CN102066420B - 1d05 pcsk9拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本文公开了人类枯草溶菌素转化酶9(“PCSK9”)的拮抗剂。本文公开的拮抗剂能有效抑制PCSK9的功能，因此是目前用于治疗与PCSK9活性相关的病症的合意的拮抗剂。本发明还公开了编码所述拮抗剂的核酸、包含所述拮抗机的载体、宿主细胞及组合物。本文还公开了制备PCSK9特异性拮抗剂的方法及利用该拮抗剂抑制或拮抗PCSK9功能的方法，这些构成了本公开的另一重要方面。

Description

1D05 PCSK9拮抗剂
相关申请的交叉引用
本申请要求申请日为2008年2月7日的美国临时专利申请61/063,949和申请日为2008年2月21日的美国临时专利申请61/066,577的优先权。
关于联邦政府资助研发的相关声明
不适用。
微缩胶片附录的引用
不适用。
背景技术
枯草溶菌素转化酶9(下文称为“PCSK9”)，亦称作神经细胞凋亡调节转化酶1(“NARC-1”)是蛋白酶K样的枯草杆菌酶，经鉴定为分泌性枯草杆菌酶家族中的第9个成员(见Seidah等人，2003PNAS100：928-933)。PCSK9基因位于人类染色体lp33-p34.3(Seidah等人，同上)。PCSK9表达于具有增殖和分化能力的细胞中，包括，例如肝细胞、肾间质细胞、回肠与结肠上皮细胞和胚胎端脑神经元等(Seidah等人，同上)。
最初合成的PCSK9为非活性酶前体或酶原的形式，其分子量约为72kDa，该酶原可于内质网(“ER”)内进行自我催化性分子内加工过程以激活其功能。据报道，这种内部加工事件发生于SSVFAQ↓SIPWNL158基序(序号分别为：SEQ ID NOs：19和20)；Benjannet等人，2004J.Biol.Chem.279：48865-48875。据报道，这种内部加工是蛋白脱离内质网所必需的(Benjannet等人，同上；Seidah等人，同上)。经过切割并因此被激活的蛋白与切割的多肽一起分泌(同上)。
人类PCSK9基因序列(长度约22kb，包括12个外显子，编码含692个氨基酸的蛋白质)的一个例子见保藏号NP_777596.2。已经描述了人类、小鼠和大鼠的PCSK9的核酸序列，分别参见例如GenBank条目号：AX127530(亦即AX207686)、NP_705793(亦即Q80W65)和P59996。PCSK9含有若干在其他前蛋白转化酶中发现的结构域，包括N端信号序列、前体结构域、催化结构域和富含半胱氨酸的C端结构域。PCSK9催化结构域与枯草杆菌酶的蛋白酶K家族具有高度序列同一性，特别是都具有D186、H226和S386催化三元体。
PCSK9在若干专利公开物中被公开和/或要求保护，包括但不限于下列：PCT公开号：WO 01/31007、WO 01/57081、WO 02/14358、WO 01/98468、WO 02/102993、WO 02/102994、WO 02/46383、WO02/90526、WO 01/77137和WO 01/34768；美国公开号：US2004/0009553和US 2003/0119038；以及欧洲公开号：EP 1 440 981、EP 1 067 182和EP 1 471 152。
已经发现PCSK9在肝细胞和神经细胞的分化中发挥作用(Seidah等人，同上)，在胚胎肝脏中高度表达，并对胆固醇体内平衡具有非常重要的意义。研究结果表明，PCSK9在胆固醇生物合成或摄取中具有特异性作用。在一项胆固醇饲喂大鼠的研究中，Maxwell等人发现，PCSK9表达水平下调与参与胆固醇生物合成的其他三个基因相似(Maxwell等人，2003J.Lipid Res.44：2109-2119)。实际上，已有研究显示PCSK9基因受固醇调控元件结合蛋白(“SREBP”)调控，这与观察到的其他参与胆固醇代谢的基因相同(同上)。后来一项关于PCSK9转录调控的研究支持这些发现，该研究证实，这种调控对于其他参与脂蛋白代谢基因是非常典型的(Dubuc等人，2004Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24：1454-1459)。已经表明抑制素(statin)使PCSK9的表达上调，这归结于药物的降低胆固醇水平的效应(同上)。此外，研究还显示，PCSK9启动子具有两个与胆固醇调节有关的保守位点，一个为固醇调控元件，另一个为Sp1位点(同上)。
尤其是，数套研究证据均证明，PCSK9降低肝LDLR的数量，因此减弱了肝脏清除循环中LDL胆固醇的能力。腺病毒介导的PCSK9在小鼠肝脏中的过度表达导致循环的LDL-C因肝LDLR蛋白大量丧失而积累，对于LDLR mRNA水平无影响(Benjannet等人，2004，J.Biol.Chem.279：48865-48875；Maxwell & Breslow，2004PNAS101：7100-7105；Park等人，2004 J.Biol.Chem.279：50630-50638；和Lalanne等人，2005 J.Lipid Res.46：1312-1319)。PCSK9过度表达对小鼠中循环的LDL-C水平升高的影响完全依赖于LDLR的表达，这再次表明，PCSK9对LDL-C的调节是通过下调LDLR蛋白而介导的。与这些发现相一致，缺乏PCSK9的小鼠或PCSK9mRNA水平因反义寡聚核苷酸抑制剂而降低的小鼠具有更高水平的肝脏LDLR蛋白和更强的清除循环的LDL-C的能力(Rashid等人，2005，PNAS 102：5374-5379；和Graham等人，2007 J.Lipid Res.48(4)：763-767)。此外，通过siRNA使培养的人肝细胞中PCSK9水平下降也会引起LDLR蛋白水平升高，且使吸收LDL-C的能力增强(Benjannet等人，2004 J.Biol.Chem.279：48865-48875；和Lalanne等人，2005 J.Lipid Res.46：1312-1319)。总之，这些研究数据表明，PCSK9作用导致通过降低LDLR蛋白水平引起LDL-C水平升高。另有研究证实，PCSK9基因的多个突变与常染色体显性高胆固醇血症(“ADH”)有关，该病症是遗传性代谢紊乱，其特征为血浆中低密度脂蛋白(“LDL”)颗粒显著增加，这会导致早期心血管功能衰竭(参见Abitadel等人，2003，Nature Genetics 34：154-156；Timms等人，2004，Hum.Genet.114：349-353；Leren，2004，Clin.Genet.65：419-422)。Abifadel等人后来发表的一项关于S127R突变的研究(同上)显示，携带这种突变的患者表现出总胆固醇含量升高，以及在血浆中含有apoB100，这是由于(1)含apoB100脂蛋白，如低密度脂蛋白(“LDL”)、极低密度脂蛋白(“VLDL”)和中等密度脂蛋白(“IDL”)的过量产生，和(2)所述脂蛋白的清除或转化作用相应减弱(Ouguerram等人，2004，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24：1448-1453)。
因此，毫无疑问，PCSK9在LDL调控中发挥作用。PCSK9的表达或上调表达与血浆LDL胆固醇水平升高有关，且PCSK9相应的抑制或表达缺失与血浆LDL胆固醇水平下降相关。已有研究发现，与PCSK9序列变异有关的LDL胆固醇水平赋予抵抗冠心病的保护(Cohen，2006，N.Engl.J.Med.354：1264-1272)。
治疗心血管病有效的化合物和/或制剂的鉴定是非常需要的。临床试验已经表明，LDL胆固醇水平下降与冠心病发病直接相关(Law等人，2003，BMJ 326：1423-1427)。最近的研究发现，血浆LDL胆固醇水平中度终身降低与冠心病发病率显著降低相关(Cohen等人，同上)。即使在非脂类相关性心血管风险因素普遍存在的人群中情况亦是如此(同上)。因此，LDL胆固醇水平的可调控性控制具有重大的意义。
本发明通过提供用于抑制PCSK9活性以及PCSK9在各种治疗病症中的相应作用的PCSK9拮抗剂，进一步提升了这些研究结果的意义。
发明内容
本发明涉及PCSK9拮抗剂，在特别的实施方式中，涉及同时抑制人类和鼠PCSK9的拮抗剂以及那些对已加工的PCSK9表现出优先靶向作用的PCSK9拮抗剂。广义地说，PCSK9的蛋白特异性拮抗剂(以下称为“PCSK9特异性拮抗剂”)为PCSK9蛋白结合分子或有效地选择性结合PCSK9并抑制PCSK9功能的分子。这些分子在治疗与PCSK9功能有关的或受其功能影响的病症中具有重要意义，所述病症包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、代谢综合症、急性冠脉综合症及相关病症。PCSK9特异性拮抗剂的特点为，选择性识别PCSK9并与之结合。PCSK9特异性拮抗剂不显示与除PCSK9之外的其他蛋白有显著结合作用，除非以下特例：即该拮抗剂补充或被专门设计为对PCSK9特异性结合成分提供额外的不同的特异性。
本文中特定实施方式中的PCSK9特异性拮抗剂包含：(a)重链可变区，其包含CDR3结构域，其包含SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：17的等同物，所述等同物的特征在于在CDR3结构域中具有一个或多个保守性氨基酸取代；和/或(b)轻链可变区，其包含CDR3结构域，其包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：7的等同物，所述等同物的特征在于在CDR3结构域中具有一个或更多个保守性氨基酸取代。在具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或鼠PCSK9结合，其KD为1.2X10-6M或更小。在另外的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的KD为1X10-7M或更小。在另外的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的KD为1X10-8M或更小。在进一步的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的KD为5X10-9M或更小，或1X10-9M或更小。在选择性实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的KD为1X10-10M或更小，1X10-11M或更小，或1X10-12M或更小。在具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂在上述与PCSK9结合的水平上不与PCSK9之外的蛋白结合。
本发明的特定实施方式包括PCSK9特异性拮抗剂，其在上述水平之一显示出与PCSK9结合并且与1D05抗体分子竞争性结合PCSK9。1D05抗体分子构成本文重要的PCSK9特异性拮抗剂。1D05抗体分子的特征在于包括(i)包含SEQ ID NO：11的重链可变区(“VH”)；和(ii)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区(“VL”)。所述VH与VL区分别包含VH区(SEQ ID NO：13、15和17)和VL区(SEQ ID NO：3、5和7)的公布的CDR 1、2和3的全长互补序列。1D05抗体分子的例子包括但不限于：(i)Fab，其包含：包含SEQ IDNO：1的轻链和包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-233(或SEQ ID NO：9)的Fd链；和(ii)全长抗体分子，其包含：包含SEQ ID NO：26的轻链和包含SEQ ID NO：25的重链。
PCSK9特异性拮抗剂可有效抵消PCSK9依赖性的对于细胞LDL摄取的抑制，尤其对人类和/或鼠PCSK9依赖性的对于细胞LDL摄取的抑制特别有效。再次证实，PCSK9特异性拮抗剂1D05对于PCSK9对LDL摄取的效应具有剂量依赖性抑制。因此，本文公布的PCSK9特异性拮抗剂对于降低血浆LDL胆固醇水平意义重大。本文公布的拮抗剂亦可用于不同的诊断目的，包括PCSK9的检测和定量。选择性1D05拮抗与人类和鼠PCSK9具有交叉反应，因而是特别有用的。这种特点使得可以在不需要确保小鼠表达人类PCSK9的鼠科模型中进行特定的1D05拮抗剂的药理学研究。在此类实验中，鼠科模型足以代表目标蛋白的天然活性和拮抗剂对其具有的抑制作用。
在具体的实施方式中，本发明包括PCSK9特异性拮抗剂。在特定实施方式中，本发明包括抗体分子，其包含本文公布的重链和/或轻链可变区，具有一个或更多个保守性氨基酸取代的所述区域的等同物，及其同源物。选择性实施方式包括分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包含公布的CDR结构域或成套重链和/或轻链CDR结构域，以及具有一个或更多个保守氨基酸取代的此类结构域的等同物。正如本领域技术人员认为的那样，维持拮抗PCSK9能力的PCSK9特异性拮抗剂的片段可插入不同的框架区，例如，参见美国专利号6,818,418及其参考文献，这些公开物共同通过引用的方式并入本文，该文献讨论了不同的骨架，这些骨架可用于展示之前通过抗原结合选择的抗体环(loop)。此外，运用重组技术可使编码VL和VH的基因连接，例如运用合成连接子使其产生单链蛋白，在这个蛋白分子内VL和VH结合形成单价分子，也称为单链Fvs(“ScFVs”)(见例如Bird等人，1988，Science 242：423-426，和Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)，这些公开物通过引用的方式并入本文。
PCSK-9特异性拮抗剂及片段可以以不同的非抗体骨架形式存在，包括但不限于avimer(Avidia)、DARPins(分子伴侣)、Adnectin(Adnexus)、Anticalin(Pieris)和Affibody(Affibody)。在科学文献中对蛋白结合的替代骨架运用给予了很高的评价，例如参见Binz和Plüeckthun，2005，Curr.Opin.Biotech 16：1-11；这些公开物通过引用的方式并入本文。因此，包含(i)公布的重链和/或轻链可变区CDR3序列(分别为SEQ ID NO：17和7)，和(ii)公布的重链可变CDR1、CDR2和CDR3序列或公布的轻链可变CDR1、CDR2和CDR3序列：CDR1(分别为SEQ ID NO：13和3)，CDR2(分别为SEQ ID NO：15和5)和CDR3(分别为SEQ ID NO：17和7)，(iii)人类重链和/或轻链序列的可变区框架内的公布的重链和轻链CDR的全长互补序列(分别为SEQ ID NO：13、15、17、3、5和7)，或(iv)公布的重链和/或轻链可变区SEQ ID NO：11和/或SEQID NO：27的非抗体骨架或拮抗剂分子构成本发明的重要实施方式，其中这样的骨架或拮抗剂分子显示出PCSK9选择性，并抵消细胞LDL摄入的PCSK9依赖性抑制作用。
在另一方面，本发明提供了编码公布的PCSK9特异性拮抗剂的核酸，在特定实施方式中，本发明提供了PCSK9特异性拮抗剂，其包含公布的重链和轻链、公布的可变重链区和可变轻链区以及其选择性成分(包括CDR 1、2和/或3)，尤其是公布的各个CDR3区。另一方面，本发明提供了包含所述核酸的载体。此外，本发明提供了包含编码公布的PCSK9特异性拮抗剂的核酸的分离的细胞。另一方面，本发明提供了包含本发明的多肽或载体的分离的细胞。
本发明提供了制备本文公布的PCSK9特异性拮抗剂的方法，所述拮抗剂包括但不限于抗体、抗原结合片段、衍生物、嵌合分子、上述任一项与另一多肽的融合物，或者包含所公布序列的能够特异结合PCSK9的替代性结构/成分。方法包括：(i)孵育一种细胞，该细胞包含编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸，或者包含编码其一个或更多个成分的单个核酸，在可表达并组装PCSK9特异性拮抗剂的条件下表达时，所述核酸共同产生该拮抗剂；和(ii)从细胞中分离所述拮抗剂。本领域技术人员运用标准DNA重组技术也能获得本文公布的PCSK9特异性拮抗剂。
本发明提供一种方法，该方法用于拮抗PCSK9的活性或功能或PCSK9的显著效应，该方法包括：在允许所述拮抗剂结合PCSK9的条件下，使表达PCSK9(或经过人类或鼠PCSK9处理或者其中含有PCSK9)的细胞、细胞群或目标组织样品与本文公布的PCSK9特异性拮抗剂结合。本发明的具体实施方式包括这样的方法：其中所述细胞是人类或鼠细胞。在附加实施方式中，细胞表达人类或鼠衍生的PCSK9。
另一方面，本发明还提供一种方法，该方法用于拮抗受试者中的PCSK9的活性或功能或者PCSK9的显著效应，该受试者表现出与PCSK9活性相关的病症或特定患者中对PCSK9功能禁忌的病症，该方法包括，向受试者施用处于药物组合物或其它组合物中的治疗上有效量的本发明的PCSK9特异性拮抗剂。
因此，本发明包含一种方法，该方法用于治疗与PCSK9活性相关的病症或特定患者中对PCSK9功能禁忌的病症，该方法包括，向受试者施用处于药物组合物或其它组合物中的治疗上有效量的本发明的PCSK9特异性拮抗剂。在选择性实施方式中，所述病症为高胆固醇血症、冠心病、代谢综合症、急性冠脉综合症或相关病症。
在具体的实施方式中，本发明包括向受试者施用公布的PCSK9特异性拮抗剂的方法，该方法包括，输送治疗上有效量的包含本文公布的PCSK9特异性拮抗剂的药物组合物或其他组合物。
在另一方面，本发明提供一种包含本发明的PCSK9特异性拮抗剂的药物组合物或其它组合物，其特征在于，包含药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、或设计为促进拮抗剂以理想剂量向治疗个体施用的替代物。
下表列出了本申请中讨论的序列的一般性总结。序列列表包括所有注释、序列及特点，其共同形成为本公开的文字部分。
表1
  序号：   说明
  SEQ ID NO：1   轻链(“LC”)；1D05
  SEQ ID NO：2   轻链(“LC”)核酸；1D05
  SEQ ID NO：3   VL CDR1；1D05
  SEQ ID NO：4   VL CDR1核酸；1D05
  SEQ ID NO：5   VL CDR2；1D05
  SEQ ID NO：6   VL CDR2核酸；1D05
  SEQ ID NO：7   VL CDR3；1D05
  SEQ ID NO：8   VL CDR3核酸；1D05
  SEQ ID NO：9   包含连接子和标签的Fd链；1D05
  SEQ ID NO：10   Fd链核酸；1D05
  SEQ ID NO：11   VH；1D05
  SEQ ID NO：12   VH核酸；1D05
  SEQ ID NO：13   VH CDR1；1D05
  SEQ ID NO：14   VH CDR1；核酸；1D05
  SEQ ID NO：15   VH CDR2；1D05
  SEQ ID NO：16   VH CDR2核酸；1D05
  SEQ ID NO：17   VH CDR3；1D05
  SEQ ID NO：18   VH CDR3核酸；1D05
  SEQ ID NO：19   加工位点的片段
  SEQ ID NO：20   加工位点的片段
  SEQ ID NO：21   IgG1的恒定区结构域
  SEQ ID NO：22   IgG2的恒定区结构域
  SEQ ID NO：23   IgG4的恒定区结构域
  SEQ ID NO：24   IgG2m4的恒定区结构域
  SEQ ID NO：   说明
  SEQ ID NO：25   1D05IgG2m4重链(“HC”)
  SEQ ID NO：26   1D05IgG轻(κ)链
  SEQ ID NO：27   VL；1D05
  SEQ ID NO：28   VL核酸；1D05
  SEQ ID NO：29   1D05IgG2m4HC核酸
  SEQ ID NO：30   1D05IgG LC核酸
  SEQ ID NO：31   1D05IgG2m4HC质粒
  SEQ ID NO：32   1D05IgG LC质粒
  SEQ ID NO：33   引物
  SEQ ID NO：34   引物
  SEQ ID NO：35   引物
  SEQ ID NO：36   引物
  SEQ ID NO：37   1D05表位结构域
  SEQ ID NO：38   附图中的PCSK9序列的一部分
  SEQ ID NO：39   人类表位区域
  SEQ ID NO：40   共有序列
  SEQ ID NO：41   小鼠表位区域
  SEQ ID NO：42   次级足迹表位
  SEQ ID NO：43   1D05变体VH CDR1序列
  SEQ ID NO：44   1D05变体VH CDR2序列
  SEQ ID NO：45   1D05变体VH CDR3序列
  SEQ ID NO：46   1D05变体VL CDR1序列
  SEQ ID NO：47   1D05变体VL CDR2序列
  SEQ ID NO：48   1D05变体VL CDR3序列
  SEQ ID NO：49   VL；1D05变体序列
  SEQ ID NO：50   VH；1D05变体序列
附图说明
图1显示了编码mPCSK92CX1D05Fab重链和轻链的Fab表达载体pMORPH_x9_MH。
图2显示了1D05的活性(PCSK9-LDLR相互作用的TR-FRET试验)。1D05的Fab段和IgG均是有效的并且均可完全抑制该相互作用。本实验中，[AF647-PCSK9]＝10nM，[Eu-sLDLR]约为1.5nM(在FI620nm计数约为20000)。
图3A-3D显示(i)1D05(Fab)对鼠PCSK9依赖性的细胞LDL摄取功能丧失的剂量依赖性抑制作用(图3A)；(ii)1D05(IgG)对鼠PCSK9依赖性的细胞LDL摄取功能丧失的剂量依赖性抑制作用(图3B)；(iii)1D05(Fab)对人类PCSK9依赖性的细胞LDL摄取功能丧失的剂量依赖性抑制作用(图3C)；和(iv)1D05(IgG)对人类PSCK9依赖性的细胞LDL摄取功能丧失的剂量依赖性抑制作用(图3D)。很明显，1D05与人类和鼠PCSK9均发生交叉反应。图3A-3D有两个对照：(i)仅有细胞的对照，显示细胞LDL摄取的基础水平，和(ii)细胞+PCSK9(5μg/ml)对照，显示PCSK9依赖性的LDL摄取功能丧失。包含1D05和PCSK9的滴度实验在PCSK9的固定浓度(5μg/ml)及1D05浓度递增条件(如图所示)下进行。如图所示，1D05能够抑制PCSK9对细胞LDL摄取的效应。1D05(Fab)对小鼠和人类PCSK9蛋白的IC50分别为97nM和144nM。1D05(IgG)对小鼠和人类PCSK9蛋白的IC50分别为85nM和79nM。
图4A和4B显示1D05(分别为Fab和IgG)对PCSK9内化的抑制作用和LDL摄取的恢复。HepG2细胞进行平板培养，然后加入AlexaFluor标记的PCSK9和LDL，并于37℃孵育4小时。孵育后，运用共聚焦显微镜检测经细胞内化的PCSK9或LDL。对照包括只加入细胞(无处理)和只加入AF标记的PCSK9和50X(250μg/ml)未标记的PCSK9(50X冷却重量)。除了5μg/ml野生型AF标记的PCSK9和10μg/ml AF的标记LDL，还加入了数量增加的1D05Fab(图板A)或IGG(图板B)，结果导致随后对于PCSK9进入细胞的抑制和LDL摄取的恢复。总之，这些研究证实，Fab和IgG均阻止PCSK9进入细胞内。
图5显示了用一套连接的符号表示的各小鼠的LDL水平；LDL变化(出血后-出血前)用各处理小组的平均值表示(Δmg/dL)。用PBS处理对LDL水平测定无影响(-4mg/dL，降低5％)。相反，用1D05全IgG(-19mg/dL)处理使血清LDL水平降低了20％；用1D05的Fab片断(-24mg/dL)处理使血清LDL水平降低了34％。
图6显示IgG1恒定结构域的序列比较(SE ID NO：21；其Fc结构域由SEQ ID NO：21的110-130残基表示)，IgG2(SEQ ID NO：22，其Fc结构域由SEQ ID NO：22的107-326残基表示)，IgG4(SEQID NO：23；其Fc结构域由SEQ ID NO：23的107-327残基表示)和IgG2m4(SEQ ID NO：24；其Fc结构域由SEQ ID NO：24的107-326残基表示)同种型。
图7A和7B显示通过AspN将a)wt-PCSK9和b)1D05/wt-PCSK9复合物进行5分钟的限制性蛋白水解而产生的肽片断。图7A中的星号着重标出了存在于wt-PCSK9光谱中的肽片断，在1D05/wt-PCSK9光谱中检测不到该片断。因此，在复合物中天冬氨酸残基169受到保护。
图8A-8H显示通过GluC将wt-PCSK9(图8A-8D)和1D05/wt-PCSK9复合物(图8E-8H)进行15分钟的限制性蛋白水解而产生的肽片断。
图9A-9D显示通过胰蛋白酶将a)wt-PCSK9和b)1D05/wt-PCSK9复合物进行5分钟的限制性蛋白水解而产生的肽片断。图9C-D分别显示了同一个光谱的缩放图。图9A和9C中的星号着重标出了存在于wt-PCSK9光谱中的肽片断，在1D05/wt-PCSK9光谱中检测不到该片断。
图10显示参与结合1D05中和性Fab的wt-PCSK9催化结构域的初级序列的残基。加方框的是在限制性蛋白水解实验中被1D05结合所保护的wt-PCSK9的肽片断。
图11显示参与结合1D05中和性Fab的wt-PCSK9催化结构域的肽。在wt-PCSK9结构的缩放图中的R194和R199，以及A168和R165之间的区断中显示了在限制性蛋白水解实验中被1D05结合所保护的wt-PCSK9的肽。
图12A和12B显示了在人类(SEQ ID NO：39)和小鼠(SEQ IDNO：41)PCSK9中所鉴别的一般性表位区域的序列比对。提供了共有序列(SEQ ID NO：40)作为图12A的第二个序列。如图所示，受保护的肽194-199中包括的残基在两个物种之间是保守的；而肽165-169中的残基则不是。
图13显示了在PCSK9-1D05相互作用TR-FRET检验中对于1D05和一种不同抗体1B20的分析。两个Fab均是有效的且完全抑制该相互作用。对于该实验，[AF647-α-V5]＝10nM，[PCSK9]＝10nM，[Eu(8044)-1D05(IgG)]～1.5nM(在FI620nm的计数为～18000)。
图14A-D显示：在Exopolar检验中，1B20是PCSK9功能的完全抑制剂。
图15显示1D05在3mpk使恒河猴的LDL-C降低～50％。曲线图显示在用抗体单IV剂量处理后不同测试时间点血清中LDL变化的百分比。
图16显示1D05在所示的不同剂量水平的药动学分析结果。曲线图表示抗体单IV剂量处理后在不同测试时间点的血清药物(1D05)水平。1D05的半衰期为77小时
具体实施方式
本发明涉及PCSK9拮抗剂，在特定实施方式中，本发明涉及那些同时抑制人类和鼠PCSK9的拮抗剂以及那些优先靶向经加工的PCSK9的拮抗剂。按照本文所述的PCSK9的蛋白特异性拮抗剂(或PCSK9特异性拮抗剂)可有效地选择性结合PCSK9并抑制其功能，因此，其在治疗与PCSK9功能相关的病症或受其影响的病症中具有重要意义，所述病症包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、代谢综合症、急性冠脉综合症及相关病症。所用术语“拮抗剂”指这样的事实：即本发明的能够拮抗PCSK9的功能。所用术语“拮抗”或其衍生物指的是对抗、抵消、抑制、中和或限制PCSK9的一项或更多项功能。本文中提及的PCSK9功能或PCSK9活性指的是由PCSK9驱动、需要PCSK9、或者被PCSK9加剧或增强的任意功能或活性。研究已经证明，本文所述PCSK9特异性拮抗剂可有效抵消人类和/或鼠PCSK9依赖性的细胞LDL摄取的抑制。
本文一个重要实施方式涉及1D05抗体分子。此类1D05抗体分子的特征在于其包含：(i)包含SEQ ID NO：11的重链可变区(“VH”)；和(ii)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区(“VL”)。所述VH与VL区分别包含VH区(SEQ ID NO：13、15和17)和VL区(SEQID NO：3、5和7)的公布的CDR 1、2和3的全长互补序列。1D05抗体分子的例子包括但不限于：(i)Fab，其包含：包含SEQ ID NO：1的轻链和包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-233(或SEQ ID NO：9)的Fd链；和(ii)全长抗体分子，其包含：包含SEQ ID NO：26的轻链和包含SEQ ID NO：25的重链。1D05抗体的选择组证实，本文公布的PCSK9特异性拮抗剂可有效抑制人类和鼠PCSK9功能，并可以在不表达人类PCSK9的鼠科模型中研究其药动学特性。
本文给出并公布的CDR定义是运用Morphosys软件程序序列分析软件(“SAS”)获得的。然而，申请者希望大家注意，其他不同的方法亦可用于描述并定义CDR序列的起点与终点，包括但不限于：Kabat，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版)，NIH出版号91-3242，U.S.Department of Health and HumanServices；Clothia等人，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Clothia等人，1989，Nature 342：877-883；Lefrane，1997，Immunol.Today，18：509；和Chen等人，1999，J.Mol.Biol.293：865-881。已经有人对这些及其它方法进行了综述，这些方法是本领域成熟的技术，本领域技术人员对此很精通；参见，例如，Honegger和Plüeckthun，2001，J.Mol.Biol.309：657-670。尽管现在的发明者都已采用SAS软件定义CDR，但本发明完全包括围绕序列的不同定义，以及通过应用不同的分析软件或方法获得的不同的CDR描述。所述应用和由此得出的本发明公布序列的CDR定义全部落在本公开的范畴之内，并已在本文中预见到。
PCSK9特异性分子亦可用于PCSK9检测和定量分析中的不同诊断目的。
而且，公布的PCSK9特异性拮抗剂是独特的，因为选择性实施方式已经证实，该拮抗剂优先识别经加工的PCSK9，即活性形式的PCSK9。
本文公开的PCSK9特异性拮抗剂为降低血浆LDL胆固醇水平的理想分子，可用于任意灵长动物、哺乳动物或脊椎动物，具有商业或家庭兽医学意义。PCSK9特异性拮抗剂亦可抑制任意含有LDL受体的细胞群或组织中的PCSK9活性。公布的拮抗剂的功效可由技术人员通过试验容易地测定。测定LDL摄取的方法在文献中有所说明：参见，例如Barak和Webb，1981，J.Cell Biol.90：595-604，和Stephan和Yurachek，1993，J.Lipid Res.34：325330。此外，测定血浆中LDL胆固醇的方法在文献中有很多描述：参见，例如，McNamara等人，2006，Clinica Chimica Acta 369：158-167。公布的拮抗剂对细胞LDL摄取的特定影响亦可通过一种方法进行测定，该方法包括：向细胞样品中加入纯化的PCSK9和标记的LDL颗粒；向细胞样品中加入PCSK9拮抗剂；将所述细胞样品孵育足够长的时间，使细胞摄取LDL颗粒；定量分析进入细胞的标记物的数量；鉴定引起被细胞摄取的定量的标记物的量增加的拮抗剂(与单独施用PCSK9时观察到的结果相比)。测定公布拮抗剂功效的另一种方法包括：向细胞样品中加入纯化的PCSK9和标记的LDL颗粒；向细胞样品中加入PCSK9拮抗剂；将所述细胞样品孵育足够长的时间，使细胞摄取LDL颗粒；通过除去上清分离细胞样品的细胞；减少标记的LDL颗粒的非特异性结合(无论与平板、细胞或除LDL受体之外的任意物质的结合)；裂解细胞；对滞留在细胞裂解物内的标记物的量进行定量分析；鉴定引起被细胞摄取的定量的标记物的量增加的拮抗剂(与单独施用PCSK9时观察到的结果相比)。引起定量的标记物的量增加的拮抗剂为PCSK9拮抗剂。
任意类型的携带LDL受体的细胞均可用于上述方法，包括但不限于HEK细胞、HepG2细胞和CHO细胞。任意来源的LDL颗粒均可用于上述试验中。在特定试验中，LDL颗粒为来自血液的新鲜颗粒。新鲜颗粒可通过技术人员掌握的任意方法获得，包括但不限于Havel等人，1995，J.Clin.Invest.34：1345-1353中提出的方法。LDL颗粒可用荧光进行标记。标记的LDL颗粒之中可以掺入可见波长激发的荧光团3，3’-双十八吲哚羰花青碘(dil(3))以形成可发出强荧光的LDL衍生物dil(3)-LDL。可使用任意能使技术人员检测细胞裂解物中的LDL的标记物。可以使用只有当在分子内代谢后，或者，例如，在进入细胞过程中将与其他分子结合(或解离)(例如，FRET试验，其中LDL类似物与次级氟石结合，或者与淬灭剂解离)才变得可以检测(例如，可发出荧光或在不同波长发出荧光，等等)的LDL类似物。可采用本领域检测标记LDL颗粒内化的任意方法。LDL颗粒和PCSK9与细胞孵育的时间等于足以使LDL颗粒被细胞摄取所需的时间长度。该时间可在5分钟到360分钟范围内。加入细胞的PCSK9浓度范围可以为1nM-5μM，在特定的方法中，该范围为0.1nM-3μM。本领域技术人员可以用于确定特定PCSK9蛋白的浓度范围的一种方法是：获得LDL摄取试验中剂量反应曲线。可以选择一个PCSK9浓度，该浓度可引发接近LDL摄取的最大丧失，但其仍在剂量反应曲线的线性范围内。典型情况下，这一浓度为提取自剂量反应曲线蛋白EC-50的～5倍。该浓度可随蛋白质不同而变化。
广义地说，本文定义的PCSK9特异性拮抗剂选择性识别并特异性结合PCSK9。一般地，当解离常数≤1μM，优选≤100nM，最优选≤10nM时将抗体称作特异性地与抗原结合。此外，文中所用术语“选择性”或“特异性”指的是这样的事实，即公布的拮抗剂不与PSCK9以外的蛋白质发生明显的结合，但某些特例下除外，在这些特例下，该拮抗剂补充或被专门设计为对PCSK9特异性结合部分提供额外的不同的特异性(如双特异性或双功能性分子，该分子被设计为结合两种分子或具有两种功能，其中至少一种为特异结合PCSK9)。在具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或鼠PCSK9结合，其KD为1.2X10-6M或更小。在更具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的KD为5X10-7M或更小、2X10-7M或更小、或1X10-7M或更小。在另外的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的KD为1X10-8M或更小。在进一步的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的KD为5X10-9M或更小，或1X10-9M或更小。在选择性实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的KD为1X10-10M或更小，1X10-11M或更小，或1X10-12M或更小。在具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂在上述KD不与PCSK9之外的蛋白结合。KD指的是由Kd(特定结合分子-靶蛋白相互作用的解离率)与Ka(特定结合分子-靶蛋白相互作用的结合率)之比获得的解离常数，或用摩尔浓度(M)表示的Kd/Ka。KD值可用本领域建立的成熟方法进行测定。确定结合分子KD的优选方法为，运用表面等离子共振技术，例如，采用生物传感器系统，例如BiacoreTM(GE Healthcare Life Sciences)系统。
已有研究显示，本文公布的PCSK9特异性拮抗剂可以剂量依赖性方式抑制人类和/或鼠PCSK9依赖性LDL摄取效应。因此，本文公布的PCSK9特异性拮抗剂的特征在于：能够抵消PCSK9依赖性的对细胞摄取LDL的抑制作用。细胞通过LDL受体对LDL的摄取在本文中被称作“细胞LDL摄取”。在具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂抵消或拮抗人类和/或鼠PCSK9依赖性的对细胞LDL摄取的抑制作用，其IC50为小于1.0X10-6M、小于1.0X10-7M、1.0X10-8M、1.0X10-9M、1.0X10-10M、1.0X10-11M和1.0X10-12M(按优选的顺序)。任意PCSK9特异性拮抗剂的抑制程度可通过与对照进行统计学比较进行定量测定，或者运用本领域已有的替代方法评价对PCSK9功能的阴性效应，或抑制效应(即，任何能够评价PCSK9功能拮抗的方法)。在具体的实施方式中，这种抑制作用为至少大约10％抑制。在其他实施方式中，这种抑制至少为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％。因此，能够以上述水平抑制PCSK9功能的PCSK9特异性拮抗剂构成了本文的特定实施方式。
按照本文的表述，PCSK9特异性拮抗剂为特异性结合人类和/或鼠PCSK9蛋白的任意结合分子，包括但不限于下文定义的抗体分子、任何PCSK9特异性结合结构、任何特异性结合PCSK9的多肽或核酸结构、前述任一项整合入不同蛋白骨架，这些骨架包括但不限于各种非抗体骨架和能够提供或允许选择性结合PCSK9的不同结构，这些结构包括但不限于小模块免疫药物(或SMIP，参见，Haan&Maggos，2004 Biocentury Jan 26)；Immunity proteins(参见，例如，Chak等人，1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：6437-6442)；cytochrome b562(参见Ku and Schultz，1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6552-6556)；肽α2p8(参见Barthe等人，2000 Protein Sci.9：942-955)；avimer(Avidia；参见Silverman等人，2005 Nat.Biotechnol.23：1556-1561)；DARPins(Molecular Partners；参见Binz等人，2003 J.Mol.Biol.332：489-503；和Forrer等人，2003 FEBS Lett.539：2-6)；Tetranectins(参见，Kastrup等人，1998 Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.54：757-766)；Adnectins(Adnexus；参见，Xu等人，2002 Chem.Biol.9：933-942)，Anticalins(Pieris；参见Vogt & Skerra，2004Chemobiochem.5：191-199；Beste等人，1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：1898-1903；Lamla & Erdmann，2003 J.Mol.Biol.329：381-388；和Lamla & Erdmann，2004 Protein Expr.Purif.33：39-47)；A-结构域蛋白(参见North & Blacklow，1999 Biochemistry 38：3926-3935)，Lipocalins(参见Schlehuber & Skerra，2005 Drug Discov.Today10：23-33)；重复基序蛋白例如Ankyrin重复蛋白(参见Sedgwick &Smerdon，1999 Trends Biochem.Sci.24：311-316；Mosavi等人，2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：16029-16034；和Binz等人，2004 Nat.Biotechnol.22：575-582)；昆虫Defensin A(参见Zhao等人，2004Peptides 25：629-635)；Kunitz结构域(参见Roberts等人，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2429-2433；Roberts等人，1992 Gene 121：9-15；Dennis & Lazarus，1994 J.Biol.Chem.269：22129-22136；和Dennis &Lazarus，1994 J.Biol.Chem.269：22137-22144)；PDZ-结构域(参见Schneider等人，1999 Nat.Biotechnol.17：170-175)；蝎子毒素例如Charybdotoxin(参见Vita等人，1998 Biopolymers 47：93-100)；10thfibronectin type III domain(or 10Fn3；参见Koide等人，1998 J.Mol.Biol.284：1141-1151，和Xu等人，2002 Chem.Biol.9：933-942)；CTLA-4(细胞外结构域；参见Nuttall等人，1999 Proteins 36：217-227；和Irving等人，2001 J.Immunol.Methods 248：31-45)；Knottins(参见Souriau等人，2005 Biochemistry 44：7143-7155和Lehtio等人，2000Proteins 41：316-322)；Neocarzinostatin(参见Heyd等人2003Biochemistry 42：5674-5683)；醣类吸附模组4-2(CBM4-2；参见Cicortas等人，2004 Protein Eng.Des.Sel.17：213-221)；Tendamistat(参见McConnell & Hoess，1995 J.Mol.Biol.250：460-470，和Li等人，2003 Protein Eng.16：65-72)；T细胞受体(参见Holler等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：5387-5392；Shusta等人，2000 Nat.Biotechnol.18：754-759；和Li等人，2005 Nat.Biotechnol.23：349-354)；Affibodies(Affibody；参见Nord等人，1995 Protein Eng.8：601-608；Nord等人，1997 Nat.Biotechnol.15：772-777；Gunneriusson等人，1999 ProteinEng.12：873-878)；和文献中识别的其它选择性结合蛋白或骨架；参见，例如，Binz & Plückthun，2005 Curr.Opin.Biotech.16：1-11；Gill &Damle，2006 Curr.Opin.Biotechnol.17：1-6；Hosse等人，2006 ProteinScience 15：14-27；Binz等人，2005 Nat.Biotechnol.23：1257-1268；Hey等人，2005 Trends in Biotechnol.23：514-522；Binz & Plückthun，2005Curr.Opin.Biotech.16：459-469；Nygren & Skerra，2004 J.Immunolog.Methods 290：3-28；Nygren & Uhlen，1997 Curr.Opin.Struct.Biol.7：463-469；这些公开物通过引用的方式并入本文。抗体及抗原结合片段的应用在文献中有成熟的定义和理解。替代性的用于蛋白结合的骨架的运用也在文献中有良好的认识，参见，例如，Binz & Plückthun，2005 Curr.Opin.Biotech.16：1-11；Gill & Damle，2006 Curr.Opin.Biotechnol.17：1-6；Hosse等人，2006 Protein Science 15：14-27；Binz等人，2005 Nat.Biotechnol.23：1257-1268；Hey等人，2005 Trends inBiotechnol.23：514-522；Binz & Plückthun，2005 Curr.Opin.Biotech.16：459-469；Nygren & Skerra，2004 J.Immunolog.Methods 290：3-28；Nygren & Uhlen，1997 Curr.Opin.Struct.Biol.7：463-469；这些公开物通过引用的方式并入本文。因此，本文所述的非抗体骨架或拮抗剂分子对PCSK9显示出选择性，其抵消PCSK9依赖性的对细胞LDL摄取的抑制作用，这构成本发明的重要实施方式。Aptamer(能够选择性结合靶分子的核酸或多肽分子)是一个具体的例子。这些分子可选自随机序列库或由天然来源(如核糖开关)鉴定。肽适体(aptamer)、核酸适体(例如结构性核酸，包括基于DNA和RNA的结构)和核酸诱饵均可有效地选择性结合并抑制靶蛋白，参见，例如，Hopper-Seyler和Butz，2000，J.Mol.Med.78：4-426-430；Bock等人，1992，Nature 355：564-566；Bunka和Stockey，2006，Nat.Rev.Microbiol.4：588-596；Martell等人，2002，Molec.Ther.6：30-34；Jayasena，1999，Clin.Chem.45：1628-1650；这些公开物通过引用的方式并入本文。
重要的是，通过限制性蛋白水解与质谱(“LP-MS”)鉴定了PCSK9的1D05结合位点(或表位)。限制性蛋白水解质谱分析包括：在严格控制的条件下将野生型PCSK9(“wt-PCSK9”)和wt-PCSK9与1D05的复合物与不同特异性的内蛋白酶一起孵育。在这样的条件下，内蛋白酶只切割暴露的初级切割位点。将实验设计为：1D05与wt-hPCSK9的结合掩盖了wt-hPCSK9上通常暴露的不与抗体结合的表面残基。这样的掩盖残基提供了有关1D05的结合结构域的信息。通过这样的实验，鉴别了一种自然界的新型中和表位构象，其由肽RYRAD(SEQID NO：42)和REIEGR(SEQ ID NO：37)代表。该表位落在PCSK9的催化结构域之内并且提供了新型靶表位以用于鉴定另外的有效的PCSK9拮抗剂。对于另外的与该表位结合的PCSK9特异性拮抗剂的鉴定对于提供1D05的PCSK9中和活性具有重要意义。
一种鉴定与所鉴别的1D05表位或重叠表位结合的拮抗剂尤其是抗体的方法是通过竞争性或类似试验，其中候选抗体或结合分子需要使1D05对表位的竞争中被淘汰。本文包括的竞争性拮抗剂是这样的分子：其在1μM或更低浓度(1D05处于其KD或以下)时，所述分子将1D05的结合抑制(即，与对照相比，阻止或干扰)或减少至少50％、60％、70％和80％(以渐增的优选程度)(甚至更优选为至少90％，最优选为至少95％)；尤其是这样的分子：其拮抗(i)PCSK9结合LDL受体，(ii)PCSK9进入细胞内，或者(iii)PCSK9结合LDL受体与PCSK9细胞内化两种作用。结合膜之间的竞争可能在体外容易地测定，例如，运用ELISA和/或通过监测溶液中抗体与PCSK9的相互作用。进行分析的确切方法无关紧要。PCSK9可被固定于96孔板上，或者可被置于均一的溶液中。在具体的实施方式中，未标记候选抗体阻断已标记1D05结合的能力可通过放射活性、酶或其他标记物进行测定。在反向试验中确定未标记抗体干扰标记的1D05与PCSK9相互作用的能力(其中所述1D05和PCSK9已经结合)。在具体的实施方式中，(i)将PCSK9与标记的1D05(一种抗体分子，其包括：包含SEQ ID NO：27的VL和包含SEQ ID NO：11的VH)接触；(ii)将PCSK9与候选抗体或抗体库接触；和(iii)鉴别能够干扰或阻止PCSK9与1D05形成复合物的抗体。在此类实施方式中结果的读出是通过测定结合的标记物进行的。可以以任意顺序加入1D05与候选抗体，或者可以同时加入。可以进行的一种特异性检验是实施例13中的检验，其中显示了抗体的活性，发现所述抗体与1D05结合至相同的表位结构域。
对于在上述或其他合适测试中鉴定为1D05竞争者的抗体，可对其拮抗或中和(i)PCSK9与LDL受体的结合；和/或(ii)PCSK9进入细胞的内化的能力进行测试。这些参数可通过使用与本说明书中采用或描述的试验相似的方法进行测定。在具体的实施方式中，竞争抗体的抑制效果至少约为10％抑制。在其他实施方式中，抑制为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者95％。
本发明特别包含PCSK9特异性拮抗剂和特定的单克隆抗体分子(及其相应氨基酸和核酸序列)，这些抗体选择性结合如1D05所鉴别的表位、或干扰1D05与PCSK9结合的重叠表位。在PCSK9的表位上鉴别的1D05结合的关键残基是对应于人类PCSK9的残基Arg194、Glu197和Arg199的那些残基。包含这些氨基酸残基的窄小表位由SEQ ID NO：37代表，并且落入人类PCSK9的SEQ ID NO：39和鼠PCSK9的SEQ ID NO：41的区域之内。该抗体的次级足迹由SEQ IDNO：42所代表。特异性结合由SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：42所代表的构象表位或重叠表位的单克隆抗体拮抗或中和(i)PCSK9与LDL受体的结合；(ii)PCSK9进入细胞的内化或(iii)两者。因此，与PCSK9的表位(包含SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41，或由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41组成)结合的单克隆抗体构成本发明的重要实施方式。本发明的具体实施方式涉及识别以下的PCSK9表位的单克隆抗体：SEQ ID NO：37和SEQID NO：42。本发明单克隆抗体分子可以是一个完整(全部或全长)抗体，基本上完整的抗体，或包含抗原结合部分的抗体部分或片段，例如，鼠抗体或嵌合抗体或人源化抗体或人类抗体的Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。本文使用的单克隆指的是均一的或基本上均一(或纯的)的抗体群，即，在群体中，至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，更优选至少大约97％或98％，或者最优选至少大约99％的抗体是相同的并且在ELISA检验中竞争性结合相同的抗原或表位。在本发明的具体的实施方式中，本发明提供单克隆抗体，其(i)与1D05抗体分子竞争性结合至PCSK9，在1D05处于其KD或以下时，所述单克隆抗体在1μM时对1D05结合作用的抑制为至少50％；(ii)阻断PCSK9与LDL受体的结合；(iii)抑制PCSK9进入细胞的内化；和(iv)包括特异性抗原结合区、VH、VL、成套CDR或重链CDR3、重链和/或轻链或本文描述的这些组分的任意变体。其它的实施方式提供了PCSK9特异性拮抗剂，包括但不限于识别/结合SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41的单克隆抗体，其中PCSK9特异性拮抗剂结合人类和/或鼠PCSK9，其结合的KD为1.2X10-6M或更低，并且其中PCSK9特异性拮抗剂与1D05相互竞争地与PCSK9结合。在本文的具体实施方式中，进一步通过以下一种或更多种性质定义了PCSK9特异性拮抗剂：(i)当1D05等于或小于其KD时，它们在1μM或更低的浓度将1D05的结合降低至少50％；(ii)阻断PCSK9与LDL受体的结合；(iii)抑制PCSK9内化进入细胞；和/或(iv)包含特异性的抗原结合区域、VH、VL、一组CDR或重链CDR3、重链和/或轻链或本文描述的这些成分的任意变体。在具体的实施方式中，根据以上描述的PCSK9特异性拮抗剂包含：(i)公开的重链和/或轻链可变区CDR3序列(分别为SEQ IDNO：17和7)；(ii)公开的重链和/或轻链可变区CDR1(分别为SEQ IDNO：13和3)、CDR2(分别为SEQ ID NO：15和5)和CDR3(分别为SEQ ID NO：17和7)；(iii)人类重链和/或轻链序列的可变框架内的公开的重链和轻链CDR的完全互补物(SEQ ID NO：13，15，17，3，5和7)；(iv)公开的VL和/或VH区域(分别为SEQ ID NO：27和11)；(v)公开的轻链和/或Fd链(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9的氨基酸1-233(或SEQ ID NO：9))；或(vi)公开的轻链和/或重链(SEQ IDNO：26和25)。在具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂同时结合/识别SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：42。
在鉴定结合与1D05相同的或重叠表位区域的抗体的上述任意试验中，与候选结合分子的结合相比，已知结合分子(即，已知与SEQID NO：37的残基Arg194、Glu197和Arg199结合的1D05抗体分子)的结合应当是可以区分的，这可以(但不必)通过在一种或这两种分子上进行标记来实现，如技术人员所认识到的。本文所用的标记指的是整合进入/附加到抗体分子中的另一种分子或试剂。在一个实施方式中，标记物为可检测的标记，例如，放射标记的氨基酸或与生物素部分多肽连接(可用标记的亲和素(例如，包含荧光标记或可通过光学或比色方法检测的酶活性的链霉亲和素)进行检测)。本领域已知有各种标记多肽和糖蛋白的方法可供使用。用于多肽的标记物包括但不限于下列：放射性同位素或放射性核(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧磷光剂)、酶标记物(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基团、由次级报告分子识别的预先设定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链配对序列、二抗结合位点、金属结合结构域、表位标签)、磁性剂(例如钆螯合物)、毒素(如百日咳毒素)、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、正定霉素、二羟基蒽醌、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普洛奈尔、和嘌呤霉素及其类似物或其同源物。在一些实施方式中，标记物通过不同长度的间隔臂连接，以减弱潜在的空间位阻。
用于竞争试验的1D05抗体可以是具有本发明提供的1D05描述的任意抗体分子，即，对PCSK9有选择性的抗体分子，其包含：包含SEQ ID NO：27的VL和包含SEQ ID NO：11的VH。此类抗体的例子包括但不限于(i)Fab，其包含：包含SEQ ID NO：1的轻链和包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-233(或者SEQ ID NO：9)的Fd链；(ii)全长抗体分子，其包含：包含SEQ ID NO：26的轻链和包含SEQID NO：25的重链。
基于对应于SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41的区域的肽或拟肽(在选择性的实施方式中为对应于SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：42的区域)应该通过阻止PCSK9与LDLR的相互作用而具有拮抗特性。重要的是，包含SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：42的肽应该产生能够抑制PCSK9与LDLR结合和/或抑制PCSK9内化进入细胞的中和性抗体。
在具体的实施方式中，本文包含的肽包含SEQ ID NO：39或SEQID NO：41。在选择性的实施方式中，肽包含SEQ ID NO：37并且在50个氨基酸以下。在一些实施方式中，肽同时包含SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：42并且等于或小于40个氨基酸。在更具体的实施方式中，肽包含SEQ ID NO：37并且在40个氨基酸以下、30个氨基酸以下、20个氨基酸以下、或10个氨基酸以下。
可以通过使用如上所述的竞争性检验来筛选本发明的肽。如果所测的肽与1D05抗体分子(即，任何对PCSK9具有选择性的抗体分子，其包括：包含SEQ ID NO：27的VL和包含SEQ ID NO：11的VH)竞争，如这样的1D05抗体分子的结合的降低所示，则有可能该肽和1D05所结合的表位是相同的或密切相关的。另外一种确定肽是否具有1D05抗体分子的特异性的方法是将1D05抗体分子与PCSK9(1D05与该PCSK9通常具有反应活性)一起预孵育，然后加入经测定具有针对PCSK9的特异性的肽，以确定该肽与PCSK9结合的能力是否被抑制。如果所测的肽被抑制，则极为可能的是其与1D05抗体分子具有相同的或功能上等同的表位和特异性。
使用本说明书通篇所描述的常规程序和本领域普通技术人员熟知的程序，人们可以通过确定肽是否阻断PCSK9与LDL受体结合和/或是否阻止PCSK9内化进入细胞而确定与PCSK9结合的肽是否是有用的。
本申请所述的任意PCSK9特异性拮抗剂的表达及选择可通过合适的技术得以实施，包括但不限于噬菌体展示(参见，例如国际申请号WO 92/01047，Kay等人，1996，Phage Display of Peptides andProteins：A Laboratory Manual，San Diego：Academic Press)、酵母展示、细菌展示、T7展示和核糖体展示(参见，例如，Lowe和Jenutus，2004，Curr.Pharm.Biotech.517-527)。
构成本发明一部分的特定PCSK9特异性拮抗剂为抗体分子或抗体。本文所述的“抗体分子”或“抗体”指的是可选择性结合人和/鼠PCSK9的免疫球蛋白衍生的结构，其包括但不限于全长或完整抗体、抗原结合片段(从物理学或概念上讲为来自抗体的片段)、上述任一项的衍生物、上述任一项与其他多肽的融合分子、或者是为了选择性结合/抑制PCSK9功能而整合了上述任一项的任意替代结构/组分。
“完整”抗体或“全长”抗体是指这样的蛋白，其包含通过二硫键连接的两条重链(H)和两条轻链(L)，其包含：(1)按重链来讲，包含可变区(此处简称VH)和重链恒定区，后者包括三个结构域，CH1、CH2和CH3；和(2)按轻链来讲，包含轻链可变区(此处简称VL)和轻链恒定区，后者包含一个结构域CL。
抗体片段，尤其是抗原结合片段是这样的分子：其具有抗体可变区或其片段(包含一个或更多个公布的CDR3结构域、重链和/或轻链的框架区域内的重链和/或轻链，视情况而定)，这使其具有针对PCSK9(尤其是人和/或鼠PCSK9)。包含此类抗体可变区的抗体片段包括但不限于下列抗体分子：Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异性抗体分子(包含与另一个功能部分连接的本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段的抗体分子，所述功能部分具有与抗体不同的结合特异性，包括但不限于另一种肽或蛋白质，例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二聚体、分离的CDR3、微型体(minibody)、scAb、dAb片段、双体(diabody)、三体(triabody)、四体(tetrabody)、微型体以及基于蛋白骨架的人工抗体，人工抗体包括但不限于III型纤连蛋白多肽抗体(参见，例如，美国专利号6,703,199和国际申请号WO 02/32925和WO 00/34784)，或细胞色素B；参见，例如，Nygren等人，1997，Curr.Opinion Struct.Biol.7：463-469；这些公开物通过引用的方式并入本文。抗体部分或结合片段可以是天然的，或者部分或全部合成的。此类抗体片段可由本领域技术人员通过各种已知的方法制备，包括但不限于传统方法如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。
当提及抗体分子、一般性PCSK9特异性拮抗剂、编码核酸或其他物质时，本文所用的术语“分离”描述的是一种特性，此特性涉及公布的PCSK9特异性拮抗剂、核酸或其他物质，使其有别于自然界天然存在的物质。例如，这种区别可以是，其纯度与天然的不同；或其结构不同，或构成与自然界中所发现的不同的结构部分。例如，自然界未发现的结构包括重组人免疫球蛋白结构，包括但不限于具有优化的CDR的重组人免疫球蛋白结构。自然界未发现的结构的其他例子为PCSK9特异性拮抗剂或实质上不含其他细胞材料的核酸。分离的PCSK9特意性拮抗剂一般不含其它的具有不同蛋白特异性的蛋白特异性拮抗剂(即，其只对PCSK9之外的物质有具有亲和性)。
在一个特定方面，本发明提供了拮抗PCSK9功能的分离的PCSK9特异性拮抗剂。在特定的实施方式中，所述PCSK9特异性拮抗剂通过干扰PCSK9与LDL受体的结合以及由此引发的PCSK9细胞内化而抑制人和/或鼠PCSK9对细胞LDL摄取的拮抗作用。因此，公布的PCSK9特异性拮抗剂构成了降低血浆LDL-胆固醇水平的理想分子；参见，例如，Cohen等人，2005，Nat.Genet.37：161-165(其中，注意到PCSK9等位基因发生无义突变的杂合子个体的血浆LDL胆固醇水平显著降低)；Rashid等人，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：5374-5379(其中，PCSK9敲除小鼠显示出肝细胞LDLR数量增加，血浆LDL清除加快，并且血浆胆固醇水平显著下降)；和Cohen等人，2006，N.Engl.J.Med.354：1264-1272(其中，PCSK9功能丧失的人突变杂合子显示患上出动脉粥样硬化性心脏病的长期风险显著下降)。
通过重复实验发现，本文公布的1D05抗体分子对人和/或鼠PCSK9对LDL摄取的效应均具有剂量依赖性的抑制作用。因此，在具体的实施方式中，本发明包含PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中包括这样的抗体分子：其包括：包含于1D05抗体分子内的重链和/或轻链可变区(分别为SEQ IDNO：11和27)，或重链和/轻链，例如分别为SEQ ID NO：9的1-233氨基酸(或者SEQ ID NO：9)和SEQ ID NO：1，或者分别为SEQ ID NO：25和26，以及其等同物(其特点为含有不破坏1D05的PCSK9选择特性的一个或更多个保守氨基酸取代)或同源物。特定的实施方式包含这样的分离的PCSK9特异性拮抗剂：其包含本文公布的CDR结构域或本文公布的几套重链和/或轻链CDR结构域或其等同物，其特点为具有一个或更多个保守氨基酸取代。
本文所用的术语“结构域”或者“区”仅指抗体分子的各个部分，所讨论的序列或部分将位于其中或者正处于其中。
在具体的实施方式中，本发明提供了分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中，提供了这样的抗体分子，其包括：包含SEQ ID NO：11的重链可变区；其等同物(特征在于具有一个或更多个保守氨基酸取代)和其同源物。公布的拮抗剂应当逆转或抑制人或/或鼠PCSK9依赖的对细胞LDL摄取的抑制作用。在具体的实施方式中，本发明提供了公布的拮抗剂的同源物，其特点为，重链可变区序列与SEQ ID NO：11具有至少90％同一性；所述拮抗剂对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
在具体的实施方式中，本发明提供了分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中，提供了这样的抗体分子，其包含：包含SEQ ID NO：27的轻链可变区；其等同物(特征在于具有一个或更多个保守氨基酸取代)和其同源物。公布的拮抗剂应当逆转或抑制人或/或鼠PCSK9依赖的对细胞LDL摄取抑制作用。在具体的实施方式中，本发明提供了公布的拮抗剂的同源物，其特点为，轻链可变区序列与SEQ ID NO：27具有至少90％的同一性；所述拮抗剂对人和/或鼠PCSK9依赖的对细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
在具体的实施方式中，本发明提供了分离的PCSK9特异性抗体分子，其包括：包含SEQ ID NO：11的重链可变区和包含SEQ ID NO：27的轻链可变区；或其等同物(特征在于，在规定的序列中含有一个或更多个保守氨基酸取代)。具体的实施方式为：所述拮抗剂对人和/或鼠PCSK9依赖的对细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。在具体的实施方式中，本发明提供了公布的拮抗剂的同源物，其特点为，重链和轻链可变区序列分别与SEQ ID NO：11和27具有至少90％的同一性；所述拮抗剂对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
在特定的实施方式中，本发明提供了分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中，提供了这样的PCSK9抗体分子：其包含重链可变区CDR3序列SEQ ID NO：17；和其等同物，其特点为含有一个或更多个保守氨基酸取代；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。具体的实施方式提供了分离的拮抗剂，其在重链可变区还包括CDR1和/或CDR2序列，分别包含SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：15；或其等同物，其特点为，在任意一个或更多个CDR序列中具有一个或更多个保守氨基酸取代。在具体的实施方式中，本发明提供了公布的拮抗剂的同源物，其特点为，CDR3序列或CDR1、CDR2和CDR3中各个序列分别与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：13、15和17的同一性至少为90％(视情况而定)；所述拮抗剂对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
在特定的实施方式中，本发明提供了分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中，提供了这样的抗体分子，其包括：包含SEQ ID NO：7的轻链可变区CDR3序列；及其等同物，其特点为含有一个或更多个保守氨基酸取代；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。具体的实施方式提供了分离的拮抗剂，其在轻链可变区中还包含CDR1和/或CDR2序列，分别包含SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：5；或其等同物，其特点为，在任意一个或更多个CDR序列中具有一个或更多个保守氨基酸取代。在具体的实施方式中，本发明提供了公布的拮抗剂的同源物，其特点为，CDR3序列或CDR1、CDR2和CDR3中各个序列分别与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：3、5和7的同一性至少为90％(视情况而定)；所述拮抗剂对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
在具体的实施方式中，本发明提供了分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中提供了这样的抗体分子，其包含重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列，其分别包含SEQ ID NO：17和7；或其等同物，其特点为，在任意一个或更多个CDR3序列中具有一个或更多个保守氨基酸取代；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。在具体的实施方式中，本发明了提供公布的拮抗剂的同源物，其特点为，重链和轻链可变区CDR3序列与SEQ ID NO：17和7的同一性分别至少为90％；所述拮抗剂对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
具体的实施方式提供了分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中提供了这样的抗体分子，其包括重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，其分别包含SEQ ID NO：13、15、17、3、5和7；和其等同物，其特点为，在任意一个或更多个CDR序列中具有一个或更多个保守氨基酸取代；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。在具体的实施方式中，本发明提供了公布的拮抗剂的同源物，其特点为，重链和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列与SEQ ID NO：13、15、17、3、5和7的同一性分别至少为90％；所述拮抗剂对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
本发明的一个特别方面提供了分离的PCSK9特异性拮抗剂，在具体的实施方式中提供了这样的抗体分子：其为上述公布的分子的变体，其包括SEQ ID NO：45的重链可变区CDR3序列，其中CDR3序列不是SEQ ID NO：17；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。本文的附加实施方式还包括SEQ ID NO：43的重链可变区CDR1序列(其中变体序列不是SEQ ID NO：13)和/或SEQ ID NO：44的重链可变区CDR2序列(其中变体序列不是SEQ ID NO：15)；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。在其他实施方式中，本发明包括：包含CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区序列，其在各自区域中分别包含SEQ ID NO：43、44和45；分别不是SEQ ID NO：13、15和17；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
本发明另一方面还包括分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中包括这样的抗体分子：其为上述公布的分子的变体，其包括SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR3序列，其中CDR3序列不是序列SEQ ID NO：7；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。本文的附加实施方式还包含SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR1序列，其中变体序列不是SEQ ID NO：3；和/或SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR2序列，其中变体序列不是SEQ ID NO：5；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。在其他实施方式中，本发明包括轻链可变区序列，其包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其在各自区域内分别包含SEQ ID NO：46、47和48，其分别不是SEQ ID NO：3、5和7；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
另外的不同的实施方式包含分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包括：(a)包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，其中，(i)CDR1序列包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：43与SEQ ID NO：13不同；(ii)CDR2序列包含SEQ ID NO：15、或SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：44与SEQ ID NO：15不同；和(iii)CDR3序列包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：45与SEQ ID NO：17不同；和/或(b)包含CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，其中，(i)CDR1序列包含SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：46，SEQ ID NO：46与SEQ ID NO：3不同；(ii)CDR2序列包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：47与SEQ IDNO：5不同；和(iii)CDR3序列包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：48与SEQ ID NO：7不同；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
本发明的其他方面包含分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中包含这样的抗体分子：其为上述公布的序列的变体，其包括(i)重链可变区序列，其包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其在各自区域内分别包含SEQ ID NO：43、44和45，其分别不是SEQID NO：13、15和17；和(ii)轻链可变区，包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其在各自区域内分别包含SEQ ID NO：46、47和48，其分别不是SEQ ID NO：3、5和7；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
在本文的具体实施方式中，CDR取代1D05相应的区域(无保守氨基酸取代)；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。在特定实施方式中，本发明包含分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中包括这样的抗体分子：其包含重链和/或轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO：50和49；所述变体SEQ ID NO分别不是SEQ ID NO：11和27；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
具体的实施方式包括任意分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中包括这样的抗体分子：其包含在SEQ ID NO：51-56任一项之中发现的重链可变区序列，可选地还包含本文公布的轻链可变区序列(例如SEQ ID NO：27)；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。其它的实施方式包括任何分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中包括：包含在SEQ ID NO：57-60中的任意项中发现的轻链可变区序列，任选地包含本文公开的重链可变区序列(例如SEQ ID NO：11)的抗体分子；其具体的实施方式对人和/或鼠PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
特定实施方式为分离的PCSK9特异性拮抗剂，其在全长抗体中包含上述VH和VL区。本文的具体的实施方式还包含一系列的氨基酸，其选自：SEQ ID NO：21(IgG1)、SEQ ID NO：22(IgG2)、SEQ ID NO：23(IgG4)和SEQ ID NO：24(IgG2m4)。
正如本领域技术人员认为的那样，保守氨基酸取代是指这样的取代：用一个赋予相似或更佳(用于指定目的)功能和/或化学特征的氨基酸残基替代另一个氨基酸残基。运用本领域现有或本文所述的功能测试方法，可以测试具有这种保守氨基酸取代的拮抗剂的持久或更高的活性。具有一个或更多个保守氨基酸取代的PCSK9特异性拮抗剂(这使其在与本文描述的1D05抗体分子相同或更佳的水平上保持选择性结合人PCSK9并拮抗PCSK9功能的能力)在本文中被称作所公布的拮抗剂的“功能等同物”，并构成本发明的具体的实施方式。保守氨基酸取代常常是这样的：其中某氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域有定义。这些家族包括：带有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、络氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链的氨基酸(例如，络氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此类修饰不被设计为显著减弱或改变PCSK9特异性拮抗剂的结合或功能抑制特性，而是可能增强这种特性。进行替代的目的并不十分重要，可包括但不限于，用一个残基替代某残基，以便维持或增强分子的结构、分子的电荷或疏水性、或分子的大小。例如，人们只是希望用一个具有相同极性或电荷的残基代替一个并不理想的残基。可通过本领域已知的标准技术引入这样的修饰，如定向诱变技术和PCR介导的诱变技术。本领域技术人员用于完成氨基酸取代的一项专门技术为丙氨酸扫描诱变，例如在MacLennan等人，1998，Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67，和Sasaki等人，1998，Adv.Biophys.35：1-24中所讨论的那样。
另一方面，本发明提供了分离的PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中，提供了这样的抗体分子：其包含重链和/或轻链可变区，其包含与公布的抗体的相应氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中抗体分子抑制PCSK9依赖的细胞LDL摄取的抑制作用。具体的实施方式为这样的拮抗剂：其包含重链和/或轻链可变区，其与公布的重链和/或轻链区的分别具有至少90％的同一性。提及“至少90％同一性”包括本文公布的分子全长的至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％的相同序列。
生产含有与本文所述拮抗剂的氨基酸序列同源的氨基酸序列的PCSK9特异性拮抗剂旨在改善拮抗剂的一种或更多种性质，而不对其PCSK9特异性产生负面影响。获得这些序列的一个方法(但不是本领域技术人员可以获得的唯一方法)是：使编码PCSK9特异性拮抗剂或其特异性决定区的序列发生突变；表达包含突变序列的拮抗剂；用已有的功能测试方法(包括本文所述的方法)测定编码的拮抗剂的功能维持特性。突变可以是定点或随机突变。然而，正如本领域技术人员认识到的那样，其他突变方法能够很容易产生同样的效果。例如，在某些方法中，突变谱受限于基于氨基酸化学或结构特性的非随机靶向保守取代，或者受限于蛋白的结构上的考虑。在亲和成熟实验中，在单选分子中可发现若干这样的突变，而不管其是随机选择的还是非随机选择的。还有针对亲和成熟的各种基于结构的方法，如下列文献所证实，例如，美国专利号7,117,096、PCT公开号WO 02/084277与WO 03/099999；这些公开物通过引用的方式并入本文。
正如本文所用的，两个氨基酸或核酸序列间的同源百分率等于两个序列间的同一性百分率，这两个术语在通篇可交替互用。正如本文采用的，两个核酸或氨基酸序列的％同一性通过运用Karlin与Altschul的算法确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993)。这种算法被归入NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410.)。运用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索(分值＝100，字长＝12)，以获得与本发明核酸分子同源的核酸序列。运用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(分值＝50，字长＝3)，以获得与本文公开的氨基酸序列同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对以便进行比较，运用了Gapped BLAST，如Altschul等人，1997，NucleicAcids Res.25：3389-3402所描述。当运用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
利用一个或更多个公开的PCSK9特异性分子的组分来产生其他具有相同或更佳特异性的结合分子在本技术领域的范围内是熟知的。例如，运用DNA重组技术可完成这一过程。其中一个具体的例子涉及将编码免疫球蛋白可变区或抗体的一个或更多个CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的可变区、恒定区、或恒定区加框架区(视情况而定)。此类分子构成本发明的重要方面。特异性免疫球蛋白或相应序列(其中可插入特定的公开序列，或者在其他情况下构成其必需部分)包括但不限于下列构成本发明特定实施方式的抗体分子：Fab(带有轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、轻链恒定区(CL)和重链恒定区1(CH1)结构域的单价片段)、F(ab’)2(双价片段，包含两个Fab片段，二者由二硫键桥连接，或者位于绞链区)、Fd(VH和CH1结构域)、Fv(VL和VH结构域)、scFv(单链Fv，其中VL和VH由连接子如多肽连接子连接，参见，例如，Bird等人，1988，Science242：423-426；Huston等人，1988，PNAS USA 85：5879-5883)、双特异性抗体分子(包含与另一个功能部分连接的本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段的抗体分子，所述功能部分具有与抗体不同的结合特异性，包括但不限于另一种肽或蛋白质，例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二聚体(参见，例如，PCT/US92/09965)，分离的CDR3、微型抗体(自我组装为约为80KDa的双价二聚体的单链-CH3融合物)、scAb(包含VH和VL以及CL或CH1的抗体片段)、dAb片段(VH结构域，参见，例如，Ward等人，1989，Nature341：544-546；和McCafferty等人，1990，Nature 348：552-554；或VL结构域；Holt等人，2003，Trends in Biotechnology 21：484-489)；双体(参见，例如，Holliger等人，1993，PNAS USA 90：6444-6448，和国际申请号WO 94/13804)、三体、四体、微型抗体(与CH3结合的scFv；参见，例如，Hu等人，1996 Cancer Res.56：3055-3061)、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或其任意衍生物，和基于蛋白骨架的人工抗体，包括但不限于III型纤连蛋白多肽抗体(参见，例如，美国专利号6,703,199和国际申请号WO 02/32925)或者细胞色素B；参见，例如，Koide等人，1998，J.Molec.Biol.284：1141-1151；和Nygren等人，1997，Current Opinion in StructuralBiology 7：463-469；其公开内容皆通过引用的方式并入本文。某些抗体分子(包括但不限于Fv、scFv、双体或结构域抗体(Domantis))可通过引入二硫键使VH和VL结构域连接成线而变得稳定，参见，例如，Reiter等人，1996，Nature Biotech.14：1239-1245；其公开内容通过引用的方式并入本文。双特异性抗体可由常规技术生产(参见，例如，Holliger和Winter，1993 Current Opinion Biotechnol.4：446-449，其具体方法包括化学生产或从杂交瘤生产)和其他技术，包括但不限于BiTETM技术(具有一个肽接头的具有不同特异性的抗原结合区的分子)和knobs-into-holes工程(参见，例如，Ridgeway等人，1996，Protein Eng.9：616-621；其公开内容通过引用的方式并入本文)。双特异性双体可以在大肠杆菌中生产，本领域技术人员将认识到，这些分子正如其他PCSK9特异性拮抗剂一样可以在合适的库中使用噬菌体展示进行选择(参见，例如，国际申请号WO 94/13804；其公开内容通过引用的方式并入本文)。
感兴趣的CDR所插入的可变结构域，可以从任何胚系或重排人类可变结构域获得。可变结构域域也可通过合成产生。CDR区可用重组DNA技术引入各可变结构域。可以实现该结果的一种方法在Marks等人，1992Bio/Technology 10：779-783中有描述；其公开内容通过引用的方式并入本文。可变重链结构域可以与可变轻链结构域配对以提供抗原结合位点。另外，独立区(例如，单独的可变重链结构域)可用于结合抗原。技术人员也清楚地知道，Fv片段的两个结构域，VL和VH，尽管可能由分离的基因编码，但仍可使用重组方法通过可以使它们成为单独蛋白链(其中VL和VH区配对以形成单价分子(scFv))的合成接头连接起来。
具体实施方式提供了位于胚系框架区内的CDR。框架区(包括但不限于人类框架区)为本领域技术人员所熟知(如，人类或非人类框架)。这些框架区可能天然产生或是共有框架区。一方面，本发明的抗体的框架区是人类的(参见，例如，Clothia等人，1998 J.Mol.Biol.278：457-479中的人类框架区列表；其公开内容通过引用全文并入本文)。本文的具体实施方式提供了重链可变CDR3 SEQ ID NO：17进入VH1A_3代替相关CDR。本文的具体实施方式提供了轻链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列(分别为SEQ ID NO：NO 13，15和17)进入VH1A_3代替相关CDR。本文的具体实施方式提供了轻链可变CDR3 SEQ ID NO：7进入VK1_4代替相关CDR。本文的具体实施方式提供了轻链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列(分别为SEQ ID NO：NO 3，5和17)进入VK1_4代替相关CDR。本文的具体实施方式进一步提供了重链可变CDR3 SEQ ID NO：17和轻链可变CDR3 SEQ ID NO：7分别进入VH1A_3和VK1_4胚系序列。进一步的实施方式提供了重链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列(分别为SEQ ID NO：NO 13，15和17)进入VH1A_3代替相关CDR；和轻链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列(分别为SEQID NO：NO 3，5和17)进入VK1_4代替相关CDR。
本发明涵盖了人类的、人源化的、去免疫化的、嵌合的和灵长源化的抗体分子。本发明也涵盖了由镶饰工艺生产的抗体分子；参见，例如，Mark等人，1994 Handbook of Experimental Pharmacology，卷113：The pharmacology of monoclonal Antibodies，Springer-Verlag，pp.105-134；其公开内容通过引用的方式并入本文。与公开的抗体分子有关的“人类”具体指的是具有衍生自人类胚系免疫球蛋白序列的可变和/恒定区的抗体分子，其中所述的序列可能(但不是必须)是修饰/改变为具有某些非人类胚系免疫球蛋白序列编码的氨基酸取代或残基。可以通过以下方法导入这种变异：包括但不限于随机或特定位点的体外诱变，或体内体细胞突变。文献中讨论的突变技术的具体例子在Gram等人，1992 PNAS USA 89：3576-3580；Barbas等人，1994PNAS USA 91：3809-3813，和Schier等人，1996 J.Mol.Biol.263：551-567中公开，其公开内容通过引用的方式并入本文。这些只是具体例子，并非代表仅有地可获得的技术。在科技文献中存在多种突变技术，这些技术对于技术人员而言是可以获得的并且是可以良好认识到的。与公开的抗体分子有关的“人源化的”具体指的是这样的抗体分子：其中衍生自另一种哺乳动物(如鼠)物种的CDR序列被移植到人类框架序列。与公开的抗体分子有关的“灵长源化的”具体指的是这样的抗体分子：其中非灵长类的CDR序列被插入到灵长类的框架序列中，参见，例如，WO 93/02108和WO 99/55369；其公开内容通过引用的方式并入本文。
本发明的特定抗体是单克隆抗体，并且在特定的实施方式中，其为下列形式中的一种：IgD，IgA，IgE，IgM，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或前述任一项的任何衍生物。在这方面，表述“其衍生物”或“衍生物”尤其包括，(i)在一个或两个可变区(即VH和/或VL)中具有保守性修饰的抗体和抗体分子，(ii)在重链和/或轻链恒定区被操作的抗体和/或抗体分子，和/或(iii)包含在通常情况下并非免疫球蛋白分子一部分的其他化学部分的抗体和抗体分子(例如，聚乙二醇化)。
可以在一个或更多个VH和/或VL CDR区内进行可变区的操作。定点诱变、随机诱变或其他产生序列或分子多样性的方法可用于产生突变，随后可以在现有的体外或体内检验(包括本文描述的那些)中检测突变的特定的感兴趣的功能特性。
本发明的抗体还包括那些已在VH和或VL内的框架残基进行过修饰以改善一个或更多个感兴趣的抗体特性的抗体。典型地，进行这种框架修饰是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或更多个框架残基“反突变”为相应的胚系序列。更具体地，已经进行体细胞突变的抗体可能包含不同于衍生该抗体的胚系序列的框架残基。可以通过比较抗体框架残基序列和衍生该抗体自的胚系序列鉴别这种残基。这种“反突变”的抗体也涵盖在本发明内。另外一种框架修饰的类型包括在框架区内或者甚至在一个或更多CDR区内使一个或更多个残基突变，以移除T细胞表位，从而降低抗体潜在的免疫原性。该方法也被称为“去免疫化”，并且在Carr等人美国专利公开号20030153043中有进一步的详细描述；其公开内容通过引用的方式并入本文。
除了在框架或CDR区的修饰之外，或作为在框架或CDR区的修饰的替代，本发明的抗体可被工程化改造为在Fc或恒定区中包括修饰，当所述修饰存在时，通常改变抗体的一个或更多个功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。
已经大体地描述了产生“杂交”或“组合”的IgG形式的概念，其包含各种抗体同种型以着眼于想要的效应子功能；参见，例如，Tao等人，1991 J.Exp.Med.173：1025-1028。本发明的具体实施方式包括在Fc区具有特定操作的抗体分子，已经发现所述操作在部分抗体上导致与FcγR受体、C1q或FcRn的结合降低或被改变。因此，本发明包括与本文的描述一致的抗体，其保持通常的药物代谢动力学(“PK”)特性，但不引起(或引起的程度更低)抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)、补体介导的细胞毒性(“CMC”)，或形成免疫复合物。本发明的具体实施方式提供了定义为与本发明一致的抗体分子，其包括SEQ IDNO：24(作为其免疫球蛋白的一部分)，在特定实施方式中，包括SEQID NO：24的残基107-326(作为免疫球蛋白结构的一部分)。本发明包括这样的抗体分子，其包含：(i)包含SEQ ID NO：1的轻链，和(ii)包含SEQ ID NO：11的重链，其和一系列氨基酸顺次排列(毗邻)或其后紧随一系列氨基酸，这些氨基酸选自：SEQ ID NO：21(IgG1)、SEQ ID NO：22(IgG2)、SEQ ID NO：23(IgG4)和SEQ ID NO：24(IgG2m4)。图6显示了包含SEQ ID NO：24(尤其是IgG2m4)的序列与包含IgG1、IgG2和IgG4的序列的比较。可以分别在SEQ IDNO：25和26中找到成熟、分泌型的抗-PCSK9IgG2m4重链和轻链氨基酸序列。至少部分由所述序列编码的抗体分子涵盖在本文中。
特异性的PCSK9特异性拮抗剂可能带有可检测的标记物，或者可能与毒素(例如，细胞毒素)、放射性同位素、放射性核素、脂质体、靶标部分、生物传感器、阳离子尾或酶(如，通过肽键或连接子)结合。这种PCSK9特异性拮抗剂成分构成了本发明另外的一个方面。
另一方面，本发明提供了编码公开的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸。前述的“分离的”是指使提及的物质与其天然发现的状态不同的性质。例如，这种不同可以是，其纯度与天然发现的不同，其结构不同，或其可构成不同于自然界发现的结构的一部分。在自然界找不到的核酸的一个例子是，例如，基本上不含其他细胞物质的核酸。核酸可能存在于全细胞中、在细胞裂解液中或者以部分纯化或基本纯化的形式存在。在具体例子中，核酸可能在从其他细胞组成或其他杂质(例如，其他细胞核酸或蛋白)中纯化出来的时候分离得到，例如，使用标准技术，包括但不限于，碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域中已知的其他合适方法。核酸可以包括DNA(包括cDNA)和/或RNA。可以用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸。对于用杂交瘤(如，从带有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码该杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因库获得的抗体(如，使用噬菌体展示技术)，可以从库中回收编码抗体的核酸。
本发明包括编码公开的可变重链和/或轻链及其选择性成分(特别是公开的可变区或各自的CDR区，尤其是CDR3)的分离的核酸。因此，在具体的实施方式中，在抗体框架区内提供了CDR，在特定的实施方式中，在人类框架区中提供了CDR。具体实施方式提供了编码进入胚系框架区(包括但不限于人类胚系框架区)的CDR的分离的核酸。本文的具体实施方式提供了编码重链CDR SEQ ID NO：17的分离的核酸(在具体实施方式中，所述的核酸包含SEQ ID NO：18)，其进入VH1A_3代替编码相关CDR的核酸。本文的具体实施方式提供了分别编码重链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列SEQ ID NO：13，15和17的核酸(并且，在特定实施方式中，所述的核酸分别包括SEQ ID NO：14，16和18)，其进入VH1A_3代替相关CDR。本文的具体实施方式提供了编码轻链CDR SEQ ID NO：7的分离核酸(在具体实施方式中，所述的核酸包含SEQ ID NO：8)，其进入VK1_4代替编码相关CDR的核酸。本文的具体实施方式提供了分别编码轻链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列SEQ ID NO：3，5和7的核酸(并且，在特定实施方式中，所述的核酸分别包括SEQ ID NO：4，6和8)，其进入VK1_4代替相关的CDR。本文的具体实施方式进一步提供了重链可变CDR3 SEQ ID NO：17(并且，在特定实施方式中，前述的核酸包括SEQ ID NO：18)和轻链可变CDR3 SEQ ID NO：7(并且，在特定实施方式中，所述的核酸包括SEQ ID NO：8)分别进入VH1A_3和VK1_4胚系序列。另外的实施方式分别提供了重链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列SEQ ID NO：13，15和17(并且，在特定实施方式中，所述的核酸分别包括SEQ ID NO：14，16和18)，其进入VH1A_3代替相关CDR；并分别提供了轻链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列SEQ ID NO：3，5和7(并且，在特定实施方式中，所述的核酸分别包括SEQ ID NO：4，6和8)，其进入VK1_4代替相关的CDR。
编码可变区的分离的核酸能够以任何期望的抗体分子形式提供，包括但不限于：F(ab’)2，Fab，Fv，scFv，双特异性抗体分子(包含与另一个功能部分连接的本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段的抗体分子，所述功能部分具有与抗体不同的结合特异性，包括但不限于另一种肽或蛋白质，例如抗体或受体配体)，双特异性单链Fv二聚体，微型抗体，dAb片段，双体，三体或四体，微型抗体，IgG，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgD，IgA，IgE或其任何衍生物。
具体实施方式提供了编码PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸，在更具体的实施方式中，提供了这样的抗体分子，其包括：包含SEQID NO：11的重链可变结构域；其具体实施方式包含核酸序列SEQ IDNO：12。本发明的具体实施方式提供了编码PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸，在更具体的实施方式中提供了这样的抗体分子，其还包括：(i)编码重链CDR1氨基酸序列SEQ ID NO：13的核酸(其具体实施方式包含核酸SEQ ID NO：14)，和/或(ii)编码重链CDR2氨基酸序列SEQ ID NO：15的核酸(其具体实施方式包含核酸SEQ IDNO：16)。具体实施方式提供了编码PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸，在更具体的实施方式提供了这样的抗体分子，其包括：包含SEQID NO：27的轻链可变结构域域；其具体实施方式包括核酸序列SEQID NO：28。本发明的具体实施方式提供了编码PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸，在更具体的实施方式中提供了这样的抗体分子，其还包括：(i)编码轻链CDR1氨基酸序列SEQ ID NO：3的核酸(其具体实施方式包含核酸SEQ ID NO：4)，和/或(ii)编码轻链CDR2氨基酸序列SEQ ID NO：5的核酸(其具体实施方式包含核酸SEQ IDNO：6)。具体实施方式提供了编码PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸，在更具体的实施方式中提供了这样的抗体分子，其包括：包含SEQID NO：11的重链可变结构域；其具体实施方式包含核酸序列SEQ IDNO：12；以及包含SEQ ID NO：27的轻链可变域，其具体实施方式包括核酸序列SEQ ID NO：28。具体实施方式提供了分离的核酸，其编码：(i)重链可变CDR1、CDR2和/或CDR3序列(分别为SEQ IDNO：13，15和17；其具体实施方式包括核酸SEQ ID NO：14，16和/或18)，优选处于框架区内(包括但不限于人类框架区)；和(ii)轻链CDR1、CDR2和/或CDR3序列(分别为SEQ ID NO：3，5和7；其具体实施方式包括核酸SEQ ID NO：4，6和/或8)，优选处于框架区内(包括但不限于人类框架区)。本发明在具体实施方式中进一步提供了上述公开的拮抗剂的同源物，其特征为重链和/或轻链可变区，或CDR区(视情况而定)(无论存在的哪一个)至少90％等同于1D05的相应序列。
另外的实施方式提供了编码PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸，在更具体实施方式中提供了这样的抗体分子，其包括：包含SEQ IDNO：1的轻链，(其具体实施方式包含核酸SEQ ID NO：2)和包含SEQID NO：9的氨基酸1-233或SEQ ID NO：9的重链或Fd链(其具体实施方式分别包含SEQ ID NO：10的核酸1-699，或SEQ ID NO：10)。另外的实施方式提供了编码PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸，在更具体实施方式中提供了这样的抗体分子，其包括：包含SEQ IDNO：26的轻链(其具体实施方式包含SEQ ID NO：30)和包含SEQ IDNO：25的重链，由SEQ ID NO：25(其具体实施方式包含SEQ ID NO：29)。本发明进在具体实施方式中进一步提供了以上公开的拮抗剂的同源物，其特征为，重链和/或轻链至少90％等同于1D05的相应序列。
本发明的具体实施方式包括编码抗体分子的核酸，这些抗体分子在Fc区内具有特定操作，所述操作在部分抗体上导致与FcγR受体、C1q或FcRn的结合降低或被改变。本发明的一个实施方式是分离的核酸，其编码抗体分子，所述抗体分子包含SEQ ID NO：24作为其免疫球蛋白结构的一部分，在特定实施方式中，还包括SEQ ID NO：24的107-326残基。在具体的实施方式中，可以通过在合适的表达载体中合成并组装的寡核苷酸产生核酸，从所述核酸表达产生PCSK9特异性拮抗剂；参见，例如，Knappick等人，2000 J.Mol.Biol.296：57-86，和Krebs等人，2001 J.Immunol.Methods 254：67-84。
本发明包括编码抗体分子的核酸，包括：(i)编码轻链的核酸，所述轻链包含SEQ ID NO：1(其具体实施方式包含核酸SEQ ID NO：2)，和(ii)编码重链的核酸，所述重链包含SEQ ID NO：11(其具体实施方式包含核酸SEQ ID NO：12)，其与编码一组氨基酸的一组核苷酸顺次排列(毗邻)，所述氨基酸酸选自：SEQ ID NO：21(IgG1)、SEQ ID NO：22(IgG2)、SEQ ID NO：23(IgG4)和SEQ ID NO：24(IgG2m4)。成熟、分泌型的抗PCSK9IgG2m4重链和轻链的核苷酸序列可以分别是SEQ ID NO：29和30。包含重链和轻链1D05抗PCSK9IgG2m4抗体分子的质粒序列可以分别是SEQ ID NO：31和32。编码这类抗体分子的核酸构成本文重要的实施方式。
本发明还包括分离的核酸，其包含与本文描述的核苷酸序列的全长具有至少大约90％同一性，优选具有至少大约95％同一性的核苷酸序列，并且，所述核苷酸序列编码PCSK9特异性的拮抗剂，所述拮抗剂对PCSK9依赖的细胞LDL摄取抑制效应的抑制至少为10％。
贯穿于本申请书，提及“至少大约90％的同一性”包括至少大约90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％的同一性。
本发明进一步提供了分离的核酸，其至少一部分在严谨杂交条件下与由SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：28组成的核酸的互补物杂交，所述核酸赋予抗体分子与PCSK9特异性结合并拮抗PCSK9功能的能力；还提供了通过所述核酸表达的PCSK9特异性拮抗剂。杂交核酸的方法在本技术领域中是众所周知的；参见，例如，Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1989。严谨杂交条件包括在68℃在5x SSC/5x丹哈德溶液(或等量的)/1.0％SDS中杂交，和在室温在0.2x SSC/0.1％SDS洗涤。中度严谨条件包括在42℃在3x SSC中洗涤。盐浓度和温度参数能够调整至达到探针和目标核酸间一致性最佳水平。本领域技术人员可以操作不同的杂交和/或洗涤条件以特异性靶向杂交部分中与SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：28具有至少80、85、90、95、98或99％同一性的核酸。影响杂交条件的选择的基本参数和涉及合适条件的指导见Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9和11章，1989和Ausubel等人(eds)，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，第2.10和6.3-6.4节，1995(其公开内容通过引用的方式并入本文)，并且可以由本领域技术人员容易地确定。具有一个或更多个可变区(可变区包含在严谨杂交条件下与由SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：28组成的核酸的互补物杂交的核酸)的PCSK9拮抗剂应该可以有效拮抗PCSK9的一种或更多种功能。因此，前述的拮抗剂和编码核酸构成本发明重要的实施方式。
另一方面，本发明提供了包含本文中公开的核酸的载体。根据本发明所述的载体包括但不限于适合于为预期目的，在适当水平上表达期望抗体分子的质粒及其他表达构建体(例如，噬菌体或噬菌粒，视情况而定)；参见，例如，Sambrook和Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual：第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；其公开内容通过引用的方式并入本文。对于多数克隆目的，可以使用DNA载体。典型载体包括质粒、经修饰的病毒、噬菌体、粘性质粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体和其他形式的游离或整合的DNA。本领域技术人员完全可以确定用于特定的基因转移、产生重组PCSK9特异性拮抗剂或其他用途的合适的载体。在具体的实施方式中，除了重组基因外，载体可能还包含为了在宿主细胞内自主复制的复制起点，合适的调控序列，例如启动子、终止序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、可选择性标记、有限数量的可用的限制性酶切位点和/或其他适当的、为了高拷贝数目潜力的序列。用于生产蛋白特异性拮抗剂的表达载体的例子在本技术领域是众所周知的；参见，例如，Persic等人，1997Gene 187：9-18；Boel等人，2000 J.Immunol.Methods 239：153-166，和Liang等人，2001 J.Immunol.Methods247：119-130；其公开内容通过引用的方式并入本文。如果需要，可以使用本技术领域熟知的技术将编码拮抗剂的核酸整合进入宿主染色体中；参见，例如，Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1999，和Marks等人，国际申请号WO 95/17516。也可以在保持游离的或导入人工染色体的质粒上表达核酸；参见，例如，Csonka等人，2000 J.Cell Science 113：3207-3216；Vanderbyl等人，2002Molecular Therapy 5：10。特别地，对于抗体分子，可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入不同的载体，或者更加典型的，可以将这两个基因插入相同的表达载体。可以使用标准技术将编码任何PCSK9特异性拮抗剂或其成分的核酸插入表达载体中(例如，在核酸片段和载体上互补的互补性限制酶性位点的连接，或者，如果不存在限制性位点的话进行平末端连接)。进行该过程的另外一个具体例子是通过重组方法，例如，Clontech“InFusion”系统，或Invitrogen“TOPO”系统(两者都是体外的)，或在细胞内(如Cre-Lox系统)。特别地，对于抗体分子，轻链和重链可变区可用于产生任意抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入表达载体中，所述表达载体已经编码想要的同种型的重链恒定区和轻链恒定区，从而VH片段与载体内的CH片段可操作地连接并且VL片段与载体内的CL片段可操作地连接。此外/或者，包含编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸的重组表达载体可以编码促进宿主细胞分泌拮抗剂的信号肽。可以将核酸克隆进入载体，从而编码信号肽的核酸与编码PCSK9-特异性拮抗剂的核酸毗邻处于读码框中。信号肽可以是免疫球蛋白或非免疫球蛋白信号肽。本领域技术人员可以获得的任意技术均可用于将核酸引入宿主细胞；参见，例如，Morrison，1985Science，229：1202。将感兴趣的核酸分子亚克隆进入表达载体、转变或转染含有载体的宿主细胞的方法，以及制备基本上纯的蛋白的方法(包括以下步骤：将各表达载体引进宿主细胞，以及在在适当条件下培养宿主细胞)是众所周知的。可以使用传统方法从宿主细胞收获按这样的方法产生的PCSK9特异性拮抗剂。适合于将核酸引进目标细胞的技术将依赖于用到的细胞类型。一般性的技术包括但不限于磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖，电穿孔，脂质体介导的转染法和使用适合于目标细胞系的病毒的转导(例如，逆转录病毒，牛痘，杆状病毒或噬菌体)。
另一方面，本发明提供了分离的细胞，其包含编码公开的PCSK9-特异性拮抗剂的核酸。本文涉及到多种不同的细胞系，并且这些细胞系可以用来进行PCSK9特异性拮抗剂的重组生产，包括但不限于那些来自于原核生物的细胞系(例如，大肠杆菌，杆菌和链霉菌)以及来自于真核生物的细胞系(例如，酵母菌，杆状病毒和哺乳动物)；参见，例如，Breitling等人，Recombinant antibodies，John Wiley &Sons，Inc.and Spektrum Akademischer Verlag，1999；其公开内容通过引用的方式并入本文。包含本文公开的核酸或拮抗剂的植物细胞(包括转基因植物)和动物细胞(包括转基因动物)(除人类以外)也被认为是本发明的一部分。合适的哺乳动物细胞或细胞系包括但不限于那些来自于中国仓鼠卵巢(CHO细胞，包括但不限于DHFR-CHO细胞，在Urlaub和Chasin，1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220中有描述)例如，与DHFR选择性标记一起使用(例如，在Kaufman和Sharp，1982 Mol.Biol.159：601-621中有描述)、NS0骨髓瘤细胞(其中可以使用如WO 87/04462，WO 89/01036和EP338,841描述的GS表达系统)、COS细胞、SP2细胞、HeLa细胞，幼仓鼠肾细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人体胚胎肾脏细胞、人体胚胎视网膜细胞、及其他包含本文公开的核酸或拮抗剂的细胞构成本发明另外的实施方式；以上引用的公开内容通过引用的方式并入本文。本发明的包括编码公开的PCSK9-特异性拮抗剂的核酸的具体实施方式，包括但不限于大肠杆菌；参见，例如Plückthun，1991Bio/Technology 9：545-551，或酵母菌，例如毕赤酵母属及其重组衍生物(参见，例如，Li等人，2006 Nat.Biotechnol.24：210-215)；以上公开内容通过引用的方式并入本文。本发明的具体实施方式涉及包含编码公开的PCSK9特异性拮抗剂的核酸的真核细胞，参见Chadd和Chamow，2001 Current Opinion in Biotechnology 12：188-194，Andersen和Krummen，2002 Current Opinion in Biotechnology13：117，Larrick和Thomas，2001 Current Opinion in Biotechnology12：411-418；其公开内容通过引用的方式并入本文。本发明的具体实施方式涉及包含编码公开的PCSK9特异性拮抗剂的核酸的哺乳动物细胞，其能够以合适的翻译后修饰生产PCSK9特异性拮抗剂。翻译后修饰包括但不限于二硫键形成和糖基化。翻译后修饰的另一个类型是信号肽的切割。本文优选的实施方式具有适当的糖基化；参见，例如，Yoo等人，2002J.Immunol.Methods 261：1-20；其公开内容通过引用的方式并入本文。天然产生的抗体包含至少一个与重链连接的N-连接的糖。同上。不同类型的哺乳动物宿主细胞可用于提供有效的翻译后修饰。这种宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、Hela细胞、C6细胞、PC12细胞和骨髓瘤细胞；参见Yoo等人，2002Immunol.Methods 261：1-20，和Persic等人，1997Gene 187：9-18；其公开内容通过引用的方式并入本文。
另一方面，本发明提供了包含本发明的多肽的分离的细胞。
另一方面，本发明提供了制备本发明的PCSK9特异性拮抗剂的方法，其包括：在允许表达PCSK9特异性拮抗剂的条件下，或允许表达并将所述重链和/或轻链或片段组装(例如VH与VL，或一个或更多个公布的重链和/或轻链可变区CDR序列)进入PCSK9特异性拮抗剂的条件下，孵育包含编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸，或包含编码想要的具有针对人类和/或鼠PCSK9的特异性的PCSK9特异性拮抗剂的重链和/或轻链或其片段的核酸的细胞；并且从细胞分离所述PCSK9特异性拮抗剂。一种产生特定的想要的重链和/或轻链序列或片段的方法是首先使用PCR扩增(并修饰)胚系重链和/或轻链可变序列或片段。本领域技术人员是可以容易地获得人类重链和/或轻链可变区的胚系序列；参见，例如，“Vbase”人类胚系序列数据库，和Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等人，1992“The Repertoire ofHuman Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VHSegments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等人，1994“A Directory of HumanGerm-line VκSegments Reveals a Strong Bias in their Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；其公开内容通过引用的方式并入本文。可以使用标准方法进行胚系序列的诱变，例如，PCR介导的诱变，其中突变体被整合入PCR引物，或者定点诱变。如期望得到全长抗体，人类重链恒定区基因的序列是可以获得的；参见，例如Kabat.E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242。包含这些区域的片段可以通过例如标准的PCR扩增获得。或者，本领域技术人员可以利用已经编码重链和/或轻链恒定区的载体。
存在重组生产其它的保持最初抗体的特异性的抗体分子的技术。该技术的具体例子是：编码免疫球蛋白可变区或CDR的DNA被引入另一个抗体分子的恒定区，或恒定区和框架区，或只是框架区；残基，例如，EP-184,187，GB 2188638，和EP-239400；其公开内容通过引用的方式并入本文。抗体分子(包括嵌合抗体)的克隆和表达在文献中有描述；参见，例如，EP 0120694和EP 0125023；其公开内容通过引用的方式并入本文。
在一个例子中，产生根据本发明所述的抗体分子，然后使用已知的技术筛选本文已鉴别的特性。制备单克隆抗体的基本技术在文献中有描述，参见，例如，Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495-497)；其公开内容通过引用的方式并入本文。可以使用现有的技术产生完全的人类单克隆抗体。这些方法包括但不限定于，使用具有免疫系统的遗传工程化的小鼠细胞株，其中小鼠抗体基因已被灭活，并依次被全套功能性人类抗体基因代替，同时保持小鼠免疫系统的其它成分不变。这种遗传工程化的小鼠具有天然的体内免疫应答和亲和成熟过程，从而产生高亲和力的完全的人类单克隆抗体。该技术在本领域是众所周知的，并且在不同出版物中有详细描述，包括但不限于美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,770,249(归属于GenPharmInternational并且可通过Medarex得到，处于“UltraMab HumanAntibody Development System”的保护之下)；以及美国专利5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和相关的家族成员(归属于Abgenix，公开了他们的技术)；其公开内容通过引用的方式并入本文。也参见Kellerman和Green的综述，2002 Curr.Opinion in Biotechnology 13：593-597，和Kontermann & Stefan，2001Antibody Engineering，Springer Laboratory Manuals；其公开内容通过引用的方式并入本文。
或者，可以将根据本发明所述的PCSK9特异性拮抗剂的库与PCSK9接触，并且选择证实具有特异性结合的那些拮抗剂。随后进行功能性研究以确保其具有恰当的功能，例如对PCSK9依赖性的细胞LDL摄取的抑制效应的抑制。本领域技术人员可以获得各种技术，以使用富集技术从库中选择蛋白特异性分子，包括但不限于噬菌体展示(例如参见来自Cambridge Antibody Technology(“CAT”)的技术，其公开在美国专利号5,565,332；5,733,743；5,871,907；5,872,215；5,885,793；5,962,255；6,140,471；6,225,447；6,291,650；6,492,160；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081，以及其他美国家族成员和/或要求申请日为1992年5月24日的GB 9206318的优先权的申请；还参见Vaughn等人，1996，Nature Biotechnology14：309-314)，核糖体展示(参见，例如，Hanes和Pluckthün，1997Proc.Natl.Acad.Sci.94：4937-4942)，细菌表面展示(参见，例如，Georgiou，等人，1997Nature Biotechnology 15：29-34)和/或酵母菌展示(参见，例如，Kieke，等人，1997Protein Engineering 10：1303-1310)；以上公开内容通过引用的方式并入本文。例如，可以在噬菌体颗粒的表面展示库，编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸或其片段在其表面表达并展示。然后可以从显示出想要的活性水平的噬菌体颗粒中将核酸分离出来并将核酸用于制备想要的拮抗剂。噬菌体展示已经在文献中有详细的描述；参见，例如，Kontermann和Stefan，见上，以及国际申请号WO 92/01047；其公开内容通过引用的方式并入本文。特别地，对于抗体分子，根据本发明所述的单独的重链或轻链克隆也可用于筛选能够分别与之发生相互作用以形成组合的重链和轻链的互补的重链或轻链；参见，例如，国际申请号WO 92/01047。本领域技术人员可以获得的任意挑选方法均可用于鉴别PCSK9特异性拮抗剂。用于完成该过程的另一具体方法是，在溶液中以目标抗原(例如，生物素化的、可溶的PCSK9)进行挑选，然后在链霉亲合素包被的磁珠上捕捉PCSK9特异性的拮抗剂-噬菌体复合物，然后洗涤以去除非特异性结合的噬菌体。然后可以按照所描述的与从平板表面回收相同的方法(例如DTT)从柱子中回收捕获的噬菌体。
可以通过本领域技术人员可以获得的技术将PCSK9特异性拮抗剂纯化。相关拮抗剂制备物、腹水、杂交瘤培养液、或相关样本的滴度可以由各种血清学或免疫学方法进行测定，包含但不限于沉淀、被动凝集反应和酶联免疫吸附剂抗体(“ELISA”)技术和放射免疫测定技术(“RIA”)。
本发明部分涉及使用本文描述的PCSK9特异性拮抗剂拮抗PCSK9的功能的方法；所述方法将在下文中作进一步的描述。本申请全文使用的术语“拮抗”是指对抗、抑制、抵消、中和或者限制PCSK9的一种或更多种功能的作用。可以使用本领域已知的方法容易地确定对于一种或更多种PCSK9相关功能的抑制或者拮抗(参见，例如，Barak & Webb，1981 J.Cell Biol.90：595-604；Stephan & Yurachek，1993 J.Lipid Res。34：325330；和McNamara等人，2006 ClinicaChimica Acta 369：158-167)，以及这些文献中描述的方法。抑制作用或拮抗作用会降低PCSK9的活性(相对于不存在拮抗剂时所看到的活性，例如，当存在不相关的特异性的对照拮抗剂时所看到的活性)。优选地，根据本发明所述的PCSK9特异性拮抗剂将PCSK9的功能拮抗至一个点，即所测参数(包括但不限于本文描述的活性)至少降低10％，更优选地，所测参数至少降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和95％。在以下情况中，这种对PCSK9功能的抑制/拮抗是特别有效的：当PCSK9的功能对于那些对个体产生负面影响的特定表型、疾病、紊乱或病症至少起到部分作用时。
一方面，本发明提供了一种拮抗PCSK9活性的方法，包括：在允许所述拮抗剂与PCSK9(当存在时)结合并抑制PCSK9对于细胞LDL摄取的抑制的条件下，将本文公开的PCSK9特异性拮抗剂与受PCSK9影响细胞、细胞群或组织样本(即，那些表达和/或包含LDL受体的)接触。本发明的具体实施方式包括其中所述细胞为人类细胞的方法。本发明的另外的实施方式包括其中所述细胞为鼠类细胞的方法。
另一方面，本发明提供了拮抗个体中的PCSK9活性的方法，包括向个体施用治疗上有效量的本发明的PCSK9特异性拮抗剂。在具体的实施方式中，拮抗PCSK9功能的方法用于治疗与PCSK9相关的疾病、紊乱、病症，或可以从PCSK9拮抗剂的作用中受益的疾病、紊乱或病症。药剂可用于表现出与PCSK9活性相关的病症，或者对于特定个体而言PCSK9的功能收到禁忌的病症。在选择性的实施方式中，这些病症可能是高胆固醇血症、冠心病、代谢综合症、急性冠状动脉综合症或者相关病症。
因此，本发明考虑到本文描述的PCSK9特异性拮抗剂在各种治疗方法中的用途，其中需要拮抗PCSK9的功能。治疗方法在性质上可分为预防性或治疗性的。在具体的实施方式中，本发明涉及治疗与PCSK9活性相关或源于PCSK9活性的病症，或者对于特定个体而言PCSK9的功能收到禁忌的病症，包括向个体施用治疗上有效量的本发明的PCSK9特异性拮抗剂。在选择性的实施方式中，这些病症可能是高胆固醇血症、冠心病、代谢综合症、急性冠状动脉综合症或者相关病症。
本发明的治疗方法包括向个体施用治疗上(或预防上)有效量的本发明的PCSK9特异性拮抗剂。当提及数量时术语“治疗上有效”或“预防上有效”是指：在需要的时间段内达到需要的治疗/预防效果所必需的预期剂量。预期达到的效果可以是，例如，与治疗的病症相关的至少一种症状的减轻。如本领域技术人员所认识到的，这些数量将根据不同的因素发生变化，所述因素包括但不限于个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及PCSK9特异性拮抗剂在个体中引起需要的效果的能力。可以通过体外检验、体内非人动物研究证明反应结果，和/或从临床试验得到进一步支持。
PCSK9特异性拮抗剂可作为药物组合物施用。因此，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包括本发明的PCSK9特异性拮抗剂和药学上可接受的载体，所述载体包含但不限于赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲液或者其它旨在促进以需要的形式和数量向治疗个体施用拮抗剂的替代物。
可以使用本技术领域已知的任意数目的策略来配制药物组合物，参见，例如，McGoff和Scher，2000 Solution Formulation ofProteins/Peptides：In-McNally，E.J.，ed.Protein Formulation andDelivery.New York，NY：Marcel Dekker；pp.139-158.Akers &Defilippis，2000，Peptides and Proteins as Parenteral Solutions.In-Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins.Philadelphia，PA：Taylor and Francis；pp.145-177；Akers等人，2002，Pharm.Biotechnol.14：47-127。适合于患者施用的药学上可接受组合物将在制剂中包含有效量的PCSK9特异性拮抗剂，所述制剂在可接受的温度范围内储存时，不仅保持生物学活性还促进最大的稳定性。
在特定的实施方式中，基于拮抗剂的药学上可接受的组合物可以是液体或固体的形式，或气体颗粒或雾化颗粒的形式。任何液体或固体制剂的生产工艺都可以利用。本领域技术人员完全掌握这样的技术。固体制剂可通过任何可利用的方法来生产，包括但不限于冻干法、喷雾干燥或通过超临界流体技术干燥。口服固体制剂可以以任何形式在既定的时间内以既定的剂量将拮抗剂输送至患者。口服制剂可采用多种固体制剂的形式，包括但不限于药片、胶囊或粉末。或者，可以根据本领域技术人员熟知的方法在施用之前将固体制剂冻干或置于溶液中，以便于单次或多次给药。一般情况下将拮抗剂组合物配制在生物相对pH值范围内，在保存时，也可以进行缓冲以保持适当的pH值范围。液体和固体制剂一般需要在较低的温度保存(例如2℃-8℃)以便较长时间地保持稳定。配制的拮抗剂组合物(特别是液体组合物)可以包含抑菌剂，以防止或尽量减少贮藏期间蛋白质水解，包括但并不限于有效浓度(例如≤1％w/v)的苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、尼泊金甲酯甲酯和/或尼泊金丙酯。对于一些患者，抑菌剂可能是禁忌的。因此，可以将冻干的组合物在含有或不含这一成分的溶液中进行复原。可以向缓冲的液体或固体拮抗剂制剂中加入另外的成分，包括但不限于：糖(作为冷冻保护剂)(包括但不限于多羟基烃，如山梨醇、甘露醇、甘油和半乳糖醇，和/或二糖如蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖)，在某些情况下，还含有相关的盐(包括但不限于NaCl、KCl或LiCl)。这种拮抗剂配方(特别是想长期保存的液体制剂)将依赖于有效的总容量渗透浓度范围以保证既能促进在一定温度(例如2℃-8℃或更高)的长期稳定性，又能使制剂用于非肠道注射。在适当的情况下，防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他的添加剂也可能包括在内。制剂可以包含二价阳离子(包括但并不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2)，和/或非离子型表面活性剂(包括但不限于聚山梨酯-80(Tween80TM)、聚山梨酯-60(Tween 60TM)、聚山梨酯-40(Tween 40TM)、和聚山梨酯-20(Tween 20TM)、聚氧乙烯烷基醚，包括但并不限于Brij 58TM、Brij 35TM和其他的，如Triton X-100TM、Triton X-114TM、NP40TM、Span 85和Pluronic系列非离子型表面活性剂(例如Pluronic 121))。这些成分的任意组合构成了本发明的具体实施方式。
液体形式的药物组合物可以包括液体载体，例如水、石油、动物油、植物油、矿物油或合成油。液体形式还可以包括生理盐溶液、右旋糖或其他的糖溶剂或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
优选地，药物组合物为非肠道可接受的水溶液的形式，其为无热源的，具有合适的pH值、张力和稳定性。药物组合物可以经等张介质(如氯化钠注射液、林格注射液或乳酸林格注射液)稀释后配制用于注射。
本发明的一个方面是一种药物组合物，其包括：(i)大约50至大约200mg/mL的本文描述的PCSK9特异性拮抗剂；(ii)多羟基烃(包括但不限于山梨醇、甘露醇、甘油和半乳糖醇)，和/或二糖(包括但不限于蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖)；多羟基烃和/或二糖合计大约为占组合物的1％至6％重量/体积(“w/v”)；(iii)大约5mM至大约200mM的组氨酸、咪唑、磷酸盐或醋酸，其用作缓冲剂以避免保质期内药物组合物的pH值发生变化，同时也作为张力调节剂；(iv)大约5mM至大约200mM的精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸和蛋氨酸以用于阻止聚合；(v)大约0.01M至大约0.1M的盐酸(“HCL”)，以足够的量使pH处于大约5.5至大约7.5的范围内；和(vi)液体载体，包括但不限于无菌水、石油、动物油、植物油、矿物油、合成油、生理盐溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇；其中所述的药物组合物的pH值处于大约5.5至大约7.5的范围内；并且其中所述的药物组合物可选地包含占制剂大约0.01％至大约1％w/v的非离子表面活性剂(包括但不限于聚山梨酯-80(Tween 80TM)、聚山梨酯-60(Tween 60TM)、聚山梨酯-40(Tween 40TM)和聚山梨酯-20(Tween 20TM)、聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij 58TM、Brij 35TM、以及其他的如Triton X-100TM、Triton X-114TM、NP40TM、Span 85和Pluronic系列的非离子表面活性剂(例如Pluronic121))。
可以以游离酸、组氨酸-盐酸或精氨酸-盐酸添加盐酸。如果以组氨酸-盐酸或精氨酸-盐酸的形式使用，则以盐酸形式存在的组氨酸或精氨酸应该如上文所指定的。因此，一些或全部的盐酸(取决于组氨酸和/或精氨酸的量)可以作为组氨酸-盐酸和/或精氨酸-盐酸来提供；视情况而定。在本说明书中用于数量的术语“大约”意思是在所提供的指定数值的10％以内。例如，以“大约50至200”提供的范围明确地包括在所述范围内的每个数字，作为不同的实施方式。如在上例中，包括但不限于那些具有50、100、125、150及200的实施方式构成本文的具体实施方式。本文公开的药物组合物虽然施用模式不同，但是具有一般的适用性。在具体的实施方式中，公开的药物组合物作为液体或者以冻干形式复原之后用于皮下施用。在具体的实施方式中，本文公开的制剂中使用的PCSK9特异性拮抗剂可以经过聚乙二醇化或者形成融合蛋白质的一部分。
本发明的具体方面涉及上文公开的药物组合物，其包括：(i)大约50至大约200mg/mL的本文描述的PCSK9特异性拮抗剂；(ii)大约1％至大约6％w/v(在特定实施方式中为大约2％至大约6％)的甘露醇、海藻糖或蔗糖；(iii)大约10mM至大约100mM的组氨酸；(iv)大约25mM至大约100mM的精氨酸或脯氨酸；(v)大约0.02M至大约0.05M的盐酸(“HCL”)，以足够的量使pH处于大约5.8至大约7的范围内；和(vi)液体载体，包括但不限于无菌水、石油、动物油、植物油、矿物油、合成油、生理盐溶液、右旋或其他的糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇；其中所述的药物组合物的pH值处于大约5.8至大约7的范围内；并且其中所述的药物组合物可选地包含占制剂大约0.01％至大约1％w/v的非离子表面活性剂(包括但不限于聚山梨酯-80(Tween 80TM)、聚山梨酯-60(Tween 60TM)、聚山梨酯-40(Tween 40TM)和聚山梨酯-20(Tween20TM)、聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij 58TM、Brij 35TM、以及其他的，如Triton X-100TM、Triton X-114TM、NP40TM、Span 85和Pluronic系列的非离子表面活性剂(例如Pluronic121))。
具体的实施方式提供了药物组合物，其包括：(i)50至200mg/mL的本文描述的PCSK9特异性拮抗剂；(ii)大约1％至大约6％w/v(在特定实施方式中为大约2％至大约6％)的甘露醇、海藻糖或蔗糖；(iii)大约10mM至大约150mM的组氨酸；(iv)大约10mM至大约150mM的精氨酸或脯氨酸；(v)大约0.03M至大约0.05M的盐酸(“HCL”)，以足够的量使pH处于大约5.8至大约6.5的范围内；和(vi)液体载体，包括但不限于无菌水、石油、动物油、植物油、矿物油、合成油、生理盐溶液、右旋或其他的糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇；其中所述的药物组合物的pH值处于大约5.8至大约6.5的范围内；并且其中所述的药物组合物可选地包含大约0.01％至大约1％w/v的聚山梨酯-80(Tween 80TM)或聚山梨酯-20(Tween 20TM)。
本文的具体的实施方式提供了药物组合物，其包括：(i)50至200mg/mL的本文描述的PCSK9特异性拮抗剂；(ii)大约1％至大约6％w/v(在特定实施方式中为大约2％至大约6％)的蔗糖；(iii)大约25mM至大约100mM的组氨酸；(iv)大约25mM至大约100mM的精氨酸；(v)大约0.040M至大约0.045M的盐酸(“HCL”)，以足够的量使pH大约为6；和(vi)无菌水；其中所述的药物组合物的pH值大约为6；并且其中所述的药物组合物可选地包含大约0.01％至大约1％w/v的聚山梨酯-80(Tween 80TM)或聚山梨酯-20(Tween 20TM)。在其具体的实施方式中，组氨酸和精氨酸的水平处于彼此相差25mM以内，在其它实施方式中，二者是相同的。
本文的具体的实施方式提供了药物组合物，其包括：(i)50至200mg/mL的本文描述的PCSK9特异性拮抗剂；(ii)蔗糖、组氨酸和精氨酸，它们的数量为下列之一：(a)大约1％w/v的蔗糖、大约10mM的组氨酸和大约25mM的精氨酸；(b)大约2％w/v的蔗糖、大约25mM的组氨酸和大约25mM的精氨酸；(c)大约3％w/v的蔗糖、大约50mM的组氨酸和大约50mM的精氨酸；或(d)大约6％w/v的蔗糖、大约100mM的组氨酸和大约100mM的精氨酸；(iii)大约大约0.04mol或者，可替代的，大约1.46g盐酸；和(iv)无菌水；其中所述的药物组合物的pH值大约为6；并且其中所述的药物组合物可选地包含大约0.01％至大约1％w/v的聚山梨酯-80(Tween80TM)或聚山梨酯-20(Tween 20TM)。本文的具体实施方式为：(ii)中所描述的蔗糖、组氨酸和精氨酸的量如(c)或(d)所描述。
本文的具体实施方式提供了所描述的药物组合物，其包含50至200mg/mL的本文描述的多种PCSK9特异性拮抗剂中的任意一种。为了例示其一种不同的实施方式的目的，并且不作为一种限制，提供以下：如上所述的包含PCSK9特异性拮抗剂的药物组合物，所述PCSK9特异性拮抗剂包含：(a)包含SEQ ID NO：26的轻链；(b)包含SEQID NO：25的重链；其中所述PCSK9特异性拮抗剂是一种抗体分子，其拮抗PCSK9对细胞LDL摄取的抑制作用。
本文特定的实施方式为根据上文描述的药物组合物，其为冻干的并复原的。在具体的实施方式中，所述冻干并复原的溶液中的所述的蛋白的浓度比冻干前的组合物中的浓度高出多达2倍。在具体的实施方式中，冻干和/或复原的药物组合物中的蛋白质或PCSK9特异性拮抗剂的浓度为大约50mg/mL至大约300mg/mL的范围内。可用于复原冻干的药物组合物的稀释剂包括但不限于无菌水、注射用抑菌剂(“BWFI”)、磷酸盐缓冲液、无菌盐水、生理盐水、林格溶液或葡萄糖溶液，在具体实施方式中，还可以包含0.01％-1％(w/v)的聚山梨酯-80(Tween 80TM)或聚山梨酯-20(Tween 20TM)。在具体的实施方式中，以1/60.2X的最初体积(或0.167mL)乃至1X(1mL)的体积将冻干粉复原。
本发明的示例性实施方式为本文描述的稳定的药物组合物。本发明的其它实施方式为本文描述的在冻干和复原中稳定的药物组合物。本领域技术人员可以采用多种方法来制备冻干的组合物；参见，例如，Martin & Mo，2007“Stability Considerations for LyophilizedBiologics”Amer.Pharm.Rev。本文使用的“稳定”是指PCSK9特异性拮抗剂保持其物理或化学稳定性、构像完整性的特性，或者，与对照样品相比，在4-37℃的温度范围内，在至少30天内，表现出较少的变性、蛋白切割、凝集、片段化、酸性变体形成或生物学活性的丧失的能力。在其它实施方式中，在上述温度可以保持多达3个月、6个月、12个月、2年或更长时间的稳定。在具体的实施方式中，该制剂在2-8℃时在6个月、优选12个月、2年或更长时间内(按照优选顺序)不显示出显著性变化。在具体的实施方式的实验中，与对照样品相比，在25-45℃的温度范围内(或者是2-8℃)，在至少大约30天、3个月、6个月、12个月、2年或更长的时间内，制剂表现出小于5％(在特定的实施方式中为小于10％)的变性、蛋白切割、凝集、片段化、酸性变体形成或生物学活性的丧失。可以通过本领域技术人员已知的几种方式测定制剂的稳定性，包括但不限于，测排阻色谱法(SEC-HPLC)来衡量聚集和片断化，测定浓缩样品的颗粒尺寸的动态光散射法(DLS)、测定片段化的毛细SDS-PAGE，以及测定酸性变体形成的毛细等电聚集(cIEF)或阳离子交换色谱(“CEX”)。本领域技术人员对于适合分析蛋白稳定性的技术是完全理解的；参见综述：Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)and Jones，1993Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90。
本文描述的药物组合物应该是无菌的。本领域技术人员可以采用各种技术实现无菌，包括但不限于通过无菌过滤膜过滤。在应用冻干并复原的组合物的具体实施方式中，可以在冻干并复原之前或之后进行灭菌。
本领域技术人员完全掌握拮抗剂治疗剂的剂量，参见，例如Lederman等人，Int.J.Cancer 47：659-664；Bagshawe等人，1991Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915-922，并且根据一些因素变化，这些因素包括但不限于所用的特定的PCSK9拮抗剂、所治疗的患者、患者的病症、所治疗的区域、施药途径和所需的治疗。普通技术的医生和兽医可以容易地确定并指导拮抗剂的有效治疗用量。剂量范围可以是大约0.01至100mg/kg主体体重，更普遍是0.05至25ml/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、或10mg/kg体重或者是1至10mg/kg的范围内。为了便于说明但不做限定，在具体的实施方式中，可以使用5mg至2.0g的剂量以全身输送拮抗剂。达到一定范围内的拮抗剂浓度的优化精确量需要基于药物到达靶位点的动力学的方案。这涉及到考虑PCSK9特异性拮抗剂的分布、平衡和清除。可以以合适的剂量单独使用本文描述的拮抗剂。或者，与其他试剂联合施用或依次施用也是合意的。可以与替代性的治疗方案联合来制定本发明的PCSK9特异性拮抗剂的治疗剂量方案。例如，PCSK9特异性拮抗剂可以与其它药物(治疗性的和/或预防性的)组合或联合使用，所述其它药物包括降胆固醇的药，例如胆固醇吸收抑制剂(例如)和胆固醇合成抑制剂(例如和)。本发明考虑到这样的组合，它们构成本发明的重要实施方式。因此，本发明涉及以上所述的治疗方法，其中在施用另一种药物(治疗性的和/或预防性的)的同时、之后或之前，施用/输送PCSK9特异性拮抗剂，所述另一种药物包括但不限于降胆固醇的药、胆固醇吸收抑制剂和胆固醇吸收抑制剂。
可以按照本文的描述进行治疗的个体(受试者)包括灵长类、人类和非人类，包括任何哺乳动物或具有商业或家养的兽医意义的脊椎动物。
可以通过本技术领域所认识到的任意途径向个体施用PCSK9特异性拮抗剂，包括但不限于口服施用、通过注射施用(其具体的实施方式包括静脉内、皮下、腹膜内、或者肌内注射)，通过吸入施用、鼻内及局部施用，可以单独施用或者与其他设计为辅助个体治疗的试剂联合施用。也可以通过注射设备、注射笔、无针装置和皮下贴输送系统施用PCSK9特异性拮抗剂。施用途径的确定应该基于本领域技术人员的诸多考虑，包括但不限于，治疗想要产生的生理化学特性。可以基于每天、每周、每两周、每月提供治疗，或者其它任何能在规定的时间将合适数量的PCSK9特异性拮抗剂输送至个体的方案，从而达到并保持想要的治疗。可以以单一剂量施用制剂或者在不同的时间以多个剂量施用。
还考虑到使用公开的拮抗剂生产用于治疗与PCSK9相关的疾病、紊乱或病症或者可以从PCSK9拮抗剂的效应中受益的疾病、紊乱或病症的药物。该药物可用于表现出与PCSK9活性相关的病症或者对于某特定受试者PCSK9的功能被禁忌的病症的个体。在选择性的实施方式中，病症可以是高胆固醇血症、冠心病、代谢综合症、急性冠脉综合症及相关病症。
本文公开的PCSK9特异性拮抗剂也可用于诊断PCSK9的方法。在选择性的具体实施方式中，本发明包括鉴定或定量样品(包括但不限于生物样品，例如血清或血液)中存在的PCSK9的水平的方法，包括：将样品与本文描述的PCSK9特异性拮抗剂接触并分别检测或定量与PCSK9的结合。PCSK9特异性拮抗剂还可以用于技术人员已知的多种检验形式，并且可以构成试剂盒(其中的试剂盒的一般性特征将在下文进一步描述)的一部分。
本发明进一步提供了施用公开的PCSK9特异性拮抗剂以用于基因治疗的目的。通过这样的方法，以编码本发明的PCSK9特异性拮抗剂的核酸转化受试者的细胞。然后，包含核酸的受试者内源地产生PCSK9特异性拮抗剂。以前，Alvarez等人，Clinical Cancer Research6：3081-3087，2000使用基因治疗的方式将单链抗-ErbB2抗体导入受试者。可以将上述Alvarez等人公开的方法容易地适用于将本发明的编码抗PCSK9的抗体的核酸导入受试者中。
可以将编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸导入受试者中。
可以通过本领域已知的任何方法将核酸导入受试者的细胞中。在优选的实施方式中，核酸作为病毒载体的一部分被导入。优选的可以衍生载体的病毒的例子包括慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、甲病毒、流感病毒以及其他具有想要的细胞趋向性的重组病毒。
多个公司商业化生产病毒载体，包括但不以任何方式局限于：Avigen，Inc.(Alameda，Calif.；AAV载体)，Cell Genesys(Foster City，Calif.；逆转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)，Clontech(逆转录和杆状病毒载体)，Genovo，Inc.(Sharon Hill，Pa.；腺病毒和AAV载体)，Genvec(腺病毒载体)，IntroGene(Leiden，Netherlands；腺病毒载体)，Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)，Norgen(腺病毒载体)，Oxford BioMedica(Oxford，United Kingdom；慢病毒载体)，和Transgene(Strasbourg，France；腺病毒、痘病毒、逆转录病毒和慢病毒载体)。
构建和施用病毒载体的方法在本领域是已知的(参见，例如Miller等人，BioTechniques 7：980-990，1992)。优选地，病毒是复制缺陷型的，即，它们不能自主复制，因此这些病毒在宿主细胞中不会传染。优选地，复制缺陷型病毒是最简病毒，也就是说它仅保留其基因组中的对于包装基因组以产生病毒颗粒所必需的序列。完全或几乎完全缺少病毒基因的缺陷型病毒是优选的。使用缺陷型病毒可以向细胞中特定的、定位的区域施用，而不必考虑载体会感染其它细胞。因此，可以特异性地靶向特异性的组织。
包含减毒的或者缺陷型DNA病毒序列的载体包括但不限于缺陷型疱疹病毒载体(Kanno等人，Cancer Gen.Ther.6：147-154，1999；Kaplitt等人，J.Neurosci.Meth.71：125-132，1997和Kaplitt等人，J.Neuro Onc.19：137-147，1994)。
腺病毒是真核DNA病毒，这种病毒可以被修饰以有效地将本发明的核酸输送至多种类型的细胞中。在一些例子中描述了减毒的腺病毒载体，例如Strafford-Perricaude等人，J.Clin.Invest.90：626-630，1992中所描述的。已经描述了多种复制缺陷型腺病毒和最简腺病毒载体(PCT公开号WO94/26914、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697和WO96/22378)。根据本发明所述的复制缺陷型重组病毒可以通过本领域技术人员已知的任意技术来制备(Levrero等人，Gene 101：195，1991；EP 185573；Graham，EMBO J.3：2917，1984；Graham等人，J.Gen.Virol.36：59，1977)。
腺相关病毒(AAV)是一种相对较小的DNA病毒，其可以以稳定且位点特异性的方式整合到其所感染的细胞基因组中。它们能够整合到多种细胞中，而对细胞生长、形态或分化不产生任何影响，并且似乎也不参与人类致病。已经描述了源自AAV的载体用于在体外和体内进行基因转染(参见，Daly等人，Gene Ther 8：1343-1346，2001，Larson等人，Adv.Exp.Med.Bio.489：45-57，2001；PCT公开号WO91/18088和WO 93/09239；美国专利号4,797,368和5,139,941和EP 488528B1)。
在另一个实施方式中，可以通过逆转录载体导入基因，如美国专利号5,399,346，4,650,764，4,980,289，和5,124,263；Mann等人，Cell 33：153，1983；Markowitz等人，J.Virol.62：1120，1988；EP 453242和EP 178220所描述。逆转录病毒是一种感染分裂细胞的整合病毒。
慢病毒载体可以用作在几种组织类型中(包括大脑、视网膜、肌肉、肝脏和血液)直接输送编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸并使其持续表达的试剂。该载体可以有效的转导这些组织的分裂细胞和非分裂细胞，并维持PCSK9特异性拮抗剂的长期表达。这方面的综述参见Zufferey等人，J.Virol 72：9873-80，1998和Kafri等人，Curr.Opin.Mol.Ther.3：316-326，2001。慢病毒包装细胞系在本领域中是可以获得的并且是已知的。它们促进高滴度慢病毒的生产以用于基因治疗。一个例子四环素可诱导的VSV-G准型慢病毒包装细胞系，其可以持续至少3到4天产生超过106IU/ml的滴度的病毒颗粒；参见Kafri等人，J.Virol.73：576-584，1999。由可诱导的细胞系产生的载体可以根据需要进行浓缩以便有效地在体外和体内转导非分裂细胞。
辛德比斯病毒是甲病毒属成员，自发现该病毒后，从1953年开始，该病毒在世界各地得到了广泛的研究。已经在体外深入研究了基于甲病毒(特别是辛德比斯病毒)的基因转导(参见Straus等人，Microbiol.Rev.58：491-562，1994；Bredenbeek等人，J.Virol.67：6439-6446，1993；Ijima等人，Int.J.Cancer 80：110-118，1999Sawai等人，Biochim.Biophyr.Res.Comm.248：315-323，1998。甲病毒载体的许多特性使它们成为其他正在开发的病毒衍生的载体系统的合意的替代，包括表达构建体的快速工程化、传染性颗粒的高滴度贮液的生产、非分裂细胞的感染和高表达水平(Strauss et al，1994见上)。已经有辛德毕斯病毒用于基因治疗的报道(Wahlfors et al，Gene.Ther.7：472-480，2000和Lundstrom，J.Recep.Sig.Transduct.Res.19(1-4)：673-686，1999)。
在另一个实施方式中，可以通过脂质体转染或以其它的转染促进试剂(肽、聚合物等)将载体导入细胞。合成的阳离子脂可用于制备脂质体以用于在体内和体外转染编码标记物的基因(Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417，1987和Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855，1987)。可用于转移核酸的脂类化合物及组合物在PCT公开号WO 95/18863和WO 96/17823以及美国专利号5,459,127中有描述。
还可以在体内作为裸DNA质粒导入载体。可以通过本领域已知的方法将用于基因治疗的裸DNA载体导入所需的宿主细胞，例如，电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE右旋糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪，或者利用DNA载体转运子(参见，例如，Wilson等人，J.Biol.Chem.267：963-967，1992；Williams等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2726-2730，1991)。其他质粒转染的常用试剂包括但不限于，FuGene、Lipofectin、和Lipofectamine。还可以使用受体介导DNA输送方法(Wu等人，J.Biol.Chem.263：14621-14624，1988)。美国专利号5580859和5589466公开了哺乳动物中的外源DNA序列的传递，其中不含转染促进试剂。最近描述了一种相对较低电压的高效率的体内DNA转移技术，被称为电转移(Vilquin等人，Gene Ther.8：1097，2001；Payen等人，Exp.Hematol.29：295-300，2001；Mir，Bioelectrochemistry 53：1-10，2001；PCT公开号WO 99/01157、WO99/01158和WO 99/01175)。
适合于这种基因治疗方法并不含编码本发明的PCSK9特异性拮抗剂的核酸的药物组合物包括在本发明的范围之内。
在另一个方面，本发明提供了使用本发明的PCSK9特异性拮抗剂来鉴别、分离、定量或拮抗目标样品中的PCSK9的方法。PCSK9特异拮抗剂可用作免疫化学分析中的研究工具，如Western印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫组织化学分析、免疫沉淀或其他本领域已知的免疫化学分析(参见，例如，Immunological TechniquesLaboratory Manual，ed.Goers，J.1993，Academic Press)或各种纯化实验程序。可以将标记掺入拮抗剂之中或者结合到拮抗剂之中，以便于鉴定或检测其中所结合的活性。本领域技术人员对于各种类型的可检测的标记是非常熟悉的(例如，酶、染料、或其他合适的分子，这些分子要么是可以容易检测的，要么引起一些容易检测的活性/结果)，其用于或可能用于以上程序中。
本发明的另一方面是不含本文公开的PCSK9基因特异性拮抗剂或药物组合物及使用说明的试剂盒。试剂盒通常但不一定包括标签，其指明该试剂盒中的物质的想要达到的用途。术语标签包括试剂盒上提供的、或与试剂盒一起提供的、或伴随该试剂盒的任何文字或记录材料。在以冻干的形式提供药物组合物的具体的实施方式中，试剂盒可以包括无菌水或盐水，用于将制剂复原为液体形式。在具体的实施方式中，水或盐水的量为大约0.1ml至1.0ml。
提供了以下实施例以说明本发明，但不是为了限制本发明：
实施例1
重组Fab展示噬菌体的分离
以固定的重组人类和鼠PCSK9筛选重组Morphosys HuCALGold Fab噬菌体展示文库(参见，例如，Knappik等人，2000J.Mol.Biol.296：57-86)，其过程如以下简要说明：首先将噬菌体Fab展示文库分成3个池(pool)：一个池为VH2+VH4+VH5，另一个为VH1+VH6，第三个池为VH3。使用脱脂干牛奶将噬菌体池和固定的PCSK9蛋白封闭。
对于第一轮筛选，使每个噬菌体池与固定于Nunc Maxisorp平板的孔中的V5-、His-标记的PCSK9蛋白进行独立的结合。相继用(1)PBS/0.5％TweenTM 20(快速洗涤3次)；(2)PBS/0.5％TweenTM 20(1次5分钟，轻微摇动并孵育)；(3)PBS(快速洗涤3次)；和(4)PBS(2个5分钟，轻微摇动并孵育)洗涤固定的噬菌体-PCSK9复合物。用20mM DTT洗脱结合的噬菌体，将所有3个洗脱的噬菌体悬浮液汇集到1个管中。以洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1细胞。使携带噬菌粒的细胞(氯霉素抗性)的汇集培养物生长并制备携带噬菌粒的培养物的冷冻贮存物。通过以辅助噬菌体进行共感染从培养物中进行噬菌体挽救，并制备用于下一轮筛选的噬菌体贮存物。
对于第二轮筛选，使来自第一轮的噬菌体与固定的、封闭的、V5-、His-标记的PCSK9蛋白结合。相继用(1)PBS/0.5％TweenTM 20(快速洗涤1次)；(2)PBS/0.5％TweenTM 20(4次5分钟，轻微摇动并孵育)；(3)PBS(快速洗涤1次)；和(4)PBS(4次5分钟，轻微摇动并孵育)洗涤固定的噬菌体-PCSK9复合物。将噬菌体洗脱，并感染大肠杆菌TG1细胞，如第一轮的方式进行噬菌体挽救。
对于第三轮筛选，使来自第二轮的噬菌体与固定的、封闭的、V5-、His-标记的PCSK9蛋白结合。相继用(1)PBS/0.5％TweenTM 20(快速洗涤10次)；(2)PBS/0.5％TweenTM 20(5次5分钟，轻微摇动并孵育)；(3)PBS(快速洗涤10次)；和(4)PBS(5次5分钟，轻微摇动并孵育)洗涤固定的噬菌体-PCSK9复合物。如第一轮的方式将噬菌体洗脱，并感染大肠杆菌TG1细胞。使感染了噬菌粒的细胞过夜生长并制备噬菌粒DNA。
将来自第三轮的噬菌粒DNA的XbaI-EcoRI插入物亚克隆进入Morphosys Fab表达载体pMORPH_x9_MH以产生质粒pMORPHx9MH/mPCSK9 2 CX1_D05(参见，例如，图1)，在大肠杆菌TG1 F-中产生Fab表达克隆的文库。将转化子涂抹到LB+氯霉素+葡萄糖平板上，过夜培养以长出细菌菌落。挑取单个转化子菌落并放入96孔板的孔中培养并筛选Fab的表达。
实施例2
ELISA法筛选细菌表达的Fab
将个体转化子的培养物进行IPTG诱导，让其过夜生长以表达Fab。培养物上清(候选Fab)与纯化的V5-、His-标记的PCSK9蛋白(固定于96孔Nunc Maxisorp平板中)一起孵育，使用平板洗涤器以PBS中的0.1％TweenTM 20洗涤，然后使用以HRP包被的抗Fab抗体孵育，再用PBS/Tween TM 20洗涤。通过加入TMP底物来检测结合的HRP，以平板读数器读出孔中的A450值。
包括如下的负对照：
每板中结合的非特异性Fab的对照与平行表达的抗EsB(不相关的Fab)制备物一同孵育。
仅有培养基。
包括如下的ELISA和Fab表达的阳性对照：
EsB的抗原结合平板上的3个孔，然后与抗EsB Fab一同孵育。为了控制Fab与重组PCSK9基因抗原的V5或His标签反应，使用在相同细胞中作为最初PCSK9抗原表达并以相似方式纯化的V5-、His-标记的分泌的碱性磷酸酶蛋白(SEAP)进行平行ELISA。当与PCSK9抗原一起孵育时，假定的与PCSK9反应的Fab被鉴定为产生＞3X的背景值，而当与SEAP孵育时为阴性。将第一轮筛选时评判为与PCSK9反应的克隆合并到单一平板中，以一式三份重新生长，以IPTG重新诱导，并在平行ELISA中针对PCSK9和SEAP重新检测。按照如上所述加入阳性和阴性对照。在3个重复中至少2个被评判为阳性的克隆继续进行如下的鉴定。在已知或怀疑为混合的初步克隆的情况下，通过在含氯霉素的2xYT平板上将单一克隆划线来重新纯化培养物，并且按照如上所述通过ELISA(一式三份)再次检验来自三个或更多个单独克隆的液体培养物。
实施例3
PCSK9ELISA阳性Fab克隆的DNA序列测定
为DNA准备的细菌培养物这样制备：将来自阳性Fab的主甘油贮液的氯霉素接种到1.2ml 2xYT液体培养基，过夜培养。在BioRobot9600上采用Qiagen Turbo Mini prep，从过夜培养物中离心出来的细胞沉淀中制备DNA。在DNA上以Morphosys定义的测序引物进行ABI Dye Terminator循环测序，在ABI 3100遗传分析仪上运行，以获得Fab克隆的DNA序列。将得到的DNA序列进行相互比较，以确定单一的克隆序列，并且决定Fab克隆的轻、重链亚型。
实施例4
从单一PCSK9ELISA阳性克隆中表达并纯化Fab
在大肠杆菌TG1F-细胞中通过IPTG诱导表达来自ELISA阳性克隆m2CX1D05的Fab及EsB(阴性对照)的Fab。将培养物裂解，通过固定的金属离子亲和层析(IMAC)纯化His标记的Fab，通过离心渗滤将蛋白交换至25mM HEPES pH 7.3/150mM NaCl。通过Caliper Lab-Chip 90电泳和常规SDS-PAGE分析蛋白，再由Bradford蛋白检验法定量。在连续稀释液中通过ELISA重新检验纯化的Fab蛋白，以确定纯化的Fab的活性。阳性及阴性对照按前面所述进行。然后按照如下所述分析纯化的Fab制备物。
实施例5
m2CX1D05Fab转化为全长IgG
使用引物ACAGATGCCAGATGCGATATCCAGATGACCCAGA(SEQ ID NO：33)和
TGCAGCCACCGTACGTTTAATTTCAACTTTCGTACC(SEQ IDNO：34)通过聚合酶链反应从质粒模板pMORPHx9_MH/mPCSK9_2_CX1_D05扩增编码m2CX1D05轻链可变区的DNA序列。使用InFusion克隆系统(Clontech)将该扩增产物克隆进入预先经过FspI和BmtI消化的质粒pV1JNSA-GS-FB-LCK。在可变区上通过DNA测序验证所得到的质粒。使用Qiagen Endo-Free质粒大量制备试剂盒制备无内毒素的质粒制备物。
使用引物
ACAGGTGTCCACTCGCAGGTGCAATTGGTTCAGTCT(SEQ IDNO：35)和
GCCCTTGGTGGATGCTGAGCTAACCGTCACCAGGGT(SEQ IDNO：36)通过聚合酶链反应扩增编码pMORPHx9_MH/PCSK9_2_CX1_D05的重链可变区的DNA序列。将该扩增产物克隆进入预先经过FspI和BmtI消化的质粒pV1JNSA-BF-HCG2M4。在可变区上通过DNA测序验证所得到的质粒。使用Qiagen Endo-Free质粒大量制备试剂盒制备无内毒素的质粒制备物。
通过以编码1D05轻链和重链的质粒共转染HEK293细胞获得全长IgG，接着通过蛋白A纯化所表达的IgG。
实施例6
通过表面等离子共振(“SPR”)进行Fab与PCSK9相互作用的动力学评价
使用BiacoreTM(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)2000系统进行SPR测定。传感器芯片CM5和用于固定的胺偶联试剂盒购自BiacoreTM。
使用BiacoreTM胺偶联试剂盒(cat#BR-1000-50)，使用固定向导中的“用于固定”选项，通过伯胺基团将抗Fab IgG(人类特异)(Sigma，catalog#I5260)共价结合到传感器芯片CM5的表面1及表面2。指定5000RU的固定目标。该向导以100mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和400mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)的1∶1混合物进行7分钟的活化作用，再通过数次脉冲注射配体以达到需要的水平，然后以7分钟的乙醇胺脉冲使其余的表面失活。
抗PCSK9Fab在捕获表面2上被捕获，表面1用作Fab与FCSK9相互作用的动力学研究的参照。每个Fab这样捕获：以5或10μl/分钟使500ng/ml的溶液流动1-1.5分钟以达到Rmax为100-150RU的目标RL以进行反应。使5-10倍浓度的hPCSK9v5His或mPCSK9v5His抗原以30μl/分钟在表面上流动3-4分钟。在以10mM甘氨酸pH 2.0的30秒脉冲进行抗Fab表面再生之前需要15-60分钟分解时间。
使用BiaEvaluation软件评估经过每个Fab分析的多种浓度PCSK9抗原的传感器图像，从而评估Fab与PCSK9相互作用的动力学常数。
动力学常数确定如下：
表2
实施例7
通过表面等离子共振(“SPR”)进行IgG与PCSK9相互作用的动力学评价。使用BiacoreTM(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)2000系统进行SPR测定。传感器芯片CM5和用于固定的胺偶联试剂盒购自BiacoreTM。
使用BiacoreTM胺偶联试剂盒(cat#BR-1000-50)，使用固定向导中的“用于固定”选项，通过伯胺基团将山羊抗人类IgG(Caltag，catalog#H10700)共价结合到传感器芯片CM5的表面1及表面2。指定5000RU的固定目标。该向导以100mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和400mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)的1∶1混合物进行7分钟的活化作用，再通过数次脉冲注射配体以达到需要的水平，然后以7分钟的乙醇胺脉冲使其余的表面失活。
抗PCSK9IgG在捕获表面2上被捕获，表面1用作IgG与PCSK9相互作用的动力学研究的参照。每个IgG这样捕获：以10μl/分钟使10nM的溶液流动1-1.5分钟以达到Rmax为100-150RU的目标RL以进行反应。使5-10倍浓度的hPCSK9v5His或mPCSK9v5His抗原以30或60μl/分钟在表面上流动4分钟。在以10mM甘氨酸pH 1.7的60秒脉冲进行抗IgG表面再生之前需要15-60分钟分解时间。
使用BiaEvaluation软件评估经过每个IgG分析的多种浓度PCSK9抗原的传感器图像，从而评估IgG与PCSK9相互作用的动力学常数。
动力学常数分别确定如下：
表3
实施例8
1D05的PCSK9-LDLR TR-FRE T检验
该检验是Fisher等人，2007 J.Biol.Chem.282：20502-20512中描述的方法的变体。将AlexaFluor647标记的PCSK9(终浓度为10nM)与不同量的1D05混合，并向其中添加Eu(8044)标记的LDLR胞外区，以在50μL总体积中达到～1.5nM的终浓度(足以在Rubystar在Fl620nM时提供～20,000计数)，50μL总体积中有10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.05％(w/v)BSA，使用的是Dynatech U底的96孔板。在至少90分钟的平衡后，使用Rubystar读数器(BMG Corp.)读取样品，每孔用20闪烁、50微秒整合延迟，总整合时间为200微秒。数据表示为(Fl665/Fl620x10000)的比率，使用标准的4参数拟合从S形的剂量反应曲线的拐点确定1D05的IC50。
图2说明了PCSK9-LDLR相互作用的TR-FRET检验中的1D05的活性。1D05的Fab与IgG药效均显著，并抑制PCSK9-LDLR的相互作用。
实施例9
EXOPOLAR分析：外源性PCSK9对细胞LDL摄取的影响
第1天，将30,000个HEK细胞/孔接种于聚D-赖氨酸包被的96孔板。第2天，将培养基转换为不含血清的DMEM培养基。第3天，除去培养基，细胞用OptiMEM洗涤。加100μl的包含LPDS和dI-LDL以及纯化的PCSK9的DMEM培养基。将平板在37℃孵育6.5小时。在含有2mg/ml BSA的TBS中迅速洗涤细胞；然后在TBS-BSA中洗涤2分钟；然后以TBS洗两次(但很快速)。将细胞在100μl RIPA缓冲液中裂解。然后使用Ex 520，Em 580nm在平板中测定荧光。采用BCA蛋白检验法测定每个孔中的总细胞蛋白，然后将荧光单位按照总蛋白进行标准化。
Exopolar分析能有效鉴定对LDL摄取的不同效应；参见以下表4，其说明了在Exopolar分析中，PCSK9突变体的能力如何与血浆LDL-胆固醇相关。
表4
  突变体   增加/减少   LDL-C(mg/dI)   EC-50(nM)Exopolar
  S127R   增加   277   14
  D374Y   增加   388   1.3
  野生型   140   51
  R46L   减少   116   78
结果：m2CX1D05，不论是Fab还是IgG，均以剂量依赖性方式抑制人类和鼠PCSK9对LDL摄取的影响，该影响可重复观察到。向细胞中加入的PCSK9的量是～100-320nM。
m2CX1D05(Fab)包含轻链SEQ ID NO：1(包括VL：SEQ IDNO：27)和Fd链SEQ ID NO：9，其中包括连接子和标记(包括VH：SEQ ID NO：11)。
m2CX1D05(IgG)包含轻链SEQ ID NO：26和包含SEQ ID NO：25的重链。
图3A-3D说明(i)1D05(Fab)对于鼠PCSK9依赖性的细胞LDL摄取的丧失的剂量依赖性抑制(图3A)；(ii)1D05(IgG)对于鼠PCSK9依赖性的细胞LDL摄取的丧失的剂量依赖性抑制(图3B)；(iii)1D05(Fab)对于人类PCSK9依赖性的细胞LDL摄取的丧失的剂量依赖性抑制(图3C)；以及(iv)1D05(IgG)对于人类PSCK9依赖性的细胞LDL摄取的丧失的剂量依赖性抑制(图3D)。
1D05与人类和鼠PCSK9均有明显的交叉反应。图3A-3D有两个对照：(i)仅有细胞的对照，显示细胞LDL摄取的基础水平，和(ii)细胞+PCSK9(5μg/ml)对照，显示PCSK9依赖性的LDL摄取的丧失水平。包含1D05和PCSK9的滴度实验在PCSK9的固定浓度(5μg/ml)及渐增的1D05浓度(如图所示)下进行。
1D05能够抑制PCSK9对细胞LDL摄取的影响。小鼠和人类PCSK9蛋白的1D05(Fab)IC50分别为97nm和144nm。小鼠和人类PCSK9蛋白的1D05(IgG)IC50分别为85nM和79nM。
实施例10
PCSK9细胞摄取
按照Fisher等人，2007 J.Biol.Chem.282：20502-12的方法进行以下检验。
将经过Alexa Fluor 647标记PCSK9处理的细胞按照以下所述成像。CHO细胞以20,000个细胞/孔的密度接种于聚D-赖氨酸包被的96孔光学CVG无菌黑色平板(Nunc)。将细胞接种于F-12K培养基中(营养混合物，Kaighn’s modification(1x))(Invitrogen)，其中包含100个单位的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素并补充了10％的FBS。将平板在37℃和5％CO2下孵育过夜。第二天早晨，去除培养基并换成含100单位青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的100μlF-12K培养基。18小时后，去除培养基。按照“实验程序”中的描述，以Alexa Fluor 647标记经纯化的PCSK9蛋白。向细胞中加入AlexaFluor 647标记的PCSK9(1、5或20μg/ml)，PCSK9处于50μl含10％脂蛋白缺乏的血清的F-12K培养基中。将平板在37℃孵育4小时，成像前细胞用Tris缓冲盐溶液迅速洗涤。为了标记细胞核，将终浓度为0.1μg/ml的Hoechst 33342加入到每个孔中。采用x40的水浸接物镜在Opera imager(Evotec Technologies GmbH，Hamburg，Germany)上进行平板成像。对于荧光细胞核，采用405nm的激发波长捕获图像，对于Alexa Fluor 647-标记的PCSK9，采用635nm的激发波长捕获图像。对于每个孔，对于2种发射波长捕获11个单独的包含＞500个细胞的视野。采用Acapella语言采用订制的算法记录(Evotec Technologies GmbH)分析数据。该算法识别并标记单个细胞的细胞核和细胞质区域。以任意荧光单位表示强度。
为测试1D05抗体，采用相同的程序，但是使用了HEK293细胞或HepG2细胞。对于HepG2细胞，平板不经过聚-D-赖氨酸包被。加入5μg/ml的AF647-标记的WT PCSK9以及滴度为50μg/ml渐减的Fab。使用该程序，我们在两种细胞类型中对于Fab获得了大约80nM的IC50值。
结果：图4A和4B说明了Fab 1D05和IgG 1D05对于PCSK9内化的抑制以及LDL摄取的恢复。
实施例11
体内分析
在小鼠体内进行人类1D05的Fab片段和整个IgG的测试，并监视LDL胆固醇水平的变化。在这些研究中所使用的小鼠是(B6xB6-Tg(CETP)Ldlrtm1)F1小鼠，其为转基因(Tg)表达人类CETP(在小鼠中缺失)以及LDL受体被破坏(tm1)的半合子。这些老鼠极其有用，因为他们具有类似于人类的脂类式样并且富含LDL的性质。
每只小鼠抽血两次，一次在研究初期，以建立个体LDL胆固醇水平的基线水平(“前”)，第二次在3小时后(“后”)，以评估处理后LDL水平发生的变化。每只小鼠在3个小时内接受2次Dulbecco PBS的IV剂量作为对照组、1D05IgG(0.5mg)、或1D05Fab片段(0.5mg)。在紧临注射之前，以230,000x g离心1D05的IgG的整个IgG以除去聚集物。
图5中，每只小鼠的LDL水平由一组连接符号表示，LDL的变化(抽血后-抽血前)表示为每个处理组的平均值(Δmg/dL)。用PBS处理对LDL测定无影响(-4mg/dL，降低5％)。与此相反，1D05的整个IgG(-19mg/dL)将血清LDL降低了20％；1D05的Fab片段(-24mg/dL)将血清LDL降低了34％。
实施例12
限制性蛋白水解
限制性蛋白水解质谱法的策略包括：在严格控制的条件(即低的酶浓度和短的消化时间)下将wt-hPCSK9和1D05/wt-hPCSK9复合物(底物)与不同特异性的内蛋白酶一起孵育。在这样的条件下，内蛋白酶将只切割蛋白底物的初级切割位点(即，位于蛋白底物表面和暴露于溶剂中的位点)。1D05Fab与wt-hPCSK9的结合将掩盖两种蛋白上的通常暴露于溶剂中的一些表面残基。因此，在wt-hPCSK9中切割而在1D05/wt-hPCSK9中不切割的初级位点对应于在复合物中受到1D05保护的PCSK9的残基。这些残基中有些可能直接参与1D05的结合。通过wt-hPCSK9和1D05/wt-hPCSK9限制性蛋白水解产生的蛋白水解肽通过使用基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI-MS)分析消化物而得到鉴别和描绘。最后，不同特异性的内蛋白酶的使用可以帮助更精确地确定参与结合的残基。
在限制性蛋白水解实验中通常使用的蛋白水解酶的量需要显著降低，以避免wt-hPCSK9的过分水解和初级结合位点(暴露的残基)的丧失。在室温在25mM HEPES pH7.5，150mM NaCl中进行wt-hPCSK9、1D05和1D05/wt-hPCSK9与内蛋白酶的孵育。使用的内蛋白酶是：AspN，以蛋白相对于蛋白水解酶为2500/1(w/w)过量添加；胰蛋白酶和GluC，以蛋白相对于内蛋白酶等于1000/1(w/w)的比例添加。在添加内蛋白酶之后的5、15和30分钟的时间，将样品的等份试样放入MALDI靶中并在存在芥子酸(SA)作为基质的情况下直接进行MALDI-MS分析。将在不同的时间通过wt-PCSK9与蛋白水解酶孵育获得的片段肽与那些来自于1D05/wt-hPCSK9复合物中的wt-hPCSK9的片段肽进行比较，从而鉴定在1D05/wt-hPCSK9相互作用的水解中受到保护的残基。本文提供的附图和表格仅报道了最相关的片段肽。
以内蛋白酶AspN进行的限制性蛋白水解：在存在AspN的情况下，按照蛋白与蛋白水解酶等于2500/1(w/w)的比例，将wt-hPCSK9蛋白、1D05/wt-hPCSK9复合物与1D05Fab孵育5、15和30分钟，AspN在N末端切割Asp残基。对消化物进行的MALDI-MS分析显示了wt-hPCSK9和1D05/wt-hPCSK9复合物的初级切割位点(参见图7A和7B以及下表5)。表5显示了AspN与wt-PCSK9和1D05/wt-hPCSK9复合物孵育5分钟之后获得的wt-hPCSK9片段肽。斜体为只在wt-hPCSK9水解时形成的肽。
表5
  测定的m/z   预期的MW   肽   切割的氨基酸
  1969.1   1969.1   153-168   Asp169
  2222.0   2222.0   31-49   Asp49
  4412.9   4411.2   698-737   Asp698
在m/z 1969.1处的种类(产生于Asp169处的切割并且匹配wt-hPCSK9的催化结构域的肽153-168的理论质量)仅在wt-hPCSK9样品中形成，这表明该残基通过1D05Fab在1D05/wt-hPCSK9复合物中的结合受到保护而免受水解。有若干种类在wt-hPCSK9和1D05/wt-hPCSK9水解中均有形成。特别地，在m/z 2222.0和4412.9处的离子(对应于wt-hPCSK9的前结构域的肽31-49和催化结构域的肽698-737)产生于在Asp49和Asp698处的切割。
在内蛋白酶AspN的孵育时间较长时(即，15、30分钟)，MALDI-MS光谱中显示的肽式样与图7A和7B中显示的5分钟时的式样相比没有显著变化，这确认了在1D05/wt-PCSK9相互作用中Asp169受到保护而免受水解。
应着重注意：所观测到的预期和测定的质量值之间的一致性程度处于这种类型的实验的标准之内，因为必须以外部标准进行质量校正。
以内蛋白酶GluC进行的限制性蛋白水解：内蛋白酶GluC在C末端切割Glu残基。按照蛋白与蛋白水解酶等于1000/1(w/w)和100/1(w/w)的比例，将GluC与wt-hPCSK9、1D05/wt-hPCSK9复合物和1D05一起孵育。为了检测初级切割位点，在孵育之后5、15和30分钟时进行样品的MALDI-MS分析。在图8A-H和下表6中显示了在wt-hPCSK9蛋白中切割的和在1D05/wt-hPCSK9复合物中保护的wt-hPCSK9残基，以及在MS光谱中检测到的对应的肽。表6显示了GluC与wt-PCSK9和1D05/wt-PCSK9复合物孵育15分钟之后获得的肽片段。斜体为产生于wt-PCSK9而在复合物中不产生的肽。
表6
使用内蛋白酶GluC，在wt-hPCSK9表面区域中显示了保护，包括Glu170、Glu197和Glu195。在m/z 3357.4处的种类(其对应于肽153-181，通过GluC与wt-hPCSK9和1D05/wt-hPCSK9的孵育获得)表明Glu181不受Fab 1D05与wt-hPCSK9结合的保护。
以胰蛋白酶进行的限制性蛋白水解：胰蛋白酶在C末端切割Arg和Lys残基。按照1000(w/w)的比例将酶加入wt-PCSK9、1D05/wt-PCSK9复合物和1D05中，持续5、15和30分钟。在图9A-D中显示了wt-PCSK9和1D05/wt-PCSK9复合物的MALDI-MS分析；在表7中报告了最相关的肽片段。表7显示了胰蛋白酶与wt-PCSK9和1D05/wt-PCSK9复合物孵育5分钟之后获得的肽片段。斜体为产生于wt-PCSK9而在复合物中不产生的肽。
表7
在5分钟时的初级切割位点是wt-hPCSK9的前结构域上的Arg46和催化结构域上的Arg160、Arg165、Arg167、Arg199、Arg215、Arg218、Arg705和Arg729。在m/z 2279.3、3909.9和4474.6处的对应于肽200-218、166-199和161-199的种类仅在wt-hPCSK9水解中能检测到，这表明残基Arg199受到1D05结合的保护。因此，这些肽片段以及在m/z 5410.5、5729.7、5850.8、6170.2处的对应于肽168-215、166-215、168-218、166-218的种类(仅在wt-PCSK9中检测到)表明在残基Arg165和Arg167上也产生了保护。
在胰蛋白酶孵育15分钟时，确认了在残基Arg199上的保护。实际上，在m/z 2280.0、3591.4、3910.9和4475.6处的种类(均产生于在Arg199处的切割)仅存在于wt-PCSK9水解中并且变得更加丰富。此外，检测到在Arg194上的保护(如在wt-PCSK9的光谱的m/z 3325.7处的种类的存在所示)。产生于Arg165和Arg167(m/z 5411.5、5730.9、5851.8和6171.6)上的切割的种类存在于wt-hPCSK9水解中，并且还在1D05/wt-hPCSK9复合物的水解中开始以低得多的强度出现。这可能表明在这些残基上的抵抗蛋白水解的保护是由于Fab的空间位阻而不是由于1D05和wt-PCSK9残基之间的初级接触。
结果：使用三种具有不同特异性的酶通过LP-MS，我们鉴定了在1D05-wt-hPCSK9中受到1D05Fab保护的wt-hPCSK9的表面区域。Arg165、Arg167、Asp169、Glu170、Arg194、Glu197和Arg199是1D05Fab结合之后受到保护的wt-hPCSK9的残基(参见图10)。这些残基属于wt-hPCSK9的催化结构域并且暴露于该分子的表面(参见图11)。此外，以胰蛋白酶进行的限制性水解显示了残基194-199直接参与1D05结合的可能性；而残基Arg165和Arg167上抵抗蛋白水解的保护可能是由于Fab的空间位阻而不是1D05和wt-PCSK9残基之间的直接接触。
肽R194-R199中的残基在人类和鼠PCSK9中是保守的。1D05Fab识别人类和小鼠蛋白。如人类和鼠PCSK9的序列比对所示(参见图12)，wt-PCSK9的肽194-199中包括的残基和被1D05保护的残基在人类和鼠PCSK9中是保守的；而肽165-169中的残基(同样被1D05的结合所保护)则不是保守的。这将支持以下假设：只有残基194-199直接与1D05相互作用而其它的(165-169)通过空间位阻受到抵抗蛋白水解的保护。
实施例13
PCSK9/1D05TR-FRET检验
按照以前的描述(参见Fisher等人，2007 J.Biol.Chem.282(28)：20502-20512)使用4当量的AlexaFluor 647(Invitrogen)标记抗-V5抗体(QED Biosciences)并进行纯化。按照类似的方式使用5当量的Eu(W8044)-DTA(Perkin-Elmer)标记1D05IgG。使材料避光并在使用之前保存在4℃。按照以前的描述(参见Fisher等人，见上)产生V5/His-PCSK9。
在黑色Microfluor 296孔平板(Dynex Technologies)中在10mMHepes pH 7.4，150mM NaCl，100uM CaCl2和0.05％BSA中进行TR-FRET检验。向25μL每种20nM的AF647标记的抗-V5抗体和V5/His-PCSK9中加入系列稀释的未标记的候选抗体(即1D05和1B20)，候选抗体可以是Fab或IgG。在室温将反应剂平衡～15分钟然后加入Eu(W8044)-1D05IgG以达到终浓度为1.5nM Eu标记的抗体(在Fl620nm为～18000计数；S/B＝12)和50uL的总体积。然后，在BMGLabTech Rubystar Reader中按照以前的描述(Fisher等人，见上)读取平衡检验值。数据报告为Fl665/Fl620x 10000。使用非线性回归分析(Kaleidagraph 4.03，Synergy Software)将数据拟合至s形剂量反应曲线，从而确定IC50。
图13显示了1D05和一种不同抗体1B20在PCSK9-1D05相互作用TR-FRET检验中的分析。两种Fab均为有效且完全抑制该相互作用。图14A-D显示了在所描述的Exopolar检验(例如实施例9中的描述)中1B20对于PCSK9的抑制。1B20Fab以152nM(n＝5)的IC50抑制鼠PCSK9；以145nM(n＝5)的IC50抑制人类PCSK9。1B20IgG以13nM的IC50抑制鼠PCSK9；以22nM的IC50抑制人类PCSK9。1B20的结合细节显示于以下的表中。
表8
  hPCSK9v5His   mPCSK9v5His
  ka(1/Ms)   6.6E+04±6.1E+03   1.41E+05±1.2E+04
  kd(1/s)   4.8E-05±7.4E-06   7.18E-05±2.9E-06
  KA(1/M)   1.5E+09±3.0E+08   2.0E+09±1.5E+08
  KD(M)   7.4E-10±1.6E-10   5.1E-10±3.8E-11
实施例14
1D05恒河猴的PK/PD研究
为了描述1D05的药代动力学，药效学和靶标特性，在雄性恒河猴上以3mg/kg(7.0-9.0kg，n＝3)进行单一的静脉剂量研究。研究中使用的所有恒河猴均为首次接受生物制剂。
在猴子头部静脉给予1D05四个单次剂量。在给药后的指定时间点从隐静脉/股动脉血管采集血液样品，将产生的血浆/血清保存在-70℃直至分析。
在100mM组氨酸、100mM精氨酸、6％蔗糖，pH值6.0中以47.2mg/mL制备1D05的给药溶液。将该给药溶液储存在4℃并且在给药时保持于湿冰之上。
按如下所述对血清样品的脂蛋白进行分析。使用商售试剂通过抗人IgG ELISA来定量1D05的水平。
如图15所示，观察到在3mpk时1D05使LDL-C降低了～50％，对于～16天，观察到≥25％的LDL-C的降低。1D05的t1/2(图16)为77小时。
实施例15
1D05恒河猴PK/PD研究中的血浆/血清样本的脂蛋白分析
为了产生脂蛋白图谱，通过层析法在Superose-6排阻柱(GELifeSciences，Inc.)上将血浆或血清进行分馏。通过与商售的酶学比色胆固醇检测试剂(Total Cholesterol E，Wako USA)进行协调混合，然后通过下游的分光光度法测定反应产物在在600nm处的吸收值，从而持续测定柱流出液中总胆固醇水平。从柱中洗脱的胆固醇的第一个峰是由于VLDL，第二个峰是LDL，第三个是HDL；使用HPLC提供的软件计算每个峰下面的面积。为了计算每个脂蛋白馏分的胆固醇浓度，将相应的峰面积与总峰面积的比值乘以样品中所测的总胆固醇的浓度。
实施例16
制剂
将单克隆抗体(其包含：包含SEQ ID NO：26的轻链和包含SEQID NO：25的重链)透析于合适的制剂中并浓缩。然后将溶液分装于3mL的玻璃瓶中以进行稳定性研究。以液体形式进行的研究样品立即放在温度为2-8℃或25℃的稳定站上。
分析方法包括：测排阻色谱法(SEC-HPLC)来衡量聚集和片断化。以下是时间0和6M SEC数据的表。在2-8℃或25℃储存6个月之后，包含3/50/50或6/100/100(蔗糖/His/Arg)的制剂形成较少的聚集物和片段。除了标准物之外，所有的制剂均为6.0-所述标准物冷冻于1mg/mL磷酸盐缓冲液中(pH～7)。
表9
实施例17
变体
产生1DO5的定点突变的变体并在本文中公开为SEQ ID NO：51-60。使用Bio-Rad ProteOn确定1D05Fab的定点突变的变体的Kd值；针对人类PCSK9-V5-His测定亲和性。测定Fab亲和性的方法基本上与以前针对所描述的相同。
表10
  Ab ID   突变的链  包含VH   KD(nM)
  H32Y   重链  SEQ ID NO：51   2.01
  M48AQ   重链  SEQ ID NO：52   2.06
  M48L   重链  SEQ ID NO：53   1.52
  H99Y   重链  SEQ ID NO：54   1.45
  M48L/M109L/M115L   重链  SEQ ID NO：55   1.13
  M48V   重链  SEQ ID NO：56   1.95
  N50D   轻链  SEQ ID NO：57   3.42
  N50Q   轻链  SEQ ID NO：58   0.615
  N50T   轻链  SEQ ID NO：59   2.13
  N50Y   轻链  SEQ ID NO：60   2.58
＊氨基酸的编号从FR1中紧随信号肽的第一个氨基酸残基开始。

Claims (38)

1.一种分离的PCSK9特异性拮抗剂，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NOs：13、15和17所示，并且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NOs：3、5和7所示；
其中所述PCSK9特异性拮抗剂拮抗PCSK9对细胞LDL摄取的抑制。
2.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中CDR1、CDR2和/或CDR3结构域位于其各自的CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的人类胚系区。
3.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的平衡解离常数(KD)小于1200nM。
4.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的KD小于500nM。
5.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的KD小于100nM。
6.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的KD小于5nM。
7.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用的IC50低于500nM。
8.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用的IC50低于200nM。
9.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用的IC50低于100nM。
10.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取至少产生20％的拮抗作用。
11.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其是抗体分子。
12.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括：SEQ ID NO：11所示的重链可变区，和SEQ ID NO：27所示的轻链可变区。
13.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括重链，所述重链具有SEQ ID NO：24所示的恒定序列。
14.权利要求12所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括重链，所述重链具有SEQ ID NO：24所示的恒定序列。
15.PCSK9特异性拮抗剂，其包括：
(a)SEQ ID NO：1所示的轻链；和
(b)SEQ ID NO：11所示的重链可变区；
其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体分子，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取具有拮抗作用。
16.权利要求15所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中SEQ ID NO：11之后跟随氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。
17.分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包括：
(a)SEQ ID NO：26所示的轻链；以及
(b)SEQ ID NO：25所示的重链；
其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体分子，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取具有拮抗作用。
18.包含权利要求1-17中任一项所述的PCSK9特异性拮抗剂和药学上可接受的载体的组合物。
19.权利要求18所述的组合物，其包括：
(a)50mg/mL至200mg/mL的权利要求1-17中任一项所述的PCSK9特异性拮抗剂；
(b)多羟基烃和/或二糖；所述多羟基烃和/或二糖合计占制剂的1％至6％w/v；
(c)5mM至200mM的组氨酸、咪唑、磷酸盐或乙酸；
(d)5mM至200mM精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或蛋氨酸；
(e)0.01M至0.1M盐酸，其量足以使pH介于5.5至7.5之间；以及
(f)液体载体，包括但不限于无菌水、石油、动物油、植物油、矿物油、合成油、生理盐水、右旋糖或其他糖溶液或二醇类；
其中所述的药物组合物的pH介于5.5至7.5；并且其中所述的药物组合物任选包括占制剂0.01％至1％w/v的非离子表面活性剂。
20.权利要求19所述的组合物，其中所述多羟基烃选自山梨醇、甘露醇、甘油和半乳糖醇。
21.权利要求19或20所述的组合物，其中所述二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。
22.权利要求19或20所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂选自聚氧乙烯烷基醚和Pluronic系列的非离子表面活性剂。
23.权利要求19或20所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂选自聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、聚山梨酯-40、聚山梨酯-20、Brij58TM、Brij35TM、TritonX-100TM、Triton X-114TM、NP40TM、Span85和Pluronic121。
24.权利要求21所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂选自聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、聚山梨酯-40、聚山梨酯-20、Brij58TM、Brij35TM、TritonX-100TM、Triton X-114TM、NP40TM、Span85和Pluronic121。
25.权利要求24所述的组合物，其包括：
(a)50mg/mL至200mg/mL的权利要求1-17中任一项所述的PCSK9特异性拮抗剂；
(b)1％至6％w/v的甘露醇、海藻糖或蔗糖；
(c)10mM至150mM的组氨酸；
(d)10mM至150mM的精氨酸或脯氨酸；
(e)0.003M至0.005M的盐酸，其量足以使pH介于5.8至6.5之间；以及
(f)液体载体，包括但不限于无菌水、石油、动物油、植物油、矿物油、合成油、生理盐水、右旋糖或其他糖溶液或二醇类；
其中所述的药物组合物的pH介于5.8至6.5；并且其中所述的药物组合物任选包括0.01％至1％w/v的聚山梨酯-80或聚山梨酯-20。
26.权利要求19或25所述的组合物，其中所述二醇类是乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
27.权利要求25所述的组合物，其包括：
(a)50mg/mL至200mg/mL的权利要求1-17中任一项所述的PCSK9特异性拮抗剂；
(b)2％至6％w/v的蔗糖；
(c)25mM至100mM的组氨酸；
(d)25mM至100mM的精氨酸；
(e)0.0040M至0.0045M的盐酸，其量足以使pH达到6的范围；以及
(f)无菌水；
其中所述的药物组合物的pH为6的范围；并且其中所述的药物组合物任选包括0.01％至1％w/v的聚山梨酯-80或聚山梨酯-20。
28.权利要求27所述的组合物，其包括：
(a)50mg/mL至200mg/mL的权利要求1-17中任一项所述的PCSK9特异性拮抗剂；
(b)蔗糖、组氨酸和精氨酸，其量为以下之一：(i)3％w/v的蔗糖，50mM组氨酸及50mM精氨酸；或(ii)6％w/v的蔗糖，100mM组氨酸及100mM精氨酸；
(c)0.0040M至0.0045M的盐酸，其量足以使pH达到6的范围；以及
(d)无菌水；
其中所述的药物组合物的pH为6的范围；并且其中所述的药物组合物任选包括0.01％至1％w/v的聚山梨酯-80或聚山梨酯-20。
29.权利要求1-17中任意一项所述的PCSK9特异性拮抗剂在制备用于拮抗PCSK9对细胞LDL摄取的抑制的药物中的用途。
30.权利要求1-17中任意一项所述的PCSK9特异性拮抗剂在制备用于减轻高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征或急性冠脉综合征的药物中的用途。
31.编码权利要求1-17中任意一项所述的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸。
32.编码权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸；其中重链可变区的CDR1结构域由SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列编码；重链可变区的CDR2结构域由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码；重链可变区的CDR3结构域由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码；轻链可变区的CDR1结构域由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列编码；轻链可变区的CDR2结构域由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列编码；并且轻链可变区的CDR3结构域由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列编码。
33.编码权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸；其中所述PCSK9特异性拮抗剂包括：
(a)由SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列编码的重链可变区；和/或
(b)由SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列编码的轻链可变区。
34.编码权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸；其中所述PCSK9特异性拮抗剂包括：
(a)由SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列编码的重链区；和/或
(b)由SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列编码的轻链区。
35.包含权利要求31-34中任意一项的核酸的载体。
36.体外或原位的分离的宿主细胞或宿主细胞的群体，其包含权利要求31-34中任意一项的核酸。
37.生产PCSK9特异性拮抗剂的方法，其包括：
(a)在适合生产PCSK9特异性拮抗剂的条件下培养权利要求36的细胞；及
(b)分离所产生的PCSK9特异性拮抗剂。
38.体外或原位的分离的宿主细胞或宿主细胞的群体，其包含权利要求1的PCSK9特异性拮抗剂。
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