JPWO2005044205A1 - 毛髪の太毛化の方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子(FGF−7)の発現を亢進させることにより毛髪の太毛化を維持・促進する方法、並びにアデノシン及び/又はその誘導体を含有するFGF−7の発現を亢進させる組成物、特に毛髪の太毛化を維持・促進するための頭皮外用剤を提供する。
Description
本発明は毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子(FGF−7)の発現を亢進させることにより毛髪の太毛化を維持・促進する方法、及びFGF−7の発現を亢進させる組成物、特に毛髪の太毛化を維持・促進するための頭皮外用剤に関する。
高齢化社会、ストレス社会といわれる現代社会では、頭部毛髪が様々な原因により脱毛の危機にさらされる機会がますます多くなってきている。これに対応して、より優れた「育毛料」を提供すべく様々な試みがなされている。育毛料が毛髪に与える効果として主なものに、1)発毛誘導効果(発毛促進効果,成長期誘導効果)、2)毛髪の太さを維持する又はその太さを太くする、即ち、太毛化効果、3)毛髪成長期延長効果、4)5α−レダクターゼ阻害効果(退行期早期移行抑制効果)、5)血行促進効果、6)殺菌効果、7)フケ防止効果、8)保湿効果、9)抗酸化効果等が挙げられる。
男性型脱毛は、毛髪成長期の短縮により毛包が矮小化し、毛髪径が次第に減少してうぶ毛に変化することによって特徴づけられ、男性型脱毛者では、毛髪密度(単位面積当たりの毛髪数)の減少はほとんど認められないのに対し、毛髪径が極端に減少するという事実が見出されている(特開2002−322094号公報)。この事実に基づき、発毛誘導のみならず、上記太毛化効果の重要性にも注目されている。
しかしながら、毛髪の太毛化にどのようなメカニズムが関与しているかについては生化学・分子生物学レベルにおいて未だ解明に至っておらず、その結果、太毛化の維持・促進に有効な薬剤を含有する育毛料の研究・開発も模索段階にあるといえよう。毛髪の太毛化のメカニズムが十分に解明できれば、既存の育毛料に比べ一層顕著な効果を奏するものの提供が可能となり得る。
男性型脱毛は、毛髪成長期の短縮により毛包が矮小化し、毛髪径が次第に減少してうぶ毛に変化することによって特徴づけられ、男性型脱毛者では、毛髪密度(単位面積当たりの毛髪数)の減少はほとんど認められないのに対し、毛髪径が極端に減少するという事実が見出されている(特開2002−322094号公報)。この事実に基づき、発毛誘導のみならず、上記太毛化効果の重要性にも注目されている。
しかしながら、毛髪の太毛化にどのようなメカニズムが関与しているかについては生化学・分子生物学レベルにおいて未だ解明に至っておらず、その結果、太毛化の維持・促進に有効な薬剤を含有する育毛料の研究・開発も模索段階にあるといえよう。毛髪の太毛化のメカニズムが十分に解明できれば、既存の育毛料に比べ一層顕著な効果を奏するものの提供が可能となり得る。
本発明は、毛髪の太毛化のメカニズムの生化学レベルでの解明、さらには毛髪の太毛化を維持・促進する方法及びそのための皮膚外用組成物の提供を課題とする。
FGF−7は194個のアミノ酸から成る糖蛋白質で、線維芽細胞増殖因子のファミリーに属する成長因子の一つである。間葉系細胞である皮膚線維芽細胞などで分泌され、表皮細胞に存在する特異的レセプターであるFGFR2 IIIbに結合してパラクラインにその増殖を促進することはよく知られた事実である(Rubin J.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86:802−806;Marchese Cら、J.Cell Physiol.1990,144:326−332など)。また、表皮ケラチノサイトのみならず、肝実質細胞、腸管上皮細胞(Houseley R.Mら、J.Clin.Invest.1994,94:1764−1777)など広く上皮系細胞の増殖を促進し、毛包のケラチノサイトもこのFGF−7により増殖が促進されることが示されている(Pierce G.F.ら、J.Exp.Med.1994,179:831−840)。また、マウスの実験からFGF−7が成長期の毛乳頭細胞で発現し、その機能表現に必須であるレセプターFGFR2が毛乳頭近傍の毛母で発現していることが示され(Dev.Dyn.1996;205(4):379−386)、毛成長にFGF−7が関与していることが示唆されている。しかしながら、FGF−7が毛成長においてどのような役割を果たしているかは解明されていない。そこで我々は、毛乳頭細胞においてFGF−7の発現を亢進させれば、そのターゲット細胞と考えられる毛母細胞などの増殖を介して、毛髪成長期延長作用による太毛化につながるのではないかという作業仮説を立てた。
まず、様々な薬剤を毛乳頭細胞などに作用させてFGF−7の発現を上昇させるものを探索したところ、アデノシン及びその誘導体がFGF−7遺伝子の発現を亢進させることがわかった。次に、アデノシンについての臨床試験を行ったところ、驚くべきことに太毛化効果をも有することが見出された。太毛化の維持・促進には特開2002−322094号公報に記載の通り、毛髪成長期延長により毛成長促進作用効果を発揮する成分(例えばクララ属植物エキス)、退行期への早期移行を抑制することにより脱毛防止作用効果を発揮する成分(例えばテストテロン)、及び休止期から成長期に至る誘導作用効果を発揮する成分(例えば、デシルテトラデシルアミンオキシド)の少なくとも3種の成分が必要であると考えられていたため、単独化合物がこのような効果を奏することは驚くべきことである。
FGF−7の毛乳頭細胞などにおける発現が亢進されるといった事実は初めて見出されたものであり、ましてやその発現の亢進が毛髪の太毛化に関与するといった事実は全く初めて見出されたものである。
従って、本発明は、毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子(FGF−7)の発現を亢進させることを特徴とする、毛髪の太毛化を維持・促進する方法を提供する。
毛包の細胞におけるFGF−7の発現の亢進は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン5’−リン酸、アデノシン5’−リン酸の塩、並びにCCPA(2−クロロ−N6−シクロペンチルアデノシン)、Cl−IB−MECA(2−クロロ−N6−(3−ヨードベンジル)−9−[5−(メチルカルバモイル)−β−D−リボフラノシル]アデニン)及びNECA(N−エチルカルボキシアミドアデノシン)から成る群から選ばれる毛包の細胞におけるFGF−7の発現を亢進させる1又は複数種の薬剤(以下、「FGF−7発現亢進剤」と称する場合がある)を含有する皮膚外用剤を頭皮に塗布することにより達成される。好ましくは、前記薬剤はアデノシンである。
別の観点において、本発明は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン5’−リン酸、アデノシン5’−リン酸の塩、並びにCCPA、Cl−IB−MECA及びNECAから成る群から選ばれる薬剤を活性成分として含有するFGF−7発現亢進組成物を提供する。
好適な態様において、FGF−7の発現が亢進されるのは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞である。
好適な態様において、前記薬剤はアデノシンである。
好適な態様において、前記組成物は頭皮に塗布することにより毛髪の太毛化を維持・促進させる皮膚外用剤である。
更なる別の観点において、本発明は毛髪の太毛化を維持・促進させる薬剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を細胞、好ましくは毛包の細胞、より好ましくは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞に適用し、当該細胞のFGF−7の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、毛乳頭細胞は不死化毛乳頭細胞である。
好適な態様において、上記細胞のFGF−7の発現の亢進は、細胞中のFGF−7の量を測定することにより決定される。
さらに好適な態様において、上記測定はFGF−7に特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法による。
さらに好適な態様において、上記細胞のFGF−7の発現の亢進は、細胞から抽出されたFGF−7をコードするmRNAの量を測定することにより決定される。
さらに好適な態様において、上記mRNAの測定はRT−PCR法(逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法)により行う。
本発明は、毛髪の太毛化の維持・促進に効果的な方法及びそのための組成物の提供を可能にする。
FGF−7は194個のアミノ酸から成る糖蛋白質で、線維芽細胞増殖因子のファミリーに属する成長因子の一つである。間葉系細胞である皮膚線維芽細胞などで分泌され、表皮細胞に存在する特異的レセプターであるFGFR2 IIIbに結合してパラクラインにその増殖を促進することはよく知られた事実である(Rubin J.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86:802−806;Marchese Cら、J.Cell Physiol.1990,144:326−332など)。また、表皮ケラチノサイトのみならず、肝実質細胞、腸管上皮細胞(Houseley R.Mら、J.Clin.Invest.1994,94:1764−1777)など広く上皮系細胞の増殖を促進し、毛包のケラチノサイトもこのFGF−7により増殖が促進されることが示されている(Pierce G.F.ら、J.Exp.Med.1994,179:831−840)。また、マウスの実験からFGF−7が成長期の毛乳頭細胞で発現し、その機能表現に必須であるレセプターFGFR2が毛乳頭近傍の毛母で発現していることが示され(Dev.Dyn.1996;205(4):379−386)、毛成長にFGF−7が関与していることが示唆されている。しかしながら、FGF−7が毛成長においてどのような役割を果たしているかは解明されていない。そこで我々は、毛乳頭細胞においてFGF−7の発現を亢進させれば、そのターゲット細胞と考えられる毛母細胞などの増殖を介して、毛髪成長期延長作用による太毛化につながるのではないかという作業仮説を立てた。
まず、様々な薬剤を毛乳頭細胞などに作用させてFGF−7の発現を上昇させるものを探索したところ、アデノシン及びその誘導体がFGF−7遺伝子の発現を亢進させることがわかった。次に、アデノシンについての臨床試験を行ったところ、驚くべきことに太毛化効果をも有することが見出された。太毛化の維持・促進には特開2002−322094号公報に記載の通り、毛髪成長期延長により毛成長促進作用効果を発揮する成分(例えばクララ属植物エキス)、退行期への早期移行を抑制することにより脱毛防止作用効果を発揮する成分(例えばテストテロン)、及び休止期から成長期に至る誘導作用効果を発揮する成分(例えば、デシルテトラデシルアミンオキシド)の少なくとも3種の成分が必要であると考えられていたため、単独化合物がこのような効果を奏することは驚くべきことである。
FGF−7の毛乳頭細胞などにおける発現が亢進されるといった事実は初めて見出されたものであり、ましてやその発現の亢進が毛髪の太毛化に関与するといった事実は全く初めて見出されたものである。
従って、本発明は、毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子(FGF−7)の発現を亢進させることを特徴とする、毛髪の太毛化を維持・促進する方法を提供する。
毛包の細胞におけるFGF−7の発現の亢進は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン5’−リン酸、アデノシン5’−リン酸の塩、並びにCCPA(2−クロロ−N6−シクロペンチルアデノシン)、Cl−IB−MECA(2−クロロ−N6−(3−ヨードベンジル)−9−[5−(メチルカルバモイル)−β−D−リボフラノシル]アデニン)及びNECA(N−エチルカルボキシアミドアデノシン)から成る群から選ばれる毛包の細胞におけるFGF−7の発現を亢進させる1又は複数種の薬剤(以下、「FGF−7発現亢進剤」と称する場合がある)を含有する皮膚外用剤を頭皮に塗布することにより達成される。好ましくは、前記薬剤はアデノシンである。
別の観点において、本発明は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン5’−リン酸、アデノシン5’−リン酸の塩、並びにCCPA、Cl−IB−MECA及びNECAから成る群から選ばれる薬剤を活性成分として含有するFGF−7発現亢進組成物を提供する。
好適な態様において、FGF−7の発現が亢進されるのは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞である。
好適な態様において、前記薬剤はアデノシンである。
好適な態様において、前記組成物は頭皮に塗布することにより毛髪の太毛化を維持・促進させる皮膚外用剤である。
更なる別の観点において、本発明は毛髪の太毛化を維持・促進させる薬剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を細胞、好ましくは毛包の細胞、より好ましくは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞に適用し、当該細胞のFGF−7の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、毛乳頭細胞は不死化毛乳頭細胞である。
好適な態様において、上記細胞のFGF−7の発現の亢進は、細胞中のFGF−7の量を測定することにより決定される。
さらに好適な態様において、上記測定はFGF−7に特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法による。
さらに好適な態様において、上記細胞のFGF−7の発現の亢進は、細胞から抽出されたFGF−7をコードするmRNAの量を測定することにより決定される。
さらに好適な態様において、上記mRNAの測定はRT−PCR法(逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法)により行う。
本発明は、毛髪の太毛化の維持・促進に効果的な方法及びそのための組成物の提供を可能にする。
図1は、毛乳頭細胞におけるアデノシンのFGF−7発現亢進効果を、FGF−7発現量(相対値)として示す。
図2は、毛乳頭細胞におけるアデノシンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加3時間後のFGF−7相対発現量として示す。
図3は、毛乳頭細胞におけるアデノシン類縁物質のFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す(Real Time PCR:n=4)。
図4は、毛乳頭細胞におけるフラバノンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す(Real Time PCR:n=4)。
図5は、毛乳頭細胞における3,4’−ジメチルフラバノンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す(Real Time PCR:n=3)。
図6は、毛乳頭細胞における3−メチルフラバノンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す(Real Time PCR:n=4)。
図7は、アデノシン含有育毛料の太毛化効果(80μm以上の太毛率)を示す。
図8は、ヒト不死化毛乳頭細胞におけるアデノシンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す。
図9は、外毛根鞘細胞におけるアデノシンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加3時間後のFGF−7相対発現量として示す。
図2は、毛乳頭細胞におけるアデノシンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加3時間後のFGF−7相対発現量として示す。
図3は、毛乳頭細胞におけるアデノシン類縁物質のFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す(Real Time PCR:n=4)。
図4は、毛乳頭細胞におけるフラバノンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す(Real Time PCR:n=4)。
図5は、毛乳頭細胞における3,4’−ジメチルフラバノンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す(Real Time PCR:n=3)。
図6は、毛乳頭細胞における3−メチルフラバノンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す(Real Time PCR:n=4)。
図7は、アデノシン含有育毛料の太毛化効果(80μm以上の太毛率)を示す。
図8は、ヒト不死化毛乳頭細胞におけるアデノシンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加2時間後のFGF−7相対発現量として示す。
図9は、外毛根鞘細胞におけるアデノシンのFGF−7発現亢進効果を、薬剤添加3時間後のFGF−7相対発現量として示す。
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子(FGF−7)の発現を亢進させることを特徴とする、毛髪の太毛化を維持・促進する方法を提供する。
本発明でいう太毛化とは、一般に毛根の矮小化によるうぶ毛化が抑制され、毛髪の太さが維持される又は太くなることをいう。太毛化効果の有無の判定は、毛髪の太さや質に個人差があり、従って個人別にされることが好ましいが、一般には、頭部の所定面積の領域、例えば1cm2、2cm2、5cm2における所定の直径の毛髪、例えば直径40μm、60μm、80μm又は100μm以上の毛髪の本数が、本発明に係るFGF−7発現亢進剤の頭皮への適用、例えば1ヶ月、3ヶ月、又は6ヶ月以上の継続的な適用の結果、実質的に減少しなかった場合、例えばその減少率が10%未満、好ましくは5%未満の場合、太毛が維持されたと判定され、例えば直径40μm、60μm、80μm又は100μmの毛髪の本数が実質的に増加した場合、例えばその増加率が5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上の場合、太毛化が促進されたものと判定できる。
毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるFGF−7の発現の亢進は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン5’−リン酸、アデノシン5’−リン酸の塩、並びにCCPA、Cl−IB−MECA及びNECAから成る群から選ばれる毛包の細胞におけるFGF−7の発現を亢進させる1又は複数種の薬剤を含有する皮膚外用剤を頭皮に塗布することにより達成される。
アデノシンは、リボヌクレオシドの一つで塩基部分にプリン誘導体であるアデニンを含むものである。アデノシン5’−リン酸は、5’−アデニル酸とも呼ばれ、アデノシンのリボースの5’位のヒドロキシル基にリン酸が1分子結合したヌクレオチドである。
また、アデノシン5’−リン酸の塩において、塩を形成する対イオンとしては、酸と対イオンを形成する物質であればいずれの物質でもよく、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等を挙げることができる。また、アデノシン5’−リン酸の塩としては、その水和物を使用することもできる。
CCPA、Cl−IB−MECA、NECAはアデノシン類縁物資である。CCPA、Cl−IB−MECA、NECAはシグマ社から入手できる。
上記アデノシン、アデノシン5’−リン酸及びアデノシン5’−リン酸の塩、CCPA、Cl−IB−MECA及びNECAは試薬として市販されているものを使用することができる。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物は、皮膚外用剤、好ましくは頭皮外用剤、例えば育毛料又は養毛料であり得る。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物は、上記FGF−7発現亢進剤を全量中、例えば0.01〜20.0質量%、好ましくは0.1〜10.0質量%で含む。この配合量が当該組成物の全量の0.01質量%未満では上記成分による太毛化効果が十分に発揮されないため好ましくなく、また20.0質量%を超えると調剤上支障をきたす傾向が顕著となり、好ましくない場合がある。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は、皮膚に直接に塗布または散布する経皮投与により投与することができる。また、その投与量は、外用剤の具体的態様、使用者の年齢、症状等により変化するので明確には特定することはできないが、ヒトに投与する場合、上記FGF−7発現亢進剤が、体重1Kgおよび1日当り、一般に0.01〜100.0mg、好ましくは0.1〜10.0mg投与されるような量であり、この量を1日1回又は2〜4回に分けて投与することが好ましい。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は、ヒトを始めとする哺乳動物において、優れた太毛化維持・促進作用を示し、ヘアーケアー用の医薬品、医薬部外品又は化粧品として有用である。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤が採り得る剤型は、好ましくは外皮に適用可能な外用剤の剤型、例えば、液状、乳液状、クリーム状、エアゾール状等の剤型を選択することができる。また、本発明の組成物の形態も任意であり、例えば、トニック、ヘアークリーム、ムース、シャンプー、リンス、乳液、化粧水、パック、エアゾール剤等の形態を採ることができる。本発明の組成物は外皮に塗布して使用するのが特に好ましい。塗布方法は特に限定されるものではないが、例えば頭皮に1日1回以上、例えば1日1から3回、塗布する皮膚面積に応じて適量、例えば1〜5ml塗布するのが好ましい。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤においては、必須成分である上記香料に加えて、必要に応じて、かつ本発明の所期の効果を損なわない限り、化粧品、医薬部外品、医薬品等において一般的に用いられる、各種の油性又は水性成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色剤、各種の薬剤等を配合することができる。
例えば、高級脂肪酸、固形パラフィン、流動パラフィン、シリコーン油、スクワラン、モノオレイン酸グリセリル、オリーブ油、イソプロピルミリステート、高級アルコール等の油分;グリセリン、ヒアルロン酸、プロピレングリコール、マルチトール、アテロコラーゲン、乳酸ナトリウム等の保湿剤;マルメロ粘質物、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム等の増粘剤;ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、ビタミンEアセテート、センブリ抽出物、塩化カルプロニウム、アセチルコリン誘導体等の血管拡張剤;セリン、メチオニン、アルギニン等のアミノ酸類;ビタミンB6、ビタミンE類、ビオチン、パントテン酸類等のビタミン類;ニコチン酸、ニコチン酸メチル、ニコチン酸トコフェロール等のニコチン酸エステル類;セファランチン等の皮膚機能亢進剤;エストラジオール等の女性ホルモン剤;グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、アズレン等の消炎剤;ヒノキチオール、ヘキサクロロフェン、ベンザルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、ウンデシレン酸、トリクロロカルバニリド、ビチオノール等の抗菌剤;メントール等の清涼剤;サリチル酸、亜鉛類、乳酸類等;クエン酸等の有機酸類を配合することができる。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は更に上記FGF−7発現亢進剤以外で育毛作用が認められている、既知の育毛成分、例えばミノキシジル、サイクロスポリン等を加えることにより、さらに効果的な育毛効果が期待され得る。
本発明は更に毛髪の太毛化を維持・促進させる薬剤のスクリーニング方法を提供する。この方法は、候補薬剤を細胞、好ましくは毛包の細胞、より好ましくは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞に適用し、当該細胞のFGF−7の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする。
毛乳頭細胞として、ヒト由来の正常な毛乳頭細胞、あるいは入手が容易であり、しかも増殖速度が速い点で有利な不死化毛乳頭細胞、例えば特開平11−89565号公報に記載のとおり、SV40 large T抗原遺伝子による形質転換により得られる不死化ヒト毛乳頭細胞などを使用することもできる。また、スクリーニングに際しては、毛乳頭細胞の他に、FGF−7を産生する間葉系細胞、例えばヒトから単離される皮膚線維芽細胞や、他の毛包由来の細胞、例えば外毛根鞘細胞などを用いることもできる。
細胞中のFGF−7発現の亢進は、例えば細胞中のFGF−7の量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はヒトFGF−7に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばELISA法、RIA法等、様々な方法により実施できる。また、細胞からRNAを抽出し、ヒトFGF−7をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は逆転写反応後、定量ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR)により行われる。例えば、定量PCRは以下のプライマーの組み合わせを利用して実施できる。
組み合わせ1
PCR産物の大きさ:251bp
組み合わせ2
PCR産物の大きさ:196bp(J Clin Endocrinol Metab 88(2),773−,2003)
組み合わせ3
PCR産物の大きさ:543bp(J Clin Invest 92,2408−,1993)
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、この実施例により、本発明の技術的範囲が限定的に解釈されるべきものではない。なお、以下の実施例等で、配合量を表す数値は、特に断わらない限り、配合される対象全体に対する質量%で表される。
本発明は、毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子(FGF−7)の発現を亢進させることを特徴とする、毛髪の太毛化を維持・促進する方法を提供する。
本発明でいう太毛化とは、一般に毛根の矮小化によるうぶ毛化が抑制され、毛髪の太さが維持される又は太くなることをいう。太毛化効果の有無の判定は、毛髪の太さや質に個人差があり、従って個人別にされることが好ましいが、一般には、頭部の所定面積の領域、例えば1cm2、2cm2、5cm2における所定の直径の毛髪、例えば直径40μm、60μm、80μm又は100μm以上の毛髪の本数が、本発明に係るFGF−7発現亢進剤の頭皮への適用、例えば1ヶ月、3ヶ月、又は6ヶ月以上の継続的な適用の結果、実質的に減少しなかった場合、例えばその減少率が10%未満、好ましくは5%未満の場合、太毛が維持されたと判定され、例えば直径40μm、60μm、80μm又は100μmの毛髪の本数が実質的に増加した場合、例えばその増加率が5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上の場合、太毛化が促進されたものと判定できる。
毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるFGF−7の発現の亢進は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン5’−リン酸、アデノシン5’−リン酸の塩、並びにCCPA、Cl−IB−MECA及びNECAから成る群から選ばれる毛包の細胞におけるFGF−7の発現を亢進させる1又は複数種の薬剤を含有する皮膚外用剤を頭皮に塗布することにより達成される。
アデノシンは、リボヌクレオシドの一つで塩基部分にプリン誘導体であるアデニンを含むものである。アデノシン5’−リン酸は、5’−アデニル酸とも呼ばれ、アデノシンのリボースの5’位のヒドロキシル基にリン酸が1分子結合したヌクレオチドである。
また、アデノシン5’−リン酸の塩において、塩を形成する対イオンとしては、酸と対イオンを形成する物質であればいずれの物質でもよく、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等を挙げることができる。また、アデノシン5’−リン酸の塩としては、その水和物を使用することもできる。
CCPA、Cl−IB−MECA、NECAはアデノシン類縁物資である。CCPA、Cl−IB−MECA、NECAはシグマ社から入手できる。
上記アデノシン、アデノシン5’−リン酸及びアデノシン5’−リン酸の塩、CCPA、Cl−IB−MECA及びNECAは試薬として市販されているものを使用することができる。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物は、皮膚外用剤、好ましくは頭皮外用剤、例えば育毛料又は養毛料であり得る。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物は、上記FGF−7発現亢進剤を全量中、例えば0.01〜20.0質量%、好ましくは0.1〜10.0質量%で含む。この配合量が当該組成物の全量の0.01質量%未満では上記成分による太毛化効果が十分に発揮されないため好ましくなく、また20.0質量%を超えると調剤上支障をきたす傾向が顕著となり、好ましくない場合がある。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は、皮膚に直接に塗布または散布する経皮投与により投与することができる。また、その投与量は、外用剤の具体的態様、使用者の年齢、症状等により変化するので明確には特定することはできないが、ヒトに投与する場合、上記FGF−7発現亢進剤が、体重1Kgおよび1日当り、一般に0.01〜100.0mg、好ましくは0.1〜10.0mg投与されるような量であり、この量を1日1回又は2〜4回に分けて投与することが好ましい。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は、ヒトを始めとする哺乳動物において、優れた太毛化維持・促進作用を示し、ヘアーケアー用の医薬品、医薬部外品又は化粧品として有用である。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤が採り得る剤型は、好ましくは外皮に適用可能な外用剤の剤型、例えば、液状、乳液状、クリーム状、エアゾール状等の剤型を選択することができる。また、本発明の組成物の形態も任意であり、例えば、トニック、ヘアークリーム、ムース、シャンプー、リンス、乳液、化粧水、パック、エアゾール剤等の形態を採ることができる。本発明の組成物は外皮に塗布して使用するのが特に好ましい。塗布方法は特に限定されるものではないが、例えば頭皮に1日1回以上、例えば1日1から3回、塗布する皮膚面積に応じて適量、例えば1〜5ml塗布するのが好ましい。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤においては、必須成分である上記香料に加えて、必要に応じて、かつ本発明の所期の効果を損なわない限り、化粧品、医薬部外品、医薬品等において一般的に用いられる、各種の油性又は水性成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色剤、各種の薬剤等を配合することができる。
例えば、高級脂肪酸、固形パラフィン、流動パラフィン、シリコーン油、スクワラン、モノオレイン酸グリセリル、オリーブ油、イソプロピルミリステート、高級アルコール等の油分;グリセリン、ヒアルロン酸、プロピレングリコール、マルチトール、アテロコラーゲン、乳酸ナトリウム等の保湿剤;マルメロ粘質物、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム等の増粘剤;ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、ビタミンEアセテート、センブリ抽出物、塩化カルプロニウム、アセチルコリン誘導体等の血管拡張剤;セリン、メチオニン、アルギニン等のアミノ酸類;ビタミンB6、ビタミンE類、ビオチン、パントテン酸類等のビタミン類;ニコチン酸、ニコチン酸メチル、ニコチン酸トコフェロール等のニコチン酸エステル類;セファランチン等の皮膚機能亢進剤;エストラジオール等の女性ホルモン剤;グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、アズレン等の消炎剤;ヒノキチオール、ヘキサクロロフェン、ベンザルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、ウンデシレン酸、トリクロロカルバニリド、ビチオノール等の抗菌剤;メントール等の清涼剤;サリチル酸、亜鉛類、乳酸類等;クエン酸等の有機酸類を配合することができる。
本発明に係るFGF−7発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は更に上記FGF−7発現亢進剤以外で育毛作用が認められている、既知の育毛成分、例えばミノキシジル、サイクロスポリン等を加えることにより、さらに効果的な育毛効果が期待され得る。
本発明は更に毛髪の太毛化を維持・促進させる薬剤のスクリーニング方法を提供する。この方法は、候補薬剤を細胞、好ましくは毛包の細胞、より好ましくは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞に適用し、当該細胞のFGF−7の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする。
毛乳頭細胞として、ヒト由来の正常な毛乳頭細胞、あるいは入手が容易であり、しかも増殖速度が速い点で有利な不死化毛乳頭細胞、例えば特開平11−89565号公報に記載のとおり、SV40 large T抗原遺伝子による形質転換により得られる不死化ヒト毛乳頭細胞などを使用することもできる。また、スクリーニングに際しては、毛乳頭細胞の他に、FGF−7を産生する間葉系細胞、例えばヒトから単離される皮膚線維芽細胞や、他の毛包由来の細胞、例えば外毛根鞘細胞などを用いることもできる。
細胞中のFGF−7発現の亢進は、例えば細胞中のFGF−7の量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はヒトFGF−7に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばELISA法、RIA法等、様々な方法により実施できる。また、細胞からRNAを抽出し、ヒトFGF−7をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は逆転写反応後、定量ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR)により行われる。例えば、定量PCRは以下のプライマーの組み合わせを利用して実施できる。
組み合わせ1
PCR産物の大きさ:251bp
組み合わせ2
PCR産物の大きさ:196bp(J Clin Endocrinol Metab 88(2),773−,2003)
組み合わせ3
PCR産物の大きさ:543bp(J Clin Invest 92,2408−,1993)
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、この実施例により、本発明の技術的範囲が限定的に解釈されるべきものではない。なお、以下の実施例等で、配合量を表す数値は、特に断わらない限り、配合される対象全体に対する質量%で表される。
実験1:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(1)
1)細胞の培養
ヒト毛乳頭細胞(dermal papillae cell;DPC)は整形手術の副産物として生じたヒト頭皮より単離・培養後凍結保存しておいた34歳女性由来のDPCを用いた。細胞密度が1.0〜1.5x104個/cm2になるように播種し、MEM(GIBCO)+10%FBS中、37℃、5%CO2の条件下で培養した。2回/週の割合で培地交換を行い、細胞が集密に達したときは(播種から10日〜20日後)0.25%トリプシンで細胞をディッシュから剥がして回収し、再び1.0〜1.5x104個/cm2の密度で播種した。
2)培養細胞の薬剤処理
解凍後1−3回継代・培養したDPCを24ウェルプレートに4.0x104個/ウェルの密度で播種し、4日後、亜集密の細胞にアデノシンを100μMの濃度に溶解したMEM(血清無添加)に交換した。コントロール細胞は、MEM(血清無添加)のみを用い、同様に処理した。
3)RT−PCR
アデノシン添加の2、4、8、24時間後、MagNAPureLC(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で培養細胞からmRNAを抽出し、逆転写酵素SuperScriptII(Invitrogen)のキットを用いてcDNAを合成した。cDNAを鋳型にLightCycler(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で二重鎖DNAの副溝に結合する蛍光色素CyberGreen Iを用いたリアルタイムPCRにより発現量の比較を行った。詳しくは、LightCycler−FastStart DNAマスターSYBR Green Iキット(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用い、添付のマニュアルに従って全量20μlの反応液(MgCl2 2mM,Forward及びReverse Primer各0.25μM)を調製し、LightCyclerでPCR反応(酵素活性化95℃/10分、熱変性95℃/15秒、アニーリング58℃/5秒、伸長反応72℃/10秒、熱変性〜伸長反応サイクルを40回)を行い、各サイクルの伸長反応終了時の蛍光強度をモニタリングした。この蛍光強度はその時点におけるPCR産物量を反映している。遺伝子の発現量は、PCR産物の指数関数的増幅期において初期鋳型量AのPCR産物YがPCRのサイクル数Xに対してY=A×2Xを満たしながら増幅されるものと仮定して、一定量のPCR産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。以下に本研究で用いたFGF−7増幅用プライマーを示す。
PCR産物の大きさ:251bp
図1にその結果を示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された毛乳頭細胞においてFGF−7の発現の顕著な亢進が認められた。
実験2:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(2)
実験1と同様にして、但しアデノシンの濃度を10μM及び100μMの二通りとし、アデノシン処理時間を3時間として、RT−PCR実験を行った。その結果を図2に示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された毛乳頭細胞においてFGF−7の発現が、アデノシン濃度依存的に亢進することが確認された。
実験3−1:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(3)
実験1と同様にして、但しアデノシンの代わりにアデノシン類縁物質であるCCPA(2−クロロ−N6−シクロペンチルアデノシン)(100μM)、Cl−IB−MECA(2−クロロ−N6−(3−ヨードベンジル)−9−[5−(メチルカルバモイル)−β−D−リボフラノシル]アデニン)(50μM)又はNECA(N−エチルカルボキシアミドアデノシン)(10μM)を用い、薬剤処理時間を3時間として、RT−PCR実験を行った。(尚、薬剤の溶解性が低い場合には薬剤無添加のコントロールを含めた全ての薬剤入り培地においてDMSO終濃度が0.1%となるよう調製してもよい。)
その結果を図3に示す。この図から明らかなとおり、CCPA、Cl−IB−MECA又はNECAで処理された毛乳頭細胞においてもFGF−7の発現の顕著な亢進が認められた。
実験3−2:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(4)
実験1と同様にして、但しアデノシンの代わりにフラバノン、3,4’−ジメチルフラバノン(YGU427)、3−メチルフラバノン(YGU429)をそれぞれ100μMを用い、薬剤処理時間を2時間としてRT−PCR実験を施した。その結果を図4,5,6にそれぞれ示す。いずれもFGF−7遺伝子の発現亢進結果を示したが、アデノシンレセプターの阻害剤である8−SPT(8−スルフォニルテオフィリン)による阻害が認められないことから、FGF−7の発現亢進には必ずしもアデノシンレセプターが必要ではないことを示す。
実験4:アデノシンの毛髪に対する太毛化効果の検討
以上のFGF−7亢進効果の見出された各種薬剤のうち、アデノシンを、毛髪の太毛化効果について以下の方法で検討した。
下記の組成1を有するアデノシン含有育毛料及びコントロールとしての下記の組成2を有するニコチン酸アミド含有育毛料を、30〜50歳の男性型脱毛を呈する男性被験者(各群51名)の皮髪頭部に対し1日2回、適量(約2〜3ml)にて6ヶ月間にわたり塗布使用し、使用開始時との比較におけるアデノシンの太毛化効果について調べた。本実験においては、うぶ毛は40μm未満の直径を有する毛髪とし、直径60μm以上のものを太毛とし、直径80μm以上のものは顕著に太毛化した毛髪とした。アデノシン含有育毛料を使用してから6ヶ月目において、使用開始時と比べ、うぶ毛は7%以上減少し、また直径60μm以上の太毛は10%以上増加した。更に、直径80μm以上の太毛は5%以上増加した。アデノシン含有育毛料を継続的に使用すると、ニコチン酸アミド含有育毛料を使用したときと比べ、これらの太毛の増加量が顕著に高かった。その結果を図7に示す。
尚、アデノシン含有育毛料とニコチン酸アミド含有育毛料の毛髪密度に対する効果を調べたところ、両者の間に統計学的に有意な差は認められなかった(データーは示さない)。従って、培養毛乳頭細胞においてFGF−7発現亢進効果を示すアデノシンが特に毛髪の太毛化の維持・促進に有効であることが明らかとなった。
アデノシン含有育毛料(組成1)
成分 配合量(質量%)
アデノシン 0.75
イソステリルアルコール 0.50
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.50
ビニルピロリドン−N,N−ジメチル
エチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩液 0.50
ジプロピレングリコール 10.0
エタノール 50.0
精製水 残量
DL−リンゴ酸 適量
ニコチン酸アミド含有育毛料(組成2)
成分 配合量(質量%)
ニコチン酸アミド 0.10
イソステリルアルコール 0.50
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.50
ビニルピロリドン−N,N−ジメチル
エチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩液 0.50
ジプロピレングリコール 10.0
エタノール 50.0
精製水 残量
DL−リンゴ酸 適量
実験5:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(4)
実験1と同様に、但しDPCとしてヒト不死化毛乳頭細胞(特開平11−89565号公報に記載のSV40 large T抗原遺伝子による形質転換により得られる不死化ヒト毛乳頭細胞)を用い、薬剤処理時間を2時間として、RT−PCR実験を行った。
その結果を図8に示す。この図から明らかなとおり、毛乳頭細胞としてヒト不死化毛乳頭細胞を用いても、アデノシンによるFGF−7の発現の亢進が確認された。従って、FGF−7発現亢進剤のスクリーニングにおいて、ヒト不死化毛乳頭細胞を用いることもできることが明らかとなった。
実験6:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(5)
1)細胞の培養
ヒト外毛根鞘細胞(outer root sheath cell:ORS)は整形手術の副産物として生じたヒト頭皮より単離・培養後凍結保存しておいた40歳女性由来のORSを用いた。細胞密度が1.0〜1.5x104個/cm2になるように播種し、K−SFM培地(GIBCO)中、37℃、5%CO2の条件下で培養した。P3のORSを24ウェルプレートに2.0×104個/ウェルの密度で播種して3日後、亜集密の細胞にアデノシンを10又は100μMの濃度に溶解したKBM培地(クラボウ)に交換した。コントロール細胞は、KBM培地のみを用い、同様に処理した。RT−PCRは実験1と同様に行った。
図9にその結果を示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された外毛根鞘細胞においても、毛乳頭細胞と同様、FGF−7の発現の顕著な亢進が認められた。
1)細胞の培養
ヒト毛乳頭細胞(dermal papillae cell;DPC)は整形手術の副産物として生じたヒト頭皮より単離・培養後凍結保存しておいた34歳女性由来のDPCを用いた。細胞密度が1.0〜1.5x104個/cm2になるように播種し、MEM(GIBCO)+10%FBS中、37℃、5%CO2の条件下で培養した。2回/週の割合で培地交換を行い、細胞が集密に達したときは(播種から10日〜20日後)0.25%トリプシンで細胞をディッシュから剥がして回収し、再び1.0〜1.5x104個/cm2の密度で播種した。
2)培養細胞の薬剤処理
解凍後1−3回継代・培養したDPCを24ウェルプレートに4.0x104個/ウェルの密度で播種し、4日後、亜集密の細胞にアデノシンを100μMの濃度に溶解したMEM(血清無添加)に交換した。コントロール細胞は、MEM(血清無添加)のみを用い、同様に処理した。
3)RT−PCR
アデノシン添加の2、4、8、24時間後、MagNAPureLC(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で培養細胞からmRNAを抽出し、逆転写酵素SuperScriptII(Invitrogen)のキットを用いてcDNAを合成した。cDNAを鋳型にLightCycler(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で二重鎖DNAの副溝に結合する蛍光色素CyberGreen Iを用いたリアルタイムPCRにより発現量の比較を行った。詳しくは、LightCycler−FastStart DNAマスターSYBR Green Iキット(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用い、添付のマニュアルに従って全量20μlの反応液(MgCl2 2mM,Forward及びReverse Primer各0.25μM)を調製し、LightCyclerでPCR反応(酵素活性化95℃/10分、熱変性95℃/15秒、アニーリング58℃/5秒、伸長反応72℃/10秒、熱変性〜伸長反応サイクルを40回)を行い、各サイクルの伸長反応終了時の蛍光強度をモニタリングした。この蛍光強度はその時点におけるPCR産物量を反映している。遺伝子の発現量は、PCR産物の指数関数的増幅期において初期鋳型量AのPCR産物YがPCRのサイクル数Xに対してY=A×2Xを満たしながら増幅されるものと仮定して、一定量のPCR産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。以下に本研究で用いたFGF−7増幅用プライマーを示す。
PCR産物の大きさ:251bp
図1にその結果を示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された毛乳頭細胞においてFGF−7の発現の顕著な亢進が認められた。
実験2:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(2)
実験1と同様にして、但しアデノシンの濃度を10μM及び100μMの二通りとし、アデノシン処理時間を3時間として、RT−PCR実験を行った。その結果を図2に示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された毛乳頭細胞においてFGF−7の発現が、アデノシン濃度依存的に亢進することが確認された。
実験3−1:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(3)
実験1と同様にして、但しアデノシンの代わりにアデノシン類縁物質であるCCPA(2−クロロ−N6−シクロペンチルアデノシン)(100μM)、Cl−IB−MECA(2−クロロ−N6−(3−ヨードベンジル)−9−[5−(メチルカルバモイル)−β−D−リボフラノシル]アデニン)(50μM)又はNECA(N−エチルカルボキシアミドアデノシン)(10μM)を用い、薬剤処理時間を3時間として、RT−PCR実験を行った。(尚、薬剤の溶解性が低い場合には薬剤無添加のコントロールを含めた全ての薬剤入り培地においてDMSO終濃度が0.1%となるよう調製してもよい。)
その結果を図3に示す。この図から明らかなとおり、CCPA、Cl−IB−MECA又はNECAで処理された毛乳頭細胞においてもFGF−7の発現の顕著な亢進が認められた。
実験3−2:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(4)
実験1と同様にして、但しアデノシンの代わりにフラバノン、3,4’−ジメチルフラバノン(YGU427)、3−メチルフラバノン(YGU429)をそれぞれ100μMを用い、薬剤処理時間を2時間としてRT−PCR実験を施した。その結果を図4,5,6にそれぞれ示す。いずれもFGF−7遺伝子の発現亢進結果を示したが、アデノシンレセプターの阻害剤である8−SPT(8−スルフォニルテオフィリン)による阻害が認められないことから、FGF−7の発現亢進には必ずしもアデノシンレセプターが必要ではないことを示す。
実験4:アデノシンの毛髪に対する太毛化効果の検討
以上のFGF−7亢進効果の見出された各種薬剤のうち、アデノシンを、毛髪の太毛化効果について以下の方法で検討した。
下記の組成1を有するアデノシン含有育毛料及びコントロールとしての下記の組成2を有するニコチン酸アミド含有育毛料を、30〜50歳の男性型脱毛を呈する男性被験者(各群51名)の皮髪頭部に対し1日2回、適量(約2〜3ml)にて6ヶ月間にわたり塗布使用し、使用開始時との比較におけるアデノシンの太毛化効果について調べた。本実験においては、うぶ毛は40μm未満の直径を有する毛髪とし、直径60μm以上のものを太毛とし、直径80μm以上のものは顕著に太毛化した毛髪とした。アデノシン含有育毛料を使用してから6ヶ月目において、使用開始時と比べ、うぶ毛は7%以上減少し、また直径60μm以上の太毛は10%以上増加した。更に、直径80μm以上の太毛は5%以上増加した。アデノシン含有育毛料を継続的に使用すると、ニコチン酸アミド含有育毛料を使用したときと比べ、これらの太毛の増加量が顕著に高かった。その結果を図7に示す。
尚、アデノシン含有育毛料とニコチン酸アミド含有育毛料の毛髪密度に対する効果を調べたところ、両者の間に統計学的に有意な差は認められなかった(データーは示さない)。従って、培養毛乳頭細胞においてFGF−7発現亢進効果を示すアデノシンが特に毛髪の太毛化の維持・促進に有効であることが明らかとなった。
アデノシン含有育毛料(組成1)
成分 配合量(質量%)
アデノシン 0.75
イソステリルアルコール 0.50
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.50
ビニルピロリドン−N,N−ジメチル
エチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩液 0.50
ジプロピレングリコール 10.0
エタノール 50.0
精製水 残量
DL−リンゴ酸 適量
ニコチン酸アミド含有育毛料(組成2)
成分 配合量(質量%)
ニコチン酸アミド 0.10
イソステリルアルコール 0.50
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.50
ビニルピロリドン−N,N−ジメチル
エチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩液 0.50
ジプロピレングリコール 10.0
エタノール 50.0
精製水 残量
DL−リンゴ酸 適量
実験5:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(4)
実験1と同様に、但しDPCとしてヒト不死化毛乳頭細胞(特開平11−89565号公報に記載のSV40 large T抗原遺伝子による形質転換により得られる不死化ヒト毛乳頭細胞)を用い、薬剤処理時間を2時間として、RT−PCR実験を行った。
その結果を図8に示す。この図から明らかなとおり、毛乳頭細胞としてヒト不死化毛乳頭細胞を用いても、アデノシンによるFGF−7の発現の亢進が確認された。従って、FGF−7発現亢進剤のスクリーニングにおいて、ヒト不死化毛乳頭細胞を用いることもできることが明らかとなった。
実験6:定量PCR実験によるFGF−7の発現亢進の検討(5)
1)細胞の培養
ヒト外毛根鞘細胞(outer root sheath cell:ORS)は整形手術の副産物として生じたヒト頭皮より単離・培養後凍結保存しておいた40歳女性由来のORSを用いた。細胞密度が1.0〜1.5x104個/cm2になるように播種し、K−SFM培地(GIBCO)中、37℃、5%CO2の条件下で培養した。P3のORSを24ウェルプレートに2.0×104個/ウェルの密度で播種して3日後、亜集密の細胞にアデノシンを10又は100μMの濃度に溶解したKBM培地(クラボウ)に交換した。コントロール細胞は、KBM培地のみを用い、同様に処理した。RT−PCRは実験1と同様に行った。
図9にその結果を示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された外毛根鞘細胞においても、毛乳頭細胞と同様、FGF−7の発現の顕著な亢進が認められた。
本発明は、毛髪の太毛化の維持・促進に効果的な方法及びそのための組成物の提供を可能にする。
Claims (10)
- 毛包の細胞におけるケラチノサイト増殖因子(FGF−7)の発現を亢進させることを特徴とする、毛髪の太毛化を維持・促進する方法。
- アデノシン、アデノシン5’−リン酸、アデノシン5’−リン酸の塩、CCPA(2−クロロ−N6−シクロペンチルアデノシン)、Cl−IB−MECA(2−クロロ−N6−(3−ヨードベンジル)−9−[5−(メチルカルバモイル)−β−D−リボフラノシル]アデニン)及びNECA(N−エチルカルボキシアミドアデノシン)から成る群から選ばれる、毛包の細胞におけるFGF−7の発現を亢進させる1又は複数種の薬剤を含有する皮膚外用剤を頭皮に塗布することにより前記FGF−7の発現を亢進させる、請求項1記載の方法。
- 前記毛包の細胞におけるFGF−7の発現を亢進させる薬剤の少なくとも1種がアデノシンである、請求項2記載の方法。
- 前記毛包の細胞が毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- アデノシン、アデノシン5’−リン酸、アデノシン5’−リン酸の塩、CCPA、CI−IB−MECA及びNECAから成る群から選ばれる薬剤を活性成分として含有する、FGF−7発現亢進組成物。
- 前記薬剤の少なくとも1種の薬剤がアデノシンである、請求項5記載の組成物。
- 頭皮に塗布することにより毛髪の太毛化を維持・促進させる皮膚外用剤である、請求項5又は6記載の組成物。
- 毛髪の太毛化を維持・促進させる薬剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を細胞に適用し、当該細胞のFGF−7の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする方法。
- 前記細胞のFGF−7の発現の亢進が、細胞から抽出されたFGF−7をコードするmRNAの量を測定することにより決定される、請求項8記載の方法。
- 前記細胞が毛乳頭細胞、不死化毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞である、請求項8又は9記載の方法。
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