TW200938552A - 1D05 PCSK9 antagonists - Google Patents

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TW200938552A
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Rose M Cubbon
Holly A Hammond
Laura Orsatti
Shilpa Pandit
Laurence B Peterson
Joseph C Santoro
Ayesha Sitlani
Dana D Wood
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Merck & Co Inc
Angeletti P Ist Richerche Bio
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200938552 六、發明說明： 【先前技術】 亦稱為神經細胞凋亡調節轉化酶1(”NARC-1")之前蛋白 轉化酶枯草桿菌蛋白酶-可新型9(在下文中稱為”PCSK9") 為鑑別為分泌性枯草桿菌酶家族之第9成員的蛋白酶K樣枯 草桿菌酶；參見 Seidah等人，2003 PNAS 100:928-933。 PCSK9之基因定位於人類染色體Ip33-p34_3 ; Seidah等 人，上述。PCSK9表現於能夠增殖及分化之細胞中，該等 細胞包括（例如）肝細胞、腎臟間質細胞、腸回腸及結腸上 皮細胞以及胚胎腦端腦神經元；Seidah等人，上述。 PCSK9之最初合成係呈約72 kDa之非活性酶前驅體或酶 原形式，其在内質網（"ER")中經歷自動催化、分子内加工 以活化其功能。已報導此内部加工事件在SSVFAQ丄 SIPWNL158 基元（分別為 SEQ ID NO: 19 及 SEQ ID NO: 20)處 發生；Benjannet 等人，2004 ·/. 5ζ·ο/_ Chem. 279:48865-48875。該内部加工已報導為退出ER所需；Benjannet等 人，上述；Seidah等人，上述。經裂解且藉此經活化之蛋 白質係與經裂解之肽結合分泌；上述。 人類PCSK9之序列（約22 kb長，具有12個編碼692胺基酸 蛋白質之外顯子）在一種情況下可以寄存編號NPJ777596.2 獲得。已寄存人類、小鼠及大鼠PCSK9核酸序列；分別參 見，例如 GenBank 寄存編號：AX127530(以及 AX207686)、 NP_705793(以及 Q80W65)及 P59996。PCSK9 具有見於其他 前蛋白轉化酶中之若干結構域，包括N-末端信號序列、原 137316.doc 200938552 結構域、催化結構域及富半胱胺酸C末端結構域。PCSK9 催化結構域與枯草桿菌酶之蛋白酶K家族及尤其D186、 H226及S386之催化三元體共同具有高序列相似性。 PCSK9係揭示及/或主張於包括（但不限於）以下專利公開 案之若干專利公開案中：PCT公開案第WO 01/31007號、 第 WO 01/57081 號、第 WO 02/14358號、第 WO 01/98468 號、第 WO 02/102993 號、第 WO 02/102994 號、第 WO 02/46383 號、第 WO 02/90526 號、第 01/77137號及第 WO 01/34768號；美國公開案第US 2004/0009553號及第US 2003/0119038號及歐洲公開案第EP 1 440 981號、第EP 1 067 182 號及第 EP 1 471 152 號。 PCSK9已被視為在肝細胞及神經元細胞之分化中起作用 (Seidah等人，上述），高度表現於胚胎肝臟中且與膽固醇 體内平衡密切相關。研究已表明PCSK9在膽固醇生物合成 或吸收中之特定作用。在膽固醇餵養大鼠的研究中， Maxwell等人發現PCSK9係以與膽固醇生物合成中所涉及 之其他3種基因類似之方式得以下調，Maxwell等人，2003 J. Lipid Res. 44:2109-2119。實際上，已展示PCSK9之表現 受固酵調節元結合蛋白（"SREBP")調節，此與關於膽固醇 代謝中所涉及之其他基因所見之情況類似；上述。隨後， 此等發現受到PCSK9轉錄調節之研究的支持，該研究表明 對於脂蛋白代謝中所涉及之其他基因而言該調節相當典 型；Dubuc 等人，2004 jrieriosc/er. Vase. Biol. 24:1454-1459。已展示斯坦汀（statin)以某種方式上調 137316.doc 200938552 PCSK9表現，此係歸因於藥物之降膽固醇效應；上述。此 外，已展示PCSK9啟動子具有膽固醇調節中所涉及之兩個 保守位點，固醇調節元及Spl位點；上述。 若干條證據表明PCSK9尤其降低肝LDLR蛋白質之量且 因此有損肝臟自循環中移除LDL膽固醇之能力。腺病毒介 導之PCSK9在小鼠肝臟中的過度表現由於肝LDLR蛋白質 之顯著損失而導致循環LDL-C積聚，而對LDLR mRNA含 量不起作用；Benjannet 等人，2004 /.仍〇/. CAem. 279:48865-48875 ； Maxwell & Breslow > 2004 PNAS 101:7100-7105 ; Park 等人，2004 ·/. Biol. Chem. 279:50630-50638 ;及 Lalanne 等人，2005 ·/. Λα. 46:1312-1319。PCSK9過度表現對提高小鼠之循環LDL-C 含量的作用完全依賴於LDLR之表現，此再次指示PCSK9 對LDL-C的調節係經由LDLR蛋白質之下調所介導。根據 此等發現，缺乏PCSK9或PCSK9 mRNA已由反義募聚核普 酸抑制劑降低之小鼠具有較高的肝LDLR蛋白質含量及較 強的清除循環LDL-C的能力；Rashid等人，2005尸 102:5374-5379 ;及 Graham等人，2007 «/· ϋρΜ 48(4): 763-767。此外’ siRNA對經培養之人類肝細胞中之pcsk9 含量的降低亦使得LDLR蛋白質含量較高且溶解LDL-C的 能力增加；Benjannet 等人 ’ 2004 出〇/. C/iew. 279:48865-48875 ;及 Lalanne 等人，2005 乂 心$ 46:1312-1319。同時，此等資料指示PCSK9作用藉由降低 LDLR蛋白質含量而使得LDL-C增加。 137316.doc 200938552 基因PCSK9中之許多突變亦確實與常染色體顯性高膽固 醇血症（"ADH")相關，後者為一種遺傳代謝病症，其特徵 為在血漿中低密度脂蛋白（"LDL”）粒子顯著升高，其可導 致過早心血管衰竭；參見Abifadel等人，2003 iVaiMre Gewei/cs 34:154-156 ; Timms 等人，2004 114:349-353 ； Leren » 2004 Clin. 65:419-422。隨後 公開之關於S127R突變之研究（Abifadel等人（上述））報導帶 有該突變之患者在血漿中呈現較高總膽固醇及apoB 100， 此係歸因於（1)諸如低密度脂蛋白（"LDL")、極低密度脂蛋 白（"VLDL”）及中間密度脂蛋白（"IDL”）之含apoBlOO脂蛋白 過度產生，及（2)該等脂蛋白之清除或轉化的相關降低； Ouguerram 等人，2004 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24:1448-1453 。 因此，毫無疑問PCSK9在LDL之調節中起作用。PCSK9 之表現或上調與LDL膽固醇之血漿含量增加相關，且 PCSK9之表現的相應抑制或缺乏與LDL膽固醇血漿含量降 低相關。已發現與PCSK9中序列變化相關之LDL膽固醇含 量降低賦予針對冠心病之防護；Cohen，2006见五《g/· «/. Μ以.354:1264-1272。 極需要鑑別有效治療心血管病痛之化合物及/或藥劑。 在臨床試驗中，LDL膽固醇含量之降低與冠狀動脈事件之 比率直接相關；Law等人，2003 5Μ·/ 326:1423-1427。近 年來，發現血漿LDL膽固醇含量之中度終身降低與冠狀動 脈事件發病率的實質性降低有關；Cohen等人，上述。甚 137316.doc 200938552 至在具有非脂質相關心血管風險因素發病率之群體中更係 如此；上述。因此，對LDL膽固醇含量之可控控制將產生 極大益處。 本發明藉由提供用於抑制PCSK9活性之PCSK9拮抗劑及 PCSK9在各種治療狀況中所起之相應作用來使得此等受關 注問題取得進展。 【發明内容】 本發明係關於PCSK9拮抗劑，在特定實施例中，係關於 抑制人類與鼠類PCSK9之彼等拮抗劑及表現對經處理 PCSK9之優先靶向的彼等拮抗劑。概括而言，PCSK9之蛋 白質特異性拮抗劑（或如本文所稱之"PCSK9特異性拮抗劑”） 為有效與PCSK9選擇性結合及抑制PCSK9功能之PCSK9蛋 白結合分子。此等分子在治療與PCSK9功能相關或受 PCSK9功能影響之病況中具有重要性，該等病況包括（但 不限於）高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠狀 動脈症候群及相關病況。PCSK9特異性拮抗劑之特徵在於 對PCSK9之選擇性識別及結合。除非在拮抗劑經補充或經 設計以賦予PCSK9-特異性結合組份以額外不同特異性之 彼等特定情況下，否則PCSK9特異性拮抗劑不顯示與除 PCSK9外之蛋白質的顯著結合。 形成本文之特定實施例的PCSK9特異性拮抗劑包含（a)重 鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 17之 等效物的CDR3結構域，該等效物之特徵為在CDR3結構域 中具有一或多個保守性胺基酸取代；及/或（b)輕鏈可變 137316.doc 200938552 區’其包含有含SEQ ID NO: 7或SEQ id NO: 7之等效物的 CDR3結構域，該等效物之特徵為在CDR3結構域中具有一 或多個保守性胺基酸取代。在特定實施例中，PCSK9特異 性拮抗劑以1.2χ10·6 Μ或更小之KD與人類及/或鼠類PCSK9 結合。在更特定實施例中，PCSK9特異性拮抗劑以1 X1 〇-7 Μ或更小之{^與人類及/或鼠類PCSK9結合。在其他實施例 中，PCSK9特異性拮抗劑以1χΐ〇·8 Μ或更小之反〇與人類及/ 或鼠類PCSK9結合。在其他實施例中，pcsΚ9特異性拮抗 劑以5χ10-9 Μ或更小或1 xl(T9 Μ或更小之〖〇與人類及/或鼠 類PCSK9結合。在選定實施例中’ pCSK9特異性拮抗劑以 lxlO-1。Μ 或更小之 KD、ΙχΙΟ-11 Μ 或更小之 Kd 或 ΐχίο-12 M 或更小之KD與人類及/或鼠類PCSK9結合。在特定實施例 中’ PCSK9特異性拮抗劑不以上文對於pcSK9結合所指示 之程度與除PCSK9外之蛋白質結合。 本發明之特定實施例包括PCSK9特異性拮抗劑，其表現 以上指定之一種程度的PCSK9結合，且與id〇5抗體分子競 爭以結合PCSK9。1D05抗體分子形成本文之重要pcSK9特 異性拮抗劑。1D05抗體分子之特徵為包含⑴含有SEQ ID NO: 11之重鏈可變區（"VH");及（ii)含有seQ ID NO: 27之 輕鏈可變區（"VL")。該VH區及該VL區分別包含對於VH區 所揭示之CDR1、CDR2及CDR3的全互補序列（SEQ ID NO: 13、15及17)及對於VL區所揭示之CDR1、CDR2及CDR3的 全互補序列（SEQ ID NO: 3、5及7)。1D05抗體分子之實例 包括（但不限於）：（i)Fab，其包含含有SEQ ID NO: 1之輕鏈 137316.doc -9- 200938552 及含有SEQ ID NO: 9之胺基酸1-233(或SEQ ID NO: 9)之Fd 鏈；及（ii)全長抗體分子，其包含含有SEQ ID NO: 26之輕 鏈及含SEQ ID NO: 25之重鏈。 PCSK9特異性拮抗劑有效抵消PCSK9依賴性細胞LDL吸 收抑制作用，且尤其有效抵消人類及/或鼠類PCSK9依賴性 細胞LDL吸收抑制作用。再者，PCSK9特異性拮抗劑1D05 對PCSK9對LDL吸收之作用顯示劑量依賴性抑制作用。因 此，所揭示之PCSK9特異性拮抗劑對降低血漿LDL膽固醇 含量具有重要性。所揭示之拮抗劑亦適用於各種診斷性目 的，包括PCSK9之偵測及量化。選定1D05拮抗劑尤其有 用，此係因為其可與人類PCSK9與鼠類PCSK9兩者交叉反 應。此品質使得特定1D05拮抗劑能夠在鼠類模型中進行藥 理學研究，而不必確保小鼠表現人類PCSK9。在該等實驗 中，鼠類模型充分展現經靶向蛋白質之天然活性及拮抗劑 對該活性之抑制作用。 在特定實施例中，本發明涵蓋PCSK9特異性拮抗劑。在 特定實施例中，本發明涵蓋包含所揭示之重鏈及/或輕鏈 可變區、具有一或多個保守性胺基酸取代之該等區的等效 物及其同系物之抗體分子。選定實施例包含經分離PCSK9 特異性拮抗劑，該等經分離PCSK9特異性拮抗劑包含所揭 示之CDR結構域或重鏈及/或輕鏈CDR結構域組及特徵為具 有一或多個保守性胺基酸取代之該等結構域之等效物。如 熟習此項技術者所瞭解，可將保留拮抗PCSK9之能力的 PCSK9特異性拮抗劑之片段插入各種構架中；參見，例如 137316.doc -10- 200938552 美國專利第6,818,418號及其中所含之參考文獻’其全部揭 示内容均以引用的方式併入本文中，其論及可用以表現先 前基於抗原結合選擇之抗體環的各種支架。在替代方法 中，可使用重組方法將編碼VL之基因及編碼VH之基因接 合，例如使用能將編碼VL之基因及編碼VH之基因製成單 一蛋白質鏈之合成連接子，其中VL及VH區配對以形成另 外稱為單鏈Fv("ScFV")之單價分子；參見，例如Bird等 人，1988 Science 242: 423-426及 Huston等人，1988 iVoc. 85:5879-5883，其揭示内容以引用的 方式併入本文中。 PCSK9特異性括抗劑及片段可呈各種非抗體基支架的形 式，包括（但不限於）高親和性多聚體（avimer，Avidia); DARPin(Molecular Partners);阿達結合素（Adnectin， Adnexus)、抗運載蛋白（Anticalin，Pieris)及親和體 (Affibody，Affibody)。用於蛋白質結合之替代支架的用途 在科學文獻中得以充分瞭解，參見，例如Binz & Pliickthun, 2005 Curr. Opin. Biotech. 1 6:1 -11 ;其揭示内容 以引用的方式併入本文中。因此，非抗體基支架或拮抗劑 分子包含⑴所揭示之重鏈及/或輕鏈可變區CDR3序列（分別 為SEQ ID NO: 17及7)，（ii)所揭示之重鏈可變CDR1、 CDR2及CDR3序列或所揭示之輕鏈可變CDR1、CDR2及 CDR3序列：CDR1(分別為 SEQ ID NO: 13 及 3)、CDR2(分 別為 SEQ ID NO: 15及 5)及CDR3(分別為 SEQ ID NO: 17及 7)，（iii)分別在人類重鏈及/或輕鍵序列之可變區構架内的 137316.doc 11 200938552 所揭示之重鏈及輕鏈CDR的全互補序列（SEQ ID NO: 13、 15、17、3、5及7)，或（iv)所揭示之重鏈及/或輕鏈可變區 SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 27形成本發明之重要實施 例，其中該等支架或拮抗劑分子呈現對PCSK9之選擇性且 抵消PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作用。在另一態樣 中，本發明提供編碼所揭示之PCSK9特異性拮抗劑之核 酸，且在特定實施例中，提供包含所揭示之重鏈及輕鏈、 所揭示之可變重鏈及輕鏈區及其選定組份（包括CDR 1、 CDR 2及/或CDR 3)，尤其所揭示之各別CDR3區的PCSK9 特異性拮抗劑。在另一態樣中，本發明提供包含該核酸之 載體。另外，本發明提供包含編碼所揭示之PCSK9特異性 拮抗劑之核酸的經分離細胞。在另一態樣中，本發明提供 包含本發明之多肽或載體之經分離細胞。 本發明提供用於製造本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑 的方法，該等PCSK9特異性拮抗劑包括（但不限於）抗體、 抗原結合片段、衍生物、嵌合分子、上述任何物質與另一 多肽之融合物或包含所揭示序列的能夠特異性結合PCSK9 之替代結構/組合物。該等方法包含：⑴在允許PCSK9特 異性拮抗劑表現及/或組裝之條件下培育細胞，該細胞包 含編碼PCSK9特異性拮抗劑之核酸或包含編碼其一或多個 組份之個別核酸，該等核酸在表現時共同產生拮抗劑，及 (ii)自該細胞分離該（等）拮抗劑。熟習此項技術者亦可使用 標準重組DNA技術獲得本文所揭示之PCSK9特異性拮抗 劑0 137316.doc -12- 200938552 本發明提供一種用於拮抗PCSK9之活性或功能或PCSK9 之顯著作用的方法，其包含使所關注之表現PCSK9之細 胞、細胞群體或組織樣品（或用人類或鼠類PCSK9處理或 其中具有人類或鼠類PCSK9)與本文所揭示之PCSK9特異性 拮抗劑在允許該拮抗劑與PCSK9結合之條件下接觸。本發 明之特定實施例包括其中細胞為人類或鼠類細胞之該等方 ’法。其他實施例為其中細胞表現人類或鼠類來源之PCSK9 的該等方法。 在另一態樣中，本發明提供一種用於拮抗呈現與PCSK9 活性相關之病況或PCSK9之功能對於特定受檢者顯示不當 之病況的受檢者之PCSK9活性或功能或PCSK9之顯著作用 的方法，其包含向該受檢者投與治療有效量之呈醫藥或其 他組合物形式的本發明之PCSK9特異性拮抗劑。 因此，本發明涵蓋一種治療與PCSK9活性相關之病況或 PCSK9之功能對於特定受檢者顯示不當之病況的方法，其 @ 包含向受檢者投與治療有效量之呈醫藥或其他組合物形式 的本發明之PCSK9特異性拮抗劑。在選定實施例中，病況 為高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠狀動脈症 - 候群或相關病況。 . 在特定實施例中，本發明涵蓋一種向受檢者投與所揭示 之PCSK9特異性拮抗劑的方法，其包含傳遞治療有效量之 包含如本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑的醫藥或其他組 合物。 在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之PCSK9特 137316.doc -13- 200938552 異性拮抗劑之醫藥組合物或其他組合物，其特徵為包含醫 藥學上可接受之載劑，該載劑包括（但不限於）賦形劑、稀 釋劑、穩定劑、緩衝劑或經設計以促進拮抗劑以所要量投 與所治療個體之替代物。 下表提供本申請案中所論述之序列的概述： 表1 SEQ ID NO: 描述 SEQ ID NO: 1 輕鏈("LC") ; 1D05 SEQ ID NO: 2 輕鏈("LC”)核酸；1D05 SEQ ID NO: 3 VLCDR1 ； 1D05 SEQ ID NO: 4 VLCDR1核酸；1D05 SEQ ID NO: 5 VLCDR2 ； 1D05 SEQ ID NO: 6 VLCDR2核酸；1D05 SEQ ID NO: 7 VLCDR3 ； 1D05 SEQ ID NO: 8 VLCDR3核酸；1D05 SEQ ID NO: 9 包括連接子及標記在内之Fd鏈；1D05 SEQ ID NO: 10 Fd鏈核酸；1D05 SEQ ID NO: 11 VH ； 1D05 SEQ ID NO: 12 VH核酸；1D05 SEQ ID NO: 13 VHCDR1 ； 1D05 SEQ ID NO: 14 VHCDR1核酸；1D05 SEQ ID NO: 15 VHCDR2 ； 1D05 SEQ ID NO: 16 VHCDR2核酸；1D05 SEQ ID NO: 17 VH CDR3 ； 1D05 SEQ ID NO: 18 VHCDR3核酸；1D05 SEQ ID NO: 19 加工位點之片段 SEQ ID NO: 20 加工位點之片段 SEQ ID NO: 21 IgGl之恆定結構域 SEQ ID NO: 22 IgG2之恆定結構域 SEQ ID NO: 23 IgG4之恆定結構域 SEQ ID NO: 24 IgG2m4之恆定結構域 SEQ ID NO: 25 1D05 IgG2m4重鏈("HC") SEQ ID NO: 26 1D05 IgG輕(κ)鏈 SEQ ID NO: 27 VL ； 1D05 SEQ ID NO: 28 VL核酸；1D05 SEQ ID NO: 29 1D05 IgG2m4HC核酸 SEQ ID NO: 30 1D05 IgG LC核酸 137316.doc -14- 200938552 SEQIDNO: 描述 SEQIDNO: 31 lD05IgG2m4HC 質體 SEQ ID NO: 32 lD05IgGLC 質體 SEQ ID NO: 33 引子 SEQ ID NO: 34 引子 SEQ ID NO: 35 引子 SEQ ID NO: 36 引子 SEQ ID NO: 37 1D05抗原決定基結構域 SEQ ID NO: 38 圖中PCSK9序列之部分 SEQ ID NO: 39 人類抗原決定基區 SEQ ID NO: 40 一致序列 SEQ ID NO: 41 鼠類抗原決定基區 SEQ ID NO: 42 二級足跡(secondary footprint)抗原決定基 Λ 【實施方式】 本發明係關於PCSK9拮抗劑，且在特定實施例中，係關 於抑制人類與鼠類PCSK9之彼等拮抗劑及優先靶向經加工 PCSK9之彼等拮抗劑。本文之PCSK9之蛋白質特異性拮抗 劑（或"PCSK9特異性拮抗劑”）有效與PCSK9選擇性結合及 抑制PCSK9功能，且因此在治療與PCSK9功能相關或受 PCSK9功能影響之病況中具有重要性，該等病況包括（但 不限於）高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠狀 ❹ 動脈症候群及相關病況。使用術語”拮抗劑”係指標的分子 可拮抗PCSK9之功能。使用術語”拮抗”或其派生詞係指對 抗、抵消、抑制、中和或削弱PCSK9之一或多種功能之行 . 為。本文提及PCSK9功能或PCSK9活性係指由PCSK9驅 • 動，需要PCSK9或由PCSK9加強或增強之任何功能或活 性。已證明如本文所述之PCSK9特異性拮抗劑有效抵消人 類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作用。 本文之一重要實施例係關於1D05抗體分子。該等1D05 抗體分子之特徵為包含⑴含SEQ ID NO: 11之重鏈可變區 137316.doc -15- 200938552 ("VH");及（ii)含 SEQ ID NO: 27之輕鍵可變區（"vl")。該 VH區及該VL區分別包含對於VH區所揭示之CDR1、CDR2 及CDR3的全互補序列（SEQ ID NO: 13、15及17)及對於VL 區所揭示之CDR1、CDR2及CDR3的全互補序列（SEQ ID NO: 3、5及7)。1D05抗體分子之實例包括（但不限於）：⑴ Fab ’其包含有含seQ ID NO: 1之輕鍵及含SEQ ID NO: 9 之胺基酸1-233(或SEQ ID NO: 9)之Fd鏈；及（ii)全長抗體 分子’其包含有含SEQ ID NO: 26之輕鏈及含SEQ ID NO: 25之重鏈。選定群組之1D〇5抗體展示如本文所揭示之 PCSK9特異性拮抗劑有效抑制人類與鼠類PCSK9且可在鼠 類模型中在不表現人類PCSK9的情況下進行藥理學研究。 PCSIC9特異性分子亦適用於PCSK9之偵測及量化中之各 種診斷性目的。 此*外’所揭示之PCSK9特異性拮抗劑之獨特之處在於選 定實施例已展示優先識別經加工PCSK9(PCSK9之活化形 式）。 如本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑為降低血漿LDL贍 固#1量之所需分子且適用於具有商業或養馴獸醫學價值 之任何靈長類動物、哺乳動物或脊椎動物。PCSK9特異性 括抗劑亦適用於抑制任何具有LDL受體之細胞或組織群體 中之PCSK9活性。可直接藉由熟習此項技術者易於使用之 檢定量測所揭示之拮抗劑的效用。量測LDL吸收之方法描 述於文獻中；參見，例如Barak及Webb，1981 乂 CW/仍〇/. 90:595-604 及 Stephan 及 Yurachek，1993 ·/· Λα. B7316.doc 200938552 34:325330。此外，量測血漿中LDL膽固醇之方法充分描述 於文獻中；參見，例如McNamara等人，2006 Clinica C/t/m/ca ία 369:1 58-1 67。所揭示之拮抗劑對於細胞LDL 吸收之特定影響亦可經由包含以下步驟之方法量測：向細 胞樣品提供經純化PCSK9及經標記LDL粒子；向細胞樣品 提供PCSK9拮抗劑；將該細胞樣品培育一段時間足以使 LDL粒子由細胞吸收；量化併入細胞中之標記物的量；及 鑑別使得所量化的由細胞溶解之標記物的量與單獨投與 ❹ PCSK9時所觀察之量比較增加的彼等拮抗劑。量測所揭示 拮抗劑之影響的另一方法包含向細胞樣品提供經純化 PCSK9及經標記LDL粒子；向細胞樣品提供PCSK9拮抗 劑；將該細胞樣品培育一段時間足以使LDL粒子由細胞吸 收；藉由移除上清液分離細胞樣品之細胞；減少經標記 LDL粒子（與培養盤、細胞或除LDL受體外之任何物）之非 特異性締合；溶解細胞；量化保留於細胞溶解產物内之標 _ 記物的量；及鑑別使得所量化之由細胞溶解之標記物的量 與單獨投與PCSK9時所觀察之量比較增加的彼等拮抗劑。 使得所量化之標記物的量增加之拮抗劑為PCSK9拮抗劑。 - 帶有LDL受體之任何類型之細胞均可用於以上方法，該 細胞包括（但不限於）HEK細胞、HepG2細胞及CHO細胞。 源於任何來源之LDL粒子均適用於上述檢定。在特定檢定 中，LDL粒子為來源於血液之新鮮粒子。此可藉由熟習此 項技術者可用之任何方法實現，該方法包括（但不限 於）Havel 等人，1955 /. 34: 1345-1353 之方 137316.doc -17- 200938552 法。可用螢光標記LDL粒子。經標記LDL粒子内部可併有 可見波長激發螢光團3,3'-二十八烷基吲哚碳菁碘化物 (dil(3))以形成極具螢光之LDL衍生物dil(3)-LDL。可使用 使熟習此項技術者能夠偵測細胞溶解產物中之LDL之任何 標記物。可使用LDL類似物，其將僅在經細胞内代謝時變 得可偵測（例如，在不同波長下變得具有螢光或發螢光等） 或（例如）若其將在内在化過程中與其他分子締合（或解 離）（例如FRET檢定，其中LDL類似物將與次級螢光染料缔 合或與抑止劑解離）。可採用此項技術中可用以偵測經標 記LDL粒子之内在化的任何方法。LDL粒子及PCSK9與細 胞之培育時間為長度足以使LDL粒子由細胞吸收之時間。 此時間可在5分鐘至3 6 0分鐘之範圍内。添加至細胞之 PCSK9的濃度可在1 nM至5 μΜ之範圍内，在特定方法中， 在0.1 ηΜ至3 μΜ之範圍内。熟習此項技術者可用來測定特 定PCSK9蛋白之濃度範圍的一特定方法為在LDL吸收檢定 中形成劑量反應曲線。可選擇促進接近於LDL-吸收之最大 損失且仍在劑量反應曲線之線性範圍中之PCSK9濃度。通 常，此濃度為自劑量反應曲線得到之蛋白質的EC-50之約5 倍。濃度可隨蛋白質而改變。 概括而言，如本文所定義之PCSK9特異性拮抗劑選擇性 識別PCSK9且與PCSK9特異性結合。當解離常數μΜ、 較佳$100 ηΜ且最佳$10 ηΜ時通常認為抗體與抗原特異性 結合。本文使用術語"選擇性”或"特異性”進一步係指除非 在拮抗劑經補充或經設計以賦予PCSK9特異性結合部分以 137316.doc •18- 200938552 2卜不同特異性之彼等特m下（例如，在雙特異性或 :=訧/刀子中，該分子經設計以結合兩種分子或實現兩種 力月b，其中至少一者將特異性結合PCSK9)，否則所揭示 6扰抗幻不展不與除PSCK9n之蛋白質的顯著結合。在特 • 實施例中，PCSK9特異性拮抗劑以1.2xl 0_6 Μ或小於 1·2χ10 6 M2KD與人類及/或鼠類PCSK9結合。在更特定實 施例中，PCSK9特異性拮抗劑以5X10·7 Μ或小於5χΐ〇_7 M ❹ 之Κ'、2x10-7 Μ或小於2x10-7厘之&〇或1><1〇-7 M或小於 HO 7 Μ之KD與人類及/或鼠類pcSK9結合。在其他實施例 中，PCSK9特異性拮抗劑以1><1〇-8 M或小於ίχ1〇·8 M之Kd 與人類及/或鼠類PCSK9結合。在其他實施例中，pcsK9^ 異性拮抗劑以5xl〇-9 M或小於5xl〇·9 M2Kd41x1〇·9 M或 小於1x10 9 M之KD與人類及/或鼠類PCSK9結合。在選定實 施例中，PCSK9特異性拮抗劑以1χ1〇·ι〇 M或小於1χ1〇·10 M 之KD、lxio·1丨M或小於1x1〇-m M之κ〇或1χ1〇-12 m或小於 φ 1X10 12 M2Kd與人類及/或鼠類PCSK9結合。在特定實施 例中，PCSK9特異性拮抗劑不以上述!^^結合除p(：SK9外的 蛋白質。KD係指由Kd(特定結合分子-目標蛋白相互作用之 ' 解離速率）與Ka(特定結合分子-目標蛋白相互作用之締合速 . 率）之比率，或以莫耳濃度（M)表示之Kd/Ka獲得的解離常 數。KD值可使用在此項技術中充分確定之方法測定。用於 測定結合分子之KD的較佳方法係使用表面電漿共振，例如 採用諸如Biacore™(GE Healthcare Life Sciences)系統之生 物感應器系統。 I37316.doc 19 200938552 已展示本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑劑量依賴性抑 制對於LDL吸收之人類及/或鼠類PCSK9依賴性作用。因 此，如本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑的特徵在於其抵 消對LDL吸收至細胞中的PCSK9依賴性抑制作用之能力。 此經由LDL受體將LDL吸收至細胞中之吸收在本文中稱為 ”細胞LDL吸收”。在特定實施例中，PCSK9特異性拮抗劑 抵消或拮抗對LDL吸收至細胞中之人類及/或鼠類PCSK9依 賴性抑制作用，呈現小於1.〇χ1(Γ6 M，或按照優先次序小 於 ΙχΙΟ·7 Μ、ΙχΙΟ-8 Μ、1χ1〇-9 Μ、1χ1〇-10 Μ、ΙχΙΟ.11 Μ 及ΙχΙΟ·12 Μ之IC5G。任何PCSK9特異性拮抗劑所達成之抑 制程度可藉由與對照組進行統計學比較或經由此項技術中 可用以評定對PCSK9功能之負性作用或抑制作用的任何替 代方法（亦即，能夠評定PCSK9功能之拮抗作用之任何方 法）來定量量測。在特定實施例中，該抑制作用為抑制至 少約10%。在其他實施例中，該抑制作用為至少20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95% ° 因此， 能夠實現此等程度之PCSK9功能抑制的PCSK9特異性拮抗 劑形成本文之特定實施例。 本文之PCSK9特異性拮抗劑可為特異性結合人類及/或 鼠類PCSK9蛋白質之任何結合分子，其包括（但不限於）如 下所定義之抗體分子、任何PCSK9特異性結合結構、特異 性結合PCSK9之任何多肽或核酸結構及併入各種蛋白質支 架中之上述任何分子；包括（但不限於）各種非抗體基支架 及能夠提供或允許與PCSK9選擇性結合之各種結構，包括 137316.doc •20- 200938552 (但不限於）小分子免疫治療藥物（或”SMIP";參見，Haan 及Maggos, 2004 1月26日）；免疫性蛋白質（參 見，例如 Chak 等人，1996 尸roc. Jcac?· Scz·. 93:6437-6442);細胞色素b562(參見 Ku 及 Schultz，1995 Proc. Λ/'βί/. *Scz·· CAS1」92:6552-6556);狀 α2ρ8(參見
Barthe等人，2000 Proieh 5cz·. 9:942-955);高親和性多聚 體（Avidia ;參見 Silverman 等人，2005 iVai_ Biotechnol. 23:1556-1561) ; DARPin(Molecular Partners ;參見 Binz 等 A » 2003 J. Mol. Biol. 332:489-503 ;及 Forrer等人，2003 FEBS Lett. 539:2-6);四結合素（Tetranectin)(參見， Kastrup等人，1998 Jcia. Ζλ _5io/· 54:757-766);阿達結合素（Adnexus ;參見，Xu等人，2002 CAew.价〇/· 9:933-942)、抗運載蛋白（Pieris;參見 Vogt及 Skerra, 2004 Chemobiochem. 5:1 9 1 -199 ; Beste等人，1999 iVoc. iWzi/· Jcaaf. *Scz·. 96:1898-1903 ; Lamia 及
Erdmann, 2003 丄 Mo/.仍〇/. 329:381-388 ;及 Lamia 及 Erdmann, 2004 Protein Expr. Purif. 33:39-47) ； A-l# 白質（參見 North及 Blacklow，1999 38:3926- 3935)、脂質運載蛋白（Lipocalin)(參見 Schlehuber及 Skerra, 2005 Drwg D^cov· 7bo?a少1 0:23-33);諸如錯蛋白重複蛋白 質之重複基元蛋白質（參見Sedgwick及Smerdon, 1999 7>e«心 5,ocAew. Sci. 24:311-316 ; Mosavi等人，2002 尸"〇〔 iVa"· JcaA 99:16029-16034 ;及 Binz等人，2004 价 oiec/mo/· 22:575-582);昆蟲防禦素A(參見 Zhao 等 137316.doc -21 - 200938552 人，2004 25:629-635);庫尼結構域（Kunitz domain)(參見 Roberts 等人，1992 Proc. Natl. Acad. Sci. [/SJ 89:2429-2433 ; Roberts等人，1992 Gene 121:9-15 ; Dennis及 Lazarus, 1994 ·/. 5ζ·ο/· CAem. 269:22129-22136 ; 及 Dennis 及 Lazarus, 1994 J. Biol. Chem. 269:22137-22144) ; PDZ-結構域（參見 Schneider 等人，1999 17:170-175);諸如卡律蛾毒素（Charybdotoxin) 之礙毒素（參見 Vita等人，1998 少werj· 47:93-100); 第10個III型纖維結合蛋白結構域（或10Fn3 ;參見Koide等 人，1998 J. Mol.价〇/· 284:1141-1 151，及 Xu等人，2002 CAew.於9:933-942) ; CTLA-4(胞外結構域；參見 Nuttall 等人，1999 尸36:217-227 ;及 Irving 等人， 2001 J. Immunol. Methods 248:31-45)；寺丁、结素(Knottin)(參 見 Souriau 等人，2005 44:7143-7155及 Lehtio 等人，2000 尸roieks 41:316-322); 新制癌菌素 (Neocarzinostatin)(參見 Heyd 等人，2003 Biochemistry 42:5674-5683);碳水化合物結合模組4-2(CBM4-2 ;參見 Cicortas等人，2004 Proiei” 五/ig. Se厂 17:213-221); 澱粉酶抑肽（Tendamistat)(參見 McConnell 及 Hoess，1995 ·/· Mol. Biol. 250:460-470>5. Li ^ A J 2003 Protein Eng. 16:65-72); T細胞受體（參見 Holler等人，2000 iVoc. iVai/·
Sci. USA 97:5387-5392 ; Shusta 等人，2000 Nat.
Biotechnol. 18:754-759 ;及 Li等人 ^ 2005 Nat. Biotechnol. 23:349-354);親和體（Affibody ;參見 Nord 等人，1995 137316.doc •22- 200938552
Protein Eng. 8:601-608 ; Nord 等人 > 1997 Nat. Biotechnol. 15:772-777 ; Gunneriusson 等人，1999 iVoie/w j&rag. 12:873-878);及文獻中所認可之其他選擇性結合蛋白或支 架；參見，例如 Binz 及 Pliickthun，2005 Cwrr. Biotech. 16:1-11 ; Gill 及 Damle, 2006 Curr. Opin.
Biotechnol. 17:1-6 ; Hosse 等人，2006 Proiez’w Science 15:14-27 ; Binz 等人，2005 iWzi. 5i_oiecA«o/· 23:1257-1268 ； Hey^ A » 2005 Trends in Biotechnol. 23:514-522 ； Binz及 Pltickthun，2005 Curr. Opin. Biotech. 16:459-469 ; Nygren及 Skerra，2004 J. Immunolog. Methods 290:3-28 ； Nygren>5. Uhlen, 1997 Curr. Opin. Struct. Biol. 7:463-469 » 其揭示内容以引用的方式併入本文中。抗體及抗原結合片 段之用途在文獻中得以充分定義及瞭解。用於蛋白質結合 之替代支架之用途亦在科學文獻中得以充分瞭解，參見， 例如 Binz及 Pliickthun，2005 Curr. 16:1-11 ; ❹ Gill及 Damle, 2006 Cwrr. 5/oiecAno/. 17:1-6 ; Hosse 等尺，2QQ6 Protein Science 15:14-27 ; Binz 等人，2005 TVai. 5/oiecAwo/. 23:1257-1268 ; Hey等人，2005 - Biotechnol. 23:514-522 ; Binz 及 Pluckthun， 2005 Curr.
Opin. Biotech. 16:459-469 ; Nygren 及 Skerra，2004 J. Immunolog. Methods 290:3-28 » Nygren^. Uhlen, 1997 Curr. 7:463-469 ;其揭示内容以引用的方式併 入本文中。因此，本文之對於PCSK9呈現選擇性並抵消 PCSK9依賴性細胞LDL-吸收抑制作用之非抗體基支架或拮 137316.doc .23- 200938552 抗劑分子形成本發明之重要實施例。適體（能夠選擇性結 合目標分子之核酸或肽分子）為一特定實例。其可選自隨 機序列集合或自諸如核糖開關（riboswitch)之天然來源鑑 別。肽適體、核酸適體（例如，結構化核酸，包括DNA基 結構與RNA基結構兩者）及核酸誘餌可有效選擇性結合及 抑制所關注之蛋白質；參見’例如Hoppe-Seyler及Butz， 2000 J. Mol, Med. 78:426-430 ; Bock 等人，1992 Nature 355:564-566 ； Bunka>5l Stockley, 2006 Nat. Rev. Microbiol. 4:588-596 ; Martell 等人，2002 Mo/ec. 77ier. 6:30-34 ; Jayasena, 1999 C7i«. C/iem. 45:1628-1650;其揭示内容以 引用的方式併入本文中。 重要地，PCSK9上對於1D05之結合位點（或抗原決定基） 係經由限制性蛋白水解及質譜分析（"LP-MS")鑑別。限制 性蛋白水解質譜分析涉及在經嚴格控制的條件下將野生型 PCSK9(”wt-PCSK9")及wt-PCSK9與1D05之複合物與具有不 同特異性之内切蛋白酶一起培育。在該等情況下，内切蛋 白酶僅裂解暴露之一級裂解位點。該實驗經設計以便使 1D05與野生型hPCSK9之結合遮蔽通常暴露於未與該抗體 結合之野生型hPCSK9上之表面殘基。該等經遮蔽之殘基 提供對1D05之結合結構域的識別。經由該等實驗，鑑別具 構形性且由肽RYRAD(SEQ ID NO: 42)及 REIEGR(SEQ ID NO: 37)表示之新穎中和性抗原決定基。此抗原決定基屬 於PCSK9之催化結構域中且提供鑑別其他有效PCSK9拮抗 劑之新穎目標抗原決定基。假定1D05具有PCSK9中和活 137316.doc -24- 200938552 性’結合此抗原決定基之其他PCSK9特異性拮抗劑的鑑別 明顯受到關注。 鑑別結合所鑑別1D05抗原決定基或重疊抗原決定基的拮 抗劑且尤其抗體之一種方法係經由競爭或類似檢定，其中 候選抗體或結合分子將必須勝過1D05以結合抗原決定基。 本文所涵蓋之競爭性拮抗劑為在1 μΜ或小於1 μΜ下在 1D05以其KD或低於其KD之情況下抑制（亦即，與對照組相 比阻止或干擾）或降低至少50%、60% ' 70%及80%(按遞增 優先次序）（甚至更佳至少90%且最佳至少95%)之1D05結合 之分子’且尤其拮抗（i) PCSK9與LDL受體之結合，（ii) PCSK9至細胞中之内在化，或（iii)pcSK9與LDL受體之結 合與PCSK9至細胞中之内在化兩者的彼等分子。可易於在 活體外（例如）使用ELISA及/或藉由監測抗體與PCSK9在溶 液中之相互作用來檢定結合成員之間的競爭。進行分析之 確切方法並不關鍵。可將PCSK9固定至96孔板中或可使其 處於均勻溶液中。在特定實施例中，可使用放射性物質、 酶或其他標記物量測未標記之候選抗體阻斷經標記1D05之 結合的能力。在逆相檢定中，測定未標記抗體干擾經標記 1D05與PCSK9之相互作用的能力’其中該等lD〇5及PCSK9 已結合。在特定實施例中’⑴使PCSK9與經標記1D05(包 含有含SEQ ID NO: 27之VL及含SEQ ID NO: 11之VH的抗 體分子）接觸；（H)使PCSK9與候選抗體或抗體之集合接 觸；及（iii)鑑別能夠中斷或阻止PCSK9與1 D05之間的複合 之抗體。該實例中之結果讀出係經由量測經結合之標記 137316.doc -25- 200938552 物。可以任何次序或同時添加1D05及候選抗體。可進行之 特定檢定為實例13之檢定，其中說明發現與1D05結合相同 抗原決定基結構域之抗體的活性。 可測試在以上或其他合適檢定中鑑別為1D05競爭者之抗 體拮抗或中和（i) PCSK9與LDL受體之結合；及/或（ii) PCSK9至細胞中之内在化的能力。可經由使用類似於本說 明書中所用或所述之檢定量測此等參數。在特定實施例 中，競爭抗體所顯示之抑制作用為抑制至少約10%。在其 他實施例中，抑制作用為至少20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%或 95%。 本發明特別涵蓋選擇性結合對於1D05所鑑別之抗原決定 基或干擾1D05與PCSK9結合的重疊抗原決定基之PCSK9特 異性拮抗劑且尤其單株抗體分子（及其相應胺基酸及核酸 序列）。於PCSK9之抗原決定基上所鑑別之供1D05結合之 關鍵殘基為對應於人類PCSK9之殘基Argl94、Glul97及 Argl99的彼等殘基。包含此等胺基酸殘基之窄抗原決定基 係由SEQ ID NO: 37表示且屬於人類PCSK9之SEQ ID NO: 39及鼠類PCSK9之SEQ ID NO: 41之區域中。抗體之二級 足跡係由SEQ ID NO: 42表示。特異性結合由SEq id NO: 37及SEQ ID NO: 42表示之構形抗原決定基或重疊抗原決 定基之單株抗體拮抗或中和（i) PCSK9與LDL受體之結合； (ii) PCSK9至細胞中之内在化或（出）兩者。因此，結合 PCSK9上包含以下序列及/或由以下序列組成之抗原決定基 的單株抗體形成本發明之重要實施例：SEQ id NO: 37、 137316.doc -26 - 200938552 SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 41。本發明之特定實施例係 關於識別PCSK9上之以下抗原決定基的單株抗體：SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 42。本文之單株抗體分子可為完整 (完全或全長）抗體、大體上完整之抗體或包含抗原結合部 分之抗體部分或片段，例如鼠類抗體或嵌合抗體或人源4匕 抗體或人類抗體之Fab片段、Fab，片段或F(ab，）2片段。如本 文所用之單株係指均質或大體上均質（或純）的抗體群體’ 亦即，在該群體中至少約90%、91%、92%、93%、94%、 01 95%、96%，更佳至少約97%或98%，或最佳至少99%之抗 體一致且將在ELISA檢定中競爭結合相同抗原或抗原決定 基。在本發明之特定實施例中，本發明提供單株抗體，該 等單株抗體⑴在1 μΜ或小於1 μΜ下在1D05以其KD或低於 其KD之情況下與1D〇5抗體分子競爭結合PCSK9，從而減少 至少50%之id〇5結合，（ii)阻斷PCSK9與LDL受體結合， (iii)抑制PCSK9内在化至細胞中，且（iv)包含特異性抗原結 p 合區、VH、VL、CDR組或重CDR3、重鏈及/或輕鏈或本 文所述之此等組份之任何變化形式。其他實施例提供 PCSK9特異性拮抗劑，其包括（但不限於）識別/結合SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39或 SEQ ID NO: 41 之單株抗體，其 中PCSK9特異性拮抗劑以i.2xl〇-6 M或小於1.2χ1〇-6 M之KD 結合人類及/或鼠類PCSK9，且其中PCSK9特異性拮抗劑與 1D05競爭結合PcsK9。在本文之特定實施例中，PCSK9特 異性括抗劑進一步由以下一或多種品質定義：其⑴在i μΜ 或小於1 μΜ下在1D05以其KD或低於其KD之情況下減少至 137316.doc -27· 200938552 少50%之1D05結合’（ii)阻斷PCSK9與LDL受體之結合， (iii)抑制PCSK9内在化至細胞中，及/或（iv)包含特異性抗 原結合區、VH、VL、CDR組或重CDR3、重鏈及/或輕鏈 或本文所述之此等組份之任何變化形式。在特定實施例 中，以上PCSK9特異性拮抗劑包含⑴所揭示之重鏈及/或 輕鏈可變區CDR3序列（分別為SEQ ID NO: π及7)，（⑴所 揭示之重鏈及/或輕鍵可變區CDR1(分別為SEQ ID NO: 13 及3)、CDR2(分別為SEQ ID NO: 15及5)及CDR3(分別為 SEQ ID NO: 17及7)，（iii)在人類重鏈及/或輕鏈序列之可 變區構架内的所揭示之重鏈及輕鏈CDR的全互補序列（SEQ ID NO: 13、15、17、3、5及 7) ; (iv)所揭示之 VL及/或 VH 區（分別為SEQ ID NO: 27及11) ; (v)所揭示之輕鏈及/或Fd 鏈（SEQ ID NO: 1 及 SEQ ID NO: 9 之胺基酸 1-233(或 SEQ ID NO: 9))，或（vi)所揭示之輕鍵及/或重鍵（SEQ ID NO: 26及 25)。在特定實施例中，PCSK9特異性拮抗劑結合/鑑別 SEQ ID NO: 37與 SEQ ID NO: 42兩者。 在用於鑑別與1D05結合相同或重疊抗原決定區之抗體的 以上任何檢定中，已知結合者（亦即，已知結合SEQ NO: 37 之殘基 Argl94、Glul97 及 Argl99 的 1D05 抗體分子） 之結合與候選結合者之結合相比應可區分。熟習此項技術 者將易於瞭解此可（但並非必須）經由對任一分子或兩分子 使用標記物來實現。如本文所用之標記物係指併入/附著 至抗體分子之另一分子或試劑。在一實施例中’標記物為 可偵測標記，例如經放射性標記之胺基酸或附著至可由經 137316.doc -28· 200938552 標記抗生物素蛋白偵測之生物素基部分之多肽（例如，含 有可藉由光學或比色方法偵測之螢光標記或酶活性之抗生 蛋白鏈菌素）。此項技術中已知且可使用標記多肽及醣蛋 白之各種方法。用於多肽之標記物的實例包括（但不限於） 以下各者：放射性同位素或放射性核素（例如，3H、、 15n、35s、9〇y、99tc、、、125i、131i)、螢光標記物(例 如，FITC '若丹明（rhodamine)、鑭系元素磷光體）、酶促 標記物（例如’辣根過氧化酶、β_半乳糖苷酶、螢光素酶、 驗性磷酸酶）、化學發光標記、生物素基、由第二報導體 識別之預先確定之多狀抗原決定基（例如，白胺酸拉鏈對 序列、第二抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定 基標記）、磁性試劑（諸如釓螯合劑）、毒素（諸如百曰咳毒 素、泰克索（taxol)、細胞鬆弛素Β、短桿菌素d、溴化乙 錠、依米丁（emetine)、絲裂黴素、依託泊苷（et〇p〇side)、 鬼臼噻吩苷（tenoposide)、長春新鹼（vincristine)、長春花 鹼（vinblastine)、秋水仙鹼（colchicin)、阿黴素 (doxorubicin)、道错黴素（daunorubicin)、二經基炭疽菌素 二酮、米托蒽醌（mitoxantrone)、米拉黴素（mithramycin)、 放線菌素D、1-脫氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因 (procaine)、丁卡因（tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普 萘洛爾（propranolol)及嘌呤黴素（puromycin))及其類似物或 同系物。在一些實施例中，標記物由各種長度之間隔臂連 接以降低可能之位阻。 用於競爭檢定之1D05抗體可為具有本文所提供之丨1)05 137316.doc -29- 200938552 描述的任何抗體分子（亦即對PCSK9具選擇性之任何抗體 分子，其包含有含SEQ ID NO·· 27之VL及含SEQ ID NO: 11 之VH)。該等抗體之實例包括（但不限於）··（i)Fab，其包含 有含SEQ ID NO: 1之輕鏈及含SEQ ID NO: 9之胺基酸1-233(或SEQ ID NO: 9)之Fd鏈；及（ii)全長抗體分子，其包 含有含SEQ ID NO: 26之輕鏈及含SEQ ID NO: 25之重鏈。 基於對應於SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 41之區域（且 在選定實施例中，對應於SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 42 之區域）的肽或肽模擬物應藉由阻止PCSK9與LDLR相互作 用而具有拮抗特性。重要地，包含SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 42之肽應產生能夠抑制PCSK9與LDLR結合及/或抑 制PCSK9内在化至細胞中之中和抗體。 在特定實施例中，本文所涵蓋之肽包含SEQ ID NO: 39 或SEQ ID NO: 41。在選定實施例中，肽包含SEQ ID NO: 37且少於50個胺基酸。在特定實施例中，肽包含SEQ ID NO: 37與SEQ ID NO: 42兩者且為40個胺基酸或少於40個 胺基酸。在更特定實施例中，肽包含SEQ ID NO: 37且少 於40個胺基酸，少於30個胺基酸，少於20個胺基酸或少於 10個胺基酸。 可利用如上所述競爭檢定進行本發明之肽的篩檢。若所 測試肽與1D05抗體分子（亦即對PCSK9具選擇性之任何抗 體分子，其包含有含SEQ ID NO: 27之VL及含SEQ ID NO: 11之VH)競爭（由該1D05抗體分子之結合降低所示），則有 可能該肽與1D05結合相同或密切相關之抗原決定基。確定 137316.doc -30- 200938552 肽是否具有1D05抗體分子之特異性的另一種方式為將 1D05抗體分子與通常具反應性之PCSK9—起預先培育，且 接著添加顯示對於PCSK9之特異性的所測試肽以確定該肽 結合PCSK9之能力是否受到抑制。若所測試肽受到抑制， 則極有可能其具有與1D05抗體分子相同或功能等效之抗原 '決定基及特異性。 '使用如本說明書通篇所述及一般熟習此項技術者熟知之 常規程序，接著可藉由確定肽是否阻斷PCSK9與LDL受體 m 結合及/或阻止PCSK9内在化至細胞中來確定結合PCSK9之 肽是否有用。 可使用合適技術達成本申請案中所述之任何PCSK9特異 性拮抗劑之表現及選擇，該等技術包括（但不限於）噬菌體 呈現（參見，例如國際申請案第WO 92/01047號，Kay等 人，1996 Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press)、酵母呈 ❾ 現、細菌呈現、T7呈現及核糖體呈現（參見，例如Lowe及
Jermutus, 2004 Cwrr. P/iarm. 517-527)。 形成本發明之部分的特定PCSK9特異性拮抗劑為抗體分 - 子或抗體。如本文所述之”抗體分子”或”抗體"係指選擇性 結合人類及/或鼠類PCSK9之免疫球蛋白衍生之結構，其包 括（但不限於）全長或全抗體、抗原結合片段（實際上或概念 上衍生自抗體結構之片段）、上述任何物質之衍生物、上 述任何物質與另一多肽之融合物或為了選擇性結合PCSK9/ 抑制PCSK9之功能之目的而併有上述任何物質之任何替代 137316.doc -31 - 200938552 結構/組合物。 ”全”抗體或"全長”抗體係指包含由雙硫鍵互連之兩個重 (H)鏈及兩個輕（L)鏈的蛋白質，其包含：（1)對於重鏈而 言，可變區（本文縮寫為”VH”）及包含三個結構域CH1、CH2 及CH3之重鏈恆定區；及（2)對於輕鏈而言，輕鏈可變區（本 文縮寫為"VL”）及包含一個結構域CL之輕鏈恆定區。 抗體片段且更特定言之抗原結合片段為具有抗體可變區 或其鏈段（其視情況包含所揭示之CDR 3結構域（在重鏈及/ 或輕鏈構架區内之重及/或輕CDR 3結構域）中之一或多者） 之分子，該抗體可變區或其鏈段賦予對PCSK9且尤其對人 類及/或鼠類PCSK9之選擇性結合。含有該抗體可變區之抗 體片段包括（但不限於）以下抗體分子：Fab、F(ab')2、Fd、 Fv、scFv、雙特異性抗體分子（包含如本文所揭示之PCSK9 特異性抗體或抗原結合片段與具有不同於該抗體之結合特 異性之第二功能部分（包括（但不限於）另一肽或蛋白質，諸 如抗體或受體配位體）之連接物的抗體分子）、雙特異性單 鏈Fv二聚體、經分離CDR3、微型抗體、’scAb'、dAb片 段、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體及基於蛋 白質支架之人工抗體，該等人工抗體包括（但不限於）ΠΙ型 纖維結合蛋白多肽抗體（參見，例如美國專利第6,703，199 號及國際申請案第WO 02/32925號及第WO 00/34784號）或 細胞色素B ;參見，例如Nygren等人，1997 Cwrr. QpzWow 5/οΛ 7:463-469 ;其揭示内容以引用的方式併入本 文中。抗體部分或結合片段可為天然的，或部分或完整合 137316.doc -32- 200938552 成式產生。該等抗體部分可藉由熟習此項技術者已知之各 種方法製備，該等方法包括（但不限於）習知技術，諸如木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。 如本文關於抗體分子、一般而言PCSK9特異性拮抗劑、 編碼核酸或其他物質所用之術語”經分離"描述一種有關於 所揭示之PCSK9特異性拮抗劑、核酸或其他物質之特性， ' 該特性使得上述各物質不同於自然界中所發現之彼物質。 該差異可為（例如）上述各物質與自然界中所發現之彼物質 相比具有不同純度，或上述各物質與自然界中所發現之彼 物質相比具有不同結構或形成不同結構之部分。並非自然 界中發現之結構包括（例如）重組人類免疫球蛋白結構，其 包括（但不限於）具有最佳化CDR之重組人類免疫球蛋白結 構。並非自然界中發現之結構的其他實例為大體上不含其 他細胞物質之PCSK9特異性拮抗劑或核酸。經分離PCSK9 特異性拮抗劑一般不含具有不同蛋白質特異性之其他蛋白 _ 質特異性拮抗劑（亦即，對除PCSK9外之物質具有親和 力）。 在一特定態樣中，本發明提供拮抗PCSK9功能之經分離 - PCSK9特異性拮抗劑。在特定實施例中，該等PCSK9特異 , 性拮抗劑藉由干擾PCSK9與LDL受體之結合及由此引起的 PCSK9細胞内在化而抑制人類及/或鼠類PCSK9之細胞LDL 吸收拮抗作用。因此，所揭示之PCSK9特異性拮抗劑形成 降低血漿LDL-膽固醇含量之所需分子；參見，例如Cohen 等人，2005 TVai. 37:161-165(其中在等位基因 137316.doc -33- 200938552 PCSK9中雜合無意義突變之個體中注意到顯著較低之血漿 LDL 膽固醇含量）；Rashid 等人 2005 尸 roc. iWzi/. dcai/. t/M 102:5374-5379(其中PCSK9-基因剔除小鼠證明肝細胞 .中數量增加之LDLR、加速之血漿LDL清除及顯著較低之 血聚膽固醇含量）；及Cohen等人，2006见五叹/. ·/· Med. 3 54:1264-1272(其中雜合突變（喪失功能）PCSK9之人類呈現 發生動脈粥樣硬化心臟病之長期風險顯著降低）。 經由重複實驗，如本文所揭示之1D05抗體分子劑量依賴 性抑制人類及/或鼠類PCSK9對於LDL吸收之作用。因此’ 在特定實施例中，本發明涵蓋PCSK9特異性拮抗劑，且在 更特定實施例中，涵蓋抗體分子，其包含有含於此等1D05 抗體分子内之重鏈及/或輕鏈可變區（分別為SEQ ID NO: 11 及27)或重鏈及/或輕鏈（例如分別為SEQ ID NO: 9之胺基酸 1-233(或 SEQ ID NO: 9)及 SEQ ID NO: 1，或分別為 SEQ ID NO: 25及26)，以及其等效物（其特徵為具有一或多個不使 1D05之PCSK9選擇特性退化之保守性胺基酸取代）或同系 物。特定實施例包含經分離PCSK9特異性拮抗劑’該等 PCSK9特異性拮抗劑包含本文所揭示之CDR結構域或本文 所揭示之重鏈及/或輕鏈CDR結構域組或特徵為具有一或 多個保守性胺基酸取代之其等效物。 本文使用術語"結構域”或"區”簡單地係指抗體分子中將 存在所論述之序列或鏈段或在替代情況下當前已存在所論 述之序列或鏈段之各別部分。 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性拮抗 137316.doc -34- 200938552 劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子其包含有含 SEQ ID NO: 11之重鏈可變區；特徵為具有一或多個保守 性胺基酸取代之其等效物及其同系物。所揭示之拮抗劑應 抵消或抑制人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制 • 作用。在特定實施例中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同 系物，其特徵為在重鏈可變區上與3£() ID N〇: u至少9〇% 致’抑制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞 ❿ LDL吸收抑制的該等拮抗劑。 在特疋實施例中，本發明提供經分離pcs.K9特異性拮抗 劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含有含 SEQ ID NO: 27之輕鏈可變區；特徵為具有一或多個保守 性胺基酸取代之其等效物及其同系物。所揭示之拮抗劑應 抵消或抑制人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制 作用。在特定實施例中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同 系物’其特徵為在輕鏈可變區上與SEQ ID NO: 27至少90% _ 致’抑制至少10%之人類及/或鼠類pcsK9依賴性細胞 LDL吸收抑制的該等拮抗劑。 在特定實施例中’本發明提供經分離pcsK9特異性抗體 刀子，其包含有含SEQ ID NO: 11之重鏈可變區及含SEQ ， ID NO: 27之輕鏈可變區；或特徵為在指定序列中具有一 或夕個保寸性胺基酸取代之其等效物。特定實施例為抑制 至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制 作用之β玄等拮抗劑。在特定實施例中，本發明提供所揭示 之括抗劑的同系物’其特徵為在重鏈及輕鏈可變區上分別 137316.doc -35- 200938552 與SEQ ID NO: 11及27至少90%—致；抑制至少10%之人類 及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制的該等拮抗劑。 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性拮抗 劑，且在更特定實施例中，提供PCSK9抗體分子，其包含 可變重CDR3序列SEQ ID NO: 17 ;及特徵為具有一或多個 保守性胺基酸取代之其等效物；其特定實施例抑制至少 10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作 用。特定實施例提供經分離拮抗劑，其另外在重鏈可變區 中包含分別包含SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 15之 CDR1及/或CDR2序列；或特徵為在任何一或多個CDR序列 中具有一或多個保守性胺基酸取代之其等效物。在特定實 施例中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同系物，其特徵為 視情況在CDR3序列上與SEQ ID NO: 17或在CDR1、CDR2 及CDR3序列各者内分別與SEQ ID NO: 13、15及17至少 90%—致；抑制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細 胞LDL吸收抑制的該等拮抗劑。 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性拮抗 劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含有含 SEQ ID NO: 7之可變輕CDR3序列；及特徵為具有一或多 個保守性胺基酸取代之其等效物；其特定實施例抑制至少 10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作 用。特定實施例提供經分離拮抗劑，其另外在輕鏈可變區 中包含分別包含SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 5之CDR1 及/或CDR2序列；或特徵為在任何一或多個CDR序列中具 137316.doc •36- 200938552 有一或多個保守性胺基酸取代之其等效物。在特定實施例 中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同系物，其特徵為視情 況在CDR3序列上與SEQ ID NO: 7或在CDR1、CDR2及 CDR3序列各者内分別與SEQ ID NO: 3、5及7至少90% — 致；抑制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL 吸收抑制的該等拮抗劑。 • 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性拮抗 劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含分別包 含SEQ ID NO: 17及7之重鏈可變區CDR3序列及輕鏈可變 區CDR3序列；及特徵為在任何一或多個CDR3序列中具有 一或多個保守性胺基酸取代之其等效物；其特定實施例抑 制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑 制作用。在特定實施例中，本發明提供所揭示之拮抗劑的 同系物，其特徵為在重鏈及輕鏈可變區CDR3序列上分別 與SEQ ID NO: 17及7至少90%—致；抑制至少10%之人類 φ 及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制的該等拮抗劑。 特定實施例提供經分離PCSK9特異性拮抗劑，且在更特 定實施例中，提供抗體分子，其包含分別包含SEQ ID NO: - 13、15、17、3、5及 7之重鏈可變區 CDR1、CDR2 及 CDR3 , 序列及輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列；及特徵為 在任何一或多個CDR序列中具有一或多個保守性胺基酸取 代之其等效物；其特定實施例抑制至少10%之人類及/或鼠 類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作用。在特定實施例 中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同系物，其特徵為在重 137316.doc -37- 200938552 鏈及輕鏈可變區CDRl、CDR2及CDR3序列上分別與SEQ ID NO: 13、15、17、3、5及7至少90%—致；抑制至少 10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制的該 等拮抗劑。 熟習此項技術者將瞭解保守性胺基酸取代為用賦予類似 或較佳（對於預期目的而言）功能及/或化學特徵之胺基酸殘 基置換胺基酸殘基之取代。可使用此項技術中可用或本文 所述之功能檢定測試帶有該等保守性胺基酸取代之拮抗劑 的保留或較佳活性。具有一或多個保守性胺基酸取代並保 留以與如本文所述之1D05抗體分子相同或優於如本文所述 之1D05抗體分子之程度選擇性結合人類PCSK9及拮抗 PCSK9功能之能力的PCSK9特異性拮抗劑在本文中稱為所 揭示拮抗劑的”功能等效物"且形成本發明之特定實施例。 保守性胺基酸取代通常為其中胺基酸殘基經具有類似側鍵 之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側 鍵之fe基酸殘基豕知。此寺豕族包括具有驗性側鏈之胺基 酸（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、具有酸性側鏈之胺 基酸（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、具有不帶電極性側鏈之 胺基酸（例如，甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺 酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、具有非極性 側鏈之胺基酸（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺 酸、脯胺酸、苯丙胺酸、曱硫胺酸）、具有β_分支鏈側鍵之 胺基酸（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）及具有芳族側 鏈之胺基酸（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺 137316.doc -38- 200938552 酸）。該等修飾並非經設計以顯著降低或改變PCSK9特異 性拮抗劑之結合或功能抑制特徵，雖然其可改良該等特 性。產生取代之目的並不顯著且可包括（但決不限於）用能 夠維持或增強分子結構、分子之電荷或疏水性或分子之尺 寸的較佳殘基置換殘基。舉例而言，可能需要簡單地用具 有相同極性或電荷之殘基取代較不需要之殘基。可藉由此 項技術中已知之諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發 之標準技術引入該等修飾。熟習此項技術者達成保守性胺 基酸取代之一種特定方法為如以下文獻中所述之丙胺酸掃 描突變誘發：例如，MacLennan等人，1998 Jciiz Scand. Suppl. 643:5 5-67^1 Sasaki ^ A 5 1998 Adv. Biophys. 35:1-24。在另一態樣中，本發明提供經分離PCSK9特異性 拮抗劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含有 含與所揭示抗體之相應胺基酸序列同源之胺基酸序列的重 鏈及/或輕鏈可變區，其中該等抗體分子抑制PCSK9依賴性 細胞LDL吸收抑制作用。特定實施例為包含分別與所揭示 之重鏈及/或輕鏈可變區至少90%—致的重鏈及/或輕鏈可 變區之拮抗劑。提及”至少90% —致"包括沿本文所揭示分 子的全長至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%及 100%—致之序列。 通常產生具有與本文所述拮抗劑之胺基酸序列同源之胺 基酸序列的PCSK9特異性拮抗劑以改良該拮抗劑之一或多 種特性而不會對其對於PCSK9之特異性有負面影響。獲得 該等序列之一種方法（並非熟習此項技術者可用之唯一方 137316.doc -39- 200938552 法）為使編碼PCSK9特異性拮抗劑或其特異性決定區之序 列突變，表現包含突變序列之拮抗劑且使用可用功能檢定 (包括本文所述之彼等檢定）測試經編碼拮抗劑之保留功 能。突變可為經由定點突變誘發或無規突變誘發。然而， 熟習此項技術者將瞭解，突變誘發之其他方法可易於引起 相同效果。舉例而言，在某些方法中，突變體之範圍受到 基於胺基酸化學或結構特徵之非隨機靶向保守性取代或受 到蛋白質結構因素的約束。在親和力成熟實驗中，可在單 一所選分子中發現若干種該等突變，不論其經隨機選擇抑 或非隨機選擇。如（例如）美國專利第7，117,096號、？<：1'公 開案第WO 02/084277號及第WO 03/099999號中所表明， 對於親和力成熟亦存在各種基於結構之方法；該等文獻之 揭示内容以引用的方式併入本文中。 如本文所用之兩個胺基酸或核酸序列之間的同源性百分 比等於兩個序列之間的一致性百分比，且在全文中此兩個 術語可互換使用。使用Karlin及Altschul之演算法測定如本 文所用之兩個核酸或胺基酸序列之一致性百分比（Pr〇c. Natl. Acad. Sci· USA 90:5873-5 877，1993)。將該演算法併 入 Altschul 等人，1990 J. Mol. Biol. 215:403-410 之 NBLAST及XBLAST程式中。用NBLAST程式，分值= 100, 字長=12實施BLAST核苷酸搜尋以獲得與本發明之核酸分 子同源的核酸序列。用XBLAST程式，分值=50，字長=3 實施BLAST蛋白質搜尋以獲得與本文所揭示胺基酸序列同 源的胺基酸序列。為獲得空位比對以達成比較目的，如 137316.doc -40- 200938552
Altschul 等人，1997 Jc/A 及以.25:3389-3402 中所 述使用 Gapped BLAST。當利用 BLAST 及 Gapped BLAST 程 式時，使用各別程式之預設參數（例如，XBLAST及 NBLAST)。 利用一或多種所揭示之PCSK9特異性分子之組份以產生 具有類似或較佳特異性之其他結合分子完全處於熟習此項 ‘ 技術者之技能範圍内。此可（例如）使用重組DNA技術之技 術實現。此技術之一特定實例涉及將編碼抗體之免疫球蛋 ❿ 白可變區或一或多個CDR之DN A視情況引入不同免疫球蛋 白之可變區、恆定區或恆定區加構架區中。該等分子形成 本發明之重要態樣。特定免疫球蛋白或相應序列（特定所 揭示序列可插入其中或在替代情況下形成其基本部分）包 括（但不限於）形成本發明之特定實施例的以下抗體分子： Fab(具有可變輕鏈（VL)、可變重鏈（VH)、恆定輕鏈（CL)及 恆定重鏈1(CH1)結構域之單價片段）、F(ab’)2(包含由雙硫 @ 橋連接或另外在鉸鏈區連接之兩個Fab片段之二價片段）、
Fd(VH及CH1結構域）、Fv(VL及VH結構域）、scFv(VL及 VH由例如肽連接子之連接子連接的單鏈Fv，參見，例如 . Bird等人，1988 Science 242:423-426，Huston等人，1988 , 尸见45 t/M 85:5879-5883)、雙特異性抗體分子（包含如本文 所揭示之PCSK9特異性抗體或抗原結合片段與具有不同 於該抗體之結合特異性之第二功能部分（包括（但不限於） 另一肽或蛋白質，諸如抗體或受體配位體）之連接物的抗 體分子）、雙特異性單鏈Fv二聚體（參見，例如PCT/ 137316.doc •41 - 200938552 US92/09965)、經分離CDR3、微型抗體（自組裝至約80 kDa 之二價二聚體中之單鏈CH3融合物）、’scAb'(含有VH及VL 以及CL或CH1之抗體片段）、dAb片段（VH結構域，參見， 例如 Ward 等人，1989 341:544-546，及 McCafferty 等人，1990 Λ/Wwre 348:552-554 ;或 VL結構域，Holt 等 人，2003 SioiecAwo/ogy 21:484-489)、雙鍵抗體 (參見，例如Holliger等人，1993 尸见45 90:6444-6448 及國際申請案第WO 94/13804號）、三鏈抗體、四鏈抗體、 微型抗體（與CH3接合之scFv ;參見，例如Hu等人，1996 Cancer Res. 56:3055-3061) ' IgG ' IgGl ' IgG2 ' IgG3 ' IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或其任何衍生物及基於蛋白 質支架之人工抗體，該等人工抗體包括（但不限於）ΠΙ型纖 維結合蛋白多肽抗體（參見，例如美國專利第6,703,199號 及國際申請案第WO 02/32925號）或細胞色素Β ;參見，例 如 Koide 等人，1998 ·/. Mo/α.价〇/. 284:1141-1151 及 Nygren等人，1997 Current Opinion in Structural Biology 7:463-469 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。某些抗 體分子（包括（但不限於）Fv、scFv、雙鏈抗體分子或結構域 抗體（Domantis))可藉由併有雙硫橋來連接VH及VL結構域 而穩定，參見，例如 Reiter 等人，1996 iVaiMre 14:1239-1245 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。可 使用習知技術（參見，例如Holliger及Winter’ 1993 4:446-449，其特定方法包括化學上或 自雜合融合瘤產生）及其他技術產生雙特異性抗體，該等 137316.doc -42- 200938552 其他技術包括（但不限於）BiTE™技術（具有具不同特異性之 抗原結合區及狀連接子的分子）及杵入臼工程化（kn〇bs_ into-holes engineering)(參見，例如Ridgeway等人，η% «五《g. 9··616-621 ;其揭示内容以引用的方式併入本 文中）。雙特異性雙鏈抗體可在大腸桿菌（五c〇⑺中產生， 且如熟習此項技術者所暸解，如同其他PCSK9特異性拮抗 劑，此等分子可使用噬菌體呈現在適當庫中選擇（參見，
例如國際申請案第WO 94/13804號；其揭示内容以引用的 方式併入本文中）。
插有所關注之CDR的可變結構域可自任何生殖系或重排 人類可變結構域獲得。可變結構域亦可以合成方式產生。 可使用重組DNA技術將CDR區引入各別可變結構域中。可 用以達成此舉之一種方法描述於Marks等人，KM 出1〇:779-783中；其揭示内容以引用的方式 併入本文_。可變重結構域可與可變輕結構域配對以提^ 抗原結合位點。此外，獨立區（例如，單獨可變重結構域） 可用以結合抗原。熟習此項技術者亦熟知Fv片段之兩個結 構域（VL及VH)儘管可能由獨立基因編碼但仍可使用重組 方法由使該等結構域能夠製成單一蛋白質鏈之合成連接子 接合，其中VL及VH區配對以形成單價分子（scFv)。 特定實施例在生殖系構架區中提供CDR。構架區(包括 (但不限於)人類構架區)為熟習此項技術者所知(例如，人 類或非人類構架）°該等構架區可天然存在或為-致構架 區。在-態樣中，本發明之抗體的構架區為人類構架區 137316.doc -43· 200938552 (關於人類構架區之清單，參見例如Clothia等人，1998 «/. Mo/. 278:457-479 ;該揭示内容以全文引用的方式併 入本文中）。本文中特定實施例提供重鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 17至VH1A_3中替代相關CDR。本文中特定實施例 提供重鏈可變CDR1、CDR2及/或CDR3序列（分別為SEQ ID NO: 13、15及17)至VH1A_3中替代相關CDR。本文中特定 實施例提供輕鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 7至VK1_4中替代 相關CDR。本文中特定實施例提供輕鏈可變CDR1、CDR2 及/或CDR3序列（分別為SEQ ID NO: 3、5及7)至VK1—4中 替代相關CDR。特定實施例進一步提供重鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 17及輕鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 7分別至 VH1A_3及VK1_4生殖系序列中。其他實施例提供重鏈可 變 CDR1、CDR2及 / 或 CDR3序列（分別為 SEQ ID NO: 13、 15及17)至VH1A_3中替代相關CDR ;及輕鏈可變CDR1、 CDR2及/或CDR3序列（分別為SEQ ID NO: 3、5及7)至 VK1_4中替代相關CDR。 本發明涵蓋人類、人源化、去免疫型、嵌合及靈長源化 分子抗體。本發明亦涵蓋藉由鑲飾方法產生之抗體分子； 參見，例如 Mark 等人，1994 Handbook of Experimental Pharmacology，第 113卷：The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer Ver lag’ 第 105-134頁；其揭示内容以 引用的方式併入本文中。關於所揭示抗體分子之''人類"特 定係指具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及/ 或恆定區的抗體分子，其中該等序列可（但非必須）經修飾/ 137316.doc 200938552 改變以具有某些胺基酸取代或並非由人類生殖系免疫球蛋 白序列編碼之殘基。可藉由包括（但不限於）活體外隨機或 定點突變誘發之方法或藉由活體内體細胞突變引入該等突 變。文獻中所述之突變技術之特定實例為Gram等人，1992 t/M 89:3576-3580 ; Barbas等人，1994 尸见 91:3809-3813及 Schier等人 1996 /· Μσ/.价〇/. 263:551-567 中所揭不之突變技術；其揭示内容以引用的方式併入本文 〇 中。此等突變技術僅為特定實例且並不表示唯一可用技 術。在科學文獻中存在熟習此項技術者可用且廣泛瞭解之 許多犬變技術。關於所揭示抗體分子的„人源化"特定係指 來源於另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之CDR序列經移植至 人類構架序列上之抗體分子。關於所揭示抗體分子的"靈 長源化"係指非靈長類動物之CDR序列經插入靈長類動物 構架序列中之抗體分子，參見，例如w〇 93/〇21〇8及w〇 99/55369 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。 Φ 本發明之特定抗體為單株抗體，且在特定實施例中呈以 下抗體形式中之-者：IgD、IgA、IgE、⑽、卿、
IgG2、IgG3、IgG4或上述任何抗體形式之任何衍生物。在 .此情況下，語言”其衍生物"或”衍生物”尤其包括⑴在一個 或兩個可變區（亦即，VH及/或VL)中具有保守性修飾之抗 體及抗體分子，（ii)在重鏈及/或輕鏈之恆定區中具有變動 之抗體及抗體分子，及/或（Hi)含有通常不為免疫球蛋白分
子之部分的額外化學部分之抗體及抗體分子（例如，= 二醇化）。 A J373l6.doc •45- 200938552 可變區之變動可在一或多個VH及/或VL CDR區域範圍 内。可使用定點突變誘發、隨機突變誘發或用於產生序列 或分子多樣性之其他方法以產生突變體，隨後可以可用活 體外或活體内檢定（包括本文所述之彼等檢定）測試該等突 變體之所關注之特定功能特性。 本發明之抗體亦包括已對VH及/或VL内之構架殘基進行 U飾以改良所關注之抗體的一或多種特性之彼等抗體。通 常，進行該等構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而 S，一種方法為使一或多個構架殘基,,回復突變"至相應生 殖系序列。更特定言之，經歷體細胞突變之抗體可含有不 同於產生抗體之生殖系序列的構架殘基。該等殘基可藉由 將抗體構架序列與產生抗體之生殖系序列比較而鑑別。該 等回復突變’’之杬體亦意欲為本發明所涵蓋。另一類構架 修飾涉及使構架區内或甚至一或多個CDR區域内之一或多 個殘基突變以移除τ細胞抗原決定基藉此降低抗體之潛在 免疫原性。此方法亦稱為”去免疫化，，且進一步詳細描述於 Carr等人之美國專利公開案第2〇〇3〇153〇43號中；其揭示 内容以引用的方式併入本文中。 除在構架或CDR區内進行修飾之外或其他，本發明之抗 體可經設計以包括Fc或恆定區内之修飾，（當存在時）該等 修飾通常改變抗體之—或多種功能特性，諸如血清半衰 期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。 產生包含多種抗體同型以便達成所要效應功能性之，，雜 合或"組合"IgG形式之概念已得以一般性描述；參見，例 137316.doc -46· 200938552 如Tao等人，l99 乂 五印.MW. 173:1025-1028。本發明之 特定實施例涵蓋右 _ Fc區具有特定變動之抗體分子，已發現 該等變動使得診> 少。因此，本發 ^抗粗部分上與FWR受體或Clq之結合減 明涵蓋不引起（或在較低程度上引起）抗體 依賴性細胞毒性r” 、、 (ADCC")、補體介導之細胞毒性（"cmc”）
或形成免疫複合物，同時保留正常藥物動力學m")特性 的付口本發明描述之抗體。纟發明之特定實施例提供一種 如本發明所定義之抗體分子，其包含SEQ ID NO: 24作為 其免疫球蛋白結構之部分’且在特定實施例中，包含 ID NO: 24之殘基107-326作為免疫球蛋白結構之部分。本 發明涵蓋包含以下各者之抗體分子：（i)包含SEQ ID NO: 1 之輕鏈，及（ii)包含SEQ ID NO: 11之重鏈，其緊接（鄰接） 或繼之以一系列選自由以下胺基酸組成之群的胺基酸： SEQ ID NO: 21(IgGl)、SEQ ID NO: 22(IgG2)、SEQ ID NO: 23(IgG4)及SEQ ID NO: 24(IgG2m4)。圖 6說明包含 SEQ ID NO: 24 之序列（尤其 IgG2m4)與 IgGl IgG2 及 IgG4 之 比較。可發現成熟分泌型抗PCSK9 IgG2m4重鏈及輕鏈之 胺基酸序列分別為SEQ ID NO: 25及26。本文涵蓋至少部 分由該序列編碼之抗體分子。 特定PCSK9特異性拮抗劑可帶有可偵測標記物或可與毒 素（例如，細胞毒素）、放射性同位素、放射性核素、脂質 體、靶向部分、生物感應器、陽離子尾端或酶（例如，經 由肽鍵或連接子）結合。該等PCSK9特異性拮抗劑組合物 形成本發明之額外態樣。 137316.doc -47- 200938552 在另一態樣中，本發明提供編碼所揭示之pcsK9_特異 性括抗劑之經分離核酸。如先前所提及之"經分離"係指有 關於物質之特性’該特性使該等物質不同於在自然界中所 發現之彼物質。該差異可為（例如）該等物質與自然界中所 發現之彼物質相比具有不同純度，或該等物f與自然界中 所發現之彼物質相比具有不同結構或形成不同結構之部 分。並非自然界中發現之核酸的實例為（例如）大體上不含 其他細胞物質之核酸。核酸可存在於完整細胞、細胞溶解 產物中或以部分純化或大體上純之形式存在。在特定情況 下，當（例如）使用包括（但不限於）鹼性/SDS處理、CsC丨分 帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中已知之其他 合適方法的標準技術純化而純化遠離其他細胞組份或其他 /亏染物（例如，其他細胞核酸或蛋白質）時核酸可經分離。 核酸可包括DNA(包括cDNA在内）及/4RNA。可使用標準 为子生物學技術獲得本發明之核酸。對於由融合瘤（例 如，由可有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠製備之融 合瘤）表現之抗體而言，編碼由融合瘤製備之抗體的輕鏈 及重鏈之cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲 得。對於獲自免疫球蛋白基因庫之抗體（例如，使用噬菌 體呈現技術）而言，可自庫回收編碼抗體之核酸。 本發明涵蓋編碼所揭示之可變重鍵及/或輕鏈及其選定 組份，尤其所揭示之可變或各別CDR區且尤其cDR3的經 分離核酸。在本文之特定實施例中，提供於抗體構 架區内’且在特定實施例中，提供於人類構架區内。特定 137316.doc -48- 200938552 實施例提供編碼CDR之經分離核酸至生殖系構架區（包括 (但不限於）人類生殖系構架區）中。本文中特定實施例提供 編碼重鏈CDR SEQ ID NO: 17之經分離核酸（在特定實施例 中，其中之該核酸包含SEQ ID NO: 18)至VH1A_3中替代 編碼相關CDR之核酸。本文中特定實施例提供編碼重鏈可 變 CDR1、CDR2 及 / 或 CDR3 序列 SEQ ID NO: 13、15 及 ’ 17(分別）之核酸（且，在特定實施例中，其中之該核酸分別
包含SEQ ID NO: 14、16及18)至VH1A_3中替代相關 CDR。本文中特定實施例提供編碼輕鏈CDR SEQ ID NO: 7 之經分離核酸（在特定實施例中，其中之該核酸包含SEQ ID NO: 8)至VK1_4中替代編碼相關CDR之核酸。本文中特 定實施例提供編碼輕鏈可變CDR1、CDR2及/或CDR3序列 SEQ ID NO: 3、5及7(分別）之核酸（且，在特定實施例中， 其中之該核酸分別包含SEQ ID NO: 4、6及8)至VK1_4中替 代相關CDR。特定實施例進一步提供重鏈可變CDR3 SEQ φ ID NO: 17(且，在特定實施例中，其中之該核酸包含SEQ ID NO: 18)及輕鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 7(且’在特定實 施例中，其中之該核酸包含SEQ ID NO: 8)分別至VH1A_3 . 及VK1_4生殖系序列中。其他實施例提供重鏈可變
CDR1、CDR2及 /或 CDR3序列 SEQ ID NO: 13、15及 17(分 別）（且，在特定實施例中，其中之該核酸分別包含SEQ ID NO: 14、16及18)至VH1A_3中替代相關CDR;及輕鏈可變 CDR1、CDR2 及 / 或 CDR3 序列 SEQ ID NO: 3、5 及 7(分 別）（且，在特定實施例中，其中之該核酸分別包含SEQ ID 137316.doc -49- 200938552 NO: 4、6及8)至VK1_4中替代相關CDR。 可在任何所要抗體分子形式内提供編碼可變區之經分離 核酸，該抗體分子形式包括（但不限於）以下各者： F(ab’）2、Fab、Fd、Fv、scFv、雙特異性抗體分子（包含如 本文所揭示之PCSK9特異性抗體或抗原結合片段與具有不 同於該抗體之結合特異性之第二功能部分（包括（但不限於） 另一肽或蛋白質，諸如抗體或受體配位體）之連接物的抗 體分子）、雙特異性單鏈Fv二聚體、微型抗體、dAb片段、 雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、IgG、 IgGl、IgG2，IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或其任 何衍生物。 特定實施例提供編碼PCSK9特異性拮抗劑，且在更特定 實施例中，編碼抗體分子之經分離核酸，該等PCSK9特異 性拮抗劑及抗體分子包含有含SEQ ID NO: 11之重鏈可變 結構域；其特定實施例包含核酸序列SEQ ID NO: 12。本 發明之特定實施例提供編碼PCSK9特異性拮抗劑，且在更 特定實施例中，編碼抗體分子之經分離核酸，其另外包 含：⑴編碼重鏈CDR1胺基酸序列SEQ ID NO·· 13之核酸 (其特定實施例包含核酸SEQ ID NO·· 14)及/或（ii)編碼重鏈 CDR2胺基酸序列SEQ ID NO: 15之核酸（其特定實施例包含 核酸SEQ ID NO: 16)。特定實施例提供編碼PCSK9特異性 拮抗劑，且在更特定實施例中，編碼抗體分子之經分離核 酸，該等PCSK9特異性拮抗劑及抗體分子包含有含SEQ ID NO: 27之輕鏈可變結構域；其特定實施例包含核酸序列 137316.doc -50- 200938552 SEQ ID NO: 28。本發明之特定實施例提供編碼1>(：队9特 異性拮抗劑’且在更特定實施例中，編碼抗體分子之經分 離核酸，其另外包含.⑴編蝎輕鏈CDR1胺基酸序列seq ID NO: 3之核酸（其特定實施例包含核酸SEq m N〇: 4)及/ 或（ii)編碼輕鍵CDR2胺基酸序列seq ID N〇: 5之核酸（其特 定實施例包含核酸SEQ ID NO: 6)。特定實施例提供編碼 PCSK9特異性拮抗劑，且在更特定實施例中，編碼抗體分 子之經分離核酸，該等PCSK9特異性拮抗劑及抗體分子包 含有含SEQ ID NO: 11之重鏈可變結構域；其特定實施例 包含核酸序列SEQ ID NO: 12 ;及含seq id NO: 27之輕鏈 可變結構域；其特異性實施例包含核酸序列SEq ID NO: 28。特定實施例提供編碼以下各者之經分離核酸：（i)重鏈 CDR1、CDR2及 /或 CDR3序列（分別為 SEQ m N〇: 13、15 及17 ;其特定實施例分別包含核酸SEQ ID NO: 14、16及/ 或18)，較佳在構架區（包括（但不限於）人類構架區）中；及 (ii)輕鏈 CDR1、CDR2及 /或 CDR3 序列（分別為 SEQ ID NO·· 3、5及7 ;其特定實施例分別包含核酸SEQ ID NO: 4、6及/ 或8) ’較佳在構架區（包括（但不限於）人類構架區）中。本 發明在特定實施例中進一步提供以上所揭示之拮抗劑之同 系物’其特徵為視情況在重鏈及/或輕鏈可變區或CDR區 上（不論何者出現）與1D05之相應序列至少90。/〇一致。 其他實施例提供編碼PCSK9特異性拮抗劑，且在更特定 實施例中，編碼抗體分子之經分離核酸，該等PCSK9特異 性拮抗劑及抗體分子包含有含SEQ ID NO: 1之輕鏈（其4寺 1373I6.doc -51 - 200938552 定實施例包含核酸SEQ ID NO: 2)及含SEQ ID NO: 9之胺基 酸1-233或SEQ ID NO: 9之重鏈或Fd鏈（其特定實施例分別 包含 SEQ ID NO: 10之核酸 1-699 或 SEQ ID NO: 10)。其他 實施例提供編碼PCSK9特異性拮抗劑，且在更特定實施例 中’編碼抗體分子之經分離核酸，該等PCSK9特異性拮抗 劑及抗體分子包含有含SEQ ID NO: 26之輕鏈（其特定實施 ’ 例包含SEQ ID NO: 30)及含SEQ ID NO: 25之重鏈（其特定 實施例包含SEQ ID NO: 29)。在特定實施例中，本發明進 一步提供以上所揭示之拮抗劑的同系物，其特徵為在重鏈 ® 及/或輕鏈上與1D05之相應序列至少90%—致。 本發明之特定實施例涵蓋編碼在Fc區具有變動之抗體分 子的核酸，該等變動使得該抗體部分上與FcYR受體或ciq 之結合減少。本發明之一特定實施例為編碼抗體分子之經 分離核酸，該等抗體分子包含SEQ ID NO: 24作為其免疫 球蛋白結構之部分，且在特定實施例中，包含SEQ ID NO: 24之殘基107-326作為其免疫球蛋白結構之部分。在特定 實施例中，合成PCSK9特異性拮抗劑可藉由自在合適表現 v 載體内合成及組裝之寡聚核苷酸所產生之核酸表現而產 生；參見’例如Knappick等人，2000 «/. Μο/.仍〇/. 296:57-86及 Krebs等人，2001 J. /w所Mei/zoA 254:67-84。 本發明涵蓋編碼抗體分子之核酸，其包含：（i)編碼包含 SEQ ID NO: 1之輕鏈的核酸（其特定實施例包含核酸SEq ID NO: 2)，及（ii)編碼包含SEQ ID NO: 11之重鏈的核酸 (其特定實施例包含核酸SEQ ID NO: 12)，其依次繼之以 137316.doc -52- 200938552 (鄰接）編碼選自由以下胺基酸組成之群的一組胺基酸之一 組核苷酸：SEQ ID NO: 21(IgGl)、SEQ ID NO: 22(IgG2) 、SEQ ID NO: 23(IgG4)及 SEQ ID NO: 24(IgG2m4)。可發現成熟分泌型抗PCSK9 IgG2m4重鏈及 輕鏈之核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 29及30。可發現包 含重鏈及輕鏈1D05抗PCSK9 IgG2m4抗體分子之質體序列 分別為SEQ ID NO: 31及32。編碼該等抗體分子之核酸形 成本文之重要實施例。 ❹
本發明亦包括包含與本文所述之全長核苷酸序列至少約 90% —致且更佳至少約95% —致之核苷酸序列的經分離核 酸，且該等核苷酸序列編碼PCSK9特異性拮抗劑，該等 PCSK9特異性拮抗劑抑制至少10%之PCSK9依賴性細胞 LDL吸收抑制作用。 本申請案通篇提及”至少約90% —致”包括至少約90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%—致。 本發明進一步提供經分離核酸，該經分離核酸之至少一 部分在嚴格雜交條件下與由SEQ ID NO: 12及/或SEQ ID NO: 28組成之核酸補體雜交，其中之該核酸賦予抗體分子 以特異性結合PCSK9且拮抗PCSK9功能之能力；及利用該 核酸表現之PCSK9特異性拮抗劑。此項技術中熟知用於使 核酸雜交之方法；參見，例如Ausubel，Cwrrewi Proioco/s in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1989。嚴格雜交條件涉及在68°C下在5xSSC/5x丹哈德溶液 137316.doc -53- 200938552 (Denhardt’s solution)(或等效物）/1.0% SDS中雜交，且在室 溫下在0.2\38(：/0.1%808中洗滌。中等嚴格條件包括在 42°C下在3xSSC中洗滌。可改變鹽濃度及溫度之參數以達 成探針與目標核酸之間的最佳程度之一致性。熟習此項技 術者可利用各種雜交及/或洗滌條件以特定靶向核酸中與 SEQ ID NO: 12 及 / 或 SEQ ID NO: 28 至少 80%、85%、 90%、95%、98%或99%—致之雜交部分。影響雜交條件之 選擇及引導設計合適條件的基本參數由Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y·，第 9章及 第 11 章，1989 及 Au sub el 等人（編），Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.,第 2.10節及第 6.3節-第6.4節，1995(其揭示内容以引用的方式併入本文 中）闡明，且可易於由一般熟習此項技術者確定。具有一 或多個包含在嚴格雜交條件下與由SEQ ID NO: 12及/或 SEQ ID NO: 28組成之核酸補體雜交的核酸之可變區之 PCSK9拮抗劑應有效拮抗PCSK9之一或多種功能。因此， 該等拮抗劑及編碼核酸形成本發明之重要實施例。 在另一態樣中’本發明提供包含本文所揭示之核酸的載 體。本發明之載體包括（但不限於）適於以對於預期目的而 言適當之程度表現所要抗體分子之質體及其他表現構築體 (例如，視情況為噬菌體或噬菌粒）；參見，例如Sambrook 及 Russell ’ Molecular Cloning: A Laboratory Manual :第 3 版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory Press ;其揭示内容以 137316.doc -54· 200938552
列、強化子序列、選擇標記、 終止序列、聚腺苷酸化序 有限數目之有用限制酶位點 及/或視情況之其他序列）及高複本數之可能。用於產生蛋 白質特異性拮抗劑之表現載體的實例在此項技術中熟知； 參見’例如 Persic 等人，1997 187:9-18 ; B〇el 等人， 2000 J. /mmwno/· MeMoA 239:153-166及 Liang等人，2001 ·/. /所则⑽/. 247:119-130 ;其揭示内容以引用的方 式併入本文中。若需要，則可使用此項技術中熟知之技術 將編碼拮抗劑之核酸整合至宿主染色體中；參見，例如 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology^ J〇hn
Wiley & Sons, 1999及Marks等人，國際申請案第w〇 95/175 16號。核酸亦可於保持游離或併入人工染色體中之 質體上表現；參見，例如Csonka等人，2000 /. Ce// •SWewce 113:3207-3216 ; Vanderbyl等人，2002 M〇/ecw/ar 5:10。特別對於抗體分子而言，可將抗體輕鏈基 因及抗體重鏈基因插入獨立載體中或，更通常可將兩個基 因插入同一表現載體中。可使用標準方法將編碼任何 137316.doc -55- 200938552 PCSK9特異性拮抗劑或其組份之核酸插入表現載體中（例 如，核酸片段及載體上之互補限制性位點之連接，或若不 存在限制性位點則鈍端連接）。進行此舉之方式之另一特 定實例係經由使用重組方法，例如Clontech，，InFusion”系 統或Invitrogen "Τ0Ρ0"系統（兩者均為活體外）或經由細胞 内方式（例如Cre-Lox系統）。特別對於抗體分子而言，可使 用輕鏈及重鏈可變區以藉由將其插入所要同型之已編碼重 鏈恆定區及輕鏈恆定區的表現載體中以便使VH鏈段與CH 鏈段在载體内有效連接且VL鏈段與CL鏈段在載體内有效 連接來產生任何抗體同型之全長抗體基因。另外或其他， 包含編碼PCSK9特異性拮抗劑之核酸的重組表現載體可編 碼促進拮抗劑自宿主細胞分泌之信號肽。可將核酸選殖至 載體中以便使編碼信號肽之核酸與編碼PCSK9特異性拮抗 劑之核酸同框相鄰連接。信號肽可為免疫球蛋白或非免疫 球蛋白信號肽。可利用熟習此項技術者可用之任何技術將 核酸引入至宿主細胞中；參見，例如Morrison, 1985 Science, 229:1202。熟知將所關注之核酸分子次選殖至表 現載體中、轉型或轉染含有載體之宿主細胞的方法及製造 大體上純之蛋白質之方法（包含將各別表現載體引入宿主 細胞中及在適當條件下培養該宿主細胞之步驟）。可以習 知方法自宿主細胞收穫由此產生之PCSK9特異性拮抗劑。 適用於將核酸引入所關注之細胞+的技術將視所用細胞之 類型而定。一般技術包括（但不限於）磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質體介導之轉染及使用適合於所關注 137316.doc -56- 200938552 細胞株之病毒（例如，反轉錄病毒、牛痘、桿狀病毒或嗤 菌體）的轉導。 在另一態樣中，本發明提供包含編碼所揭示之PCSK9特 異性括抗劑之核酸的經分離細胞。多種不同細胞株均涵蓋 於本文中且可用於重組產生PCSK9特異性拮抗劑，包括 (但不限於）來自原核生物體（例如，大腸桿菌、芽孢桿菌 (Bacillus)及鏈黴菌（Streptomyces))及來自真核生物（例如， 酵母、桿狀病毒及哺乳動物）之彼等細胞株；參見，例如 Breitling 等人，Recombinant antibodies, John Wiley & Sons，Inc. and Spektrum Akademischer Verlag 1999 ;其揭 示内容以引用的方式併入本文中。亦涵蓋包含本文所揭示 之核酸或拮抗劑之植物細胞（包括轉殖基因植物）及動物細 胞（包括轉殖基因動物（除人類外））作為本發明之部分。包 括（但不限於）以下各者之合適哺乳動物細胞或細胞株形成 本發明之額外實施例：來源於中國倉鼠卵巢之彼等細胞或 細胞株（CHO細胞，包括（但不限於）與（例如）DHFR選擇標 記（例如，如Kaufman及 Sharp，1982 Afo/.仍759:60/-627中所述）一起使用之DHFR-CHO細胞（描述於Urlaub及 Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 中））、NSO骨髓瘤細胞（其中可使用如WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中所述之GS表現系統）、COS細胞、 SP2細胞、海拉細胞（HeLa cell)、幼倉鼠腎細胞、YB2/0大 鼠骨髓瘤細胞、人胚腎細胞、人類胚視網膜細胞及包含本 文所揭示之核酸或拮抗劑之其他細胞或細胞株；先前引用 137316.doc -57- 200938552 之揭不内容以引用的方式併入本文中。包含編碼所揭示之 PCSK9特異性拮抗劑之核酸的本發明之特定實施例包括 (但不限於）大腸才干鲕（參見，例如piUckthun，1991 5ζ·ο/ 沁幻；9:545-55 1)或諸如畢赤酵母（pichia)之酵母及其 重組衍生物（參見，例如Li等人’ 2006 iWu.们 24:210-215);先前揭示内容以引用的方式併入本文中。本 發明之特定實施例係關於包含編碼所揭示之pcSK9特異性 拮抗劑之核酸的真核細胞，參見Chadd及Chamow, 2001
Cwreni h 少 12:188-194，Andersen及
Krummen, 2002 Current Opinion in Biotechnology 13:117 > Larnck及 Thomas，2001 C町以价〇iec/m〇/〇烈 12:411-418 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。本發 明之特定實施例係關於包含編碼所揭示之PC§Κ9特異性括 抗劑之核酸的哺乳動物細胞’其能夠以適當轉課後修舞產 生PCSK9特異性持抗劑。轉譯後修飾包括（但決不限於）雙 硫鍵形成及糖基化。另一類轉譯後修飾為信號肽裂解。本 文中較佳實施例具有適當糖基化；參見，例如γ〇〇等人， 2002 ·/· /w_wo/· 261:1-20 ;其揭示内容以引用的 方式併入本文中。天然存在之抗體含有至少一種與重鏈連 接之N連接碳水化合物。同上。不同類型之哺乳動物宿主 細胞可用以提供有效轉譯後修飾。該等宿主細胞之實例包 括中國倉鼠卵巢（CHO)、海拉細胞、C6、PC12及骨髓瘤細 胞，參見 ’ Yoo等人，2002 /. .仏如a 261:1 — 20 ’及Persic等人，1997 187:9-18 ;其揭示内容以引 137316.doc -58- 200938552 用的方式併入本文中。 在另一態樣中，本發明提供包含本發明之多肽的經分離 細胞。 在另—態樣中，本發明提供一種製造本發明之PCSK9特 異性拮抗劑的方法，該方法包含將包含編碼PCSK9特異性 拮抗劑或對於人類及/或鼠類PCSK9具有特異性之所要 PCSK9特異性拮抗劑之重鏈及/或輕鏈或其片段（例如，VH 及/或VL，或所揭示之重鏈及/或輕鏈可變區CDR中之一或 多者）（由所要拮抗劑決定）之核酸的細胞在允許PCSK9特異 性拮抗劑表現或允許該等重鏈及/或輕鏈或片段表現及組 裝成PCSK9特異性拮抗劑之條件下培育，及自該細胞分離 該PCSK9特異性拮抗劑。產生特定所要重鏈及/或輕鏈序列 或片段之方法之一實例為首先使用PCR擴增（及修飾）生殖 系重鏈及/或輕鏈可變序列或片段。熟習此項技術者可易 於使用人類重及/或輕可變區之生殖系序列，參見，例如 "Vbase”人類生殖系序列資料庫（the "Vbase" human germline sequence database)及 Kabat, E.A.等人，1991
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版， 美國衛生與公眾服務部（U.S. Department of Health and Human Services)，NIH 公開案第 91-3242 號；Tomlinson, I.M.等人，1992 "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798 ;及 Cox J.P.L.等人，1994 "A Directory of Human 137316.doc -59- 200938552
Germ-line Vk Segments Reveals a Strong Bias in their
Usage” */. 24:827-836 ;其揭示内容以引用的 方式併入本文中。可使用標準方法進行生殖系序列之突變 誘發，例如’ PCR介導之突變誘發（其中將突變併入pCR引 子中）或定點突變誘變。若需要全長抗體，則可用人類重 鍵恆疋區基因之序列；參見’例如Kab at. E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological lnterest，赛 5版， 美國衛生與公眾服務部，NIH公開案第91-3242號。可（例 如）藉由標準PCR擴增獲得含有此等區之片段。或者，熟習 此項技術者可利用已編碼重鏈及/或輕鏈怪定區之載體。 存在用以重組產生保留原始抗體之特異性之其他抗體分 子的可用技術。其特定實例為將編碼免疫球蛋白可變區或 CDR之DNA引入另一抗體分子之恆定區，或恆定區及構架 區 或單獨構架區中；參見，例如EP-184,1 87、GB 218863 8及EP-239400;其揭示内容以引用的方式併入本文 中。抗體分子（包括嵌合抗體）之選殖及表現描述於文獻 十；參見，例如EP 〇 120694及EP 0125023 ;其揭示内容以 引用的方式併入本文中。 在一種情況下，可使用已知技術產生本發明之抗體分子 且接著篩檢本文所鑑別之特徵。製備單株抗體之基本技術 描述於文獻中’參見，例如Kohler及Milstein(l 975, Nature 256:495-497);其揭示内容以引用的方式併入本文中。可 藉由可用方法產生完全人類單株抗體。此等方法包括（但 決不限於）使用基因工程小鼠品系，該等小鼠品系具有免 •37316.doc 200938552 疫系統藉此使小鼠抗體基因失活且轉而經功能人類抗體基 因譜置換，同時使小鼠免疫系統之其他組份不改變。該等 基因工程小鼠允許產生高親和力、完全人類單株抗體之天 然活體内免疫反應及親和力成熟過程。此技術在此項技術 中熟知且充分詳細描述於諸多公開案中，該等公開案包括 (但不限於）美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第 5,625,126 號；第 5,633,425 號；第 5,789,650 號；第 5,877,397 號；第 5,661,016 號；第 5,8 14,3 18 號；第 5,874,299 號；第 5,770,249 號（讓渡予 GenPharm International 且可經由 Medarex使用，在"UltraMab Human Antibody Development System"之保護下）；以及美國專利 第 5,939,598 號；第 6,075，181 號；第 6，114,598 號；第 6,150,5 84號及相關家族成員（讓渡予Abgenix，揭示其 XenoMouse®技術）；其揭示内容以引用的方式併入本文 中。亦參見 Kellerman 及 Green, 2002 Cwrr. 13:593-597，及 Kontermann及 Stefan, 2001 Antibody Springer Laboratory Manuals 之評 述；其揭示内容以引用的方式併入本文中。 或者，可使本發明之PCSK9特異性拮抗劑庫與PCSK9及 能顯示選定特異性結合者接觸。接著可進行功能研究以確 保適當功能性，例如對PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作 用的抑制。熟習此項技術者可使用多種技術以便使用富集 技術自庫中選擇蛋白質特異性分子’該等技術包括（但不 限於）噬菌體呈現（例如，參見美國專利第5,565,332號；第 137316.doc -61 - 200938552 5,733,743 號；第 5,871,907 號；第 5,872,215 號；第 5,885,793 號；第 5,962,255 號；第 6,140,471 號；第 6,225,447 號；第 6,291,650 號；第 6,492,160 號；第 6,521,404 號；第 6,544,731 號；第 6,555,3 13 號；第 6,5 82,915號；第6,593,081號以及其他美國專利家族成員 及/或申請案（其依賴於1992年5月24日申請之GB 9206318 申請之優先權）中所揭示之Cambridge Antibody Technology(”CAT”）之技術）、核糖體呈現（參見，例如 Hanes及 Pluckthtin， 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4937-4942)、細菌呈現（參見，例如Georgiou等人，1997 iVaiwre 仍15:29-34)及/或酵母呈現（參見，例如Kieke 等人，1997 /Voiez·«五10:1303-1310);先前揭示 内容以引用的方式併入本文中。舉例而言，庫可於噬菌體 粒子之表面上呈現，其中編碼PCSK9特異性拮抗劑或其片 段之核酸在噬菌體粒子表面上表現及呈現。接著可將呈現 所要程度之活性之核酸與噬菌體粒子分離且將該核酸用於 形成所要拮抗劑。噬菌體呈現已充分描述於文獻中；參 見，例如Kontermann及Stefan，上述，及國際申請案第WO 92/01047號；其揭示内容以引用的方式併入本文中。特別 對於抗體分子而言，本發明之個別重鏈或輕鏈純系亦可分 別用以篩檢能夠彼此相互作用以形成組合重鏈及輕鏈之分 子的互補重鏈或輕鏈；參見，例如國際申請案第WO 92/0 1047號。熟習此項技術者可用之任何淘選方法均可用 以鑑別PCSK9特異性拮抗劑。用於實現此舉之另一特定方 137316.doc •62- 200938552 法為針對溶液中之目標抗原（例如生物素標記之可溶性 PCSK9)淘選，且接著將PCSK9特異性拮抗劑-噬菌體複合 物捕捉於經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁性珠粒上，接著將該 等珠粒洗滌以移除非特異性結合之噬菌體。接著可以與如 本文所述自培養板（例如DTT)之表面回收所捕捉之噬菌體 相同之方式自珠粒回收所捕捉之噬菌體。 PCSK9特異性拮抗劑可藉由熟習此項技術者可用之技術 純化。可藉由各種血清學或免疫檢定測定相關拮抗劑製 劑、腹水、融合瘤培養液或相關樣品之效價，該等檢定包 括（但不限於）沈澱、被動凝集、酶聯結免疫吸附抗體 (’’ELISA”）技術及放射免疫檢定（"RIA”）技術。 本發明在某種程度上係關於利用本文所述之PCSK9特異 性拮抗劑拮抗PCSK9功能的方法；該等方法在下文中作進 一步描述。本申請案通篇使用術語”拮抗”係指對抗、抑 制、抵消、中和或削弱PCSK9之一或多種功能之行為。可 根據此項技術已知之方法（參見，例如Barak及Webb, 1981 J. Cell Biol. 90:595-604 ; Stephan 及 Yurachek, 1993 ·/· 及以· 34:325330 ;及 McNamara 等人，2006 C7zWca C/n’m/ca jcia 369:158-167)以及本文所述之彼等方法容易 地測定對一或多種PCSK9相關功能特性的抑制作用或拮抗 作用。抑制作用或拮抗作用將使得PCSK9活性相對於不存 在拮抗劑之情況下所見之活性或（例如）當存在具有不相關 特異性之對照拮抗劑時所見之活性降低。較佳地，本發明 之PCSK9特異性拮抗劑拮抗PCSK9功能至以下程度：所量 B7316.doc -63- 200938552 測參數（包括（但不限於）本文所揭示之活性）降低至少10〇/0， 且更佳’所量測參數降低至少20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%及95%。該對於PCSK9功能之抑制 作用/拮抗作用在PCSK9功能至少部分促成對受檢者有負面 影響之特定表型、疾病、病症或病況之彼等情況下尤其有 效。 在一態樣中，本發明提供一種拮抗PCSK9活性的方法， 該方法包含使能夠受PCSK9影響之細胞、細胞群體或組織 樣品（亦即，其表現及/或包含LDL受體）與本文所揭示之 PCSK9特異性拮抗劑在允許該拮抗劑結合pcSK9(若存在） 且抑制PCSK9對細胞LDL吸收之抑制作用之條件下接觸。 本發明之特定實施例包括細胞為人類細胞之該等方法。本 發明之其他特定實施例包括細胞為鼠類細胞之該等方法。 在另—態樣中，本發明提供一種拮抗受檢者之PCSK9活 性的方法，該方法包含向受檢者投與治療有效量之本發明 之PCSK9特異性拮抗劑。在特定實施例中，拮抗pCSK9功 能之方法係用於治療PCSK9相關之疾病、病症或病況，或 者可受益於PCSK9拮抗劑作用之疾病、病症或病況。該藥 劑將適用於呈現與PCSK9活性相關之病況或pcSK9之功能 對於特定受檢者顯示不當之病況的受檢者。在選定實施例 中’病況可為高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性 冠狀動脈症候群或相關病況。 因此’本發明涵蓋本文所述之PCSK9特異性拮抗劑在需 要括抗PCSK9功能之各種治療方法中的用途。治療方法可 137316.doc 200938552 為預防性質或治療性質的。在特定實施例中，本發明係關 於-種治療與PCSK9活性相關/歸因於pcsK9活性之病況， 或PCSK9之功能對特定受檢者顯示不當之病況的方法該 方法包3向丈檢者投與治療有效量之本發明之pcsK9特異 . ❹抗劑。在選定實施例中，病況可為高膽固醇血症、冠 . 心病、代謝症候群、急性冠狀動脈症候群或相關病況。 本發明之治療方法包含向個體投與治療（預防）有效量之 φ 纟發明之PCSK9特異性拮抗劑。關於量使用術語”治療有 效”或，，預防有效"係指在預期劑量下達成所要治療性/預防 性：用歷時所要時間所必需之量。所要作用可為(例如)至 少一種與所治療病況相關之症狀的改善。如熟習此項技術 者所瞭解，此等量將根據各種因素改變，該等因素包括 (但不限於）個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，及 PCSK9特異性拮抗劑在個體中引發所要作用之能力。反應 Z錯由活體外檢定、活體内非人類動物研究記錄及/或進 ❹ 步經由臨床試驗予以支持。 PCSK9特異性拮抗劑可以醫藥組合物形式投與。因此， 本發明提供醫藥學上可接受之組合物，其包含本發明之 SK9特異性拮抗劑醫 玩齊j及醫樂學上可接受之載劑，該載劑包 , 旦不限於)賦形劑、稀釋劑、穩定劑、緩衝劑或經設叶 以促進拮抗劑以所要來”“ 劑L…十 物。 所要形式及所要置投與所治療個體之替代 醫藥組合物可藉由此項技術中已知之許多策略調配，來 ’例如 McG〇ff及 Scher，200"〇/m_ 吖 137316.doc -65- 200938552 iVoiei.ws/PepiiWes : McNally，E.J.編，Protein Formulation and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker,第 139-158 頁；Akers 及 Defilippis，2000，Proieks as Parenteral Solutions. Pharmaceutical Formulation
Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA:
Taylor and Francis,第 145-177 頁；Akers 等人，2002， ’ P/zarm. 14:47-127。適用於投與患者之醫藥學 ‘ 上可接受之組合物將在調配物中含有有效量之PCSK9特異 性拮抗劑，其保留生物活性同時亦促進在儲存期間在可接 〇 受之溫度範圍内之最大穩定性。 在特定實施例中，基於拮抗劑之醫藥學上可接受之組合 物可呈液體或固體形式或呈氣體粒子或霧化粒子形式。可 使用產生液體或固體調配物之任何技術。該等技術完全處 於熟習此項技術者之能力範圍内。可藉由任何可用方法產 生固體調配物，該等方法包括（但不限於）冷凍乾燥、嘴霧 乾燥或藉由超臨界流體技術乾燥。用於經口投與之固體調 〇 配物可呈使得拮抗劑以指定量且在指定時間内為患者獲得 之任何形式。經口調配物可呈多種固體調配物形式，該等 固體調配物包括（但不限於）錠劑、膠囊或散劑。或者，可 將固體調配物冷凍乾燥且在投與之前製成溶液以供單次或 多次給藥。拮抗劑組合物一般應經調配成處於生物學相關 pH值範圍内且可經緩衝以在儲存期間維持適當pH範圍。 液體與固體調配物一般均需要在較低溫度（例如2-8。(：）下儲 存以使穩定性保持較長時間。經調配之拮抗劑組合物、尤 1373l6.doc -66- 200938552 其液體調配物可含有防止儲存期間發生蛋白水解或將其減 至最少的抑菌劑，該抑菌劑包括（但不限於）有效濃度（例 如，训w/ν)之节醇、苯盼、間甲紛、氯丁醇、對經基苯 曱酸曱酯及/或對羥基苯曱酸丙酯。抑菌劑可能對於一些 患者顯示不當。因此，冷凍乾燥之調配物可於含有或不含 該組份之溶液中復水。可將其他組份添加至經緩衝之液體 . 或固體拮抗劑調配物中，該等組份包括（但不限於）糖，如 ❿ 低溫保護劑（包括（但不限於）聚羥基烴，諸如山梨糖醇、甘 露糖醇、甘油及半乳糖醇，及/或雙醣，諸如蔗糖、乳 糖、麥芽糖或海藻糖）及在一些情況下，相關鹽（包括（但不 限於）NaCM、KC1或LiCl)。該等拮抗劑調配物、尤其預計 供長期儲存之液體調配物將依賴於適用的總容積滲透濃度 範圍以促進在（例如）2-81或更高溫度下之長期穩定性同時 亦使調配物適用於非經腸注射。視情況而定，可包括防腐 劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。調配 φ 物可含有二階陽離子（包括（但不限於）MgCh、CaCl2及
MnCl2)，及/或非離子型界面活性劑（包括（但不限於）聚山 梨醇酯-80(Tween 80™)、聚山梨醇酯 _60(Tween 6〇TM)、聚 山梨醇酯_4〇(Tween 40™)及聚山梨醇酯_2〇(Tween 2〇TM)、
• t氧化乙稀烧基謎（其包括（但不限於）Brij 5 8TM、Brij 3 5 TM 以及其他’诸如 Triton X-10〇TM、Triton X-114TM、 NP4〇TM、Span 85及Pluronic系列之非離子型界面活性劑 (例如’ Pluronic 121)))。該等組份之任何組合形成本發明 之特定實施例。 137316.doc •67- 200938552 呈液體形式之醫藥組合物可包括液體載劑，例如水、石 油、動物油、植物油、礦物油或合成油。液體形式亦可包 括生理食鹽水溶液、右旋糖或其他醣類溶液或二醇，諸如 乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。 較佳地，醫藥組合物可呈非經腸可接受之水溶液形式， 其無熱原質，具有合適pH值、張力及穩定性。醫藥組合物 可經調配以便在等張媒劑中稀釋之後投與，例如氯化鈉注 射液、林格氏注射液（Ringer，s Inj.ecti〇n)或乳酸林格氏注射 液。 拮抗劑治療劑之給藥完全處於熟習此項技術者之技能範 圍内，參見，例如Lederman等人，1991 /此J. 47:659-664 ； Bagshawe# A ^ 1991 Antibody, Immunoconjugates we/ h〜β/ί 4:915922，且將基於許多因素 而改變，該等因素包括（但不限於）所用特定pcsK9特異性 拮抗劑、所治療之患者、患者之病況、所治療之區域、投 樂途徑及所要之治療。一般熟習此項技術之醫師或獸醫會 今易地確疋且指定拮抗劑之治療有效量。劑量範圍可為每 公斤主體體重約〇.〇1至1〇〇毫克，且更通常每公斤主體體 重0.05至25毫克。舉例而言，劑量可為每公斤體重ο]毫 克、每公斤體重1毫克、每公斤體重3毫克、每公斤體重5 毫克或每公斤體重10毫克或在1-1〇 mg/kg之範圍内。出於 說明之目的但不加以限制，在特定實施财，可使用5 mg 至.0 g之劑量以全身傳遞括抗劑。達到處於產生功效而無 毒性之犯圍内之拮抗劑濃度的最佳精度需要基於藥物對於 137316.doc •68· 200938552 目標位點之可用性的動力學之方案。此涉及考慮PCSK9特 =抗劑之分布、平衡及消除。可以適當劑量單獨使用 丰文所述之拮抗劑。或者， 了此而要共冋投與或依序投與 其，樂劑。本發明之PCSK9特異性括抗劑之治療給藥方案 • 替代治療方案聯合存在。舉例而言，PCSK9特異性 。几劑可與其他藥物（治療性及/或預防性）組合或聯合使 用’该等藥物包括(但不限於)降膽固醇藥物，例如膽固酵 ❹：及收：制劑(例如，Zetia，及膽固醇合成抑制劑(例如， —及VytoHnV本發明涵蓋該等組合且其形成本發明 之重要實施例。因此’本發明係關於如上所述之治療方 =’其t將PCSK9特異性拮抗劑與另外—或多種藥物（治 療性及/或預防性)同時投與/傳遞、在另外一或多種藥物之 後:戈之前投與/傳遞，該或該等藥物包括(但不限於)降膽固 醇樂物、膽固醇吸收抑制劑及膽固醇吸收抑制劑。 能夠如本文所述治療之個體（受檢者）包括靈長類動物、 © 類及非人類，且包括具有商業或養酬獸醫學價值之任何 非人類哺乳動物或脊椎動物。 可將PCSK9特異性拮抗劑單獨或與經設計以辅助治療個 . 冑之其他藥劑組合，藉由此項技術中所瞭解之任何投藥途 • 徑投與個體，該投藥途徑包括（但不限於他口^ 注射投與（其特定實施例包括靜脈内、皮下、腹膜内或肌 肉内注射）、藉由吸入投與、鼻内投與或局部投與。投藥 途控應基於熟習此項技術者所瞭解之許多因素而確定，該 等因素包括（但不限於）治療之所要物理化學特徵。可基於 137316.doc -69- 200938552 每曰、每週、每兩週或每月或以指定次數向個體傳遞適當 量之PCSK9特異性拮抗劑以便實現且維持所要治療之任何 其他方式提供治療。可以單次劑量或以一次以上劑量以分 開時間投與調配物。 亦涵蓋在製造用於治療PCSK9相關之疾病、病症或病況 或可受益於PCSK9结抗劑之作用的疾病、病症或病況之藥 劑中使用所揭示之拮抗劑的方法。該藥劑將適用於呈現與 PCSK9活性相關之病況，或PCSK9之功能對於特定受檢者 顯示不當之病況的受檢者。在選定實施例中，病況可為高 膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠狀動脈症候群 或相關病況。 本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑亦可用作診斷PCSK9 之方法。在選定實施例中，本發明涵蓋鑑別存在於樣品 (包括（但不限於）生物樣品，例如血清或企液）中之PCSK9 或量化其含量的方法，該方法包含使樣品與本文所述之 PCSK9特異性才吉抗劑接觸且分另"貞測或量化與PCSK9之結 合。PCSK9特異性拮抗劑可用於熟習此項技術者已知之各 種檢定形式，且可形成套組之部分（以下進一步描述套組 之一般特徵）。 本發明進一步提供投與所揭示之抗PCSK9拮抗劑以達成 基因療法之目的。經由該等方法，用編碼本發明之PCSK9 特異性拮抗劑的核酸將受檢者之細胞轉型。接著包含該等 核酸之受檢者内源性產生PCSK9特異性拮抗劑。先前 Alvarez 等人，C//«/ca/ Ca«cer (5:3081-3087 137316.doc -70- 200938552 2000 ’使用基因療法將單鏈抗ErbB2抗體引入受檢者。 Alvarez等人’上述所揭示之方法可調適用於將編碼本發明 之抗PCSK9抗體之核酸引入受檢者。 可將編碼任何PCSK9特異性拮抗劑之核酸引入受檢者。 可藉由此項技術中已知之任何方法將核酸引入受檢者之 細胞中。在較佳實施例中，將核酸作為病毒載體之部分引 入。可產生載體之較佳病毒的實例包括慢病毒、疱疹病 毒、腺病毒、腺相關病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、α病 毒、流感病毒及具有所要趨細胞性之其他重組病毒。 許多公司均商業生產病毒載體，該等公司包括（但決不 限於）Avigen, Inc.(Alameda，Calif. ; AAV載體）、Cell Genesys(Foster City，Calif.;反轉錄病毒、腺病毒、AAV 載體及慢病毒載體）、Clontech(反轉錄病毒及桿狀病毒載 體）、Genovo, Inc.(Sharon Hill, Pa.;腺病毒及 AAV 載體）、 Genvec(腺病毒載體）、IntroGene(Leiden，Netherlands ;腺 病毒載體）、Molecular Medicine(反轉錄病毒、腺病毒、 AAV及疮療病毒載體）、Norgen(腺病毒載體）、Oxford BioMedica(Oxford, United Kingdom ;慢病毒載體）及 Transgene(Strasbourg, France ;腺病毒、牛痘、反轉錄病 毒及慢病毒載體）。 用於建構及使用病毒載體之方法在此項技術中已知（參 見，例如Miller等人，BioTechniques 7:980-990，1992)。較 佳地，病毒載體為複製缺陷型，亦即其不能在目標細胞中 自主複製，且因此不具感染性。較佳地，複製缺陷型病毒 137316.doc -71 - 200938552 為最小病毒，亦即其僅保持用殼體包裹基因組以產生病毒 粒子所必需之其基因組序列。較佳為完全或幾乎完全缺乏 病毒基因之缺陷型病毒。使用缺陷型病毒載體允許向細胞 之特定、限定區域中投藥，而不必擔心該載體會感染其他 細胞。因此，可特定靶向特定組織。 包含減毒或缺陷型DNA病毒序列之載體的實例包括（但 不限於）缺陷型癌瘆病毒載體（Kanno等人，Cfltwcer Ge”. 77ier. 6:147-154，1999 ; Kaplitt等人，《/· MeiA. 71:125-132，1997 及 Kaplitt 等人，《/. A^ewro Owe. 19:137-147, 1994)。 腺病毒為可經修飾以有效傳遞本發明之核酸至多種細胞 類型之真核生物DNA病毒。在一些情況下，需要減毒型腺 病毒載體，諸如 Strafford-Perricaudet等人，《/. C/z·”. /«ναί. 90:626-630, 1992所述之載體。已描述各種複製缺陷型腺 病毒及最小腺病毒載體（PCT公開案第WO 94/26914號、第 WO 94/28938號、第 WO 94/28152號、第 WO 94/12649號、 第WO 95/02697號及第WO 96/22378號）。本發明之複製缺 陷型重組腺病毒可藉由熟習此項技術者已知之任何技術製 備（Levrero 等人，101:195, 1991 ; EP 185573 ;
Graham,五対5(9 ·/. 3:2917，1984 ; Graham等人，《/.
Fzro/. 36:59, 1977)。 腺相關病毒（AAV)為具有相對較小尺寸之DNA病毒，其 可以穩定及定點方式整合至其所感染之細胞的基因組中。 該等病毒能夠感染廣泛範圍之細胞，而不對細胞生長、形 137316.doc •72- 200938552 態或分化產生任何影響，且其似乎並不牵涉於人類病理學 中。已描述AAV產生之載體用於在活體外及活體内轉移基 因之用途（參見 Daly等人，Gene Ther. 8:1343-1346, 2001， Larson等人，Adv. Exp. Med. Bio. 489:45-57, 2001 ; PCT公 開案第WO 91/18088號及第WO 93/09239號；美國專利第 4,797,368號及第 5，139,941 號及 EP 488528B1)。 在另一實施例中，可將基因引入反轉錄病毒載體中，例 如，如美國專利第5,399,346號、第4,650,764號、第 4,980,289 號及第 5,124,263 號；Mann等人，Ce// 33:153, 1983 ; Markowitz 等人，·/. Virol., 62:1120, 1988 ； Ep 45 3242及EP178220中所述。反轉錄病毒為感染分裂細胞之 整合病毒。 慢病毒載體可用作在若干組織類型（包括腦、視網膜、 肌肉、肝臟及血液）中直接傳遞且持續表現編碼本發明之 PCSK9特異性拮抗劑之核酸的介質。載體可在此等組織中 有效轉導分裂細胞及非分裂細胞且維持PCSK9特異性拮抗 劑之長期表現。對於評述參見Zufferey等人，乂妁ro/. 72:9873-80, 1998 及 Kafri 等人，Cwrr. M〇/·以以 3:316-326，2001。此項技術中一般可用且已知慢病毒封裝 細胞株。其有利於產生用於基因療法之高效價慢病毒載 體。實例為四環素誘導性VSV-G假型慢病毒封裝細胞株， 其可產生大於1〇6 IU/ml之效價之病毒粒子歷時至少3至4 日；參見Kafri等人，丄乃>〇/. 73:576-584, 1999。由誘導性 細胞株產生之載體可視需要加以濃縮以便在活體外及活體 137316.doc -73- 200938552 内有效轉導非分裂細胞。 辛德畢斯病毒（Sindbis virus)為α病毒屬之成員且自從其 在1953年開始在世界各地被發現以來已得以廣泛研究。已 在活體外充分研究基於α病毒、尤其辛德畢斯病毒之基因 轉導（參見 Straus 等人，Microho/. i?ev·, 58:491-562, 1994 ; Bredenbeek 等人，/ Virol., 67:6439-6446, 1993 '» Ijima等人，/«ί· /. Cawcer 80:110-118, 1999及 Sawai等人， 价ocAz'm.仍少r. Comm. 248:315-323，1998)。α病毒 載體之許多特性使其成為開發中之其他病毒源性載體系統 的所需替代物，該等特性包括表現構築體之快速工程化、 高效價感染性粒子儲備物的產生、非分裂細胞之感染及高 程度表現（Strauss等人，1994上述）。已描述辛德畢斯病毒 用於基因療法之用途。（Wahlfors等人，Ge”e. 77?er. 7:472-480, 2000^. Lundstrom, J. Recep. Sig. Transduct. Res. 19(1-从673-686, 1999)。 在另一實施例中，可藉由脂質轉染或用其他轉染促進劑 (肽、聚合物等）將載體引入細胞中。合成陽離子性脂質可 用以製備用於活體内及活體外轉染編碼標記之基因的脂質 體（Feigner 等人，/Voc. TVa". ylccti/. 5W. 54:7413-7417, \9%Ί 專 k，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84’·Ί^>5\- 7855, 1987)。適用於轉移核酸之脂質化合物及組合物描述 於卩(：丁公開案第\¥0 95/18863號及第^0 96^7823號及美國 專利第5,459,127號中。 亦可在活體内將載體以裸DNA質體形式引入。可藉由此 137316.doc -74- 200938552 項技術中已知之例如電穿孔、顯微注射、細胞融合、 DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、使用基因槍或使用DNA載體 轉運體之方法將用於基因療法之裸DNA載體引入所要宿主 細胞中（參見，例如Wilson等人，《/.价〇/.^7^讲.267:963-967，1992 ; Williams 等人，iVoc. iVai/. 88:2726-2730, 1991)。常用於轉染質體之其他試劑包括（但 決不限於）FuGene、Lip〇fectin及 Lipofectamine。亦可使用 受體介導之DNA傳遞方法（Wu等人，/_ 5ζ·ο/. Ckw. 263:14621-14624，1988)。美國專利第 5,580,859 號及第 5,589,466號揭示哺乳動物中不含轉染促進劑之外源DNA序 列的傳遞。近來，已描述相對較低電壓、較高效率的活體 内DNA轉移技術，稱為電轉移（Vilquin等人，Gene 8:1097，2001 ; Payen等人，五如〇/. 29:295-300, 2001 ; Mir，少 53:1 - 10，2001 ; PCT公開 案第 WO 99/01157號、第;w〇 99/01158 號及第 WO 99/01175
適用於該等基因療法且包含編碼本發明之抗PCSK9拮抗 劑之核酸的醫藥組合物包括於本發明之範嘴内。 在另一態樣中，本發明提供一種使用本發明之PCSK9特 異性拮抗劑鑑別、分離、量化或拮抗所關注之樣品中之 PCSK9的方法。PCSK9特異性拮抗劑可在以下方案中用作 研究工具.免疫化學檢定’諸如西方墨點法（Western blots)、ELISA、放射免疫檢定、免疫組織化學檢定、免疫 沈澱或此項技術中已知之其他免疫化學檢定（參見、例如 137316.doc -75- 200938552
Immunological Techniques Laboratory Manual, Goers, J.編 1993, Academic Press)或各種純化方案。拮抗劑可具有併 入其中或附著至其上之標記物以有利於簡便鑑別或量測與 其相關之活性。熟習此項技術者易於知曉各種類型之可偵 測標記物（例如，容易偵測到或產生一些容易偵測到之行 為/結果之酶、染料或其他合適分子），該等標記物適用於 或可能適用於以上方案。 本發明之另一態樣為包含本文所揭示之PCSK9特異性拮 抗劑或醫藥組合物及使用說明書之套組。套組通常（但並 非必需）包括指示套組内含物之預期用途的標記物。術語 標記物包括提供於套組上或與套組一起提供或另外伴隨該 套組之任何書面或記錄材料。 提供以下實例以說明本發明而不限制本發明： 實例1 重組Fab呈現噬菌體之分離 經由如下簡單描述之方法針對固定重組鼠類PCSK9淘選 重組Morphosys HuCAL Gold Fab嗟菌體呈現庫（參見，例 如 Knappik等人，2000 J. Mol. Biol. 296:57-86):將噬菌體 Fab呈現庫分成3個集合：一個集合為VH2+VH4+VH5，另 一集合為VH1+VH6且第三個集合為VH3。將噬菌體集合及 經固定之PCSK9蛋白用脫脂奶粉阻斷。 對於第一輪淘選而言，使每一噬菌體集合獨立結合固定 於1^1111。]^&\丨5〇印板之孔中之''/5-、11丨8-標記之？€8〖9蛋 白。將經固定之噬菌體-PCSK9複合物相繼用以下溶液洗 137316.doc -76- 200938552 滌：（1) PBS/0.5% Tween™ 20(三次快速洗滌）；（2) PBS/0.5% Tween™ 20(在輕微震盪下一次5 min培育）；（3) PBS(三次快速洗滌）；及（4) PBS(在輕微震盪下兩次5 min 培育）。將經結合之噬菌體用20 mM DTT溶離且將所溶離 之所有三種噬菌體懸浮液組合至一管中。用所溶離之噬菌 體感染大腸桿菌TG1。使彙集之帶噬菌粒細胞（耐氣黴素） 培養物生長且製備冷凍的帶噬菌粒培養物儲備物。藉由用 輔助噬菌體協同感染自培養物中拯救噬菌體，且製備用於 下一輪淘選之噬菌體儲備物。 對於第二輪淘選而言，使來自第一輪之噬菌體與經固定 經阻斷之V5-、His-標記之PCSK9蛋白結合。將經固定之噬 菌體-PCSK9複合物相繼用以下溶液洗滌：（1) PBS/0.05% Tween™ 20(—次快速洗滌）；（2) PBS/0.05% Tween™ 20(在 輕微震盪下四次5 min培育）；（3) PBS(—次快速洗滌）；及 (4) PBS(在輕微震盪下四次5 min培育）。如同第一輪，溶 離經結合之噬菌體，感染大腸桿菌TG1細胞且拯救噬菌 體。 對於第三輪淘選而言，使來自第二輪之噬菌體與經固定 經阻斷之V5-His-標記之PCSK9蛋白結合。將經固定之噬菌 體-PCSK9複合物相繼用以下溶液洗滌：（1) PBS/0.05% Tween™ 20(十次快速洗滌）；（2) PBS/0.05% Tween™ 20(在 輕微震盪下五次5 min培育）；（3) PBS(十次快速洗滌）；及 (4) PBS(在輕微震盪下五次5 min培育）。如同第一輪，溶 離經結合之噬菌體且感染大腸桿菌TG1細胞。使經噬菌粒 137316.doc -77- 200938552 感染之細胞生長隔夜且製備噬菌粒DNA。 將來自第三輪噬菌粒DNA之Xbal-EcoRI插入物次選殖至 Morphosys Fab表現載體pMORPH_x9—MH中以產生質體 pMORPHx9 MH/mPCSK9 2 CXI D05(參見，例如圖 1)，且 在大腸桿菌TGI F-中產生Fab表現純系庫。將轉型物展布 於LB+氯黴素+葡萄糖板上且生長隔夜以產生菌落。選取 個別轉形物菌落且將其置於兩個96孔板之孔中使其生長且 針對Fab表現進行篩檢。 實例2 細菌表現之FAB的ELISA篩檢 使個別轉型物之培養物用IPTG誘發且生長隔夜以達成 Fab表現。將培養物上清液（候選Fab)與固定於96孔Nunc Maxisorp板之孔中之經純化V5-、His-標記之PCSK9蛋白一 起培育，使用板洗滌器用於PBS中之0.1% Tween™ 20洗 滌’與HRP偶合抗Fab抗體一起培育且再次用PBS/Tween™ 20洗滌。藉由添加TMP受質偵測經結合之HRP，且用板讀 取器讀取孔之A45〇值。 包括如下陰性對照： 將每一板上用於非特異性Fab結合之對照與平行表現之 抗-EsB(—種不相關Fab)製劑一起培育。 僅生長培養基。 包括如下用於ELISA及Fab表現之陽性對照： 使EsB抗原結合至板之3個孔且隨後與抗-EsB Fab —起培 育。 137316.doc -78- 200938552 為對照與重組P C S Κ 9抗原之V 5或JJi s標記反應之F ab，使 用在與原始PCSK9抗原相同之細胞中表現且經類似純化之 V5-、His-標記之分泌型驗性填酸酶蛋白（seap)進行平行 ELISA。假定PCSK9反應性Fab係鏗別為當與pcsKW^S — 起培育時產生大於3倍背景值’但當與seaP —起培育時為 陰性。將在第一輪篩檢中記為PCSK9反應性之純系固定於 單一板上’再生長（一式三份）’用IPTG再誘發且對比 PC SK9及SEAP以平行ELISA再檢定。如上所述包括陽性及 陰性對照。使3個複本中至少2個記為陽性之純系進行後續 表徵。在已知或疑似混合初級純系之情況下，藉由於 2xYT板上用氣黴素針對單一菌落劃線來將培養物再純 化’且再次藉由ELISA如上所述一式三份檢定來自3個或3 個以上獨立菌落之液體培養物。 實例3 PCSK9 ELISA-陽性FAB純系、之DNA序列測定 藉由用來自陽性Fab之母甘油儲備物之氣黴素接種1.2 ml 2xYT液體培養基且生長隔夜來製備用於ΒΝΑ製備之細菌 培養物。使用於BioRobot 9600上進行之Qiagen Turbo小規 模製備自隔夜培養物離心所得之細胞離心塊製備dna。用 Morphosys明確定序引子對DNA進行ABI染料終止子循環測 序’且在ABI 3 100遺傳分析器上運作以獲得Fab純系之 DNA序列。將DNA序列相互比較以確定獨特純系序列及確 定Fab純系之輕鏈及重鏈亞型。 實例4 137316.doc -79- 200938552 來自獨特PCSK9 ELISA-陽性純系之FAB的表現及純化 藉由IPTG誘導在大腸桿菌TG1F細胞中表現來自ELISA 陽性純系m2CXlD05之Fab及EsB(陰性對照）Fab。將培養物 溶解且藉由固定金屬離子親和層析（IMAC)純化His標記之 Fab，且藉由離心滲濾使蛋白質交換至25 mM HEPES pH 7.3/150 mM NaCl 中。將蛋白質藉由於 Caliper Lab-Chip 90 上電泳且藉由習知SDS-PAGE來分析且藉由布萊德福蛋白 質檢定（Bradford protein assay)量化。使經純化Fab蛋白以 連續稀釋藉由ELISA再檢定以確定經純化Fab之活性。如 前所述運作陽性及陰性對照。接著如下所述分析經純化之 F ab製劑。 實例5 m2CXlD05 FAB至全長IgG之轉化 使用引子：ACAGATGCCAGATGCGATATCCAGATGACC CAGA(SEQ ID NO: 33)及 TGCAGCCACCGTACGTTTAATTT CAACTTTCGTACC(SEQ ID NO: 34)藉由聚合酶鏈式反應 自質體模板 pMORPHx9—MH/mPCSK9_2_CXl_D05 擴增編 碼m2CXlD05輕鏈可變區之DNA序列。使用InFusion選殖 系統（Clontech)將此擴增之產物選殖至先前已用FspI及 Bmtl消化之質體pVIJNSA-GS-FB-LCK中。藉由跨可變區 之DNA測序驗證所得質體。使用Qiagen無内毒素質體大規 模製備套組進行無内毒素質體製備。
使用引子：ACAGGTGTCCACTCGCAGGTGCAATTGGTT CAGTCT(SEQ ID NO: 35)及 GCCCTTGGTGGATGCTGA 137316.doc -80- 200938552 GCTAACCGTCACCAGGGT(SEQ ID NO: 36)藉由聚合酶鍵 式反應擴增編碼pMORPHx9-MH/mPCSK9 2 CXI D05 之 重鏈可變區之DNA序列，且將擴增產物選殖至先前已用 FspI及Bmtl消化之質體pVlJNSA-BF-HCG2M4中。藉由跨 可變區之DNA測序驗證所得質體。使用Qiagen無内毒素質 體大規模製備套組進行無内毒素質體製備。 藉由用編碼1D05輕鏈之質體及編碼1D05重鏈之質體共 同轉染HEK293細胞來獲得全長IgG，之後對所表現之IgG 進行蛋白質A純化。 實例6 用表面電漿共振（"SPR”）對FAB:PCSK9相互作用作動力學 評估 使用 Biacore™(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)2000系統進行SPR量測。用於固定之感應器晶片 CM5及胺偶合套組係來自BiacoreTM。 使用固定嚮導在”對準固定”選項下使用Biacore™胺偶合 套組（目錄號BR-1000-50)將抗-Fab IgG(人類特異 性）（Sigma，目錄號15260)經由第一胺基共價偶合至感應器 晶片CM5之表面1及2。指定5000 RU之目標固定。該嚮導 使用經100 mM NHS(N-羥基琥珀醯亞胺）與400 mM EDC(卜 乙基-3-(3-二曱基胺基丙基）-碳化二醯亞胺）之1:1混合物之 7分鐘活化，以若干脈衝注入配體以達成所要含量，接著 用乙醇胺之7分鐘脈衝使其餘表面失活。 將抗PCSK9 Fab捕捉於捕捉表面2上，且將表面1用作 137316.doc •81 · 200938552
Fab:PCSK9相互作用之動力學研究之參照。藉由使500 ng/ml溶液以5 μΐ/min或10 μΙ/min流動1 -1.5分鐘以達到目標 Rl來捕捉各Fab，該反應之Rmax為100-150 RU。使5-10個濃 度之hPCSK9v5His或 mPCSK9v5His抗原以 30 μΐ/min流經表 面歷時3-4分鐘。在用10 mM甘胺酸（pH 2.0)之30秒脈衝再 生抗-Fab表面之前留有15-60分鐘解離時間。 使用BiaEvaluation軟體評估來自用各Fab分析之多個濃 度之CSK9抗原的感應譜，以便估算Fab:PCSK9相互作用之 動力學常數。 動力學常數確定如下： 表2
Fab 抗原 kond/MsxlO^ k〇ff(l/sxl〇4) KD ίηΜ m2CXlD05 Fab 人類 PCSK9 0.22 ±0.01 2.47 ±0.05 11.5 土 0.75 平均值(N=3) m2CXlD05 Fab 鼠類 PCSK9 0.86 ±0.02 2.57 ±0.19 3.35 ±0.39 平均值(N=3) 實例7 用表面電漿共振（"SPR")對IgG:PCSK9相互作用作動力學評估 使用 Biacore™(Pharmacia Biosensor AB， Uppsala, Sweden)2000系統進行SPR量測。用於固定之感應器晶片 CM5及胺偶合套組係來自Biacore™。 使用固定嚮導在"對準固定"選項下使用Biacore™胺偶合 套組（目錄號BR-1000-50)將山羊抗-人類IgG(Caltag，目錄 號H10700)經由第一胺基共價偶合至感應器晶片CM5之表 面1及2。指定5000 RU之目標固定。該嚮導使用經1〇〇 mM NHS(N-羥基琥珀醯亞胺）與400 mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲 137316.doc -82- 200938552 基胺基丙基）-碳化二醯亞胺）之1:1混合物之7分鐘活化，以 若干脈衝注入配體以達成所要含量，接著用乙醇胺之7分 鐘脈衝使其餘表面失活。 將抗PCSK9 IgG捕捉於捕捉表面2上，且將表面1用作 IgG:PCSK9相互作用之動力學研究之參照。藉由使10 nM 溶液以10 μΐ/min流動1 -1.5分鐘以達到目標RL來捕捉IgG， 該反應2Rmax 為 100-150 RU。使 5-10 個濃度之 hPCSK9v5His 或mPCSK9v5His抗原以30或60 μΐ/min流經表面歷時4分 鐘。在用10 mM甘胺酸（pH 1.7)之60秒脈衝再生抗-IgG表 面之前留有15-60分鐘解離時間。 使用BiaEvaluation軟體評估來自用各IgG分析之多個濃 度之PCSK9抗原的感應譜，以便估算IgG:PCSK9相互作用 之動力學常數。 動力學常數確定如下： 表3
IgG 抗原 k〇n(l/ Msx10'5> k〇ff(i/sxl04) KD(nM) 1D05 IgG2m4 hPCSK9 0.88 ±0.01 3.16 ±0.27 3.6 ±0.33 平均值(N=2) 1D05 IgG2m4 mPCSK9 0.67 ±0.06 2.15 ±0.16 3.2 ±0.06 平均值(N=2) 實例8 1D05之PCSK9-LDLR TR-FRET檢定 此檢定為 Fisher 等人，2007 J. 5ζ·ο/. C/rew. 282:20502-20512中所述檢定之變化形式。使用96孔黑色Dynatech U 型底板將AlexaFluor647標記之PCSK9(最終濃度10 nM)與 變化量之1D05組合且向此組合物中添加Eu(8044)標記之 LDLR胞外結構域以達到於10 mM HEPES(pH 7.4)、150 137316.doc -83- 200938552 mM NaCl、0.1 mM CaCl2、0.05% (w/v)BSA 中約 1.5 nM之 最終濃度（總體積為50 μΕ)(足以上在F1620 nM下 得到約20,0〇〇個計數）。在平衡至少90分鐘之後，在 Rubystar讀取器（BMG Corp)中使用每孔20次閃爍、50 nsec 整合延遲及200 usee總整合時間讀取樣品。數據表示為 (尸1665斤162。><10000)之比率且使用標準4參數擬合自8形劑量 反應曲線之拐點確定1D05之IC50。 圖2說明1D05在PCSK9-LDLR相互作用TR-FRET檢定中 之活性。1D05之Fab與IgG均有效且完全抑制PCSK9-LDLR 相互作用。 實例9 EXOPOLAR檢定：外源性PCSK9對細胞LDL吸收之作用 在第1日，將30,000個HEK細胞/孔平板接種於96孔經聚 D離胺酸塗佈之板中。在第2曰，將培養基換為不含血清之 DMEM培養基。在第3日，移除培養基且將細胞用 OptiMEM洗滌。添加於100 μΐ含LPDS及dl-LDL之DMEM培 養基中的經純化之PCSK9。將板在37°C下培育6.5小時。將 細胞於含2 mg/ml BSA之TBS中快速洗滌；接著於TBS-BSA中洗滌2分鐘；且接著用TBS洗滌兩次（但快速）。將細 胞於100 μΐ RIPA緩衝劑中溶解。接著使用Ex 520、Em 580 nm量測板中之螢光性。使用BCA蛋白質檢定量測每一孔中 之總細胞蛋白質且接著將螢光單位針對總蛋白質正規化。 該Exopolar檢定有效表徵對LDL吸收之不同作用；參見 下表4，表4說明在Exopolar檢定中PCSK9突變體之效能與 137316.doc • 84 - 200938552 血漿LDL-膽固酵之關係。 表4 突變 增加/減少 LDL-C (mg/dl) EC-50 (nM) Exopblar S127R 增加 277 14 D374Y 增加 388 1.3 野生型 140 51 R46L 減少 116 78 潜术：m2CXlD05(Fab與IgG)劑量依賴性抑制人類與鼠 類PCSK9對於LDL吸收之作用；其為一種可重複觀察到之 作用。添加至細胞中之PCSK9的量為約100-320 nM。 m2CXlD05(Fab)包含 SEQ ID NO: 1 之輕鏈（包含 SEQ ID NO: 27之VL)及包括連接子及標記在内之SEQ ID NO: 9之 Fd 鏈（包含 SEQ ID NO: 11 之 VH)。 M2CXlD05(IgG)包含SEQ ID NO: 26之輕鏈，及包含 SEQ ID NO: 25之重鏈。 圖3A-圖3D說明⑴iD〇5(Fab)對鼠類PCSK9依賴性細胞 LDL-吸收損失的劑量依賴性抑制作用（圖3A) ; (ii) © 對鼠類PCSK9依賴性細胞LDL-吸收損失的劑量 依賴性抑制作用（圖3B) ; (iii) lD05(Fab)對人類PCSK9依賴 性細胞LDL-吸收損失的劑量依賴性抑制作用（圖3C);及 對人類PSCK9依賴性細胞LDL-吸收損失的劑 . 量依賴性抑制作用（圖3D)。 1D05明確與人類PCSK9與小鼠PCSK9兩者交叉反應。圖 3 A-圖3D具有兩個對照：⑴單獨細胞對照，其展示細胞 LDL吸收之基礎程度，及（ii)細胞+PCSK9(5 pg/ml)對照， 137316.doc -85- 200938552 其展示PCSK9依賴性LDL吸收損失的程度。含有1D05及 PCSK9之滴定實驗係在圖中所示之固定PCSK9濃度（5 pg/ml)及遞增1D05濃度下進行。 1D05可抑制PCSK9對細胞LDL吸收之作用。lD05(Fab) 對於小鼠及人類PCSK9蛋白之IC5。分別為97 nM及144 nM。lD05(IgG)對於小鼠及人類PCSK9蛋白之IC5〇分別為 85 nM及 79 nM ° 實例10 PCSK9細胞吸收 以下檢定係根據Fisher等人，2007 ·/·价<?/. 282: 20502-12之方法進行。 如下將用Alexa Fluor 647標記之PCSK9處理之細胞成 像。將CHO細胞以20,000個細胞/孔之密度平板接種於經聚 D離胺酸塗佈之96孔光學CVG無菌黑色板（Nunc)上。將細 胞平板接種於F-12K培養基中（營養混合物，Kaighn氏改良 (1 x))(Invitrogen)，該培養基含有100個單位之青黴素及100 pg/ml硫酸鏈黴素且補充有10% FBS。將板在37°C及5% C02下培育隔夜。次日早晨，將培養基移除且用100 μΐ含 有100個單位青黴素及100 pg/ml硫酸鏈黴素之F-12K培養 基置換。18 h之後，移除培養基。如"實驗程序”下所述將 經純化之PCSK9蛋白用Alexa Fluor 647標記。將Alexa Fluor 647標 I己之 PCSK9(1 、 5 或 20 pg/ml)於 50 μΐ含有 10〇/〇 脂蛋白缺乏血清之F-12K培養基中添加至細胞中。將該等 板在37°C下培育4 h，且將細胞用Tris-緩衝生理食鹽水快 137316.doc -86- 200938552 速洗滌，隨後成像。將Hoechst 33342以0.1 gg/ml之最終濃 度添加至每一孔中以標記細胞核。將板於具有40倍水浸物 鏡之 Opera成像儀（Evotec Technologies GmbH，Hamburg， Germany)上運作。對於螢光核使用405 nm之激發波長且對 於Alexa Fluor 647-標記之PCSK9使用635 nm之激發波長來 捕捉影像。對於每一孔而言，針對兩個發射波長捕捉11個 含有大於500個細胞之個別視場。使用以Acapella語言編寫 之定製演算法（Evotec Technologies GmbH)分析資料。該演 算法鑑別且標記個別細胞之核及細胞質區域，隨後量測細 胞之總細胞質強度。該強度用任意螢光單位表示。 為測試1D05 Ab，使用相同程序及HEK293細胞或HepG2 細胞。對於HepG2細胞而言，板將不經聚D離胺酸塗佈。 添加5 pg/ml AF647標記之WT PCSK9以50 pg/ml以下範圍 内之Fab滴定物。使用此程序，在兩細胞類型中均獲得約 80 nM之Fab IC5〇值。 .结采：圖4A及圖4B說明Fab 1D05及IgG 1D05對PCSK9内 在化的抑制作用及LDL吸收之恢復。 實例11 活體内檢定 此等研究中所用之小鼠為（B6xB6-Tg(C£7T) 小鼠，其對於人類CETP(小鼠缺乏）之轉殖基因（Tg)表現以 及LDL受體之分裂為半合的。此等小鼠因其類似於人 類之脂質概況及富LDL性質而尤其適用。 對每隻小鼠取血兩次，一次在研究開始時以確定個別 137316.doc -87- 200938552 LDL膽固醇基礎含量（"前，，）且第二次在3小時之後（"後"）以 評定處理後LDL含量發生何種改變。在3小時之過程中每 隻小鼠接受杜比可氏PBS(Dulbecco’s PBS)(作為媒劑對 照）、1D05 IgG(0.5 mg)或 1D05 Fab 片段（〇.5 mg)之兩次 IV 劑量。將1D05完整IgG在即將注射之前在230,000 X g下離 心以便移除凝集物。 在圖5中，每隻小鼠之LDL含量係由一組連接符號表示 且LDL之變化（取血後-取血前）顯示為每一處理組之平均值 (△mg/dL)。用PBS處理對LDL量測無影響（-4 mg/dL’降低 5%)。相比之下，用1D05完整IgG處理使血清LDL降低 20%(-19 mg/dL)且用1D05之Fab片段處理使血清LDL降低 34%(-24 mg/dL)。 實例12 限制性蛋白水解 限制性蛋白水解質譜分析策略為在受嚴格控制之條件 (亦即，低酶濃度及短消化時間）下將野生型hPCSK9及 1D05/野生型hPCSK9複合物（受質）與具有不同特異性.之内 切蛋白酶一起培育。在此等條件下，内切蛋白酶將僅裂解 蛋白質受質之一級裂解位點（亦即，處於蛋白質受質之表 面上及暴露於溶劑之位點）。1D05 Fab與野生型hPCSK9之 結合將遮蔽兩種蛋白質中之一些通常暴露於溶劑中之表面 殘基。因此，在野生型hPCSK9中裂解而在id〇5/野生型 hPCSK9複合物中未裂解之一級位點對應於複合物中由 1D05保護之PCSK9之殘基。此等殘基中有一些可能與 137316.doc -88- 200938552 1D05結合直接相關。藉由用基質輔助雷射脫附/離子化質 譜分析（MALDI-MS)分析消化來鑑別及表徵藉由野生型 hPCSK9及1D05/野生型hPCSK9限制性蛋白水解所產生之 蛋白水解肽。最後，使用具有不同特異性之内切蛋白酶有 助於更精確確定與結合相關之殘基。 限制性蛋白水解實驗中常用之蛋白水解酶之量必須大大 降低以避免野生型hPCSK9之過量水解及一級結合位點（暴 露殘基）之損失。野生型hPCSK9、1D05及1D05/野生型 hPCSK9與内切蛋白酶之培育係在25 mM HEPES pH 7.5、 150 mM NaCl中在室溫下進行。所用内切蛋白酶為以蛋白 質與蛋白水解酶相比2500/1(评/'^)過量添加之八8卩>1，及以 蛋白質與内切蛋白酶1000/1 (w/w)之比率添加之騰蛋白酶及 GluC。在添加内切蛋白酶之後的第5分鐘、第15分鐘及第 30分鐘，使樣品之等分試樣沈積於MALDI目標上且在作為 基質之芬子酸（SA)存在下進行直接MALDI-MS分析。在多 個時間點將由野生型PCSK9在與蛋白水解酶一起培育之後 所產生之片段肽與由1D05/野生型hPCSK9複合物樣品中之 野生型hPCSK9所產生之彼等片段肽相比以鑑別在1D05/野 生型hPCSK9相互作用中受到保護以免於蛋白水解之殘 基。本文所提供之圖及表僅報導最相關之片段肽。 使用内切蛋白錄AspN進行之限制性蛋白水解·洛齊 型hPCSK9蛋白、1D05/野生型hPCSK9複合物及1D05 Fab 在AspN(其以N末端方式裂解Asp殘基）存在下在蛋白質與 蛋白水解酶之間呈2500/1 (w/w)之比率下培育5、15及30分 137316.doc -89· 200938552 鐘。對消化之MALDI-MS分析揭示一級野生型hPCSK9及 1D05/野生型hPCSK9複合物裂解位點（參見圖7A及圖7B及 下表5)。表5說明在AspN與野生型PCSK9及1D05/野生型 hPCSK9複合物一起培育5分鐘之後所獲得的野生型 hPCSK9片段肽。斜體字為僅在野生型hPCSK9水解時所形 成之肽。 表5 m/z量測值 MW預斯值 V：肽:： 所裂解之AA Asp 169 1969.1 1969.1 153-168 2222.0 2222.0 31-49 Asp49 4412.9 4411.2 698-737 Asp698 m/z為1969.1，來源於在Aspl69處裂解且匹配野生型 hPCSK9之催化結構域之肽153-168的理論質量之物質僅在 野生型hPCSK9樣品中形成，其指示在1D05/野生型-hPCSK9複合物中此殘基受到1D05 Fab結合的保護以免於 蛋白水解。在野生型hPCSK9與1D05/野生型hPCSK9水解 中均形成若干物質。詳言之，m/z為2222.0及4412.9，對應 於野生型hPCSK9之前結構域之肽3 1-49及催化結構域之肽 698-737的離子係來源於Asp49及Asp698處之裂解。 在較長内切蛋白酶AspN培育時間（亦即’ 15、30分鐘）下 MALDI-MS譜中所展示之肽概況與圖7A及圖7B中所示在5 分鐘内切蛋白酶AspN培育下之肽概況相比並未顯著改 變，從而確證在1D05/野生型PCSK9相互作用中Aspl69受 到保護以免於水解。 應注意所觀察到之質量預期值與質量量測值之間的符合 137316.doc •90· 200938552 程度在此類實驗之標準範圍内’此係因為必須用外標進行 質量校正。 使用内切蛋白酶GluC進行之限制性蛋白水解：汽切蛋台 酶GluC以C-末端方式裂解Glu殘基。GluC與野生型 hPCSK9、1D05/野生型hPCSK9複合物及1D05之培育係在 蛋白質與蛋白水解酶之間呈1〇〇〇八及l〇〇/l(w/w)的比率下 進行。為偵測一級裂解位點，在培育5、15及30分鐘之後 進行樣品之MALDI-MS分析。在野生型hPCSK9蛋白質中 裂解而在1D05/野生型hPCSK9複合物中受到保護之野生型 hPCSK9殘基及在MS譜中偵測到之相應肽展示於圖8A-圖 8H及下表6中。表6說明GluC與野生型PCSK9及1D05/野生 型PCSK9複合物一起培育15分鐘後所獲得之肽片段。斜體 字為來源於野生型PCSK9而非來源於複合物之肽。 表6 m/z量測值 .._MW預期值:： 肽 所裂&> AA 1675.9 1675.8 182-195 Glul81 ___Glul95 1918.0 1918.0 182-197 GIu181 G/r/707 2213.2 2213.1 153-170 Glul7〇 3357.4 3357.7 153-181 --G1u181 在内切蛋白酶GluC之情況下，保護係展示於包括殘基 Glul70、Glul97及Glul95之野生型hPCSK9表面區域中。 m/z為33 57.4、對應於肽153-181且在01\1(：與野生型111)(：5〖9 一起培育以及GluC與1D05/野生型hPCSK9 —起培育中均獲 得之物質指示Glul81並未受到Fab 1D05與野生型hpcSK9 結合的保護。 137316.doc -91 - 200938552 使用肤蛋白酶進行之限制性蛋白水解：氟蚤白酶认c-先 端方式裂解Arg及Lys殘基。將該酶以1000(w/w)比率添加 至野生型PCSK9、1D05/野生型PCSK9複合物及1D05中歷 時5、15及30分鐘。野生型PCSK9及1D05/野生型PCSK9複 合物的MALDI-MS分析展示於圖9A-圖9D中且最相關之肽 片段報導於表7中。表7說明胰蛋白酶與野生型PCSK9及 1D05/野生型PCSK9複合物一起培育5分鐘後所獲得之肽片 段。斜體字為來源於野生型PCSK9而非來源於複合物之 肽。 表7 m/z量測值 MW預期值 肽 所裂解之AA 1877.9 1878.0 31-46 Arg46 2279.3 2279.5 200-218 Argl99 Arg218 2581.9 2581.9 706-729 Arg705 Arg729 3562.9 3562.9 706-737 Arg705 3909.9 3910.2 166-199 Arg 165 Arg 199 4474.6 4474.9 161-199 Argl60 Arg 199 5410.5 5410.8 168-215 Argl67 Arg215 5729.7 5730.2 166-215 Arg 165 Arg215 5850.8 5851.3 168-218 Arg 167 Ar^218 6170.2 6170.7 166-218 Argl65 Arg218 7290.7 7291.0 153-215 Arg215 7731.5 7731.5 153-218 Arg218 5分鐘胰蛋白酶培育下之一級裂解位點為野生型hPCSK9 之前結構域上的Arg46及野生型hPCSK9之催化結構域上的 Argl60、Argl65、Argl67、Argl99、Arg215、Arg218、 137316.doc -92- 200938552 八^705及入^729 °111/2為 2279.3、3909.9及4474.6，對應於 肽200-218、166-1 99及161-199之物質僅在野生型hPCSK9 水解中偵測到且指示殘基Argl99受到1D05結合的保護。此 等肽片段以及 m/z為 5410.5、5729.7、5850.8、6170.2，對 應於肽 168-215、166-215、168-218、166-218，僅在野生 型PCSK9中偵測到之物質因此指示亦對殘基Argl65及 Argl67存在保護。 在15分鐘胰蛋白酶培育下，確證對殘基Argl99之保護。 實際上，m/z 為 2280.0、3591.4、3910.9及 4475.6，皆來源 於Argl99處裂解之物質僅存在於野生型PCSK9水解中且變 得更大量。此外，偵測到在Argl94處之保護（如野生型 PCSK9譜中存在m/z為3325.7之物質所示）。來源於Argl65 及 Arg 167 處之裂解的物質（m/z為 5411.5、5730.9、5851.8 及6171·6)存在於野生型hPCSK9水解中且亦在1D05/野生型 hPCSK9複合物蛋白水解中開始以較低強度出現。此可指 示對該等殘基之保護以免於蛋白水解係應歸於Fab之位 阻，而非1D05與野生型PCSK9殘基之間的初級接觸。 .餘术··藉由使用三種具有不同特異性之酶進行LP-MS ’ 鑑別在1D05-野生型hPCSK9中受到1D05 Fab保護之野生型 hPCSK9表面區域。Argl65、Argl67、Aspl69、Glul7〇、 Argl94、Glul97及Argl99為結合1D05 Fab後受到保護之野 生型hPCSK9殘基（參見圖1〇)。此等殘基屬於野生型 hPCSK9之催化結構域中且暴露於分子之表面上（參見圖 11)。此外厂用膜蛋白酶進行之限制性蛋白水解展示殘基 137316.doc -93- 200938552 194-199與1D05結合直接相關之可能性，而對殘基Argl65 及Argl 67之保護以免於蛋白水解可能係應歸於Fab之位 阻，而非1D05與野生型PCSK9殘基之間的直接接觸。 肽R194-R199中之殘基在人類及小鼠PCSK9中為保守 的。1D05 Fab識別人類及小鼠蛋白質。如由人類PCSK9與 小鼠PCSK9之間的序列比對（參見圖12)所示，包括於野生 型PCSK9之肽194-199中且受到1D05保護之殘基在人類 PCSK9與小鼠PCSK9中均為保守的，而肽165-169中之殘基 (亦受到1D05結合保護）則不為保守的。此將支持僅有殘基 194-199與1D05直接相互作用而其它殘基（165-169)受到位 阻保護以免於蛋白水解之假設。 實例13 PCSK9 / 1D05 TR-FRET檢定 如先前所述使用4種AlexaFluor 647等效物（Invitrogen)標 記並純化抗V5抗體（QED Biosciences)(參見Fisher等人， 2007 J•价〇/· C/zew. 282(28): 20502-20512)。使用 5種 Eu(W8044)-DTA等效物（Perkin-Elmer)以類似方式標記 1D05 IgG。對物質加以保護以避光且將其在使用之前儲存 於4°C下。如先前所述產生V5/His-PCSK9(參見Fisher等 人，同上）。 在黑色 Microfluor 2 96 孔板（Dynex Technologies)中於 10 mM Hepes pH 7.4、150 mM NaCl、100 μΜ CaCl2及 0.05% BSA中進行TR-FRET檢定。向25 jxL 20 nM每一經AF647標 記之抗V5抗體及V5/His-PCSK9中添加連續稀釋之未標記 137316.doc -94- 200938552 候選抗體（亦即，1D05及lB20)(Fab或IgG)。將試劑在室溫 下平衡約15分鐘且接著添加Eu(W8044)-lD05 IgG以得到 1.5 nM經Eu標記之抗體的最終濃度（在Fl62。nm下約18000個 計數；S/B=12)及50 gL之總體積。之後，如先前所述在 BMG LabTech Rubystar讀取器中讀取平衡檢定（Fisher等 人，同上）。數據以Fl665/Fl620xlOOOO報導。使用擬合至S形 劑量反應曲線之數據使用非線性回歸分析（Kaleidagraph 4.03，Synergy Software)測定 IC50。 圖13圖示在PCSK9-1D05相互作用TR-FRET檢定中對 1D05及不同抗體1B20之分析。兩種Fab均有效且完全抑制 該相互作用。圖14說明在所述Exopolar檢定中（例如在實例 9 中）1B20 對 PCSK9 之抑制作用。lB20Fab 以 152nM(n=5)之 IC5〇抑制鼠類PCSK9 ;且以145 nM(n=5)之IC5〇抑制人類 PCSK9。IB20 IgG以 13 nM之 IC5〇抑制鼠類 PCSK9 ;且以 22 nM之I5GC抑制人類PCSK9。1B20 Fab之結合特點示於下表 中〇 表8 hPCSK9v5His mPCSK9v5His ka (1/Ms) 6.6E+04±6.1E+03 1·41Ε+05± 1.2E+04 kd (1/s) 4.8E-05 ± 7.4E-06 7.18E-05 ± 2.9E-06 Ka(1/M) 1.5E+09±3.0E+08 2.0E+09 士 1-5E+08 Kd(M) 7.4E-10±1.6E-10 5.1E-10±3.8E-11 實例14 1D05恆河猴PK/PD研究 為表徵1D05之藥物動力學、藥效學及目標接合，在雄性 恆河狼中以3 mg/kg(7.0-9.6 kg，n=3)進行單次IV劑量研 137316.doc -95- 200938552 究。此研究中所用之所有恆河猴均未用過生物製劑。 經由頭靜脈對猴子給予1D05之單次IV劑量。在給藥後 的指定時間點自隱靜脈/股動脈血管收集血樣，且將所得 血聚/血清在進行分析之前儲存於-70 °C下。 於100 mM組胺酸、100 mM精胺酸、6%蔗糖（pH 6.0)中 以47.2 mg/mL製備1D05之給藥溶液。將給藥溶液儲存於 4 °C下且在給藥期間保持於濕冰上。 如下所述進行血清樣品之脂蛋白分析。使用市售試劑進 行抗人類IgGELISA以量化1D05含量。 如圖15所示，1D05在3 mpk下使LDL-C降低約50%，且 歷時約16日觀察到225%之LDL-C降低。1〇05之t1/2(圖16) 為77小時。 實例15 1D05恆河猴PK/PD研究之血漿/血清樣品的脂蛋白分析 為產生脂蛋白概況，將企黎·或血清藉由於Superose-6尺 寸排除管柱（GE LifeSciences，Inc)上層析而分顧。用市售 酶比色膽固醇债測試劑（Total Cholesterol E, Wako USA)經 由管線内混合物連續量測管柱流出物中之總膽固醇含量， 隨後在600 nm吸光度下進行反應產物之下游分光光度偵 測。自管柱溶離之膽固醇的第一個峰係歸屬為VLDL，第 二個峰係歸屬為LDL且第三個峰係歸屬為HDL ;使用 HPLC提供之軟體計算各峰下之面積。為計算各脂蛋白溶 離份之膽固醇濃度，將相應峰面積與總峰面積之比率乘以 樣品中所量測之總膽固醇濃度。 137316.doc -96- 200938552 【圖式簡單說明】 圖1說明編碼mPCSK9 2CX1D05 Fab重鏈及輕鏈之Fab表 現載體 pMORPH_x9_MH。 圖2說明1D05在PCSK9-LDLR相互作用TR-FRET檢定中 之活性。1D05之Fab與IgG均有效且完全抑制該相互作用。 對於該實驗而言，[AF647-PCSK9] = 10nM, [Eu-sLDLR]為 約1·5 nM(在FI62〇nm下約20000個計數）。 圖3A-圖3D說明（i)lD05(Fab)對鼠類PCSK9依賴性細胞 LDL-吸收損失的劑量依賴性抑制作用（圖3A); (ii)lD05(IgG)對鼠類PCSK9依賴性細胞LDU吸收損失的劑 量依賴性抑制作用（圖3B) ; (iii)lD〇5(Fab)對人類pCSK9依 賴性細胞LDL-吸收損失的劑量依賴性抑制作用（圖3C);及 (iv) lD05(IgG)對人類PSCK9依賴性細胞LDL、吸收損失的劑 量依賴性抑制作用（圖3D)。1D05明確與A_pcSK9與小鼠 PCSK9兩者交叉反應。圖3八_圖30具有兩個對照：（i)單獨 細胞組’其展示細胞LDL吸收之基礎程度，及（i〇細胞 +PCSK9(5 pg/ml)對照，其展示PCSK9依賴性Ldl吸收損失 的程度。含有1D05及PCSK9之滴定實驗係在圖中所示之固 定PCSK9濃度（5 pg/ml)及遞增1D05濃度下進行。如所示， 1D05可抑制PCSK9對細胞ldl吸收之作用。1D〇5(Fab)對 於小鼠及人類PCSK9蛋白之IC5〇分別為97 _及144 nM。 lD05(IgG)對於小鼠及人類pcSK9蛋白之ICs〇分別為85 nM 及 79 nM。 圖4A及圖4B說明1D〇5(Fal^IgG，分別）對pcsK9内在化 137316.doc -97- 200938552 的抑制作用及LDL吸收之恢復。將HepG2細胞平板接種且 接著將AlexaFluor標記之PCSK9及LDL添加至細胞中且在 37°C下培育4小時。培育之後，使用共焦顯微術測定經細 胞内在化之PCSK9或LDL的量。對照包括除添加50X(250 pg/ml)未標記PCSK9(50X冷野生型（Cold Wt))外亦添加單獨 細胞（未處理）及單獨AF標記之PCSK9。除添加5 gg/ml野生 型AF標記之PCSK9及10 pg/ml AF標記之LDL外，亦添加遞 增量之1D05 Fab(圖A)或IGG(圖B)，從而引起隨後對 PCSK9内在化至細胞中之抑制及LDL吸收之恢復。此等研 究共同表明Fab與IgG均阻止PCSK9内在化至細胞中。 圖5說明由一組連接符號表示之每隻小鼠之LDL含量； LDL之變化（取血後-取血前）顯示為每一處理組之平均值 (△mg/dL)。用PBS處理對LDL量測無影響（-4 mg/dL，降低 5%)。相比之下，用1D05完整IgG處理使血清LDL降低 20%(-19 mg/dL)且用1D05之Fab片段使血清LDL降低34% (-24 mg/dL)。 圖6說明以下同型之恆定結構域之序列比較：IgGl(SEQ ID NO: 21 ;其Fc結構域由SEQ ID NO: 21之殘基110-130表 示）、IgG2(SEQ ID NO: 22，其 Fc 結構域由 SEQ ID NO: 22 之殘基107-326表示）、IgG4(SEQ ID NO: 23 ;其Fc結構域 由 SEQ ID NO: 23 之殘基 107-327表示）及 IgG2m4(SEQ ID NO: 24;其Fc結構域由SEQ ID NO: 24之殘基107-326表 示）。 圖7A及圖7B說明藉由a)野生型PCSK9及b)lD05/野生型 137316.doc • 98- 200938552 PCSK9複合物經AspN限制性蛋白水解5分鐘所產生之肽片 段。圖7A中之星形強調存在於野生型PCSK9光譜中之肽片 段，其在1D05/野生型PCSK9光譜中未偵測到。因此天冬 胺酸殘基169在複合物中受到保護。 圖8A-圖8H說明藉由野生型PCSK9(圖8A-圖8D)及1D05/ 野生型PCSK9複合物（圖8E-圖8H)經GluC限制性蛋白水解 15分鐘所產生之肽片段。 圖9A-圖9D說明藉由a)野生型PCSK9及b)lD05/野生型 PCSK9複合物經胰蛋白酶限制性蛋白水解5分鐘所產生之 肽片段。圖9C-圖9D分別說明同一光譜之縮放視圖。圖9A 及圖9C中之星形強調存在於野生型PCSK9光譜中之肽片 段，其在1D05/野生型PCSK9光譜中未偵測到。 圖10說明與結合1D05中和Fab相關之野生型PCSK9催化 結構域之一級序列的殘基。將限制性蛋白水解實驗中受到 1D05結合保護之野生型PCSK9之肽片段加框。 圖11說明與結合1D05中和Fab有關之野生型PCSK9催化 結構域之肽。在限制性蛋白水解實驗中受到1D05結合保護 之野生型PCSK9之肽以野生型PCSK9之結構的縮放視圖中 R194與R199之間，及A168與R165之間的鏈段描繪。 圖12A及圖12B說明所鑑別之人類PCSK9之一般抗原決定 基區（SEQ ID NO: 39)與鼠類PCSK9之一般抗原決定基區 (SEQ ID NO: 41)之間的序列比對。一致序列（SEQ ID NO: 40)提供為圖12A之第二序列。由圖中可見，包括於受保護 肽194-199中之殘基在兩種物種之間為保守的，而肽165- 137316.doc -99- 200938552 169中之殘基則不為保守的。 圖13說明在PCSK9-1D05相互作用TR-FRET檢定中對 1D05及不同抗體1B20之分析。兩種Fab均有效且完全抑制 該相互作用。對於該實驗而言，[AF647-a-V5] = 10 nM， [PCSK9] = 10 nM 及[Eu(8044)-lD05(IgG)]為約 1.5 nM(在 Fl62〇 nm下約18000個計數）。 圖14A-圖14D說明在Exopolar檢定中1B20為PCSK9功能 之完全抑制劑。 圖15說明在恆河猴中在3 mpk下1D05使LDL-C降低約 50%。所繪製曲線為在抗體治療之單次IV劑量之後，在不 同測試時間點的血清中之LDL變化百分比。 圖16說明1D05在所示劑量水準下之藥物動力學概況。所 繪製曲線為在抗體之單次IV劑量之後，在測試時間點的血 清藥物（1D05)含量。1D05之半衰期為77小時。 137316.doc 100- 200938552 序列表 <11〇> 美國默克大藥廠 <120> 1D05PCSK9 拮抗劑 <130> MRL-ACV-22542 <140> 098103553 <141> 2009-02-04 <150> 61/063,949 <151> 2008-02-07 <150> 61/066,577 <151> 2008-02-21 ❹ <160> 42 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LC; m2CXlD05 <400> 1
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Ser Ala 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Gly Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asp Gly Asp Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160
Ser val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Ala 210 137316·序列表.doc 200938552 <210> 2 <211> 639 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LC; m2CXlD05 <400> 2 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc attacctgca gagcgagcca gggtattcgt ggtaaagcac cgaaactatt aatttataat cgttttagcg gctctggatc cggcactgat gaagactttg cggtttatta ttgccagcag acgaaagttg aaattaaacg tacggtggct gatgaacaac tgaaaagcgg cacggcgagc cgtgaagcga aagttcagtg gaaagtagac agcgtgaccg aacaggatag caaagatagc agcaaagcgg attatgaaaa acataaagtg agcagcccgg tgactaaatc ttttaatcgt <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 tctgctctga attggtacca gcagaaacca 120 ggttctactt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 tttgatggtg atcctacctt tggccagggt 300 gctccgagcg tgtttatttt tccgccgagc 360 gtggtgtgcc tgctgaacaa cttttatccg 420 aacgcgctgc aaagcggcaa cagccaggaa 480 acctattctc tgagcagcac cctgaccctg 540 tatgcgtgcg aagtgaccca tcaaggtctg 600 ggcgaggcc 639 <220> <223> VL CDR 1; m2CXlD05 <400> 3
Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Ser Ala Leu Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VL CDR 1; m2CXlD05 <400> 4 agagcgagcc agggtattcg ttctgctctg aat 33 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VL CDR2; m2CXlD05 <400> 5
Leu Leu lie Tyr Asn Gly Ser Thr Leu Gin Ser 15 10 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> 137316-序列表.doc 200938552 <223> VL CDR2; m2CXlD05 <400> 6 ctattaattt ataatggttc tactttgcaa age <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VL CDR3; m2CXlD05 <400> 7
Gin Gin Phe Asp Cly Asp Pro 1 5 ❹
<210> β <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VL CDR3； m2CXlD05 <400> 8 cagcagtttg atggtgatcc t <210> 9 <211> 255 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Fd鏈；m2CXlD05 <400> 9
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Ser His 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie Asn Pro He Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Tyr Glu lie Gin lie Gly Arg iyr Gly Met Asn val Tyr 100 105 110
Tyr Leu Met Tyr Arg Phe Ala Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 180 185 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205
Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220 -3- 137316-序列表.doc 200938552
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Glu Gin Lys Leu lie 225 230 235 240
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro His His His His His His 245 250 255 <210> 10 <211> 765 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> Fd鏈；m2CXlD05 <400> 10 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cacttttaat tctcatgcta tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcaatccga ttcttggcat tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtcattat 300 gagattcaga ttggtcgtta tggtatgaat gtttattatc ttatgtatcg ttttgcttct 360 tggggccaag gcaccctggt gacggttagc tcagcgtcga ccaaaggtcc aagcgtgttt 420 ccgctggctc cgagcagcaa aagcaccagc ggcggcacgg ctgccctggg ctgcctggtt 480 aaagattatt tcccggaacc agtcaccgtg agctggaaca gcggggcgct gaccagcggc 540 gtgcatacct ttccggcggt gctgcaaagc agcggcctgt atagcctgag cagcgttgtg 600 accgtgccga gcagcagctt aggcactcag acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg 660 agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa ccgaaaagcg aattcgagca gaagctgatc 720 tctgaggagg atctgaacgg cgcgccgcac catcatcacc atcac 765 <210> 11 <211> 131 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VH? m2CXlD05 <400> 11
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Ser His 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie Asn Pro lie Leu Gly He Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Tyr Glu He Gin lie Gly Arg Tyr Gly Met Asn Val Tyr 100 105 no
Tyr Leu Met Tyr Arg Phe Ala Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125
Val Ser Ser 130 <210> 12 <211> 393 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VH; m2CX!D05 -4· 137316-序列表.doc 200938552 <400> 12 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cacttttaat tctcatgcta tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcaatccga ttcttggcat tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtcattat 300 gagattcaga ttggtcgtta tggtatgaat gtttattatc ttatgtatcg ttttgcttct 360 gcaccctggt gacggttagc tea 393 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VH CDR1； m2CXlD05 <400> 13
Gly Gly Thr Phe Asn Ser His Ala lie Ser 1 5 10
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His Tyr Glu lie Gin lie Gly Arg Tyr Gly Met Asn Val Tyr Tyr Leu 1 5 10 15
Met Tyr Arg Phe Ala Ser 20 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VH CDR3; m2CXlD05 <400> 18 cattatgaga ttcagattgg tcgttatggt atgaatgttt attatcttat gtatcgtttt 60 gcttct 66
<210> 19 <211> 6 <212> PRT < 213 >人^工序列 <220> <223>内部加工位點 <400> 19
Ser Ser val Phe Ala Gin 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213 >人工序列 <220> <223>内部加工位點 <400> 20
Ser lie Pro Trp Asn Leu
i 5 Q <210> 21 <211> 330 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>含有IgGl之Fc結構域 <400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 7〇 75 80 -6 - 137316-序列表.doc 200938552
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 22 <211> 326 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>含有IgG2之Fc結構域 <400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 137316·序列表.doc 200938552 180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205
Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320
Ser Leu ser Pro Gly Lys 325 <21〇> 23 <211> 327 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>含有IgG4之Fc結構域 <400> 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205
Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 137316-序列表.doc 200938552
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 290 295
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 305 310
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
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<210> 24 <211> 326 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉含有IgG2m4之Fc結構域 <400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 20
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Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 85
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 100
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Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 245
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 290 295
Ser Val Met His Glu Ala Leu His 305 310
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 10 15
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30
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Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 125
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 140
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Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp 185 190
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Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 220
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 235 240
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 250 255
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 285
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 300
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Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Ser His 20 25 30
Ala He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie Asn Pro lie Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Tyr Glu lie Gin lie Gly Arg Tyr Gly Met Asn Val Tyr 100 105 110
Tyr Leu Met Tyr Arg Phe Ala Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 X20 125
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 180 185 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly 195 200 205
Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys Val 260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr 275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300
Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335
Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin 340 345 350
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 26 <211> 213 •10- 137316-序列表.doc 200938552 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> lD05IgG輕鏈 <400> 26
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Ser Ala 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Gly Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223> VL; m2CXXD05 <400> 27
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr 工le Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Ser Ala 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 4S
Tyr Asn Gly Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asp Gly Asp Pro Thr 85 90 95
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tcccaggcag ggaccaagac aggtgaacca tgttgttaca ctctatttgt 1680 aacaagggga aagagagtgg acgccgacag cagcggactc cactggttgt ctctaacacc 1740 cccgaaaatt aaacggggct ccacgccaat ggggcccata aacaaagaca agtggccact 1800 cttttttttg aaattgtgga gtgggggcac gcgtcagccc ccacacgccg ccctgcggtt i860 ttggactgta aaataagggt gtaataactt ggctgattgt aaccccgcta accactgcgg 1920 tcaaaccact tgcccacaaa accactaatg gcaccccggg gaatacctgc ataagtaggt 1980 gggcgggcca agataggggc gcgattgctg cgatctggag gacaaattac acacacttgc 2040 -15- 137316-序列表.doc 200938552 gcctgagcgc tgggctaatg ctaatctata ctaatctata ctaatctata ctaatctgta ctaatttata tctatatctg tctatatctg tttatatctg tctatatctg tgcatataca gccgccacct tttaaacatt gagaaaatac atgtacattt agttattaat gttacataac acgtcaataa tgggtggagt agtacgcccc atgaccttat atggtgatgc tttccaagtc gactttccaa cggtgggagg catccacgct gaacggtgca gtctataggc atacaccccc attgaccatt atggctcttt tgacacggac tacaacacca cgaatctcgg tccgagccct acagtggagg gccgtggcgg gcagatggaa tgataagagt tgagcagtac ctgttccttt catgagtgtg cgatatccag cattacctgc aggtaaagca ccgttttagc tgaagacttt tacgaaagtt tgatgagcag cagagaggcc gagtgtcaca gagcaaagca gagctcgccc tgccttctag aaggtgccac gtaggtgtca aagacaatag tgcggccctg cagaagtatg ctccccagca gcccctaact tggctgacta ccagaagtag catggccacc gccccagggt caagcacagg ttgccatggg tctgggtagc tctgggtagt tctgggtagc tccgggtagc tctgggtagc ggtagcatat ggtagcatat ggtagcatag ggtagtatat gtcagcatat cccaaggggg taaatggatc cgcatcagat atattggctc agtaatcaat ttacggtaaa tgacgtatgt atttacggta ctattgacgt gggactttcc ggttttggca tccaccccat aatgtcgtaa tctatataag gttttgacct ttggaacgcg ccaccccctt gcttcctcat attgaccact gccacaactc tctgtatttt ccgtccccag gtacgtgttc gctcccatgc ccagacttag tagggtatgt gacttaaggc cagaggtaac tcgttgctgc ccatgggtct cccactcagg atgacccaga agagcgagcc ccgaaactat ggctctggat gcggtttatt gaaattaaac ttgaaatctg aaagtacagt gagcaggaca gactacgaga gtcacaaaga ttgccagcca tcccactgtc ttctattctg caggcatgct tggaatgtgt caaagcatgc ggcagaagta ccgcccatcc atttttttta tgaggaggct tcagcaagtt gagaaagtcc gttgttggtc tagcatatac ataggctatc atatgctatc atatgctatc atatgctatc atatactacc gctatcctaa gctatcctaa gctatcctaa gctatcctaa gatacccagt cgtgaatttt cgcaccatat tggctattgg atgtccaaca tacggggtca tggcccgcct tcccatagta aactgcccac caatgacggt tacttggcag gtacatcaat tgacgtcaat caactccgcc cagagctcgt ccatagaaga gattccccgt ggcttcttat gttataggtg cccctattgg tctttattgg tacaggatgg tgcccgcagt cggacatggg ctccagcgac gcacagcacg gtctgaaaat agcggcagaa tcccgttgcg cgcgcgcgcc tttctgcagt tcctggggtt gcccgtctag agggtattcg taatttataa ccggcactga attgccagca gtacggtggc gaactgcctc ggaaggtgga gcaaggacag aacacaaagt gcttcaacag tctgttgttt ctttcctaat gggggtgggg ggggatgcgg gtcagttagg atctcaatta tgcaaagcat cgcccctaac tttatgcaga tttttggagg cccacttgaa aagccatgta ctcatattca tacccaaata ctaatctata ctaatttata ctaatctata ctaatagaga caaatatctg tctatatctg tctatatctg tctatatctg tctgtatccg agtagagtgg cgctgcttgt gcggtgtgaa ccattgcata ttaccgccat ttagttcata ggctgaccgc acgccaatag ttggcagtac aaatggcccg tacatctacg gggcgtggat gggagtttgt ccattgacgc ttagtgaacc caccgggacc gccaagagtg gcatgctata atggtatagc tgacgatact ctatatgcca ggtctcattt ttttattaaa ctcttctccg tcatggtcgc atgcccacca gagcgtggag gaagatgcag gtgctgttaa accagacata caccgtcctt gctgctgctg cctgagcgcg ttctgctctg tggttctact ttttaccctg gtttgatggt tgcaccatct tgttgtgtgc taacgccctc cacctacagc ctacgcctgc gggagagtgt gcccctcccc aaaatgagga tggggcagca tgggctctat gtgtggaaag gtcagcaacc gcatctcaat tccgcccagt ggccgaggcc cctaggcttt caaaaacatc tatctgggtt cgaggtcgct tctggatagc tctgggtagc tctgggtagc tctgggtagt ttagggtagt gatagcatat ggtagcatag ggtagtatat ggtagcatat ggtagcatat gagtgctatc ccttttcctg ataccgcaca cgttgtatcc gttgacattg gcccatatat ccaacgaccc ggactttcca atcaagtgta cctggcatta tattagtcat agcggtttga tttggcacca aaatgggcgg gtcagatcgc gatccagcct acgtaagtac ctgtttttgg ttagcctata ttccattact atacactgtc attatttaca cataacgtgg gtagcggcgg tcggcagctc ccaccagtgt attgggctcg gcagctgagt cggtggaggg atagctgaca gacacgaagc tggcttacag agcgtgggtg aattggtacc ttgcaaagcg accattagca gatcctacct gtcttcatct ctgctgaata caatcgggta ctcagcagca gaagtcaccc taggcggccg cgtgccttcc aattgcatcg cagcaagggg ggccgctgag tccccaggct aggtgtggaa tagtcagcaa tccgcccatt gcctctgcct tgcaaaaagc aagcaaatgt gatggtactg gagagcacgg atatgctatc atatgctatc ataggctatc atatgctatc atatgctatc gctatcctaa gctatcctaa gctatcctaa gctatcctaa gctatcctca ctttgcatat cggcgcgccg gatgcgtaag atatcataat attattgact ggagttccgc ccgcccattg ttgacgtcaa tcatatgcca tgcccagtac cgctattacc ctcacgggga aaatcaacgg taggcgtgta ctggagacgc ccgcggccgg cgcctataga cttggggtct ggtgtgggtt aatccataac cttcagagac aattcacata gatctccacg agcttctaca cttgctccta gccgcacaag cacggctgac tgttgtattc cagtgtagtc gactaacaga ttgccgccac atgccagatg atcgtgtgac agcagaaacc gggtcccgtc gcctgcaacc ttggccaggg tcccgccatc acttctatcc actcccagga ccctgacgct atcagggcct cgatctgctg ttgaccctgg cattgtctga gaggattggg atctggccgc ccccagcagg agtccccagg ccatagtccc ctccgcccca ctgagctatt tgtcgaccac acttgtgcct gagaaggact 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 137316-序列表.doc •16· 200938552
❹ gcgctgcaaa acccgcaccc tggactgtga gcccaagtgt gtagaagagt tacctgagtg 6060 gaattttgat ggctctagta cctttcagtc tgagggctcc aacagtgaca tgtatctcag 6120 ccctgttgcc atgtttcggg accccttccg cagagatccc aacaagctgg tgttctgtga 6180 agttttcaag tacaaccgga agcccgcaga gaccaattta aggcactcgt gtaaacggat 6240 aatggacatg gtgagcaacc agcacccctg gtttggaatg gaacaggagt atactctgat 6300 gggaacagat gggcaccctt ttggttggcc ttccaatggc tttcctggac cccaaggtcc 6360 gtattactgt ggtgtgggcg cagacaaagc ctatggcagg gacatcgtgg aggctcacta 6420 ccgcgcctgc ttgtatgctg gggtcaagat tacaggaaca aatgctgagg tcatgcctgc 6480 ccagtgggag ttccaaatag gaccctgtga aggaatccgc atgggagatc atctctgggt 6540 ggcccgtttc atcttgcatc gagtatgtga agactttggg gtaatagcaa cctttgaccc 6600 caagcccatt cctgggaact ggaatggtgc aggctgccat accaacttta gcaccaaggc 6660 catgcgggag gagaatggtc tgaagcacat cgaggaggcc atcgagaaac taagcaagcg 6720 gcaccggtat cacattcgag cctacgatcc caaggggggc ctggacaatg cccgtggtct 6780 gactgggttc cacgaaacgt ccaacatcaa cgacttttct gctggtgtcg ccaatcgcag 6840 tgccagcatc cgcattcccc ggactgtcgg ccaggagaag aaaggttact ttgaagaccg 6900 ccgcccctct gccaattgtg acccctttgc agtgacagaa gccatcgtcc gcacatgcct 6960 tctcaatgag actggcgacg agcccttcca atacaaaaac taagtcgaca acttgtttat 7020 tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 7080 tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 7140 gatcggcgcg ccggccgctg cggccaggtg ctgaagaatt gacccggttc ctcctgggcc 7200 agaaagaagc aggcacatcc ccttctctgt gacacaccct gtccacgccc ctggttctta 7260 gttccagccc cactcatagg acactcatag ctcaggaggg ctccgccttc aatcccaccc 7320 gctaaagtac ttggagcggt ctctccctcc ctcatcagcc caccaaacca aacctagcct 7380 ccaagagtgg gaagaaatta aagcaagata ggctattaag tgcagaggga gagaaaatgc 7440 ctccaacatg tgaggaagta atgagagaaa tcatagaatt tcttccgctt cctcgctcac 7500 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 7560 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 7620 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 7680 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 7740 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 7800 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg 7860 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 7920 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 7980 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 8040 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 8100 aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 8160 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 8220 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 8280 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 8340 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 8400 tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 8460 ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccggggg gggggggcgc tgaggtctgc 8520 ctcgtgaaga aggtgttgct gactcatacc aggcctgaat cgccccatca tccagccaga 8580 aagtgaggga gccacggttg atgagagctt tgttgtaggt ggaccagttg gtgattttga 8640 acttttgctt tgccacggaa cggtctgcgt tgtcgggaag atgcgtgatc tgatccttca 8700 actcagcaaa agttcgattt attcaacaaa gccgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct 8760 ctgccagtgt tacaaccaat taaccaattc tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg 8820 aaactgcaat ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg 8880 taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc 8940 tgcgattccg actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag 9000 gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt 9060 atgcatttct ttccagactt gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact 9120 cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc 9180 gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag 9240 cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt 9300 cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat 9360 ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc 9420 attggcaacg ctacctttgc catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata 9480 caat 9484 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213>人工序列 17- 137316-序列表.doc 200938552 <220> <223>引子 <400> 33 acagatgcca gatgcgatat ccagatgacc caga <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 34 tgcagccacc gtacgtttaa tttcaacttt cgtacc <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 35 acaggtgtcc actcgcaggt gcaattggtt cagtct <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 36 gcccttggtg gatgctgagc taaccgtcac cagggt <21Q> 37 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>抗原決定基結構域 <400> 37
Arg Glu lie Glu Gly Arg 1 5 <210> 38 <211> 585 <212> PRT <213>智人 <400> 38
Ser lie Pro Trp Asn Leu Glu Arg lie Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala 15 10 15
Asp Glu Tyr Gin Pro Pro Asp Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu 20 25 30
Leu Asp Thr Ser lie Gin Ser Asp His Arg Glu lie Glu Gly Arg Val 35 40 45
Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg phe 18- 137316-序列表.doc 200938552 50 55 60
His Arg Gin Ala Ser Lys Cys Asp Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly 65 70 75 80
Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg 85 90 95
Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gin Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr 100 105 110
Leu lie Gly Leu Glu Phe lie Arg Lys Ser Gin Leu Val Gin Pro Val 115 120 125
Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val 130 135 140
Leu Asn Ala Ala Cys Gin Arg Leu Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val 145 150 155 160
Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala 165 170 175
Ser Ala Pro Glu Val lie Thr Val Gly Ala Thr Asn Ala Gin Asp Gin 180 185 190
Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp 195 200 205
Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp lie lie Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser 210 215 220
Thr Cys Phe Val Ser Gin Ser Gly Thr Ser Gin Ala Ala Ala His Val 225 230 235 240
Ala Gly lie Ala Ala Met Met Leu Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu 245 250 255
Ala Glu Leu Arg Gin Arg Leu lie His Phe Ser Ala Lys Asp Val lie 260 265 270
Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp Gin Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu 275 280 285
Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr His Gly Ala Gly Trp Gin Leu Phe 290 295 300
Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr 305 310 315 320
Ala lie Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser 325 330 335
Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gin Gly 340 345 350
Gly Lys Leu val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val 355 360 365
Tyr Ala lie Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gin Ala Asn Cys Ser Val 370 375 380
His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys 385 390 395 400
His Gin Gin Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val 405 410 415
Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gin 420 425 430
Pro Asn Gin Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser lie His Ala Ser Cys 435 440 445
Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu His Gly lie Pro 450 455 460
Ala Pro Gin Glu Gin Val Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu 465 470 475 480
Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr 485 490 495
Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr 500 505 510
Gly Ser Thr Ser Glu Glu Ala Val Thr Ala Val Ala lie Cys Cys Arg 515 520 525
Ser Arg His Leu Ala Gin Ala Ser Gin Glu Leu Gin Lys Gly Asn Ser 530 535 540
Ala Asp lie Gin His Ser Gly Gly Arg Ser Ser Leu Glu Gly Pro Arg 545 550 555 560
Phe Glu Gly Lys Pro lie Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 565 570 575
Arg Thr Gly His His His His His His •19- 137316·序列表.doc 200938552 580 585 <210> 39 <211> 53 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類抗原決定基區 <400> 39
Ser lie Pro Trp Asn Leu Glu Arg lie Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala 15 10 15
Asp Glu Tyr Gin Pro Pro Asp Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu 20 25 30
Leu Asp Thr Ser lie Gin Ser Asp His Arg Glu lie Glu Gly Arg Val 35 40 45
Met Val Thr Asp Phe 50 <210> 40 <211> 37 <212> PRT <213>人工序列 <220> c223> —致抗原決定基區 <400> 40
Ser lie Pro Trp Asn Leu Glu Arg lie Pro Glu Pro Asp Gly Ser Val 15 10 15
Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser lie Gin His Arg Glu lie Glu Gly 20 25 30
Arg Val Thr Asp Phe 35 <210> 41 <211> 53 <212> PRT <213>小鼠 <400> 41
Ser He Pro Trp Asn Leu Glu Arg lie lie Pro Ala Trp His Gin Thr 15 10 15
Glu Glu Asp Arg Ser Pro Asp Gly Ser Ser Gin Val Glu Val Tyr Leu 20 25 30
Leu Asp Thr Ser lie Gin Gly Ala His Arg Glu lie Glu Gly Arg Val 35 40 45
Thr lie Thr Asp Phe 50 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>二級足跡抗原決定基 <400> 42
Arg Tyr Arg Ala Asp 1 5 20· 137316-序列表.doc

Claims (1)

  1. 200938552 七、申請專利範圍： 1 · 一種經分離PCSK9特異性拮抗劑，其包含： (a)重鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO: 17或其等效 物之CDR3結構域，該等效物之特徵為在該CDR3結構域 中具有一或多個保守性胺基酸取代；及/或 ' (b)輕鏈可變區，其包含有含SEQ ID NO: 7或其等效物 •之CDR3結構域，該等效物之特徵為在該CDR3結構域中 具有一或多個保守性胺基酸取代； ® 其中該PCSK9特異性拮抗劑拮抗PCSK9對細胞LDL吸 收之抑制作用。 2. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其中該（等）CDR3結 構域係位於人類生殖系區之CDR3區中。 3. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於1200 nM之 平衡解離常數（KD)結合人類PCSK9。 4. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於500 nM之 KD結合人類PCSK9。 參 5. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於100 nM之 KD結合人類PCSK9。 • 6.如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於5 nM之KD 結合人類PCSK9。 7. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於500 nM之 IC5〇拮抗PCSK9對細胞LDL吸收之抑制作用。 8. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於200 nM之 IC50拮抗PCSK9對細胞LDL吸收之抑制作用。 137316.doc 200938552 9. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於100 nM之 IC50拮抗PCSK9對細胞LDL吸收之抑制作用。 10. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其拮抗至少20%之 PCSK9對細胞吸收之抑制作用。 11. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其為抗體分子。 12. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其進一步包含： (a) 包含SEQ ID NO: 13之重鏈可變CDR1序列； (b) 包含SEQ ID NO: 15之重鏈可變CDR2序列； (c) 包含SEQ ID NO: 3之輕鏈可變CDR1序列；及/或 (d) 包含SEQ ID NO: 5之輕鏈可變CDR2序列。 13. 如請求項12之PCSK9特異性拮抗劑，其中該（等）CDR1、 CDR2及/或CDR3結構域係位於人類生殖系區之各別 CDR1、CDR2及 / 或 CDR3 區中。 14. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其包含： (a) 包含有含SEQ ID NO: 17之CDR3結構域的重鏈可變 區， (b) 包含有含SEQ ID NO: 7之CDR3結構域的輕鏈可變 區， (c) 包含SEQ ID NO: 13之重鏈可變CDR1序列； (d) 包含SEQ ID NO: 3之輕鏈可變CDR1序列； (e) 包含SEQ ID NO: 15之重鏈可變CDR2序列；及 (f) 包含SEQ ID NO: 5之輕鏈可變CDR2序列。 15. 如請求項14之PCSK9特異性拮抗劑，其中該（等）CDR1、 CDR2及/或CDR3結構域係位於人類生殖系可變區之各別 137316.doc 200938552 CDRl、CDR2及/或CDR3可變區中。 16. 如請求項12之PCSK9特異性拮抗劑，其包含含有SEQ ID NO: 11之重鏈可變區及/或含SEQ ID NO: 27之輕鏈可變 區。 17. 如請求項12之PCSK9特異性拮抗劑，其包含具有含有 SEQ ID NO: 24之恆定序列之重鏈。 • 18.如請求項16之PCSK9特異性拮抗劑，其包含具有含有 SEQ ID NO: 24之恆定序列之重鏈。 ^ 19. 一種PCSK9特異性拮抗劑，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 1之輕鏈；及 (b) 包含SEQ ID NO: 11之重鏈； 其中該PCSK9特異性拮抗劑為拮抗PCSK9對細胞LDL 吸收之抑制作用之抗體分子。 20. 如請求項19之PCSK9特異性拮抗劑，其中SEQ ID NO: 11 係依次繼之以選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸 _ 序列：SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 及 SEQ ID NO: 24。 21. —種PCSK9特異性拮抗劑，其包含： - (a)包含SEQ ID NO: 26之輕鏈；及 (b)包含SEQ ID NO: 25之重鏈； 其中該PCSK9特異性拮抗劑為拮抗PCSK9對細胞LDL 吸收之抑制作用之抗體分子。 22. —種PCSK9特異性拮抗劑，其： (a)抑制至少50%之1D05 Fab與PCSK9之結合；該1D05 137316.doc 200938552 Fab之特徵為包含含有SEQ ID N〇: 1之輕鏈及含有seq ID NO: 9之胺基酸丨_233之Fd鏈；及 (b)括抗（i)PCSK9與LDL受體之結合及/或（ii)pcsK9i 細胞中之内在化。 23. —種PCSK9特異性拮抗劑，其： (a) 抑制至少50%之1D05 IgG與PCSK9之結合；該1〇〇5 IgG之特徵為包含⑴含SEQ ID NO: !之輕鏈及⑴）含SEQ ID NO: 11之重鏈；及 (b) 括抗（i)PCSK9與LDL受體之結合及/或（ii)pcsK9至 細胞中之内在化。 24. 如請求項23之PCSK9特異性拮抗劑，其中SEQ 1]〇 nq η 係依次繼之以選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸 序列：SEQ ID Ν0: 21、SEQ ID NO: 22、SEq ⑴ Ν〇· 23 及 SEQ ID NO: 24 0 25· —種組合物，其包含如請求項丨_24中任— 項之PCSK9特 異性拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑。 26. —種鏗別、分離、量化或拮抗樣品中之之方法 其利用如請求項卜24中任一項之PCSK9特異性拮疒气 27. —種如請求項卜24中任一項之pcsK9特異性拮抗^的用 途，其係用於製造改善由PCSK9功能引起及/或加劇之病 症、病況或疾病的藥劑。 28· 一種經分離核酸，其編碼如請求項1-24中任一項之 PCSK9特異性拮抗劑。 29· 一種經分離核酸’其編碼如請求項1之PCSK9特異性卢抗 137316.doc 200938552 劑；其中該重鏈可變區之CDR3結構域係由包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列所編碼；且/或其中該輕鏈可變區之 CDR3結構域係由包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列所編 碼。 30.如請求項29之經分離核酸，其進一步包含： (a) 重鏈可變區中之CDR1及/或CDR2結構域，其分別係 •由包含SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 16之核苷酸序列所 編碼；及/或 (b) 輕鏈可變區中之CDR1及/或CDR2結構域，其分別 係由包含SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6之核苷酸序列所 編碼。 3 1 · —種經分離核酸，其編碼如請求項1之PCSK9特異性拮抗 劑；其中該PCSK9特異性拮抗劑包含： (a)由包含SEQ ID NO: 12之核苷酸序列所編碼之重鏈 可變區；及/或 @ (b)由包含SEQ ID NO: 28之核苷酸序列所編碼的輕鏈 可變區。 32. —種經分離核酸，其編碼如請求項1之PCSK9特異性拮抗 • 劑；其中該PCSK9特異性拮抗劑包含： (a) 由包含SEQ ID NO: 29之核苷酸序列所編碼之重鏈 區，及/或 (b) 由包含SEQ ID NO: 30之核苦酸序列所編碼的輕鏈 區。 33. —種載體，其包含如請求項28-32中任一項之核酸。 137316.doc 200938552 34. —種在活體外或原位經分離之宿主細胞或宿主細胞群 體，其包含如請求項28-32中任一項之核酸。 35. —種產生PCSK9特異性拮抗劑之方法，其包括： (a) 在適於產生該PCSK9特異性拮抗劑之條件下培養如 請求項3 4之細胞；及 (b) 分離所產生之PCSK9特異性拮抗劑。 36. —種在活體外或原位經分離之宿主細胞或宿主細胞群 體，其包含如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑。 137316.doc
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