JP2011511637A - １ｄ０５ｐｃｓｋ９拮抗薬 - Google Patents

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Abstract

ヒトプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（「ＰＣＳＫ９」）の拮抗薬を開示する。開示した拮抗薬は、ＰＣＳＫ９機能の阻害に効果があり、従って、ＰＣＳＫ９活性に関連する状態の治療に使用するための望ましい拮抗薬を提示する。本発明はまた、前記拮抗薬をコードする核酸、本拮抗薬を含むベクター、宿主細胞および組成物も開示する。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を製造する方法、並びに本拮抗薬をＰＣＳＫ９機能の阻害または拮抗に使用する方法も開示しており、本開示の重要な追加的な態様を形成する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６１／０６３，９４９号（２００８年２月７日出願）および第６１／０６６，５７７号（２００８年２月２１日出願）の利益を主張する。
（発明の背景）
プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（本書ではこれ以降「ＰＣＳＫ９」と呼ぶ）は、神経アポトーシス調節コンベルターゼ１（「ＮＡＲＣ−１」）としても知られており、分泌性サブチラーゼ系統群の９番目の構成要素として識別されるタンパク質分解酵素Ｋ様のサブチラーゼである（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，２００３ ＰＮＡＳ １００：９２８−９３３を参照）。ＰＣＳＫ９のための遺伝子は、ヒト染色体１ｐ３３−ｐ３４．３に局在している（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．、上記）。ＰＣＳＫ９は、例えば、肝実質細胞、腎臓間葉細胞、回腸、および大腸上皮、並びに胚性脳終脳ニューロン（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｒａｉｎ ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ ｎｅｕｒｏｎｓ）を含む、増殖および分化の能力のある細胞に発現される（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，上記）。
ＰＣＳＫ９の本来の合成（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、〜７２−ｋＤａの不活性酵素前駆体、または酵素前駆体の形態であり、これが小胞体（「ＥＲ」）において自己触媒的な分子内処理を受けて、その機能性を活性化する。この内部プロセシングイベントは、ＳＳＶＦＡＱ↓ＳＩＰＷＮＬ１５８モチーフ（それぞれ配列番号：１９および２０）で発生することが報告されている（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５）。こうした内部プロセシングは、ＥＲから抜け出るための要件として報告されている（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，上記）。切断され、それによって活性化したタンパク質は、切断ペプチドに付随して分泌される（上記）。
ヒトＰＣＳＫ９の配列（６９２アミノ酸タンパク質をコードする１２のエキソンを持ち、長さ〜２２−ｋｂ）は、一例では、寄託番号ＮＰ＿７７７５９６．２で見つかる。ヒト、マウスおよびラットのＰＣＳＫ９核酸配列が登録されている（例えば、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．：ＡＸ１２７５３０（またＡＸ２０７６８６）、ＮＰ＿７０５７９３（またＱ８０Ｗ６５）、およびＰ５９９９６を参照）。ＰＣＳＫ９は、Ｎ−末端シグナル配列、プロドメイン、触媒ドメインおよびシステインが豊富なＣ端末領域を含む、他のプロタンパク質転換酵素において見いだされるいくつかのドメインを持つ。ＰＣＳＫ９触媒ドメインは、サブチラーゼのタンパク質分解酵素Ｋファミリーおよび、特に触媒三組（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）Ｄ１８６、Ｈ２２６およびＳ３８６と高い配列類似性を共有する。
ＰＣＳＫ９は、限定されないものの、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０１／３１００７号、ＷＯ ０１／５７０８１号、ＷＯ ０２／１４３５８号、ＷＯ ０１／９８４６８号、ＷＯ ０２／１０２９９３号、ＷＯ ０２／１０２９９４号、ＷＯ ０２／４６３８３号、ＷＯ ０２／９０５２６号、ＷＯ ０１／７７１３７号およびＷＯ ０１／３４７６８号、米国公開番号ＵＳ ２００４／０００９５５３号およびＵＳ ２００３／０１１９０３８号、並びに欧州公開番号ＥＰ １ ４４０ ９８１号、ＥＰ １ ０６７ １８２号およびＥＰ １ ４７１ １５２号などを含むいくつかの特許公開で開示および／または主張されている。
ＰＣＳＫ９は、肝臓や神経細胞の分化において役割が与えられてきて（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．、上記）、胚性肝臓で非常によく発現され、およびコレステロール恒常性に強く関連してきた。研究では、コレステロール生合成または取り込みにおけるＰＣＳＫ９の具体的な役割が示唆されてきた。コレステロールを与えたラットの研究では、Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．は、コレステロール生合成に関与する３つのその他の遺伝子と同様な方法で、ＰＣＳＫ９がダウンレギュレートされることを見出した（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：２１０９−２１１９）。ＰＣＳＫ９の発現は、実際に、コレステロール代謝に関与する他の遺伝子で見られるように、ステロール調節要素結合タンパク質（「ＳＲＥＢＰ」）により制御されることが示された（上記）。後に、これらの研究結果についての裏付けがＰＣＳＫ９の転写性の制御の研究を通してなされ、こうした制御がリポタンパク質の代謝に関連する他の遺伝子にとって全く一般的なものであることが示された（Ｄｕｂｕｃ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．２４：１４５４−１４５９）。スタチンは、薬物のコレステロール低下効果に起因する方法で、ＰＣＳＫ９の発現をアップレギュレートすることが示されてきた（上記）。その上、ＰＣＳＫ９プロモーターは、コレステロール制御に関与する２カ所の保存部位（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｉｔｅｓ）、ステロール調節要素およびＳｐ１部位を持つことが示されてきた（上記）。
特にＰＣＳＫ９が肝臓ＬＤＬＲタンパク質の量を低下させ、そのため、肝臓のＬＤＬコレステロールを循環から除去する能力を弱めることを、いくつかの系統の証拠が示している。マウスの肝臓におけるアデノウイルスを媒介したＰＣＳＫ９過剰発現は、肝臓ＬＤＬＲタンパク質の劇的な喪失による循環ＬＤＬ−Ｃの蓄積を生じ、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡレベルに対する影響はない（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５、Ｍａｘｗｅｌｌ ＆ Ｂｒｅｓｌｏｗ，２００４ ＰＮＡＳ １０１：７１００−７１０５、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０６３０−５０６３８、およびＬａｌａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：１３１２−１３１９）。マウスにおけるＰＣＳＫ９過剰発現の循環ＬＤＬ−Ｃレベル上昇に対する効果は、ＬＤＬＲの発現に完全に依存し、やはり、ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ−Ｃの制御は、ＬＤＬＲタンパク質のダウンレギュレーションにより媒介されることを示している。これらの研究結果と一致して、ＰＣＳＫ９を欠損したマウスまたはＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡがアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害薬により低下したマウスは、高いレベルの肝臓ＬＤＬＲタンパク質および循環ＬＤＬ−Ｃを一掃する高い能力を持つ（Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００５ ＰＮＡＳ １０２：５３７４−５３７９、およびＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４８（４）：７６３−７６７）。さらに、ｓｉＲＮＡにより培養したヒト肝実質細胞におけるＰＣＳＫ９レベルを低下させることでも、ＬＤＬＲタンパク質レベルの上昇およびＬＤＬ−Ｃ取り込み能力の増大につながる（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５、およびＬａｌａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：１３１２−１３１９）。総合して、これらのデータは、ＰＣＳＫ９の作用が、ＬＤＬＲタンパク質レベルの低下によるＬＤＬ−Ｃ増大につながることを示している。
遺伝子ＰＣＳＫ９での多数の突然変異も、血漿中の低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）粒子の著しい増加で特徴付けられ、早発性の心臓血管障害につながりうる遺伝性の代謝障害である常染色体優性高コレステロール血症（「ＡＤＨ」）と結論的に関連してきた（Ａｂｉｆａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：１５４−１５６、Ｔｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９−３５３、Ｌｅｒｅｎ，２００４ Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５：４１９−４２２を参照）。後に公開されたＡｂｉｆａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記）のＳ１２７Ｒ突然変異に関する研究では、こうした突然変異を有する患者は、（１）低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）、超低密度リポタンパク質（「ＶＬＤＬ」）および中間密度リポタンパク質（「ＩＤＬ」）など、ａｐｏＢ１００を含有するリポタンパク質の過剰産生、並びに（２）それに関連する前記リポタンパク質のクリアランスまたは転換の減少に起因して、血漿中で高めの総コレステロールおよびａｐｏＢ１００を示すことが報告されている（Ｏｕｇｕｅｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４：１４４８−１４５３）。
従って、ＰＣＳＫ９がＬＤＬの制御においてある役割をすることについて疑いはないと考えられる。ＰＣＳＫ９の発現またはアップレギュレーションは、ＬＤＬコレステロールの血漿濃度の増加に関連し、またそれに対応するＰＣＳＫ９の阻害または発現の欠如は、ＬＤＬコレステロール血漿濃度の減少に関連する。ＰＣＳＫ９での配列の変化に関連したＬＤＬコレステロール濃度の減少によって、冠動脈心疾患に対する保護が与えられることが分かっている（Ｃｏｈｅｎ、２００６ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４−１２７２）。
心臓血管系の病気の治療に効果のある化合物および／または薬剤の同定が、非常に望ましい。臨床試験において、ＬＤＬコレステロールレベルの低減は、冠動脈性事象の発生率に直接関連している（Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００３ ＢＭＪ ３２６：１４２３−１４２７）。ごく最近では、適度の生涯にわたる血漿ＬＤＬコレステロールレベルの低減は、冠動脈性事象の発生の大幅な低減に関連していることが分かっている（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、上記）。このことは、非脂質関連の心臓血管危険因子の高い有病性を持つ集団でもそうであった（上記）。従って、ＬＤＬコレステロールレベルを管理して制御することによって、大きな利益が得られる。
本発明は、様々な治療状態において、ＰＣＳＫ９の活性およびそれに対応してＰＣＳＫ９の果たす役割を阻害する目的で使用するＰＣＳＫ９の拮抗薬を提供することにより、これらの関心事を促進するものである。
国際公開第０１／３１００７号 国際公開第０１／５７０８１号 国際公開第０２／１４３５８号 国際公開第０１／９８４６８号 国際公開第０２／１０２９９３号 国際公開第０２／１０２９９４号 国際公開第０２／４６３８３号 国際公開第０２／９０５２６号 国際公開第０１／７７１３７号 国際公開第０１／３４７６８号 米国特許出願公開第２００４／０００９５５３号 米国特許出願公開第２００３／０１１９０３８号 欧州特許出願公開第１４４０９８１号 欧州特許出願公開第１０６７１８２号 欧州特許出願公開第１４７１１５２号
Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，２００３ ＰＮＡＳ １００：９２８−９３３ Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５ Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：２１０９−２１１９ Ｄｕｂｕｃ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．２４：１４５４−１４５９ Ｍａｘｗｅｌｌ ＆ Ｂｒｅｓｌｏｗ，２００４ ＰＮＡＳ １０１：７１００−７１０５ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０６３０−５０６３８ Ｌａｌａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：１３１２−１３１９ Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００５ ＰＮＡＳ １０２：５３７４−５３７９ Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４８（４）：７６３−７６７ Ａｂｉｆａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：１５４−１５６ Ｔｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９−３５３ Ｌｅｒｅｎ，２００４ Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５：４１９−４２２ Ｏｕｇｕｅｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４：１４４８−１４５３ Ｃｏｈｅｎ、２００６ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４−１２７２ Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００３ ＢＭＪ ３２６：１４２３−１４２７
（発明の要旨）
本発明は、ＰＣＳＫ９の拮抗薬、また特定の実施形態において、ヒトおよびマウス両方のＰＣＳＫ９を抑制し、プロセスされたＰＣＳＫ９の優先的ターゲティングを示す拮抗薬に関する。広くは、タンパク質特異的なＰＣＳＫ９の拮抗薬（または、本書では「ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬」という）は、ＰＣＳＫ９タンパク質結合分子またはＰＣＳＫ９の選択的結合およびＰＣＳＫ９機能の阻害に効果的な分子である。これらの分子は、限定されないものの、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群および関連する状態を含む、ＰＣＳＫ９機能と関連性があるか、またはその影響を受ける状態の治療において重要である。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の選択的な認識およびそれへの結合により特徴付けられる。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９特異的結合要素に対する追加的な明確な特異性を与えるよう補助されたか設計されている特定の場合を除き、ＰＣＳＫ９以外のタンパク質との有意な結合は示さない。
本書の特定の実施形態を形成するＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、（ａ）配列番号：１７または配列番号：１７の同等物を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変部であって、前記同等物はＣＤＲ３ドメインに１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられる重鎖可変部、および／または（ｂ）配列番号：７または配列番号：７の同等物を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変部であって、前記同等物はＣＤＲ３ドメインに１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられる軽鎖可変部を含む。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に１．２×１０−６Ｍ以下のＫＤで結合する。さらに特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する。別の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に１×１０−８ Ｍ以下のＫＤで結合する。さらなる実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に５×１０−９Ｍ以下、または１×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。特に選んだ実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に１×１０−１０Ｍ以下のＫＤ、１×１０−１１Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−１２Ｍ以下のＫＤで結合する。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９への結合について示した上記レベルで、ＰＣＳＫ９以外のタンパク質には結合しない。
本発明の特定の実施形態には、上記の所定のレベルの１つでＰＣＳＫ９との結合を示し、ＰＣＳＫ９との結合を１Ｄ０５抗体分子と競争するＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が含まれる。１Ｄ０５抗体分子は、本書において重要なＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を形成する。１Ｄ０５抗体分子は、（ｉ）配列番号：１１を含む重鎖可変部（「ＶＨ」）および（ｉｉ）配列番号：２７を含む軽鎖可変部（「ＶＬ」）を含むものとして特徴付けられる。前記ＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれＶＨ（配列番号：１３、１５および１７）およびＶＬ領域（配列番号：３、５および７）について開示したＣＤＲ １、２および３の完全相補物を含む。１Ｄ０５抗体分子の例には、限定はされないものの、（ｉ）配列番号：１を含む軽鎖および配列番号：９のアミノ酸１〜２３３を含むＦｄ鎖を含むＦａｂ（つまり配列番号：９）、並びに（ｉｉ）配列番号：２６を含む軽鎖および配列番号：２５を含む重鎖を含む全長抗体分子が含まれる。
ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害、また特にヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害の影響を弱めるのに効果的である。繰り返すと、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬１Ｄ０５は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込みに対する効果の用量依存的阻害が示された。従って、開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、血漿ＬＤＬコレステロールレベルの低下にとって重要である。また、開示した拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の検出および数量化を含む各種の診断目的での有用性を持つ。特に選んだ１Ｄ０５拮抗薬は、ヒトおよびマウス両方のＰＣＳＫ９との交差反応性のために有用である。この特質により、マウスがヒトＰＣＳＫ９を発現することを確認することなく、特定の１Ｄ０５拮抗薬をマウスモデルで薬理学的に研究することが可能となっている。こうした実験において、マウスモデルは、標的とされたタンパク質の天然の活性およびその拮抗薬の阻害を十分に示す。
特定の実施形態において、本発明には、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が含まれる。特定の実施形態において、本発明には、開示した重鎖および／または軽鎖の可変部、１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つ前記領域の同等物、およびその相同体を含む抗体分子が含まれる。特に選んだ実施形態は、開示したＣＤＲドメインまたは何組かの重鎖および／または軽鎖ＣＤＲドメイン、および１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つものとして特徴付けられるドメインの同等物を含む、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を含む。当業者であれば理解されるとおり、ＰＣＳＫ９を拮抗する能力を保持するＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の断片を各種のフレームワークに挿入することもできる（例えば、米国特許第６，８１８，４１８号およびそれに含まれる参考資料を参照し、抗原結合に基づきこれまでに選択された抗体ループを示すために使用しうる各種の骨格について考察したその開示全体を参照することにより本書に組み込む）。別の方法で、ＶＬおよびＶＨをコードする遺伝子は、組み換え法を使用して、例えばそれらをＶＬおよびＶＨ領域ペアが一価分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができ、別の点では単鎖Ｆｖｓ（「ＳｃＦＶｓ」）として知られている合成リンカーを使用して結合しうる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
ＰＣＳＫ−９特異的拮抗薬および断片は、限定されないものの、アビマー（Ａｖｉｄｉａ）；ＤＡＲＰｉｎｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）；アドネクチン（Ａｄｎｅｘｕｓ）、アンチカリン（Ｐｉｅｒｉｓ）およびアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）を含む、各種の非抗体ベースの骨格の形態でもよい。タンパク質結合のための代替的な骨格の使用は、学術論文で高く評価されている（例えば、Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１−１１を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。従って、（ｉ）開示した重鎖および／または軽鎖の可変部ＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号：１７および７）、（ｉｉ）開示した重鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列または開示した軽鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列：ＣＤＲ１（それぞれ配列番号：１３および３）、ＣＤＲ２（それぞれ配列番号：１５および５）およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号：１７および７）、（ｉｉｉ）それぞれヒトの重鎖および／または軽鎖配列の可変部フレームワーク内の開示した重鎖および軽鎖ＣＤＲの完全な相補物（配列番号：１３、１５、１７、３、５および７）、または（ｉｖ）開示した重鎖および／または軽鎖の可変部配列番号：１１および／または配列番号：２７を含む、非抗体ベースの骨格または拮抗薬分子は、本発明の重要な実施形態を形成し、ここでこうした骨格または拮抗薬分子は、ＰＣＳＫ９についての選択性を示し、ＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害の影響を弱める。
別の態様において、本発明は、開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、また特定の実施形態において、開示した重鎖および軽鎖、開示した可変の重領域および軽領域、並びにその選択成分（ＣＤＲ １、２および／または３など）、特に開示したそれぞれのＣＤＲ３領域を含むＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を提供する。別の態様において、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。さらに、本発明は、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を含む単離された細胞を提供する。別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはベクターを含む単離された細胞を提供する。
本発明は、限定されないものの、抗体、抗原結合断片、誘導体、キメラ分子、上記のいずれかと別のポリペプチドの融合物、または開示した配列を含むＰＣＳＫ９と特異的に結合する能力を持つ代替の構造／組成物を含む、本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を製造する方法を提供する。本方法は、（ｉ）ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を含む細胞、またはその１つ以上の成分をコードする個別の核酸を含む細胞の培養であって、前記核酸は発現されると、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の発現および／または組立が許容される条件下で集合的に拮抗薬を生成する培養、並びに（ｉｉ）細胞からの前記拮抗薬の単離を含む。当業者は、本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を同様に標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して得ることもできる。
本発明は、ＰＣＳＫ９の活性もしくは機能またはＰＣＳＫ９の特筆すべき効果を拮抗する方法であって、前記拮抗薬のＰＣＳＫ９への結合が許容される条件下で、ＰＣＳＫ９を発現する（またはヒトもしくはマウスのＰＣＳＫ９で処理したか、またはその内部にヒトもしくはマウスのＰＣＳＫ９を有する）関心対照の細胞、細胞の集団または組織試料を、本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬と接触させることを含む方法を提供する。本発明の具体的な実施形態には、細胞がヒトまたはマウスの細胞である方法が含まれる。別の実施形態は、細胞がヒトまたはマウス由来のＰＣＳＫ９を発現するものである。
別の態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９活性に関連した状態またはＰＣＳＫ９の機能が特定の被験者について禁忌である状態を示す被験者において、ＰＣＳＫ９の活性もしくは機能またはＰＣＳＫ９の特筆すべき効果を拮抗する方法であって、薬剤組成物またはその他の組成物中の本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の治療的に有効な量を被験者に投与することを含む方法を提供する。
こうして、本発明は、ＰＣＳＫ９活性に関連した状態またはＰＣＳＫ９の機能が特定の被験者について禁忌である状態を治療する方法であって、薬剤組成物またはその他の組成物中の本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の治療的に有効な量を被験者に投与することを含む方法が含まれる。特に選んだ実施形態において、状態は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群または関連する状態である。
特定の実施形態において、本発明には、治療的に有効な量の本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を含む薬剤組成物またはその他の組成物の送達を含む、開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を被験者に投与する方法が含まれる。
別の態様において、本発明は、限定されないものの、賦形剤、希釈剤、安定剤、緩衝液、または代替的に拮抗薬の希望する量での治療対象者への投与を促進するように設計されたものを含む医薬品として容認される担体を含むものとして特徴付けられる本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を含む薬剤組成物またはその他の組成物を提供する。
次の表は、本出願で考察した配列についての全般的概要を提供するものである。全ての記号、配列および特徴（ｆｅａｔｕｒｅｓ）を含む配列リストは、本書の開示の明示的部分（ｅｘｐｒｅｓｓ ｐａｒｔ）を形成する。
Figure 2011511637
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ｍＰＣＳＫ９ ２ＣＸ１Ｄ０５ Ｆａｂ重鎖および軽鎖をコードするＦａｂ発現ベクター ｐＭＯＲＰＨ＿ｘ９＿ＭＨを図示する。 ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用ＴＲ−ＦＲＥＴ試験法での１Ｄ０５の活性を図示する。１Ｄ０５のＦａｂおよびＩｇＧはどちらも強力で、相互作用を完全に抑制する。この実験では、［ＡＦ６４７−ＰＣＳＫ９］＝１０ｎＭ、［Ｅｕ−ｓＬＤＬＲ］〜１．５ｎＭ（ＦＩ６２０ｎｍで〜２００００カウント）である。 図３Ａ〜３Ｄは、（ｉ）１Ｄ０５（Ｆａｂ）の用量依存的なマウスＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの喪失の阻害（図３Ａ）；（ｉｉ）１Ｄ０５（ＩｇＧ）の用量依存的なマウスＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの喪失の阻害（図３Ｂ）；（ｉｉｉ）１Ｄ０５（Ｆａｂ）の用量依存的なヒトＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの喪失の阻害（図３Ｃ）；および（ｉｖ）１Ｄ０５（ＩｇＧ）の用量依存的なヒトＰＳＣＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの喪失の阻害（図３Ｄ）を図示する。１Ｄ０５は、明確にヒトおよびマウスのＰＣＳＫ９の両方と交差反応をする。図３Ａ〜３Ｄには、（ｉ）細胞ＬＤＬ取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、および（ｉｉ）細胞＋ＰＣＳＫ９依存的ＬＤＬ取り込みの喪失レベルを示すＰＣＳＫ９（５μｇ／ｍｌ）対照の２つの対照がある。１Ｄ０５およびＰＣＳＫ９が含まれる滴定実験は、一定の濃度のＰＣＳＫ９（５μｇ／ｍｌ）、およびグラフに示すとおり次第に増える濃度の１Ｄ０５で実施した。図示したとおり、１Ｄ０５は、細胞ＬＤＬ取り込みに対するＰＣＳＫ９の効果を抑制しうる。１Ｄ０５（Ｆａｂ）についてのＩＣ５０は、マウスおよびヒトのＰＣＳＫ９タンパク質についてそれぞれ９７ｎＭおよび１４４ｎＭである。１Ｄ０５（ＩｇＧ）についてのＩＣ５０は、マウスおよびヒトのＰＣＳＫ９タンパク質についてそれぞれ８５ｎＭおよび７９ｎＭである。 図４Ａおよび４Ｂは、１Ｄ０５（それぞれＦａｂおよびＩｇＧ）によるＰＣＳＫ９インターナリゼーションの阻害およびＬＤＬ取り込みの修復を図示する。ＨｅｐＧ２細胞を平板培養し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識化したＰＣＳＫ９およびＬＤＬを細胞に加え、３７℃で４時間培養した。培養後、細胞によって内部移行されたＰＣＳＫ９またはＬＤＬの量を共焦点顕微鏡（ｃｏｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して決定した。対照には、細胞のみの添加（処理なし）、および５０Ｘの未標識のＰＣＳＫ９（５０Ｘ Ｃｏｌｄ Ｗｔ）にＡＦ標識化したＰＣＳＫ９のみ（２５０μｇ／ｍｌ）を加えたものを含む。５ μｇ／ｍｌの野生型ＡＦ標識化ＰＣＳＫ９および１０μｇ／ｍｌのＡＦ標識化ＬＤＬに加えて、１Ｄ０５ Ｆａｂ（パネルＡ）またはＩＧＧ（パネルＢ）のどちらかを増量したものを加えると、細胞へのＰＣＳＫ９インターナリゼーションの阻害およびＬＤＬ取り込みの回復が起こった。これらの研究は総合して、ＦａｂおよびＩｇＧの両方が、細胞へのＰＣＳＫ９インターナリゼーションを阻止することを示している。 一組の結合シンボルで表示されるそれぞれのマウスについてのＬＤＬレベルを図示し；ＬＤＬ（ｐｏｓｔｂｌｅｅｄ−ｐｒｅｂｌｅｅｄ）の変化が各治療群についての平均として表示されている（Δ ｍｇ／ｄＬ）。ＰＢＳでの治療は、ＬＤＬ測定に全く効果がない（−４ｍｇ／ｄＬ、５％減少）。対照的に、血清ＬＤＬは、１Ｄ０５の完全ＩｇＧ（−１９ｍｇ／ｄＬ）で２０％、１Ｄ０５のＦａｂ断片（−２４ｍｇ／ｄＬ）で３４％減少した。 ＩｇＧ１（配列番号：２１；そのＦｃドメインは、配列番号：２１の残基１１０〜１３０によって表される）、ＩｇＧ２（配列番号：２２、そのＦｃドメインは、配列番号：２２の残基１０７〜３２６によって表される）、ＩｇＧ４（配列番号：２３；そのＦｃドメインは、配列番号：２３の残基１０７〜３２７によって表される）およびＩｇＧ２ｍ４（配列番号：２４；そのＦｃドメインは、配列番号：２４の残基１０７〜３２６によって表される）アイソタイプの定常部の配列比較を図示する。 図７Ａおよび７Ｂは、５分間のａ）ｗｔ−ＰＣＳＫ９およびｂ）１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９複合体のＡｓｐＮによる限定的なタンパク質分解に由来するペプチド断片を図示する。図７Ａの星印は、ｗｔ−ＰＣＳＫ９スペクトル内に存在するペプチド断片のうち、１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９スペクトルでは検出されていないものを強調するものである。それ故、アスパラギン酸残基１６９は、複合体内で保護されている。 図８Ａ〜８Ｈは、１５分間にわたるｗｔ−ＰＣＳＫ９（図８Ａ〜８Ｄ）および１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９複合体（図８Ｅ〜８Ｈ）のＧｌｕＣによる限定的タンパク質分解に由来するペプチド断片を図示する。 図９Ａ〜９Ｄは、５分間にわたるａ）ｗｔ−ＰＣＳＫ９およびｂ）１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９複合体のトリプシンによる限定的タンパク質分解に由来するペプチド断片を図示する。図９Ｃ〜Ｄは、それぞれ同一スペクトルの拡大図を示す。図９Ａおよび９Ｃの星印は、ｗｔ−ＰＣＳＫ９スペクトル内に存在するペプチド断片のうち、１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９スペクトルでは検出されていないものを強調するものである。 １Ｄ０５中和Ｆａｂとの結合に関与するｗｔ−ＰＣＳＫ９触媒ドメインの主要配列の残基を図示する。限定的タンパク質分解実験で１Ｄ０５結合により保護されたｗｔ−ＰＣＳＫ９のペプチド断片を囲んである。 １Ｄ０５中和Ｆａｂの結合に関与するｗｔ−ＰＣＳＫ９触媒ドメインのペプチドを図示する。限定的タンパク質分解実験で１Ｄ０５結合により保護されたｗｔ−ＰＣＳＫ９のペプチドは、ｗｔ−ＰＣＳＫ９の構造の拡大図においてＲ１９４とＲ１９９の間およびＡ１６８とＲ１６５の間のセグメントに図示されている。 図１２Ａおよび１２Ｂは、同定されたヒト（配列番号：３９）およびマウス（配列番号：４１）のＰＣＳＫ９の一般的エピトープ領域間の配列アラインメントを図示する。コンセンサス配列（配列番号：４０）は、図１２Ａの第二の配列として提示されている。図から明らかなとおり、保護されたペプチド１９４〜１９９に含まれている残基は、２つの種の間で保存されているが、ペプチド１６５〜１６９の残基は保存されていない。 ＰＣＳＫ９−１Ｄ０５相互作用ＴＲ−ＦＲＥＴ試験法における１Ｄ０５および別個の抗体１Ｂ２０の分析を図示する。両方のＦａｂは強力であり、相互作用を完全に抑制する。この実験で、［ＡＦ６４７−α−Ｖ５］＝１０ｎＭ、［ＰＣＳＫ９］＝１０ｎＭ、および［Ｅｕ（８０４４）−１Ｄ０５（ＩｇＧ）］〜１．５ｎＭ（Ｆ１６２０ｎｍで〜１８０００カウント）である。 図１４Ａ〜Ｄは、Ｅｘｏｐｏｌａｒ試験法において１Ｂ２０がＰＣＳＫ９機能の完全な阻害剤であることを図示する。 アカゲザルにおいて、３ｍｐｋで１Ｄ０５がＬＤＬ−Ｃを〜５０％減少させることを図示する。プロットしたのは、抗体治療単回ＩＶ投与後の試験した異なる時点での、血清中の％ＬＤＬ変化である。 表示した用量レベルでの１Ｄ０５の薬物動態的プロフィールを図示する。プロットしたのは、抗体の単回ＩＶ用量後、試験した時点での血清薬物（１Ｄ０５）レベルである。１Ｄ０５の半減期は７７時間である。
（発明の詳細な記述）
本発明は、ＰＣＳＫ９の拮抗薬、また特定の実施形態において、ヒトおよびマウス両方のＰＣＳＫ９を抑制し、プロセスされたＰＣＳＫ９を優先的にターゲティングする拮抗薬に関する。本書によるタンパク質特異的なＰＣＳＫ９の拮抗薬（または「ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬」）は、ＰＣＳＫ９機能への選択的結合およびＰＣＳＫ９機能の阻害に効果があり、よって、限定されないものの、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群および関連する状態を含むＰＣＳＫ９機能に関連するか、またはＰＣＳＫ９機能の影響を受けた状態の治療にとって重要である。用語「拮抗薬」の使用は、主題の分子がＰＣＳＫ９の機能を拮抗しうる事実を意味する。用語「拮抗する」またはその派生語の使用は、ＰＣＳＫ９の１つ以上の機能に対抗、反作用、阻害、中和または抑制する作用を意味する。本書におけるＰＣＳＫ９機能またはＰＣＳＫ９活性への言及は、ＰＣＳＫ９により促進される、それを必要とする、またはそれにより悪化もしくは向上される何らかの機能または活性を意味する。本書で説明したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害の影響を弱めることに効果があることが実証されている。
本発明の重要な一実施形態は、１Ｄ０５抗体分子に関する。こうした１Ｄ０５抗体分子は、（ｉ）配列番号：１１を含む重鎖可変部（「ＶＨ」）、および（ｉｉ）配列番号：２７を含む軽鎖可変部（「ＶＬ」）を含むものとして特徴付けられる。前記ＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれＶＨ（配列番号：１３、１５および１７）およびＶＬ領域（配列番号：３、５および７）について開示したＣＤＲ １、２および３の完全相補物を含む。１Ｄ０５抗体分子の例には、限定はされないものの、（ｉ）配列番号：１を含む軽鎖および配列番号：９のアミノ酸１〜２３３を含むＦｄ鎖を含むＦａｂ（または配列番号：９）、並びに（ｉｉ）配列番号：２６を含む軽鎖および配列番号：２５を含む重鎖を含む全長抗体分子が含まれる。特に選んだ群の１Ｄ０５抗体は、本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬がヒトおよびマウス両方のＰＣＳＫ９を効果的に阻害すること、およびヒトＰＣＳＫ９の発現が不在のマウスモデルで薬理学的に研究しうることを示す。
本書で到達し、開示したＣＤＲ定義は、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓソフトウェアプログラム配列分析ソフトウェア（「ＳＡＳ」）を使用して定義したものである。ただし、出願人は、ＣＤＲ配列の開始点および終了点の描写および定義には、その他の様々な方法が利用できることの注記を希望し、これには、限定されないものの、Ｋａｂａｔ，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２ Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｃｌｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｃｌｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３、Ｌｅｆｒａｎｃ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８：５０９、およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１を含む。これらおよびその他の方法が、検討（ｒｅｖｉｅｗｅｄ）されてきており、十分に当業者の有する技能の範囲内である（例えば、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０を参照）。ＣＤＲを定義するために当発明人はＳＡＳソフトウェアを採用したが、本発明は配列に関連する異なる定義や異なる任意の分析ソフトウェアまたは方法を用いることにより到達した異なるＣＤＲ描写も全面的に包括する。現時点で開示されている配列に基づく前記使用および結果的なＣＤＲ定義は、十分に本開示の範囲内にあり、本書で予想される。
ＰＣＳＫ９特異的分子は、ＰＣＳＫ９の検出および数量化での各種の診断目的のための有用性も持つ。
その上、開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、特に選んだ実施形態がプロセスされたＰＣＳＫ９、活性形態のＰＣＳＫ９の優先的認識を示してきたという点でユニークである。
本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、血漿ＬＤＬコレステロールレベルの低下にとって望ましい分子であり、また商業的または家畜の獣医学上の重要性のある任意の霊長類、哺乳動物または脊椎動物にとって有用である。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＬＤＬ受容体を有する任意の細胞の集団または組織においてＰＣＳＫ９の活性を抑制するという有用性もある。開示した拮抗薬の有用性は、当業者がたやすく利用できるアッセイにより直接測定される。ＬＤＬ取り込みの測定手段は、文献に記載されている（例えば、Ｂａｒａｋ ＆ Ｗｅｂｂ，１９８１ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０：５９５−６０４、およびＳｔｅｐｈａｎ ＆ Ｙｕｒａｃｈｅｋ， １９９３ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４：３２５３３０を参照）。さらに、血漿中のＬＤＬコレステロールを測定する手段は、文献に詳しく記載されている（例えば、ＭｃＮａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３６９：１５８−１６７を参照）。開示した拮抗薬の細胞ＬＤＬ取り込みに対する特定の影響は、精製した（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）ＰＣＳＫ９および標識化したＬＤＬ粒子を細胞試料に供給すること、ＰＣＳＫ９拮抗薬を細胞試料に供給すること、ＬＤＬ粒子が細胞により取り込みされるために十分な期間の間で前記細胞試料を培養すること、細胞に取り込まれた標識の量を数量化すること、およびＰＣＳＫ９を単独で投与したときに観測された量と比較して、細胞により取り込みされた数量化した標識の量の増加につながる拮抗薬を同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）することを含む方法によっても測定しうる。開示した拮抗薬の影響を測定する追加的な方法は、精製した（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）ＰＣＳＫ９および標識化したＬＤＬ粒子を細胞試料に供給すること、ＰＣＳＫ９拮抗薬を細胞試料に供給すること、ＬＤＬ粒子が細胞により取り込みされるために十分な期間の間で前記細胞試料を培養すること、上澄みを除去することで細胞試料の細胞を分離すること、標識化したＬＤＬ粒子の非特異的な関連を低減すること（プレート、細胞、またはＬＤＬ受容体以外の物に対してかどうか）、細胞を溶解させること、細胞可溶化物内に保持されている標識の量を数量化すること、およびＰＣＳＫ９を単独で投与したときに観測された量と比較して、細胞により取り込みされた数量化した標識の量の増加につながる拮抗薬を同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）することを含む。数量化した標識の量の増加につながる拮抗薬がＰＣＳＫ９拮抗薬である。
ＬＤＬ受容体を持つ任意のタイプの細胞が、上記の方法で採用でき、これには、限定されないものの、ＨＥＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、およびＣＨＯ細胞を含む。任意の出所（ｓｏｕｒｃｅ）に由来するＬＤＬ粒子が、上述のアッセイで使用される。特定のアッセイにおいて、ＬＤＬ粒子は、血液に由来する新鮮な粒子である。これは、当業者が利用できる任意の方法により達成でき、これには、限定されないものの、Ｈａｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９５５ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：１３４５−１３５３の方法を含む。ＬＤＬ粒子は、蛍光で標識化することもできる。標識化したＬＤＬ粒子は、その内部に可視光の波長で励起したフルオロフォア３，３’−ジオクタデシルインドカルボシアニンヨウ化物（ｄｉｌ（３））が取り込まれて、高い蛍光性のあるＬＤＬ誘導体ｄｉｌ（３）−ＬＤＬを形成することもある。当業者が細胞可溶化物内のＬＤＬを検出できるようにする任意の標識を使用しうる。細胞内で代謝されたときにのみ（例えば、蛍光性を持つようになるかまたは異なる波長で蛍光を発するなど）、または、例えば、内部移行される過程でその他の分子と結合する（または分離する）ようになった場合（例えば、ＬＤＬ類似体が二次蛍光と結合するようになるか、または他の場合に消光剤と分離する、ＦＲＥＴ試験法）に検出可能となるＬＤＬ類似体を使用できる。標識化したＬＤＬ粒子のインターナリゼーションの検出のために当技術で利用可能ないずれの手段を採用できる。ＬＤＬ粒子およびＰＣＳＫ９を細胞とともに培養する時間は、細胞によるＬＤＬ粒子の取り込みを可能にするのに十分な長さの時間である。この時間は、５分〜３６０分の範囲内である。細胞に追加するＰＣＳＫ９の濃度は、１ｎＭ〜５μＭの範囲とすることができ、また、特定の方法において、０．１ｎＭ〜３μＭの範囲である。当業者が特定のＰＣＳＫ９タンパク質についての濃度の範囲を決定できる１つの特定の手段は、ＬＤＬ取り込み試験法での用量反応曲線の作成である。ＰＣＳＫ９の濃度は、ＬＤＬ取り込みの最大に近い喪失が促進され、なおかつ用量反応曲線の直線範囲内にあるように選択できる。一般に、この濃度は、用量反応曲線から求めたタンパク質のＥＣ−５０の〜５倍である。濃度は、タンパク質によって変化しうる。
概して、本書で定義したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９を選択的に認識し、それに対して特異的に結合される。抗体は、一般に解離定数が＜１μＭ、望ましくは＜１００ ｎＭおよび最も望ましくは＜１０ ｎＭのときに、抗原に対して特異的に結合されるといわれる。さらに本書での用語「選択的」または「特異的」の使用は、開示した拮抗薬がＰＳＣＫ９以外のタンパク質に対して有意な結合を示さないという事実を意味するが、拮抗薬が追加的な、明確な特異性をＰＣＳＫ９特異的結合部分に対して与えるよう補完または設計されている特定の場合（例えば、分子が２つの分子と結合するか、もしくは２つの機能に影響を及ぼすよう設計されている二重特異性または二機能性の分子において、そのうち少なくとも一方が、ＰＣＳＫ９と特異的に結合するような場合）を除く。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に１．２×１０−６Ｍ以下のＫＤで結合する。さらに特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に５×１０−７Ｍ以下、２×１０−７Ｍ以下、または１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する。別の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する。さらなる実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に５×１０−９Ｍ以下、または１×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。特に選んだ実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に１×１０−１０Ｍ以下のＫＤ、１×１０−１１Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−１２Ｍ以下のＫＤで結合する。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、上記ＫＤではＰＣＳＫ９以外のタンパク質には結合しない。ＫＤは、Ｋｄ（特定の結合分子−標的のタンパク質相互作用の解離率）のＫａ（特定の結合分子−標的のタンパク質相互作用の関連率）に対する比率から得られる解離定数、または濃度（Ｍ）で表現されるＫｄ／Ｋａを意味する。ＫＤ値は、当技術で十分に確立された方法を用いて決定できる。結合分子のＫＤを決定するための望ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することで、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）システムなどのバイオセンサーシステムを採用する方法である。
本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＬＤＬ取り込みに対するヒトおよび／またはマウスＰＣＳＫ９依存的効果を用量依存的に抑制することが示されてきた。従って、本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、細胞へのＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存的阻害の影響を弱める能力によって特徴付けられる。ＬＤＬ受容体による細胞内へのこのＬＤＬの取り込みを、本書では「細胞ＬＤＬ取り込み」という。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞内へのＬＤＬ取り込みの阻害の影響を弱めるかまたは拮抗し、１．０×１０−６Ｍ未満、あるいは、優先される順に、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満および１×１０−１２Ｍ未満のＩＣ５０を示している。任意のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬による阻害の度合いは、対照との統計的比較において、またはＰＣＳＫ９機能に対するマイナスの影響またはその阻害を評価するために当技術で利用可能な任意の代替的な方法（すなわち、ＰＣＳＫ９機能の拮抗作用を評価する能力のある任意の方法）により、数量的に測定しうる。特定の実施形態において、阻害は少なくとも約１０％の阻害である。その他の実施形態において、阻害は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。従って、ＰＣＳＫ９機能のこれらの阻害レベルを達成する能力のあるＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、本書の特定の実施形態を形成する。
本発明によるＰＣＳＫ９特異的拮抗薬には、ヒトおよび／またはマウスＰＣＳＫ９タンパク質に特異的に結合する任意の結合分子（限定されないものの、下記に定義する抗体分子を含む）、任意のＰＣＳＫ９特異的結合構造、ＰＣＳＫ９と特異的に結合する任意のポリペプチドまたは核酸構造、および各種のタンパク質骨格（限定されないものの、各種の非抗体ベースの骨格を含む）に組み込まれた上記のいずれか、およびＰＣＳＫ９との選択的結合を産出または許容する各種の構造（限定されないものの、「ＳＭＩＰ」（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（Ｈａａｎ ＆ Ｍａｇｇｏｓ，２００４ Ｂｉｏｃｅｎｔｕｒｙ Ｊａｎ ２６を参照）、免疫タンパク質（例えば、Ｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：６４３７−６４４２を参照）、シトクロムｂ５６２（Ｋｕ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６５５２−６５５６を参照）、ペプチドα２ｐ８（Ｂａｒｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：９４２−９５５を参照）、アビマー（Ａｖｉｄｉａ、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５５６−１５６１を参照）、ＤＡＲＰｉｎｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４８９−５０３、およびＦｏｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５３９：２−６を参照）、テトラネクチン（Ｋａｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ． Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５４：７５７−７６６を参照）、アドネクチン（Ａｄｎｅｘｕｓ、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：９３３−９４２を参照）、アンチカリン（Ｐｉｅｒｉｓ、Ｖｏｇｔ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００４ Ｃｈｅｍｏｂｉｏｃｈｅｍ．５：１９１−１９９、Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１８９８−１９０３、Ｌａｍｌａ ＆ Ｅｒｄｍａｎｎ， ２００３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２９：３８１−３８８、およびＬａｍｌａ ＆ Ｅｒｄｍａｎｎ，２００４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３３：３９−４７を参照）、Ａドメインタンパク質（Ｎｏｒｔｈ ＆ Ｂｌａｃｋｌｏｗ，１９９９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：３９２６−３９３５を参照）、リポカリン（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００５ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １０：２３−３３を参照）、アンキリンリピートタンパク質などのリピートモチーフタンパク質（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ ＆ Ｓｍｅｒｄｏｎ，１９９９ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：３１１−３１６、Ｍｏｓａｖｉ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１６０２９−１６０３４、およびＢｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５７５−５８２を参照）、インセクトディフェンシンＡ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２５：６２９−６３５を参照）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｇｅｎｅ １２１：９−１５、Ｄｅｎｎｉｓ ＆ Ｌａｚａｒｕｓ，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２１２９−２２１３６、およびＤｅｎｎｉｓ ＆ Ｌａｚａｒｕｓ，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２１３７−２２１４４を参照）、ＰＤＺドメイン（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７０−１７５を参照）、カリブドトキシンなどのサソリ毒（Ｖｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ４７：９３−１００を参照）、１０ｔｈフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（または１０Ｆｎ３、Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：９３３−９４２を参照）、ＣＴＬＡ−４（細胞外ドメイン、Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３６：２１７−２２７、およびＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１−４５を参照）、ノッチン（Ｓｏｕｒｉａｕ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：７１４３−７１５５およびＬｅｈｔｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４１：３１６−３２２を参照）、ネオカルチノスタチン（Ｈｅｙｄ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：５６７４−５６８３を参照）、炭水化物結合モジュール４−２（ＣＢＭ４−２、Ｃｉｃｏｒｔａｓ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７：２１３−２２１を参照）、テンダミスタット（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ＆ Ｈｏｅｓｓ，１９９５ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−４７０、およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １６：６５−７２を参照）、Ｔ細胞受容体（Ｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５３８７−５３９２、Ｓｈｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：７５４−７５９、およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４９−３５４を参照）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ、Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：６０１−６０８、Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２−７７７、Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２：８７３−８７８を参照）、および文献で認識されているその他の選択的に結合するタンパク質または骨格（例えば、Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１−１１、Ｇｉｌｌ ＆ Ｄａｍｌｅ，２００６ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１−６、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７−１２６８、Ｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５１４−５２２、Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４５９−４６９、Ｎｙｇｒｅｎ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：３−２８、Ｎｙｇｒｅｎ ＆ Ｕｈｌｅｎ，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３−４６９を参照）などが含まれ、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。抗体および抗原結合断片の使用については、文献で十分に定義され、理解されている。タンパク質結合のための代替的な骨格の使用については、同様に学術論文で十分に認識されている（例えば、Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１−１１、Ｇｉｌｌ ＆ Ｄａｍｌｅ，２００６ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１−６、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７−１２６８、Ｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５１４−５２２、Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４５９−４６９、Ｎｙｇｒｅｎ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：３−２８、Ｎｙｇｒｅｎ ＆ Ｕｈｌｅｎ，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３−４６９を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。従って、ＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害の影響を弱めるＰＣＳＫ９の選択性を示す、本発明による非抗体ベースの骨格または拮抗薬分子は、本発明の重要な実施形態を形成する。アプタマー（目標の分子と選択的に結合する能力のある核酸またはペプチド分子）は、１つの具体的な例である。これらは、ランダムな配列プールから選択するか、またはリボスイッチなど天然の出所から同定することができる。ペプチドアプタマー、核酸アプタマー（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方をベースにした構造を含む構造化された核酸）および核酸デコイが、選択的な結合および目的のタンパク質の阻害に効果的でありうる（例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ＆ Ｂｕｔｚ，２０００ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：４２６−４３０、Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６、Ｂｕｎｋａ ＆ Ｓｔｏｃｋｌｅｙ，２００６ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：５８８−５９６、Ｍａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．６：３０−３４、Ｊａｙａｓｅｎａ，１９９９ Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．４５：１６２８−１６５０を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
重要なことには、ＰＣＳＫ９上の１Ｄ０５のための結合部位（つまりエピトープ）は、限定的タンパク質分解および質量分析法（「ＬＰ−ＭＳ」）により同定された。限定的タンパク質分解質量分析法での分析には、野生型ＰＣＳＫ９（「ｗｔ−ＰＣＳＫ９」）およびｗｔ−ＰＣＳＫ９と１Ｄ０５の複合体を異なる特異性のエンドプロテアーゼ酵素とともに注意深く管理された条件で培養することを含んだ。こうした条件下では、エンドプロテアーゼが、暴露された主要な切断部位のみを切断した。この実験は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９に対する１Ｄ０５の結合により、通常は抗体に結合されていないｗｔ−ｈＰＣＳＫ９上に暴露される表面残基をマスクするようにデザインされた。こうしたマスクされた残基により、１Ｄ０５の結合ドメインの洞察（ｉｎｓｉｇｈｔ）がもたらされた。こうした実験を通して、性質上は立体配置的で、ペプチドＲＹＲＡＤ（配列番号：４２）およびＲＥＩＥＧＲ（配列番号：３７）で代表される、新しい中和エピトープが同定された。このエピトープは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメイン内にあり、効果的な別のＰＣＳＫ９拮抗薬を同定するための新しい標的エピトープを提供する。１Ｄ０５のＰＣＳＫ９中和活性を考慮すると、このエピトープに結合する別のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の同定は、かなりの関心の対象である。
同定された１Ｄ０５エピトープまたは重複するエピトープに結合される拮抗薬および特に抗体を同定する１つの手段は、競合または類似した試験法によるもので、この場合、補抗体または結合分子がそのエピトープについて１Ｄ０５を凌ぐ（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）必要がある。本書で包含された競合的拮抗薬は、１Ｄ０５の結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、および８０％（優先順）（さらにより望ましくは、少なくとも９０％で、最も望ましくは、少なくとも９５％）だけ抑制する（すなわち、対照と比較して、阻止するか、または妨害する）または１ μＭ以下、１Ｄ０５がそのＫＤ以下で低減する分子であり、また特に（ｉ）ＬＤＬ受容体へのＰＣＳＫ９の結合、（ｉｉ）細胞へのＰＣＳＫ９のインターナリゼーション、あるいは（ｉｉｉ）ＬＤＬ受容体へのＰＣＳＫ９の結合および細胞へのＰＣＳＫ９のインターナリゼーションの両方を拮抗する分子である。結合する構成要素間での競合は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、および／または溶液中での抗体のＰＣＳＫ９との相互作用をモニターすることで、インビトロで容易にアッセイしうる。分析を実施する厳密な手段は重要ではない。ＰＣＳＫ９は、９６ウェルプレートに固定化したり、同種（同質）の溶液中に配置することができる。特定の実施形態において、標識化した１Ｄ０５の結合を阻止する未標識の候補抗体の能力は、放射能、酵素またはその他の標識を使用して測定できる。逆アッセイでは、標識化された１Ｄ０５のＰＣＳＫ９との相互作用（ここで前記１Ｄ０５およびＰＣＳＫ９は既に結合されている）を妨害する未標識の抗体の能力が決定される。特定の実施形態において、（ｉ）ＰＣＳＫ９が標識化された１Ｄ０５（配列番号：２７を含むＶＬおよび配列番号：１１を含むＶＨを含む抗体分子）と接触し；（ｉｉ）ＰＣＳＫ９が候補抗体または抗体プールと接触し、並びに（ｉｉｉ）ＰＣＳＫ９および１Ｄ０５の間の複合体の妨害または阻止をする能力のある抗体が同定される。こうした例での読み出しは、結合された標識の測定による。１Ｄ０５および候補抗体は、任意の順序でまたは同時に追加しうる。実行しうる特定の試験法は、１Ｄ０５と同一のエピトープドメインに結合することが分かっている抗体の活性が例証されている実施例１３のものである。
上記またはその他の適切なアッセイにおいて１Ｄ０５競合相手として同定された抗体を、（ｉ）ＬＤＬ受容体へのＰＣＳＫ９の結合、および／または（ｉｉ）細胞へのＰＣＳＫ９のインターナリゼーションを拮抗もしくは中和する能力について試験することができる。これらのパラメーターは、本明細書で採用または説明したものと類似したアッセイの使用により測定することができる。特定の実施形態において、競合する抗体により示される阻害は、少なくとも約１０％の阻害である。その他の実施形態において、阻害は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。
本発明には特に、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、また特に１Ｄ０５について同定されたエピトープ、または１Ｄ０５のＰＣＳＫ９への結合に干渉する重複するエピトープ（およびそれらの対応するアミノ酸および核酸配列）に選択的に結合するモノクローナル抗体分子が含まれる。ＰＣＳＫ９のエピトープ上で同定された１Ｄ０５結合にとって重要な残基は、ヒトＰＣＳＫ９の残基Ａｒｇ１９４、Ｇｌｕ１９７およびＡｒｇ１９９に対応する残基である。これらのアミノ酸残基を含む狭いエピトープは、配列番号：３７により表され、またヒトＰＣＳＫ９の配列番号：３９およびマウスＰＣＳＫ９の配列番号：４１の領域内にある。抗体の第二のフットプリントは、配列番号：４２により表される。配列番号：３７および配列番号：４２によって表される立体配置的エピトープまたは重複するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、（ｉ）ＬＤＬ受容体へのＰＣＳＫ９の結合；（ｉｉ）細胞へのＰＣＳＫ９のインターナリゼーション、もしくは（ｉｉｉ）両方を拮抗または中和する。従って、配列番号：３７、配列番号：３９もしくは配列番号：４１を含む、および／またはからなるＰＣＳＫ９上のエピトープに結合するモノクローナル抗体は、本発明の重要な実施形態を形成する。本発明の特定の実施形態は、以下のＰＣＳＫ９上のエピトープ：配列番号：３７および配列番号：４２を認識するモノクローナル抗体に関する。本書によるモノクローナル抗体分子は、無傷の（完全または全長）抗体、実質的に無傷の抗体、または抗原結合部分を含む抗体の部分または断片、例えば、マウス抗体の、もしくはキメラ抗体の、もしくはヒト化抗体の、もしくはヒト抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片としうる。本書で使用するとき、モノクローナルは、均質または実質的に均質（または純粋）な抗体集団（すなわち、集団内の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、より望ましくは少なくとも約９７％または９８％、または最も望ましくは少なくとも９９％の抗体が同一であり、また同じ抗原またはエピトープについてのＥＬＩＳＡ試験法で競合する）。本発明の特定の実施形態において、本発明は、（ｉ）１Ｄ０５抗体分子と、ＰＣＳＫ９への結合について競合し、１ μＭ以下で１Ｄ０５がそのＫＤ以下で１Ｄ０５結合を少なくとも５０％低減し、（ｉｉ）ＬＤＬ受容体へのＰＣＳＫ９の結合をブロックし、（ｉｉｉ）細胞内へのＰＣＳＫ９のインターナリゼーションを抑制し、並びに（ｉｖ）特定の抗原結合領域、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲのセットまたは重鎖ＣＤＲ３、重鎖および／もしくは軽鎖または本書で説明したこれらの成分の任意の変異体を含むモノクローナル抗体を提供する。さらなる実施形態では、限定されないものの、配列番号：３７、配列番号：３９または配列番号：４１を認識／結合するモノクローナル抗体を含むＰＣＳＫ９特異的拮抗薬であって、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に対して１．２×１０−６ Ｍ以下のＫＤで結合し、かつＰＣＳＫ９特異的拮抗薬がＰＣＳＫ９に対する結合について１Ｄ０５と競合する、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を提供する。本書の具体的な実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、以下の品質の１つ以上によってさらに定義される：これらは、（ｉ）１ μＭ以下で、１Ｄ０５がそのＫＤ以下で１Ｄ０５結合を少なくとも５０％減少させる、（ｉｉ）ＬＤＬ受容体へのＰＣＳＫ９結合を遮断する、（ｉｉｉ）細胞へのＰＣＳＫ９インターナリゼーションを抑制する、および／または（ｉｖ）特異的な抗原結合領域、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲのセットもしくは重鎖ＣＤＲ３、重鎖および／もしくは軽鎖または本書で記述したこれらの成分の任意の変異体を含む。具体的な実施形態において、上記によるＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、（ｉ）開示した重鎖および／または軽鎖可変部ＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号：１７および７）、（ｉｉ）開示した重鎖および／または軽鎖可変部ＣＤＲ１（それぞれ配列番号：１３および３）、ＣＤＲ２（それぞれ配列番号：１５および５）およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号：１７および７）、（ｉｉｉ）ヒト重鎖および／または軽鎖配列の可変部フレームワーク内の開示した重鎖および軽鎖ＣＤＲの完全な相補物（配列番号：１３、１５、１７、３、５および７）；（ｉｖ）開示したＶＬおよび／もしくはＶＨ領域（それぞれ配列番号：２７および１１）；（ｖ）開示した軽鎖および／もしくはＦｄ鎖（配列番号：１および配列番号：９のアミノ酸１〜２３３（または配列番号：９））、または（ｖｉ）開示した軽鎖および／もしくは重鎖（配列番号：２６および２５）を含む。具体的な実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、配列番号：３７および配列番号：４２の両方に結合し／認識する。
１Ｄ０５と同一または重複するエピトープ領域に結合する抗体を同定するための上記のアッセイのいずれかにおいて、既知の結合剤（すなわち、配列番号：３７の残基Ａｒｇ１９４、Ｇｌｕ１９７およびＡｒｇ１９９を結合することが知られている１Ｄ０５抗体分子）の結合は、候補結合剤の結合と比較して、識別可能であるべきである。これは、当業者により用意に理解されるとおり、一方または両方の分子に標識を使用することにより達成することができる（ただし必ずしもその必要はない）。本書で使用するとき、標識は、抗体分子に組み込まれる／添付される別の分子または薬剤を意味する。一実施形態において、標識は、検出可能マーカー、例えば、放射標識化したアミノ酸または標識を付けたアビジンにより検出可能なビオチニル部分のポリペプチドへの付着（例えば、光学的または比色分析の方法により検出が可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識化する様々な方法が当技術で知られており、それを使用することができる。ポリペプチドの標識の例には、限定されないものの、以下を含む：放射同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ）、化学発光法マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチド抗原決定基（例えば、ロイシンジッパー配列対、二次抗体の結合部位、金属結合領域、抗原決定基タグ）、ガドリニウムキレートなどの磁性物質、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、並びにこれらの類似体または相同体。一部の実施形態において、標識は、様々な長さのスペーサーの腕によって付着し、潜在的な立体障害が低減される。
競合アッセイに使用される１Ｄ０５抗体は、本書で提供した１Ｄ０５の描写に該当する任意の抗体分子（つまり配列番号：２７を含むＶＬおよび配列番号：１１を含むＶＨを含む、ＰＣＳＫ９について選択的な任意の抗体分子）としうる。こうした抗体の例には、限定はされないものの、（ｉ）配列番号：１を含む軽鎖および配列番号：９のアミノ酸１〜２３３を含むＦｄ鎖を含むＦａｂ（つまり配列番号：９）、（ｉｉ）配列番号：２６を含む軽鎖および配列番号：２５を含む重鎖を含む全長抗体が含まれる。
配列番号：３９または配列番号：４１に対応する領域（および特に選んだ実施形態では、配列番号：３７および配列番号：４２に対応する領域）に基づくペプチドまたはペプチド擬態、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲとの相互作用を阻止することにより、拮抗特性を持つはずである。重要なことに、配列番号：３７および配列番号：４２を含むペプチドは、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９結合の阻害および／または細胞へのＰＣＳＫ９インターナリゼーションの阻害が可能な中和抗体を生成するはずである。
具体的な実施形態において、本書に含まれるペプチドは、配列番号：３９または配列番号：４１を含む。特に選んだ実施形態において、ペプチドは、配列番号：３７を含み、アミノ酸数５０未満である。一定の実施形態において、ペプチドは、配列番号：３７および配列番号：４２の両方を含み、アミノ酸数は４０以下である。さらに具体的な実施形態において、ペプチドは配列番号：３７を含み、アミノ酸数４０未満、アミノ酸数３０未満、アミノ酸数２０未満、またはアミノ酸数１０未満である。
本発明のペプチドのスクリーニングは、上述の競合試験法を利用することもできる。試験されるペプチドが、こうした１Ｄ０５抗体分子の結合の減少により示されるとおり、１Ｄ０５抗体分子（すなわち、配列番号：２７を含むＶＬおよび配列番号：１１を含むＶＨを含む、ＰＣＳＫ９に対して選択的な任意の抗体分子）と競合する場合には、ペプチドおよび１Ｄ０５が同一または密接に関連したエピトープと競合する可能性が高い。ペプチドが１Ｄ０５抗体分子の特異性を持つかどうかを決定するためのさらに別の方法では、１Ｄ０５抗体分子を通常されとの反応性のあるＰＣＳＫ９とともにプレインキュベートし、次いでＰＣＳＫ９に対する特異性が示されている試験されるペプチドを加えて、ペプチドがそのＰＣＳＫ９と競合する能力が阻害されたかどうかを判断する。試験されるペプチドが阻害された場合には、おそらく、１Ｄ０５抗体分子と同一または機能的に同等なエピトープおよび特異性を持つ。
本明細書全体を通して概説し、また当業者に周知のルーチンの手順を使用して、ペプチドがＰＣＳＫ９のＬＤＬ受容体に対する結合を遮断するか、および／または細胞へのＰＣＳＫ９インターナリゼーションを阻止するかどうかを決定することにより、ＰＣＳＫ９に結合するペプチドが有用であるかを決定することができる。
本出願で説明した任意のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の発現および選択は、限定されないものの、ファージディスプレイ（例えば、国際出願番号ＷＯ ９２／０１０４７号、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照）、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、およびリボソームディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｅ ＆ Ｊｅｒｍｕｔｕｓ，２００４ Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５１７−５２７を参照）を含む、適切な技術を使用して達成できる。
本発明の一部を形成する特定のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、抗体分子または抗体である。本書で記載される「抗体分子」または「抗体」は、ヒトおよび／またはマウスＰＣＳＫ９に対する選択的結合性を持つ免疫グロブリン由来の構造を意味し、これには、限定されないものの、全長抗体または抗体全体、抗原結合断片（物理的にまたは概念的に抗体構造に由来する断片）、上記のいずれかの誘導体、上記のいずれかの別のポリペプチドとの融合体、またはＰＣＳＫ９との選択的な結合／ＰＣＳＫ９の機能の阻害の目的で上記のいずれかを組み込む任意の代替的な構造／組成物が含まれる。
抗体「全体」または「全長」抗体は、（１）重鎖については、可変部（本書では「ＶＨ」として省略）および３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む重鎖定常部、並びに（２）軽鎖については、軽鎖可変部（本書では「ＶＬ」として省略）および１つのドメインＣＬを含む軽鎖定常部を含むジスルフィド結合により内部結合した２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を意味する。
抗体断片および、さらに具体的には、抗原結合断片は、抗体可変部またはその断片（必要に応じて、１つ以上の開示したＣＤＲ ３ドメイン、重鎖および／もしくは軽鎖のフレームワーク領域内の重鎖および／または軽鎖を含む）を持つ分子であり、これが、ＰＣＳＫ９および特にヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９に対する選択的結合を与える。こうした抗体可変部を含む抗体断片には、限定はされないものの、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体分子（抗体とは異なる結合特異性を持つ第二の機能的部分に連結された、本書で開示したＰＣＳＫ９特異的な抗体または抗原結合断片を含む抗体分子で、これには、限定されないものの、抗体もしくは受容体リガンドといった別のペプチドまたはタンパク質が含まれる）、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、単離されたＣＤＲ３、ミニボディー、「ｓｃＡｂ」、ｄＡｂ断片、二重特異性抗体、三量体、四量体、ミニボディー、およびタンパク質骨格を基にした人工抗体（これには、限定されないものの、フィブロネクチンＩＩＩ型ポリペプチド抗体（例えば、米国特許第６，７０３，１９９号および国際出願番号ＷＯ ０２／３２９２５号およびＷＯ ００／３４７８４号を参照）またはシトクロムＢ（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３−４６９を参照）があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）などの抗体分子が含まれる。抗体部分または結合断片は、天然でも、または部分的または完全に合成的製造したものでもよい。こうした抗体部分は、限定されないものの、パパインまたはペプシン消化などの保存的技術を含む、当業者に周知の各種の手段により準備できる。
本書で抗体分子、一般的にＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、コードする核酸またはその他に関連して使用される、用語「単離された」は、それが属するという属性を、それらが天然に見いだされる開示のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、核酸またはその他のものとは異なるものにすることを記述する。例えば、それらの純度、またはその構造もしくは構造の形態部分が天然に見いだされるものとは異なるなどの差異があり得る。天然に見いだされない構造には、例えば組み換え体ヒト免疫グロブリン構造を含み、これには、限定されないものの、最適化されたＣＤＲを持つ組み換え体ヒト免疫グロブリン構造が含まれる。天然に見いだされない構造のその他の例は、実質的にその他の細胞材料が含まれていないＰＣＳＫ９特異的拮抗薬または核酸がある。単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、一般的に、異なるタンパク質特異性を持つ（すなわち、ＰＣＳＫ９以外に対する親和性を持つ）その他のタンパク質特異的拮抗薬は含まれていない。
特定の態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９機能を拮抗する単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を提供する。特定の実施形態において、前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＬＤＬ受容体へのＰＣＳＫ９の結合の妨害およびその結果としてのＰＣＳＫ９細胞インターナリゼーションにより、ヒトおよび／またはマウスＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込みの拮抗作用を阻害する。よって、開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、血漿ＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させるための望ましい分子を形成する（例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３７：１６１−１６５（ここでは、対立遺伝子ＰＣＳＫ９におけるナンセンス変異に対してヘテロ接合性の個人で著しく低い血漿ＬＤＬコレステロールレベルが見られた）、Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２：５３７４−５３７９（ここでは、ＰＣＳＫ９−ノックアウトマウスにより、肝実質細胞におけるＬＤＬＲ数の増加、血漿ＬＤＬクリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の加速、および著しく低い血漿コレステロールレベルが見られた）、およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３５４：１２６４−１２７２（ここでは、機能喪失した、突然変異ＰＣＳＫ９についてヘテロ接合性のヒトは、アテローム硬化性心臓病の長期的な発病リスクの著しい低減を示した）を参照）。
繰り返し実験により、本書で開示した１Ｄ０５抗体分子は、ヒトおよび／またはマウス両方のＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込みに対する効果を用量依存的に阻害した。特定の実施形態において、よって本発明には、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が、さらに特定の実施形態において、これらの１Ｄ０５抗体分子または重鎖および／もしくは軽鎖に含まれる重鎖および／または軽鎖の可変部（それぞれ配列番号：１１および２７）を含む抗体分子、例えば、それぞれ配列番号：９のアミノ酸１〜２３３（または配列番号：９）および配列番号：１、またはそれぞれ配列番号：２５および２６）、並びに同等物（１Ｄ０５のＰＣＳＫ９選択的な性質を低下させない１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられる）または相同体が含まれる。特定の実施形態は、本書で開示したＣＤＲドメインまたは本書で開示した重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲドメインのセットまたは１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を含む単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を含む。
本書での用語「ドメイン」または「領域」の使用は、単に、問題の配列またはセグメントが存在することになるか、または別の方法では、現時点で存在する抗体分子のそれぞれの部分を意味する。
特定の実施形態において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：１１を含む重鎖可変部を含む抗体分子、１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物、およびその相同体を提供する。開示した拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害の影響を弱めるか阻害すべきである。特定の実施形態において、本発明は、配列番号：１１の重鎖可変部に対して少なくとも９０％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
特定の実施形態において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：２７を含む軽鎖可変部を含む抗体分子、１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物、およびその相同体を提供する。開示した拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害の影響を弱めるか阻害すべきである。特定の実施形態において、本発明は、配列番号：２７の軽鎖可変部に対して少なくとも９０％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
特定の実施形態において、本発明は、配列番号：１１を含む重鎖可変部および配列番号：２７を含む軽鎖可変部、または所定の配列において１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を含む単離されたＰＣＳＫ９特異的抗体分子を提供する。具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する前記拮抗薬である。特定の実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号：１１および２７の重鎖および軽鎖の可変部に対して少なくとも９０％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
特定の実施形態において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、可変重ＣＤＲ３配列（配列番号：１７）を含むＰＣＳＫ９抗体分子、および１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供し、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。具体的な実施形態は、それぞれ配列番号：１３および／または配列番号：１５を含む重鎖可変部ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２配列を含む単離された拮抗薬、または１つ以上の任意のＣＤＲ配列内にある１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ＣＤＲ３配列に対して、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列のそれぞれ内で配列番号：１７またはそれぞれ必要に応じて配列番号：１３、１５および１７に対して少なくとも９０％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
特定の実施形態において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：７を含む可変軽−ＣＤＲ３配列を含む抗体分子；および１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供し、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。具体的な実施形態は、それぞれ配列番号：３および／または配列番号：５を含む軽鎖可変部ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２配列を含む単離された拮抗薬、または１つ以上の任意のＣＤＲ配列内にある１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ＣＤＲ３配列に対して、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列のそれぞれ内で配列番号：７またはそれぞれ必要に応じて配列番号：３、５および７に対して少なくとも９０％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
特定の実施形態において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、それぞれ配列番号：１７および７を含む重鎖可変部ＣＤＲ３配列および軽鎖可変部ＣＤＲ３配列を含む抗体分子、または１つ以上の任意のＣＤＲ３配列内に１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供し、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。特定の実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号：１７および７の重鎖および軽鎖の可変部ＣＤＲ３配列に対して少なくとも９０％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
具体的な実施形態は、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、重鎖可変部ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む抗体分子、およびそれぞれ配列番号：１３、１５、１７、３、５および７を含む軽鎖可変部ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、および１つ以上の任意のＣＤＲ配列内に１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つことで特徴付けられるその同等物を提供し、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。特定の実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号：１３、１５、１７、３、５および７に対する重鎖および軽鎖の可変部ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に対して少なくとも９０％同一であることで特徴付けられる開示した拮抗薬の相同体を提供し、前記拮抗薬は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
本発明の特定の態様には、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：４５の重鎖可変部ＣＤＲ３配列を含み、ＣＤＲ３配列が配列番号：１７ではない、上記に開示したその変異体である抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。本発明のさらなる実施形態は、さらに配列番号：４３の重鎖可変部ＣＤＲ１配列で、変異体配列が配列番号：１３ではないもの、および／または配列番号：４４の重鎖可変部ＣＤＲ２配列で、変異体配列が配列番号：１５ではないものを含み、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。その他の実施形態において、本発明には、それぞれ、各領域内の配列番号：４３、４４および４５を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、それぞれ配列番号：１３、１５および１７ではない重鎖可変部配列が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
本発明の別の態様では、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：４８の軽鎖可変部ＣＤＲ３配列を含み、ＣＤＲ３配列が配列番号：７ではない、上記に開示したその変異体である抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。本発明のさらなる実施形態は、さらに配列番号：４６の軽鎖可変部ＣＤＲ１配列で、変異体配列が配列番号：３でないもの、および／または配列番号：４７の軽鎖可変部ＣＤＲ２配列で、変異体配列が配列番号：５でないものを含み、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。その他の実施形態において、本発明には、それぞれ、各領域内のそれぞれ配列番号：４６、４７および４８を含み、配列番号：３、５および７ではないＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変部配列が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
その他の別個の実施形態には、（ａ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変部であって、（ｉ）ＣＤＲ１配列は配列番号：１３または配列番号：４３を含み、配列番号：４３は配列番号：１３とは配列が異なり、（ｉｉ）ＣＤＲ２配列は配列番号：１５または配列番号：４４を含み、配列番号：４４は配列番号：１５とは配列が異なり、並びに（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列は配列番号：１７または配列番号：４５を含み、配列番号：４５は配列番号：１７とは配列が異なり、および／または（ｂ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変部であって、（ｉ）ＣＤＲ１配列は配列番号：３または配列番号：４６を含み、配列番号：４６は配列番号：３とは配列が異なり、（ｉｉ）ＣＤＲ２配列は配列番号：５または配列番号：４７を含み、配列番号：４７は配列番号：５とは配列が異なり、並びに（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列は配列番号：７または配列番号：４８を含み、配列番号：４８は配列番号：７とは配列が異なる軽鎖可変部を含む、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
本発明のその他の態様には、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、（ｉ）それぞれ各領域で配列番号：４３、４４および４５を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、それぞれ配列番号：１３、１５および１７ではない重鎖可変部配列、並びに（ｉｉ）それぞれ各領域で配列番号：４６、４７および４８を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、それぞれ配列番号：３、５および７ではない軽鎖可変部配列を含む上記に開示したその変異体である抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
本発明の特定の実施形態において、ＣＤＲは、保存的アミノ酸置換のない１Ｄ０５の対応する領域の代わりであり、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。特定の実施形態において、本発明には、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、それぞれ配列番号：５０および４９を含む重鎖および／または軽鎖の可変部を含む抗体分子が含まれ、前記変異体配列番号は、それぞれ配列番号：１１および２７ではなく、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。
具体的な実施形態には、任意の単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、任意に本書で開示した軽鎖可変部配列（例えば、配列番号：２７）を含む配列番号：５１〜５６のいずれかに見いだされる重鎖可変部配列を含む抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態は、ヒトおよび／またはマウスのＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％阻害する。その他の実施形態には、任意の単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに具体的な実施形態において、任意に本書で開示した重鎖可変部配列（例えば、配列番号：１１）を含む配列番号：５７〜６０のいずれかに見いだされる軽鎖可変部配列を含む抗体分子が含まれ、その具体的な実施形態では、細胞ＬＤＬ取り込みのヒトおよび／またはマウスＰＣＳＫ９依存的阻害が少なくとも１０％阻害される。
特定の実施形態は、全長抗体の上述のＶＨおよびＶＬ領域を含む単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬である。本書における具体的な実施形態はさらに、配列番号：２１（ＩｇＧ１）、配列番号：２２（ＩｇＧ２）、配列番号：２３（ＩｇＧ４）および配列番号：２４（ＩｇＧ２ｍ４）を含む群から選択した一連のアミノ酸を含む。
当業者が理解するとおり、保存的アミノ酸置換はアミノ酸残基を、類似しているか、またはより適切な（意図した目的について）機能的および／または化学的な特性を与えるものと置き換える置換である。こうした保存的アミノ酸置換を持つ拮抗薬は、当技術で利用可能な、または本書で説明した機能的アッセイを使用して、活性が同等またはより適切かどうかについて試験することができる。ヒトＰＣＳＫ９に選択的に結合する能力を保持し、本書で説明した１Ｄ０５抗体分子と同じかまたは高いレベルでＰＣＳＫ９機能を拮抗する１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、本書では開示した拮抗薬の「機能的同等物」といい、本発明の具体的な実施形態を形成する。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似した側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられるものであることがよくある。類似した側鎖を持つアミノ酸残基ファミリーは、当技術で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が含まれる。こうした修飾は、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の結合または機能的阻害特性を著しく低減または変化させるようにはデザインされていないが、にもかかわらずこうした性質（特性）が改善されうる。置換をする目的は重要ではなく、また、いかなる形でもこれに限定されるわけではないが、残基を分子の構造、分子の電荷もしくは疎水性、または分子のサイズをより良く維持または高めるものと置き換えることが含まれうる。例えば、単にそれほど望ましくない残基を同じ極性または電荷のものと置き換えることもできる。こうした修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲを媒介した突然変異誘発など、当技術で既知の標準技法により導入できる。当業者が保存的アミノ酸置換を実行する１つの特定の手段は、例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７、およびＳａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４で考察されているアラニンスキャニング突然変異誘発である。
別の態様において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、開示した抗体の対応するアミノ酸配列に対して相同的なアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖の可変部を含む抗体分子であって、抗体分子がＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を抑制する抗体分子を提供する。具体的な実施形態は、それぞれ開示した重鎖および／または軽鎖の可変部と少なくとも９０％同一である重鎖および／または軽鎖の可変部を含む拮抗薬である。「少なくとも９０％同一」の言及には、本書で開示した分子の全長に沿って、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００％同一の配列が含まれる。
本書で説明した拮抗薬のアミノ酸配列と相同的なアミノ酸配列を持つＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は一般に、そのＰＣＳＫ９に対する特異性にマイナスの影響を与えずに拮抗薬の１つ以上の性質を改善させるように製造される。こうした配列を得る１つの方法は、これは当業者が利用できる唯一の方法ではないが、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬またはその特異性を決定する領域をコードする配列を変異させ、変異した配列を含む拮抗薬を発現させ、保持された機能について、本書に記載したものを含む利用可能な機能的アッセイを使用して、コードした拮抗薬を試験する方法である。突然変異は、部位特異的またはランダム突然変異誘発によるものとすることができる。ただし、当業者が理解するとおり、その他の突然変異誘発方法によっても、簡単に同じ効果をもたらしうる。例えば、ある一定の方法において、突然変異体のスペクトルは、アミノ酸の化学的もしくは構造的特性のいずれかに基づいて非ランダムに保存的置換をターゲティングすることにより、またはタンパク質構造を考慮することにより制約される。親和性成熟実験において、こうしたいくつかの突然変異は、ランダムまたは非ランダムに選択されたかどうかによらず、選択した単一の分子内で見つかることがある。親和性成熟についてはまた、例えば、米国特許第７，１１７，０９６号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０２／０８４２７７号およびＷＯ ０３／０９９９９９号で例証されているとおり構造をベースにした様々なアプローチもあり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。
本書で使用するとき、２つのアミノ酸または核酸配列間の相同性パーセント値は、２つの配列間の同一性パーセント値と等価であり、これら２つの用語は全体にわたり置き換えが可能なものとして使用する。本書で使用するとき、２つの核酸またはアミノ酸配列の同一性パーセント値は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）のアルゴリズムを使用して決定される。こうしたアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同的な核酸配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で実行される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本書で開示したアミノ酸配列と相同的なアミノ酸配列を得るためにＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で実行される。比較の目的でギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載のあるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用する。
類似したまたはより良い特異性を持つその他の結合分子を製造するために、１つ以上の開示したＰＣＳＫ９特異的分子の成分を利用することは、十分に当業者の範囲内にある。これは、例えば、組み換えＤＮＡ技術を使用して達成することができる。これの１つの特定の例には、抗体の免疫グロブリン可変部、または１つ以上のＣＤＲをコードするＤＮＡを、必要に応じて異なる免疫グロブリンの可変部、定常部、または定常部とフレームワーク領域に導入することが関与する。こうした分子は、本発明の重要な態様を形成する。特異的免疫グロブリンまたはそれに対応する配列は、特定の開示した配列をそれに挿入でき、また別の方法では、その不可欠の部分を形成するが、これには、本発明の特定の実施形態を形成する以下の抗体分子が含まれるが、これらに限定されない：Ｆａｂ（可変軽（ＶＬ）、可変重（ＶＨ）、定常軽（ＣＬ）および定常重１（ＣＨ１）ドメインを有する一価の断片）、Ｆ（ａｂ’）２（ジスルフィド架橋または代替的方法でヒンジ領域で連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片）、Ｆｄ（ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、Ｆｖ（ＶＬおよびＶＨドメイン）、ｓｃＦｖ（ＶＬおよびＶＨがリンカーで結合された単鎖Ｆｖ、例えば、ペプチドリンカー、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照）、二重特異性抗体分子（抗体とは異なる結合特異性を持つ第二の機能的部分と連結した本書で開示したＰＣＳＫ９特異的な抗体または抗原の結合断片を含む抗体分子で、限定されないが、抗体、または受容体リガンドなどの別のペプチドまたはタンパク質が含まれる）、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５を参照）、単離されたＣＤＲ３、ミニボディー（約８０ ｋＤａの二価の二量体に自己凝集する単鎖−ＣＨ３融合）、「ｓｃＡｂ」（ＶＨおよびＶＬ、並びにＣＬまたはＣＨ１のいずれかを含む抗体断片）、ｄＡｂ断片（ＶＨドメイン、例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４、またはＶＬドメイン、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：４８４−４８９を参照）、二重特異性抗体（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８および国際出願番号ＷＯ ９４／１３８０４号を参照）、三量体、四量体、ミニボディー（ＣＨ３に連結されたｓｃＦｖ、例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１を参照）、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたは何らかのその誘導体、およびタンパク質骨格をベースにした人工抗体（これには、限定されないもののフィブロネクチンＩＩＩ型ポリペプチド抗体が含まれる）（例えば、米国特許第６，７０３，１９９号および国際出願番号ＷＯ ０２／３２９２５号を参照）またはシトクロムＢで、例えば、Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１、およびＮｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：４６３−４６９を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。限定されないものの、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体分子または領域抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）を含む一定の抗体分子は、ジスルフィド架橋を組み込みＶＨおよびＶＬドメインを整列させることで安定化させることができる（例えば、Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９−１２４５を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。二重特異性抗体は、保存的技術（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４４６−４４９を参照、その特定の方法には、化学的な製造、またはハイブリッドのハイブリドーマからの製造が含まれる）、および限定されないものの、ＢｉＴＥ（商標）技術（異なる特異性の抗原結合領域を持つ分子とペプチドリンカー）および適当なアミノ酸置換法（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（例えば、Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１６−６２１を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）などその他の技術を使用して製造しうる。二重特異性抗体は、大腸菌内で製造でき、またその他のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬と同様にこれらの分子は、当業者が理解するとおり、適切なライブラリー内のファージディスプレイを使用して選択できる（例えば、国際出願番号ＷＯ ９４／１３８０４号を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
関心対照のＣＤＲが挿入される可変ドメインは、任意の生殖系列または再配列したヒト可変ドメインから得ることができる。可変ドメインは、合成的に製造することもできる。ＣＤＲ領域は、組み換えＤＮＡ技術を使用して、それぞれの可変ドメインに導入できる。これを達成できる１つの手段は、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３に記載があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。可変重ドメインを可変軽ドメインと対にして抗原結合部位を提供することもできる。さらに、独立した領域（例えば、可変重ドメインのみ）を抗原の結合に使用することもできる。当業者は、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、おそらく別個の遺伝子によりコードされているが、その一方、それらをＶＬおよびＶＨ領域の対が一価分子（ｓｃＦｖｓ）を形成する単一のタンパク質鎖とすることができる合成的なリンカーにより組み換え法を使用して結合できることも十分承知している。
具体的な実施形態は、生殖系列フレームワーク領域内のＣＤＲを提供する。限定されないものの、ヒトフレームワーク領域を含むフレームワーク領域は、当業者に周知である（例えば、ヒトまたはヒト以外のフレームワーク）。フレームワーク領域は、天然に存在するまたはコンセンサスフレームワーク領域としうる。態様において、本発明の抗体のフレームワーク領域は、ヒトである（ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えば、Ｃｌｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９を参照し、その前記開示内容を参照することによりその全文を本書に組み込む）。本書における具体的な実施形態は、重鎖可変ＣＤＲ３配列番号：１７を関連するＣＤＲの代わりにＶＨ１Ａ＿３に入れたものを提供する。本書における具体的な実施形態は、重鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号：１３、１５および１７）を関連するＣＤＲの代わりにＶＨ１Ａ＿３に入れたものを提供する。本書における具体的な実施形態は、軽鎖可変ＣＤＲ３配列番号：７を関連するＣＤＲの代わりにＶＫ１＿４に入れたものを提供する。本書における具体的な実施形態は、軽鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号：ｓ ３、５および７）を関連するＣＤＲの代わりにＶＫ１＿４に入れたものを提供する。具体的な実施形態はさらに、重鎖可変ＣＤＲ３配列番号：１７および軽鎖可変ＣＤＲ３配列番号：７をそれぞれＶＨ１Ａ＿３およびＶＫ１＿４生殖系列配列に入れたものを提供する。さらに、実施形態は、重鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号：１３、１５および１７）を関連するＣＤＲの代わりにＶＨ１Ａ＿３に入れたものを提供し、また軽鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号：３、５および７）を関連するＣＤＲの代わりにＶＫ１＿４に入れたものを提供する。
本発明には、ヒト、ヒト化、脱免疫化、キメラおよび霊長類化の抗体分子が含まれる。本発明には、ベニアリングのプロセスにより製造された抗体分子も含まれる（例えば、Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１１３：Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ． １０５−１３４を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。開示した抗体分子に関連した「ヒト」は具体的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する変数部および／または定常部を持つ抗体分子を意味し、ここで前記配列は、必ずしもその必要はないが、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていない一定のアミノ酸置換または残基を持つように修飾／変更することができる。こうした突然変異は、限定されないものの、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異などの方法により導入することができる。文献で考察されている突然変異技法の特定の例が、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３、およびＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７に開示されており、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。これらは単に特定の例であり、唯一利用できる技術を表すものではない。学術論文には、当業者が利用でき、広く認識されている多数の突然変異技法がある。開示した抗体分子に関連した「ヒト化」は、マウスなど別の哺乳類の種に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体分子を具体的に意味する。開示した抗体分子に関連する「霊長類化」は、非霊長類のＣＤＲ配列が霊長類フレームワーク配列に挿入される抗体分子を意味する（例えば、ＷＯ ９３／０２１０８号およびＷＯ ９９／５５３６９号を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
本発明の特定の抗体は、モノクローナル抗体で、また特定の実施形態において、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４または上記のいずれかの任意の誘導体の抗体形式のいずれか１つである。この点での用語「その誘導体」または「誘導体」には、とりわけ、（ｉ）片方または両方の可変部（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）に保存的修飾を持つ抗体および抗体分子、（ｉｉ）重鎖および／または軽鎖の定常部に操作のある抗体および抗体分子、並びに／または（ｉｉｉ）通常は免疫グロブリン分子の一部ではない追加的な化学的な部分を含む抗体および抗体分子（例えば、ペグ化）が含まれる。
可変部の操作は、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域内とすることができる。配列または分子の多様性を生成するための部位特異的変異誘発、ランダム突然変異誘発またはその他の方法を利用して、突然変異体を作成でき、その後、本書に記載したものを含む利用可能なインビトロまたはインビボでのアッセイで目的とする特定の機能的性質について試験することができる。
また、本発明の抗体には、関心対照の抗体の１つ以上の性質（特性）を改善させるために、修飾がＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対してなされたものも含まれる。一般に、こうしたフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるためになされる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させることである。さらに具体的に言えば、体細胞突然変異を受けた抗体には、その抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基が含まれることがある。こうした残基は、抗体フレームワーク配列をその抗体が由来する生殖系列配列と比較することで同定できる。こうした「逆突然変異した（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅｄ）」抗体も、本発明に含まれることが意図される。別のタイプのフレームワーク修飾には、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的免疫原性を低減させるために、フレームワーク領域内で、あるいは場合によっては１つ以上のＣＤＲ領域内で、１つ以上の残基の突然変異が関与する。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細な記載があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内での修飾に加えて、またはその代わりとして、一般に血清半減期、補体定着、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存的細胞毒性など、その抗体の１つ以上の機能的な特性を変更するために、Ｆｃまたは定常部がある場合にその内部に修飾を含むよう、本発明の抗体を操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）できる。
希望のエフェクター機能性に対して磨きをかける各種の抗体アイソタイプを含む「ハイブリッド」または「コンビナトリアル」ＩｇＧ形態を生成するという概念は、一般に記載がある（例えば、Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１７３：１０２５−１０２８を参照）。本発明の特定の実施形態には、抗体の一部でのＦｃγＲ受容体、Ｃ１ｑまたはＦｃＲｎへの結合を低減または変化させることが分かっている特定の操作をＦｃ領域に含む抗体分子が含まれる。従って、本発明には、抗体依存細胞性細胞毒素（「ＡＤＣＣ」）、補体−媒体細胞毒性（「ＣＭＣ」）を誘発しないか（あるいはより少ない程度で誘発する）、または免疫複合体を形成して、正常な薬物動態学的（「ＰＫ」）性質（特性）を保持する、本明細書による抗体が含まれる。本発明の具体的な実施形態は、本発明に従い定義される、その免疫グロブリン構造の一部として、配列番号：２４を含み、また特定の実施形態において、免疫グロブリン構造の一部として配列番号：２４の残基１０７〜３２６を含む抗体分子を提供する。本発明には、配列番号：２１（ＩｇＧ１）、配列番号：２２（ＩｇＧ２）、配列番号：２３（ＩｇＧ４）および配列番号：２４（ＩｇＧ２ｍ４）からなる群から選択される一連のアミノ酸と連続（隣接）して、またはそれが続いて、（ｉ）配列番号：１を含む軽鎖、および（ｉｉ）配列番号：１１を含む重鎖を含む抗体分子が含まれる。図６は、配列番号：２４、特にＩｇＧ２ｍ４を含む配列の、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４との比較を図示する。成熟し、分泌された抗ＰＣＳＫ９ ＩｇＧ２ｍ４重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２５および２６として見つけることができる。前記配列により少なくとも部分的にコードされている抗体分子が、本書に含まれている。
特定のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、検出可能ラベルを持つことができ、または毒素（例えば、細胞毒）、放射性同位元素、放射性核種、リポソーム、標的部分、バイオセンサー、陽イオン性尾部、または酵素（例えば、ペプチジル結合またはリンカーにより）に抱合することができる。こうしたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の組成物は、本発明の追加的な態様を形成する。
別の態様において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を提供する。前に言及した「単離された」は、それを天然に存在するものとは異なるものにする、言及したものの性質を意味する。例えば、それらの純度、またはその構造もしくは構造の形態部分が天然に見いだされるものとは異なるなどの差異があり得る。天然には存在しない核酸の一例は、例えば、その他の細胞材料が実質的に含まれない核酸である。核酸は、細胞全体内に、細胞可溶化物内に、または部分的に精製した、もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。特定の例において、核酸は、例えば、限定はされないものの、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術で既知のその他の適切な方法など、標準技法を使用して、その他の細胞構成成分またはその他の汚染物質（例えば、その他の細胞の核酸またはタンパク質）から精製したときに単離されうる。核酸には、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）および／またはＲＮＡが含まれうる。本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して獲得することができる。ハイブリドーマ（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つ遺伝子導入マウスから準備したハイブリドーマ）により発現された抗体については、ハイブリドーマにより生成した抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術で得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）から得られた抗体については、その抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収することができる。
本発明には、開示した可変の重鎖および／または軽鎖およびその特定成分をコードする単離された核酸、特に開示した可変部またはそれぞれのＣＤＲ領域、特にＣＤＲ３が含まれる。本書の特定の実施形態において、ＣＤＲは、抗体フレームワーク領域内、また特定の実施形態において、ヒトフレームワーク領域内に提供される。具体的な実施形態では、ＣＤＲを生殖系列フレームワーク領域にコードする単離された核酸が提供され、これには、限定されないものの、ヒト生殖系列フレームワーク領域が含まれる。本書における具体的な実施形態では、重鎖ＣＤＲ配列番号：１７を、関連するＣＤＲをコードする核酸の代わりにＶＨ１Ａ＿３にコードする、単離された核酸（特定の実施形態において、前記核酸は配列番号：１８を含む）が提供される。本書における具体的な実施形態では、重鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号：１３、１５および１７を関連するＣＤＲの代わりにＶＨ１Ａ＿３にコードする核酸（また、特定の実施形態において、前記核酸は、それぞれ配列番号：１４、１６および１８を含む）が提供される。本書における具体的な実施形態では、軽鎖ＣＤＲ配列番号：７を、関連するＣＤＲをコードする核酸の代わりにＶＫ１＿４にコードする、単離された核酸（特定の実施形態において、前記核酸は配列番号：８を含む）が提供される。本書における具体的な実施形態では、軽鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号：３、５および７を関連するＣＤＲの代わりにＶＫ１＿４にコードする核酸（また、特定の実施形態において、前記核酸は、それぞれ配列番号：４、６および８を含む）が提供されている。具体的な実施形態ではさらに、それぞれＶＨ１Ａ＿３およびＶＫ１＿４生殖系列配列に入れる、重鎖可変ＣＤＲ３配列番号：１７（および、特定の実施形態において、前記核酸は配列番号：１８を含む）および軽鎖可変ＣＤＲ３配列番号：７（および、特定の実施形態において、前記核酸は配列番号：８を含む）が提供される。さらなる実施形態では、重鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号：１３、１５および１７（および、特定の実施形態において、前記核酸は、それぞれ配列番号：１４、１６および１８を含む）を関連するＣＤＲの代わりにＶＨ１Ａ＿３に入れたもの、並びに軽鎖可変ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号：３、５および７（および、特定の実施形態において、前記核酸は、それぞれ配列番号：４、６および８を含む）を関連するＣＤＲの代わりにＶＫ１＿４に入れたものが提供される。
可変部をコードする単離された核酸は、限定されないものの、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体分子（本書で開示したＰＣＳＫ９特異的抗体または抗原結合断片を含む抗体分子で、抗体とは異なる結合特異性を持つ第二の機能的部分と連結したもので、これには、限定はされないが、抗体、または受容体リガンドなどの別のペプチドまたはタンパク質がある）、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ミニボディー、ｄＡｂ断片、二重特異性抗体、三量体または四量体、ミニボディー、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたは任意のその誘導体を含む、望ましい任意の抗体分子の形式内で提供できる。
具体的な実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：１１を含む重鎖可変ドメインを含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供されており、その具体的な実施形態は核酸配列（配列番号：１２）を含む。本発明の具体的な実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、さらに（ｉ）重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号：１３）をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：１４を含む）および／または（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号：１５）をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：１６を含む）を含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供される。具体的な実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：２７を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供されており、その具体的な実施形態は核酸配列（配列番号：２８）を含む。本発明の具体的な実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、さらに（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号：３）をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：４を含む）および／または（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号：５）をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：６を含む）を含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供される。具体的な実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：１１を含む重鎖可変ドメイン（その具体的な実施形態は核酸配列（配列番号：１２）を含む）、および配列番号：２７を含む軽鎖可変ドメイン（その具体的な実施形態は核酸配列（配列番号：２８）を含む）を含む抗体分子をコードする単離された核酸が提供される。具体的な実施形態では、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号：１３、１５および１７で、その具体的な実施形態は、それぞれ核酸配列番号：１４、１６および／または１８を含む）で、望ましくはフレームワーク領域（限定されないもののヒトフレームワーク領域を含む）内にあるもの、並びに（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号：３、５および７で、その具体的な実施形態はそれぞれ核酸配列番号：４、６および／または８を含む）で、望ましくはフレームワーク領域（限定されないもののヒトフレームワーク領域を含む）内にあるものをコードする単離された核酸が提供される。本発明はさらに、特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変部、または場合に応じてＣＤＲ領域、どちらか１Ｄ０５の対応する配列に対して存在する方に対して少なくとも９０％同一であることを特徴とする、上記に開示した拮抗薬の相同体を提供する。
別の実施形態は、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：１を含む軽鎖（その具体的な実施形態は核酸配列番号：２を含む）並びに配列番号：９のアミノ酸１〜２３３、または配列番号：９を含む重鎖またはＦｄ鎖（その具体的な実施形態は、それぞれ配列番号：１０の核酸１〜６９９、または配列番号：１０を含む）抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。さらなる実施形態は、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および、さらに特定の実施形態において、配列番号：２６を含む軽鎖（その具体的な実施形態は配列番号：３０を含む）および配列番号：２５を含む重鎖（その具体的な実施形態は配列番号：２９を含む）を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明はさらに、特定の実施形態において、１Ｄ０５の対応する配列に対して重鎖および／または軽鎖にわたって少なくとも９０％同一であることを特徴とする上記に開示した拮抗薬の相同体を提供する。
本発明の具体的な実施形態には、抗体の一部でのＦｃγＲ受容体、Ｃ１ｑもしくはＦｃＲｎへの結合を低減または変化させるＦｃ領域内の操作を持つ抗体分子をコードする核酸が含まれる。本発明の１つの特定の実施形態は、免疫グロブリン構造の一部として配列番号：２４、また特定の実施形態において、配列番号：２４の残基１０７〜３２６を含む抗体分子をコードする単離された核酸である。特定の実施形態において、合成的なＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、適切な発現ベクター内で合成・組立をしたオリゴヌクレオチドから生成した核酸から発現させて製造できる（例えば、Ｋｎａｐｐｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６、およびＫｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４：６７−８４を参照）。
本発明には、（ｉ）配列番号：１を含む軽鎖をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：２を含む）および（ｉｉ）配列番号：１１を含む重鎖をコードする核酸（その具体的な実施形態は核酸配列番号：１２を含む）を含む抗体分子をコードする核酸が含まれ、これは配列番号：２１（ＩｇＧ１）、配列番号：２２（ＩｇＧ２）、配列番号：２３（ＩｇＧ４）および配列番号：２４（ＩｇＧ２ｍ４）を含む群から選択される一組のアミノ酸をコードする一組のヌクレオチドの後に順に続く（それに隣接する）。成熟し、分泌された抗ＰＣＳＫ９ ＩｇＧ２ｍ４重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：２９および３０として見つけることができる。重鎖および軽鎖１Ｄ０５抗ＰＣＳＫ９ ＩｇＧ２ｍ４抗体分子を含むプラスミド配列は、それぞれ配列番号：３１および３２で見つけることができる。こうした抗体分子をコードする核酸は、本発明の重要な実施形態を形成する。
また、本発明には、本書に記載した全長ヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％同一で、より望ましくは少なくとも約９５％同一なヌクレオチド配列、およびＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を少なくとも１０％抑制するＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸が含まれる。
出願全体を通して、「少なくとも約９０％同一」の言及は、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一が含まれる。
本発明はさらに、その少なくとも一部分が配列番号：１２および／または配列番号：２８を含む核酸の相補物に、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成された単離された核酸を提供し、その前記核酸は抗体分子にＰＣＳＫ９に特異的に結合しＰＣＳＫ９機能を拮抗する能力を与え、またＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は前記核酸を採用して発現される。核酸のハイブリッド形成方法は、当技術では周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６，１９８９を参照）。ストリンジェントなハイブリッド形成条件には、６８℃、５ｘ ＳＳＣ／５ｘ デンハート液（または同等物）／１．０％ ＳＤＳ内でのハイブリッド形成、および０．２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで室温での洗浄が含まれる。適度にストリンジェントな条件には、３ｘ ＳＳＣで、４２℃での洗浄が含まれる。塩分濃度および温度のパラメーターは、プローブおよび標的の核酸間で最適なレベルの同一性を達成するために変化させうる。当業者であれば、配列番号：１２および／または配列番号：２８に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％同一のハイブリッド形成する部分で核酸を特異的にターゲティングするために、ハイブリッド形成および／または洗浄の各種の条件を操作できる。ハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメーターおよび適切な条件を導く指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３−６．４，１９９５（その開示内容を参照することにより本書に組み込む）に記載があり、また通常の技能を持つ当業者であれば、簡単に判断できる。ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号：１２および／または配列番号：２８を含む核酸の補体にハイブリッド形成する核酸を含む１つ以上の可変部を持つＰＣＳＫ９拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の１つ以上の機能の拮抗において有効であるはずである。こうして、前記拮抗薬およびコードする核酸は、本発明の重要な実施形態を形成する。
別の態様において、本発明は、本書で開示した核酸を含むベクターを提供する。本発明によるベクターには、限定されないものの、意図した目的の適切なレベルでの望ましい抗体分子の発現にとって適切なプラスミドおよびその他の発現構築物（例えば、場合に応じてファージまたはファージミド）が含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。ほとんどのクローニングの目的で、ＤＮＡベクターを使用することもできる。典型的なベクターには、プラスミド、変性ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、および遺伝子副体または組み込み型ＤＮＡのその他の形態が含まれる。特定の遺伝子導入、組み換え体ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の生成、またはその他の用途での適切なベクターの決定は、十分に当業者の認識範囲内である。特定の実施形態において、組み換え遺伝子に加えて、ベクターには、宿主細胞内の自律増殖のための複製起点、適切な制御配列（プロモーター、終端配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、および／または必要に応じてその他の配列など）および高いコピー数の潜在性も含まれる。タンパク質特異的拮抗薬の製造のための発現ベクターの例は、当技術では周知である（例えば、Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｇｅｎｅ １８７：９−１８、Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９：１５３−１６６、およびＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：１１９−１３０を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。希望に応じて、拮抗薬をコードする核酸を、当技術で周知の技術を使用して宿主染色体に組み込むこともできる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、国際出願番号ＷＯ ９５／１７５１６号を参照）。核酸は、エピソームで維持されているか、または人工染色体に組み込まれたプラスミド上に発現することもできる（例えば、Ｃｓｏｎｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３：３２０７−３２１６、Ｖａｎｄｅｒｂｙｌ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１０を参照）。特に抗体分子に関しては、抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入でき、またより一般的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することができる。どのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬またはその構成要素をコードする核酸も、標準的な方法（例えば、核酸断片およびベクター上の相補的制限部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）の連結、または制限部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）が存在しない場合、ブラントエンド連結）を使用して発現ベクターに挿入できる。これをどのように遂行しうるかについての別の特定の例は、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ「ＩｎＦｕｓｉｏｎ」システムもしくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ「ＴＯＰＯ」システムなどの組み換え法（どちらもインビトロ）の使用、または細胞内（例えば、Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステム）での方法がある。特に抗体分子に関して、軽鎖および重鎖の可変部は、希望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常部を既にコードした発現ベクターに、ＶＨ断片がベクター内のＣＨ断片に操作できる形で連結され、またＶＬ断片がベクター内のＣＬ断片に操作できる形で連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作成するために使用できる。追加的に、または代替的に、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を含む組み換え体発現ベクターは、宿主細胞からの拮抗薬の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸が、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸に隣接してインフレームで連結されるように、ベクター内にクローン化できる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンのシグナルペプチドとすることができる。当業者が利用できる任意の技術を採用して、核酸を宿主細胞に導入することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２を参照）。関心対照の核酸分子を発現ベクターにサブクローニングして、ベクターを含む宿主細胞を形質転換または形質移入する方法、並びにそれぞれの発現ベクターを宿主細胞に導入することおよび宿主細胞を適切な条件下で培養することを含む実質的に純粋なタンパク質を作成する方法は、周知のとおりである。そのように製造されるＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、宿主細胞から保存的方法で収穫しうる。核酸を関心対照の細胞に導入するために適切な技術は、使用する細胞のタイプに依存する。一般的な技術には、限定されないものの、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポーレーション、関心対照の株細胞にとって適切なウイルス（例えば、レトロウイルス、ワクシニア、バキュロウイルス、またはバクテリオファージ）を使用したリポソームを媒介した形質移入および形質導入が含まれる。
別の態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を含む単離された細胞を提供する。本書では、限定されないものの、原核生物（例えば、大腸菌、バシラス属、およびストレプトマイセス）からの株細胞および真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルス、および哺乳類）からの株細胞を含む、多様な異なる株細胞が意図されており、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の組み換え体製造に使用できる（例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９９９を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。本書で開示した核酸または拮抗薬を含む、遺伝子組み換え植物を含む植物細胞、および遺伝子組み換え動物（ヒト以外）を含む動物細胞も、本発明の一部として意図されている。限定されないものの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞、限定されないもののＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載）を例えばＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用したものを含む）（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８２ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載のとおり）、ＮＳ０骨髄腫細胞（ここでＷＯ ８７／０４４６２号、ＷＯ ８９／０１０３６号、およびＥＰ ３３８，８４１号に記載のあるＧＳ発現システムを使用できる）、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２ 細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞および本書で開示した核酸または拮抗薬を含むその他に由来するものが含まれる適切な哺乳類の細胞または株細胞は、本発明の別の実施形態を形成し、その前述の開示内容を、参照して本書に組み込む。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を含む本発明の具体的な実施形態には、限定されないものの、大腸菌（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９１ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５−５５１を参照）、またはピキアなどの酵母、およびその組み換え誘導体が含まれる（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、２００６ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５を参照）が含まれ、その前述の開示内容を、参照して本書に組み込む。本発明の具体的な実施形態は、開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を含む真核細胞に関連する（Ｃｈａｄｄ ＆ Ｃｈａｍｏｗ，２００１ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８８−１９４、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＆ Ｋｒｕｍｍｅｎ， ２００２ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１１７、Ｌａｒｒｉｃｋ ＆ Ｔｈｏｍａｓ， ２００１ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：４１１−４１８を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。本発明の具体的な実施形態は、適切な翻訳後修飾をしてＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を製造できる、開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を含む哺乳類の細胞に関する。翻訳後修飾には、いかなる形でも限定されることはないが、ジスルフィド結合形成およびグリコシル化が含まれる。別のタイプの翻訳後修飾は、シグナルペプチド切断である。本発明の好ましい実施形態には、適切なグリコシル化がある（例えば、Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。天然に存在する抗体には、重鎖に付着した少なくとも１つのＮ−連鎖した炭水化物が含まれる（同書）。効果的な翻訳後修飾を提供するために、異なるタイプの哺乳類の宿主細胞を使用できる。こうした宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２および骨髄腫細胞を含む（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０およびＰｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｇｅｎｅ １８７：９−１８を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む単離された細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を製造する方法であって、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸またはヒトおよび／もしくはマウスのＰＣＳＫ９に対する特異性を持つ望ましいＰＣＳＫ９特異的拮抗薬（望ましい拮抗薬の影響を受ける）の重鎖および／もしくは軽鎖またはその断片（例えば、ＶＨおよび／もしくはＶＬまたは１つ以上の開示した重鎖および／もしくは軽鎖の可変部ＣＤＲ）を含む細胞を、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の発現またはＰＣＳＫ９特異的拮抗薬内の前記重鎖および／もしくは軽鎖または断片の発現および組立が許容される条件下で培養すること、並びに前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を細胞から分離することを含む方法を提供する。特定の望ましい重鎖および／もしくは軽鎖配列または断片を作製する一例は、まずＰＣＲを用いて生殖系列の重鎖および／または軽鎖の可変配列または断片を増幅（および修飾）することである。ヒトの重鎖および／または軽鎖可変部用の生殖系列配列は、当業者にとってたやすく入手できる（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース、およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，１９９２“Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８、およびＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９４“Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ Ｖκ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。生殖系列配列の突然変異誘発は、標準的な方法、例えば、突然変異がＰＣＲプライマーに組み込まれるＰＣＲを媒介した突然変異誘発、または部位特異的変異誘発を使用して遂行しうる。全長抗体が望ましい場合には、ヒト重鎖定常部遺伝子用の配列が入手できる（例えば、Ｋａｂａｔ．Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照）。これらの領域を含む断片は、例えば、標準的なＰＣＲ増幅により入手できる。あるいは、当業者は、重鎖および／または軽鎖の定常部を既にコードする自身のベクターを利用できる。
元の抗体の特異性を保持するその他の抗体分子を組み換えにより製造するために利用可能な技術が存在する。この特定の例は、免疫グロブリン可変部またはＣＤＲをコードするＤＮＡが、別の抗体分子の定常部に、または定常部およびフレームワーク領域に、または単にフレームワーク領域に導入される場合である（例えば、ＥＰ−１８４，１８７、ＧＢ ２１８８６３８、およびＥＰ−２３９４００を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。キメラ抗体を含む抗体分子のクローニングおよび発現については、文献に記載がある（例えば、ＥＰ ０１２０６９４およびＥＰ ０１２５０２３を参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む）。
本発明による抗体分子は、一例において、産生した後、本書で同定した特性について既知の技術を用いて選別することもできる。モノクローナル抗体の準備のための基本的技術については、文献（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照）に記載があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。完全ヒトモノクローナル抗体は、利用可能な方法により製造できる。これらの方法には、いかなる形でも限定はされないが、免疫系を持ち、それによってマウス抗体遺伝子が不活性となり、各種の機能的ヒト抗体遺伝子で置き換えられるが、マウス免疫系のその他の成分は未変化のまま残る、遺伝子組み換えマウス株の使用が含まれる。こうした遺伝子組み換えのマウスにより、自然なインビボでの免疫応答および親和性成熟プロセスが許容され、高い親和性の完全ヒトモノクローナル抗体がもたらされる。この技術は、当技術で周知のとおりであり、また限定されないものの、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、第５，７７０，２４９号（ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに譲渡され、「ＵｌｔｒａＭａｂ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ」の保護のもとＭｅｄａｒｅｘを通じて入手可）、また同様に米国特許第５，９３９，５９８号、第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号および関連する対応特許（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を開示しているＡｂｇｅｎｉｘに譲渡）を含む様々な公開に詳細が記載されており、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２００２ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５９３−５９７、およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｓｔｅｆａｎ，２００１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｓによるレビューも参照し、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。
あるいは、本発明によるＰＣＳＫ９特異的拮抗薬のライブラリーを、ＰＣＳＫ９と接触させて、特異的結合を示しうるものを選択することができる。次に、機能的研究を実施し、適切な機能性、例えば、ＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの阻害の阻害を確認する。濃縮技術を使用して、ライブラリーからタンパク質特異的な分子を選択するために、当業者が利用できる様々な技術があり、これには、限定されないものの、ファージディスプレイ（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，７３３，７４３号、第５，８７１，９０７号、第５，８７２，２１５号、第５，８８５，７９３号、第５，９６２，２５５号、第６，１４０，４７１号、第６，２２５，４４７号、第６，２９１，６５０号、第６，４９２，１６０号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１号、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号、第６，５９３，０８１号、並びにその他の米国の対応特許および／または優先出願ＧＢ ９２０６３１８（１９９２年５月２４日出願）に依存する出願で開示されたＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（「ＣＡＴ」）の技術を参照するほか、またＶａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４を参照）、リボソームディスプレイ（例えば、Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２を参照）、細菌ディスプレイ（例えば、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：２９−３４を参照）および／または酵母ディスプレイ（例えば、Ｋｉｅｋｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１３０３−１３１０を参照）があるが、その前述の開示内容を、参照して本書に組み込む。例えば、ライブラリーをバクテリオファージ粒子の表面に表示して、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬またはその断片をコードする核酸を、その表面に提示することができる。次に核酸は、望ましいレベルの活性を示すバクテリオファージ粒子および望ましい拮抗薬の開発に使用した核酸から単離できる。ファージディスプレイについては、文献（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｓｔｅｆａｎ、上記、および国際出願番号ＷＯ ９２／０１０４７号を参照）に十分な記載があり、その開示内容を参照することにより本書に組み込む。特に抗体分子に関連して、本発明による個別の重鎖または軽鎖クローンは、それらとの間で相互作用して、組み合わされた重鎖および軽鎖の分子を形成する能力のあるそれぞれ相補的な重鎖または軽鎖を選別するために使用することもできる（例えば、国際出願番号ＷＯ ９２／０１０４７号を参照）。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を同定するために、当業者が利用できる任意のパニング方法が使用できる。これを達成するための別の特定の方法は、溶液中で標的の抗原に対して、例えば、ビオチン化した可溶性のＰＣＳＫ９をパニングした後、ストレプトアビジン被覆した磁性ビーズ上でＰＣＳＫ９特異的拮抗薬−ファージ複合体を捕獲し、その後、洗浄して非特異的に結合したファージを除去する方法である。次に捕獲したファージは、本書に記載したとおり、プレートの表面から回収する方法と同じ方法でビーズから回収できる（例えば、ＤＴＴ）。
ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、当業者が利用できる技術により精製できる。関連する拮抗薬の製剤、腹水、ハイブリドーマ培養液、または関連する試料の力価は、各種の血清学的または免疫学的アッセイで決定することができ、これには、限定されないものの、沈殿、受身凝集反応、酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）技術および放射免疫アッセイ（「ＲＩＡ」）技術が含まれる。
本発明は、部分的に、本書で説明したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をＰＣＳＫ９機能を拮抗するために使用する方法に関し、その前記方法を下記にさらに説明する。本出願全体での用語「拮抗する」の使用は、１つ以上のＰＣＳＫ９の機能を妨害、阻害、相殺、中和または低減する作用を意味する。ＰＣＳＫ９に関連した１つ以上の機能的な特性の阻害または拮抗作用は、当技術で既知の方法（例えば、Ｂａｒａｋ ＆ Ｗｅｂｂ，１９８１ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０：５９５−６０４、Ｓｔｅｐｈａｎ ＆ Ｙｕｒａｃｈｅｋ，１９９３ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３４：３２５３３０、およびＭｃＮａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３６９：１５８−１６７を参照）、および本書に記載した方法により簡単に判断できる。阻害または拮抗作用により、拮抗薬がない場合に見られるもの、または、例えば、無関係の特異性の対照拮抗薬があるときに見られるものと比較したＰＣＳＫ９活性の減少が達成される。望ましくは、本発明によるＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、測定したパラメーター（限定されないものの、本書で開示した作用が含まれる）の少なくとも１０％の減少があった時点で、またより望ましくは、測定したパラメーターの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および９５％の減少があった時点で、ＰＣＳＫ９機能を拮抗する。こうしたＰＣＳＫ９機能の阻害／拮抗作用は、ＰＣＳＫ９機能が被験者にマイナスの影響を与える特定の表現型、病気、障害または状態に少なくとも部分的に寄与している場合において特に効果的である。
一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９による影響を受ける能力のある細胞、細胞集団または組織試料（すなわち、ＬＤＬ受容体を発現するか、および／またはＬＤＬ受容体を含むもの）を、前記拮抗薬が存在するときＰＣＳＫ９に結合して、ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を抑制する条件で、本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬と接触させることを含む、ＰＣＳＫ９の活性を拮抗するための方法を提供する。本発明の具体的な実施形態には、細胞がヒト細胞である方法が含まれる。本発明の追加的な実施形態には、細胞がマウスの細胞である方法が含まれる。
別の態様において、本発明は、被験者に治療的に有効な量の本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を投与することを含む、被験者においてＰＣＳＫ９の活性を拮抗する方法を提供する。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９機能を拮抗する方法は、ＰＣＳＫ９に関連した病気、障害もしくは状態、またはあるいは、ＰＣＳＫ９拮抗薬の効果から利益を得ることのできる病気、障害もしくは状態の治療のためのものである。薬剤は、ＰＣＳＫ９活性に関連した状態、またはＰＣＳＫ９の機能が特定の被験者にとって禁忌である状態を示す被験者において有用といえる。特に選んだ実施形態において、状態は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群または関連する状態が考えられる。
こうして、本発明は、ＰＣＳＫ９機能の拮抗が望ましい様々な治療方法における、本書に記載したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の使用が意図されている。治療方法は、性質上、予防的または治療的なものとしうる。特定の実施形態において、本発明は、治療的に有効な量の本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の被験者への投与を含む、ＰＣＳＫ９活性に関連した／起因する状態、またはＰＣＳＫ９の機能が特定の被験者について禁忌である状態のための治療方法に関する。特に選んだ実施形態において、状態は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群または関連する状態が考えられる。
本発明による治療方法は、個体に対して、本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の治療的に（または予防的に）有効な量を投与することを含む。量に関連した用語「治療的に有効な」または「予防的に有効な」の使用は、望ましい期間にわたり、望ましい治療的／予防的な効果を達成するための、意図した投薬に必要な量を意味する。望ましい効果は、例えば、治療する状態に関連した少なくとも１つの症状の改善としうる。これらの量は、当業者が理解するとおり、限定されないものの、個人の病気の状態、年齢、性別および体重、およびその個人に望ましい効果を誘発するＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の能力などの様々な要因により変化する。反応は、インビトロでの試験法、インビボでの非ヒト動物の研究、および／または臨床試験でサポートされたそれ以外の方法により文書化しうる。
ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、薬剤組成物として投与しうる。本発明は、本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および限定されないものの、賦形剤、希釈剤、安定剤、緩衝液または拮抗薬の望ましい形態と量での治療対象者への投与を促進するように設計された代替物を含む医薬品として容認される担体を含む医薬品として容認される組成物を提供する。
薬剤組成物は、当技術で既知の任意の数の方法で調製することができる（例えば、ＭｃＧｏｆｆ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒ，２０００ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｉｎ−ＭｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；ｐｐ．１３９−１５８、Ａｋｅｒｓ ＆ Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉｓ，２０００，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｉｎ−Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ；ｐｐ．１４５−１７７、Ａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：４７−１２７を参照）。患者への投与に適切な医薬品として容認される組成物には、許容可能な温度範囲での貯蔵時に生物活性を保持しつつ、最大の安定性も促進する製剤形態での、有効量のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が含まれることになる。
拮抗薬をベースにした医薬品として容認される組成物は、特定の実施形態において、液体もしくは固形とし、またはガス粒子もしくはエアロゾル化した粒子とすることもできる。液体または固形の製剤を製造する任意の技術が利用されうる。こうした技術は、十分に当業者の技能の範囲である。固形製剤は、限定されないものの、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨海流体技術による乾燥を含む、利用可能な任意の方法で製造できる。経口投与のための固形製剤は、処方量で、また処方された時間内に拮抗薬を患者が利用できるようにする任意の形態とすることができる。経口の製剤形態は、限定されないものの、錠剤、カプセルまたは粉末を含む多数の固形製剤の形態をとることができる。固形製剤は、代替的に、当業者に既知の方法に従って、単一または複数回のいずれかの投薬の前に、凍結乾燥して溶液とすることもできる。拮抗薬の組成物は一般に、生物学的に適切なｐＨ範囲内に調製すべきで、また貯蔵中に適切なｐＨ範囲を維持するために緩衝化することもできる。液体および固形のどちらの製剤でも一般に、長期間にわたり安定性を保持するために、低めの温度（例えば、２〜８°Ｃ）の貯蔵を必要とする。製剤化した拮抗薬の組成物、特に液体製剤には、貯蔵中のタンパク質分解の阻止または最小化のために静菌剤が含まれうるが、これには、限定されないものの、有効濃度（例えば、＜１％ ｗ／ｖ）のベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、および／またはプロピルパラベンを含む。静菌剤は、一部の患者にとって禁忌であることがある。従って、こうした構成要素を含むか、または含まない凍結乾燥した製剤形態を、溶液に戻すことができる。緩衝化した液体または固体拮抗薬のどちらの製剤形態にも、追加的な成分を加えることもでき、これには、限定されないものの、凍結保護物質としての糖類（これには、限定されないものの、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、およびズルシトールなどのポリヒドロキシ炭化水素、並びに／またはショ糖、ラクトース、麦芽糖、もしくはトレハロースなどの二糖類を含む）および、一部の例において、適切な塩（これには、限定されないものの、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＬｉＣｌを含む）を含む。こうした拮抗薬製剤は、とくに長期間貯蔵される予定の液体製剤は、例えば、２〜８°Ｃまたはそれ以上の温度での長期にわたる安定性を促進しつつも、非経口的な注射用に製剤形態を有用なものとする有用範囲の合計浸透圧に依存することになる。適切な場合、防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤および／またはその他の添加物を含みうる。製剤には、二価の陽イオン（これには、限定されないものの、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を含む）および／または非イオン性界面活性剤（これには、限定されないものの、ポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））、ポリソルビン酸−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０（商標））、ポリソルビン酸−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０（商標））、およびポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（これには、限定されないものの、Ｂｒｉｊ ５８（商標）、Ｂｒｉｊ３５（商標）のほかに、トリトンＸ−１００（商標）、トリトンＸ−１１４（商標）、ＮＰ４０（商標）、Ｓｐａｎ ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１）を含む）を含みうる。こうした成分の任意の組み合わせが、本発明の具体的な実施形態を形成する。
液体形態での薬剤組成物には、液体担体、例えば、水、石油、動物油、植物油、鉱油または合成油が含まれうる。液体形態には、生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールも含まれうる。
望ましくは、薬剤組成物は、発熱物質を含まない適切なｐＨ、緊張度、および安定性の非経口的に容認可能な水溶液の形態としうる。薬剤組成物は、例えば生理食塩液注射液、リンガー液、または乳酸リンゲル液など、等張性の溶媒に希釈した後で投与するよう製剤化することもできる。
本発明の一態様は、以下の薬剤組成物である：（ｉ）本書で説明した約５０〜約２００ｍｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、（ｉｉ）ポリヒドロキシ炭化水素（これには、限定されないものの、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトールが含まれる）および／または二糖類（これには、限定されないものの、ショ糖、ラクトース、麦芽糖およびトレハロースが含まれる）、前記ポリヒドロキシ炭化水素および／または二糖類の合計は、製剤の体積百分率で約１％〜約６％（「ｗ／ｖ」）であり、（ｉｉｉ）薬剤組成物の有効期間全体を通したｐＨの浮動を阻止する緩衝剤として、また緊張度モディファイヤーとしての役目をする約５ ｍＭ〜約２００ ｍＭのヒスチジン、イミダゾール、ホスフェートまたは酢酸、（ｉｖ）凝集の影響を弱めるための約５ ｍＭ〜約２００ ｍＭのアルギニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはメチオニン、（ｖ）約５．５〜約７．５の範囲のｐＨを達成するために十分な量の約０．０１Ｍ〜約０．１Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）および（ｖｉ）限定されないものの、滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む液体担体、ここで前記薬剤組成物は、約５．５〜約７．５の範囲のｐＨを持ち、また前記薬剤組成物は、製剤の約０．０１％〜約１％ ｗ／ｖの非イオン性界面活性剤（これには、限定されないものの、ポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））、ポリソルビン酸−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０（商標））、ポリソルビン酸−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０（商標））、およびポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（これには、限定されないものの、Ｂｒｉｊ ５８（商標）、Ｂｒｉｊ３５（商標）のほかに、トリトンＸ−１００（商標）、トリトンＸ−１１４（商標）、ＮＰ４０（商標）、Ｓｐａｎ ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１）を含む）を任意に含む。
遊離酸、ヒスチジン−ＨＣｌまたはアルギニン−ＨＣｌとして、ＨＣｌを加えることもできる。ヒスチジン−ＨＣｌまたはアルギニン−ＨＣｌとして供給される場合には、ＨＣｌ中のヒスチジンまたはアルギニンの合計量は、上記に指定したものとすべきである。従って、ヒスチジンおよび／またはアルギニンの量に応じた一部または全てのＨＣｌは、場合に応じてヒスチジン−ＨＣｌおよび／またはアルギニン−ＨＣｌとして供給しうる。明細書中で開示した量に関して用語「約」の使用は、提示した指定の数の１０％以内を意味する。例えば、「約５０〜約２００」で提示された範囲は、明確な実施形態として前記範囲内にある各数が含まれることを明示的に示す。上記の例のとおり、これには、限定されないものの、５０、１００、１２５、１５０および２００を持つものを含む実施形態は、本書での具体的な実施形態を形成する。本書で開示した薬剤組成物は、投与方法にかかわらず一般的な適応性を持つ。特定の実施形態において、開示した薬剤組成物は、液体として、または凍結乾燥した形態を元に戻してから、皮下投与に有用である。具体的な実施形態において、開示した製剤に採用されるＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ペグ化させ、または融合タンパク質の一部を形成してもよい。
本発明の特定の態様は、上記に開示した薬剤組成物に関連するが、これは以下を含む：（ｉ）約５０〜約２００ ｍｇ／ｍＬの本書で説明したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、（ｉｉ）約１％〜約６％（特定の実施形態では約２％〜約６％）ｗ／ｖのマンニトール、トレハロースまたはショ糖、（ｉｉｉ）約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのヒスチジン、（ｉｖ）約２５ｍＭ〜約１００ｍＭのアルギニンまたはプロリン、（ｖ）約５．８〜約７の範囲のｐＨを達成するために十分な量の約０．０２Ｍ〜約０．０５Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）および（ｖｉ）限定されないものの、滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む液体担体、ここで前記薬剤組成物は、約５．８〜約７の範囲のｐＨを持ち、また前記薬剤組成物は製剤の約０．０１％〜約１％ ｗ／ｖの非イオン性界面活性剤（これには、限定されないものの、ポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））、ポリソルビン酸−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０（商標））、ポリソルビン酸−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０（商標））、およびポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（これには、限定されないものの、Ｂｒｉｊ ５８（商標）、Ｂｒｉｊ３５（商標）のほかに、トリトンＸ−１００（商標）、トリトンＸ−１１４（商標）、ＮＰ４０（商標）、Ｓｐａｎ ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１）を含む）などを任意に含む。
具体的な実施形態は、以下を含む薬剤組成物を提供する：（ｉ）約５０〜約２００ ｍｇ／ｍＬの本書で説明したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、（ｉｉ）約１％〜約６％（特定の実施形態では約２％〜約６％）ｗ／ｖのマンニトール、トレハロースまたはショ糖、（ｉｉｉ）約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭのヒスチジン、（ｉｖ）約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭのアルギニンまたはプロリン、（ｖ）約５．８〜約６．５の範囲のｐＨを達成するために十分な量の約０．０３Ｍ〜約０．０５Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）、並びに（ｖｉ）限定されないものの、滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む液体担体、ここで前記薬剤組成物は約５．８〜約６．５の範囲のｐＨを持ち、また前記薬剤組成物は製剤の約０．０１％〜約１％ ｗ／ｖのポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））またはポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））から任意に構成される。
本書における具体的な実施形態は、以下を含む薬剤組成物を提供する：（ｉ）約５０〜約２００ｍｇ／ｍＬの本書で説明したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、（ｉｉ）約１％〜約６％（特定の実施形態では約２％〜約６％）ｗ／ｖのショ糖、（ｉｉｉ）約２５ｍＭ〜約１００ ｍＭのヒスチジン、（ｉｖ）約２５ｍＭ〜約１００ｍＭのアルギニン、（ｖ）約６のｐＨを達成するために十分な量の約０．０４０Ｍ〜約０．０４５Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）、並びに（ｖｉ）滅菌水、ここで前記薬剤組成物は約６のｐＨを持ち、また前記薬剤組成物は、約０．０１％〜約１％ ｗ／ｖのポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））またはポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））を任意に含む。その特定の実施形態において、ヒスチジンおよびアルギニンのレベルは、互いに２５ ｍＭ以内で、その他の実施形態では同じである。
本書における具体的な実施形態は、以下を含む薬剤組成物を提供する：（ｉ）約５０〜約２００ ｍｇ／ｍＬの本書で説明したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、（ｉｉ）（ａ）約１％ ｗ／ｖのショ糖、約１０ｍＭのヒスチジンおよび約２５ｍＭのアルギニン、（ｂ）約２％ ｗ／ｖのショ糖、約２５ｍＭのヒスチジンおよび約２５ｍＭのアルギニン、（ｃ）約３％ ｗ／ｖのショ糖、約５０ｍＭのヒスチジンおよび約５０ｍＭのアルギニン、または（ｄ）約６％ ｗ／ｖのショ糖、約１００ｍＭのヒスチジンおよび約１００ｍＭのアルギニンのいずれかの量でのショ糖、ヒスチジンおよびアルギニン、（ｉｉｉ）約０．０４ ｍｏｌまたは、別の方法で、約１．４６ ｇのＨＣｌ、並びに（ｉｖ）滅菌水、ここで前記薬剤組成物は約６のｐＨを持ち、また前記薬剤組成物は、約０．０１％〜約１％ ｗ／ｖのポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））またはポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））を任意に含む。本書における具体的な実施形態は、上記の（ｉｉ）のショ糖、ヒスチジンおよびアルギニンの量が、（ｃ）または（ｄ）で記載されたものである。
本書の特定の実施形態では、説明したとおり、本書に記載した各種ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬のうち５０〜２００ｍｇ／ｍＬの任意の拮抗薬を含む薬剤組成物が提供される。例証の目的で、また限定としては解釈してはならないが、明確なその１つの実施形態は、（ａ）配列番号：２６を含む軽鎖、および（ｂ）配列番号：２５を含む重鎖を含む、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を含む上記記載の医薬品製剤であり、ここで、前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を拮抗する抗体分子である。
本書における特定の実施形態は、冷凍乾燥して元に戻した上記記載による薬剤組成物である。特定の実施形態において、前記冷凍乾燥して元に戻した溶液中の前記タンパク質濃度は、凍結乾燥前の組成物中よりも最高２倍高い。特定の実施形態において、タンパク質もしくはＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の冷凍乾燥し、および／または元に戻した薬剤組成物中の濃度は、約５０ ｍｇ／ｍＬ〜約３００ ｍｇ／ｍＬの範囲内である。凍結乾燥した薬剤組成物を元に戻すために有用な希釈剤には、限定はされないが、滅菌水、静菌性注射用水（「ＢＷＦＩ」）、リン酸緩衝生理食塩水、無菌生理食塩水、生理食塩水、リンゲル液またはブドウ糖液などが含まれ、また特定の実施形態において、０．０１〜１％（ｗ／ｖ）のポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））またはポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））を含みうる。特定の実施形態において、凍結乾燥した粉末は、１／６０．２Ｘ原体積（または０．１６７ｍＬ）から最高１Ｘ（１ｍＬ）で戻すことができる。
本発明の模範的実施形態は、本書で説明した安定した薬剤組成物である。本発明のその他の実施形態は、本書で説明した凍結乾燥および再生（戻すこと）に対して安定した薬剤組成物である。凍結乾燥した組成物の調製には、当業者は様々な方法を利用できる（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｍｏ，２００７“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ”Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．を参照）。本書で使用するとき「安定」は、タンパク質またはＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の、その物理的または化学的な安定性を保持する性質、立体配置的完全性、または対照試料と比較して４〜３７℃の温度範囲で少なくとも約３０日間にわたり、少ない変性、タンパク質クリッピング、凝集、断片化、酸性変異体の生成または生物活性の喪失を示すその能力を意味する。その他の実施形態は、最高３カ月、６カ月、１２カ月、２年間またはそれより長い期間、上記の温度で安定性が保たれる。特定の実施形態において、製剤形態は、２〜８℃で、優先順に、少なくとも６カ月間、また望ましくは１２カ月、２年間またはそれより長く、有意な変化は示さない。具体的な実施形態では、対照試料と比較して、２５〜４５℃（または他の方法では２〜８℃）の温度範囲で、少なくとも約３０日間、３カ月、６カ月、１２カ月、２年間またはそれより長く、１０％未満または、特定の実施形態において、５％未満の変性、タンパク質クリッピング、凝集、断片化、酸性変異体生成または生物活性の喪失が起こる。製剤の安定性は、当業者に周知のいくつかの手段により試験することができ、これには、限定されないものの、凝集および断片化を測定するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、濃縮した試料の粒子サイズを測定する動的光散乱（ＤＬＳ）、断片化を測定する毛細管ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酸性変異体の生成を測定するキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）または陽イオン交換クロマトグラフィー（「ＣＥＸ」）を含む。タンパク質安定性の分析に適した技術は、当業者により良く理解されており、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，１９９３ Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０のレビューを参照。
本書で説明した薬剤組成物は、無菌であるべきである。これを達成するために、当業者が利用できる様々な技術があり、これには、限定されないものの、無菌のろ過膜を通すろ過がある。凍結乾燥して元に戻す組成物を採用する特定の実施形態において、これは凍結乾燥して元に戻す前または後に実施することができる。
拮抗薬治療薬の投薬は、十分に当業者の理解の範囲内であり（例えば、Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４７：６５９−６６４、Ｂａｇｓｈａｗｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ４：９１５−９２２を参照）、また多数の要因に基づき変化するが、これには、限定されないものの、利用される特定のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、治療を受ける患者、患者の病状、治療する部位、投与経路および望まれる治療を含む。通常の技能を持つ医師または獣医であれば、拮抗薬の効果的な治療の量を簡単に決定し、および処方することができる。投薬範囲は、宿主体重の約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより通常的には０．０５〜２５ｍｇ／ｋｇとしうる。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内としうる。例証の目的で、また限定することなく、特定の実施形態において、拮抗薬を全身的に送達するために５ｍｇ〜２．０ｇの用量を利用しうる。毒性なしに効力を得る範囲内の拮抗薬の濃度を達成する最適な精度には、標的部位への薬物の利用可能性の動態学に基づく療法を必要とする。これには、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の配給、平衡、および除去が関与する。本書で説明した拮抗薬は、適切な投薬量で単独で使用しうる。あるいは、その他の薬剤の同時投与または順次投与が望ましいこともある。代替治療法とともに、本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬のための治療の投薬療法が提示することもできるであろう。例えば、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、その他の薬物との組み合わせまたは併用により使用することもでき（治療的および／または予防的に）、これには、限定されないものの、コレステロール低下薬、例えば、コレステロール吸収阻害剤（例えば、Ｚｅｔｉａ（登録商標））およびコレステロール合成阻害剤（例えば、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）およびＶｙｔｏｒｉｎ（登録商標））を含む。本発明では、こうした組み合わせが意図されており、これらは本発明の重要な実施形態を形成する。従って、本発明は、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が、別の薬物もしくは複数の薬物と同時に、その後に、またはその前に投与／送達（治療および／または予防的に）される上述の治療の方法に関するものであり、この薬物には、限定されないものの、コレステロール低下薬、コレステロール吸収（ａｂｓｏｒｐｏｒｔｉｏｎ）阻害剤およびコレステロール吸収阻害剤を含む。
本書で記載した治療の能力を持つ個人（被験者）には、霊長類、ヒトおよび非ヒトが含まれ、また商業的または家畜での獣医学上の重要性のあるヒト以外の任意の哺乳動物または脊椎動物が含まれる。
ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、当技術で認識されている任意の投与経路で個人に投与しうるが、これには、限定されないものの、経口投与、注射による投与（その具体的な実施形態には、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射が含まれる）、吸入による投与、鼻腔内もしくは局所的投与を含み、これは単独でまたは個人の治療を支援するために設計されたその他の薬剤との組み合わせのいずれかで投与される。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、注射装置、ペン型注射器、無針装置および皮下パッチ送達システムによって投与することもできる。投与経路は、当業者により認識される多数の考慮事項をもとに決定すべきで、これには、限定されないものの、望まれる治療の生理化学的特性が含まれる。治療は、毎日、毎週、２週間ごと、もしくは毎月、またはは望まれる治療が行われて、維持されるように、適切な量のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を処方された時間に個人に供給するその他の任意の療法（ｒｅｇｉｍｅｎ）で供給しうる。製剤は、単回用量、または２回以上の用量を時間を分けて投与することができる。
また、ＰＣＳＫ９に関連した病気、障害もしくは状態または代替的に、ＰＣＳＫ９拮抗薬の効果から利益を得ることのできる病気、障害もしくは状態の治療のための薬剤の製造において、開示した拮抗薬を使用する方法も意図されている。薬剤は、ＰＣＳＫ９活性に関連した状態、またはＰＣＳＫ９の機能（作用）が特定の被験者にとって禁忌である状態を示す被験者において有用といえる。特に選んだ実施形態において、状態は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、代謝症候群、急性冠動脈症候群または関連する状態が考えられる。
本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の診断方法としても使用しうる。特に選んだ実施形態において、本発明には、試料（これには、限定されないものの、生体試料、例えば、血清または血液を含む）内に存在するＰＣＳＫ９を同定しそのレベルを数量化する方法が含まれ、これは、試料を本書で説明したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬に接触させること、およびＰＣＳＫ９への結合をそれぞれ検出または定量することを含む。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、当業者に既知の様々な試験法形式で使用することができ、またキットの一部を形成することもできる（そのキットの一般的な特徴については、下記にさらに記載する）。
本発明はさらに、遺伝子治療の目的での開示した抗ＰＣＳＫ９拮抗薬の投与を提供する。こうした方法によって、被験者の細胞が、本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸によって形質転換される。この核酸を有する被験者は、次に内因的にＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を精製する。以前、Ａｌｖａｒｅｚ， ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０８１−３０８７，２０００では、単鎖の抗ＥｒｂＢ２抗体が遺伝子治療アプローチを用いて被験者に導入された。Ａｌｖａｒｅｚ、ｅｔ ａｌ、上記、により開示された方法は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体をコードする核酸の被験者への導入に簡単に適応させることができる。
任意のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸を、被験者に導入することができる。
核酸は、当技術で既知のいずれの手段で被験者の細胞に導入することができる。望ましい実施形態において、核酸は、ウイルスベクターの一部として導入される。ベクターを引き出すのに好ましいウイルスの例には、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス、および望ましい細胞の向性を持つその他の組み換え体ウイルスが含まれる。
各社が、ウイルスベクターを商業的に製造しており、これには、いかなる形でも制限されないが、Ａｖｉｇｅｎ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州アラメダ；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（カリフォルニア州フォスターシティ；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ， Ｉｎｃ．（ペンシルべニア州シャロンヒル；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（オランダ、ライデン；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペス（疱疹）ウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（英国オックスフォード；レンチウイルスベクター）、およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ（フランス、ストラスブール；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）を含む。
ウイルスベクターの構築および使用の方法は、当技術で既知である（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０，１９９２を参照）。ウイルスベクターは、複製欠陥、つまり、標的細胞内において自立的には複製できず、またそれ故、感染性でないことが望ましい。複製欠陥ウイルスは、最小ウイルス、すなわち、ウイルス粒子を生成するためのゲノムのキャプシド形成に必要なゲノムの配列のみを保持することが望ましい。ウイルス遺伝子を完全にまたはほぼ完全に欠損した欠陥ウイルスが望ましい。欠陥ウイルスベクターの使用により、ベクターがその他の細胞に感染しうる心配なしに、特定の局在的な領域にある細胞への投与が許容される。こうして、特定の組織を特異的に標的としうる。
弱毒化したまたは欠陥のＤＮＡウイルス配列を含むベクターの例としては、限定されないものの、欠陥ヘルペスウイルスベクターが含まれる（Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：１４７−１５４，１９９９、Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．７１：１２５−１３２，１９９７およびＫａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃ．１９：１３７−１４７，１９９４）。
アデノウイルスは、変性させて、本発明の核酸を多様な細胞タイプに効率よく供給することのできる真核生物のＤＮＡウイルスである。Ｓｔｒａｆｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２に記載のあるベクターなどの弱毒化されたアデノウイルスベクターが、一部の例で望ましい。様々な複製欠陥のアデノウイルスおよび最小のアデノウイルスベクターについて記載がある（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２６９１４号、ＷＯ９４／２８９３８号、ＷＯ９４／２８１５２号、ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９５／０２６９７号およびＷＯ９６／２２３７８号）。本発明による複製欠陥の組み換えアデノウイルスは、当業者に既知の任意の技術で用意できる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １０１：１９５，１９９１；ＥＰ １８５５７３、Ｇｒａｈａｍ， ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７，１９８４、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、それらが感染する細胞のゲノム内に、安定し部位特異的な方法で組み込むことができる比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。これらは、細胞の成長、形態または分化には何の影響も誘発することなく、非常に多様な細胞に感染することができ、またヒトの病気には関与していないと見られる。ＡＡＶに由来するベクターのインビトロおよびインビボでの遺伝子の転写への使用についての記載がある（Ｄａｌｙ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３４３−１３４６，２００１、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．４８９：４５−５７，２００１、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／１８０８８号およびＷＯ ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号および第５，１３９，９４１号、並びにＥＰ ４８８５２８Ｂ１号を参照）。
別の実施形態において、遺伝子は、レトロウイルスベクターに導入することができ、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第４，６５０，７６４号、第４，９８０，２８９号、および第５，１２４，２６３号、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ３３：１５３，１９８３、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１１２０，１９８８、ＥＰ ４５３２４２号およびＥＰ １７８２２０号に記載のとおりである。レトロウイルスは、分割する細胞に感染する組み込み型ウイルスである。
レンチウイルスベクターは、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含む複数の組織タイプで本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする核酸の直接送達および持続的発現のための媒介物として使用できる。本ベクターは、それらの組織内の分割する細胞および分割しない細胞で効率よく形質導入でき、また長期にわたるＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の発現が維持される。レビューについては、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−８０，１９９８およびＫａｆｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：３１６−３２６，２００１を参照。レンチウイルスパッケージング細胞株が利用でき、当技術では一般的に知られている。これらは、遺伝子治療のための力価の高いレンチウイルスベクターの製造を促進する。ウイルス粒子を１０６ＩＵ／ｍｌを超える力価で少なくとも３〜４日間生成できるテトラサイクリン誘導性のＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスパッケージング細胞株の例については、Ｋａｆｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５７６−５８４，１９９９を参照。誘導性の細胞株で生成したベクターは、非分裂細胞をインビトロおよびインビボで効率よく形質導入するために必要に応じて濃縮できる。
シンドビスウイルスは、動植物分類上、アルファウイルス属の一種であり、また１９５３年より世界中の様々な場所でそれが発見されたことから、広範にわたり研究されてきた。アルファウイルス、特にシンドビスウイルスによる遺伝子形質導入は、インビトロでよく研究されてきた（Ｓｔｒａｕｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２，１９９４、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：６４３９−６４４６，１９９３、Ｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０：１１０−１１８，１９９９およびＳａｗａｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｒ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４８：３１５−３２３，１９９８を参照）。アルファウイルスベクターの数多くの性質によって、開発中のその他のウイルス由来のベクターシステムに対して望ましい代替方法となっているが、これには、発現構築物の迅速なエンジニアリング、力価の高い感染性粒子ストックの製造、非分裂細胞の感染、および高いレベルの発現を含む（Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ，１９９４上記）。遺伝子治療でのシンドビスウイルスの使用が記載されている。（Ｗａｈｌｆｏｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：４７２−４８０，２０００およびＬｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｒｅｃｅｐ．Ｓｉｇ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９（１−４）：６７３−６８６，１９９９）。
別の実施形態において、ベクターは、リポフェクションによって、またはその他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）を用いて細胞に導入できる。合成的なカチオン脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボおよびインビトロでのトランスフェクションのためにリポソーム調製することができる（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７，１９８７およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５， １９８７）。核酸の転写に有用な脂質化合物および組成物については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９５／１８８６３号およびＷＯ ９６／１７８２３号、並びに米国特許第５，４５９，１２７号に記載がある。
ベクターをインビボで裸のＤＮＡプラスミドとして導入することも可能である。遺伝子治療用の裸のＤＮＡベクターは、望ましい宿主細胞に当技術で既知の方法、例えば、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用により導入することができる（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７，１９９２、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０，１９９１を参照）。プラスミドのトランスフェクションに一般的に使用されるその他の試薬には、いかなる形でも限定はされないが、ＦｕＧｅｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅなどが含まれる。受容体を媒介したＤＮＡ送達アプローチも使用することができる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４，１９８８）。米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号には、哺乳動物における、トランスフェクション促進剤を使用しない外来性のＤＮＡ配列の送達についての開示がある。最近では、エレクトロトランスファーと呼ばれる、比較的低い電圧、高効率のインビボでのＤＮＡ転写技術についての記載がある（Ｖｉｌｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１０９７，２００１、Ｐａｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ． ２９：２９５−３００， ２００１、Ｍｉｒ， Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３：１−１０，２００１、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０１１５７号、ＷＯ ９９／０１１５８号およびＷＯ ９９／０１１７５号）。
こうした遺伝子治療アプローチに適し、本発明の抗ＰＣＳＫ９拮抗薬をコードする核酸を含む薬剤組成物は、本発明の範囲内に含まれる。
別の態様において、本発明は、関心対照の試料について、本発明のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を使用した、ＰＣＳＫ９の同定、分離、数量化または拮抗の方法を提供する。ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降または当技術（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｏｅｒｓ，Ｊ．１９９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照）で既知のその他の免疫化学的なアッセイなどの、免疫化学的アッセイもしくは各種の精製プロトコルにおける研究ツールとして利用することもできる。拮抗薬には、素早い同定またはそれに関連する活性の測定を促進するために、その中に標識が組み込まれていたり、またはそれに添付されている場合がある。当業者であれば、上記のプロトコルで有用な、または有用である可能性のある各種の検出可能標識（例えば、酵素、染料、または簡単に検出可能であるか、もしくは簡単に検出可能な何らかの活性／結果をもたらすその他の適切な分子）を十分によく分かっている。
本発明の追加的な態様は、本書で開示したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬または薬剤組成物および使用説明を含むキットである。キットには一般的に、必ずしもその必要はないが、キットの内容物の意図される用途を示すラベルが含まれる。標識という用語には、キット上にあるいは同封して供給されるか、もしくは別の方法でキットに付属する任意の書面または記録された資料が含まれる。薬剤組成物が凍結乾燥して提供される特定の実施形態において、キットには、製剤形態を液体の形態に戻すための滅菌水または生理食塩水を含むことができる。特定の実施形態において、水または生理食塩水の量は、約０．１ｍｌ〜１．０ｍｌである。
以下の実施例は、本発明を例証するために提供したものであり、それに制限されるものではない。
実施例１
組み換え体Ｆａｂディスプレイファージの分離
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ Ｇｏｌｄ Ｆａｂファージディスプレイライブラリ（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６を参照）を、固定化した組み換え体マウスＰＣＳＫ９に対して、下記に簡単に説明するプロセスによってパニングした。ファージＦａｂディスプレイライブラリは、まず３つのプール（第一のプールＶＨ２ ＋ ＶＨ４ ＋ ＶＨ５、第二のプールＶＨ１ ＋ ＶＨ６、および第三のプールＶＨ３）に分割した。ファージプールおよび固定化したＰＣＳＫ９タンパク質を脱脂粉乳でブロックした。
最初のラウンドのパニングにおいて、各ファージプールは、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルに固定化されたＶ５−、Ｈｉｓ−タグ付きのＰＣＳＫ９タンパク質に独立的に結合させた。固定化されたファージ−ＰＣＳＫ９複合体を、（１）ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（急速洗浄３回）、（２）ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（軽く振盪しながら５分間の培養を１回）、（３）ＰＢＳ（急速洗浄３回）、並びに（４）ＰＢＳ（軽く振盪しながら５分間の培養を２回）で順次洗浄した。結合したファージを２０ ｍＭ ＤＴＴで溶出し、溶出した３つのファージ懸濁液全てを１本の管に合わせた。大腸菌ＴＧ１を、溶出したファージに感染させた。プールしたファージミドを有する細胞（クロラムフェニコール耐性）の培養液を培養し、ファージミドを有する培養液の冷凍ストックを作成した。ファージをヘルパーファージで同時感染させて培養液から取り出し（ｒｅｓｃｕｅｄ）、次のパニングのラウンド用のファージストックを作成した。
第二ラウンドのパニングでは、ラウンド１からのファージを、固定化させブロックしたＶ５−、Ｈｉｓ−タグ付のＰＣＳＫ９タンパク質に結合させた。固定化したファージ−ＰＣＳＫ９複合体を、（１）ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（急速洗浄１回）、（２）ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（軽く振盪しながら５分間の培養を４回）、（３）ＰＢＳ（急速洗浄１回）、並びに（４）ＰＢＳ（軽く振盪しながら５分間の培養を４回）で順次洗浄した。結合したファージを溶出し、大腸菌ＴＧ１細胞を感染させ、ファージをラウンド１と同様に取り出した。
第３ラウンドのパニングでは、ラウンド２からのファージを、固定化させブロックしたＶ５−Ｈｉｓ−タグ付きＰＣＳＫ９タンパク質に結合させた。固定化されたファージ−ＰＣＳＫ９複合体を、（１）ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（急速洗浄１０回）、（２）ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（軽く振盪しながら５分間の培養を５回）、（３）ＰＢＳ（急速洗浄１０回）、並びに（４）ＰＢＳ（軽く振盪しながら５分間の培養を５回）で順次洗浄した。結合したファージを溶出し、ラウンド１と同様に大腸菌ＴＧ１細胞を感染させた。ファージミド感染細胞を一晩培養し、およびファージミドＤＮＡを準備した。
ラウンド３ファージミドＤＮＡからのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ挿入物を、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ Ｆａｂ発現ベクターｐＭＯＲＰＨ＿ｘ９＿ＭＨにサブクローン化して、プラスミドｐＭＯＲＰＨｘ９ ＭＨ／ｍＰＣＳＫ９ ２ ＣＸ１ Ｄ０５を得て（例えば、図１を参照）、またＦａｂ発現クローンのライブラリーを大腸菌 ＴＧ１ Ｆ−内に生成した。形質転換体を、ＬＢ ＋ クロラムフェニコール ＋ ブドウ糖のプレート上に広げ、一晩培養して細菌コロニーを生成した。個別の形質転換体コロニーを取り、培養用およびＦａｂ発現についてのスクリーニング用に２つの９６ウェルプレートのウェルに載せた。
実施例２
細菌で発現させたＦＡＢのＥＬＩＳＡスクリーニング
個別の形質転換体の培養液をＩＰＴＧ誘発し、Ｆａｂ発現のために一晩培養した。培養上清（Ｆａｂ候補）を、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルに固定化した精製したＶ５−、Ｈｉｓ−タグ付きＰＣＳＫ９タンパク質とともに培養し、プレートウォッシャーを用いてＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ（商標）２０で洗浄し、ＨＲＰ結合した抗Ｆａｂ抗体とともに培養し、再びＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（商標）２０で洗浄した。結合したＨＲＰを、ＴＭＰ基質を加えて検出し、ウェルのＡ４５０値をプレートリーダーを用いて読み取った。
負の対照を次のとおりに含めた：
各プレート上の非特異的Ｆａｂ結合についての対照を、並行して発現させた無関係のＦａｂである抗ＥｓＢのプレパラートとともに培養した。
培地のみ。
ＥＬＩＳＡおよびＦａｂ発現についての正の対照を次のとおり含めた。
ＥｓＢ抗原をプレートの３つのウェルに結合させ、その後、抗ＥｓＢ Ｆａｂとともに培養した。
組み換え体ＰＣＳＫ９抗原のＶ５タグまたはＨｉｓタグとのＦａｂｓの反応を対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）するために、同じ細胞で発現したＶ５−、Ｈｉｓ−タグ付きの分泌したアルカリフォスファターゼタンパク質（ＳＥＡＰ）を、オリジナルのＰＣＳＫ９抗原として用いて、並列ＥＬＩＳＡを実施し、同様に精製した。推定上のＰＣＳＫ９−反応性Ｆａｂを、ＰＣＳＫ９抗原で培養したとき、＞３Ｘのバックグラウンド値を生じるが、ＳＥＡＰと培養したときにはネガティブとして同定した。最初のラウンドのスクリーニングでＰＣＳＫ９−反応性として採点されたクローンを、単一のプレート上にまとめ、３通りに再培養し、ＩＰＴＧで再誘発し、ＰＣＳＫ９およびＳＥＡＰに対して並行のＥＬＩＳＡで再試験（ｒｅ−ａｓｓａｙｅｄ）した。正および負の対照を上述のとおり含めた。３つの複製のうち少なくとも２つで陽性となったクローンは、その後の性質決定に進めた。既知または疑いのある混合した予備的なクローンの場合には、培養液を再精製し、クロラムフェニコールを用いて２ｘＹＴ プレート上の単一のコロニーについて画線培養し、３つ以上の異なるコロニーからの液体培養を、再びＥＬＩＳＡで上記のとおり３通りに検査した。
実施例３
ＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡ陽性のＦＡＢクローンのＤＮＡ配列決定
１．２ ｍｌ ２ｘＹＴ液体培養液にＦａｂ陽性グリセロールのマスターストックからのクロラムフェニコールを接種することで、ＤＮＡ精製用の細菌培養液を作成し、一晩培養した。ＤＮＡを一晩培養したものから遠心分離した細胞ペレットから、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００上でＱｉａｇｅｎ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉプレップを使用して準備した。ＡＢＩ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクル配列決定を、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓで確定した配列決定プライマーを用いてＤＮＡについて実施し、およびＡＢＩ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを実行して、ＦａｂクローンのＤＮＡ配列を得た。ＤＮＡ配列を互いに比較し、一意のクローン配列を決定し、またＦａｂクローンの軽鎖および重鎖サブタイプを決定した。
実施例４
一意のＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡ陽性クローンからのＦＡＢの発現および精製
ＥＬＩＳＡ陽性クローンｍ２ＣＸ１Ｄ０５からのＦａｂおよびＥｓＢ（負の対照）Ｆａｂを大腸菌ＴＧ１Ｆ−細胞内でＩＰＴＧ誘発により発現させた。培養を溶解させ、Ｈｉｓ−タグ付きのＦａｂを固定化した金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製し、遠心ダイアフィルトレーションにより、タンパク質を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３／１５０ ｍＭ ＮａＣｌに交換した。タンパク質をＣａｌｉｐｅｒ Ｌａｂ−Ｃｈｉｐ ９０で電気泳動法により、また従来的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質試験法により数量化した。精製したＦａｂタンパク質を段階希釈でＥＬＩＳＡにより再び試験し、精製したＦａｂの活性を確認した。正および負の対照を、前述のとおり実行した。次に、精製したＦａｂプレパラートを下記に記載したとおり分析した。
実施例５
ｍ２ＣＸ１Ｄ０５ ＦＡＢの完全長ＩｇＧへの変換
ｍ２ＣＸ１Ｄ０５軽鎖可変部をコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応により、プラスミドテンプレートｐＭＯＲＰＨｘ９＿ＭＨ／ｍＰＣＳＫ９＿２＿ＣＸ１＿Ｄ０５から、プライマーＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡ（配列番号：３３）およびＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＴＡＣＣ（配列番号：３４）を用いて増幅した。この増幅の生成物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、事前にＦｓｐＩおよびＢｍｔＩで消化しておいたプラスミドｐＶ１ＪＮＳＡ−ＧＳ−ＦＢ−ＬＣＫにクローン化した。その結果生じるプラスミドを可変部全体にわたりＤＮＡ配列決定により検証した。エンドトキシンを含まないプラスミドのプレパラートを、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅプラスミド・マキシプレップ・キットを用いて作成した。
ｐＭＯＲＰＨｘ９＿ＭＨ／ｍＰＣＳＫ９＿２＿ＣＸ１＿Ｄ０５の重鎖可変部をコードするＤＮＡ配列を、プライマー：ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴ（配列番号：３５）およびＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴ（配列番号：３６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、増幅した生成物をＦｓｐＩおよびＢｍｔＩであらかじめ消化させておいたプラスミドｐＶ１ＪＮＳＡ−ＢＦ−ＨＣＧ２Ｍ４にクローン化した。その結果生じるプラスミドを可変部全体にわたりＤＮＡ配列決定により検証した。エンドトキシンを含まないプラスミドのプレパラートを、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅプラスミド・マキシプレップ・キットを用いて作成した。
１Ｄ０５の軽鎖コード用および重鎖コード用プラスミドを用いたＨＥＫ２９３細胞の同時トランスフェクションの後、発現したＩｇＧのタンパク質Ａ精製により、全長ＩｇＧが得られた。
実施例６
表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）を用いたＦＡＢ：ＰＣＳＫ９相互作用の動態学的評価
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）２０００システムを使用してＳＰＲ測定を実施した。固定化用のセンサーチップＣＭ５およびアミン・カプリング・キットはＢｉａｃｏｒｅ（商標）製である。
抗Ｆａｂ ＩｇＧ（ヒト特異的）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５２６０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アミン・カプリング・キット（カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）を用い、固定化ウィザードを「Ａｉｍ ｆｏｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」（固定化を目標）オプションにして使用して、一級アミン基を介してセンサーチップＣＭ５の表面１および２に共有結合的に結合した。標的固定化５０００ ＲＵを指定した。ウィザードでは、１００ ｍＭ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）および４００ ｍＭ ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）の１：１混合物の７分間の活性化を使用して、望ましいレベルを達成するために複数パルスでリガンドを注入し、その後、エタノールアミンの７分間のパルスにより、残りの表面を非活性化させる。
抗ＰＣＳＫ９ Ｆａｂを取り込み表面２に取り込み、また表面１をＦａｂ：ＰＣＳＫ９相互作用の動態学的研究用の基準として使用した。それぞれのＦａｂを、反応についてＲ最大値１００〜１５０ ＲＵに対して標的のＲＬにいたるまで、５００ ｎｇ／ｍｌ溶液を５または１０ μｌ／ｍｉｎで１〜１．５分間流して取り込んだ。５〜１０のｈＰＣＳＫ９ｖ５ＨｉｓまたはｍＰＣＳＫ９ｖ５Ｈｉｓ抗原の濃縮物を、表面全体に３０ μｌ／ｍｉｎで３〜４分間流した。１５〜６０分の解離時間を許容した後、１０ ｍＭグリシンｐＨ ２．０の３０秒のパルスで抗Ｆａｂ表面を再生した。
各Ｆａｂを用いて分析したＰＣＳＫ９抗原の複数の濃縮物からのセンソグラムをＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して評価し、Ｆａｂ：ＰＣＳＫ９相互作用の動態学的定数を予測した。
動態学的定数は以下のとおり決定した。
Figure 2011511637
実施例７
表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）を用いたＩｇＧ：ＰＣＳＫ９相互作用の動態学的評価
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）２０００システムを使用してＳＰＲ測定を実施した。固定化用のセンサーチップＣＭ５およびアミン・カプリング・キットはＢｉａｃｏｒｅ（商標）製である。
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ヒト特異的）（Ｃａｌｔａｇ， カタログ番号Ｈ１０７００）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アミン・カプリング・キット（カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）を用い、固定化ウィザードを「Ａｉｍ ｆｏｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」（固定化を目標）オプションにして使用して、一級アミン基を介してセンサーチップＣＭ５の表面１および２に共有結合的に結合した。標的固定化５０００ ＲＵを指定した。ウィザードでは、１００ ｍＭ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）および４００ ｍＭ ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）の１：１混合物の７分間の活性化を使用して、望ましいレベルを達成するために複数パルスでリガンドを注入し、その後、エタノールアミンの７分間のパルスにより、残りの表面を非活性化させる。
抗ＰＣＳＫ９ ＩｇＧを取り込み表面２に取り込み、また表面１はＩｇＧ：ＰＣＳＫ９相互作用の動態学的研究用の基準として使用した。ＩｇＧを、反応についてＲ最大値１００〜１５０ ＲＵに対して標的のＲＬにいたるまで、１０ ｎＭ溶液を１０ μｌ／ｍｉｎで１〜１．５分間流して取り込んだ。５〜１０のｈＰＣＳＫ９ｖ５ＨｉｓまたはｍＰＣＳＫ９ｖ５Ｈｉｓ抗原の濃縮物を、表面全体に３０または６０μｌ／ｍｉｎで４分間流した。１５〜６０分の解離時間を許容した後、１０ｍＭグリシンｐＨ １．７の６０秒のパルスで抗ＩｇＧ表面を再生した。
各ＩｇＧを用いて分析したＰＣＳＫ９抗原の複数の濃縮物からのセンソグラムをＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して評価し、ＩｇＧ：ＰＣＳＫ９相互作用の動態学的定数を予測した。
動態学的定数は以下のとおり決定した。
Figure 2011511637
実施例８
１Ｄ０５についてのＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ ＴＲ−ＦＲＥＴ試験法
この試験法は、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２８２：２０５０２−２０５１２に記載のあるものの変形である。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−標識化したＰＣＳＫ９（最終濃度１０ｎＭ）を可変量の１Ｄ０５と組み合わせ、これに、９６ウェルのブラックＤｙｎａｔｅｃｈ Ｕボトムプレートを用いて、Ｅｕ（８０４４）−標識化したＬＤＬＲ外部ドメインを最終濃度〜１．５ｎＭ（Ｒｕｂｙｓｔａｒ上でＦｌ６２０ｎＭで〜２０，０００カウントを得るために十分な量）になるまで加えた（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中、合計体積５０μＬ）。少なくとも９０分の平衡状態の後、ウェル当たり２０回のフラッシュ、５０ ｕｓｅｃの取り込み遅延、および２００ ｕｓｅｃ合計取り込み時間を使用して、試料をＲｕｂｙｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ Ｃｏｒｐ．）で読み取った。データを（Ｆｌ６６５／Ｆｌ６２０ × １００００）の比として表し、１Ｄ０５についてのＩＣ５０を標準的な４個のパラメーターフィットを使用して、シグモイド用量−反応曲線の反曲点から決定した。
図２は、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用ＴＲ−ＦＲＥＴ試験法での１Ｄ０５の活性を図示する。１Ｄ０５のＦａｂおよびＩｇＧはどちらも強力で、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用を完全に抑制する。
実施例９
ＥＸＯＰＯＬＡＲ試験法：細胞ＬＤＬ取り込みに対する外来性ＰＣＳＫ９の効果
１日目に、９６ウェルｐｏｌｙＤ−リジン被覆プレートに３０，０００ ＨＥＫ細胞／ウェルを平板固定した。２日目に、培養液を血清を含まないＤＭＥＭ培養液と交換した。３日目に、培養液を除去し、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄した。精製したＰＣＳＫ９をＬＰＤＳおよびｄＩ−ＬＤＬを含む１００μｌのＤＭＥＭ培養液に加えた。プレートを３７℃で６．５時間培養した。細胞を、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＴＢＳ中で素早く洗浄してから、ＴＢＳ−ＢＳＡで２分間洗浄し、その後、ＴＢＳで２回（ただし素早く）洗浄した。細胞を１００μｌ ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。次に、Ｅｘ ５２０、Ｅｍ ５８０ｎｍを使用して、プレートにおいて蛍光性を測定した。各ウェルにおける合計細胞タンパク質をＢＣＡタンパク質試験法を使用して測定した後、蛍光単位を総タンパクに正規化した。
Ｅｘｏｐｏｌａｒ試験法は、ＬＤＬ取り込みに対する変異体の効果の特徴付けに効果的である。Ｅｘｏｐｏｌａｒ試験法でＰＣＳＫ９突然変異体の作用強度が血漿ＬＤＬ−コレステロールとどう相関するかを図示した下記の表４を参照。
Figure 2011511637
結果：ｍ２ＣＸ１Ｄ０５は、ＦａｂおよびＩｇＧのどちらも、ＬＤＬ取り込みに対するヒトおよびマウスの両方のＰＣＳＫ９の効果を用量依存的に阻害し、この効果は再現可能な形で観察された。細胞に加えたＰＣＳＫ９の量は、〜１００〜３２０ｎＭであった。
ｍ２ＣＸ１Ｄ０５（Ｆａｂ）は、配列番号：１（配列番号：２７のＶＬを含む）の軽鎖と、リンカーおよびタグを含む配列番号：９のＦｄ 鎖（配列番号：１１のＶＨ）を含む。
Ｍ２ＣＸ１Ｄ０５（ＩｇＧ）は、配列番号：２６の軽鎖と、配列番号：２５を含む重鎖を含む。
図３Ａ〜３Ｄは、（ｉ）１Ｄ０５（Ｆａｂ）のマウスＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの喪失の用量依存的な阻害（図３Ａ）；（ｉｉ）１Ｄ０５（ＩｇＧ）のマウスＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの喪失の用量依存的な阻害（図３Ｂ）；（ｉｉｉ）１Ｄ０５（Ｆａｂ）のヒトＰＣＳＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの喪失の用量依存的な阻害（図３Ｃ）；および（ｉｖ）１Ｄ０５（ＩｇＧ）のヒトＰＳＣＫ９依存的細胞ＬＤＬ取り込みの喪失の用量依存的な阻害（図３Ｄ）を図示する。
１Ｄ０５は、明確にヒトおよびマウスのＰＣＳＫ９の両方と交差反応をする。図３Ａ〜３Ｄには、（ｉ）細胞ＬＤＬ取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照および（ｉｉ）細胞 ＋ ＰＣＳＫ９依存的ＬＤＬ取り込みの喪失レベルを示すＰＣＳＫ９（５μｇ／ｍｌ）対照の２つの対照がある。１Ｄ０５およびＰＣＳＫ９が含まれる滴定実験は、一定の濃度のＰＣＳＫ９（５μｇ／ｍｌ）、およびグラフに示すとおり次第に増える濃度の１Ｄ０５で実施した。
１Ｄ０５は、細胞ＬＤＬ取り込みに対するＰＣＳＫ９の効果を阻害しうる。１Ｄ０５（Ｆａｂ）についてのＩＣ５０は、マウスおよびヒトのＰＣＳＫ９タンパク質についてそれぞれ９７ｎＭおよび１４４ｎＭである。１Ｄ０５（ＩｇＧ）についてのＩＣ５０は、マウスおよびヒトのＰＣＳＫ９タンパク質についてそれぞれ８５ｎＭおよび７９ｎＭである。
実施例１０
ＰＣＳＫ９細胞取り込み
以下の試験法を、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２０５０２−１２の方法により実施した。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識化したＰＣＳＫ９で処理した細胞を下記のとおり画像処理した。ＣＨＯ細胞を、ポリ−Ｄ−リジン−被覆した９６ウェル光学ＣＶＧ滅菌ブラックプレート（Ｎｕｎｃ）に密度２０，０００細胞／ウェルで平板固定した。細胞は、１００単位のペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩を含み、１０％ ＦＢＳで補充したＦ−１２Ｋ培養液（栄養混合物、Ｋａｉｇｈｎの改変（１ｘ））（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に平板固定した。プレートを３７℃および５％ ＣＯ２で一晩培養した。翌朝、培養液を除去し、１００単位のペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩を含む１００μｌのＦ−１２Ｋ培養液で置き換えた。１８時間後、培養液を除去した。精製したＰＣＳＫ９タンパク質を「実験手順」の項に記載されたとおり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識化した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識化されたＰＣＳＫ９（１、５、または２０μｇ／ｍｌ）を、１０％リポタンパク質欠損の血清を含む５０ μｌのＦ−１２Ｋ培養液に入れて、細胞に加えた。プレートを３７℃で４時間培養し、細胞を画像処理の前にトリス緩衝化した生理食塩水で素早く洗浄した。細胞核を標識化するために、最終濃度０．１μｇ／ｍｌでＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を各ウェルに加えた。プレートを×４０水浸対物レンズを備えたＯｐｅｒａイメージャー（Ｅｖｏｔｅｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ドイツ、ハンブルグ）にかけた。蛍光核について励起波長４０５ｎｍ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識化されたＰＣＳＫ９について６３５ｎｍを使用して、画像を取り込んだ。各ウェルについて、＞５００個の細胞が含まれる個別の１１のフィールドを２種の発光波長について取り込んだ。Ａｃａｐｅｌｌａ言語（Ｅｖｏｔｅｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ）を用いて記述された特注アルゴリズムでデータを分析した。アルゴリズムにより個別の細胞の核および細胞質の領域を同定して標識した後、細胞の合計細胞質強度を測定した。強度は、任意蛍光単位で表現した。
１Ｄ０５ Ａｂの試験については、同一の処置を使用したが、ＨＥＫ２９３またはＨｅｐＧ２のいずれかの細胞で実施した。ＨｅｐＧ２細胞については、プレートをポリ−Ｄ−リジン被覆しなかった。５μｇ／ｍｌのＡＦ６４７標識化ＷＴ ＰＣＳＫ９を、５０μｇ／ｍｌ以下のＦａｂの滴定とともに加えた。この手順を使用して、両方の細胞タイプについておよそ８０ｎＭのＩＣ５０値を観測した。
結果：図４Ａおよび４Ｂに、Ｆａｂ １Ｄ０５およびＩｇＧ １Ｄ０５によるＰＣＳＫ９インターナリゼーションの阻害、およびＬＤＬ取り込みの修復を図示する。
実施例１１
インビボ試験法
ヒト１Ｄ０５のＦａｂ断片と完全なＩｇＧの両方をマウスにおいてインビボで試験し、ＬＤＬコレステロールのレベルの変化をモニターした。これらの研究で使用したマウスは、ヒトＣＥＴＰ（これはマウスでは欠損）の導入遺伝子（Ｔｇ）発現、並びにＬＤＬ受容体（ｔｍ１）の分裂についてヘミ接合性である（Ｂ６ ｘ Ｂ６−Ｔｇ（ＣＥＴＰ）Ｌｄｌｒｔｍ１）Ｆ１マウスである。これらのマウスは、そのヒトに似た脂質プロフィールおよびＬＤＬが豊富な性質から、特に有用である。
各マウスについて２回出血させ、１度目はＬＤＬコレステロールの個別のベースラインレベルを確立するために研究開始時（「ｐｒｅ」）に、２度目は処理後にＬＤＬレベルに発生した変化を評価するために３時間後（「ｐｏｓｔ」）に出血させた。各マウスは、媒体管理として３時間の過程中に、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ、１Ｄ０５ ＩｇＧ（０．５ ｍｇ）、または１Ｄ０５ Ｆａｂ断片（０．５ｍｇ）の２回にわたるＩＶ投与を受けた。Ｔｈｅ １Ｄ０５の完全ＩｇＧを２３０，０００ ｘ ｇで遠心分離し、注射の直前に凝集体を除去した。
図５では、一組の結合シンボルおよびＬＤＬ（ｐｏｓｔｂｌｅｅｄ−ｐｒｅｂｌｅｅｄ）の変化で表示されるそれぞれのマウスについてのＬＤＬレベルは、各治療群についての平均として示してある（Δ ｍｇ／ｄＬ）。ＰＢＳでの治療は、ＬＤＬ測定に全く効果がない（−４ｍｇ／ｄＬ、５％減少）。対照的に、血清ＬＤＬは、１Ｄ０５ 完全ＩｇＧ（−１９ｍｇ／ｄＬ）で２０％、１Ｄ０５のＦａｂ断片（−２４ｍｇ／ｄＬ）で３４％減少した。
実施例１２
限定的タンパク質分解
限定的タンパク質分解質量分析法の戦略は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体（基質）を異なる特異性のエンドプロテアーゼ酵素とともに、注意深く管理された条件（すなわち、低酵素濃度および短い消化時間）で培養することからなる。これらの条件下で、エンドプロテアーゼは、タンパク質基質の主要な切断部位（すなわち、タンパク質基質の表面にあり、溶媒に暴露される部位）のみを切断する。１Ｄ０５ Ｆａｂのｗｔ−ｈＰＣＳＫ９への結合は、両方のタンパク質において通常は溶媒に暴露される一部の表面残基をマスクする。従って、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９で切断され、１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体では切断されていない主要部位は、複合体において１Ｄ０５により保護されているＰＣＳＫ９の残基に対応する。これらの残基の一部は、１Ｄ０５結合に直接的に関与している可能性が高い。ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９限定的タンパク質分解により生成されたタンパク質分解性ペプチドは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）による消化物の分析により同定され、および特性付けされる。最後に、異なる特異性のエンドプロテアーゼの使用は、結合に関与する残基をより正確に定義する手助けとなる。
限定的タンパク質分解実験に通常使用されるタンパク質分解性酵素の量は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９の過剰な加水分解および主要な結合部位（暴露された残基）の喪失を避けるために、著しく低減する必要があった。ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９、１Ｄ０５および１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９のエンドプロテアーゼによる培養は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、室温で実施した。使用したエンドプロテアーゼには、タンパク質分解性酵素と比較してタンパク質が過剰な２５００／１（ｗ／ｗ）でＡｓｐＮを添加し、トリプシンおよびＧｌｕＣを１０００／１（ｗ／ｗ）のタンパク質対エンドプロテアーゼ比で添加した。エンドプロテアーゼ添加後、５分間、１５分間および３０分間の期間において、一定分量の試料をＭＡＬＤＩ標的上に付着させ、基質としてのシナピン酸（ＳＡ）の存在下で、直接ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を行った。ｗｔ−ＰＣＳＫ９に由来する断片ペプチドを、タンパク質分解性酵素で様々な時間で培養した後、１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体試料のｗｔ−ｈＰＣＳＫ９に由来するものと比較して、１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９相互作用の際にタンパク質分解から保護されている残基を同定した。本書に記載した図および表では、最も関連性のある断片ペプチドのみを報告する。
エンドプロテアーゼＡｓｐＮによる限定的タンパク質分解：ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９タンパク質、１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体および１Ｄ０５ Ｆａｂを、ＡｓｐＮの存在下で（Ａｓｐ残基をＮ−末端で切断）、２５００／１（ｗ／ｗ）のタンパク質とタンパク質分解性酵素との比で５分間、１５分間および３０分間培養した。消化物のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析により、主要なｗｔ−ｈＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体の切断部位が明らかとなった（下記の図７Ａおよび７Ｂおよび表５を参照）。表５は、ｗｔ−ＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体との５分間のＡｓｐＮ培養後に得られたｗｔ−ｈＰＣＳＫ９断片ペプチドを示す。イタリック体は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９が加水分解したときのみに形成されるペプチドである。
Figure 2011511637
Ａｓｐ１６９での切断に由来し、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９の触媒ドメインのペプチド１５３〜１６８の理論的質量と一致するｍ／ｚ １９６９．１における種は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９試料でのみ形成され、この残基が１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体において１Ｄ０５ Ｆａｂ結合によってタンパク質分解から保護されていることが示された。いくつかの種は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９加水分解の両方で形成された。特に、プロドメインのペプチド３１〜４９およびｗｔ−ｈＰＣＳＫ９の触媒ドメインの６９８〜７３７に対応するｍ／ｚ ２２２２．０および４４１２．９でのイオンは、Ａｓｐ４９およびＡｓｐ６９８での切断に由来するものであった。
長めのエンドプロテアーゼＡｓｐＮ培養時間（すなわち、１５分、３０分）で、ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルに表示されたペプチドプロフィールは、図７Ａおよび７Ｂに示した５分でのものと比較して有意な変化はなく、Ａｓｐ１６９が、１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９相互作用での加水分解から保護されていることが確認された。
質量の校正は、外部標準を用いて行う必要があるため、予想質量値と実測質量値との間で観察された一致度は、このタイプの実験では標準の範囲内であることに留意することが重要である。
エンドプロテアーゼＧｌｕＣによる限定的タンパク質分解：エンドプロテアーゼＧｌｕＣは、Ｇｌｕ残基をＣ端末で切断する。ＧｌｕＣのｗｔ−ｈＰＣＳＫ９、１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体および１Ｄ０５との培養を、１０００／１および１００／１（ｗ／ｗ）のタンパク質とタンパク質分解性酵素との比で実施した。主要な切断部位を検出するために、試料のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を培養後５分、１５分および３０分で実施した。ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９タンパク質内で切断され、かつ１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体内で保護されたｗｔ−ｈＰＣＳＫ９残基およびＭＳスペクトル内で検出されたそれに対応するペプチドを下記の図８Ａ〜Ｈおよび表６に示す。表６は、ｗｔ−ＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９複合体との１５分間のＧｌｕＣ培養により得られたペプチド断片を示す。イタリック体は、ｗｔ−ＰＣＳＫ９に由来し、複合体に由来しないペプチドである。
Figure 2011511637
エンドプロテアーゼＧｌｕＣでは、保護は、残基Ｇｌｕ１７０、Ｇｌｕ１９７およびＧｌｕ１９５を含むｗｔ−ｈＰＣＳＫ９表面領域で示される。ペプチド１５３〜１８１に対応し、またｗｔ−ｈＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９の両方のＧｌｕＣとの培養で得られたｍ／ｚ ３３５７．４における種は、Ｇｌｕ１８１がＦａｂ １Ｄ０５のｗｔ−ｈＰＣＳＫ９への結合によって保護されていないことを示す。
トリプシンによる限定的タンパク質分解：トリプシンは、ＡｒｇおよびＬｙｓ残基をＣ端末で切断する。酵素を１０００（ｗ／ｗ）の比でｗｔ−ＰＣＳＫ９、１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９複合体および１Ｄ０５に５分、１５分および３０分間加えた。ｗｔ−ＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９複合体のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を、図９Ａ〜Ｄに示し、また最も関連性の高いペプチド断片を表７に報告する。表７は、ｗｔ−ＰＣＳＫ９および１Ｄ０５／ｗｔ−ＰＣＳＫ９複合体をトリプシンで５分間培養して得られたペプチド断片を例証するものである。イタリック体は、ｗｔ−ＰＣＳＫ９に由来し、複合体に由来しないペプチドである。
Figure 2011511637
５分での主要な切断部位は、プロドメイン上のＡｒｇ４６、並びにｗｔ−ｈＰＣＳＫ９の触媒ドメイン上のＡｒｇ１６０、Ａｒｇ１６５、Ａｒｇ１６７、Ａｒｇ１９９、Ａｒｇ２１５、Ａｒｇ２１８、Ａｒｇ７０５およびＡｒｇ７２９であった。ペプチド２００〜２１８、１６６〜１９９および１６１〜１９９に対応するｍ／ｚ ２２７９．３、３９０９．９および４４７４．６における種は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９加水分解でのみ検出され、残基Ａｒｇ１９９が１Ｄ０５結合によって保護されていることを示す。これらのペプチド断片は、ペプチド１６８〜２１５、１６６〜２１５、１６８〜２１８、１６６〜２１８に対応するｍ／ｚ ５４１０．５、５７２９．７、５８５０．８、６１７０．２における種とともに、ｗｔ−ＰＣＳＫ９においてのみ検出され、よって残基Ａｒｇ１６５およびＡｒｇ１６７での保護も示している。
トリプシン培養の１５分の時点で、残基Ａｒｇ１９９での保護が確認された。実際に、ｍ／ｚ ２２８０．０、３５９１．４、３９１０．９および４４７５．６における種は、どれもＡｒｇ１９９の切断に由来するが、ｗｔ−ＰＣＳＫ９加水分解でのみ存在し、より豊富となる。さらに、Ａｒｇ１９４での保護が検出された（ｗｔ−ＰＣＳＫ９スペクトルのｍ／ｚ ３３２５．７における種の存在により示される）。Ａｒｇ１６５およびＡｒｇ１６７における切断に由来する種（ｍ／ｚ ５４１１．５、５７３０．９、５８５１．８および６１７１．６）は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９加水分解において存在し、１Ｄ０５／ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９複合体タンパク質分解においてもずっと低い強度で現れ始めた。これは、こうした残基でのタンパク質分解からの保護は、１Ｄ０５とｗｔ−ＰＣＳＫ９残基との主な接触よりは、Ｆａｂの立体障害によるものであることを示すと考えられる。
結果：異なる特異性の３種の酵素を使用したＬＰ−ＭＳでは、１Ｄ０５−ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９において１Ｄ０５ Ｆａｂにより保護されたｗｔ−ｈＰＣＳＫ９の表面積を同定した。Ａｒｇ１６５、Ａｒｇ１６７、Ａｓｐ１６９、Ｇｌｕ１７０、Ａｒｇ１９４、Ｇｌｕ１９７およびＡｒｇ１９９は、１Ｄ０５ Ｆａｂに対する結合によって保護されるｗｔ−ｈＰＣＳＫ９の残基である（図１０を参照）。これらの残基は、ｗｔ−ｈＰＣＳＫ９の触媒ドメインに属し、分子表面上に暴露されている（図１１を参照）。さらに、トリプシンによる限定的タンパク質分解は、残基１９４〜１９９が１Ｄ０５結合に直接的に関与している可能性を示すのに対して、残基Ａｒｇ１６５およびＡｒｇ１６７でのタンパク質分解からの保護は、１Ｄ０５とｗｔ−ＰＣＳＫ９残基との間の直接接触よりは、Ｆａｂの立体障害によることが考えられる。
ペプチドＲ１９４〜Ｒ１９９の残基は、ヒトおよびマウスのＰＣＳＫ９で保存されている。１Ｄ０５ Ｆａｂは、ヒトおよびマウスのタンパク質を認識する。ヒトおよびマウスのＰＣＳＫ９間の配列アラインメントで図示したとおり（図１２を参照）、ｗｔ−ＰＣＳＫ９のペプチド１９４〜１９９に含まれ、かつ１Ｄ０５により保護されている残基は、ヒトおよびマウス両方のＰＣＳＫ９内に保存されるが、ペプチド１６５〜１６９の残基（１Ｄ０５結合によっても保護される）は、保存されていない。これは、残基１９４〜１９９のみが１Ｄ０５と直接的に相互作用を持つが、その他（１６５〜１６９）は、立体障害によりタンパク質分解から保護されるという仮説を裏付ける。
実施例１３
ＰＣＳＫ９／１Ｄ０５ ＴＲ−ＦＲＥＴ試験法
抗−Ｖ５抗体（ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、４当量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前述のとおり標識化して、精製した（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（２８）：２０５０２−２０５１２を参照）。１Ｄ０５ ＩｇＧを、５当量のＥｕ（Ｗ８０４４）−ＤＴＡ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して同様の方法で標識化した。使用前に、材料に光が当たらないよう保護し、４℃で保存した。Ｖ５／Ｈｉｓ−ＰＣＳＫ９を前述のとおり生成した（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、（同書）を参照）。
ＴＲ−ＦＲＥＴ試験法を、黒いＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ ２ ９６ウェルプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ ＣａＣｌ２および０．０５％ ＢＳＡ中で実施した。２５μｌの２０ ｎＭのそれぞれのＡＦ６４７標識化した抗Ｖ５抗体およびＶ５／Ｈｉｓ−ＰＣＳＫ９に、ＦａｂまたはＩｇＧのどちらかの未標識の候補抗体（つまり、１Ｄ０５および１Ｂ２０）を段階希釈で加えた。試薬を室温で〜１５分間平衡化した後、Ｅｕ（Ｗ８０４４）−１Ｄ０５ ＩｇＧを加えて、最終濃度１．５ｎＭのＥｕ標識化抗体（Ｆｌ６２０ ｎｍにおいて〜１８０００カウント；Ｓ／Ｂ＝１２）および合計量５０ μＬを得た。その後、平衡試験法は、上述のとおり、ＢＭＧ ＬａｂＴｅｃｈ Ｒｕｂｙｓｔａｒ Ｒｅａｄｅｒで読み取った（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、同書。）。データは、Ｆｌ６６５／Ｆｌ６２０×１００００として報告してある。ＩＣ５０値は、データをＳ字状用量反応曲線に当てはめ、非線形回帰分析を使用して決定した（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ４．０３、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
図１３は、ＰＣＳＫ９−１Ｄ０５相互作用ＴＲ−ＦＲＥＴ試験法における１Ｄ０５および別個の抗体１Ｂ２０の分析を図示する。両方のＦａｂは強力であり、相互作用を完全に抑制する。図１４Ａ〜Ｄは、例えば、実施例９で説明したＥｘｏｐｏｌａｒ試験法での１Ｂ２０のＰＣＳＫ９阻害を図示する。１Ｂ２０ Ｆａｂは、マウスＰＣＳＫ９をＩＣ５０値１５２ ｎＭ（ｎ＝５）で、またヒトＰＣＳＫ９をＩＣ５０値１４５ ｎＭ（ｎ＝５）で阻害した。ＩＢ２０ ＩｇＧは、マウスＰＣＳＫ９をＩＣ５０値１３ ｎＭで、またヒトＰＣＳＫ９をＩＣ５０値２２ ｎＭで阻害した。１Ｂ２０ Ｆａｂの結合の詳細は、以下の表に示してある。
Figure 2011511637
実施例１４
１Ｄ０５アカゲザルＰＫ／ＰＤ研究
１Ｄ０５の薬物動態、薬力学および標的結合を特徴付けるために、オスのアカゲザルにおいて３ ｍｇ／ｋｇ（７．０〜９．０ｋｇ、ｎ＝３）での単回用量ＩＶ研究を実施した。この研究で使用した全てのアカゲザルは、生物製剤で未処置であった。
サルに、橈側皮静脈を介して１Ｄ０５のＩＶボーラス投与をした。伏在／大腿血管から投薬後の計画した時点で血液試料を採取し、生じる血漿／血清を分析まで−７０℃で貯蔵した。
１Ｄ０５の投薬用溶液は、１００ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのアルギニン、６％ショ糖、ｐＨ ６．０に対して、４７．２ｍｇ／ｍＬで調製した。投薬用溶液は、４℃で貯蔵し、投薬中はウェットアイスで保冷した。
血清試料のリポタンパク質分析を下記のとおりに実施した。市販の試薬を使用した抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して、１Ｄ０５レベルを数量化した。
図１５に示すとおり、１Ｄ０５は、ＬＤＬ−Ｃを３ｍｐｋで〜５０％低下させ、また＞２５％ ＬＤＬ−Ｃの低下が〜１６日間に観察された。１Ｄ０５のｔ１／２（図１６）は、７７時間であった。
実施例１５
１Ｄ０５ アカゲザルＰＫ／ＰＤ研究からの血漿／血清試料のリポタンパク質分析
リポタンパク質プロフィールを作成するために、血漿または血清をＳｕｐｅｒｏｓｅ−６サイズ排除カラム（ＧＥ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）でのクロマトグラフィーにより分画した。カラム流出液中の総コレステロールレベルを、市販の酵素による比色分析コレステロール検出試薬（Ｔｏｔａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅ、Ｗａｋｏ ＵＳＡ）を用いてインライン混合により連続的に測定した後、下流で反応生成物の分光光度検出を６００ｎｍの吸光度で実施した。カラムから溶出したコレステロールの最初のピークは、ＶＬＤＬ、第二のピークはＬＤＬ、および第三のピークはＨＤＬによるもので、各ピークの下の面積は、ＨＰＬＣとともに提供されたソフトウェアを用いて計算した。リポタンパク質の各部についてのコレステロール濃度を計算するために、対応するピーク面積の合計面積に対する比に、試料において測定され総コレステロール濃度を掛けた。
実施例１６
製剤
配列番号：２６を含む軽鎖および配列番号：２５を含む重鎖を含むモノクローナル抗体を、適切な製剤に透析して、濃縮した。次に溶液を、安定性研究用の３ ｍＬのガラス製バイアルに分配した。液体形態で実施された研究は、２〜８℃または２５℃で直ちに安定状態に置いた。
分析方法には、凝集および断片化を測定するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を含む。以下は、Ｔｉｍｅ ０および６Ｍ ＳＥＣデータの表である。３／５０／５０または６／１００／１００（ショ糖／Ｈｉｓ／Ａｒｇ）を含む製剤では、２〜８℃または２５℃で６カ月貯蔵した後に、少な目の凝集体および断片が形成された。全ての製剤は、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ〜７）内に１ ｍｇ／ｍＬで凍結させた標準以外は６．０でのものである。
Figure 2011511637
実施例１７
変異体
１ＤＯ５の部位特異的突然変異体を作製して、配列番号：５１〜６０として本書で開示した。１Ｄ０５ Ｆａｂの部位特異的突然変異体のＫｄは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎを使用して決定し、親和性をヒトＰＣＳＫ９−Ｖ５−Ｈｉｓに対して測定した。Ｆａｂ親和性の測定方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）について以前に記載した方法と本質的に同じである。
Figure 2011511637

Claims (41)

  1. 単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬であって：
    （ａ） 配列番号：１７またはその同等物を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変部（前記同等物は、ＣＤＲ３ドメインにおいて１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つものとして特徴付けられる。）、および／または
    （ｂ） 配列番号：７またはその同等物を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変部（前記同等物は、ＣＤＲ３ドメインにおいて１つ以上の保存的アミノ酸置換を持つものとして特徴付けられる。）、
    を含み、
    前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込み阻害を拮抗する、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  2. ＣＤＲ３ドメインがＣＤＲ３領域内のヒト生殖系列領域内にある請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  3. １２００ ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＰＣＳＫ９に結合する請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  4. ５００ ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９に結合する請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  5. １００ ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９に結合する請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  6. ５ ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９に結合する請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  7. ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を５００ｎＭ未満のＩＣ５０で拮抗する請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  8. ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を２００ｎＭ未満のＩＣ５０で拮抗する請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  9. ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込みの阻害を１００ｎＭ未満のＩＣ５０で拮抗する請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  10. ＰＣＳＫ９の細胞取り込みの阻害を少なくとも２０％拮抗する請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  11. 抗体分子である請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  12. （ａ） 配列番号：１３を含む重鎖可変ＣＤＲ１配列；
    （ｂ） 配列番号：１５を含む重鎖可変ＣＤＲ２配列；
    （ｃ） 配列番号：３を含む軽鎖可変ＣＤＲ１配列；および／または
    （ｄ） 配列番号：５を含む軽鎖可変ＣＤＲ２配列
    をさらに含む請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  13. ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３ドメインがそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のヒト生殖系列領域内にある請求項１２のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  14. （ａ） 配列番号：１７を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変部；
    （ｂ） 配列番号：７を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変部；
    （ｃ） 配列番号：１３を含む重鎖可変ＣＤＲ１配列；
    （ｄ） 配列番号：３を含む軽鎖可変ＣＤＲ１配列；
    （ｅ） 配列番号：１５を含む重鎖可変ＣＤＲ２配列；および
    （ｆ） 配列番号：５を含む軽鎖可変ＣＤＲ２配列
    を含む請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  15. ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３ドメインがそれぞれそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のヒト生殖系列可変領域内にある請求項１４のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  16. 配列番号：１１を含む重鎖可変部および／または配列番号：２７を含む軽鎖可変部を含む請求項１２のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  17. 配列番号：２４を含む定常配列を持つ重鎖を含む請求項１２のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  18. 配列番号：２４を含む定常配列を持つ重鎖を含む請求項１６のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  19. ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬であって：
    （ａ） 配列番号：１を含む軽鎖；および
    （ｂ） 配列番号：１１を含む重鎖；
    を含み、
    前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込み阻害を拮抗する抗体分子である、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  20. 配列番号：１１に、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３および配列番号：２４を含む群から選択されるアミノ酸配列が順に（ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）続く請求項１９のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  21. 単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬であって：
    （ａ） 配列番号：２６を含む軽鎖；および
    （ｂ） 配列番号：２５を含む重鎖；
    を含み、
    前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込み阻害を拮抗する抗体分子である、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  22. （ａ） １Ｄ０５ ＦａｂのＰＣＳＫ９への結合を少なくとも５０％阻害し、前記１Ｄ０５ Ｆａｂが配列番号：１を含む軽鎖および配列番号：９のアミノ酸１〜２３３を含むＦｄ鎖を含むものとして特徴付けられ、かつ
    （ｂ） （ｉ）ＰＣＳＫ９のＬＤＬ受容体への結合および／または（ｉｉ）ＰＣＳＫ９の細胞へのインターナリゼーションを拮抗する、
    単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  23. （ａ） １Ｄ０５ ＩｇＧのＰＣＳＫ９への結合を少なくとも５０％阻害し、前記１Ｄ０５ ＩｇＧが（ｉ）配列番号：１を含む軽鎖および（ｉｉ）配列番号：１１を含む重鎖を含むものとして特徴付けられ、かつ
    （ｂ） （ｉ）ＰＣＳＫ９のＬＤＬ受容体への結合および／または（ｉｉ）ＰＣＳＫ９の細胞へのインターナリゼーションを拮抗する、
    ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬：。
  24. 配列番号：１１に、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３および配列番号：２４を含む群から選択されるアミノ酸配列が順に続く、請求項２３のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  25. 単離されたＰＣＳＫ９特異的拮抗薬であって：
    （ａ） 配列番号：４５の重鎖可変部ＣＤＲ３配列；
    （ｂ） 配列番号：４５の重鎖可変部ＣＤＲ３配列、配列番号：４３の重鎖可変部ＣＤＲ１配列および配列番号：４４の重鎖可変部ＣＤＲ２配列；
    （ｃ） 配列番号：４８の軽鎖可変部ＣＤＲ３配列；
    （ｄ） 配列番号：４８の軽鎖可変部ＣＤＲ３配列、配列番号：４６の軽鎖ＣＤＲ１配列および配列番号：４７の軽鎖ＣＤＲ２配列；
    （ｅ） （ａ） および（ｃ）の両方、
    （ｆ） （ｂ）および（ｄ）の両方、
    （ｇ） それぞれ配列番号：５０および４９を含む重鎖および／または軽鎖の可変部；
    （ｈ） 配列番号：５１〜５６のいずれか１つを含む重鎖可変部および任意に配列番号：２７を含む軽鎖可変部；または
    （ｉ） 配列番号：５７〜６０のいずれか１つを含む軽鎖可変部および任意に配列番号：１１を含む重鎖可変部；
    を含み、
    前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬は、ＰＣＳＫ９の細胞ＬＤＬ取り込み阻害を拮抗する抗体分子である、ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬。
  26. 請求項１から２５のいずれかのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬および医薬品として容認される担体を含む組成物。
  27. （ａ） 約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、
    （ｂ） ポリヒドロキシ炭化水素（限定されないものの、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトールを含む。）および／または二糖（限定されないものの、ショ糖、ラクトース、マルトースおよびトレハロースを含む。）（前記ポリヒドロキシ炭化水素および／または二糖の合計は、製剤の約１％から約６％ ｗ／ｖである。）；
    （ｃ） 約５ｍＭから約２００ｍＭのヒスチジン、イミダゾール、ホスフェートまたは酢酸；
    （ｄ） 約５ ｍＭから約２００ ｍＭのアルギニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはメチオニン；
    （ｅ） 約５．５から約７．５の範囲のｐＨを達成するために十分な量の約０．０１Ｍから約０．１Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）；および
    （ｆ） 限定されないものの、滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理学的生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む液体担体；
    を含む請求項２６に記載の組成物であって：
    前記薬剤組成物は、約５．５から約７．５の範囲のｐＨを持ち；かつ前記薬剤組成物は任意に、製剤の約０．０１％から約１％ ｗ／ｖの非イオン性界面活性剤（限定されないものの、ポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））、ポリソルビン酸−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０（商標））、ポリソルビン酸−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０（商標））、およびポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））、限定されないものの、Ｂｒｉｊ ５８（商標）、Ｂｒｉｊ３５（商標）を含むポリオキシエチレンアルキルエーテル、並びにトリトンＸ−１００（商標）、トリトンＸ−１１４（商標）、ＮＰ４０（商標）、Ｓｐａｎ ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１）などのその他を含む。）を含む、組成物。
  28. （ａ） 約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、
    （ｂ） 約１％から約６％ ｗ／ｖのマンニトール、トレハロースまたはショ糖；
    （ｃ） 約１０ｍＭから約１５０ｍＭのヒスチジン；
    （ｄ） 約１０ｍＭから約１５０ｍＭのアルギニンまたはプロリン；
    （ｅ） 約５．８から約６．５の範囲のｐＨを達成するために十分な量の約０．００３ Ｍから約０．００５ Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）；および
    （ｆ） 限定されないものの、滅菌水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油、生理食塩水、ブドウ糖もしくはその他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む液体担体：
    を含む請求項２７の組成物であって：
    前記薬剤組成物は約５．８から約６．５の範囲のｐＨを持ち；かつ前記薬剤組成物は任意に、約０．０１％から約１％ ｗ／ｖのポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））またはポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））を含む、組成物。
  29. （ａ） 約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、
    （ｂ） 約２％から約６％ ｗ／ｖのショ糖；
    （ｃ） 約２５ｍＭから約１００ｍＭのヒスチジン；
    （ｄ） 約２５ｍＭから約１００ｍＭのアルギニン；
    （ｅ） 約６の範囲のｐＨを達成するために十分な量の約０．００４０Ｍから約０．００４５Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）；および
    （ｆ）滅菌水；
    を含む請求項２８の組成物であって：
    前記薬剤組成物は約６の範囲のｐＨを持ち；かつ前記薬剤組成物は任意に、約０．０１％から約１％ ｗ／ｖのポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））またはポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））を含む、組成物。
  30. （ａ） 約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬、
    （ｂ） 以下のうちの１つの量のショ糖、ヒスチジンおよびアルギニン：（ｉ）約３％ ｗ／ｖのショ糖、約５０ｍＭのヒスチジンおよび約５０ｍＭのアルギニン；または（ｉｉ）約６％ ｗ／ｖのショ糖、約１００ｍＭのヒスチジンおよび約１００ｍＭのアルギニン；
    （ｃ） 約６の範囲のｐＨを達成するために十分な量の約０．００４０Ｍから約０．００４５Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）；および
    （ｄ） 滅菌水；
    を含む請求項２９の組成物であって：
    前記薬剤組成物は約６の範囲のｐＨを持ち；かつ前記薬剤組成物は任意に、約０．０１％から約１％ ｗ／ｖのポリソルビン酸−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））またはポリソルビン酸−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標））を含む、組成物。
  31. 請求項１から２５のいずれかのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の投与を含むＰＣＳＫ９機能を拮抗するための方法。
  32. ＰＣＳＫ９機能によって引き起こされ、および／もしくは増悪される障害、状態または病気を回復させるための医薬の製造における請求項１から２５のいずれかのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の使用。
  33. 請求項１から２５のいずれかのＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする単離された核酸。
  34. 請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする単離された核酸であって、重鎖可変部のＣＤＲ３ドメインは、配列番号：１８を含むヌクレオチド配列によりコードされ、および／または軽鎖可変部のＣＤＲ３ドメインは、配列番号：８を含むヌクレオチド配列によりコードされる、単離された核酸。
  35. （ａ） それぞれ配列番号：１４および配列番号：１６を含むヌクレオチド配列によりコードされた重鎖可変部内のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメイン；および／または
    （ｂ） それぞれ配列番号：４および配列番号：６を含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変部内のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメイン
    をさらに含む請求項３４の単離された核酸。
  36. 請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする単離された核酸であって、前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が
    （ａ） 配列番号：１２を含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変部；および／または
    （ｂ） 配列番号：２８を含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変部
    を含む、単離された核酸。
  37. 請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬をコードする単離された核酸であって、前記ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬が
    （ａ） 配列番号：２９を含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖領域；および／または
    （ｂ） 配列番号：３０を含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖領域
    を含む、単離された核酸。
  38. 請求項３３から３７のいずれかの核酸を含むベクター。
  39. 請求項３３から３７のいずれかの核酸を含むインビトロ、もしくはインサイチューの単離された宿主細胞または宿主細胞の集団。
  40. ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を製造する方法であって
    （ａ） ＰＣＳＫ９特異的拮抗薬の製造に適切な条件下で請求項３９の細胞を培養すること；および
    （ｂ） 製造したＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を単離すること
    を含む、方法。
  41. 請求項１のＰＣＳＫ９特異的拮抗薬を含むインビトロ、もしくはインサイチューの単離された宿主細胞または宿主細胞の集団。
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