TW201036554A

TW201036554A - Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof

Info

Publication number: TW201036554A
Application number: TW099107980A
Authority: TW
Inventors: Kirk E Apt; Joseph W Pfeifer Iii; Jon Milton Hansen; Paul Warren Behrens; Ross Zirkle; Tracey Lynn Stahl
Original assignee: Martek Biosciences Corp
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2010-03-18
Publication date: 2010-10-16
Also published as: AR071493A1; AR111298A2; US20180064138A1; US20120088831A1; CL2013002822A1; US8207363B2; US20240081376A1; CL2009001061A1; US10362794B2; US20160309748A1; US10085465B2; US20100239533A1; US9414612B2; US20200390126A1; US20190000114A1; US10757959B2

Description

201036554 六、發明說明：【明戶斤屬^^軒々貝】發明領域以本申請案申請之該以電子檔提出之序列表（於2009 年2月 26 日設計之“sequence listing.txt”，10,531位元組）的内容之全文在此併入本案以為參考資料。 H ^tT 才支·^标 3 Ο

發明背景脂肪酸係根據碳鏈之長度及飽和特性而分類。短鏈脂肪酸通常具有12個或較少的碳，中鏈脂肪酸通常具有14至 18個碳，而長鏈脂肪酸通常具有20個或更多的碳。當該等碳原子間不存在雙鍵，則脂肪酸稱為飽和脂肪酸，而當存在雙鍵時則稱為不飽和脂肪酸。當僅存在一個雙鍵時，不飽和長鏈脂肪酸具單不飽和性且當存在超過一個雙鍵時則具多不飽和性。多不飽和脂肪酸(PUFA)係根據自該脂肪酸之甲基末端算起的第一個雙鍵位置而分類：ω-3(η-3)脂肪酸於第三碳含有第一個雙鍵，而ω-6(η-6)脂肪酸於第六碳含有第一個雙鍵。例如二十二碳六烯酸(“DHA”)為具有22個碳及6個雙鍵之鏈長之通常命名為“22: 6 η-3”之ω-3長鏈多不飽和脂肪酸 (LC-PUFA) 〇其它ω-3 LC-PUFA包括命名為“20 : 5 η-3”之二十碳五稀酸(“ΕΡΑ”）、及命名為“22 : 5 η-3”之ω-3二十二碳五稀酸(“DPA η-3”）。DHA及ΕΡΑ業經稱為“必須”脂肪酸。 ω-6 LC-PUFA包括命名為“20 : 4 η-6”之花生四烯酸 201036554

(“ARA”）、及命名為“22 : 5 n-6”之ω-6二十二碳五烯酸(“DPA n-6”）。 ω-3脂肪酸由於存在於細胞膜内，所以是可影響細胞生理學之具生物學重要性的分子，且其可調整生物活性化合物之產生及基因表現性，且可作為生物合成基質。Roche, Η. Μ.，/Voc. iVw紀 Soc.兄：397-401 (1999)。例如DHA佔人類大腦皮質内脂質之約15%-20%、佔視網膜内脂質之 30%-60%、集中於睪丸及精子，且其係為母乳之重要組份。 Jean-Pascal Berge & Gilles Barnathan, Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms: Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds, and Economical Aspects, in Marine Biotechnology I 49(T. Scheper, ed., 2005)。DHA佔腦内該等ω-3脂肪酸之至高97%且佔視網膜内該等ω-3脂肪酸之至高93%。而且，就胎兒及嬰兒發育以及成人認知機能之維護。Μ ω-3脂肪酸（其包括DHA及ΕΡΑ) 亦具有抗發炎性質。見，例如/d. and Simopoulos, Α.Ρ., J. dm. Co". TVwir. 27: 495-595 (2002)。於ω-3脂肪酸在人體内不能再合成，所以這些脂肪酸必須衍生自營養源。亞麻仁油及魚油被視為ω-3脂肪酸之良好食物源。亞麻油不含ΕΡΑ、DHA、DPA或ARA，但是卻含有次亞麻油酸 (C18: 3 η-3)，該次亞麻油酸為可以使身體製造ΕΡΑ之砌塊。然而，證據顯示尤其在健康已受損之人們之間，代謝轉化速率可變慢且可易變。根據特定物種及其等之飲食，魚油之脂肪酸組成物的類型及位準可大不同。例如藉水產養殖 201036554 而飼養之魚傾向於具有比野生魚還低位準之©_3脂肪酸。而且’魚油具有含有環境污染物之風險且可以與穩定性問題及魚腥臭味或味道有關連。破囊壺菌為破囊壺菌目的微生物。破囊壺菌包括裂殖壺菌屬的成員且業經確認為ω_3脂肪酸（其包括DHA)之其它可替代來源。見美國專利第5,130,242號。自這些海洋異養微生物所產生的油類通常具有比對應魚或微藻油類還簡單的多不飽和脂肪酸輪廓。Lewis, Τ.Ε., Mar. /: 580-587(1999)。破囊壺菌物種之菌株業經報告可產生ω-3脂肪酸，因為該等微生物可產生高百分率之總脂肪酸。美國專利第5,130,242號；Huang, J.等人，《/· Jm. (9//. C/^所. 7& 605-610 (2001); Huang，J.等人，Μπ. 5: 450-457 (2003)。然而，已單離的破囊壺菌所產生之LC-PUFA的特性及數量可不同，因此某些先前所述之菌株可具有非所欲位準之ω_6脂肪酸及/或在培養物内可顯示低生產力。因此，對於可顯示高生產力及所欲LC_PUFA 輪廓之破囊壺菌的離析有持續的需求。【明内容J 發明概要本發明係有關於寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之該等破囊壺菌物種之已單離的破囊壺菌微生物或自其衍生之菌株’其中藉該微生物或自其衍生之菌株而產生之總脂肪酸包含約10重量％或更少之二十碳五烯酸。本發明亦有關於一具有寄存在ATCC登錄號第 201036554 PTA-9695號下之該等破囊壺菌物種之特性的已單離破囊壺菌微生物，其中藉該微生物或自其衍生之菌株而產生的總脂肪酸包含約10重量％或更少之二十碳五烯酸。本發明亦有關於一含三酸甘油酯溶離份之已單離的破囊壺菌微生物或自其衍生之菌株，其中該三酸甘油酯餾份之二十二礙六烯酸含量為至少約40重量％，其中該三酸甘油西旨顧份之二十二碳五稀酸η-6含量為自至少約0.5重量％至約6重量％，且其中藉該微生物或自其衍生之菌株而產生之總脂肪酸包含約1〇重量％或更少之二十碳五烯酸。本發明亦有關於一與寄存在ATCC登錄號第ΡΤΑ-9695 號下之破囊壺菌相同之物種的已單離破囊壺菌微生物或自其衍生之菌株，其中藉該微生物或自其衍生之菌株而產生的總脂肪酸包含約1〇重量％或更少之二十碳五烯酸。在某些實施例中，該衍生自本發明之已單離的破囊壺菌微生物之菌株為突變體菌株。本發明亦有關於一寄存在ATCC登錄號第ΡΤΑ-9695、 ΡΤΑ-9696、ΡΤΑ-9697或ΡΤΑ-9698號下之已單離的微生物。本發明亦有關於一含本發明該等破囊壺菌微生物中之任一者或其等之混合物的破囊壺菌生物質塊。本發明亦有關於一已單離之破囊壺菌生物質塊，其中該生物質塊之乾細胞重量的至少約50重量％為脂肪酸，且其中該等脂肪酸之至少約50重量％為ω-3脂肪酸。在某些實施例中，該等脂肪酸之至少約50重量％為二十二碳六烯酸。本發明亦有關於一已單離的破囊壺菌生物質塊，其中 201036554 該質塊之乾細胞重量的至少約25重量％為二十二碳六婦酸。在某一貫知例中，本發明亦有關於一種已單離的破囊亞菌生物貝塊’其中該等脂肪酸之約1〇重量％或較小為二十厌五烯fee 1其巾紅十二碳六烯酸對二十碳五稀酸之重量比為至少約5 : 1。。在某些實施例中，本發明亦有關於一種已單離的破囊亞菌生物質塊’其中該等脂肪酸之約15重量。或更少為花 ❹ i四烯且其中紅十二碳六稀酸對花生四烯酸之重要比為至少約20 : 1。在某些實施例中，本發明亦有關於-種含至少約10: i 之重里比之一十_碳六烯酸及二十二碳五稀酸以的已單 ' 離破囊壺菌生物質塊。 * I發明亦#關於—種含本發明料破囊壺g微生物中之任-者或彼等之混合物的已單離破囊壺菌培養物。在某些實施例中，該培養物包含至少約5%溶氧。〇纟發财有關於—種用於動物或人類之含本發明該等破囊壺菌微生物或生物質塊中之任—者的食物產品、化妝品或藥學組成物。本發明亦有關於一種含至少約7 〇重量％之三酸甘油醋 /合離伤的微生物油，其中該三酸甘油醋溶離份之二十二石炭讀酸含量為至少約5G重量％，^其中該三酸甘油醋溶離伤之一十一碳五烯酸n_6含量為自约〇 5重量％至約6重量 %。在某些實施财，該微生物石油之三酸甘油酯溶離份進-步包含約1_5重量％或更少之花生四婦酸。 201036554 本發明亦有關於一種含至少約70重量％三酸甘油酿溶離份之微生物油’其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳丄烯酸含量為至少約40重量。/〇,其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳五烯酸n-6含量為自至少約〇·5重量％至約6重量 %，且其中該二十二碳六烯酸對二十二碳五烯酸η_6之比率大於約6 : 1。本發明亦有關於—種含至少約70重量％三酸甘油酿溶離份之微生物油，其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳六烯酸含量為至少約60重量。/〇。在某些實施例中’ S亥微生物油之三酸甘油醋溶離份中之至少約20%三酸甘油酯的選自sn-1、sn_2、及sn_3位置中之任兩者含有二十二碳六烯酸。在某些實施例中，該微生物油之三酸甘油酯溶離份内的至少約5%三酸甘油酯之 sn-l、sn-2、及sn-3位置含有二十二碳六烯酸。在某些實施例中，該微生物油進一步包含約5重量％或更少之十七酸。本發明亦有關於一種用於動物或人類之含本發明該等微生物油中任一者的食物產品、化妝品或藥學組成物。在 -、二實施例中，5亥食物產品為嬰兒食品。在某些實施财，該嬰兒食品適於早產兒。在某些實施例中，，食物產品為牛奶、飲料、治療肢品、營養性飲品或其等之組合。在某些實施例中，該食物產品為一用於動物或人類食物之添加物。在某些實施例中，該食物產品為營養補給品。在某些實施例中，該食物產品為動物飼料。在某

201036554 中，该動物飼料為剔養動物飼料在某些實施例動物飼料、禽畜_或其等之組合動物園動物飼料、役用本發明亦有關於一種用於t 油的方法，該方法包括.3脂肪酸之微生物忐包括.（a)在培養物離破囊壺菌微生物巾之任 4等已早 -生物質塊，物自該生嶋萃取等含某些實施例中，該培養物包含至少㈣溶氧。^之^在例中該培養物卿約W.5。在某些;2 中，係維持該培養物溫度於約irc至約3〇。。。在某些二：例中’該培養物包含約5克/升至約5〇克/升之葡萄糖濃度把 .本發明亦有關於一種用於製造含ω-3脂肪酸之微=物油的方法’該方法包括自本發明該等生物質塊中之任—種萃取含ω_3脂肪酸之油。在某些實施例中，係利用己炫萃取方法萃取該微生物油。在某些實施例中，係利用無溶劑萃取方法卒取該微生物油。在某些實施例中，於約17°C至約3(TC下在含碳、氮、及營養物源以及約950ppm至約8500ppm氣根離子之培養基 (約pH 6.5至約pH 8.0)内生長7天後，自本發明該等培養物中之任一種(各1升)所分離之生物質塊的乾細胞重為至少約5〇克。在某些實施例中，於約17°C至約30°C下在含碳、氮、及營養物源以及約950ppm至約85〇Oppm氯根離子之培養基 (約pH 6.5至約pH 8.0)内生長7天後，本發明該等已單離培養物中之任一種具有至少約2克/升/天之ω-3脂肪酸生產力。 9 201036554 本發明亦有關於藉本發明之方法而製造之微生物油。本發明亦有關於本發明該等已單離微生物、生物質塊或微生物油中之任一種或其等之混合物用於製造可用以治療炎症或其相關病症之藥物的用途。本發明亦有關於本發明該等已單離微生物、生物質塊或微生物油中之任一種或其等之混合物用於治療炎症或其相關病症的用途。本發明亦有關於可用以治療炎症或其相關病症之本發明該等已單離微生物、生物質塊或微生物油中之任一種或其等之混合物。本發明亦有關於一種用於治療需要其治療之患者的炎症或其相關病症之方法，其包括對該患者投與本發明該等已單離微生物、生物質塊或微生物油中之任一種或其等之混合物、以及藥學上可接受載劑。 I：實施方式3 較佳實施例之詳細說明本發明係有關於已單離之破囊壺菌微生物以及其等之菌株及突變體、以及其等之生物質塊、微生物油、組成物、及培養物。本發明亦有關於自本發明該等破囊壺菌製造微生物油之方法、以及使用該等破囊壺菌、生物質塊、及微生物油之方法。與先前離析物比較，文中所述之破囊壺菌具高生產力且可產生獨特脂肪酸輪廓，其部份特徵在於具高位準之ω-3脂肪酸，尤其高位準之DHA。破囊壺菌微生物 10 201036554 本發明係有關於已單離的破囊壺菌，包括其等之突變體、重組體、及變異體。在某些實施例中，本發明係有關於寄在ATCC登錄號第 PTA-9695號下之物種的破囊壺菌。該已單離的破囊壺菌在文中亦稱為裂殖壺菌屬。ATCC PTA-9695。該與ATCC登錄號第PTA-9695號有關之破囊壺菌係寄存在於2〇〇9年1月7曰在 the American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209之 Budapest Treaty 下0 在某些實施例中，本發明係有關於寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之已單離破囊壺菌株。在某些實施例中，本發明係有關於與寄存ATCC登錄號第PTA-9695號下之破囊壺菌相同之物種的已單離破囊壺菌微生物。在某些實施例中，本發明係有關於具有寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之物種之特性的已單離破囊壺菌或自其衍生之菌株。寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之該破囊壺菌物種的特性包括其生長及表型性質（表型性質的實例包括形態及再生性質）、其物理及化學性質（諸如乾重及液體輪廓）、及其基因序列。在某些實施例中，本發明該等已單離破囊壺菌之表型性質與寄存在ATCC登錄號第 PTA-9695號下之破囊壺菌實質上相同。在某些實施例中，本發明該等已單離破囊壺菌之生長性質與寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之破囊壺菌實質上相同。在某些實施例中，本發明係有關於本發明一已單離破 11 201036554 囊亞&之犬變體、變異體或重組體，其中藉該突變體、突變體或重組體而產生之總脂肪酸包含約10重量％或更少之二十礙五烯酸。突變體菌株可藉已為吾人所熟知之程序而製成。常用程序包括照射；於高溫下處置；及使用突變原進行處置。變異體菌株可以是文中所述物種之自然產生的離析物及/或亞離析物。可藉用於表現外源基因或改變内源基因機能或表現性之分子生物學中的任何已為吾人所熟知之方法而製造重組體菌株。在某些實施例中，該突變體、變異體或重組體菌株比野生型菌株可產生更高數量之ω-3 脂肪酸，其包括DHA及/或ΕΡΑ。在某些實施例中，該突變體、變異體或重組體菌株可產生較少數量之一或多種脂肪酸(諸如較低數量之ΕΡΑ、ARA、DPA η-6)或其等之組合。在某些實施例中，該突變體、變異體或重組體菌株比野生型菌株可產生更大的乾細胞重/每升培養物。此等突變體、變異體或重組體菌株為衍生自本發明一已單離破囊壺菌之菌株實例。在某些實施例中，本發明係有關於寄存在ATCC登錄號第ΡΤΑ-9695號下之該破囊壺菌的一突變體菌株。在另外實施例中，該突變體菌株為一寄存在ATCC登錄號第 ΡΤΑ-9696、ΡΤΑ-9697或ΡΤΑ-9698號下之菌株。該等與ATCC 登錄號第ΡΤΑ-9696、ΡΤΑ-9697、及ΡΤΑ-9698號有關之破囊壺菌菌株係寄存在於2009年1月在the American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209之Budapest Treaty下。 12 201036554 這些經寄存之突變體菌株為兮卑苟°亥寄存在ATCC登錄號第 ΡΤΑ-9695號下之破囊壺菌的衍生物。

〇在某些實施财，本翻之—已單離破囊_(包括其突變體、變異體或重組體）包含—在自該破囊麵所離析之 -或多種溶雜中的脂㈣麵。自該破囊㈣所離析的 -或多種溶離份包括總脂肪酸溶離份、固醇自旨溶離份、三酸甘油雜離份、游_肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸醋溶離份、極性溶離份(包括翻轉份)、及其等之組合。破囊壺菌培養物及已單離破囊壺菌生物質塊本發明進-步係有關於含本發明之一或多種已單離破囊壺菌的培養物。用於接種、生長、及回復微生物區系之各種發酵參數在本項技藝中係已知，諸如美國專利第 5,130,242號中所述之發酵參數。可使用用於破囊壺菌之生長的任何習知培養基。液體或固體培養基可含有天然或人造海水。碳源包括，但不限於：葡萄糖、果糖、木糖、蔗楗、麥芽糖、可溶性澱粉、糖蜜、岩藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、乙酸鈉、及甘露醇。氮源包括，佴不限於：腺、酵母萃取物、聚腺、麥芽萃取物、肉萃取物、酪蛋白胺基酸、玉米漿(corn steep liquor)、有機氮源、然酸鈉、尿素、無機氮源、乙酸銨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸鈉。典型的培養基示於表1内： 13 201036554 成份濃廑 NaCl 克/升 12.5 KC1 克/升 1.0 MgS04_7H20 克/升 5.0 (NH4)2S〇4 克/升 0.6 CaCl2 克/升 0.29 T154(酵母萃取物）克/升 6.0 ΚΗ2Ρ〇4 克/升 1.2 高m減諂後（金屬）檸檬酸毫克/升3.5 FeS04-7H20 毫克/升10.30 MnCl2-4H20 毫克/升3.10 ZnS04'7H20 毫克/升3.10 CoC12-6H2〇毫克/升0.04 Na2Mo〇4*2H2〇毫克/升0.04 CuS04.5H20 毫克/升2.07 NiS04-6H20 毫克/升2.07 高壓滅菌後（維生素Ί 噻胺μ 毫克/升9.75 維生素Β12** 毫克/升0.16 泛酸鈣％* 毫克/升3.33 高壓滅菌後（碳、葡萄糖克/升 30.0 氮進料：成份濃度 νη4οη 毫升/升21.6 典型培養條件可包括下述：

pH 表1 :容器培養基範圍 0-25、5-20或 10-15 0-5 、 0.25-3或.5-2 0-10、2-8或3-6 0-10、0.25-5或0_5-3 0.1-5、0_15-3 或0.2-1 0-20 、 1-15或5-10 0.1-10、0.5-5或 1-3 0.1-100、1-50或2-25 0.1-100、1-50或5-25 0.1-100、1-50或2-25 0.1-100、1-50或2-25 0.001-1、0.005-0.5 或0.01-0.1 0.001-1、0.005-0.5 或0.01-0.1 0.1-100、0.5-50或 1-25 0.1-100、0.5-50或 1-25 0.1-100、1-50或5-25 0.1-100、0.1-10或0.1-1 0.1-100、0.1-50或 1-10 5-150、UM00或20-50 0-150 、 ίο-loo或15-50 約6.5至約8.5、約6.5至約8.〇、或約7.0 至約7.5 14 201036554 溫度 · 溶氧：受控之葡萄糖@: 約17至約3〇。〇、約20至約25°C、或約 22至約23 °C 約5至約100%飽和、約1〇至約80%飽和、或約20至約50%飽和約5至約50克/升、約1〇至約40克/升、或約20至約μ克/升在某些實施例中，該培養基包含以飽和位準之百分率〇表示之至少約5%、至少約1 〇%、至少約20% '至少約30%、至少約40%、至少約5〇%、至少約6〇%、至少約7〇%、至少約80%、或至少約溶氧在某些實施例中，該培養基包含以飽和位準之百分率表示之自約5%至約20%、約5%至約 50%、約5%至約1〇〇%、約1〇%至約2〇%、約丨〇。/❶至約50%、約10%至約1 〇〇%、約20%至約50%、或約20%至約100%溶氧。本發明進一步係有關於本發明一破囊壺菌之已單離生物質塊。本發明一已單離破囊壺菌生物質塊為藉，諸如在 Ο 美國專利第5,130,242號及美國專利申請公開案第 2002/0001833號中所述之用於單離破囊壺菌生物質塊的任何習知方法而獲得之已採集細胞生物質塊。在某些實施例中’於約17°C至約30°C下在含碳、氮、及營養物源以及约950ppm至約8500ppm氯根離子之培養基 (約pH 6_5至約8.5)内生長約7天後’自各升培養物所離析之該生物質塊的乾細胞重量為至少約50克、至少約60克、至少約70克、至少約80克、至少約克、至少約120克、至少約140克、至少約160克、至少約180克、或至少約200克。 15 201036554 在某些實施例中’於約17°C下、於約18°C下、於約19°C下、於約20t：下、於約21°C下、於約22°C下、於約23°C下、於約24°C下、於約25°C下、於約26°C下、於約27°C、於約28 °(：下、於約29°C下、或於約30°C下，在含碳、氮、及營養物源以及約950ppm至約8500ppm氣根離子之培養基（約pH 6·5、約pH 7、約pH 7.5、約pH 8.0或約pH 8.5)内生長約7天後，自各升培養物所離析之該生物質塊的乾細胞重量為至少約50克、至少約60克、至少約70克、至少約80克、至少約100克、至少約120克、至少約140克、至少約160克、至少約180克或至少約200克。在某些實施例中，於約17°C至約30°C下，在含碳、氮、及營養物源以及約950ppm至約 8500ppm氮根離子之培養基（約pH 6.5至約pH 8.5)内生長約 7天後’自各升培養物所離析之該生物質塊的乾細胞量為自約50克至約200克。在某些實施例中，於約17°C下、於約18 °(：下、於約19°C下、於約20°C下、於約21。(：下、於約22°C 下、於約23°C下、於約24。(：下、於約25°C下、於約26°C下、於約27°C下、於約28。(：下、於約29〇C下或於約30°C下，在含石反、氮、及營養物源以及約950ppm至約8500ppm氮根離子之培養基（約pH 6.5、約pH 7、約pH 7.5、約pH 8.0或約pH 8.5)内生長約7天後’自各升培養物所離析之該生物質塊的乾細胞重量為自約50克至約200克。在某些實施例中，於約17°C至約3(TC下，在含碳、氮、及營養物源以及約950ppm至約8500ppm氯根離子之培養基 (約pH 6.5至約PH 8.5)内生長約7天後，該已單離破囊壺菌培 16 201036554 養物具有至少約2克/升/天、至少約4克/升/天、或至少約8 克/升/天之ω-3脂肪酸生產力。在某些實施例中，於約至約30C下，在含碳、氮、及營養物源以及約95〇ppm至約 8500ppm氯根離子之培養基（約pH 6 5至約pH 8 5)内生長約 7天後，該已單離破囊壺菌培養物具有介於約1克/升/天至約 2〇克/升/天之間、約2克/升/天至約15克/升/天之間、約2克/ 升/天至約10克/升/天之間、約3克/升/天至約1〇克/升/天之間、或約4克/升/天至約9克/升/天之間的0-3脂肪酸生產力。在某些實施例中’該發酵體積(培養物體積）為至少約2 升、至少約10升、至少約50升、至少約1〇〇升、至少約200 升、至少約500升、至少約1〇〇〇升、至少約1〇〇〇〇升、至少約20,000升、至少約50,〇〇〇升、至少約1〇〇,〇〇〇升、至少約 150,000升、至少約200,000升、或至少約250,000升。在某些實施例中’該發酵體積為約2升至約300,000升、約2升、約10升、約50升、約1〇〇升、約2〇〇升、約500升、約1000升、約 10,000升、約 20,000升、約 50,000升、約 100,000升、約 150,000升、約2〇〇,〇〇〇升、約250,000升、或約300,000升。在某些實施例中，本發明係有關於一種含本發明之脂肪酸輪廓的已單離破囊壺菌生物質塊。在某些實施例中，該生物質塊之乾細胞重量的至少約50%、至少60%、至少約 70%或至少約8〇%為脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊之乾細胞重量的大於約50%、大於約55%或大於約60%為脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊之乾細胞重量的自約 50至約60重量％、約50至約重量70%、約50至約80重量％、 17 201036554 約55至約7〇重量％、約55至觸重量％、驗至約观量％或約60至約80重量％為脂肪酸。在某些實施例中該生物質塊包含至少約50重量％、至少約60重量％、至少約7〇重量 %或至少約80重量％如(〇_3脂肪酸之該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊包含自約50至約6〇重量％、約5〇至約 70重1 %、約50至約80重量％如ω_3脂肪酸之該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊包含至少約5〇重量％、至少約55重量％、至少約60重量。/。、至少約65重量％、至少約7〇重量％、至少約75重量°/。或至少約80重量。/。如DHA之該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊包含自約5〇至約6〇重量％、約50至約70重量％或約50至約80重量％如DHA之該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊之乾細胞重量的至少約25重量％、至少約30重量％、至少約40重量％、至少約 50重量％或至少約60重量％為二十二碳六烯酸。在某些實施例中，該生物質塊之乾細胞重量的約25至約65重量％、約 25至約50重量％、約30至約40重量％或約25至約35重量°/〇為二十二碳六烯酸。在某些實施例中，該生物質塊包含約1〇重量％或更小、約9重量％或更小、約8重量％或更小、約7 重量％或更小、約6重量％或更小、約5重量％或更小、約4 重量％或更小、約3重量％或更小、約2重量％或更小或約1 重量％或更小如EPA之該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊包含自約1至約10重量％、約1至約5重量％、約2至約 5重量％、約3至約5重量％或約3至約10重量％如EPA之該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊實質上不含EpA。 18 201036554 在某些貫施例中’該生物質塊包含至少約5 : 1、至少約7 : 1、至少約10 : 1、至少約11 : 1、至少約14 : 1、至少約15 : 1、至少約17 : 1、至少約20 : 1、至少約25 : 1、至少約50 : 1或至少約100 : 1之重量比的DHA : EPA，其中該生物質塊包含約10重量％或更少之如EPA的該等脂肪酸。在某些實施例中’該生物質塊包含自約0.1至〇_2重量％、約〇.丨至約〇.3 重量％、約0_1至約0.4重量％、約0.1至約〇.5重量％或約〇.1 至約1.5重量％如ARA之該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊包含約1.5重量％或更少、約1重量％或更少、約〇.5 重量％或更少、約0.4重量％或更少、約0.3重量％或更少、約0.2重量°/〇或更少或約〇·ΐ重量％或更少如ARA之該等脂肪酸。某些實施例中，該生物質塊實質上不含ARA。在某些實施例中，該生物質塊包含至少約20 : 1、至少約40 : 1、至少約60 : 1、至少約80 : 1、至少約100 : 1、至少約150 : 卜至少約200 : 1、至少約250 : 1或至少約300 : 1之重量比的DHA: ARA。在某些實施例中，該生物質塊包含自約0.5 至約1重量％、約0.5至約2重量％、約0.5至約5重量％、約0.5 至約6重量％、約1至約5重量％、約1至約6重量％、約2至約 5重量％或約2至約6重量％如D PA η - 6之該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊包含約6重量或更少、約5重量％或更少、約2重量％或更少、約1重量％或更少或約〇.5重量％或更少之如DPAn-6的該等脂肪酸。在某些實施例中，該生物質塊實質上不含DPAn-6。在某些實施例中，該生物質塊包含大於約6 : 1、至少約8 : 1、至少約1〇 : 1、至少約15 : 19 201036554 1、至少約20 : 1、至少約25 : 1、至少約5〇 : 1或至少約1 〇〇 : 1之重量比的DHA : DPA。在某些實施例中’該生物質塊包含具有約5重量％或更少、約4重量％或更少、約3重量％或更少或約2重量％或更少之各亞麻油酸(18 : 2n-6)、次亞麻油酸(18 : 3 n-3)、二十烯酸(20 ·_ 1 n-9)、及芥子酸(22 : 1 n-9)。本發明一已單離生物質塊的特性係與該已單離生物質塊之内源或天然性質有關而不與外源性導入之物質有關。微生物油本發明進一步係有關於製造微生物油之方法。在某些貫施例中，該方法包括在培養物内生長本發明之破囊壺菌以產生生物質塊並自該生物質塊萃取含ω_3脂肪酸之油。該油可自新採集之生物質塊萃取或可自業經貯存於可防止糟踢之條件下的先前觸之线f料取。可㈣已知方法以培養本發明之破囊壺菌、該生物質塊萃取微生物油、油的脂肪酸輪廓。見，例如自該培養物離析生物質塊、自

20 201036554 在某些實施例中，該微生物油包含一約〇重量％、至少約0.1重量％、至少約0.2重量％、至少約〇 5重量％、至少約 1重量％、至少約1.5重量％、至少約2重量％或至少約5重量 %之固醇酯溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一自約0至約1_5重量％、約〇至約2重量％、約〇至約5重量0/〇、約1至約1.5重量％、約〇.2至約1.5重量％、約〇 2至約2重量％或約0.2至約5重量％之固醇酯溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一小於約5重量％、小於約4重量％、小於約3 重量％或小於約2重量％之固醇酯溶離份。在某些實施例中，§亥微生物油包含一至少約65重量％、至少約70重量％、至少約75重量％、至少約8〇重量。/。、至少約85重量％或至少約90重量％之三酸甘油酯溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一自約65至約95重量％、約75至約95重量◦/〇或約 80至約95重量％、或約97重量％或約98重量％之三酸甘油酯溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一至少約0.5重量0/。、至少約1重量％、至少約1.5重量％、至少約2重量〇/〇、至少約2.5重量％或至少約5重量％之游離脂肪酸溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一自約〇·5至約5重量％、約〇_5至約2.5重量％、約0.5至約2重量％、約0.5至約1.5重量 %、約0.5至約1重量％、約1至約2.5重量％、約1至約5重量％、 1.5至約2·5重量％、約2至約2·5重量％或約2至約5重量％之游離脂肪酸溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一小於約5重量％、小於約4重量％、小於約3重量％、小於約2重量°/◦或小於約1重量％之游離脂肪酸溶離份。在某些實施例 21 201036554 中，該微生物油包含一至少約0.5重量％、至少約1重量％、至少約1 · 5重量％、至少約2重量％或至少約5重量％之固醇溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一自約0.5至約1.5 重量％、約1至約1.5重量％、約〇.5至約2重量％、約0.5至約5 重量％、約1至約2重量％或約1至約5重量％之固醇溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一小於約5重量％、小於約4重量％、小於約3重量❶/〇、小於約2重量％或小於約1重量 %之固醇溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一至少約1.5重量％、至少約約2重量％、至少約2·5重量％、至少約3重量％、至少約3.5重量％或至少約5重量。/。之甘油二酸酯溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含一自約15至約 3重量％、約2至約3重量％、約L5至約3 5重量％、約丨5至約 5重量％、約2.5至約3重量❹/。、約2_5至約3.5重量％或約2.5至約5重量％之甘油二酸酯溶離份。在某些實施例中，該微生物油包含小於約2重量％、小於約15重量％、小於約丨重量％或小於約0.5重量％之不可息化物。存在於該微生物油内之脂質種類（諸如三酸甘油酯溶離份）可藉驟層分析法而分離並藉薄層層析法(TLC)而分析、或藉本項技藝内已知之其它方法而分離並分析。在某些實施例中，該微生物油及/或其-或多種選自該三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、油二酸獅份、及其等之組合的溶離份包== 量％、至少約45重量％、至少觸重量％、至少⑽重量至少約60重量％、至少約65重量％、至少⑽重量％、至少 22 201036554 475重I/。或至少約⑽重量％ dha。在某些實施例中該微生物&及/或其_或多種選自該三酸甘油_溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇_份、甘油二_溶離份、及其等 ^組合的溶離份包含自約避約45重量％、約概⑽重里％、約40至約6〇重量％'約％至約6〇重量％、約55至約⑼ 重量％、約4G至祕重量％、約5()至約65重量％、約55至約 65重里％、約4〇至約70重量％、約4〇至約8〇重量％、約刈至約80重$%、約55至約8G重量％、_至物重量％或約川至約80重量DHA。在某些實施例中，該微生物油包含一含約45重量％或更少、約4〇重量％或更小、約35重量％或更少、約30重量％或更少、約25重量％或更少、約2〇重量％或更少、約15重量％或更少或約13重量％或更少之DHA的固醇酯。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種選自該三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、及其等之組合的溶離份包含約重量％或更少、約9重量％或更少、約8重量。/。或更少、約7重量％或更少、約6重量％或更少、約5重量％或更少、約4重量％或更少、約3重量％或更少、約2重量％或更少或約1重量％或更少之EPA。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種選自該三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、及其等之組合的溶離份包含自約2至約3重量％、約2至約3_5重量％、約2.5至約3.5重量 %、約2至約6重量％、約2_5至約6重量％、約3.0至約6重量％、約3.5至約6重量％、約5至約6重量％或約2至約1〇重量％ 23 201036554 EPA。在某些實施例中，該微生物油及/或其-或多種選自該固醇㈣離份、三酸甘油離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份 '甘油二_旨雜份、極性溶離份(其包括溶離份）、及其等之組合的溶離份實質上不含epa。在某此實施例中，該微生物油及/或其—❹種選自刻醇酿溶離份、三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份(其包括磷脂溶離份）、及其等之組合的溶離份包含至少約5: i、至少7: i、至少約9: 卜至少約10: 1、至少約15:丨、至少約2〇:丨、至少約25: 1、至少約30: 至少約50: i之重量比的DHA!EpA，其中該微生物油及/或其一或多種溶離份包含1〇重量％或更少之EPA。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種選自該固醇酯溶離份、三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離伤、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份(其包括磷脂溶離份）、及其等之組合的溶離份包含至少約5 :丨但小於約20 · 1之重量比的DHA : EPA。在某些實施例中，該 DHA : EPA之重量比為自約5 : 1至約18 : 1、自約7 : 1至約 16: 1或自約10: 1至約15: 1。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種選自該固醇溶離份、三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份（其包括磷脂溶離份）、及其等之組合的溶離份包含自約0.1至約0.25重量％、約〇·2至約0.25重量％、約〇. 1至約0.5重量％或約0.1至約15重量％ARA。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種選自該固醇酯溶離份、三酸甘 24 201036554 油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇館份、甘油二酸醋溶離份、極性溶離份(其包括磷脂溶離份）、及其等之組合的溶離份包含約1.5重量％或更少、約1重量％或更少、約〇5 重量％或更少、約0.2重量％或更少或約〇1重量％或更少之 AR A。在某些實施例中，该微生物油及/或其一或多種選自該固醇酯溶離份、三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份（其包括磷脂〇溶離份）、及其等之組合的溶離份實質上不含ARA。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種選自該固醇酯溶離份、三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份(其包括磷脂溶離份）'及其等之組合的 • 溶離份包含至少約20: 1、至少約30: 1、至少約35 : i、至 - 少約40:卜至少約6〇: 1、至少約80: 1、至少約1〇〇:卜至少約150:卜至少約200:卜至少約25〇:1或至少約3〇〇: 1之重量比的DHA: ARA。在某些實施财，該微生物油及〇 /或其一或多種選自該固醇酿溶離份、三酸甘油醋溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份(其包括雜溶離份)、及其等之組合的溶離份包含自約〇.5至約1重量％、約〇.5至約2重量％、約〇5至約25重量約0.5至約3重量％、約〇,5至約3,5重量％、約〇5至約作量％、約0.5至約6重量％、m至約2重量％、約2至約3重量 %、約2至約3.5重量％、約丨至約2·5重量％、約i至約3重量約1至約3.5重量％、約1至約5重量％或約i至約6重量％DpA η - 6。在某些實施财，該微生物油及/或其—或多種選自該 25 201036554 固醇酯溶離份、三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份（其包括碟脂溶離份）、及其等之組合的溶離份包含約6重量％或更少、約 5重量％或更少、約3重量％或更少、約2.5重量％或更少、約 2重量％或更少、約1重量％或更少或約〇·5重量％或更少之 DPAn-6。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種衍生該固醇酯溶離份、三酸甘油酯溶離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份（其包括磷脂溶離份）、及其等之組合的溶離份實質上不含DpA n-6。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種選自該固醇酯溶離份、三酸甘油酯餾份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份 '甘油二酸酯溶離份、極性溶離份（其包括磷脂溶離份）、及其等之組合的溶離份包含大於6 :卜至少約8 : 1、至少約10 : 1、至少約15 : 1、至少約2〇 : 1、至少約25 : 1、至少約50 : 1或至少約1〇〇 : 1之重量比的DHA : dpa。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種選自該固醇酯溶離份、三酸甘油酯游離份、游離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份(其包括磷脂溶離份）、及其等之組合的溶離份包含約5重量％或更少、約4重量％或更少、約3重量°/〇或更少、約2重量％或更少、約15重量％或更少、約1重量％或更少或約〇5重量％或更少之各亞麻油酸（18.2 n-6)、次亞麻油酸（18: 3 n-3)、二十烯酸(20: 1 n-9)、及芥子酸(22 : 1 n-9)。在某些實施例中，該微生物油及/或其或多種選自該固醇酯溶離份、三酸甘油酯溶離份、游 26 201036554 離脂肪酸溶離份、固醇溶離份、甘油二酸酯溶離份、極性溶離份(其包括磷脂溶離份）、及其等之組合的溶離份包含約 5重量％或更少、約4重量％或更少、約3重量％或更少、約2 重量％或更少、約1.5重量％或更少或約1重量％或更少十七酸（17 : 0)。在某些實施例中，該微生物油及/或其一或多種溶離份包含自約0.01至約5重量％、約0·05至約3重量％或約 0.1至約1重量％十七酸。該三酸甘油1旨分子含有3個中央碳原子 Ο ^ 因此可形成不同之位置異構物。在某些實施例中，該微生物油包含一三酸甘油酯溶離份，其中以HPLC層析圖上之波峰的相對面積百分率為基 - 準，在該三酸甘油醋溶離份中之三酸甘油醋的至少約 _ 20%、至少約30%、至少約35%或至少約40%在該三酸甘油西旨（二-取代之DHA)内之選自sn-1、sn-2、及sn-3位置中之任兩個位置處含有DHA。在某些實施例中，該微生物油包含一三酸甘油醋溶離份，其中以HPLC層析圖上之波峰的相對

Q 面積百分率為基準，在該三酸甘油醋溶離份中之三酸甘油酯的自約20°/◦至約40%、約20%至約35%、約30%至約40% 或約30%至約35%在該三酸甘油酯内之選擇自sn-1、sn-2或 sn-3位置中之任兩位置含有DHA。在某些實施例中，該微生物油包含一三酸甘油酯溶離份，其中以HPLC層析圖上之波峰的相對面積百分率為基準，在該三酸甘油酯溶離份中之三酸甘油酯的至少約5%、至少約10%、至少約15%或至少約20%於所有sn-1、sn-2、及sn-3位置含有DHA(三-取代 27 201036554 之DHA)。在某些實施例中，該微生物油包含一三酸甘油酯溶離份，其中以HPLC層析圖上之波峰的相對面積百分率為基準，該三酸甘油®旨溶離份中之三酸甘油酿的自約5%至約 20%、約5%至約15%、約1〇%至約20%或約10%至約15%於所有sn-1、sn-2、及sn_3位置含有DHA。反之，在美國專利第6,582,941號内所報告之TAG物種於所有3個位處並不含 DHA。在某些實施例中’該微生物油包含一三酸甘油酷溶離份，其中以HPLC層析圖上之波峰的相對面積百分率為基準’在該三酸甘油酯溶離份中之三酸甘油酯的至少約 50% '至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約7〇0/〇或至少約75%在該三酸甘油酯内之選自⑽-丨、sn_2或811_3位置之任一位置含有DHA。在某些實施例中，該微生物油包含一三酸甘油酯溶離份，其中以HPLC層析圖上之波峰的相對面積百分率為基準，在該三酸甘油酯溶離份中之三酸甘油酯的自約50%至約75%、約50%至約7〇%、約5〇%至約 65%、約60%至約75%、約6〇%至約7〇%或約6〇%至約65%在該三酸甘油酯内之選自srM、sn_2、及sn_3位置中之任一位置含有DHA。組成物本發明進-步係有關於含本發明一破囊壺菌'本發明一已單離生物質塊、本發明—微生物油或其等之組合的組成物。，根據該組成物之需求，可藉任何已知技術而進一步化學或物理修飾或加工本發明一破囊壺菌、生物質塊或微生 28 201036554 物油。在用於組成物内之前，可藉以下方法而乾燥破囊壺菌細胞或生物質塊’該方法包括，但不限於：冷;東乾燥、風乾、喷霧乾燥、隧道乾燥、真空乾燥(束態乾燥）或類似方法。或者’經採集並清洗之生物質塊不需乾燥即可直接用於組成物内。見，例如美國專利第5，13〇,242號及第6,812，_號。本發明之微生物油可作為起始物質以更有效地產生富〇含_酸(諸如DH取聽。勤可以使本發明該等微生物油進行本項技藝已知之各種純化技術(諸如蒸館或尿素加成）以產生具更高濃度之加歧另—種脂肪酸的更高效力產物。本發明該等微生物油亦可用於化學反應以產生衍 . 生自該等油内之脂肪酸的化合物。諸如DHA或另-種脂肪 - 酸之酯類及鹽類。曰本發明之一組成物可包含一或多種賦形劑。如文中使用’“賦形劑，，係指用於本發明-組成物以使該組成物(其包 0 括食品以及醫藥、化妝品、及工業組成物)得到所欲特性之組份或組份的混合物。當添加至藥學組成物日村被稱為“藥學上可接受”賦形劑之本發明一賦形劑意指該賦形劑為化合物、物質、組成物、鹽、及/或劑型，其在合理的醫學判斷犯圍内’適於接觸人類及動物的組織且在所欲接觸期間内不會有過量毒性、刺激性、過敏反應或其它有問題的併發症並符合合理的效益性/危險性比率。在某些實施例中，該名詞“詩上可接受，，意指適將動物且更日㈣地可適用於人類且被聯邦或州政府f理局許可或列示在美國藥典 29 201036554 (U.S. Pharmacopeia)或其它普遍承認之國際藥典内。可使用各種賦形劑。在某些實施例中，該賦形劑可以是，但不限於：驗劑、安定劑、抗氧化劑、黏著劑、分離劑、塗覆劑、外相組份、控制性釋放組份、溶劑、表面活化劑、保濕劑、緩衝劑、填料、柔潤劑或其等之組合。除了文中所論述之賦形劑外，賦形劑可包括（但不限於）列示在TTze «Sci⑼ce am/ o/P/mrmac少，第 21 版(2005)内之賦形劑。文中包含在特定分類(例如“溶劑，’）内之賦形劑有意闡明該賦形劑之作用而非對其加以限制。特定賦形劑可屬於多重分類範圍。本發明之組成物包括，但不限於：食品產物、藥學組成物、化妝品、及工業用組成物。在某些實施例中，該組成物為食品產物。食品產物為適於動物或人類食用之任何食物’且兼包括固體及液體組成物。食品產物可以是動物或人類食品的添加物。食品包括，但不限於一般食品；液體產物，其包括牛奶、飲料、治療性飲品、及營養飲品；機能性食品；補給品；營養藥物，嬰兒食品，其包括早產兒食品；適於孕婦或银乳婦女之食品；用於成人之食品；老年病人的食品；及動物食品。在某些實施例中’本發明之破囊壺菌、生物質塊或微生物油可直接作為以下之一或多種或包括以下之一或多種作為添加物：油、起穌油（shortening)、抹醬（Spread)、其它脂肪成份、飲料、醬料、以乳品或大豆為主之食品（諸如牛奶、酸奶酪(yogurt)、乾酪及冰淇淋）、烘烤食品、營養產物， 30 201036554 例如營養補給品（呈膠囊或旋劑形式）、維生素補給品、飲食補給品、粉狀飲品、粉狀食品產物之成品或等之組合。可包括本發明之微生物油的食品組成物之部份清單包括仁不限於.以大显為主之產物（牛奶、冰琪淋、酸奶路、飲料礼路、抹醬、增白劑）；湯及湯料；生麵網、麵糊 (batter)、及洪烤食品項目，其包括，例如烘烤製品、早餐〇縠類、蛋糕、絡餅、派銘餅、小蛋糕、餅乾、棒狀物(bar)、麵包、麵包捲MD、小圓餅(biscuit)、鬆餅、洪烤糕點 (pastry) '烤餅(則ne)、油炸或烤過的小麵包片（⑽t叫、薄脆餅乾(咖ker)、甜食(sweet㈣）、點心餅、派館餅、格蘭諾拉麥(gmnGla)/f£心棒(咖⑶㈣、及烤_餅㈣_ pastries)"糖果，硬甜食；巧克力及其它甜食；口香糖；液體食品產物’例如牛奶、能量飲料、嬰兒食品、碳酸飲料、茶、液態膳食、果汁、以水果為主之飲料、以蔬菜為主之〇飲料；多維生素糖漿、代餐、藥用食品、及糖漿；粉末狀飲料混合物；意大利麵製品(_a);加工魚產物；加工肉產物’加工家禽產物；肉汁及醬汁；佐料(蕃蘇醬、美奶滋 (mayonnaise)等）；以蔬菜油為主之抹醬；乳製品，·酸奶酷；奶油’冷凌奶製品；冰淇淋；冷束點心，·冷凍酸乳酷；半固體食品產物，諸如嬰兒食品；布丁(pudding)及明朦點心；加工及半加工乾酪；薄烤餅粉；食品棒狀物，其包括能量棒，鬆餅粉；沙拉調味料；蛋替代粉；堅果及以堅果為主之抹醬，鹽味點心，諸如馬鈴薯片及其它炸馬鈴薯片或脆 31 201036554 片、玉米片、玉米薄脆餅片（t〇rtilla chip)、擠製點心。爆玉米花、椒鹽捲餅(pretzel)、馬鈴薯脆片、及堅果；特製品點心，諸如沙司（dip)、乾水果點心、内點心、豬皮、健康食品棒及米/玉米餅。在某些實施例中，本發明之微生物油可用以增補嬰兒食品。嬰兒食品可僅經本發明之微生物油增補或經本發明微生物油與衍生自可產生花生四烯酸(ARA)之微生物之物理精煉油的組合增補。可產生ARA之微生物為，例如高山被孢黴（Mortierella alpina)或斯馬克節被孢黴(Mortierella sect. Schmuckeri)。或者，嬰兒食品可經本發明之微生物油與富含ARA 之油，其包括 ARASCO®(Martek Bi〇sciences， Columbia，MD)，之組合增補。在某些實施例中，該組成物為動物飼料。“動物，，意指屬於動物界之任何非人類生物，且其包括，但不限於：水棲動物及陸棲生物。該名詞“動物飼料，，或“動物食品，，係指計劃用於非人類動物之任何食物，非人類動物不限於魚類；商業魚類；觀賞魚類；魚類幼苗；雙殼類動物；軟體動物；甲殼綱動物；有殼的水生動物；蝦；幼苗蝦；豐年蝦(artemia);輪蟲；豐年蝦(brine shrimp”濾食性動物；兩棲動物；爬行動物；哺乳動物；馴養動物；農場動物動物園動物；休間動物；種畜；競賽用動物；表演用動物. 傳家寶動物；稀有或瀕於滅絕的動物；伴侶動物寵物諸如狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、 X馬，瘦長目動物，诸如猴（例如卷尾猴屬（cebus)、獼猴(比以 J邛洲綠猴、 32 201036554 赤猴（patas)、舍解箪猴（cynomolgus)、及長尾猴 (CerC〇PitheCUS))、無尾猿、獲獲狒狒、長臂猿、及黑猩獲；犬科動物，諸如狗月伯.< ^ _ 及狼，貓科動物，諸如貓、獅、及虎；馬科動物’諸如馬、_、 ' .驢及斑馬，食用動物，諸如乳牛、牛豬&平，有蹄類哺乳動物，諸如鹿及長頸鹿；喷齒目動物，諸如大氣、小氣、倉鼠(hamster)及天竺鼠等等。動物飼料包括，但不阳於.卜太兰、寺 —不限於.水產養殖飼料；馴養動物飼料， Ο

其包括龍物飼料、動脱A h k，劲物園動物飼料、役用動物飼料、家畜飼料；或其等之組合。在某些實施例中，該組成物為一種用於其肉或產物可被人U之任何動物(諸如可自其獲得供人類食用之肉、蛋或奶的任何動物）的飼料或飼料補給品。當Μ此等動物時，可將呂養物(諸如LC-PUFA)併入此等動物之肉、奶、蛋或其它產物内以增加其等之這些營養物的含量。、在某二實細*例中，該組成物為可經粉碎以形成具有適於被浮㈣物、豐年振、輪蟲、及齡性動純食之大小的顆粒之喷務乾燥物質。在某些實施例中，經該組成物慑養之浮游動物、豐年瑕或輪蟲隨後可拿來餵魚類幼苗、魚類、有设的水生動物、雙殼類動物或甲殼綱動物。在某些實施例中，該組成物為藥學組成物。合適的藥學組成物包括’但不限於：抗發炎組成物、用於治療冠狀動航、、臟病之藥物、用於治療硬脈硬化之藥物、化療劑、活性賦形藥、tf疏鬆症藥物、抗抑鬱劑、抗f厥藥、抗幽門螺杯ij (anti_Heiic〇bacter pyi〇ri)藥物、用於治療神經變 33 201036554 性症之藥物、用於治療變性肝病之藥物、抗生素、降膽固醇組成物、及降三酸甘油酯組成物。在某些實施例中，該組成物為醫療食物。醫療食物包括在醫生的監督丁欲經攝食或從外部投與之在組成物内的食物，且計劃用於一病症的特定飲食管理，根據已認知的科學原理，該病症之特殊營養需求係藉醫學評估而確認。在某些實施例中’可將該微生物油調配成劑型。劑型可包括，但不限於：錠劑、膠囊、扁囊劑（cachet)、小片、丸劑、散劑及顆粒；以及非經腸劑型，其包括，但不限於：含有效量之該微生物油之溶液、懸浮液、乳液、及無水散劑。在本項技藝中亦已知此等調配物亦可含有藥學上可接受稀釋劑、填料、分解劑、結合劑、潤滑劑、表面活化劑、疏水媒劑、水溶性媒劑、乳化劑、緩衝劑、保濕劑、增濕劑、增溶劑、防腐劑等。投藥形式可包括，但不限於：含有該微生物油及一或多種合適藥學上可接受載劑之錠劑、糖衣藥丸(dragee)、膠囊、囊片（caplet)、及丸劑。就口服而言，該微生物油可以合併本項技藝中已為吾人所熟知的藥學上可接受載劑。此等載劑可以使本發明之微生物油調配成適於被欲治療之患者口服的鍵劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿體、懸浮液等。可藉以下方法而獲得用於口服之醫藥製劑：添加固體賦形劑’可選擇性研磨所形成混合物’並若必要在添加合適輔藥後加工該等顆粒之混合物以獲得錠劑或糖衣藥丸核心。合適的賦形劑包括，但不限於：填料、諸如糖，其包括但 34 201036554 不限於乳输 ^ 、庶糖、甘露醇、及山梨糖醇；纖維素製劑， :°但不限於：玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈐薯殿粉、明賑、主切膠頁蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、缓甲基纖維素納、及聚乙烯峨洛唆酮(PVP)。若必要，可添加刀解劑，諸如，不限於：交聯聚乙烯t各咬_、缓脂或海藻酸或其鹽。諸如絲誠。可口服之醫藥製劑包括，不限於’由明膠製成之配合插入(puch-fit)膠囊、以及由 0 明膠製成之軟密封膠囊、及增塑劑，諸如甘油或山梨糖醇。在某些實施例中，該組成物為化妝品。化妝品包括，不限於·乳液、乳膏、化妝水、面膜、肥皂、洗髮劑、洗劑、面霜、護膚劑、化妝品、沐浴劑、及分散液。化妝 5式劑可以是藥肖或麵用試劑。 ' 在某些實施例中，該組成物為工業用組成物。在某些實施例中’該組成物為用於―或多種製品之起始物質。製品包括，但不限於：聚合物；照像光敏材料；去污劑；工〇業用油，或工業用去污劑。例如美國專利第7,259,006號描述3 DHA之脂肪及油用於製造蘿酸(behenic扣丨幻及使用蘿酸製造照像敏感性材料的用途。使用該等組成物之方法在某些實施例中，該等組成物可用以治療人類或動物之病症。該等名詞“治療”及“處置，，係兼指治療性處置及預防性或防病性措施’其中係使患者避免減缓(減輕）一非所欲生理病症、疾病或障礙或使其獲得有利或所欲臨床結果。就本 35 201036554

疾病或障礙有關之劣程度之減少；病症、或障礙並未惡化）； -斤欲臨床結果包括，但不限於：與病症、之病徵或體徵的緩解；病症、疾病成陸、疾病或障礙之穩定（亦即該病症、疾病，該病症'疾病或障礙之發作或進展延 :4病症、疾病或障礙之改善；該病症、疾病或障礙之 (不’疋局部或全部且不論是可偵檢或不可倾或病症、疾病或障礙之好轉或改善。處置包括引發臨床上顯著，反應且不會產生過度的副作用。處置亦包括與未接受處置之預期存活期比較，可延長存活期。在某些實施例中’該組成物係用以治療病症、疾病或 p手礙’諸如痤瘡、急性炎症、老年相關黃斑、過敏症、阿 ’兹海默氏症(Alzheimer’s)、關節炎、氣喘、動脈粥瘤硬化、自體免疫症、血脂病症、乳房囊腫、惡病質、癌、心臟再狹乍、心血管疾病、慢性炎症、冠狀動脈心臟病、纖維囊 /包症、肝變性病症、糖尿病、濕疹、胃腸病症、心臟病、两一 ®^甘油6旨位準、高血壓、機能宄進、免疫疾病、抑制劑腫瘤生長、多發性硬化、神經變性病症、骨關節炎、過氧化酶體病症、子癇先兆(preeclampsia)、早產、牛皮癬、肺病、類風濕性關節炎、心臟病之危險、或血拴形成。在某些實施例中，該組成物係用以增加姓娠第三期之長度。在某些實施例中，該組成物係用以控制血壓。在某些實施例中，該組成物係用以改善或維持認知機能。在某些實施例中，該組成物係用以改善或維持記憶力。 36 201036554 可藉與該組成物或劑型相容之任何方法而將該組成物或劑型投入患者之體内。若一物質塊係藉患者而導入自己的體内或若藉另一人、機械或裝置而將該物質導入該患者之體内，則該物質被視為“可投與性(administered)”。因此， “投與’’包括，例如自投藥、藉其它人而投藥、及直間投藥。如文中使用，與“投藥”有關之“持續，，或“連續，，意指投藥之頻率為每天至少一次。然而，應注意的是，該投藥頻率可大於每天一次且仍然具“持續性，，或“連續性，，，例如每日兩次或甚至3次’但其限制條件為不可超過如文中詳述之劑量。用於投藥之裝置及方法在本項技藝中係已知且技術人員可查閱用於導引之各種藥理學參考文獻。例如可查閱“M〇dern Pharmaceutics,^ Banker & Rhodes, Informa Healthcare, USA 第 4 版（2002);及 “Goodman & Gilman，s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics；5 McGraw-Hill

Companies, Inc” New York，第 l〇版(2001)。 “被實驗者”、“個人，，或“患者，，意指需要診斷、預後或治療之任何被實驗者（人類或非人類）。哺乳動物被實驗者包括，但不限於：人類；馴養動物；農場動物；動物園動物；休閒動物；寵物，諸如狗、猶、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠或馬；靈長目動物，諸如猴(例如卷尾猴屬、獼猴、非洲綠猴、赤猴、食蟹猴、及長尾猴屬）、無尾猿、猩猩、彿彿、長濘猿、及黑猩猩；犬科動物、諸如狗及狼；貓科動物，諸女豸4獅、及虎，馬科動物，諸如馬、驢、及斑馬；食用動物’諸如乳牛、牛、豬、及羊；有蹄類哺乳動物，諸 37 201036554 如鹿及長頸鹿；嚙齒目動物，諸如大鼠、小鼠、倉鼠及天竺氣等等。該名詞“被實驗者”亦涵蓋模式動物（m〇dei animal)，例如疾病模式動物，在某些實施例中，該名詞“被實驗者”包括貴重動物（經濟上或其它方面上），例如經濟上重要的家畜、競赛用動物、表演用動物、傳家寶動物、稀有或瀕於滅絕的動物或伴侣動物。在某些實施例中，該被實驗者為人類被實驗者。在某些實施例中，該被實驗者為非人類被實驗者。可以以治療上有效量”、“預防上有效量，，、“治療劑量” 或“預防劑篁”投與該組成物。“治療上有效量，，或“治療劑量，，係指於劑量規定及所需時間下能有效獲得所欲治療效果之數量。治療結果可以是，例如病徵之減輕、延長的存活期、改善的可動性等。治療結果並必是“治療”。“預防上有效量，，或預防劑里係指於劑量規定及所需時間下能有效獲得所欲預防結果之數量。典型上，由於預防劑量係在疾病之較早期或其4用於被實驗者，所以預防上有效量小於用於治療疾病之晚期的治療上有效量。根據欲對被實驗者投與之該破囊壺菌、生物質塊或微生物油的DHA或其它脂肪酸組份的含量’可對該被實驗者投與各種劑量之本藥學組成物。文中該等名詞“每曰劑量規定”、“每曰劑量位準，，及“每曰劑量，，係指每天(每Μ小時)所才又與之DHA或其它脂肪酸組份的數量。因此，例如以每天2 毫克劑量對一被實驗者投與DHa意指該被實驗者接受以每曰計總共2毫克DHA，且不論該DHA係以含2毫克〇HA之單 38 201036554 一劑型投與或以各含〇_5毫克DHA之4個劑型（總共2毫克 DHA)投與。在某些實施例中，DHA之每日用量係以單一劑型或2個劑型投與。本發明該劑型可以呈單一施用或多次施用形式。例如若每日服用4粒錠劑’各錠劑含0.5毫克〇ΗΑ，則可母日一次服用全部4粒錠劑或每日兩次服用2粒錠劑、或每6小時可服用1粒錠劑。在某些實施例中，該每曰劑量為自約100毫克至約15克〇11八。在某些實施例中，該每曰劑 ^ 量為自約1〇〇毫克至約250毫克、約1〇〇毫克至約5〇〇毫克、約100毫克至約1克、約1克至約2.5克、約丨克至約5克、約1 克至約10克、約1克至約15克、約5克至約1〇克、約5克至約 15克、約10克至約15克、約1〇〇毫克至約1〇克、約1〇〇毫克 ’ 至約5克、或約1〇〇毫克至約2.5克。 - 可使用各種方式進行本發明該等組成物或劑型之投藥。例如在某些實施例中，係以連續幾天或每隔一天（兩天兩次(bi-daily)進行投藥。可以在一或數天進行投藥。〇該等組成物與劑型之投藥可以合併用於治療該病症之其它方式。例如本發明該方法可以併用飲食療程、減重療程、成煙療程或其等之組合。本發明該方法亦可以與其它藥學產物一起用以治療該病症。可在其它療程或藥學產物之前或之後投與本發明該等組成物或劑型。含該等組成物之套組本發明進一步係有關於含一或多個單位之本發明組成物的套組或包裝。套組或包裝可包括以下之單位：含本發明該破囊壺菌、生物質塊或微生物油或其等之組合的食品 39 201036554 產物、藥學組成物、化妝品或工業用組成物。套組戋包裝亦可包括-含用於製造食品、化妝品、藥學㈣物或=業用組成物之本發明該破囊㈣、生物f塊或财物油或其等之組合的添加物。 ^ 在某些實施例中，該套組或包裝含有—或多個單位之欲根據本發明該等方法投與之藥學組成物。該套組或包裝可含有一劑量單位或不止一劑量單位（亦即多劑量單位若多劑ϊ單位存在於該套組或包裝内，則可選擇性安排該等多劑量單位以用於連續投藥。本發明該等套組可選擇性含有與其單位或劑型有關之使用說明。此等使用說明可以呈由管理醫藥產物之製造、使用或銷售的政府部門規定之形式，該告示表明政府部門對於可投藥以治療人類的病症或障礙之該藥物製造、使用或销售的許可。該等使職明可以呈任能傳達根據本發明方法有關於套組内之單位或劑型之使用的資訊之形式。例如該等使用說明可以呈印刷物之形式或呈已預記錄之媒許裝置。 ’、且在診察患者之過程中，醫療專業人員可確定本發明該等方法中之一的使用適於該患者，或醫生可確定該患者之病症可藉使用本發明該等方法之一而改善。在開出任何治療方法前，醫生可以與患者討論有關於，例如與該治療方去有關之各種危險及效益。可以使該患者完全瞭解與該治療方法有關之所有已知及可疑的危險。可以以口頭以及奎面形式提供此種討論。在某些實施例中，醫生可以提供串 40 201036554 者有關於該治療方法之文獻資料，諸如產物資訊、教育資料等。本發明亦有關於教育消費者有關於該等治療方法之方法’§亥方法包括於一銷焦點銷售具有消費資訊之該等劑型。在某些實施例中，係於有僱用藥劑師或醫療照護之銷售點進行銷售。該名詞“消費資訊”可包括，但不限於：英文原文、非英文原文、視覺影像、圖表、電話錄音、網址、及可接近現場轉播的客服代表。在某些實施例中，消費資訊可提供有關於根據本發明該等方法之劑型的使用、合適的使用年齡、指徵、禁忌症、合適的給藥、警告、網址的電話號碼之使用說明。在某些實施例中，該方法進一步包括提供相關人員專業資訊以便回答消費者有關於根據本發明該等方法之所揭示治療方法的使用問題。該名詞“專業資訊，，包括’但不限於：當根據本發明方法投與時有關於該治療方法之經設計可以使醫療專業人員回答消費者問題的資訊。 “醫療專業人員”包括，但不限於：醫生、助理醫生、從業護士、藥劑師及消費者服務代表。由於已廣泛地描述本發明，可藉參考文中提供之實例而獲得進一步的瞭解。這些實例僅用於闡明而無意限制本發明。實例1 描述寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之已單離破囊壺菌的特性以進行生物分類學的分類。 41 201036554 自在低潮(low tide)期間之潮間帶棲息地收集試樣。將水、沈積物、活植物材料及腐化的植物/動物碎屑放入無菌 50毫升試管内。將各試樣之部份連同水塗佈在離析培養基之固體瓊脂平板上。離析培養基係由5〇〇毫升人造海水、5〇〇毫升蒸餾水、1克葡萄糖、1克甘油、13克瓊脂、丨克麵胺酸鹽、0.5克酵母萃取物、〇·5克酪蛋白水解產物、丨毫升維生素溶液（100毫克/升噻胺、〇.5毫克/升生物素、〇 5毫克U、 1毫升微量礦物溶液(PII金屬，每升含：6 〇*FeCl36H2〇、 6·84克H3B〇3、〇_86克MnCl24H20、0.06克ZnCl2、0.026克 C〇Cl26H20、0.052克NiS04H20、0.002克CuS045 H20及0.005 克ΝαΜοΟΘ^Ο)、及5〇〇毫克各青黴素G及硫酸鏈黴素。於 20-25°C下在黑暗中培育該等瓊脂平板。2至4天後，在放大倍數下檢查該等瓊脂平板，並以無菌牙籤剔取細胞之菌落並在新的培養基平板上重複劃出條紋。將細胞重複地在新培養基上劃出條紋，直到移除已污染的微生物為止。將得自瓊脂平板之菌落轉移至含有半強度海水及（1亳升）經高壓滅菌之新孵化的豐年蝦幼苗懸浮液之皮氏培養皿(petri dish)。經2至3後，該等豐年蝦幼蝦變得過度發育且具有孢子囊串。於排放時已釋放的游動孢子為雙鞭毛類 (biflagellate) ’其可活躍地自成熟的孢子囊游離孢子釋放後，其在牆上之遺存物清楚可見（以相對比表示）。孢子囊之直徑經測定為12.5微米至25微米，且游動孢子之大小為25 微米至2.8微米χ4·5微米至4.8微米。每一各別孢子囊有8至 24個孢子。將已沈降的遊動孢子放大並快速進行二部分裂 42 201036554 (binary division)以得到四聯體、八聯體且最後得到孢子囊串。八聯體係在該孢子囊成熟期之前的很早期形成。這些特徵與裂殖壺菌屬一致。進一步根據寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之已單離破囊壺菌的18s rRNA基因與已知物種的18s rRNA之相似性而表示該已單離破囊壺菌的特性。藉標準程序 (Sambrook J. and Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual，第 3版。Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)而製備得自寄存在 ATCC登錄號第PTA-9695號下之破囊壺菌的總基因組DNA 並用於該18s RNA基因之PCR擴增。使用先前所述之引子 (primer)進行該 18s RNA之PCR擴增（Honda等人 ’ ·/.五 M/craMo/. 46(6) 1999)。使用染色體DNA模板之PCR條件如下：0.2微莫耳濃度(μΜ) dNTPs、0.1微莫耳濃度各引子、8% DMSO、200毫微克(ng)染色體DNA、2.5單位(U) PfuUltra® 融合HS DNA聚合酶（Stratagene)、及 IX PfuUltra®緩衝劑 (Stratagene)，總共50微升總體積。該PCR實驗程序包括以下步驟：⑴95°C，費時2分鐘；（2)95°C，費時45秒；（3)55 °C，費時30秒；（4)72°C，費時2分鐘；（5)重複步驟(2)至(4)，共40次循環；（6)72°C，費時5分鐘；及(7)維持於6°C下。使用上述染色體模板，PCR擴增可產生具有預定大小之不同DNA產物。根據製造商之使用說明，在病媒pJET1.2/ 純(Fermentas)内選殖該PCR產物且使用所供應的標準引子測定插入序列。 43 201036554 表2表示得自寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之破囊壺菌的該l8s rRNA序列與在the National Center for Biotechnology Information (NCBI)電子資料庫内之DNA序列的比較。簡言之，係藉the VectorNTI程式(Invitrogen)内之計分矩陣“swgapdnamt”(其係為一用於DNA排列的標準）而測定“相同性％”。“涵蓋％”係取自從該NCBI電子資料庫進行 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)計算的結果且係為包含在該對齊的節段内之質詢長度(query length)的百分率。表2 : 18s rRNA序列之比較破囊壺菌相同性％第一次計算值涵蓋％第二次計算值集生破囊壺菌（P) Thraustochytrium aggregatum (p) 98 90 破囊壺菌屬HUl 84 86 破囊壺菌屬8-7 84 91 多增殖性破囊壺菌 (Thraustochytrium multirudimentale) 81 88 破囊壺菌屬PW19 81 85 裂殖壺菌屬ATCC 20888 81 95 (P):表示局部序列如表2所示，已發現就相同性％而言，得自寄存在ATCC 登錄號第PTA-9695號下之破囊壺菌的該18s rRNA(序列辨識編號(SEQ ID NO) : 1)與Honda, D·等人在五政 M/cro. 妨(6): 637-647 (1999)中所提供之集生破囊壺菌的i8s rRNA 基因序列緊密相關’但並非相同。集生破囊壺菌所公開之該18s rRNA序列為一局部序列，其在該序列之中間具有一約71 DNA核苷酸間隙。就涵蓋％而言，本發明該離析物之 44 201036554 18s rRNA基因序列與裂殖壺菌屬ATcc 20888之關係比與集生破囊壺菌之關係更密切。高保留性蛋白質’諸如肌動蛋白及冷-小管素 (tubulin)，連同18s rRNA基因業經廣泛使用來作為用於評估微生物間之種系發生關係的標記(Baldauf, S. M. I54, SI78 (W9))。得自寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之該破囊壺菌的總基因組DNA亦可作為一用於該等肌動蛋白及石-小管素基因之PCR擴增的模板。以用於得自集生破囊壺菌之該等肌動蛋白及0 -小管素DNA序列的保留區之引子進行該PCR擴增。使用染色體DNA模板之該等PCR條件如下：0.2微莫耳濃度dNTPs、0_1微莫耳濃度各引子、8% DMSO、200毫微克染色體DNA、2.5單位Herculase® II融合DNA聚合酶 (Stratagene)、及 IX Herculase®緩衝劑（Stratagene)，總共50 微升總體積。該PCR實驗程序包括以下步驟：（1)95。(：，費時2分鐘；（2)95°C ’ 費時30秒；（3)55°C，費時30秒；（4)72。(：，費時2分鐘；（5)重複步驟(2)至(4)，共40次循環；（6)72°C，費時5分鐘；及(7)維持於6t下。使用上述染色體模板、PCR擴增可產生具有預定大小之不同DNA產物。根據製造商之使用說明，在病媒pjET12/ 純(Fermentas)内選殖該PCR產物且使用所供應之標準引子測定各插入序列。表3表示與可得自公開資料庫之肌動蛋白序列比較，得自寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之破囊壺菌的肌動 45 201036554 蛋白fe：基酸序列(序列辨識編號：^)的彳目同性。經由使用出e VeCt〇rNTI程式之“AlignX”程式内的計分矩陣 “bl〇SUm62mt2”(其係為一用於蛋白質排列之標準）以測定相同性。表3 :肌動蛋白蛋白質序列相同性％之比較破囊壺菌相同性％破囊壺齒屬RT49 98 裂殖壺菌屬ATCC 20888 96 珲磬破囊壺菌 (Inraustochytrium striatum! 96 集生破囊壺菌 96 冷洋日本壺菌 (Japonochytrium marinum) 95 金黃色破囊壺菌 (Thraustochytrium aureum) 95 表4表示與可得自公開資料庫之点-小管素序列比較，得自寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之破囊壺菌的小管素胺基酸序列（序列辨識編號：5)之相同性。經由使用 the VectorNTI程式之“AlignX”程式内的計分矩陣 “blosum62mt2”(其係為一用於蛋白質排列之標準）以測定相同性。表4: /3-小管素蛋白質序列相同性％之比較破囊壺菌相同性°/„ 凱爾蓋朗不動壺菌 (Aplanochytrium kerguelense) 100 史托契諾不動壺菌 (Aplanochytrium stocchinoi) 100 海洋曰本壺菌 100 s 網黏菌目N8 iLabvrinthula sp) N8 100 破囊壺菌屬RT49 .......... ϊόο~^ 集生破囊壺菌 100 ^ 破囊壺菌屬HU1 ......- 100 金黃色破囊壺菌 100 S 金尼破囊壶菌（Thraustochytrium kinnei) 100 破囊壺菌屬#32 ___ 100 破囊壺菌屬PW19 ___ 100 46 201036554 集生裂殖32菌 100 裂殖壺菌屬ATCC 20888 100 根據上述特性描述，咸信該寄存在ATCC登錄號第 PTA-9695號下之已單離破囊壺菌代表新的裂殖壺菌物種且因此亦稱為裂殖壺菌屬ATCC PTA-9695。實例2 在如下述之不同的培養條件下，該寄存在ATCC登錄號第PTA-9095號下之已單離破囊壺菌可產生高位準之細胞生長。典型培養基及培養條件示於表1内。而且亦發現高位準之脂肪酸及DHA(亦即該乾細胞重量之大於5〇重量％為脂肪酸且該脂肪酸曱酯之大於50重量％為DHA)。在於22.5C下具有8200ppm C1—且於pH 7.0下具有20% 溶氧之已假過礙及氮的培養物内，經7天培養後，該離析物可產生140克/升之乾細胞重且脂肪酸含量為70重量％。使用閉環(Closed loop)氨進料並維持該pH於7·〇下。在這些條件下，ω-3生產力為8.92克/(升*天），且在7天内可得到4.7克/ 升之ΕΡΑ(脂肪酸之5重量％)及56.3克/升之DHA(脂肪酸之 57重量％) <= 在於22_5°C下具有3640ppm C1-且於pH 7.0下具有20% 溶氧之已餵過碳及氮的培養物内，經7天培養後，該離析物可產生82克/升之乾細胞重且脂肪酸含量為58重量％。在這些條件下，該ω-3生產力為4.5克/(升*天），且在7天内可得到2· 1克/升之ΕΡΑ(脂肪酸之4.3重量％)及28.5克/升之 DHA(脂肪酸之58.7重量％)。在於22.5°C下具有980ppm Cr且於pH 7.0下具有20%溶 47 201036554 氧之已餵過碳及氮的培養物内，經7天培養後，該離析物可產生60克/升之乾細胞重且脂肪酸含量為53重量％。在這些條件下，該ω-3生產力為2.8克/(升*天），且在7天内可得到 1·1克/升之ΕΡΑ(脂肪酸之3.4重量％)及18·4克/升之DHA(脂肪酸之56.8重量％)。實例3 自該寄存在ATCC登錄號第ΡΤΑ-9695號下之已單離破囊壺菌的生物質塊試樣(試樣Α)萃取油類。在於22.5°C下具有980ppm Cl—且於pH 7.0下具有20%溶氧之已餵過碳及氮的培養物内產生該生物質塊。藉己烷萃取法而自生物質塊試樣A萃取油類以得到微生物油試樣A1。簡言之，利用不銹鋼管及不銹鋼球軸承以己烷將乾燥的生物質塊磨碎，費時2小時。真空過濾該漿體並收集濾液。利用旋轉蒸發器移除己烷。亦利用 FRIOLEX® 方法（GEA Westfalia Separator UK Ltd·，Milton Keynes，England)自生物質塊試樣a萃取油類以得到微生物油試樣A2。利用低壓驟層分析法自微生物油试樣A1及A2離析各別脂質種類，並測定各種類之重量 %。使用具有火焰離子化檢測作用之氣體層析法(gc_fid) 測定各種類之可作為脂肪酸甲酯(FA Μ E)的脂肪酸輪摩。驟層分析法-使用驟層分析法以分離存在於該等原油内之脂質種類，並測定存在於該等油内之各種類的重量 %。該層析法系統係利用具有3毫升/分鐘之由石油醚及乙酸乙酯所組成的流動相之矽凝膠（Silica Gel) 60 @MD Chemical, Gibbstown，NJ)。使用階段梯度以選擇性溶析得 48 201036554 自該柱之各脂質種類。該流動相梯度係自⑽％石油謎開始並以50%乙酸乙酯結束（繼而進行100%甲醇清洗）。使用 Gilson FC 204大床溶離份收集器（Gils〇n, Inc , Middiet〇n， WI)在内彳线;容離份。藉薄層層析法而分析各試管且匯集含各脂質種類（如藉在具有預定滯留係數 (Rf)之TLC平板上之單斑點而判斷）之該等試管，濃縮至乾燥並稱重。然後以重量儀測定總溶離份含量。 TLC分析-在矽凝膠平板上進行薄層層析法。使用由石油醚：乙醚：乙酸(80 : 20 :丨）所組成之溶劑系統溶析該等平板並使用蛾蒸汽進行視覺化測定。然後比較各斑點之Rf 值與各脂質種類之報告文獻值。脂肪酸分析。分析生物質塊及已單離脂質試樣之可作為FAME的脂肪酸組成物。直接稱出試樣的重量並加入螺旋帽試管内並添加C19 : 〇内標準物(NuCheck, Elysian，MN)在甲苯中之1毫升溶液及丨.5 NHC1在甲醇中之2毫升溶液至各試管。短暫地渦漩該等試管，然後M100°CT放入加熱板塊内（heating block)，費時2小時。自該加熱板塊移除試管，使其等冷却並添加飽和NaCl在水中之1毫升溶液。再渦旋該等試管、離心處理並將上（有機）層之一部份放在GC小玻瓶内，然後藉GC-FID而分析。使用利用Nu-Chek-PrepGLC參考標準物(Nu-Chek Prep，Inc.，Elysian，MN)所產生之3點内標準校準曲線定量FAME並根據滯留時間暫時地辨識。以總 FAME之毫克/克及％表示所存在之脂肪酸。藉將該原油溶解在己烧内並施加至該柱之頂部而製成 49 201036554 試樣A1。使用驟層分析法進行該試樣之分餾後，該原油内之固醇酯溶離份佔1.2重量。/◦、三醯甘油（TAg)溶離份佔82 7 重量°/。、游離脂肪酸(FFA)溶離份佔〇.9重量％、且二醯甘油 (DAG)溶離份佔2.9重量％。分別以毫克/克及％ FAME計算之試樣A1原油及已單離溶離份之總脂肪酸輪廓示於下表5 及表6内。表5 :以毫克/每克FAME計算之試樣A1脂肪酸輪廟

50 201036554 C22:6 N3* 253.5 569.7 107.3 556.5 352.8 451.4 所有FAME之總數 408.6 934.0 435.4 1 958.0 620.1 786.4 表6 :以總FAME之百分率表示之試樣A1脂肪酸輪廓生物質塊原油固醇酯 TAG FFA DAG 脂肪酸 %FAME %FAME %FAME %FAME %FAME %FAME C12:0* 0.1 0.0 0.4 0.3 0.3 0.0 C14:0* 1.4 1.5 2.9 2.1 2.1 2.2 C14:l* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C15:0 0.3 0.4 0.7 0.3 0.3 0.3 C16:0* 25.8 25.6 51.0 28.6 29.6 28.6 C16:l* 0.0 0.0 0.2 0.0 0.1 0.0 C18:0* 1.6 1.8 9.9 1.8 1.6 1.8 C18:l N9* 0.0 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 C18:l N7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:2 N6* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:0* 0.4 0.6 3.0 0.5 0.3 0.4 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:4 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C22:0* 0.0 0.1 1.7 0.1 0.0 0.1 C20:4 N7 0.0 0.0 0.2 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4N6* 0.3 0.4 0.0 0.3 0.3 0.2 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20.4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 C20:5 N3* 4.5 4.2 0.8 4.0 4.9 5.4 C24:0* 0.0 0.0 1.4 0.0 0.0 0.0 C22:4 N9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C24:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C22:5 N6* 2.9 3.2 2.1 2.8 2.4 2.4 C22:5 N3* 0.3 0.5 0.2 0.4 0.5 0.3 C22:6 N3* 62.0 61.0 24.6 58.1 56.9 57.4 FAME%之總數 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 藉將該原油溶解在己烷内並施加至該柱之頂部而製成試樣A2。使用驟層分析進行分餾後，該粗油内之固醇酯溶離份佔0.8重量％、三醯甘油（TAG)溶離份佔83.4重量％、游離脂肪酸(FFA)溶離份佔1.8重量％、且二醯甘油（DAG)溶離 51 201036554 份佔5.6重量％。分別以毫克/克及％^^^^計算之气油及已單離溶離份的總脂肪酸輪廓示於下表7及表^羨八2原表7:以毫克/每克FAME計算之試樣A2脂肪酸輪廓内。生物質塊原油固醇酯 TAG FFA ~[ --——~~~_ 重量％ ΝΑ NA 0-8% 83.4% 1.8% dag -——_ 5.6% 脂肪酸 FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） FAME ' (毫克/克） FAME (毫克/克） FAME (亳克/克） C12:0* 0.6 0.0 0.0 1.5 0.0 1.0 C14:0* 5.7 13.2 8.9 14.1 9.5 5.4 C14:l* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C15:0 1.3 3.3 2.8 3.4 2.1 2.2 C16:0* 105.5 233.7 183.8 246.1 159.7 137.3 C16:” 0.0 0.0 0.0 0.8 0.0 0.0 CI8:0* 6.4 16.6 23.6 16.9 II.3 5.6 C18:1 N9* 0.0 7.6 5.0 4.3 2.4 2.6 C18:l 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:2 N6* 0.0 2.2 0.7 1.6 0.8 5.1 C20:0* 1.8 5.2 12.1 5.5 2.6 1.1 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:4 N3 0.0 0.0 0.0 0.8 1.0 0.0 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N6 0.0 0.0 0.0 0.3 0.0 0.0 C22:0* 0.0 0.7 6.0 1.3 0.8 0.0 C20:4 N7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N6* 1.0 3.0 0.0 3.1 2.3 1.2 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 1.5 4.1 1.4 4.3 2.7 1.0 C20:5 N3* 18.2 38.6 2.7 38.6 39.5 45.5 C24:0* 0.0 0.0 4.7 0.6 0.0 0.3 C22:4 N9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C24:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C22:5 N6* 11.9 28.2 8.6 29.6 18.0 14.7 C22:5 N3* 1.1 3.4 0,0 3.5 2.5 2.2 C22:6 N3* 253.5 566.7 102.2 575.0 475.3 447.2 所有FAME之總數 408.6 926.5 362.3 951.3 730.4 672.5 52 201036554 表8 :以總FAME之百分率表示之試樣A2脂肪酸輪廓生物質塊原油固醇酯 TAG FFA DAG 脂肪酸 %FAME %FAME %fame %FAME %FAME %FAME C12:0* 0.1 0.0 〇.〇 0.2 0.0 0.2 C14:0* 1.4 1.4 2.4 1.5 1.3 0.8 C14:l* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C15:0 0.3 0.4 0.8 0.4 0.3 0.3 C16:0* 25.8 25.2 50.7 25.9 21.9 20.4 C16:l* 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 C18:0* 1.6 1.8 6.5 1.8 1.5 0.8 C18:l N9* 0.0 0.8 1.4 0.5 0.3 0.4 C18:l N7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:2 N6* 0.0 0.2 0.2 0.2 0.1 0.8 C20:0* 0.4 0.6 3.3 0.6 0.4 0.2 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Cl8:4 N3 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.0 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C22:0* 0.0 0.1 1.7 0.1 0.1 0.0 C20:4 N7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N6* 0.3 0.3 0.0 0.3 0.3 0.2 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 C20:5 N3* 4.5 4.2 0.7 4.1 5.4 6.8 C24:0* 0.0 0.0 1.3 0.1 0.0 0.0 C22:4 N9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C24:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C22:5 N6* 2.9 3.0 2.4 3.1 2.5 2.2 C22:5 N3* 0.3 0.4 0.0 0.4 0.3 0.3 C22:6 N3* 62.0 61.2 28.2 60.4 65.1 66.5 FAME%之總數 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

實例4 使用己烷萃取法（試樣A1)或如實例3所述之該 FRIOLEX® 方法(GEA Westfalia Separator UK Ltd.，Milton 53 201036554

Keynes, England)(試樣A2)自先前萃取自該寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之已單離囊壺菌的微生物油試樣離析三醯甘油（TAG)。使用具有常壓化學離子化-質譜測定法 (APCI-MS)檢測作用之非水性逆相高效液相層析法 (NARP-HPLC)測定各TAG異構物之相對面積％，並利用該等質譜片段圖案進行各位置異構物之暫時辨識。使用驟層分析法離析各別脂質種類，其包括TAG。藉 HPLC/APCI-MS而分析該TAG溶離份以測定何種脂肪酸分子團存在於各TAG物種内、及各TAG物種之相對含量。各 TAG尖峰之暫時辨識係根據滯留時間及各波峰之APCI光譜。當使用NARP-HPLC時，各TAG之滯留時間隨當量碳數 (ECN)(其之定義為所有醯基鏈中之總碳數減雙鍵數之兩倍) 增加而增加。而且，當使用最佳層析條件時，亦可拆分具有相同ECN但不同之飽和及不飽和脂肪酸分佈的TAG物種之臨界對、以及具有不同鏈長之脂肪酸。各TAG波峰之APCI 質譜可提供質子化分子離子[M+H]+、銨加成物離子 [M+NH4]+、及DAG片段離子等之質量。各TAG可得到獨特的質譜，且該等DAG得自該sn-2位置之一醯基的損失之片段離子可以是APCI光譜内之最低強烈信號，因為其在能量上之有利性低於發生於sn-1或sn-3位置之損失。Modern

Methods for Lipid Analysis by Liquid Chromatography Mass

Spectrometry and Related Techniques 276-297(William Craig Byrdwell ed.，2005)。驟層分析法-使用驟層分析法以分離存在於該原油内 54 201036554 之脂質種類並測定各種類存在於該原油内之重量％。該層析法系統係使用具有於3毫升/分鐘下由石油醚及乙酸乙酯所組成的流動相之矽凝膠6〇。使用階段梯度以選擇性自該柱溶析各脂質種類。該流動相梯度係自100%石油醚開始並經50%乙酸乙酯結束（繼而進行1〇〇%甲醇清洗）。使用Gils〇n FC 2〇4大床溶離份收集器（GUs〇n，Inc , Middlet〇n,紹)在2〇毫升試管内收集溶離份。藉TLC而分析各試管並匯集該等含各別脂質種類（如藉在具有預定RfiTLC上的單斑點所判斷)之試管’滚縮至乾燥並稱重。然後以重力儀測定總溶離份含量。 TLC分析-在矽凝膠平板上進行薄層層析法。使用由石油趟：乙謎：乙酸(8〇 : 2〇 :丨）所組成之溶劑系統溶析該等平板並利用蛾蒸汽進行視覺化測定。然後比較各斑點之Rf 值與各脂質種類之報告文獻值。 HPLC/APCI-MS分析-所使用LC/MS系統係由配備常壓化學離子化裝置（APCI)之Hewlett Packard型號1100

HPLC、及Hewlett Packard型號1100質量選擇偵檢器（MSD) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)組成。該HPLC 方法係使用兩串聯之PHENOMENEX® C18柱(250毫米x4.6 毫米 ’ 5微米；Phenomenex, Inc.(Torrance, CA))、1 毫升/分鐘之流率、2微升之注射體積、及5(rC之柱溫。該流動相係由0_ 1乙酸銨在異丙醇（溶劑A)及乙腈（溶劑B)中之溶液所組成。所使用線型梯度係於20%溶劑A開始，在4〇分鐘内增加至75%溶劑A，維持於75%溶劑A，費時5分鐘，在1分鐘内 55 201036554 返回20%溶劑A ’並維持於20%溶劑A，費時9分鐘。將該 ]\/180質5：5史疋至 m/z 400-1150’ 且其碎裂器（fragmentor)電壓為150、乾燥氣流為6升/分鐘、霧化器壓力為45psig '乾燥氣體溫度為350°C、汽化器溫度為325°C、毛細管電壓為 3500V、電暈電流為10微安培(μΑ)。二十二碳六烯酸甘油三酯（Tri-DHA)-使用Tri-DHA STD (NuCheck，Elysian，MN)以評估該層析系統及偵檢器反應之準確度。該Tri-DHA波峰之滯留時間為22.5分鐘，且總離子層析圖（tic)可得到良好的信臂比。該Tri_DHA波峰之APCI質譜表示於m/z 1023.7下之質子化分子離子 [M+H]+，於m/z 1040.8下之錢加成物離子[M+NH4]+、及於 m/z 695.5下之單一特性DAG片段離子。在己烷内製備該己單離TAG餾份之試樣並藉NARP HPLC/APCI-MS而分析以測定各該TAG異構物之相同性。如下表9及1〇内所摘述，評估各波峰之質譜並進行各脂肪酸分子團之暫時辨識。 56 201036554 表9 :在試樣A1内藉LC/APCI-MS而進行TAG物種之暫時辨識

滯留時間波峰# 暫時辨識 (sn-l/sn-2/sn-3) 面積％ [M+H] + [M+NH4] + 主要（DAG)片段 21.4 1 EPA/EPA/DHA 0.3 971.7 988.8 643.5, 669.3 21.9 2 DHA/DHA/EPA 4.4 997.8 1014.7 669.5, 695.5 22.4 3 DHA/DHA/DHA 11.6 1023.7 1040.7 695.5 23.3 4 DHA/ARA/DHA 0.5 999.6 1016.7 671.4 23.6 5 DHA/DPA/DHA 0.2 1025.9 1042.8 697.5 24.1 6 DHA/DHA/ARA 0.7 999.7 1016.8 671.5, 695.5 24.6 7 DHA/DHA/DPA 2.4 1025.7 1042.5 695.5, 697.4 25.3 8 EPA/14:0/DHA 0.3 897.6 914.6 569.4, 595.3 25.9 9 DHA/DHA/14:0 2.6 923.7 940.7 595.4, 695.5 27.2 10 DHA/DHA/15:0 0.4 937.8 954.7 609.5, 695.5 27.5 11 EPA/EPA/16:0 0.2 899.5 916.7 597.5, 643.5 28.0 12 DHA/16:0/EPA 4.7 925.8 942.7 597.4, 623.5, 669.3 28.5 13 DHA/DHA/16:0 30.8 951.7 968.7 623.7, 695.5 29.5 14 DHA/ARA/16:0 0.7 927.6 944.7 599.5, 671.5 29.7 15 DHA/DPA/16:0 0.9 953.7 970.8 625.5, 697.5 30.4 16 DHA/16:0/ARA 0.9 927.7 944,6 599.5, 623.5 30.8 17 DHA/16:0/DPA 4.5 953.8 970.7 623.4, 625.3 31.1 18 DHA/18:0/DHA 1.8 979.7 996.7 651.5 32.3 19 DHA/14:0/16:0 2.3 851.7 868.7 523.5 33.6 20 DHA/15:0/16:0 DHA/20:0/DHA 0.8 865.7 1007.8 882.7 1024.9 537.4 679.5 34.9 21 DHA/16:0/16:0 19.3 879.7 896.7 551.5, 623.5 36.1* 22 DHA/22:0/DHA DHA/18:0/15:0 DPA/16:0/16:0 0.5 1035.8 893.8 881.8 1052.8 910.8 898.8 707.7 565.5 551.5, 625.4 37.4 23 DHA/16:0/18:0 3.7 907.7 924.7 579.5, 623.5 38.9 24 16:0/16:0/14:0 0.3 NA 796.7 523.4, 551.5 40.1 25 含DH A之TAG 0.4 1117.9 1134.9 789.7 40.8 26 含DH A之TAG 0.4 1091.9 1108.9 763.7 41.3 27 16:0/16:0/16:0 1.0 NA 824.6 551.5 42.0 28 DHA/16:0/22:0 0.2 963.8 980.8 623.3, 635.4 43.5* 29 DHA/20:0/22:l 16:0/20:0/14:0 0.3 1017.8 835.6 1034.8 852.8 689.7 579.5, 607.5 45.6* 30 DHA/22:0/22:l 0.7 1045.8 1062.8 717.7 46.3* 31 DHA/20:0/22:0 0.5 1019.8 1036.9 691.7 57 表10 :在試樣A2内藉LC/APCI-MS而進行TAG物種之暫時辨識滯留時間波峰# 暫時辨識 (sn-l/sn-2/sn-3) 面積％ [M+H] + [M+NH4] + (DAG)片段 21.4 1 EPA/EPA/DHA 0.3 971.7 988.8 643.5, 669.3 21.9 2 DHA/DHA/EPA 4.5 997.8 1014.7 669.5, 695.5 22.3 3 DHA/DHA/DHA 14.0 1023.7 1040.7 695.5 23.3 4 DHA/ARA/DHA 0.6 999.6 1016.7 671.4 23.6 5 DHA/DPA/DHA 0.3 1025.9 1042.8 697.5 24.1 6 DHA/DHA/ARA 0.9 999.7 1016.8 671.5, 695.5 24.6 7 DHA/DHA/DPA 3.0 1025.7 1042.5 695.5, 697.4 25.4 8 EPA/14:0/DHA 0.2 897.6 914.6 569.4, 595.3 25.9 9 DHA/DHA/14:0 2.1 923.7 940.7 595.4, 695.5 27.2 10 DHA/DHA/15:0 0.5 937.8 954.7 609.5, 695.5 27.6 11 EPA/EPA/16:0 0.2 899.5 916.7 597.5, 643.5 28.1 12 DHA/16:0/EPA 4.2 925.8 942.7 597.4, 623.5, 669.3 28.5 13 DHA/DHA/16:0 31.4 951.7 968.7 623.7, 695.5 29.6 14 DHA/ARA/16:0 0.7 927.6 944.7 599.5, 671.5 29.8 15 DHA/DPA/16:0 0.6 953.7 970.8 625.5, 697.5 30.4 16 DHA/16:0/ARA 0.9 927.7 944.6 599.5, 623.5 30.8 17 DHA/16:0/DPA 4.5 953.8 970.7 623.4, 625.3 31.1 18 DHA/18:0/DHA 2.2 979.7 996.7 651.5 32.4 19 DHA/14:0/16:0 1.5 851.7 868.7 523.5 33.6 20 DHA/15:0/16:0 DHA/20:0/DHA 0.9 865.7 1007.8 882.7 1024.9 537.4 679.5 34.9 21 DHA/16:0/16:0 16.1 879.7 896.7 551.5, 623.5 36.P 22 DHA/22:0/DHA DHA/18:0/15:0 DPA/16:0/16:0 0.4 1035.8 893.8 881.8 1052.8 910.8 898.8 707.7 565.5 551.5, 625.4 37.3 23 DHA/16:0/18:0 3.4 907.7 924.7 579.5, 623.5 39.7 24 16:0/16:0/14:0 0.9 NA 796.7 523.4, 551.5 40.0 25 含DHA之TAG 0.8 1117.9 1134.9 789.7 40.8 26 含DHA之TAG 0.6 1091.9 1108.9 763.7 41.3 27 16:0/16:0/16:0 0.7 NA 824.6 551.5 42.1 28 DHA/16:0/22:0 0.3 963.8 980.8 623.3, 635.4 43.5* 29 DHA/20:0/22:l 16:0/20:0/14:0 0.2 1017.8 835.6 1034.8 852.8 689.7 579.5, 607.5 45.6* 30 DHA/22:0/22:l 0.8 1045.8 1062.8 717.7 46.3* 31 DHA/20:0/22:0 0.7 1019.8 1036.9 691.7 實例5 使用如實例3中所述之Friolex方法自發酵肉湯萃取油後，經由精煉、漂白、及脫臭步驟而進一步處理該原油以 58 201036554 獲得油成品。使該油成品經高油酸向日葵油稀釋以獲得具有約400毫克/克之dhA含量的商業油成品。離析各脂質種類並使用具有火焰離子化檢測作用之氣體層析法(GC-FID) 測定作為脂肪酸甲酯(FAME)之各種類的脂肪酸輪廓。驟層層析法-使用驟層層析法以分離存在於該油成品内之脂質種類並測定各種類存在於該油内之重量％。該層析法系統利用具有於3毫升/分鐘下由石油醚及乙酸乙酯所組成之流動相的矽凝膠60(EMD Chemical, Gibbstown, NJ)。使用階段梯度以選擇性溶析得自該柱之各脂質種類。該流動相梯度係自1 〇〇 %石油醚開始並以5 〇 %乙酸乙酯結束 (繼而進行1〇〇〇/。甲醇清洗）<3使用Giison fc 204大床溶離份收集器（Gilson, lnc.，Middleton, WI)在10毫升試管内收集溶離份。藉薄層層析法(TLC)而分析各試管且匯集含各脂質種類（如藉在具有預定滯留係數(Rf)之TLC平板上之單斑點而判斷)之該等試管，濃縮至乾燥並稱重。然後以重量儀測定總溶離份含量。 TLC分析-在矽凝膠平板上進行薄層層析法。使用由石油鍵：乙_ :乙酸(80 : 20 : 1}所組成之溶劑系統溶析該等平板並使用碘蒸汽進行視覺化測定。然後比較各斑點之Rf 值與各脂質種類之報告文獻值。脂肪酸分析··分析該油成品試樣及己單離脂質種類之可作為FAME之脂肪酸組成物。直接稱出試樣的重量並加入螺旋帽試管内並添加C19 : 〇内標準物（NuCheck，Ει_η， MN)在甲苯中之1毫升溶液及1·5 N HC1在甲醇中之2毫升溶 59 201036554 液至各試管。短暫地渦旋該等試管，然後於100°C下放入加熱板塊内（heating block)，費時2小時。自該加熱板塊移除試管，使其等冷却並添加飽和NaCl在水中之1毫升溶液。再渴漩該等試管、離心處理並將上（有機)層之一部份放在GC小玻瓶内，然後藉GC-FID而分析。使用利用Nu-Chek-Prep GLC參考標準物(Nu-Chek Prep, Inc.，Elysian，MN)所產生之 3點内標準校準曲線定量FAME並根據滯留時間暫時地辨識。以總FAME之毫克/克及％表示所存在之脂肪酸。藉將250毫克油成品溶解在600微升己烷内並施加至該柱之頂部而製備該試樣。使用驟層層析法進行該試樣之分館後，該油成品内，固醇酯溶離份佔1.2重量％、三酿甘油 (TAG)溶離份佔92.1重量％、游離脂肪酸(FFA)溶離份佔2] 重量°/〇、固醇溶離份估1.1%、二醯甘油（DAG)溶離份佔28 重量％。所匯集溶離份之TLC分析顯示該等FFA與固醇溶離份分別與TAG及DAG混合。分別以毫克/克及％FAME計算之該等FRIOLEX®油成品及已單離溶離份之總脂肪酸輪廓示於下表11及表12内。 60 201036554 表11 :以毫克/每克FAME計算之脂肪酸輪廓

油成品固醇酯 TAG FFA 固醇 DAG 重量％ ΝΑ 1.2 92.1 2.1 1.1 2.8 脂肪酸 FAME FAME FAME FAME FAME FAME (毫克/克） (毫克/克） (毫克/克） (毫克/克） (毫克/克） (毫克/克） C12:0* 0.0 0.0 1.0 0.0 1.2 0.6 C14:0* 11.5 5.1 11.3 6.0 9.6 5.7 014:1* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C15:0 2.3 0.0 2.3 1.2 2.0 1.9 C16:0* 183.3 80.0 180.8 99.9 149.3 132.2 016:1* 0.0 0.0 0.9 0.0 0.8 0.6 C18:0* 19.6 17.5 19.6 7.5 16.2 6.7 C18:l N9* 243.3 242.8 249.6 62.9 190.5 84.0 C18:l N7 1.9 1.7 2.0 0.8 1.9 0.9 C18:2 N6* 13.8 5.6 13.8 6.2 14.3 9.1 C20:0* 4.3 6.6 4.5 1.5 3.6 1.4 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.3 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0.8 0.0 0.8 0.0 C18:4 N3 0.0 0.0 0.7 1.3 0.9 0.4 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.6 0.0 0.0 0.0 C20:3 N6 0.0 0.0 0.3 0.0 0.0 0.0 C22:0* 3.3 61.0 3.2 1.1 3.0 1.2 C20:4 N7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4N6* 1.7 0.0 2.3 1.4 1.9 1.3 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 2.4 4.5 3.0 2.2 2.6 1.3 C20:5 N3* 28.1 3.0 27.7 38.6 25.6 43.2 C24:0* 1.4 64.3 1.4 0.0 2.0 1.0 C22:4 N9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C24:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C22:5 N6* 20.0 7.6 21.0 10.1 17.2 14.4 C22:5 N3* 2.8 0.0 3.1 3.7 3.4 2.9 C22:6 N3* 407.1 72.5 417.4 443.6 350.5 428.5 所有FAME之總數 936.1 572.1 967.6 688.0 797.3 737.3 61 201036554 表12:以總FAME之百分率表示之脂肪酸輪廓油成品固醇酯 TAG FFA 固醇 DAG 脂肪酸 % FAME % FAME % FAME % FAME % FAME % FAME C12:0* 0.0 0.0 0.1 0.0 0.2 0.1 014:0* 1.2 0.9 1.2 0.9 1.2 0.8 C14:l* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C15:0 0.2 0.0 0.2 0.2 0.2 0.3 C16:0* 19.6 14.0 18.7 14.5 18.7 17.9 C16:l* 0.0 0.0 0.1 0.0 0.1 0.1 C18:0* 2.1 3.1 2.0 1.1 2.0 0.9 C18:i N9* 26.0 42.4 25.8 9.1 23.9 11.4 C18:l N7 0.2 0.3 0.2 0.1 0.2 0.1 C18:2 N6* 1.5 1.0 1.4 0.9 1.8 1.2 C20:0* 0.5 1.1 0.5 0.2 0.5 0.2 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0.1 0.0 0.1 0.0 C18:4 N3 0.0 0.0 0.1 0.2 0.1 0.1 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 C20:3 N6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C22:0* 0.4 10.7 0.3 0.2 0.4 0.2 C20:4 N7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4N6* 0.2 0.0 0.2 0.2 0.2 0.2 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 0.3 0.8 0.3 0.3 0.3 0.2 C20:5 N3* 3.0 0.5 2.9 5.6 3.2 5.9 C24:0* 0.2 11.2 0.1 0.0 0.2 0.1 C22:4 N9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C24:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 C22:5 N6* 2.1 1.3 2.2 1.5 2.2 1.9 C22:5 N3* 0.3 0.0 0.3 0.5 0.4 0.4 C22:6 N3* 43.6 12.7 43.1 64.5 44.0 58.1 FAME %之總數 100 100 100 100 100 100 實例6 使用實例4中所述之技術進行實例5中所述之油成品的三醯甘油（TAG)分析，如下表13及14内所摘述，進行各脂肪 62 201036554 酸分子團之暫時辨識。表13 :主要TAG物種之暫時辨識

波峰滞留時間，分鐘暫時辨識 {sn-llsn-ilsn-3、面積％ 22.0 DHA/DHA/EPA 3.4 22.5 DHA DHA/DHA 10.4 24.7 DHA/DHA/DPA 2.1 28.2 DHA/16:0/EPA 3.4 28.7 DHA/16:0/DHA 23.0 31.0 DHA/16:0/DPA 3.3 35.2 DHA/16:0/16:0 11.6 37.6 DHA/16:0/18:0 4.3 40.4 18:1/18:1/18:1 14.0

63 表14 :藉LC-APCI-MS而進行TAG物種之暫時辨識滯留 4間波峰 # 暫時辨識 (s/i-l/i/i-2/i/i-3) 面積％ [M+H] + [M+NH4] + (DAG)片段 21.5 1 EPA/EPA/DHA 0.4 971.7 988.7 643.5, 669.5 22.0 2 DHA/DHA/EPA 3.4 997.8 1014.7 669.4, 695.5 22.5 3 DHA/DHA/DHA 10.4 1023.8 1040.7 695.5 23.4 4 DHA/DHA/ARA 0.5 999.8 1016.7 671.4, 695.3 23.7 5 DHA/DPA/DHA 0.3 1025.7 1042.7 697.5 24.2 6 DHA/DHA/ARA 0.8 999.7 1016.8 671.5, 695.5 24.7 7 DHA/DHA/DPA 2.1 1025.7 1042.5 695.5, 697.4 25.6 8 EPA/14:0/DHA 0.2 897.7 914.8 569.4, 595.3 26.1 9 DHA/14:0/DHA 1.4 923.7 940.7 595.5, 695.5 27.4 10 DHA/15:0/DHA 0.3 937.8 954.8 609.3 27.7 11 EPA/16:0/EPA 0.2 899.5 916.7 597.5 28.2 12 DHA/16:0/EPA 3.4 925.7 942.7 597.5, 623.4, 669.3 28.7 13 DHA/16:0/DHA 23.0 951.7 968.7 623.5, 695.5 29.8 14 DHA/16:0/ARA 0.5 927.7 944.8 599.5, 623.5 30.0 15 DHA/16:0/DPA 0.7 953.8 970.8 623.4, 625.5 30.6 16 DHA/16:0/ARA 0.8 927.7 944.8 599.5, 623.5 31.0 17 DHA/16:0/DPA 3.3 953.7 970.7 623.4, 625.5 31.3 18 DHA/18:0/DHA 1.6 979.8 996.8 651.5 32.6 19 DHA/14:0/16:0 1.6 851.8 868.8 523.5 33.9 20 DHA/15:0/16:0 DHA/20:0/DHA 0.8 865.7 1007.8 882.7 1024.8 537.4 679.5 35.2 21 DHA/16:0/16:0 11.6 879.7 896.8 551.5, 623.5 36.4 22 DHA/22:0/DHA DHA/18:0/15:0 DPA/16:0/16:0 0.5 1035.8 893.8 881.8 1052.8 910.8 898.8 707.7 565.5 551.5, 625.4 37.6 23 DHA/16:0/18:0 4.3 907.8 924.8 579.5, 623.5 40.0 24 DHA/16:0/20:0 0.8 935.8 952.8 607.6, 623.5 40.4 25 18:1/18:1/18:1 14.0 885.8 902.8 603.5 40.7 26 18:1/16:0/18:1 2.2 859.8 876.8 577.5 41.1 27 含DHA之TAG 1.6 1092.0 1108.8 763.7 42.4 28 含 24:0 之 TAG 0.5 963.8 980.9 594.5 43.0 29 18:1/18:1/18:0 1.9 887.7 904.8 603.6, 605.6 45.9 30 DHA/22:0/22:l 0.9 1045.9 1062.9 717.6 46.6 31 DHA/20:0/22:0 0.7 1019.8 1036.8 691.5 實例7 在具有980ppm Cl_之已餵過碳及氮之培養物(破囊壺菌培養基）内製備該寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之已 64 201036554 單離破囊壺菌的2天久之接種物燒瓶。根據以下程序進行致突變：將無菌T = 2天久之燒瓶（約50毫升)倒入無菌40毫升玻璃均質器内。在該均質器内使培養物接受5〇次前後搖動。以吸管吸出該培養物並經由無菌5〇微米網目濾器過濾，將其放在50毫升無菌試管内（該網目係作為滯留較大菌落塊並可以使較小菌叢及單細胞通過該50微米網目的裝置）。在無菌50毫升試管内收集所有濃縮的浸解物。渦旋該經浸解的培養物並在含破囊壺菌培養基之試管内製成至高1 : 1〇〇倍位準的稀釋液。渦旋該等經稀釋浸解物試樣，然後添加 200微升接種物至含4-5粒玻璃珠(3毫米玻璃珠)之破囊壺菌培養基瓊脂皮氏培養孤（1〇〇χ15毫米）。溫和攪動各平孤以使玻璃珠能將該接種均勻地塗佈在平m上。自平孤倒出玻璃珠並使該等平皿靜置且其蓋上蓋子，費時約5分鐘以便乾煉。當在微暗的光線下進行該程序時，可將無菌櫥及鄰接區域内之燈光關閉。可使用最小的光線以操作該程序，但僅使用間接及微弱的光線。將5個複製平皿放在XL鍵結箱（crossHnker)(Spectr〇nics Coloration，New York)之底部上且打開蓋子並照射該等試樣。該鍵結箱可傳遞以微焦耳表示之電力，且可找到能獲得90%至％%致死率的位準。使用相同方法使5個複製對照組平皿經未致突變的細胞接種.使用這些細胞計數以計算致死％。一旦完成照射，取代平凰，替換蓋子並先後以封口膜及㈣包裏該等平皿。重要的是於第—職等平皿係 65 201036554 在黑暗中生長，因此不能修護已受損基因。 *將平皿放在22.5 C之室内，費時約1〇天，然後進行該等菌落s十數。當進行最終計數時，以一無菌接種環剔取各別菌落並在新的破囊壺菌培養基平皿上再劃出條紋。將各菌落放在各平皿上。當平皿生長稠密時，使用接種環取出一試樣並接種入含50毫升破囊壺菌培養基之無菌25〇毫升振盈燒瓶内。將本燒瓶放在22.5。(：室内之搖動器（200rpm) 上。在T=7天時，採集該振盪燒瓶培養物並裝入50毫升無菌試管内。測定pH並旋轉該試樣以收集生物質塊小粒。沖洗各s式樣並再懸浮於異丙醇及蒸條水之5〇 : 5〇混合物内，然後再旋轉。所收集小粒經凍乾、稱重並進行FAME分析。表15至21内之數據代表使用上述方法所產生之突變體。 66 201036554 οο ||竊·钬 w^g696-VHdM·^翁^UUHV 卷涸® 嘟嶼镩：SI< 突變體10 I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 1 I 0.00 I I 0.00 I I 0.08 I I 0.00 I I 0.14 I I 0.00 [ | 1.57 I 0.00 I 0.00 I | 29.20 I 0.24 I 0.00 I I 0.00 I L—. .I i_^34_I I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 I | 0.00 | I 0.40 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I I 0.36 I 0.75 | 突變體9 I 0.00 I 0.00 [0.00 [0.00 | 0.00 [0.08 I 0.00 I 0.15 I 0.00 I 1.72 0.00 I I 0.00 i I 30.11 I 0.27 I 0.00 I I 0.00 I L 0.13 I τ— ί 0.00 I I 0.00 I ! 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.40 I 0.00 0.00 I 0.00 0.00 I 0.33 I 0.73 突變體8 I 0.00 1 I 0.00 1 I 0.00 1 I 0.00 I I 0.00 I T— T— o I 0.00 I T— T— o I 0.00 I | 1.85 0.00 I 0.00 I I 30.97 | 0.16 | 0.00 I I 0.00 I I_0^6_! I_L25_I I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 I ! 0.03 I ! 0.00 | ! 0.00 | 0.37 I ! 0.00 0.00 I ! 0.00 0.00 I 0.41 I 0.60 突變體5 .......... 1 1 0.00 i I 0.00 i I 0.00 1 I 0.00 I I 0.00 I | 0.07 I 0.00 I I 0.18 I I 0.00 I I 1.29 I 0.00 I 0.00 I I 29.86 | 0.27 I 0.00 I I 0.00 | I_0^2_I In T— I 0.00 I I 0.00 | I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 | I 0.00 I I 0.46 I 0.00 I 0.00 | 0.00 ! o.oo I ! 0.32 I 0.89 突變體4 1 0.00 1 0.00 , [0.00 ί [0.00 I 0.00 ! I 0.13 I I o.oo ! 0J2 I 0.00 I I 2.36 I 0.00 I 0.00 I I 30.33 | 0.25 I 0.00 I I 0.00 | L22_ I 0.00 I ! o.oo I ! 0.00 I ! 0.07 | 0.00 | 0.00 | 0.34 I 0.00 0.00 I 0.00 0.00 I 0.44 | 0.80 突變體3 1 0.00 | 1 0.00 1 I 0.00 1 I 0.00 I I 0.00 I I 0.08 I I 0.00 I I_ai3_1 I 0.00 I LJ.37 0.00 I 0.00 I I 29.97 | 0.14 I 0.00 I I 0.00 | I_〇Δ1_I I__I I 0.00 I I 0.00 | I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 | I 0.00 | I 0.45 I 0.00 0.00 I 0.00 0.00 I 0.42 ] 0.57 突變體2 1 0.00 i 1 0.00 1 I 0.00 1 I 0.00 I I 0.00 I I 0.08 | I 0.00 I 1_0^17_1 I 0.00 I I 1.49 I 0.00 I 0.00 | | 29.96 | 0.31 I 0.00 I I 0.00 | I_〇J3_I I_L38_I I 0.00 I I 0.00 | I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 | I 0.00 | L—…—M2——— — I 0.00 I 0,00 I 0.00 I 0.00 | 0.32 | 0.94 突變體1 1 0.00 1 0.00 I 0.00 ί I o.oo ! I 0.00 ! 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o Q 突變體44 1 0.00 | | 0.00 1 | 0.00 1 I 0.00 | I 0.00 | I 0.09 I 0.00 | 0.15 I I 0.00 I | 1.75 I I 0.00 I I 0.50 | I 30.18 | I 0.22 I I 0.00 I I 0.00 I 0.13 I | 1,34 I I 0.10 I I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 I I 0.00 I 0.40 I 0.49 I I 0.00 I ! o.oo I I 0.00 I 0.00 I 0.23 I 2.80 I 0.08 突變體43 1 0.00 1 0.00 | 0.00 0.00 I 0.00 i 0.12 I 0.00 | I 0.08 I | 0.00 I 2.17 | 0.00 I | 0.62 | I 43.37 | 1.05 I 0.00 I ! 〇.〇〇 I ! 0.26 I 2.21 I 0.09 | 0.05 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.61 0.15 I 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.35 I 3.47 I 0.14 突變體42 1 0.00 | I 0.00 1 | 0.00 1 0.00 I 0.00 | I 0.08 I | 0.00 | | 0.12 I I 0.00 I 1.43 I I 0.00 I | 0.36 | 25.77 I I 0.10 I I 0.00 I | 0.00 I | 0.10 I ! 1.25 | 0.12 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.36 0.15 I 0.00 I 0.00 ] 0.00 I 0.00 I 0.30 | 3.21 I 0.07 突變體40 1 0.00 | I 0.00 I I 0.00 1 0.00 I 0.00 | I 0.09 I 0.00 T— 〇 I 0.00 I CO T— I 0.00 | | 0.55 | | 30.25 | I 〇^1 J | 0.00 I I 0.00 | L———0.16 I I 1.29 | I 0.09 | ! 0.00 I I 0.00 I I 0.00 I ί 0.00 I I 0.00 I ! 0.39 | 0.14—」 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.24 | 2.80 I 0.08 突變體39 | 0.00 1 0.00 I 0.00 ! 0.00 I 0.00 | I 0.11 I 0.00 I 0.12 | I 0.00 I L96 I 0.00 | | 0.54 | | 30.84 | I 0.22 | I 0.00 I I 0.00 | I_0J6 J 8 T— 0.09 | 0.00 | 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.38 0.00 | 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.27 | 2.72 I 0.07 突變體38 | 0.00 | 1 0.00 | 1 0.00 | 0.00 I 0.00 | I 0.00 | 0.00 I_0^4_I I 0.00 I I 1.48 | I 0.00 | I_0^1_1 | 32.28 | I 0.23 | L 〇.〇〇 I I 0.00 | I 0.28 | I_LZ9_I I_0^5_I ! 0.00 | ! 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.00 I 0.43 0.43 | 0.00 | 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.24 | 4.00 I 0.14 突變體37 | 0.00 | 1 0.00 | 1 0.00 | 0.00 I 0.00 | I 0.11 | 0.00 I 0.09 | I 0.00 | I 1.99 | I 0.00 | | 0.48 ] | 28.04 | I 0.26 | I 0.00 | I 0.00 | I_0^3_I T— τ— T— I 0.08 | I 0.00 | I 0.00 | I 0.06 I I 0.00 | | 0.00 I 0.31 ! 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.31 | 2.77 | 0.07 突變體36 | 0.00 1 0.00 I 0.00 ! 0.00 | I 0.00 | I 0.00 | 0.00 I 0.44 | I 0.00 | I_L25_I I 0.00 | 1_2^12_I | 26.95 | I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 | I 0.95 | I_L58_I I_0^7_I I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 I I 0.00 | I 0.00 I 0.34 I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 | ! o.oo I 0.00 | 0.41 | 5.36 I 0.00 對照組 ATCC PTA-9695 | 0.00 1 0.00 I 0.00 0.00 | 0.00 I 0.10 i 0.00 L 0^1_； I 0.00 I 05 T— I 0.00 | | 0.00 | | 30.98 | _0^1 I 0.00 | I 0.00 | I 0^12 1^9 I 0.00 | I 0.00 | | 0.00 I ! 〇.〇〇 I 0.00 | 0.00 I 0.39 0.00 | 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.37 | 0.55 | 2.62 I 0.08 脂肪酸 08:0 09:0 ： 10:0 I 11:0 11:1 | 12:0 I 12:1 13:0 I 13:1 I 14:0 | 14:1 | 15:1 | 16:0 | 16:1 | 16:2 ] 16:3 I 17:0 I 18:0 | 18:1 n-9 | 18:1 n-7 | 18:2 I 18:3 n-6 I 18:3 n-3 J 18:4 n-3 I 20:0 20:1 n-9 | 20:2 | 20:3 n-9 I 20:3 n-6 | 20:3 n-3 | 20:4 ARA | 20:5 n-3 EPA I 22:0 * * * 73 201036554 ο ο ο ο CO CO 卜 τ— CD 卜 o o s 〇 CN ο CM ο ο ο ο CO o CO LO o o t— 寸 τ— ο ο ο ο CO CO CO T— CD o o § ο ο (D ο oi o T— 寸 d d CO ΙΛ d ο ο ο ο O) 00 0.30 σ> σ> o o g 00 τ— CO ο ο ο ο CO ο CD o o τ— ο ο ο ο σ> CM 卜 T— g o o σ> in Ο CN ο ο ο ο CO o LO d o 会 Τ- ο ο ο ο ra 卜艺 o o o 00 CM C> CD ο ο CO o CD LO o o in τ— ο ο ο ο in o o CN o o g ΓΟ ο ο ο ο csi o s o o 00 τ— ο ο ο ο g s O) T— o g CO 00 CD CO ο ο ο ο CO o 00 o o s τ— I 0.00 0.00 1 0.00 ι I 0.00 1 2.40 1 0.00 1 57.52 I 1 0.00 I | 0.00 J 12,73 I 0.29 | ο ο ο ο σ> 00 00 00 o o CO 00 S ο ο ο ο CO d (D LO d d (D ο < I (Ο 广 CO CO Q CO Τ— CN <〇 in ID CD o T— CNJ Csl CNI <Ν CSJ CSJ CM CNI CM CM cn CSJ CN CSJ * * 201036554 οο 韜翱钬 ln696-vHd 姝鯧t咖uulv#· ® 嘟輕镩：6 ί 突變體52 I 0.00 I I 0.00 1 1 0.00 I I 0.00 I | 0.00 I 0.11 0.00 0.09 0.00 L〇 oq T— I 0.00 I 0.53 I 32.53 I I 0.22 I 0.00 I 0.00 I 0.15 I LO CO T— 0.06 0.00 0.00 I 0.00 0.00 0.00 0.41 0.19 I 0.00 0.00 0.00 I 0.00 突變體51 I 0.00 | 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.00 0.09 | 0.00 | 0.10 | 0.00 ί 00 T— | 0.00 I 0.53 I 30.79 I I 0.21 I I 0.00 I ί o.oo I 0.18 I 1.48 I 0.09 I 0.00 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 0.40 I 0.16 I 0.00 0.00 I 0.00 I 0.00 突變體50 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.00 0.09 I 0.00 ! 0.13 I 0.00 I 00 T— | 0.00 I I 0.55 I ί 30.46 I ! 0.18 I 0.00 I 0.00 I 0.17 I CO CO τ— 0.10 I 0.00 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.39 I 0.19 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 突變體49 L 〇-〇〇 1 0.00 | 0.00 I 0.00 I I 0.00 I 0.09 I 0.00 I I 0.09 I I 0.00 I I_1J2 I I 0.00 I I 0.48 I I 31.21 | 0.17 I I 0.00 I ! o.oo I ί 0.14 I 1.43 I 0.08 I 0.00 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.42 | 0.13 I 0.00 I 0.00 | 0.00 I 0.00 突變體48 1 0.00 1 0.00 1 0.00 | 0.00 I 0.00 0.07 ! | 0.00 I I__0.13 I 0.00 | I_L52_I I 0.00 I I 0.46 | | 29.07 | I_0,17 I I 0.00 | I 0.00 | I_0^2 I T— T— I 0.09 | '0.00 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.42 | 0.24 I 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.00 突變體47 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 I 0.00 0.11 I 0.00 I 0.09 | 0.00 | _L86_ I 0.00 I ___o^Z | 30.07 | | 0.18 | ! o.oo I ：0.00 | 0.16 | 1.28 | 0.09 | 0.00 0.00 I 0.05 | 0.00 I 0.00 I 0.37 | 0.11 | 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.00 突變體46 1 0.00 1 0.00 1 〇.〇〇 I 0.00 ! I 0.00 | I0^3_I | 0.00 | I 0.10 | I 0.00 I !_ML_I I 0.00 | I_0J6__I | 24.90 | ___〇^4_ I 0.00 I I 0.00 | 1 0.24 | 1.07 | 0.07 | 0.00 0.00 | 0.12 | 0.00 | 0.00 | 0.29 | 0.13 | 0.00 I 0.00 | 0.05 | 0.12 突變體45 1 〇.〇〇 1 〇.〇〇 1 〇.〇〇「0.00 I 〇.〇〇 0.10 ί I 0.00 | | 0.11 | [0.00 I __1Z? I o.oo I I 0.41 | | 28.79 I | 0.19 I I 0.00 | o.oo I 0.11 I 1.24 | 0.08 | 0.00 o.oo I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.36 | 0.15 I 0.00 I 0.00 | o.oo I 0.00 對照組 ATCC ΡΤΑ-9695 1 〇.〇〇 1 〇.〇〇 1 〇.〇〇 I 0.00 I | 0.00 | 0.10 I 〇.〇〇 Ί I 0.11 Π I - o.oo I __LZ?__ I o.oo I I 0.00 | I 30.98 | _o^Z_ I o.oo Ί I o.oo I I 0.12 I | 1.29 I | 0.00 | 0.00 ! 0.00 | o.oo Ί o.oo I 0.00 | 0.39 I 0.00 I 0.00 | o.oo I o.oo I 0.37 脂肪酸 08:0 09:0 10:0 11:0 11:1 12:0 12:1 13:0 13:1 14:0 14:1 15:1 I 16:0 | T— CD 16:2 | 16:3 I 17:0 I 18:0 I 18:1 n-9 | 18:1 n-7 18:2 | 18:3 n-6 | 18:3 n-3 | 18:4 n-3 I 20:0 | 20:1 n-9 | 20:2 | 20:3 n-9 I 20:3 n-6 | 20:3 n-3 * * * 75 201036554 g o o o o 卜 τ— g o o 卜 o CO σ> σ> Τ— ο CN o o d o d 00 〇 in l〇 o o r~~ LO τ- 艺 S g o o o o 00 卜 τ— O) τ— o o τ- Ο CO CN ο CN o o o o o cd 〇 CD l〇 o o cd τ— CM CM g σ o o o 卜 CD T- CO 00 o o T— CO ⑦ Τ— CO 〇 csi o d d o o co 〇 CD L〇 o o τ~~ τ— CN (D g o o o o CVJ CO 卜 τ— 穿 o T— T— § L〇 CO 〇 c\i o o o o o CO 〇 CD LO o o τ— 00 CO 〇> σ> o o o o 卜 T— m CD o o 寸 σ> o csi o o d o o cd CD 00 LO o o LO CO τ— CO CNJ CD CO o o o lO ω GO o o o T— § o cvi o o 〇 o o cd 〇 (D LO o o s Τ— m CO 00 CM o o o o 00 CN c\i CNJ CO o m T— in σ> CO CO o 七 o o 〇 o d 七 o 00 to o o 00 IT) τ— 〇> Csl o o o o σ> in in CM 寸卜 o o T— O) L〇 in o CO o o o o o CO d ¢5 o o 00 τ— m If) 2.62 00 o o o o O) 00 00 00 o o CO 00 If) 00 o o d d d d c〇 d CD d d CD ο < cr < III < X Q CO CD CD 00 CO 寸 m 22:0 22:1 22:2 22:3 寸 <Si CN m Csi CN m csi CM CD cvi CNJ 24:0 24:1 运 * 201036554 οο 顴翱钬w?^696-vHd狨餒獠咖UUHV卷涸g嘟輕镩：0(N< 突變體65 丨 0.00 1 0.00 I 0.00 1 I 0.00 I | 0.00 I | 0.08 I I 0.00 I I 0.14 I I 0.00 I 00 LO Τ— 0.00 I 0.48 I I 30.03 I | 0.25 I I 0.00 I I 0.00 I 0.13 I 1.35 I 0.07 I I 0.00 I | 0.00 I | 0.00 I 0.00 0.00 I 0.41 I 0.21 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.19 I 2.82 I 0.09 突變體61 I 0.00 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.10 I 0.00 0-09 I 0.00 I LO 〇〇 Τ— I 0.00 I 0.51 I 31.15 I I 0.26 I I 0.00 I ! o.oo I ! 0.14 I τ— 0.07 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 0.00 I 0.39 I 0.13 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.24 I 2.59 I 0.08 突變體60 I 0.00 1 〇.〇〇 I I 0.00 1 | 0.00 I I 0.00 I I 0.08 I I 0.00 | I 0.14 | I 0.00 I 1.59 I 0.00 ! 0.50 I ! 29.39 I ! 0.22 I 0.00 I 0.00 I 0.13 I 1.30 I 0.10 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 0.00 I 0.39 I 0.14 0.00 | 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.20 I 2.72 I 0.08 突變體58 I 0.00 1 0.00 I 0.00 1 I 0.00 I L 〇.〇〇 I I 0.08 | I 0.00 | I_0J6__! L 〇.〇〇 I (J) 1〇 Τ— 0.00 I 0.45 | I 30.65 | I_025 | I 0.00 I I 0.00 I ! 0.12 | I 1.46 I 0.09 I 0.00 I 0.00 | 0.00 I 0.00 0.00 I 0.43 I 0.17 0.00 | 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.51 I 5.76 | 0.09 突變體57 ! ! I 0.00 | 0.00 | 0.00 1 I 0.00 | I 0.00 | I 0.08 | | 0.00 | I_0^131 I 0.00 | σ> in Τ— 0.00 I_0^2__I I 29.37 | | 0.14 | I 0.00 I I 0.00 I I 0.16 | CO τ— τ— T— C) 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.00 0.00 I 0.38 I 0.20 0.00 | 0.00 I 0.00 | 0.00 I 0.25 I 2.78 | 0.08 突變體56 ! I 0.00 1 0.00 1 0.00 | I 0.00 | I 0.00 | | 0.08 | | 0.00 | | 0.09 | [0.00 | 1_1^Ζ_! I 0.00 | I_Ml_1 I 31.08 | | 0.26 | I 0.00 | I 0.00 I | 0.14 | 00 CO τ— I 0.06 | ! o.oo I 0.00 I 0.00 I 0.00 0.00 | 0.42 I 0.19 0.00 | 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.22 | 2.67 | 0.09 突變體55 1 0.00 0.00 1 〇.〇〇 ! | 0.00 | I 0.00 | I_QJ2__I I 0.00 | | 0.08 | I 0.00 | I_2J3__I I 0.00 | I 0.48 | | 33.01 | | 0.26 ] I 0.00 I I 0.00 | | 0.14 | T— I 0.00 | I 0.00 I I 0.00 | I 0.00 | 0.00 I 0.00 | I 0.40 | 0.13 I 0.00 I I 0.00 I ! o.oo | I 0.00 I i 0.26 | 2.81 | 0.08 突變體54 1 0.00 0.00 1 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.08 | 0.00 | 0.12 | 0.00 I 1.63 0.00 I 0.52 | 29.54 I 0.23 I 0.00 i I 0.00 | | 0.14 | !_L3〇_I I 0.08 | I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 | 0.00 I 0.00 I I 0.39 | 0.16 I 0.00 I i o.oo | 0.00 | 0.00 I 0.21 | 2.78 | 0.08 突變體53 1 0.00 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.09 I 0.00 I 0.11 | 0.00 I 1.74 0.00 I 0.53 | 30.13 ! I_0^1_1 I 0.00 I I 0.00 | QJ5_ ° T— I 0.08 | I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 | 0.00 I 0.00 I 0.38 | 0.19 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.00 ] 0.25 | 2.75 | 0.08 對照組 ATCC ΡΤΑ-9695 1 0.00 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.10 I 0.00 I__0J1__1 | 0.00 | 05 T— 0.00 I 0.00 | | 30.98 | 1_o^Z__1 I 0.00 I I 0.00 | t___0^2___ I_L29_I I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 | 0.00 I 0.00 I ! 0.39 | 0.00 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.37 | 0.55 | 2.62 | 0.08 脂肪酸 08:0 09:0 10:0 11:0 11:1 12:0 12:1 13:0 13:1 ! 14:0 14:1 15:1 ! 16:0 | 16:1 | 16:2 | 16:3 | 17:0 | 18:0 | 18:1 n-9 | 18:1 n-7 | 18:2 | 18:3 n-6 | 18:3 n-3 18:4 n-3 | 20:0 | 20:1 n-9 20:2 | 20:3 n-9 | 20:3 n-6 | 20:3 n-3 | 20:4 ARA | 20:5 n-3 EPA | 22:0 * * 77 201036554 ο ο ο ο 00 卜 T— CD in o o 00 τ— (N 卜 τ— ο ο ο ο CO 〇 o o CO CO τ— ο ο ο g 卜 T— CD o δ o 00 寸 ο ο ο ο CO 〇 L〇 LO CD o S τ~~ ο ο ο ο 另卜 x— CN o o T— 艺 ο d ο ο CO d 00 m o d CD CO τ— ο ο ο ο (N (D O) LO σ> o o τ— CD cr> h- ο ο CD ο csi o s o 〇 cd CO Ο ο ρ Ο ο o <N CD 卜 o g LO CO ο ο ο ο co o o o cd 寸 τ— ο ο ο ο O) 卜 T— 00 CO o o T— CM 〇) σ> CNJ ο ο ο ο CO o CD LO o o T~ 甘 τ— ο ο ο ο m CNJ 卜〇 o 白 T— 00 Ο) τ— ο ο ο ο CO o s o o TO Τ— ο ο ο ο s 00 白 o σ> <J> IT) σ> Τ— ο ο ο ο CO o 00 LO d o <J) CO Τ— ο ο ο ο 00 T— σ> σ> o o g CO 00 00 CN ο ο ο ο cd d cd m o o JO τ— ο ο ο ο 00 00 00 o o o CO CO LO 00 ο ο ο ο 00 o CD i〇 o o CO Ο CD c (D c CO c < X Q CO c 22:1 22:2 22:3 寸 (Si CM m eg CN m eg CN CO csi CM 24:0 24:1 s 4 201036554 ο ❹ H 翱钬 w^s696-vHd 狨？£t砌UUHV 卷洄涸嘟輕镩：ΐ(Ν< 突變體74 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 2.05 0.00 0.47 23.95 0.00 ! 〇.〇〇 1 0.00 0.00 S Τ— 0.00 0.00 0.00 0.00 0.22 0.00 0.27 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.39 4.53 0.34 突變體73 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 ί 1.97 0.00 0.50 24.50 0.00 0.00 0.00 0.00 ! 0.00 0.00 0.00 0.00 0.22 0.00 0.29 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.38 4.43 0.35 突變體72 ATCC ΡΤΑ-9695 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 | 0.13 0.00 0.00 0.00 2.29 0.00 0.40 ! 33.49 0.21 0.00 0.00 0.13 2.24 I 〇.〇〇 0.00 0.00 0.00 0.16 0.00 0.52 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 I 0.27 2.74 0.12 突變體71 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 0.00 I 0.00 0.22 I 2.27 0.19 I 0.46 I 28.89 ί 0.19 I 0.00 I I 0.00 I 0.00 I 1.51 I 0.00 0.00 0.00 I 0.00 I 0.22 0.00 0.44 0.00 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.30 3.09 I 0.43 突變體70 ATCC ΡΤΑ-9695 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 丨 0.00 L 〇.〇〇 I 0.00 I 0.00 I 2.21 0.00 ! I 0.44 I I 28.14 I I 0.00 I ! 〇.〇〇 I 0.00 1 0.00 1.49 I 0.00 I 0.00 0.00 I 0.00 I 0.17 I 0.00 I 0.37 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.00 I 0.37 I 4.12 I 0.38 突變體69 I 0.00 1 0.00 1 0.00 | 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 [0.00 I 0.00 | L 2.11 0.00 L 0.47 L 27.79 I I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 1 0.00 ί 1.44 I 0.00 I 0.00 0.00 | 0.00 I 0.19 I 0.00 I 0.35 I 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.15 | 0.00 I 0.24 | 3.32 | 0.48 突變體68 ATCC PTA-9695 1 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 I 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 , I 2.09 | 0.00 I_ML_I I 25.84 | I 0.00 | I 0.00 | 1 0.00 | 0.00 I_L22_I I 0.00 | 0.00 I 0.00 | I 0.00 | 0.21 | 0.00 | 0.31 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.27 | 3.97 | 0.44 突變體67 1 0.00 1 0.00 1 〇.〇〇 I 0.00 | 0.00 I 0.00 I 0.00 I 〇.〇〇 I 0.00 | 2.07 0.00 I 0.48 | 26.20 , | 0.00 | ! 〇.〇〇 | 〇.〇〇 Π 0.00 1.22 | 0.00 | 0.00 〇.〇〇 1 〇.〇〇 | 0.20 | 0.00 | 0.32 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 〇.〇〇 | o.oo I 0.33 | 3.86 \ 0.35 突變體66 1 〇.〇〇丨 0.00 1 〇.〇〇 I 〇.〇〇 I 〇.〇〇 | 0.00 I 〇.〇〇 | 0.00 I | 0.00 | I 2.29 | 0.00 I 047 | [31.02 I I 0.19 Ί I 〇.〇〇 I 1 〇.〇〇 1 ! 0.00 1.68 I 〇.〇〇 | 0.00 〇.〇〇 1 〇.〇〇 I 0.18 | 0.00 | 0.41 | 〇.〇〇 1 〇.〇〇 I 〇.〇〇 I 〇.〇〇 | o.oo I 0.16 | 2.30 I 0.46 | 對照組 ATCC PTA-9695 1 〇.〇〇 1 〇.〇〇 1 〇.〇〇 I 〇.〇〇 I 〇.〇〇 | 0.15 I 0.00 | 0.00 I 〇.〇〇 i _2^2_I 0.00 | 0.55 | I 39.19 | _0^3_ I 0.00 I | 0.00 | 0.16 _167_ I 〇.〇〇 | 0.00 I 0.00 1 I 0.00 I 0.00 I 〇.〇〇 | 0.49 | 〇.〇〇 1 〇.〇〇 I 0.00 | 0.00 | 0.00 I 0.18 l 1.76 | 0.33 I 脂肪酸 08:0 09:0 10:0 11:0 T— T— 12:0 12:1 13:0 13:1 14:0 14:1 15:1 16:0 16:1 ί 16:2 | 16:3 | 17:0 18:0 | 18:1 η-9 | 18:1 η-7 18:2 | 18:3n-6 | 18:3 n-3 | 18:4 n-3 I 20:0 I 20:1 η-9 | 20:2 | 20:3 η-9 I 20:3 η-6 I 20:3 n-3 I 20:4 ARA | 20:5 n-3 EPA | 22:0 | S5 79 201036554 1 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 | I 3.19 | 0.57 i 62.23 | i o.oo I 0.00 | j 46.63 「0.76 0.00 i o.oo I 0.00 o.oo I I 3.17 | 0.48 6183 | i o.oo ] o.oo 1 i 48.27 丨 0.78 1 0.00 i o.oo ] I 0.00 I o.oo | I 2.79 | 0.27 | 53.06 | 1 o.oo | I 0.00 | 63-40 CO τ— τ— 1 0.00 1 I 0.00 | I 0.00 | I 0.00 I I 3.46_I 0.25 Γ 55.62 | I 0.00 | 1 0.00 | | 40.38 | 1 2.46 | 1 0.00 I o.oo ! 0.00 I 0.00 I !2,95_! 0.61 | 58.03 Π | 0.00 J 1 0.00 I 53.65 0.73 j 1 o.oo 1 I 0.00 i 0.00 I 0.00 I ί 272 ： 0.34 1 59.74 1 I 0.00 1 I 0.00 1 48.80 0.67 I 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.00 I I 2.66 I 0.42 I 61.42 I | 0.00 1 I 0.00 1 49.49 0.66 0.00 I 0.00 I 0.00 | 0.00 I I 3.17 I 0.46 I 60.60 I ! 0.00 1 I 0.00 1 48,51 ：0.73 1 〇.〇〇 I I 0.00 I 0.00 I 0.00 I ! 2.83 I 0.18 | 57.01 I 1 0.00 1 | 0.00 1 | 49,32 I 0.82 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 0.00 I 2.62 0.18 I 49.52 I I 0.00 I 0.00 52.70 0.35 22:1 22:2 I 22:3 22:4 n-6 22:5 n-6 I 22:5 n-3 22:6 n-3 DHA 24:0 24:1 ocr JfD os： %未知 201036554 實例8 4種破囊壺函試樣係得自the American Tissue and Culture Collection (ATCC)且分析各試樣之生物質塊的脂肪族輪廓、經萃取原油之脂肪酸輪廓、該原油之三醯甘油 (TAG)溶離份、及該原油之極性脂質（pL)溶離份。所分析之試樣為 ATCC 34304、20890、20889、及20892。將該等菌株接種入含50毫升以下培養基之250毫升振盪燒瓶内：1克腺、1克酶母萃取物、5克葡萄糖在1升人造海水中之溶液。在軌道遙動器上以200rpm搖動下，於2(TC下培育培養物。7 天後，藉離心法(5087xg)而採取該等培養物’經水：異丙醇 (1 : 1)之混合物清洗，並再離心處理。凍乾所形成小粒。使用 Bligh and Dyer之方法（Can. J. of Biol. And Phys. 37: 911-917 (1959))自該乾生物質塊萃取原油。使用由Kaluzny 等人研發之固相萃取（SPE)法的變異法（J. Lipid Res. 26: 13 5 -140 (19 5 9))自該原油離析ΤΑ G及P L。分析該原油及已單離溶離份之DHA及EPA含量以及總脂肪酸含量（作為脂肪酸甲酯）。脂質萃取-自該凍乾生物質塊萃取原油，其係藉稱重 100至200毫克並加入1.5x10厘米螺旋蓋試管内，添加8毫升由氣仿：甲醇：水(CHC13 : MeOH : H20(1 : 2 : 0.8))所組成之單相系統，並經配備PT-DA3012/2聚集體之p〇LYTR〇N® PT 3100分散裝置均質化。以1 OOOOrpm將該試樣均質化並浸在冰浴内。藉添加2.1毫升CHCI3 ’渴旋1分鐘，添加ι·7毫升 H20並再渦旋1分鐘而製成雙相系統。使用巴斯德(Pasteur) 81 201036554 吸管移除下（有機）層並放入收集燒瓶内。留在該試管内之 Me〇H-H2〇層再經2·1毫升份量之CHC13萃取2次。合併有機層並在氮氣流下乾燥。

固相萃取-使用放在Vac Elm裝置内之5〇〇毫克胺基丙基藥筒（Burdick & jackson)藉SPE而自該原油分離TAG&pL 溶離份。使该藥筒經5毫升己烧調節並使1〇至2〇毫克各試樣 ;谷解在400微升CHCI3内並施加至該藥筒。使該柱經2 : ^ CHCI3 :異丙醇(IPA)(4毫升）清洗以溶析所有中性脂質，收集該等中性脂質並在氮下乾燥。然後以2%乙酸(H〇Ac)在醚中之5毫升溶液溶析該等脂肪酸，接著將該溶析液棄置。以 5毫升MeOH溶析該PL份量，收集該溶析液並在氮下乾燥。使該中性脂質溶離份再溶解於4〇〇微升己烷内並施加至第二胺基丙基柱（先前已經過2毫升己烷調節）。以1%乙酸乙酯 (EtOAc)在己烷中之5毫升溶液溶析固醇酯並棄置。最後，以3% EtOAc在己烷中之5毫升溶液溶析TAG，收集該溶析液並在氮下乾燥。 TLC分析-在矽凝膠平板上進行薄層層析法。使用由石油醚：乙醚：乙酸(80 : 20 : 1)所組成之溶劑系統溶析該等平板並使用填蒸汽進行視覺化測定。脂肪酸分析-分析生物質塊、原油、已單離TAG、及PL 溶離份試樣之可作為FAME的脂肪酸組成物。直接稱試樣之重量並加入螺旋帽試管内，並添加C19: 0内標準物在曱苯中之1宅升>谷液及1 _ 5N HC1在甲醇中之2毫升溶液至各試管。短暫地渦旋該等試管並於100°c下將其放在加熱板塊 82 201036554 内’費時2小時。自該加熱板塊移除試管，使其冷却並添力飽和NaCl在水中之1毫升溶液。再渦旋該等試管、離心處理並將上（有機）層之一份放入GC小玻璃内並藉GC_FID而八析。使用利用Nu-Chek-Prep GLC參考標準所產生之3點内標準校準曲線定量FAME並根據滯留時間暫時辨識。所存在月t 肪酸係以總FAME之毫克/克及％表示。 ATCC 34304-作為FAME之總數，ATCC 34304生物質塊之脂質含量經估計為9.1% ’且溶劑萃取後所獲得之原油含量為9.2重量％ ’其在該生物質塊内可得到1〇1〇/。回收率之脂肪。該生物質塊之EPA及DHA含量經測定分別為4 8毫克/ 克及38_7毫克/克。該經萃取原油含有25.9毫克/克之£?八及 238·7毫克/克之DHA。該已單離TAG含有13.9毫克/克之EPA 及303.9毫克/克之DHA，而該已單離PL含有38.7毫克/克之 EPA及237.980毫克/克之DHA。分別以毫克/克及％ FAME計算之該生物質塊、經萃取原油、TAG溶離份、及pl溶離份之總脂肪酸輪廓示於下表22及表23内。 83 201036554 表22 :以毫克/每克計算之ATCC 34304的脂肪酸輪廓生物質塊原油 TAG PL 脂肪酸 FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） C12:0* 0.0 0.0 0.0 0.0 C14:0* 1.5 8.5 13.7 1.5 C14:l* 0.0 0.2 0.0 0.0 C15:0 0.0 0.0 0.0 0.0 C16:0* 20.8 138.9 250.8 73.9 C16:l* 0.2 2.9 6.9 0.3 C18:0* 2.1 17.8 45.6 0.8 C18:l N9* 3.8 29.8 74.2 4.2 C18:l N7 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:2 N6* 1.5 12.0 31.0 2.5 C20:0* 0.1 0.7 1.7 0.1 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.1 0.3 0.0 C18:4 N3 0.0 8.5 0.3 0.0 C20:2 N6* 0.1 0.8 2.2 0.0 C20:3 N6 0.0 2.5 6.3 0.5 C22:0* 0.3 5.2 0.3 0.0 C20:4 N7 0.4 2.7 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.6 0.0 C20:4N6* 3.4 20.8 20.9 27.5 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 0.1 0.6 1.3 0.3 C20:5 N3* 4.8 25.9 13.9 38.7 C24:0* 0.4 0.2 0.3 0.0 C22:4 N9 0.0 1.2 0.7 0.4 C24:l N9* 0.9 6.9 18.2 0.8 C22:5 N6* 11.0 60.8 51.9 45.9 C22:5 N3* 0.4 3.1 6.8 1.0 C22:6 N3* 38.7 238.7 303.9 237.9 所有FAME之總數 91.2 590.9 855.7 437.3 84 201036554 表23 :以總FAME之百分率計算之ATCc 34304的脂肪酸輪廓生物質塊原油 TAG PL 脂肪酸 % FAME % FAME % FAME % FAME C12:0* 0.0 0.0 0.0 0.0 C14:0* 1.7 1.5 1.6 0.4 C14:l* 0.0 0.0 0.0 0.0 C15:0 0.0 0.0 0.0 0.0 C16:0* 22.8 24.2 29.3 16.9 C16:l* 0.2 0.5 0.8 0.1 C18:0* 2.3 3.1 5.3 0.2 C18:l N9* 4.2 5.2 8.7 1.0 C18:l N7 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:2 N6* 1.6 2.1 3.6 0.6 C20:0* 0.1 0.1 0.2 0.0 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:4 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:2 N6* 0.1 0.1 0.3 0.0 C20:3 N6 0.0 0.4 0.7 0.1 C22:0* 0.3 0.9 0.0 0.0 C20:4 N7 0.5 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.1 0.0 C20:4N6* 3J 3.4 2.4 6.3 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 0.1 0.1 0.2 0.1 C20:5 N3* 5.3 4.5 1.6 8.8 C24:0* 0.5 0.0 0.0 0.0 C22:4 N9 0.0 0.0 0.1 0.1 C24:l N9* 1.0 1.2 2.1 0.2 C22:5 N6* 12.1 10.5 6.1 10.5 C22:5 N3* 0.5 0.5 0.8 0.2 C22:6 N3* 42.5 41.5 35.5 54.4 FAME %之總數 100.0 100.0 100.0 100,0

ATCC 20890-作為FAME之總數，該ATCC 20890生物質塊之脂質含量經估計為9.2%，且溶劑萃取後所獲得之原油含量為10.2重量％，其在該生物質塊内可得到in%回收率之脂肪。該生物質塊之EPA及DHA含量經測定分別為12.2毫克/ 克及36.6毫克/克。該經萃取原油含有64.7毫克/克之EPA及 194.2毫克/克之DHA。該已單離TAG含有41.9毫克/克之EPA 及230.2毫克/克之DHA，而該已單離PL含有54.4毫克/克之 85 201036554 EPA及149.5毫克/克之DHA。分別以毫克/克及°,。FAME計算之該生物質塊、經萃取原油、TAG溶離份、及PL溶離份的總脂肪酸輪廓示於下表24及表25内。酸輪廓表24:以毫克/每克計算之ATCC 20890之脂肪生物質塊原油 TAG 脂肪酸 FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） FAME、 (毫克/克） C12:0* 0.0 0.0 0.0 ' C14:0* 0.6 5.2 22.6 、 C14:l* 0.0 0.0 0.0 、 C15:0 0.0 0.0 0.0 、 C16;0* 25.4 161.1 206.1 、 C16:l* 0.2 1.3 4.7 、 C18:0* 1.8 12.1 58.9 〜― C18:l N9* 1.0 9.7 37.6 ^ C18:l N7 0.0 0.0 0.0 ^ C18:2 N6* 0.8 4.8 6.9 ~~ C20:0* 0.1 0.0 〇.〇 ...... C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 ...... C20:l N9* 0.0 0.0 0.0 ' C18:4 N3 0.0 0.0 0.0 〜 C20:2 N6* 1.9 11.1 14.2 〜 C20:3 N6 1.0 5.4 2.4 ^ C22:0* 0.0 0.0 0.0 ^ C20:4 N7 0.0 0.0 0.0 〜 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 C20:4N6* 5.3 33.6 ~~~~ C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 ~~ C20:4 N5 0.2 0.0 0.0 ' C20:4 N3 0.1 2.2 0.0 、 C20:5 N3* 12.2 64.7 41.9 ~~ C24:0* 0.3 0.0 〇.〇、 C22:4 N9 0.0 0.0 0.0 、 C24:l N9* 0.3 1.4 1.6 ^ C22:5 N6* 0.5 2.4 1.4 〜 C22:5 N3* 3.6 19.4 23.9 ^ C22:6 N3* 36.6 194.2 230.2 ^ 所有FAME之總數 92.3 535.1 735.0 86 201036554 Ο

表25 :以總FAME之百分率計算之ATCC 20890的脂肪酸

ATCC 20889-作為FAME之總數，該生物質塊之脂質含量經估計為3.3%，且溶劑萃取後所獲得之原油含量為3 4重量％，其在該生物質塊内可得到103%回收率之脂肪。該生物質塊之EPA及DHA含量經測定分別為2.3毫克/克及16.5毫克/克。該經萃取原油含有26·8毫克/克之EPA及205.1毫克/克之DHA 〇該經單離TAG含有7.3毫克/克之ΕΡΑ及185.9毫克/克之DHA，而該經單離PL含有35.2毫克/克之EPA及218.6毫克/克 87 201036554 之DHA。分別以毫克/克及％ FAME計算之該生物質塊、經萃取原油、TAG溶離份、及PL溶離份的總脂肪酸輪靡示於下表26及表27内。酸輪廓表26:以毫克/每克計算之ATCC 20889之脂肪

生物質塊原油 TAG 脂肪酸 FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） FAMJ (毫克Ο C12:0* 0.0 0.0 0.0 C14:0* 0.5 8.3 32.0 C14:l* 0.0 0.0 0.0 C15:0 0.0 0.0 0.0 C16:0 + 6.6 80.3 150.8 C16:l* 0.1 1.7 12.3 C18:0* 0.3 4.8 9.7 C18:l N9* 0.6 6.6 7.6 C18:l 0.0 0.0 0.0 C18:2 N6* 0.0 0.4 1.1 C20:0* 0.0 0.1 2.1 C18:3 N3 + 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0.0 C18:4 N3 0.0 0.0 0.0 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.0 C20:3 N6 0.0 0.1 0.7 C22:0* 0.0 0.0 0.1 C20:4 N7 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 C20:4N6* 0.4 1.4 1.1 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 C20:4N5 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 0.0 0.5 0.9 C20:5 N3* 2.3 26.8 7.3 C24:0* 0.1 0.4 1.8 C22:4 N9 0.0 3.4 0.2 C24:l N9* 0.0 0.0 0.8 C22:5 N6* 5.0 63.6 76.2 C22:5 N3* 0.2 1.8 2.2 C22:6 N3* 16.5 205.1 185.S 所有FAME之總數 32.8 405.2 493.C 88 201036554 表27:以總成FAME之百分率計算之ATCC 20889的脂肪酸輪廓生物質塊原油 TAG PL 脂肪酸 % FAME % FAME % FAME % FAME 012:0* 0,0 0.0 0.0 0.0 C14:0* 1.4 2.0 6.5 0.8 C14:l* 0.0 「0.0 0.0 0.0 C15:0 0,0 0.0 0.0 0.0 C16:0* 20.3 19.8 30.6 13.7 C16:l* 0.4 0.4 2.5 0.0 C18:0* 0.8 1.2 2.0 0.4 C18:l N9* 1.8 1.6 1.5 0.3 C18:l N7 0.0 0.0 0.0 0.0 C1S:2 N6* 0.1 0.1 0.2 0.0 C20:0* 0.0 0.0 0.4 0.0 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0*0 0.0 C18:4 N3 0.0 0‘0 0.0 0.0 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N6 0.0 0.0 0.1 0.0 C22:0* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N7 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4N6* 1.3 0.4 0.2 2.0 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N3 0.1 0.1 0.2 0.1 C20:5 N3* 7.0 6.6 1.5 9.5 C24:0* 0.3 0.1 0.4 0.0 C22:4 N9 0.0 0.8 0.0 0.8 C24:l N9* 0.0 0.0 0.2 0.1 C22:5 N6* 15.3 15.7 15.5 12.5 C22:5 N3* 0.5 0.5 0.5 0.5 C22:6N3* 50.2 50.6 37.7 59.3 FAME %之總數 100.0 100.0 100.0 100.0 〇 ATCC 20892-作為FAME之總數，該生物質塊之脂質含量經估計為8.8%，且溶劑萃取後所獲得之原油的含量為 12.1重量％，其在該生物質塊内可得到138%回收率之脂肪。該生物質塊之EPA及DHA含量經測定分別為8 3毫克/ 克及43.3毫克/克。該經萃取原油含有50.5毫克/克之EPA及 26〇·1毫克/克之DHA。該已單離TAG含有98.7毫克/克之£卩八及407.7毫克/克之DHA，且該已單離pl含有50.4毫克/克之 89 201036554 EPA及243.12毫克/克之DHA。分別以毫克/克及％ FAME計算之該生物質塊、經萃取原油、TAG溶離份、及PL溶離份的總脂肪酸輪廓示於下表28及表29内。表28:以毫克/每克計算之ATCC 20892的脂肪酸輪廓生物質塊原油 TAG PL _ 脂肪酸 FAME (姜克/克） FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） FAME (毫克/克） C12:0* 0.0 0.0 0.0 0.0 C14.0* 7.3 42.2 29.7 54.7 --— 014:1* 0.0 0.0 0.0 0.2 _ C15:0 0.0 0.0 0.0 0.0 C16:0* 18.9 109.0 133.5 116.7 C16:l* 0.0 0.8 3.5 0.2 _ C18:0* 0.0 2.6 9.1 0.7 C18:l N9* 0.6 7.3 22.0 1.3 C18:l N7 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:2 N6* 0.0 1.4 9.7 0.4 C20:0* 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 _ C20:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 ——— C18:4 N3 0.0 0.6 0.0 0.1 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.0 0.0 _ C20:3 N6 0.3 1.1 6.3 0.6 C22:0* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4 N7 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:4N6* 1.3 7.6 15.8 7.8 C22:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 一 C20:4 N5 0.0 0.0 0.0 0.0 _ C20:4 N3 0.3 1.5 4.7 Π 1.4 _ C20:5 N3* 8.3 49.6 97.0 49.8 C24:0* 0.0 0.0 0.0 1 0.0 C22:4 N9 0.2 0.0 0.0 0.1 C24:l N9* 0.0 1.1 4.9 1.0 _ C22:5 N6* 2.8 16.1 25.3 15.8 C22:5 N3* 1.1 6.6 23.9 6.0 C22:6 N3* 43.4 254.3 398.3 239.5 所有FAME之總數 87.5 508.0 800.7 498.2 90 201036554 表29 :以總FAME之百分率計算之ATCC 20892的脂肪酸輪廓生物質塊原油 TAG PL 脂肪酸 % FAME % FAME % FAME % FAME C12:0* 0.0 0.0 0.0 0.0 C14:0* 8.3 8.3 3.6 11.0 C14:l* 0.0 0.0 0.0 0.0 C15:0 0.0 0.0 0.0 0.0 C16:0* 21.6 21.4 16.4 23.4 C16:l* 0.0 0.2 0.5 0.0 C18:0* 0.0 0.5 1.1 0.1 C18:l N9* 0.7 1 1.4 2.6 0.2 C18:l N7 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:2 N6* 0.0 0.2 1.1 0.1 C20:0* 0.0 0.1 0.6 0.0 C18:3 N3* 0.0 0.0 0.0 0.0 C20:l N9* 0.0 0.0 0.0 0.0 C18:4 N3 0.0 0.1 0.0 0 0 C20:2 N6* 0.0 0.0 0.0 0 0 C20:3 N6 0.3 0.2 0.7 0 1 C22:0* 0.0 0.0 0 0 0.0 C20:4 N7 1.9 0.8 1.6 0 2 C20:3 N3 0.0 0.0 0.0 η n C20:4N6* 1.4 1.5 1.9 1.6 C22:l N9* 0.0 0.0 0 0 0.0 C20:4 N5 0.0 0.0 0 0 0.0 C20:4 N3 0.3 0.3 Γ ----- 〇 5 0.3 C20:5 N3* 9.5 9.7 C24:0* 0.0 〇.〇 10.0 C22:4 N9 0.2 0.0 u.u 0.0 0.0 C24:l N9* 0.0 0.0 0.2 ol — C22:5 N6* 3.2 ~" 0.2 3.1 C22:5 N3* 1.3 1.2 3.0 3.2 〇 Q C22:6 N3* 49.6 49.8 0 1.2 49.0 48.0 FAME %之總數 100.0 100.0 ,.—-—— 100.0 ---— 100.0 ❹ Ο 本專利說明書内所揭示之所有公開案、專利案及專利申請案在此併人本案以為參考資料，該參考的程度就如同已特定地及㈣地將各個公開案、專利案或專利^案併入本案以為參考資料一般。 91 201036554 I：圖式簡單說明3 (無）【主要元件符號說明】 (無） 92 Ο

201036554 序列清單 <110> Apt, Kirk

Pfeifer III, Joseph W.

Hansen, Jon Milton Behrens, Paul Warren Zirkle, Ross Stahl, Tracey Lynn

<120〉破囊壺菌、脂肪酸組成物以及其等製造及使用方法 <130> 2715.OO3PC0O <140〉欲被指定 <141> 隨案附上 <160> 5 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 1713 <212> DNA <213>裂殖壺菌屬 <400> 1 acctggttga tcctgccagc tgtcatttgc tcgtctaaaa gattaagcca tgcatgtcta agtataaaca aattatacgg tgaaactgcg aacggctcat tatatcagtt atagtttctt tgatagtgta tttctatatc tatttggata actgtggcaa ttctagagct aacacatgct ttcgagtggg actttttggt accactgcat ttattagatt ttgaagccaa cgtaaaattg gtgattcatg ataactttgc gaatcgcagt agcgtcttgt acgcggcgat gaatcattca agtttctgcc ccatcagctg tcgatggtac ggtattggcc taccatggct ttcacgggtg acggagaatt agggtttgat tccggagagg acgcttgaga gacggcgacc acatccaagg aaggcagcag gcgcgtaaat tacccaatgg ggactccccg aggtagtgac aagaaataaa aatgaggagc gctttgcgtt tttcaatttg aatgagagaa tcgtacaatc ctcatcgagg atcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ctccagctcc aatagcaaat attagagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttgaatttc cgatagtctt tggccgtgtc cttggtctcg tatcatgggt ttattgtgcc aagatgatcg tcctctatgg ttagtgatag tcatagtcgt ttactgtaaa aaaactggag tgtttaaagc atttctttgg gaaaggtaca tattagtata ggataattag ataggacctg tgattcttat ttggttggtt tgtgagtcat ggtaatgatt aatagggaca atcgggggta ttcgaattta attgtcagag gtgaaattct 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 1 201036554 tggatttaag aaagtcgaac tactgcgaag gcatttacca aggatgtttt cattaataaa 960 gaacgaasgt taggggatcg aagatgatta gataccatcg tagtcttaac tgtaaactat 1020 gccgacttgc gattgtccgt cgttgttttt tcaaaaaaga gacctgggca gcagcacatg 1080 agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa 1140 ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta attcgactca acacgggaaa 1200 acttaccagg tccagacata gtaaggattg acagattgag agctctttct tgattctatg 1260 ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa ttccgttaac 1320 gaacgagacc tcagcctact aaatagtggt gcatattgtg agatatgtga caaaaatcgc 1380 ttcttagagg gacatttcgg gtttaccgga aggaagtttg aggcaataac aggtctgtga 1440 tgcccctaga tgttctgggc cgcacgcgcg ctacaatgac agattcaaca agtccggtag 1500 tggagctttt gcttctctat tattactttt ccgagaggaa tggttaatct tctaaatgtc 1560 tgtcgtgatg gggctagatt tttgcaatta ttaatctcca acgaggaatt cctagtaaac 1620 gcaagtcatc agcttgcatt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgcacc 1680 taccgattga acggtcctat gaaatcttcg gat 1713 <210> 2 <211> 924 <212> DNA <213>裂殖壺菌屬 <400> 2 atcgaccaga aggatgccta cgtaggggac gaggcgcaga gcaagcgtgg tgtgctgacg 60 ctcaagtacc cgatcgagca cggcatcgtg accaactggg acgacatgga gaagatctgg 120 catcacacct tctacaacga gctgcgcgtg gcgcccgagg agcaccccgt gctgctcacc 180 gaggcccccc tcaaccccaa ggcgaaccgc gagcgcatga cccagatcat gttcgagacc 240 ttcaacgtgc cggccatgta cgtcaacatc caggccgtgc tgtccctgta cgcttcgggc 300 cgcaccaccg gcgccgtgct cgattcggga gatggcgtca cgcacaccgt gcccatctac 360 gagggctacg cgctcccgca cgcggtgctg cgcatcgacc tggctggccg cgacctgacc 420 gactacatga tgaagatcct gacggagcgc gggtactcgt tcacgacgac cgccgagcgc 480 gaaatcgtgc gcgacatcaa ggagaagctg tgctacgtgg cgctcgactt cgaccaggag 540 atgaagacgg ccgccgagtc gtcgtcgctg gagaagagct acgagctgcc ggacggcaac 600 gtgatcacga tcggcaacga gcgcttccgc tgccccgagg tgctcttcca gccgtcgttc 660 720 201036554 atcggcaagg aggccgccgg cgtgcacgag accatgttcc agacgatcat gaagtgcgac gtcgatatcc gcaaggacct gtacgccaac atcgtcatgt ccggtggctc caccatgtac gagggcatcg ccgcgcgcct ggagaaggag atggtgtcac tggcgccctc caccatgaag atcaaggtgg tcgcgccccc cgagcgcaag tactcggtgt ggatcggcgg ctccatcctg gcctcgctct ccaccttcca gcaa <210> 3 <211> 291 <212> PRT <213> 裂殖壺菌屬 <400> 3

o 780 840 900 924

Val Leu Thr Leu Lys Tyr Pro lie Glu His Gly lie Val Thr Asn Trp 15 10 15

Asp Asp Met Glu Lys lie Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg 20 25 30

Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn 35 40 45

Pro Lys Ala Asn Arg Glu Arg Met Thr Gin lie Met Phe Glu Thr Phe 50 55 60

Asn Val Pro Ala Met Tyr Val Asn lie Gin Ala Val Leu Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ala Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val 85 90 95

Thr His Thr Val Pro lie Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Val 100 105 110

Leu Arg lie Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Met Met Lys 115 120 125 lie Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu 130 135 140 lie Val Arg Asp lie Lys Glu 145 150

Lys Leu Cys Tyr 155

Val Ala Leu Asp Phe 160 3 201036554

Asp Gin Glu Met Lys Thr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser 165 170 175

Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Asn Val lie Thr lie Gly Asn Glu Arg Phe 180 185 190

Arg Cys Pro Glu Val Leu Phe Gin Pro Ser Phe lie Gly Lys Glu Ala 195 200 205

Ala Gly Val His Glu Thr Met Phe Gin Thr lie Met Lys Cys Asp Val 210 215 220

Asp lie Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn lie Val Met Ser Gly Gly Ser 225 230 235 240

Thr Met Tyr Glu Gly lie Ala Ala Arg Leu Glu Lys Glu Met Val Ser 245 250 255

Leu Ala Pro Ser Thr Met Lys lie Lys Val Val Ala Pro Pro Glu Arg 260 265 270

Lys Tyr Ser Val Trp lie Gly Gly Ser lie Leu Ala Ser Leu Ser Thr 275 280 285

Phe Gin Gin 290 <210> 4 <211> 918 <212> DNA <213>裂殖壺菌屬 <400> 4 60 120 180 240 300 360 gatctgcagc tggagcgcat caacgtgtac ttcaacgagg ccacgggcgg ccgctacgtg ccgcgcgcca tcctcatgga cctggagccc ggtacgatgg actctgtccg cgccggcccc tttggccagc tcttccgccc agacaacttc gtcttcgggc agacgggcgc cggtaacaac tgggccaagg gccactacac tgagggcgcg gagcttatcg actcggtgct cgacgtggtg cgcaaggagg cagagtcgtg cgactgcctg cagggcttcc agatcaccca ctcgctcggc ggcggcacgg gctccggtat gggcacgctt ctcatcagca agatccgcga ggagtacccc gaccgcatca tgctgacctt ctccatcgtg ccctcgccca aggtgtcgga caccgtcgtg 4 420 480 201036554 gagccctaca acgcgacgct ctcggtgcac cagctcgtgg agaacgccga cgaggtcatg gtcctcgaca acgaggcgct gtacgacatc tgcttccgca ccttgaagct caccacgccc acctacggcg acctcaacca cctcgtgtgc gccgccatga gcgggtgcac gtgctgcctg cgcttcccgg gccagctcaa ctcggacctg cgcaagctgg ccgtcaacct ggtgcccttt ccgcgcctcc acttcttcat gatcggcttc tcgcccctca cctcgcgtgg ctcgcagcag taccgcgccc tgaccgttcc ggagctcacg cagcaggcgt ttgacgctaa gaacatgatg tgcgccgccg acccgcgcca cggccgctac ctgacggcga cgacgctctt ccgcgggcgc atgtcgacca aggaggtgga cgagcagatg ctcaacatcc agaacaagaa ctcgtcgtac tttgtcgagt ggatcccc <210> 5 <211> 307 <212> PRT <213> 裂殖壺菌屬 <400> 5

540 600 660 720 780 840 900 918

Asp Asp Leu Gin Leu Glu Arg He Asn Val Tyr Phe Asn Glu Ala Thr 15 10 15

Gly Gly Arg Tyr Val Pro Arg Ala He Leu Met Asp Leu Glu Pro Gly 20 25 30

Thr Met Asp Ser Val Arg Ala Gly Pro Phe Gly Gin Leu Phe Arg Pro 35 40 45

Asp Asn Phe Val Phe Gly Gin Thr Gly Ala Gly Asn Asn Trp Ala Lys 5〇 55 60

Gly His Tyr Thr Glu Gly Ala Glu Leu lie Asp Ser Val Leu Asp Val 65 70 75 80

Val Arg Lys Glu Ala Glu Ser Cys Asp Cys Leu Gin Gly Phe Gin lie 85 90 95

Thr His Ser Leu Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Met Gly Thr Leu Leu 100 105 110

He Ser Lys He Arg Glu Glu Tyr Pro Asp Arg lie Met Leu Thr Phe 115 120 125 5 201036554

Ser 工le Val Pro Ser Pro Lys Val Ser Asp Thr Val Val Glu Pro Tyr 130 135 140

Asn Ala Thr Leu Ser Val His Gin Leu Val Glu Asn Ala Asp Glu Val 145 150 155 160

Met Val Leu Asp Asn Glu Ala Leu Tyr Asp lie Cys Phe Arg Thr Leu 165 170 175

Lys Leu Thr Thr Pro Thr Tyr Gly Asp Leu Asn His Leu Val Cys Ala 180 185 190

Ala Met Ser Gly Cys Thr Cys Cys Leu Arg Phe Pro Gly Gin Leu Asn 195 200 205

Ser Asp Leu Arg Lys Leu Ala Val Asn Leu Val Pro Phe Pro Arg Leu 210 215 220

His Phe Phe Met lie Gly Phe Ser Pro Leu Thr Ser Arg Gly Ser Gin 225 230 235 240

Gin Tyr Arg Ala Leu Thr Val Pro Glu Leu Thr Gin Gin Ala Phe Asp 245 250 255

Ala Lys Asn Met Met Cys Ala Ala Asp Pro Arg His Gly Arg Tyr Leu 260 265 270

Thr Ala Thr Thr Leu Phe Arg Gly Arg Met Ser Thr Lys Glu Val Asp 275 280 285

Glu Gin Met Leu Asn lie Gin Asn Lys Asn Ser Ser Tyr Phe Val Glu 290 295 300

Trp lie Pro 305 6

Claims

201036554 七、申請專利範圍： 1. 一種寄存在ATCC登錄號第^^別％號下之破囊壺菌物種的已單離破囊壺菌微生物或自其衍生之菌株，其中藉該微生物或自其衍生之菌株而產生之總脂肪酸包含約 10重量％或更少之二十碳五稀酸。 2. —種具有該寄存在ATCC^錄號第PTA_9695號下之破囊壺菌物種的特性之已單離破囊壺菌微生物，其中藉該微生物或自其衍生之菌株而產生之總脂肪酸包含約10重量％或更少之二十碳五烯酸。 3. —種已單離破囊壺菌微生物或自其衍生之菌株，其包含三酸甘油酯溶離份，其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳六烯酸含量為至少約40重量％，其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳五烯酸n_6含量為自至少約0.5重量％至約6重量％，且其中藉該微生物或自其衍生之菌株而產生之總脂肪酸包含約10重量％或更少之二十碳五烯酸。 4_ 一種與該寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之破囊壺菌相同之物種的已單離破囊壺菌微生物或自其衍生之菌株，其中藉該微生物或自其衍生之菌株而產生之總脂肪酸包含約10重量％或更少之二十碳五烯酸。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之已單離破囊壺菌微生物，其中該自其衍生之菌株為突變體菌株。 6. —種寄存在ATCC登錄號第PTA-9695號下之已單離破囊壺菌微生物。 7· —種寄存在ATCC登錄號第PTA-9696號下之已單離破囊 1 201036554 壺菌微生物。 8· —種寄存在ATCC登錄號第ΡΤΑ_9697號下之已單離破囊壺菌微生物。 9_ 一種寄存在ATCC登錄號第ΡΤΑ-9698號下之已單離破囊壺菌微生物。 10. —種破囊壺菌生物質塊，其包含申請專利範圍第1至9項中任一項之破囊壺菌微生物或其等之混合物。 11. 一種已單離破囊壺菌生物質塊，其中該生物質塊之乾細胞重的至少約50重量％為脂肪酸，且其中該等脂肪酸之至少約50重量％為ω-3脂肪酸。 12. 如申請專利範圍第丨項之已單離破囊壺菌生物質塊，其中該脂肪酸之至少約50重量。/。為二十二碳六稀酸。 13. 種已單離破囊壺菌生物質塊，其中該生物質塊之乾細胞重的至少約25重量％為二十二碳六烯酸。 Μ·如申請專利範圍第10至13項中任一項之已單離破囊壺菌生物質塊，其中該等脂肪酸之約10重量％或更少為二十碳五烯酸，且其中該二十二碳六烯酸對二十碳五稀酸之重量比為至少約5 : 1。 15.如申凊專利範圍第1〇至14項中任一項之已單離破囊壺菌生物質塊，其中該等脂肪酸之約1.5重量％或更少為花生四烯酸，且其中該二十二碳六烯酸對花生四烯酸之重量比為至少約20 : 1。 6.如申4專利&圍第1()至15項中任—項之已單離破囊壺菌生物質塊，其進-步包含重量比為至少約10: 1之二 201036554 十二碳_六烯酸及二十二碳_五稀酸n-6。 17. —種已單離破囊壺菌培養物，其包含申請專利範圍第1 至9項中任一項之破囊壺菌微生物或其混合物。 18. 如申請專利範圍第17項之已單離破囊壺菌培養物，其進一步包含至少約5%溶氧。 19. 一種用於動物或人類之食品產物、化妝品或藥學組成物，其包含申請專利範圍第1至16項中任一項之破囊壺菌微生物或破囊壺菌生物質塊或其混合物。 20. —種微生物油，其包含至少約70重量％三酸甘油酯溶離份，其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳六烯酸含量為至少約50重量％，且其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳五烯酸n-6含量為自約0.5重量％至約6重量％。 21. 如申請專利範圍第20項之微生物油，其三酸甘油酯溶離份進一步包含約1.5重量％或更少之花生四烯酸。 22. —種微生物油，其包含至少約70重量％三酸甘油酯溶離份，其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳六烯酸含量為至少約40重量％，其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳五烯酸n-6含量為自至少約0.5重量％至約6重量％，且其中該二十二碳六浠酸對二十二碳五浠酸n-6之比率大於約 6 : 1。 23. —種微生物油，其包含至少約70重量％三酸甘油酯溶離份，其中該三酸甘油酯溶離份之二十二碳六烯酸含量為至少約60重量％。 24. 如申請專利範圍第20至23項中任一項之微生物油，其中 3 201036554 該三酸甘油酯溶離份中之該等三酸甘油酯的至少約 20%在該三酸甘油酯中之選自sn-l、sn-2、及sn-3位置中之任兩位置含有二十二破六晞酸。 25. 如申請專利範圍第20至23項中任一項之微生物油，其中該三酸甘油酯溶離份中之該等三酸甘油酯的至少約5% 在該三酸甘油酯中之所有3個位置；sn-l、sn-2、及sn-3 含有二十二碳六烯酸。 26. 如申請專利範圍第20至23項中任一項之微生物油，其進一步包含約5重量％或更少之十七酸。 27. —種用於動物或人類之食品產物、化妝品或藥學組成物，其包含申請專利範圍第20至26項中任一項之微生物油。 28. 如申請專利範圍第19或27項之食品產物，其中該食品產物為嬰兒食品。 29. 如申請專利範圍第28項之食品產物，其中該嬰兒食品適於早產兒。 30. 如申請專利範圍第19或27項之食品產物，其中該食品產物為牛奶、飲料、治療用飲品、營養飲品或其等之組合。 31. 如申請專利範圍第19或27項之食品產物，其中該食品產物為用於動物或人類食品之添加劑。 32. 如申請專利範圍第19或27項之食品產物，其中該食品產物為營養補給品。 33. 如申請專利範圍第19或27項之食品產物，其中該食品產物為動物飼料。 34. 如申請專利範圍第33項之動物飼料，其中該動物飼料為 201036554 水產養殖飼料。 35. 如申請專利範圍第33項之動物飼料，其中該動物飼料為馴養動物飼料、動物園動物飼料、役用動物飼料、禽畜飼料或其等之組合。 36. —種用於製造含ω-3脂肪酸之微生物油的方法，該方法包括： (a) 在一培養物内使申請專利範圍第1至9項中任一項之已單離破囊壺菌微生物或其混合物生長以〇產生一生物質塊；及 (b) 自該生物質塊萃取含ω-3脂肪酸之油。 37. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該培養物包含至少 • 約5%溶氧。 J 38·如申請專利範圍第36項之方法，其中該培養物pH係維持於約6.5至約8.5。 39. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該培養物溫度係維持於約17°C至約30°C。〇 40. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該培養物包含一約 5克/升至約50克/升之葡萄糖濃度。 41. 一種用於製造含ω-3脂肪酸之微生物油的方法，該方法包括自申請專利範圍第10至16項中任一項之生物質塊萃取含ω-3脂肪酸之油。 42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該含ω-3脂肪酸之微生物油係利用己烷萃取法萃取。 43. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該含ω-3脂肪酸之 5 201036554 微生物油係利用無溶劑萃取法萃取。 4 4 ·如申請專利範圍第3 6至4 3項中任一項之方法、或如申請專利範圍第17或18項之已單離破囊壺菌培養物，其中於約17°C至約30°C下在一含碳、氮、及營養物源以及約 950ppm至約8500ppm氯根離子的約pH 6.5至約pH 8.0之培養基内生長約7天後，自各升培養物所離析之生物質塊的乾細胞重為至少約5〇克。 45. 如申請專利範圍第36至43項中任一項之方法或如申請專利範圍第17或18項之已單離破囊壺菌培養物，其中於約17°C至約30。(：下在含碳、氮、及營養物源以及約 950ppm至約8500ppm氯根離子之約pH 6.5至約pH 8.0的培養基内生長約7天後，該ω_3脂肪酸生產力為至少約 2克/升/天。 46. —種藉申請專利範圍第36至45項中任一項之方法而製成之微生物油。 47. —種將如申請專利範圍第1至16項、第2〇至26項、第46 項中任一項之已單離微生物、生物質塊或微生物油或其等之混合物用於製造用以治療炎症或其相關病症之藥物的用途。 48. —種將如申請專利範圍第1至沁項、第2〇至26項、第46 項中任一項之已單離微生物油、生物質塊或微生物油或其等之混合物用於治療炎症或其相關病症之用途。 49·如申請專利範圍第1至16項 '第20至26項、第46項中任一項之已單離微生物、生物質塊或微生物或其等之混合 201036554 物，其係用於治療炎症或其相關病症。 50. —種用於治療需要治療之患者的炎症或其相關病症的方法，其包括對該患者投與申請專利範圍第1至16項、第20至26項、第46項中任一項之已單離微生物、生物質塊或微生物油或其等之混合物、及一藥學上可接受載劑。 0 ❹ 7 201036554 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（）圖。（無) (二) 本代表圖之元件符號簡單說明：五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：