgtcctca 480 cgctggcgcc aagagcttct acaagaacct gatctggctg gtcaagaagg gcaacagcta 540 ccccaaactg agcaagagct acatcaacga caagggcaaa gaagtgctgg tgctgtgggg 600 catccaccac cctagcacca gcgccgacca gcagagcctg taccagaacg ccgacgccta 660 cgtgttcgtg ggcagcagcc ggtacagcaa gaagttcaag cccgagatcg ccatcagacc 720 caaagtgcgg gaccaagagg gccggatgaa ctactactgg accctggtgg agcccggcga 780 9 201102084 caagatcacc ttcgaggcca ccggcaatct ggtcgtgccc agatacgcct tcgccatgga 840 aagaaacgcc ggcagcggca tcatcatcag cgacaccccc gtgcacgact gcaacaccac 900 ctgtcagacc cccaaaggcg ccatcaacac cagcctgccc ttccagaaca tccaccccat 960 caccatcggc aagtgcccta agtacgtgaa gtctaccaag ctgaggctgg ccacaggcct 1020 gcggaacatc cccagcatcc agagcagagg cctgtttggc gccattgccg gctttatcga 1080 gggcggctgg accggaatgg tggatggatg gtatggctac caccaccaga atgagcaggg 1140 aagcggctac gccgccgacc tgaagtccac acagaacgcc atcgacgaga tcaccaacaa 1200 agtgaactca gtgatcgaga agatgaacac ccagttcacc gccgtgggca aagaattcaa 1260 ccacctggaa aagcggatcg agaacctgaa caagaaggtg gacgacggct tcctggacat 1320 ctggacctac aacgccgagc tgctcgtgct gctggaaaac gagcggaccc tggactacca 1380 cgactccaac gtgaagaatc tgtacgagaa agttcgctcc cagctgaaga acaacgccaa 1440 agagatcggc aacggctgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacacct gtatggaaag 1500 cgtgaagaac ggcacctacg actaccccaa gtacagcgag gaagccaagc tgaaccggga 1560 agagatcgac ggcgtggata tcagatctct ggtgccaaga ggatctccag gatctggata 1620 catcccagag gctccaagag atggacaagc ttacgtgaga aaggacggag agtgggtgct 1680 gctgtctact ttcctgggac accaccacca ccaccactaa 1720 <210> 8 <211> 567 <212> PRT <213> A型流感病毒 <400〉8
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyi-15 10 15
Ala Asp Thr lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30
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Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly lie 50 55 60
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Leu Trp Gly Val His His Pro Pro Asn lie Gly Asp Gin Arg Ala Leu 195 200 205
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Arg Arg Phe Thr Pro Glu lie Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin 225 230 235 240
Glu Gly Arg lie Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 lie lie Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu He Ala Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270
Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly lie 11ε Thr Ser Asn Ala Pro 275 280 285
Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala lie Asn 290 295 300 201102084
Ser Ser Leu Pro Phe Gin Asn Val His Pro Yal Thr lie Gly Glu Cys 305 310 315 320
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Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr lie Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin 530 535 540
Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 12 201102084 545 550 555 560
Gly His His His His His His 565 <210> 9 <211> 1704 <212> DNA <213> A型流感病毒 <400> 9 atgaaggtga aactgctggt gctgctgtgc accttcaccg ccacctacgc cgacaccatc 60 tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gacaccgtgg ataccgtgct ggaaaagaac 120 gtgaccgtga cccacagcgt gaacctgctg gaagatagcc acaacggcaa gctgtgcctg 180 ctgaagggca ttgcccccct gcagctgggc aactgtagcg tggccggctg gattctgggc 240 aaccccgagt gcgagctgct gatcagcaaa gagtcctggt cctacatcgt ggagacaccc 300 aaccccgaga acggcacctg ttaccccggc tacttcgccg actacgagga actgagagag 360 cagctgtcct ctgtctccag cttcgagcgg ttcgagatct tccccaaaga gagcagctgg 420 cccaaccaca ccgtgacaaa gggcgtgagc gccagctgct cccacaatgg caagagcagc 480 ttctaccgga acctgctgtg gctgaccggc aagaacggcc tgtaccccaa cctgagcaag 540 agctatgcca acaacaaaga gaaagaggtc ctcgtcctct ggggcgtgca ccaccccccc 600 aacatcggcg accagcgggc cctgtaccac accgagaacg cctacgtgtc cgtggtgtcc 660 agccactaca gcagacggtt cacccccgag atcgccaaga ggcccaaagt gcgggaccag 720 gaaggccgga tcaactacta ctggaccctg ctggaacccg gcgacaccat catcttcgag 780 gccaacggca acctgatcgc ccccagatac gcctttgccc tgagcagagg cttcggcagc 840 ggcatcatca ccagcaacgc ccccatggac gagtgcgacg ccaagtgtca gaccccccag 900 ggcgccatca acagcagcct gcccttccag aacgtgcacc ccgtgaccat cggcgagtgc 960 cctaagtacg tgcggagcac caagctgaga atggtgaccg gcctgcggaa catccccagc 1020 atccagagca gaggcctgtt tggcgccatt gccggcttta tcgagggcgg ctggaccgga 1080 13 201102084 atggtggacg ggtggtacgg ctaccaccac cagaatgagc agggcagcgg ctacgccgcc 1140 gatcagaagt ccacccagaa cgctatcaac ggcatcacca acaaagtgaa cagcgtgatc 1200 gagaagatga acacccagtt caccgccgtg ggcaaagagt tcaacaagct ggaacggcgg 1260 atggaaaacc tgaacaagaa ggtggacgac ggcttcctgg acatctggac ctacaacgcc 1320 gagctgctgg tcctgctgga aaacgagcgg accctggact tccacgacag caacgtgaag 1380 aacctgtacg agaaagtgaa gtcccagctg aagaacaacg ccaaagagat cggcaacggc 1440 tgcttcgagt tctaccacaa gtgcaacgac gagtgcatgg aaagcgtgaa gaacggcaca 1500 tacgactacc ccaagtacag cgaggaaagc aagctgaacc gggagaagat cgacggcgtg 1560 gatatcagat ctctggtgcc aagaggatct ccaggatctg gatacatccc agaggctcca 1620 agagatggac aagcttacgt gagaaaggac ggagagtggg tgctgctgtc tactttcctg 1680 ggacaccacc accaccacca ctaa 1704 <210> 10 <211> 567 <212> PRT <213> A型流感病毒 <400> 10
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15
Ala Asp Thr lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly lie 50 55 60
Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp lie Leu Gly 65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu lie Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr lie 85 90 95
Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly His Phe 14 201102084 100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125
Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140
Thr Yal Thr Gly Val Ser Ala Ser Gys Ser His Asn Gly Glu Ser Ser 145 150 155 160
Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro 165 170 175
Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val 180 185 190
Leu Trp Gly Val His His Pro Pro Asn lie Gly Asp Gin Lys Ala Leu 195 200 205
Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser 210 215 220
Arg Lys Phe Thr Pro Glu lie Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin 225 230 235 240
Glu Gly Arg lie Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 lie lie Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu lie Ala Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270
Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly lie lie Asn Ser Asn Ala Pro 275 280 285
Met Asp Lys Cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala lie Asn 290 295 300
Ser Ser Leu Pro Phe Gin Asn Val His Pro Val Thr lie Gly Glu Cys 305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335
Asn He Pro Ser lie Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly 340 345 350
Phe lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Yal Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 15 201102084
His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys Ser 370 375 380
Thr Gin Asn Ala lie Asn Gly lie Thr Asn Lys Val Asn Ser Val He 385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys 405 410 415
Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430
Leu Asp lie Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460
Lys Val Lys Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu lie Gly Asn Gly 465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510
Asn Arg Glu Lys lie Asp Gly Yal Asp lie Arg Ser Leu Val Pro Arg 515 520 525
Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr lie Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin 530 535 540
Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 545 550 555 560
Gly His His His His His His 565 <210> 11 <211> 1704 <212> DNA <213> A型流感病毒 <400 11 16 201102084 atgaaggtga aactgctggt gctgctgtgc accttcaccg ccacctacgc cgacaccatc 60 tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gacaccgtgg ataccgtgct ggaaaagaac 120 gtgaccgtga cccacagcgt gaacctgctg gaagatagcc acaacggcaa gctgtgcctg 180 ctgaagggca ttgcccccct gcagctgggc aactgtagcg tggccggctg gattctgggc 240 aaccccgagt gcgagctgct gatctccaaa gagtcctggt cttacatcgt ggagacaccc 300 aaccccgaga acggcacctg ttaccccggc cacttcgccg actacgagga actgcgggag 360 cagctgagca gcgtgtccag cttcgagcgg ttcgagatct tccccaaaga gagcagctgg 420 cccaaccacg ataccgtgac cggcgtgagc gccagctgtt cccacaacgg cgagagcagc 480 ttctaccgga acctgctgtg gctgaccggc aagaacggcc tgtaccccaa cctgagcaag 540 agctatgcca acaacaaaga gaaggaagtc ctggtcctct ggggcgtgca ccaccccccc 600 aacatcggcg accagaaggc cctgtaccac accgagaacg cctacgtgtc cgtggtgtcc 660 agccactaca gccggaagtt cacccccgag atcgccaaga ggcccaaagt gcgggaccag 720 gaaggccgga tcaactacta ctggaccctg ctggaacccg gcgacaccat catcttcgag 780 gccaacggca acctgatcgc ccccagatac gcctttgccc tgagcagagg cttcggcagc 840 ggcatcatca acagcaacgc ccccatggac aagtgcgacg ccaagtgcca gacaccccag 900 ggcgccatca acagctccct gcccttccag aacgtgcacc ccgtgaccat cggcgagtgc 960 cctaagtacg tgcggagcgc caagctgaga atggtgaccg gcctgcggaa catccccagc 1020 atccagagca gaggcctgtt tggcgccatt gccggcttta tcgagggcgg ctggaccgga 1080 atggtggacg ggtggtacgg ctaccaccac cagaatgagc agggcagcgg ctacgccgcc 1140 gatcagaagt ccacccagaa cgccatcaac ggcatcacca acaaagtgaa cagcgtgatc 1200 gagaagatga acacccagtt caccgccgtg ggcaaagagt tcaacaagct ggaacggcgg 1260 atggaaaacc tgaacaagaa ggtggacgac ggcttcctgg acatctggac ctacaacgcc 1320 gagctgctgg tgctgctgga aaacgagcgg accctggact tccacgacag caacgtgaag 1380 aacctgtacg agaaagtgaa gtcccagctg aagaacaacg ccaaagagat cggcaacggc 1440 tgcttcgagt tctaccacaa gtgcaacgac gagtgcatgg aaagcgtgaa gaacggcaca 1500 17 201102084 tacgactacc ccaagtacag cgaggaaagc aagctgaacc gggagaagat cgacggcgtg gatatcagat ctctggtgcc aagaggatct ccaggatctg gatacatccc agaggctcca agagatggac aagcttacgt gagaaaggac ggagagtggg tgctgctgtc tactttcctg ggacaccacc accaccacca ctaa > > > > 0 12 3 11 11 11 11 <2<2<2<2 1560 1620 1680 1704 12 298
PRT 人呼吸道融合病毒 <400> 12
Met Ser Lys Asn Lys Asp Gin Arg Thr Thr Lys Thr Leu Glu Lys Thr 15 10 15
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe lie Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30
Leu Asn Leu Lys Ser lie Ala Gin lie Thr Leu Ser lie Leu Ala Met 35 40 45
He lie Ser Thr Ser Leu lie lie Ala Ala lie lie Phe lie Ala Ser 50 55 60
Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Ala lie lie Gin Asp Ala Thr 65 70 75 80
Ser Gin lie Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gin Asn Pro Gin 85 90 95
Leu Gly He Ser Phe Ser Asn Leu Ser Glu Thr Thr Ser Gin Thr Thr 100 105 110
Thr lie Leu Ala Ser Thr Thr Pro Ser Val Lys Ser Thr Leu Gin Ser 115 120 125
Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Lys lie Gin Pro Ser 130 135 140
Lys Pro Thr Thr Lys Gin Arg Gin Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn 145 150 155 160
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser lie Cys 165 170 175 18 201102084
Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala lie Cys Lys Arg lie Pro Asn Lys 180 185 190
Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr lie 195 200 205
Lys Thr Thr Lys Lys Asp Leu Lys Pro Gin Thr Thr Lys Pro Lys Glu 210 215 220
Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Lys Pro Thr lie Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240
Thr Asn De Arg Thr Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255
Glu His Thr Ser Gin Lys Gly Thr Leu His Ser Thr Ser Ser Asp Gly 260 265 270
Asn Pro Ser Pro Ser Gin Val Tyr Thr Thr Ser Glu Tyr Leu Ser Gin 275 280 285
Pro Pro Ser Pro Ser Asn Thr Thr Asn Gin 290 295 <210> 13 <211> 495 <212〉PRT <213>登革熱病毒 <400> 13
Met Arg Cys Val Gly lie Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15
Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp lie Glu Leu Leu Lys Thr 35 40 45
Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys lie Glu Ak Lys 50 55 60 lie Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gin Gly Glu Ala 65 70 75 80 19 201102084
Thr Leu Val Glu Glu Gin Asp Ala Asn Phe Val.Cys Arg Arg Thr Phe 85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110
Leu Leu Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys 115 120 125 lie Val Gin Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val lie Val Thr Val His 130 135 140
Thr Gly Asp Gin His Gin Val Gly Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr 145 150 155 160 lie Ala Thr lie Thr Pro Gin Ala Pro Met Ser Glu lie Gin Leu Thr 165 170 175
Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val 195 200 205
His Lys Gin Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala 210 215 220
Ser Thr Ser Gin Glu Thr Trp Asn Arg Gin Asp Leu Leu Val Thr Phe 225 230 235 240
Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gin Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gin 245 250 255
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu lie Gin Thr 260 265 270
Ser Gly Thr Thr Thr lie Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 275 280 285
Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Val Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 290 295 300
Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gin His Gly Thr Val 305 310 315 320
Leu Val Gin Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys lie Pro 325 330 335
Phe Ser Thr Gin Asp Glu Lys Gly Val Thr Gin Asn Gly Arg Leu lie 20 201102084 340 345 350
Thr Ala Asn Pro lie Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn lie Glu 355 360 365
Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr lie Val lie Gly Ala Gly Glu 370 375 380
Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser lie Gly Lys 385 390 395 400
Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala lie Leu Gly 405 410 415
Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser lie Gly Gly Ala Phe Thr Ser Val 420 425 430
Gly Lys Leu Val His Gin Val Phe Gly Thr Ala Tyr Gly Val Leu Phe 435 440 445
Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys lie Gly He Gly lie Leu Leu Thr 450 455 460
Tip Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Met Thr Cys lie 465 470 475 480
Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Val Val Gin Ala 485 490 495 <210〉 14 <211> 192 <212> PRT <213> C型肝炎病毒 <400〉 14
Ala Glu Val Lys Asn lie Ser Thr Gly Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys 15 10 15
Thr Asn Asp Ser lie Thr Trp Gin Leu Gin Ala Ala Val Leu His Val 20 25 30
Pro Gly Cys Val Pro Cys Glu Lys Val Gly Asn Thr Ser Arg Cys Trp 35 40 45 lie Pro Val Ser Pro Asn Val Ala Val Gin Gin Pro Gly Ala Leu Thr 50 55 60 21 201102084
Gin Gly Leu Arg Thr His lie Asp Met Val Val Met Ser Ala Thr Leu 65 70 75 80
Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Gly Val Met Leu Ala 85 90 95
Ala Gin Met Phe lie Val Ser Pro Gin His His Trp Phe Yal Gin Asp 100 105 110
Cys Asn Cys Ser lie Tyr Pro Gly Thr lie Thr Gly His Arg Met Ala 115 120 125
Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Thr Met lie Leu Ala 130 135 140
Tyr Ala Met Arg Val Pro Glu Val lie lie Asp lie lie Gly Gly Ala 145 150 155 160
His Trp Gly Yal Met Phe Gly Leu Ala Tyr Phe Ser Met Gin Gly Ala 165 170 175
Trp Ala Lys Val Val Val lie Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Asp Ala 180 185 190 <210> 15
<211> 478 <212> PRT <213>第1型人免疫缺陷病毒 <400> 15
Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr 1 5 10 15
Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val 20 25 30
His Asn Val Tip Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro 35 40 45
Gin Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys 50 55 60
Asn Asp Met Val Glu Gin Met His Glu Asp lie lie Ser Leu Trp Asp 65 70 75 80 22 201102084
Gin Ser Leu Lys Pro Cys "Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser Leu 85 90 95
Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser Gly 100 105 110
Arg Met lie Met Glu Lys Gly Glu lie Lys Asn Cys Ser Phe Asn He 115 120 125
Ser Thr Ser lie Arg Gly Lys Yal Gin Lys Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr 130 135 140
Lys Leu Asp lie He Pro lie Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Lys Leu 145 150 155 160
Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val He Thr Gin Ala Cys Pro Lys Val Ser 165 170 175
Phe Glu Pro lie Pro lie His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala lie 180 185 190
Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn 195 200 205
Val Ser Thr Val Gin Cys Thr His Gly He Arg Pro Val Val Ser Thr 210 215 220
Gin Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Yal Val lie Arg 225 230 235 240
Ser Val Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr lie lie Val Gin Leu Asn 245 250 255
Thr Ser Val Glu lie Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys 260 265 270
Arg lie Arg He Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr lie Gly 275 280 285
Lys lie Gly Asn Met Arg Gin Ala His Cys Asn lie Ser Arg Ala Lys 290 295 300
Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gin lie Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gin Phe 305 310 315 320
Gly Asn Asn Lys Thr lie lie Phe Lys Gin Ser Ser Gly Gly Asp Pro 325 330 335
Glu lie Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys 23 201102084 340 345 350
Asn Ser Thr Gin Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser 355 360 365
Thr Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr lie Thr Leu Pro 370 375 380
Cys Arg lie Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Lys Val Gly Lys Ala 385 390 395 400
Met Tyr Ala Pro Pro lie Ser Gly Gin lie Arg Cys Ser Ser Asn lie 405 410 415
Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu Ser 420 425 430
Glu lie Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser 435 440 445
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys He Glu Pro Leu Gly Val Ala 450 455 460
Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gin Arg Glu Lys Arg 465 470 475 24

Claims (1)

  1. 201102084 七、申請專利範園： 1'種用於提高對病毒、細菌、真菌或其他來源病 原體之免疫反應的免疫原性組合物，該組合物包 含： ^ 來自病毒、細菌、真菌或其他來源病原體的 抗原糖蛋白’其中該糖蛋白含有至少一糖基化位 點以及其中該抗原糖蛋白在一或多個糖基化位點 被部分糖基化。 2. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中 該病原體係病毒以及該部分糖基化抗原係病毒、 源自病毒的病毒胜肽、蛋白質、多肽，或其片段。 3. 如申請專利範圍第2項之免疫原性組合物，其中 該病毒係選自流感病毒、呼吸道融合病毒 (RSV)、衣原體、腺病毒科、巨大腺病毒、禽腺 病毒、皰療病毒科、單純皰療病毒1、單純皰療 病毒2、單純皰療病毒5、單純皰療病毒6、光滑 病毒科、輕小病毒、腸桿菌嗤菌體MS2、蘿莉病 毒、痘病毒科、痘病毒脊索亞科、副痘病毒屬、 禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、諸痘 病毒屬、軟:庑疫病毒屬、疫病毒昆蟲亞科、乳多 瘤病毒科、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、副黏液病毒 科、副黏液病毒、副流感病毒1、麻療病毒屬、 麻療病毒、德國麻療病毒屬、腿腺炎病毒、肺炎 病毒亞科、肺炎病毒屬、間質肺炎病毒屬、禽肺 炎病毒、人間質肺炎病毒、小RNA病毒科、腸 病毒、鼻病毒、肝炎病毒、人A型肝炎病毒、心 肌炎病毒、口蹄疫病毒屬、里奥病毒科、正里奥 病毒、環狀病毒、輪狀病毒、多角體病毒屬、斐 濟病毒屬、植物里奥病毒屬、水稻病毒屬、反轉 201102084 錄病毒科、
    屬、流行熱病毒屬、胞内水稻黃矮炮彈病毒、核 内水稻黃矮炮彈病毒、沙狀病毒科、沙狀病毒屬、 淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、Ippy病毒、拉薩埶 病毒、冠狀病毒科、冠狀病毒和曲狀病毒。 、哺乳類B型反轉錄病毒 4.如申請專利範圍第3項之免疫原性組合物，其中 該病毒胜肽、蛋白、多肽或其片段係選自流感病 毒神經胺酸酶；流感病毒凝集素；流感病毒M2 蛋白’人呼吸道融合病毒(RSV)-病毒蛋白；RSV F 糖蛋白；RSV G糖蛋白；單純皰疹病毒(HSV)病 毒蛋白；單純皰疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE ; 衣原體MOMP和PorB抗原；核心蛋白；登革熱 病毒之基質蛋白或其他蛋白；麻療病毒凝集素； 單純皰療病毒第2型糖蛋白gB ;小兒麻痒病毒1 VP1 ; HIV 1之封套糖蛋白；B型肝炎表面抗原； 白喉毒素，鍵球菌24H表位；纖毛淋病雙球菌； 假性狂犬病病毒g5O(gpD);假性狂犬病病毒II (gpB);假性狂犬病病毒III (gpC);假性狂犬病病 毒糖蛋白Η;假性狂犬病病毒糖蛋白E;傳染性 胃腸炎病毒糖蛋白195;傳染性胃腸炎病毒基質 蛋白；豬輪狀病毒糖蛋白38 ;豬小病毒衣殼蛋 白；猪痢疾蛇形螺旋體保護抗原；牛病毒性腹瀉 2 201102084 糖蛋白55 ;新城疫病毒凝集素-神經胺酸酶；豬 流感凝集素；豬流感神經胺酸酶；口蹄疫病毒； 褚癌病毒，猪流感病毒，非洲豬痕病毒；豬肺炎 黴漿菌；牛傳染性鼻氣管炎病毒；牛傳染性鼻氣 管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G;傳染性喉氣管炎 病毒；傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I; 拉克錫病毒糖蛋白；初生仔牛下痢症病毒；委内 瑞拉馬腦脊髓炎病毒；靜脈病毒；鼠白灰病病毒； 鼠乳腺腫瘤病毒；B型肝炎病毒核心蛋白和B型 肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物；馬流感病 毒或馬皰疹病毒之抗原，包括馬流感病毒A型 /Alaska 91神經胺酸酶、馬流感病毒a型/Miami 63神經胺酸酶、馬流感病毒a型/ Kentucky 81 神經胺酸酶、馬皰疹病毒1型糖蛋白B和馬皰修 病毒1型糖蛋白D;牛呼吸道融合病毒或牛副流 感病毒之抗原；牛呼吸道融合病毒附著蛋白 (BRS V G);牛呼吸道融合病毒融合蛋白（brs v F);牛呼吸道融合病毒核衣殼蛋白（BRSVN);牛 副流感病毒3型融合蛋白；牛副流感病毒3型凝 集素神經胺酸酶；牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48 和糖蛋白53;登革熱病毒糖蛋白E以及人c型肝 炎病毒之糖蛋白E1或E2的表面糖蛋白。 5·如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物’其中 該來自病原體的部分糖基化糖蛋白係利用一或多 種化學或酵素法藉由部分去糖基化所產生。 6. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中 該部分糖基化病毒抗原在0-糖基化或N-糖基化 位點被部分糖基化。 7. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中 201102084 該部分糖基化病毒抗原含胺基酸序列具有天冬胺 酸鹽-Xaa-絲胺酸和天冬胺酸鹽_Xaa_蘇胺酸的一 N-糖化位點，該xaa係除脯胺酸之外的任何胺基 酸。 8. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中 該部分糖基化病毒抗原係單_、雙-或三糖基化流 感病毒血球凝集素(HA)、神經胺酸酶(NA)或M2 蛋白，或其免疫原性片段。 9. 如申請專利範圍第8項之免疫原性組合物，其中 該部分糖基化病毒抗原係以N-乙醯葡萄糖胺 (GlcNAc)及/或甘露糖糖基化的流感病毒凝集素。 10. 如申請專利範圍第8項之免疫原性組合物，其中 該部分糖基化病毒抗原係選自由部分糖基化流感 病毒HI、H3和H5構成之群組的單糖基化凝集 素。 11. 如申請專利範圍第9項之免疫原性組合物，其中 該部分糖基化病毒抗原係以N-乙酿葡萄糖胺 (GlcNAc)糖基化的單糖基化流感病毒凝集素。 12. 如申請專利範圍第丨丨項之免疫原性組合物，其 中5亥單糖基化流感病毒凝集素含具有Sa區的Ν-糖基化位點。 13. 如申請專利範圍第u項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化流感病毒凝集素係於位置177的天 冬胺酸殘基被部分糖基化。 14. 如申。。請專利範圍第n項之免疫原性組合物其 中該單GlcNAc-糖基化流感病毒凝集素對ΉΑ受 體的結合具有較低的特異性及較強的親和力。 15. 如申J青專利範圍第14項之免疫原性組合物，其 中該單GlcNAc-糖基化流感病毒凝集素結合唾液 4 201102084 酸化HA-受體。 16. 如申請專利範圍第11項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化流感病毒凝集素含有包括共有H5 HA序列（序列辨識編號：4)的多肽。 17. 如申請專利範圍第16項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化共有H5 HA序列（序列辨識編號： 4)於一或多個位置 39、127、170、181、302、495 和500的天冬胺酸殘基被糖基化。 18. 如申睛專利範圍第11項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化流感病毒凝集素含有選自由季節性 NIBRG-m (2009年大流行A(H1N1)疫苗株)序列 (序列辦識編號：6)、共有H1-A(序列辦識編號： 8)和共有Hl-C(序列辦識編號：10)序列構成之群 組的H1多肽序列。 19. 如申請專利範圍第η項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化流感病毒凝集素(HA)序列係選自 由共有H5 HA序列（序列辦識編號：4)、 NIBRG-121(2009年大流行A(h1N1)疫苗株)序列 (序列辦識編號：6)、共有H1-A(序列辦識編號： 8)和一共有Hl-C(序列辦識編號：1〇)序列構成之 群組’其中該HA序列被修飾成能表達於一適當 真核細胞内。 20. 如申請專利範圍第^項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化流感病毒凝集素含有季節性H1(布 里斯本）多狀。 21. 如申請專利範圍第丨項之免疫原性組合物，其中 該病毒係呼吸道融合病毒(RSV)，以及該部分糖 基化病毒抗原係單_、雙_或三糖基化RSVF(融 合）、G(附著）或SH(低疏水性)糖蛋白，或其免疫 201102084 原性片段。 22·如申清專利範圍第21項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化RSVG蛋白序列(序列辨識編號：12) 於表6中所示一或多個可能N_糖基化位點的天冬 胺酸殘基被部分糖基化。 23. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中 該1毒係黃熱病毒，以及該部分糖基化病毒抗原 係單_、雙-或三糖基化登革熱病毒封套糖蛋白 Μ、糖蛋白£，或其免疫原性片段。 24. 如申睛專利範圍第23項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化登革熱病毒封套糖蛋白Ε(序列辨 識編號.13)於表7中所示一或多個Ν-糖基化位 點Ν67和Ν153的天冬胺酸殘基被部分糖基化。 25. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中 該病f係C型肝炎病毒，以及該部分糖基化病毒 抗原係單·、雙-或三糖基化C型肝炎封套糖蛋白 E卜糖蛋白E2 ’或其免疫原性片段。 26. 如申。請專利範圍第25項之免疫原性組合物，其 中，單糖基化C型肝炎封套糖蛋白E](序列辨識 編號：14)於表8中所示一或多個N_糖基化位點 N196、N209、N234、N305 和 N325 的天冬胺酸 殘基被部分糖基化。 27\如申&請專利範圍第丨項之免疫原性組合物，其中 該病毒係人類免疫缺陷病毒(HIV)，以及該部分糖 基化病毒抗原係單-、雙-或三糖基化HIV封套糖 蛋白gpl20、跨膜糖蛋白gp41，或其免疫原性片 段。 28^申™請專利範圍第27項之免疫原性組合物，其 中該單糖基化HIV封套糖蛋白gpl2〇(序列辨識編 6 201102084 號· 15)於表9中所示一或多個可能队糖基化位 點的天冬胺酸殘基被部分糖基化。 29. —種疫苗包含： (a) 含有病毒表面糖蛋白，或其免疫學活性片 段在一或多個耱基化位點被部分糖基化至 單-、雙•或三糖狀態的免疫原性多肽；以及 (b) 選擇性佐劑，其中該疫苗能誘發對抗病毒 的免疫反應。 30. 如申請專利範圍第29項之疫苗，其中該病毒係 流感病毒以及該病毒糖蛋白係血球凝集素 (HA)、神經胺酸酶(NA)或M2。 31·如申請專利範圍第30項之疫苗，其中該流感病 毒係選自由禽流感病毒、動物流感病毒和人流感 病毒構成的群組。 32. 如申請專利範圍第31項之疫苗，其中該禽流感 病毒係Η5Ν1。 33. 如申請專利範圍第31項之疫苗，其中該流感病 毒係Α型流感病毒。 34. 如申請專利範圍第30項之疫苗，其中當將該單 糖基化流感HA多肽導入一生物體時，該多肽可 誘發該生物體產生結合至呼吸道病毒的抗體。 35. 如申請專利範圍第34項之疫苗’其中該呼吸道 病毒係禽、動物及/或人流感病毒’或Rsv。 36. 如申請專利範圍第34項之疫苗，其中該部分糖 基化病毒抗原於〇-糖基化或N糖基化位點被部 分糖基化。 37. 如申請專利範圍第34項之疫苗’其中該部分糖 基化病毒抗原係含有部分糖基化N-糖基化位點 之胺基酸序列具有天冬胺酸鹽 Xaa- 絲胺酸和天冬 201102084 胺酸鹽-xaa-蘇胺酸的單糖基化流感病毒HA多 肽’該xaa係除脯胺酸之外的任何胺基酸。 38·如申凊專利範圍第34項之疫苗，其中該N-糖基 化位點含有對HA受體結合呈現低特異性及較強 親和力的單GlcNAc糖基化流感病毒ha多肽。 39.如申請專利範圍第34項之疫苗，其中該單糖基 化流感病毒HA多肽含具有Sa區的糠基化位 40. 如申請專利範圍第34項之疫苗，其中該單糖基 化流感病毒HA多肽含有於位置177天冬胺酸殘 基的N-糖基化位點。 、 41. 如申凊專利範圍第38項之疫.苗，其中該單 GlcNAc糖基化流感病毒凝集素結合唾液酸化ha 受體。 42.如申请專利範圍第34項之疫苗，其中單gicnac 糖基化流感病毒凝集素含有包括共有Ή5 HA序 列（序列辦識編號：4)的多肽。 43. 如申請專利範圍第42項之疫苗，其中該單糖基 化共有H5 HA序列(序列辦識編號：句於一或多 個位置39、170、181、302和495的天酸 基被糖基化。 44. 如申^專利範圍第34項之疫苗，其中該單糖基 化&感病毒血球凝集素含有選自由nibrg_12】 (2009年大流行A(H1N1)疫苗株 編號斗共有m-A (序列辦識編號== H1-C(序列辦識編號：10)序列構成之群組的η】 多狀序列。 45. 如申請專利範圍第34項之疫苗，其輩 化流感病毒血球凝集素含有季節性Hlj布里^ 8 201102084 本)HA多肽以及當將該單糖基化HA多肽導入生 物體時，該H1(布里斯本)HA多肽可誘發該生物 體產生中和NIBRG-121(2009年大流行a(H1N1) 疫苗株）、WSN(H1N1)1933，或A/波多黎各 /8/34(HlNl) : PR8株流感病毒的抗體。 46.如申請專利範圍第34項之疫苗，其中該單糖基 化流感病毒血球凝集素含有NIBRG-121(2009年 大流行A(H1N1)疫苗株）多肽以及當將該單糖基 化HA多肽導人生物體時，該nibrg_121(2〇〇9 年大流行Α(Η1Ν1)疫苗株）多狀可誘發該生物體 產生中和季節性H1(布里斯本）HA、 WSN(H1N1)1933，或 A/波多黎各/8/34(Η1Ν1): PR8株流感病毒的抗體。 47. 如申請專利範圍第34項之疫苗，其中該生物體 係哺乳動物、鳥類、動物，或人類。 48. 如申請專利範圍第34項之疫苗，其中該疫苗具 有對抗一或多株流感病毒的顯著抗病毒活性。 49·如申專利範圍第29項之疫苗，其中該病毒係 呼吸道，合病毒(RSV)，以及該部分糖基化病毒 抗原係單、雙-或三糖基化RSVF(融合）、G(附著） 或sft低疏水性)糖蛋白，或其免疫原性片段。 5 π如專利範圍第49項之疫苗，其中該單糖基 G蛋白序列(序列辨識編號：12)於表6中 夕個可能&糖基化位點的天冬胺酸殘 基被部分糖基化。 51·ϋΛ專利範圍第29項之疫苗，其中該病毒係 毒’以及該部分糖基化病毒抗原係單-、雙 / 基化登革熱病毒封套糖蛋白Μ、糖蛋白 Ε，或其免疫原性片段。 201102084 52. 如申請專利範圍第51項之疫苗，其中該單糖基 化登革熱病毒封套糖蛋白E(序列辨識編號：13) 於表7中所示一或多個N_糖基化位點n67和 N153的天冬胺酸殘基被部分糖基化。 53. 如申請專利範圍第29項之疫苗，其中該病毒係 C型肝炎病毒，以及該部分糖基化病毒抗原係單 _、雙-或三糖基化C型肝炎封套糖蛋白E卜糖| 白E2 ’或其免疫原性片段。 54. 如申請專利範圍第53項之疫苗，其中該單糖基 化C型肝炎封套糖.蛋白ei(序列辨識編號： 表8中所示一或多個N-糖基化位點n]96、N209、 N234、N305和N325的天冬胺酸殘基被部分糖基 化。 55. 如申請專利範圍第29項之疫苗，其中該病毒係 人類免疫缺陷病毒(HIV)，以及該部分糖基化病毒 抗原係單-、雙-或三糖基化HIV封套糖蛋白 gP120、跨膜糖蛋白gp41，或其免疫原性片段。 56. 如申請專利範圍第55項之疫苗，其中該單糖基 化HIV封套糖蛋白gpi2〇(序列辨識編號：15)於 表9中所示一或多.個可能N-糖基化位點的天冬胺 酸殘基被部分糖基化。 57. 如申請專利範圍第29項之疫苗，其中該佐劑係 選自氫氧化鋁、磷酸鋁、氫氧化鋁和磷酸鋁、佛 氏不完全佐劑(IFA)、角鯊烯、明礬和MF59。 58. —種製造方法包含： 提供糖基化病毒表面糖蛋白，或其免疫活性片 段；以及 移除蛋白上結合至一或多個糖基化位點的至少一部 分聚糖而形成一部分糖基化蛋白，其中至少一聚 201102084 糖保持結合至該蛋白上的部分糖基化位點以及其 中該蛋白保留免疫上活性構形。 59. 如申請專利範圍第59項之方法，其進一步包含： 提供包含具有病毒糖蛋白之胺基酸序列的適合用於 表達重組多肽，或其免疫上活性片段之構體的真 核宿主細胞；以及 從該真核宿主細胞分離該糖基化重組病毒糖蛋白多 肽。 60. 如申請專利範圍第59項之方法，其中該部分糖 基化蛋白保留該病毒糖蛋白於其天然狀態的三級 結構。 61. 如申請專利範圍第59項之方法，其中利用糖苷 酶、神經胺酸酶、α-1-甘露糖苷酶、内切F-N聚 糖酶，或選擇性消化該糖於Ν-或0-連接糖基抱 位點的酵素移除該聚糖部分。 62. 如申請專利範圍第59項之方法，其中利用選擇 性消化該糖於Ν-或0-連接糖基化位點的化學方 法移除該聚糖部分。 63. 如申請專利範圍第60項之方法，其中該真核宿 主係選自酵素、昆蟲細胞、桿狀病毒、哺乳動物 細胞，及人類細胞。 64. 如申請專利範圍第64項之方法，其中該真核宿 主係ΗΕΚ293Ε細胞。 65. 如申請專利範圍第59項之方法，其中該部分糖 基化位點保留一、二或三個聚糖。 66. 如申請專利範圍第59項之方法，其中該病秦表 面糖蛋白係選自由下列所構成的群組： 選自流感病毒神經胺酸酶；流感病毒凝集 素；流感病毒M2蛋白；人呼吸道融合病毒(RSV)- 11 201102084 病毒蛋白；RSVF糖蛋白；RSVG糖蛋白；單純 跑修病毒(HSV)病毒蛋白；單純皰疹病毒糖蛋白 gB、、gD和gE ;衣原體MOMP和PorB抗原； 核心蛋白；登革熱病毒之基質蛋白或其他蛋白； 麻療病毒凝集素；單純皰疹病毒第2型糖蛋白 gB ;小兒麻痒病毒1 VP1 ; HIV 1之封套糖蛋白； B型肝炎表面抗原；白喉毒素；鏈球菌24H表位； 纖毛淋病雙球菌；假性狂犬病病毒g5〇(gPD);假 性狂犬病病毒II (gpB);假性狂犬病病毒ill (gpC);假性狂犬病病毒糖蛋白η ;假性狂犬病病 毒糖蛋白Ε ;傳染性胃腸炎病毒糖蛋白195 ;傳 染性胃腸炎病毒基質蛋白；豬輪狀病毒糖蛋白 38 ’豬小病毒衣殼蛋白；猪痢疾蛇形螺旋體保護 抗原；牛病毒性腹瀉糖蛋白55 ;新城疫病毒凝集 神經胺酸酶；豬流感凝集素；豬流感神經胺酸 _，口蹄疫病毒；豬瘟病毒；豬流感病毒；非洲 豬瘟病毒；豬肺炎黴漿菌；牛傳染性鼻氣管炎病 毒，牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G; 傳染性喉氣管炎病毒；傳染性喉氣管炎病毒糖蛋 白G或糖蛋白I ;拉克踢病毒糖蛋白；初生仔牛 下痢症病毒；委内瑞拉馬腦脊髓炎病毒；靜脈病 毒，鼠白血病病毒；鼠乳腺腫瘤病毒；B型肝炎 病毒核心蛋白和B型肝炎病毒表面抗原或其片段 或衍生物；馬流感病毒或馬皰疹病毒之抗原，包 括馬流感病毒A型/Alaska 91神經胺酸酶、馬流 感病毒A型/Miami 63神經胺酸酶、馬流感病毒a 型/Kentucky 81神經胺酸酶、馬皰疹病毒1型糖 蛋白B和馬皰瘆病毒1型糖蛋白D;牛呼吸道融 合病毒或牛副流感病毒之抗原；牛呼吸道融合病 12 201102084 毒附著蛋白（BRSVG);牛呼吸道融合病毒融合蛋 白（BRSV F);牛呼吸道融合病毒核衣殼蛋白 (BRSVN);牛副流感病毒3型融合蛋白；牛副流 感病毒3型凝集素神經胺酸酶；牛病毒性腹瀉病 毒糖蛋白48和糖蛋白53 ;登革熱病毒糖蛋白E 以及人C型肝炎病毒之糖蛋白E1或E2之表面糖 蛋白的病毒胜肽、蛋白、多肽或其片段。 13
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