TW200529877A - Method and composition for thickening hair - Google Patents

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200529877 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種藉由亢進毛囊細胞，較好是毛乳頭細 胞之角化細胞增殖因子（FGF-7)之表現而維持·促進毛髮粗 厚化之方法，以及亢進FGF-7之表現的組合物、尤其係用以 維持·促進毛髮粗厚化之頭皮外用劑。 【先前技術】 所謂之高齡化社會、壓力社會的現代社會中，頭部毛髮 因種種原因而陷入脫髮危機之機會變得越來越多。對應於 此，業者為提供更為優良之[生髮料]實行各種嘗試。作為生 髮料賦予毛髮之效果主要可列舉如下幾點· 1}毛髮誘生效 果（促進毛髮生長效果、成長期誘發效果），2)維持毛髮之粗 度或者增加其粗度，即粗厚化效果，3)延長毛髮成長期之 效果，4)5a-還原酶抑制效果（抑制更年期早期過渡之效 果），5)促進血液循環之效果，6)殺菌效果，7)防止老化之 效果’ 8)保濕效果，9)抗氧化效果等。 男性型掉髮具有如下之特徵，因毛髮成長期縮短而使毛 囊短丨化毛髮直徑逐漸減小從而變為柔毛，且發現男性 型掉髮者中，相對於毛髮密度(每一單位面積之毛髮數)之減 少幾乎未得㈣知’而有毛髮直徑極端減小之情況（日本專 利特開2GG2.322G94號公報）。基於該情況，不僅注重誘發生 丈，亦應注重上述粗厚化效果之重要性。 然而，關於與毛髮之粗厚化有關之機制，於生化學·分子 生物學階層至今仍不清楚’其結果係，可認為含有對粗厚 97465.doc 200529877 化之維持.促進有效之藥劑的生 ^ ^ ^^ , 枓之研究·開發亦處於摸 索Ρ自&。右此充分瞭解毛髮粗 予1C之機制，則斑前右 之生髮料相比，可提供且右ρ Λ g 只〗/、目月〗現有 捉供具有更加顯著效果者。 【發明内容】 本發明之目的在於：提供毛髮 杈供毛髮粗厚化之機制於生化學水 平之明確解釋，進而維持·促進 七髮粗厚化的方法以及其皮 膚外用組合物。 且係屬於纖維母 FGF-7係包含194個胺基酸之糖蛋白質 細胞增殖因子族之成長 膚纖維母細胞等分泌， 因子之一。以作為間葉系細胞之皮 結合於作為存在於表皮細胞之特異 性接收器之FGFR2 IIIb，並於副劍毒鹼（八，少X y )促進 其增殖之情形為眾所周知（Rubin j S等，NaU心以

Sci. USA 1989, 86:802-806;Marchese C等，J· Cell Physiol· 1990, 144··326_332等）。又，揭示有不僅促進表皮角化細胞， 且促進肝實質細胞、腸道上皮細胞旧⑽代丨叮RM等，j· Clin·

Invest· 1994, 94:1764-1777)等廣泛之上皮系細胞之增殖， 且藉由該FGF-7毛囊之角化細胞之增殖亦得以促進（Pierce G.F_ 等，J. Exp· Med· 1994, 179:831- 840)。又，揭示有自鼠 類試驗於成長期之毛乳頭細胞發現FGF-7，並於毛乳頭附近 之毛母發現其功能表現所必須的接收器FGFR2(Dev. Dyn· 1996; 205(4):3 79-3 86)，且指出FGF-7參與毛髮成長。然而， 並未明確解釋FGF-7於毛髮成長中發揮何種作用。於此，本 發明者們作出如下操作假設，若於毛乳頭細胞中亢進FGF-7 之表現，則介以認為係其目標細胞的毛母細胞等之增殖， 97465.doc 200529877 或許可與藉由毛髮成長期延長作用之粗厚化相聯繫。 首先，使各種藥劑作用於毛乳頭細胞等，並探索使fgf_7 之表現上升者，而瞭解腺苷及其衍生物會亢進FgF_7基因之 表現。其次，於施行腺苷之臨床試驗後，驚訝的是亦發現 具有毛髮粗厚化之效果。可認為毛髮粗厚化之維持·促進如 曰本專利特開2002-322094號公報中所揭示，必須具有至少 如下之三種成分：藉由毛髮成長期延長而發揮毛髮成長促 進作用效果之成分（例如克拉屬植物萃取物），藉由抑制向更 年期之早期過渡而發揮防止脫髮作用效果之成分（例如睾 固酮），以及發揮自暫息期直至成長期之誘發作用效果的成 分（例如癸基十四烷基胺氧化物），故而驚訝的是單獨化合物 可發揮此種效果。 FGF-7之毛乳頭細胞等之表現得以亢進之情況係初次發 現，進而該表現之亢進參與毛髮粗厚化的情況完全係初次 發現。 因此，本發明提供一種維持·促進毛髮粗厚化的方法，其 特徵在於亢進毛囊細胞，較好是毛乳頭細胞處之角化細胞 增殖因子（FGF_7)之表現。 毛囊細胞之FGF-7的表現亢進係藉由將皮膚外用劑塗布 於頭皮而得以實現，該皮膚外用劑含有一種或數種之選自 由腺苷及其衍生物，例如腺苷5，_磷酸，腺苷5，_磷酸鹽，以 及 CCPA(2-氣-N6_環戊基腺苷），C1-IB-MECA(2_ 氣·Ν6_(3· 碘苄基）-9-[5-(甲基胺甲醯基呋喃核糖基]腺嘌呤）以 及NECA(N-乙基羧基醯胺基腺苷）所組成之群的亢進毛囊 97465.doc 200529877 細胞中FGF-7表現的藥劑（以下，有時稱為[1?(31^7表現亢進 劑])。較好是上述藥劑為腺苷。 於其他觀點，本發明係提供一種FGF-7表現亢進組合物， 其含有選自由腺苷及其衍生物，例如腺苷磷酸，腺芽5，_ 磷酸鹽，以及CCPA、C1-IB-MECA以及NECA所組成之群的 藥劑作為活性成分。 於較好之態樣中，亢進FGF-7表現的是毛乳頭細胞或者外 毛根勒細胞。 於較好之態樣中，上述藥劑為腺苷。 於較好之態樣中，上述組合物係藉由塗布於頭皮而維持· 促進毛髮粗厚化的皮膚外用劑。 進而於其他觀點’本發明係提供一種方法，係維持·促進 毛髮粗厚化之藥劑的篩選方法，該方法之特徵在於：將待 選藥劑適用於細胞，較好是毛囊細胞，更好是毛乳頭細胞 或外毛鞘細胞，並選定亢進該細胞之FGF-7表現的藥劑。較 好是，毛乳頭細胞為不死化毛乳頭細胞。 於較好之態樣中，上述細胞之FGF-7表現之亢進係藉由測 定細胞中之FGF-7量而決定。 進而於較好之態樣中，上述測定藉由利用對FGF-7特異性 之抗體之ELLSA法或RIA法。 進而於較好之態樣中，上述細胞之FGF-7表現之亢進係藉 由測定將自細胞抽出之FGF-7實行編碼的mRNA之量而決 定。 進而於較好之態樣中，上述mRNA之測定藉由RT-PCR法 97465.doc 200529877 (逆轉錄聚合酶鏈反應）實行。 之有效的方法 以及 本發明可提供維持.促進毛髮粗厚化 用於其之組合物。 【實施方式】 以下就本發明之實施形態加以說明。 本發明提供一 於亢進毛囊細胞 子（FGF-7)之表現 種維持·促進毛髮粗厚化的方法，其特徵在 ’較好是毛乳頭細胞處之角化細胞增殖因 本發明中所謂毛髮粗厚化係指—般地抑制由髮根之矮小 化而引起的柔毛化’ ^維持毛髮之粗度或者變粗。判定有 無毛髮粗厚化效果，因毛髮之粗度或質地具有個人差別， 故而較好的是因人而異，然而—般而t ,頭部之特定面積 之區域，例如i Cm2、2 cm2、5 cm2之特定直徑的毛髮，例 如直徑40 μπι、60 μιη、80 μπι或100 μιη以上之毛髮根數於將 本發明之FGF-7表現亢進劑適用於頭皮，例如持續適用“固 月，3個月，或6個月以上時，其結果為未實質性減少之情 形時，例如其減少率未滿10%，較好是未滿5%之情形，則 可判定為毛髮之粗厚得以維持，於例如直徑為4〇 、6〇 μηι、80 μιη或100 μηι之毛髮根數實質性增加之情形時，例 如其增加率為5%以上，較好是10%以上，更好是2〇%以上 之情形，可判定為毛髮粗厚化得以促進。 毛囊細胞，較好是毛乳頭細胞處之FGF-7表現的亢進係藉 由塗布皮膚外用劑於頭皮而得以實現，該皮膚外用劑含有 一種或數種之選自由腺苷及其衍生物，例如腺苷5，_磷酸， 97465.doc -10- 200529877 腺苷5’-磷酸鹽，及CCPA，C1-IB-MECA以及NECA所構成之 群的亢進毛囊細胞中之FGF-7表現的藥劑。 腺皆係核糖核皆之一，且係於驗基部分包含作為嗓σ令衍 生物之腺嘌呤者。腺苷5，-磷酸亦稱為5，-腺嘌呤酸，其係於 腺皆之核糖之Υ位經基結合有一分子碌酸之核苷。 又，於腺苷5’-磷酸之鹽，作為形成鹽之相對離子，若為 形成酸與相對離子之物質則可為任何物質，例如，可列舉 納、卸、躬專。又’作為腺皆5’-磷酸之鹽，亦可使用其水 合物。 <^卩八、（：1-；^-]^€八、_€八係腺苷類似物質。。(^八、 C1-IB-MECA、NECA可自 Sigma公司購入。 上述腺苷、腺苷5’-填酸以及腺苷5，-填酸之鹽、CCPA、 C1-IB-MECA以及NECA可使用市場上銷售者作為試驗藥 劑。 本發明之FGF-7表現亢進組合物可為皮膚外用劑，較好的 是頭皮外用劑，例如生髮料或者養髮料。 本發明之FGF-7表現宄進組合物於總量中包含例如 0.01-20.0質量％，較好是(M_10.0質量％之上述F(JF_7表現亢 進劑。於該添加量未滿該組合物總量之〇〇1質量％時，藉由 上述成分之毛髮粗厚化效果未得以充分發揮故而較不理 想，又，當超過20.0質量％時，明顯於配藥方面造成困擾， 故而有時較不理想。 本發明之FGF-7表現宄進組合物，尤其皮膚外用劑可藉由 直接塗布或散佈於皮膚而經皮投藥。又，其投藥量依據外 97465.doc ι, 200529877 用劑之具體態樣，使用者之年齡、 法明確指定，對人類投藥之情形時 以體重一 Kg及一天為單位， mg，較好是 0.1-10.0 mg，且 至4次投藥。 症狀等而變化，故而無 上述FGF-7表現亢進劑 一般而言投藥量為0.01-1 〇〇·〇 較好是將該量分為1日1次或2 、本發明之FGF.7表現宄進組合物，尤其是皮膚外用劑，於 以人類為主之哺乳動物中，顯示了優良之毛髮粗厚化之維 持.促進作用，作為護髮用之醫藥品，以醫藥外用品或化妝 品較為有用。 本發明之FGF-7表現充進組合物，尤其是皮膚外用劑可採 用之劑型，較好S可適用於表皮之外用劑劑型，例如，可 選擇液狀、乳液狀、乳霜狀、以及氣溶膠狀等之劑型。又， 本發明之組合物之形態亦為任意，例如，可採用滋補品、 髮油、慕絲、洗髮精、潤髮乳、乳液、化妝水、面膜 '以 及氣溶膠劑等形態。本發明之組合物尤為較好是以塗布於 表皮之方式使用。塗布方法並未特別限定者，然而較好是 例如於頭皮一日塗布一次以上，例如一日一至三次，並相 應塗布之皮膚面積適量塗布，例如1 _5 mi。 本發明之FGF-7表現宄進組合物，尤其是皮膚外用劑，除 作為必須成分之上述香料，相應需要，並且只要不損宝= 發明所期望之效果，可添加一般而言於化妝品、醫藥外 品及醫藥品等使用之各種油性或水性成分、保濕劑、增2 劑、防腐劑、抗氧化劑、香料、著色劑及各種藥劑等。 97465.doc -12- 200529877 例如，可添加高級脂肪酸，固體石蠟、流動石蠟、矽氧 油、三十碳烷、單烯烴酸甘油酯、橄欖油、十四（烷）酸異丙 酯、以及高級醇等油分；甘油、透明質酸、丙二醇、多妥 爾、動脈膠原（atherocollagen)、以及乳酸納等保濕劑；木 瓜黏質物、羧基乙烯基聚合物、以及氧雜蒽樹膠等增黏劑； 尼古丁酸醯胺、尼古丁酸苄基酯、維他命E乙酸鹽、當藥萃 取物、氣化三甲胺丁酸甲酯、以及乙醯膽鹼衍生物等血管 擴張劑；蠟酸、蛋氨酸、精氨酸等氨基酸；維他命B6、維 他命E類、維他命Η、以及泛酸類等維他命類；尼古丁酸、 尼古丁酸甲酯、以及尼古丁酸生育酚酯等尼古丁酸酯類； 頂花防己鹼等皮膚功能亢進劑；雌二醇等女性荷爾蒙劑； 甘草酸鹽、甘草次（/ y千小k千 > )酸、以及甘菊環等消炎 劑；日扁柏醇、六氣代二酚基曱烷、氯化苄烷胺、氣化十 六（烷）基吡啶鏽鹽、十一碳烯、三氣均二苯脲、以及雙二氣 酚硫醚等抗菌劑；薄荷等清涼劑；水揚基酸、鋅類、以及 乳酸類等；檸檬酸等有機酸類。 本發明之FGF-7表現亢進組合物、尤其是皮膚外用劑藉由 添加上述FGF-7表現亢進劑以外之已認為具有生髮作用之 既有生髮成分、例如敏樂定、環孢靈素等，可進而獲得有 效之育髮效果。 本發明係進而提供一種維持·促進毛髮粗厚化之藥劑的 篩選方法。該方法之特徵在於：將待選藥劑適用於細胞、 較好是毛囊細胞、更好是毛乳頭細胞或外毛根鞘細胞，從 而選定亢進該細胞之FGF-7表現的藥劑。 97465.doc •13· 200529877 作為毛乳頭細胞，可使用源自人類之正常毛乳頭細胞、 或較容易獲得並且於增殖速度較快方面具有優勢之不死化 毛乳頭細胞、例如日本專利特開平1 1-89565號公報所揭 示，藉由SV40 large T抗原基因之形質轉換所獲得之不死化 人類毛乳頭細胞等。又，篩選時，除了毛乳頭細胞以外， 亦可使用產生FGF-7之間葉系細胞、例如自人類所單離之皮 膚纖維母細胞、或源自其他毛囊之細胞、例如外毛根鞘細 胞等。 細胞中之FGF-7表現亢進係藉由測定例如細胞中之 FGF-7之量而得以決定。較好是該測定於人類FGF-7中利用 特異性抗體，並藉由於業界所眾所周知的方法，例如利用 螢光物質、色素、及酵素等之免疫染色法、西式吸墨法、 免疫測定法、例如ELIS A法、RIA法等各種方法而實施。又， 亦可藉由自細胞抽出RNA並測定編碼人類FGF-7之mRNA 之量而決定。mRNA之抽出、其量之測定亦於業界為眾所周 知，例如RNA之定量係於逆轉錄反應之後，藉由定量聚合 酶鏈反應法（RT-PCR)而得以實施。例如定量PCR可利用以 下引子之組合而實施。 組合1 前向引子（Forward Primer): 5，-CATGAACACCCGGAGCACTAC-3, (NM 一 002009:419-439)(序列號 1) 97465.doc -14- 200529877 反向引子（Reverse Primer): 5 丨 _CACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTC-3’(NM 一 002009:669-646)(序列號 2) PCR產物之大小：251 bp 組合2 前向引子：5，-CACAAATGGATACTGACATGGA-3’ (ΝΜ_002009:449-470)(序列號 3) 反向弓I 子：S^TCACTCTTATATCCCCTCCTTTd (NM—002009:644-623)(序列號 4) PCR產物之大小：196 bp(J Clin Endocrinol Metab 88(2)， 773- ， 2003) 組合3 前向引子：5,-CTTTGCTCTACAGATCATGCTTTC-3, (NM一002009:480-503)(序列號 5) 反向引子：5，-TTGCCATAGGAAGAAAGTGGGCTG-3， (NM—002009:1022-999)(序列號 6) PCR產物之大小：543 bp(J Clin Invest 92, 2408-，1993) 以下，藉由實施例進一步具體地說明本發明。然而藉由 本實施例’並非限定性地解釋本發明之技術範圍。再者， 於以下實施例等，表示添加量之數值只要未特別事先限 定，係以對於添加之對象全體之質量％表示。 實施例 實驗1 :藉由定量PCR實驗之FGF-7表現亢進之研究（1) 1)細胞之培養 97465.doc -15- 200529877 人類毛乳頭細胞（dermal papillae cell;DPC)使用由作為整 形手術之副產物產生之頭皮單離·培養後凍結保存之源自 34歲女性的DPC。以細胞密度為1.0-1.5xlO4個/cm2之方式播 種，並於MEM(GIBCO)+10%FBS 中，37°C、5%C〇2之條件 下培養。以2次/週的比例施行培養基交換、當細胞達到密 集時（自播種起10日-20日後），以0.25%之胰蛋白酶自盤中除 去細胞並回收，且再次以1.(Μ.5χ104個/cm2之密度播種。 2) 培養細胞之藥劑處理 將解凍後經1-3次繼代培養之DPC於24孔盤以4·〇χ 104個/ 孔之密度播種，4日後於亞密集之細胞中將腺苷交換為溶解 於100 μΜ之濃度的MEM(未添加血清）。對照組細胞僅使用 MEM(未添加血清），並施行同樣處理。

3) RT-PCR 添加腺苷2、4、8、24小時後，以MagNAPureLC(羅歇·代 亞科納斯迪克斯股份公司）自培養細胞萃取mRNA，並使用 逆轉錄酵素Superscript Il(Invitrogen)之套組從而合成 cDNA。藉由使用螢光色素CyberGreen I之即時進行表現量 之比較，該螢光色素CyberGreen I於铸件模具中將cDNA以 LightCycler(羅歇·代亞科納斯迪克斯股份公司）結合於雙股 DNA之副溝。具體為使用 LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I套組（羅歇·代亞科納斯迪克斯股份公司）並按 照隨付之說明書，調製全量20 μΐ之反應液（MgCl2 2 mM，前 向引子以及反向引子各0·25 μΜ)，以LightCycler實行PCR 反應（酵素活性化95°C/l〇分、熱變性95°C/15秒、退火58°C/5 97465.doc -16- 200529877 秒、伸長反應72°C/10秒、熱變性-伸長反應循環40次），並 監控各循環之伸長反應結束時之螢光強度。該螢光強度反 映有該時刻之PCR產物量。基因之表現量係假設於PCR產物 之指數函數放大期，初期鑄件模具量A之PCR產物Y對於 PCR之循環數X滿足Υ=Αχ2χ並且得以放大者，並自獲得固 定量之PCR產物為止之循環數算出相對值。以下表示用於 本研究之FGF-7放大用引子。 前向弓I 子：SLCATGAACACCCGGAGCACTACJ， (NM__002009:419-439)(序列號 1) 反向弓丨子：5，-CACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTC -3，(NM—002009:669-646)(序列號 2) PCR產物之大小：251 bp 其結果示於圖1。如該圖所明示，可認為於藉由腺苷所處 理之毛乳頭細胞中FGF-7之表現亢進十分明顯。 實驗2:定量PCR實驗之FGF-7之表現亢進的研究（2) 與實驗1同樣，其中將腺苷濃度設為10 以及100 01^兩 種，將腺苷處理時間設為3小時，實行RT_PCR實驗。其結 果示於圖2。如該圖所明示，可認為於藉由腺苷所處理之毛 乳頭細胞中FGF-7之表現以依存於腺苷濃度之方式宄進。 實驗3-1 :定量PCR實驗之FGF_7之表現宄進的研究（3) 與實驗1同樣，其中使用作為腺苷類似物質之CCPA(2-氣 ,-N6-環戊基腺苷）（100 μΜ)，C1-IB-MECA(2-氣-N6-(3-鐵节 基）-9-[5-(甲基胺甲醯基呋喃核糖基]腺嘌呤）（50 ΚΜ) 以及NEC Α(Ν-乙基羧基醯胺基腺苷）（10 ΚΜ)替代腺苷’嚴將 97465.doc -17- 200529877 藥劑處理時間設為3小時，實行RT_pCR實驗。（再者，於藥 劑之溶解性較低之情形時於放入包含未添加藥劑之對照組 之所有藥劑的培養基中，亦可以DMS〇最終濃度為〇1%之 方式調製）。 其結果示於圖3。如該圖所明示，可認為即使於藉由 CCPA、C1-IB-MECA或NECA所處理之毛乳頭細胞中FGF-7 之表現亢進亦十分明顯。 實驗3-2·定量pcr實驗之FGF-7之表現亢進的研究（4) 與實驗1同樣，其中使用黃烷酮、3, 4，·二甲基黃烷酮 (YGU427)、3-甲基黃烷酮（YUG429)各1〇() μΜ替代腺苷，並 將藥劑處理時間設為2小時，實行RT-PCR實驗。其結果分 別示於圖4、5、6。雖然均表示FGF-7基因之表現亢進結果， 然而並未認為由作為腺苷接收器抑制劑之8_spT(8_磺醯基 余鹼）所造成之抑制，故而對於FGF_7之表現亢進未必需要 腺苷接收器。 實驗4:對於腺苷之毛髮粗厚化效果之研究 發現具有以上FGF-7亢進效果之各種藥劑之中，關於毛髮 粗厚化效果藉由以下方法對腺苷加以研究。 將具有下述組成1之含腺苷的生髮料以及具有對照物的 下述組成2之含尼古丁酸醢胺的生髮料，以一日2次、適量 (2·3 ml)之方式對30-50歲之呈現男性型脫髮之男性被實驗 者（各組51名）之毛髮頭部塗布使用6個月，並就與使用開始 時之比較腺苷之毛髮粗厚化效果加以分析。於本實驗中， 將柔毛設為具有不滿4〇 μιη直徑之毛髮，將直徑6〇 _以上 97465.doc •18- 200529877 =設為粗毛’將直_μιη以上者設為粗厚化效果顯著之毛 髮°於使用含腺芽之生髮料第6個月，與使用開始時相比 車又柔毛減夕7%以上，又直徑6〇 μιη以上之粗毛則增加ι〇% 、 進而直從8 0 μιη以上之粗毛增加了 5 %以上。若連 續使用含有腺芽之生髮料，則與使用含尼古丁酸醯胺的生 髮料時相比，該等粗毛之增加量明顯較高。其結果示於圖7。 再者，分析對於含有腺苷之生髮料與含尼古丁酸醯胺的 生髮料之毛髮密度的效果，並未認可於兩者之間統計學上 的有w義差距（資料並未顯示）。故而可清楚得知，於培養毛鲁 乳頭細胞中表示FGF_7表現亢進效果之腺苷對於毛髮之粗 厚化的維持•促進特別有效。 含有腺苷之生髮料（組成υ 成分 添加量（質量％) 腺苷 0.75 異硬脂醇 0.50 聚氧化乙烯硬化蓖麻油 0.50 乙烯基吡咯烷酮-Ν，Ν-二甲基 乙基異丁烯酸共聚物二乙基硫酸鹽液 〇.50 二丙二醇 10.0 乙醇 50.0 精製水 剩餘量 DL-蘋果酸 適量 含尼古丁酸醯胺的生髮料（組合物2) 成分 添加量（質量％) 97465.doc -19- 200529877 尼古丁酸醯胺 0.10 異硬脂醇 0.50 聚氧化乙烯硬化蓖麻油 0.50 乙烯基吡咯烷酮-Ν，Ν-二甲基 乙基異丁烯酸共聚物二乙基硫酸鹽液 0.50 二丙二醇 10.0 乙醇 50.0 精製水 剩餘量 DL-相果酸 適量 實驗5:定量PCR實驗之FGF-7之表現亢進的研究（4) 與實驗1同樣，其中使用人類不死化毛乳頭細胞（藉由由 曰本專利特開平11-89565號公報所揭示之SV40 large T抗原 基因所引起之形質轉換所獲得之不死化人類毛乳頭細胞） 作為DPC，並將藥劑處理時間設為2小時，從而施行RT-PCR 實驗。 其結果示於圖8。如該圖所明示，即使使用人類之不死化 毛乳頭細胞作為毛乳頭細胞，亦可確認藉由腺普之FGF-7 之表現亢進。故而清楚可知，於FGF-7表現亢進劑之篩選 中’亦可使用人類不死化毛乳頭細胞。 實驗6:定量PCR實驗之FGF-7之表現亢進的研究（5) 1)細胞之培養 人類外毛根鞘細胞（outer root sheath cell:〇RS)使用由作 為整形手術之副產物而產生之人類頭皮經單離·培養後束 結保存之源自40歲女性的0RS。以細胞密度成為丨n 5χ 1〇4 97465.doc -20- 200529877 個/cm之方式播種，並於Κ-SFM培養基（GIBCO)中，於 37 C、5%C02之條件下培養。於24孔盤將p3i〇RSa 2 〇χ1〇4 個/孔之密度播種，3天後，於亞密集之細胞將腺苷交換為 溶解於10或1〇〇 μΜ之濃度的KBM培養基0今水。對照 組細胞僅使用KBM培養基，並實行同樣處 理。而RT-PCD與 實驗1同樣地實行。 其結果示於圖9。如該圖所明示，可認為即使於藉由腺苷 所處理之外毛根鞘細胞，亦與毛乳頭細胞同樣，FGF-7之表 現亢進較顯著。 [產業上之可利用性] 本發明可提供一種具有維持·促進毛髮粗厚化效果的方 法以及用於該方法之組合物。 【圖式簡單說明】 圖1係表示將毛乳頭細胞處之腺苷之FGF-7表現亢進效果 作為FGF-7表現量（相對值）。 圖2係表示將毛乳頭細胞處之腺苷之fgf-7表現亢進效果 作為藥劑添加3小時後之FGF- 7相對表現量。 圖3係表示將毛乳頭細胞處之腺苷類似物質之fgf_7表現 充進效果作為藥劑添加2小時後之FGF-7相對表現量（即時 PCR ·· n=4)。 圖4係表示將毛乳頭細胞處之黃烷酮之fgf-7表現亢進效 果作為藥劑添加2小時後之FGF-7相對表現量（即時PCR : n=4) 〇 圖5係表示將毛乳頭細胞處之3,4，_二甲基黃烷酮之FGF-7 97465.doc -21 - 200529877 表現亢進效果作為藥劑添加2小時後之FGF_7相對表現量 (即時PCR : n=3)。 圖6係表示將毛乳頭細胞處之3-甲基黃烷酮之FGF-7表現 完進效果作為藥劑添加2小時後之FGF-7相對表現量（即時 PCR : n=4) 〇 圖7係表示含有腺苷之生髮料的粗厚化效果（8〇 μιη以上 之粗厚率）。 圖8係表示將人類不死化毛乳頭細胞處之腺苷之FGF-7表 現宄進效果作為藥劑添加2小時後之FGF-7相對表現量。 圖9係表示將外毛根鞘細胞處之腺苷之fgf-7表現亢進效 果作為藥劑添加3小時後之FGF-7相對表現量。 97465.doc -22- 200529877

Cl 10>日商資生堂股份有限公司 <120>毛髮粗厚化之方法及組合物 <130> P907 <140〉 093134541 <141〉 2004-1卜11 <150> JP2003-381470 <151〉 2003-11-11 <160〉 6 <210> 1 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列 <223〉前向引子 <400> 1 catgaacacc cggagcacta c <210〉 2 <211〉 25 <212> DNA <213〉人工序列 <223〉反向引子 <400> 2 cactgtgttc gacagaagag tcttc <210> 3 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <223〉前向引子 <400> 3 cacaaatgga tact^acatg ga 97465.doc 200529877 <210〉 4 <211> 22 <212〉DM <213〉人工序列 <223〉反向引子 <400〉 4 tcactcttat atcccctcct tc <210> 5 <211> 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <223〉前向引子 <400〉 5 ctttgctcta cagatcatgc tttc <210> 6 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <223>反向引子 22

24 <400> 6 ttgccatagg aagaaagtgs gctg 24

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Claims (1)

1. 200529877 十、申請專利範圍： 一種維持⑯進毛髮粗厚化之方法，其特徵在於：其係 進毛囊、、田胞中之角化細胞增殖因子（FGF-7)之表現。 2 . 如請求項1之方、、:^ , ' & ’其中藉由塗布皮膚外用劑於頭皮而亢 進上述毛囊細胞中F购之表現，該皮膚外用劑含有選自 由腺普腺普碟酸，腺苦5，-磷酸鹽、CCPA(2_氣·Ν6-f 戊基腺普）、C1-IB-MECA(2-氣-Ν6-(3·破节基）-9-[5-(甲 基胺甲醯基）-β-Ε)“夫喃核糖基]腺嗓吟）以及neca⑻乙基 叛土酿胺基腺普）所構成之群的宄進毛囊細胞中之FGF-7 表現的一種或多種藥劑。 如响求項2之方法’其中亢進上述毛囊細胞中之表 現之藥劑之至少一種為腺苷。 4·如明求項1至3中任一項之方法，其中上述毛囊細胞為毛 乳頭細胞或外毛根鞘細胞。 5· —種亢進FGF-7表現之組合物，其特徵在於：其含有選自 由膝芽、腺苦5，-磷酸，腺苷5，_磷酸鹽、CCpA、CMb_meca 以及NEC A所構成之群的藥劑作為活性成分。 6·如，月求項5之組合物，其中上述藥劑之至少一種藥劑為腺 苷。 7.如請求項5或6之組合物，其中其係藉由塗布於頭皮之處 理而維持·促進毛髮粗厚化之皮膚外用劑。 8· —種方法，其係維持·促進毛髮粗厚化之藥劑的篩選方 法，其特徵在於：將待選藥劑應用於細胞，而選定亢進 該細胞之FGF-7表現的藥劑。 97465.doc 200529877 9. 如請求項8之方法，其中上述細胞之FGF-7表現亢進係藉 由測定編碼自細胞所萃取之FGF-7的mRNA之量而決定。 10. 如請求項8或9之方法，其中上述細胞為毛乳頭細胞、不 死化毛乳頭細胞或外毛根鞠細胞。

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