KR20060123256A

KR20060123256A - 모발의 태모화 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20060123256A
Application number: KR1020067011001A
Authority: KR
Inventors: 리츠코 에하마; 마사토 이이노; 요스케 나카자와; 마사히로 다지마; 마사시 오고우; 세이지 아라세
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2003-11-11
Filing date: 2004-11-10
Publication date: 2006-12-01
Also published as: TW200529877A; CN1878530A; WO2005044205A1; US20070299032A1; EP1683509A4; JPWO2005044205A1; EP1683509A1

Abstract

본 발명은 모포 세포, 바람직하게는 모유두 세포에서 케라티노사이트 증식 인자(FGF-7)의 발현을 항진시킴으로써 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 방법, 및 아데노신 및/또는 그 유도체를 함유하는 FGF-7 발현을 항진시키는 조성물, 특히 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키기 위한 두피 외용제를 제공한다.

Description

모발의 태모화 방법 및 조성물{METHOD AND COMPOSITION FOR HAIR THICKENING}

본 발명은 모포 세포, 바람직하게는 모유두 세포에서 케라티노사이트 증식 인자(FGF-7)의 발현을 항진시킴으로써 모발의 태모화(太毛化)를 유지하고 촉진시키는 방법, 및 FGF-7의 발현을 항진시키는 조성물, 특히 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키기 위한 두피 외용제에 관한 것이다.

고령화 사회, 스트레스 사회라고 불리는 현대 사회에서는, 두부 모발이 여러 가지 원인에 의해 탈모의 위기에 노출되는 경우가 점점 더 많아지고 있다. 이에 대응하여, 보다 우수한 「육모료(育毛料)」를 제공하기 위해 여러 가지 시도가 이루어지고 있다. 육모료가 모발에 주는 주된 효과로는, 1) 발모 유도 효과(발모 촉진 효과, 성장기 유도 효과), 2) 모발의 굵기를 유지하거나 또는 그 굵기를 굵게 하는, 즉, 태모화 효과, 3) 모발 성장기 연장 효과, 4) 5α-리덕타제 저해 효과(퇴행기 조기 이행 억제 효과), 5) 혈행 촉진 효과, 6) 살균 효과, 7) 비듬 방지 효과, 8) 보습 효과, 9) 항산화 효과 등을 들 수 있다.

남성형 탈모는 모발 성장기의 단축에 의해 모포가 왜소화되어, 모발 직경이 점차로 감소하여 솜털 같은 머리칼로 변화하는 데에 특징을 부여할 수 있으며, 남 성형 탈모자는, 모발 밀도(단위면적 당 모발수)의 감소는 거의 보이지 않는 데 대하여, 모발 직경이 극단적으로 감소한다고 하는 사실이 발견되고 있다(일본 특허 공개 2002-322094호 공보). 이 사실에 기초하여, 발모 유도뿐 아니라, 상기 태모화 효과의 중요성도 주목을 받고 있다.

그러나, 모발 태모화에 어떠한 메커니즘이 관여하고 있는지에 대해서는 생화학·분자 생물학 레벨에서 아직 해명에 이르지 못했으며, 그 결과, 태모화의 유지하고 촉진시키기에 유효한 약제를 함유하는 육모료의 연구·개발도 모색 단계에 있다고 할 수 있다. 모발 태모화의 메커니즘을 충분히 해명할 수 있으면, 기존의 육모료에 비해 한층 현저한 효과를 발휘하는 것을 제공할 수 있게 될 수 있다.

발명의 개시

본 발명은, 모발 태모화 메커니즘의 생화학 레벨에서의 해명, 나아가서는 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 방법 및 이를 위한 피부 외용 조성물의 제공을 과제로 한다.

FGF-7은 194개의 아미노산으로 이루어진 당단백질로서, 선유아 세포 증식 인자의 패밀리에 속하는 성장 인자의 하나이다. 간엽계 세포인 피부 선유아 세포 등에서 분비되어, 표피 세포에 존재하는 특이적 수용체인 FGFR2 IIIb에 결합하여 파라크린(paracrine) 방식으로 그 증식을 촉진하는 것은 잘 알려져 있던 사실이다(Rubin J. S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86 : 802-806 ; Marchese C 등, J. Cell Physiol. 1990, 144 : 326-332 등). 또한, 표피 케라티노사이트뿐 아니라, 간 실질 세포, 장관 상피 세포(Houseley R. M 등, J. Clin. Invest. 1994, 94 : 1764-1777) 등 넓게 상피계 세포의 증식을 촉진하며, 모포의 케라티노사이트도 이 FGF-7에 의해 증식이 촉진되는 것이 기재되어 있다(Pierce G. F. 등, J. Exp. Med. 1994, 179 : 831-840). 또한, 마우스 실험에서 FGF-7이 성장기의 모유두 세포에서 발현하고, 그 기능 표현에 필수인 수용체 FGFR2가 모유두 근방의 모모(毛母)에서 발현하고 있는 것이 기재되어(Dev. Dyn. 1996 ; 205(4) : 379-386), 모(毛) 성장에 FGF-7이 관여하고 있는 것이 시사되어 있다. 그러나, FGF-7이 모 성장에서 어떠한 역할을 하고 있는지 해명되지 못하고 있다. 그래서 본 발명자들은 모유두 세포에서 FGF-7의 발현을 항진시키면, 그 표적 세포라고 생각되는 모모 세포 등의 증식을 통해 모발 성장기 연장 작용에 의한 태모화로 이어지는 것은 아닌가라는 작업 가설을 세웠다.

우선, 여러 가지 약제를 모유두 세포 등에 작용시켜 FGF-7의 발현을 상승시키는 것을 탐색한 바, 아데노신 및 그 유도체가 FGF-7 유전자의 발현을 항진시키는 것을 알 수 있었다. 이어서, 아데노신에 관한 임상 시험을 행한 바, 놀랍게도 태모화 효과도 갖는 것이 발견되었다. 태모화의 유지 및 촉진에는 일본 특허 공개 2002-322094호 공보에 기재된 바와 같이, 모발 성장기 연장에 의해 모 성장 촉진 작용 효과를 발휘하는 성분(예컨대 고삼속 식물 엑기스), 퇴행기로의 조기 이행을 억제함으로써 탈모 방지 작용 효과를 발휘하는 성분(예컨대 테스토스테론), 및 휴지기에서 성장기에 이르는 유도 작용 효과를 발휘하는 성분(예컨대, 데실테트라데실 아민옥사이드)의 적어도 3 종의 성분이 필요하다고 생각되고 있었기 때문에, 단독 화합물이 이러한 효과를 발휘하는 것은 놀랄만한 일이다.

FGF-7의 모유두 세포 등에서 발현이 항진된다고 하는 사실은 처음으로 발견된 것이며, 더구나 그 발현의 항진이 모발의 태모화에 관여한다고 하는 사실은 완전히 처음으로 발견된 것이다.

따라서, 본 발명은, 모포 세포, 바람직하게는 모유두 세포에서 케라티노사이트 증식 인자(FGF-7)의 발현을 항진시키는 것을 특징으로 하는, 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 방법을 제공한다.

모포 세포에서 FGF-7 발현의 항진은 아데노신 및 그 유도체, 예컨대, 아데노신 5'-인산, 아데노신 5'-인산염, 및 CCPA (2-클로로-N⁶-시클로펜틸아데노신), Cl-IB-MECA (2-클로로-N⁶-(3-요오도벤질)-9-[5-(메틸카르바모일)-β-D-리보푸라노실]아데닌) 및 NECA (N-에틸카르복시아미도아데노신)로 이루어지는 군에서 선택된 모포 세포에서 FGF-7의 발현을 항진시키는 1 종 이상의 약제(이하, 「FGF-7 발현 항진제」라고 부르는 경우가 있음)를 함유하는 피부 외용제를 두피에 도포함으로써 달성된다. 바람직하게는, 상기 약제는 아데노신이다.

다른 관점에서, 본 발명은, 아데노신 및 그 유도체, 예컨대, 아데노신 5'-인산, 아데노신 5'-인산염, 및 CCPA, Cl-IB-MECA 및 NECA로 이루어지는 군에서 선택된 약제를 활성 성분으로서 함유하는 FGF-7 발현 항진 조성물을 제공한다.

적합한 형태에 있어서, FGF-7의 발현이 항진되는 것은 모유두 세포 또는 외모근초 세포이다.

적합한 형태에 있어서, 상기 약제는 아데노신이다.

적합한 형태에 있어서, 상기 조성물은 두피에 도포함으로써 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 피부 외용제이다.

한층 더 다른 관점에 있어서, 본 발명은 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 약제의 스크리닝 방법으로서, 후보 약제를 세포, 바람직하게는 모포 세포, 보다 바람직하게는 모유두 세포 또는 외모근초 세포에 적용하여, 그 세포에서 FGF-7의 발현을 항진시키는 약제를 선정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 모유두 세포는 불사화(immortalized) 모유두 세포이다.

적합한 형태에 있어서, 상기 세포에서 FGF-7 발현의 항진은 세포 중의 FGF-7의 양을 측정함으로써 결정된다.

더욱 적합한 형태에 있어서, 상기 측정은 FGF-7에 특이적인 항체를 이용하는 ELISA법 또는 RIA법에 의한 것이다.

더욱 적합한 형태에 있어서, 상기 세포에서 FGF-7 발현의 항진은 세포로부터 추출된 FGF-7을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정된다.

더욱 적합한 형태에 있어서, 상기 mRNA의 측정은 RT-PCR법(역전사-폴리머라제 연쇄 반응법)에 의해 실시한다.

본 발명은 모발 태모화의 유지 및 촉진에 효과적인 방법 및 그를 위한 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 모유두 세포에서 아데노신의 FGF-7 발현 항진 효과를, FGF-7 발현량(상대치)으로서 나타낸다.

도 2는 모유두 세포에서 아데노신의 FGF-7 발현 항진 효과를, 약제 첨가 3시간 후의 FGF-7 상대 발현량으로서 나타낸다.

도 3은 모유두 세포에서 아데노신 유연 물질의 FGF-7 발현 항진 효과를, 약제 첨가 2시간 후의 FGF-7 상대 발현량으로서 나타낸다(실시간 PCR : n=4).

도 4는 모유두 세포에서 플라바논의 FGF-7 발현 항진 효과를, 약제 첨가 2시간 후의 FGF-7 상대 발현량으로서 나타낸다(실시간 PCR : n=4).

도 5는 모유두 세포에서 3,4'-디메틸플라바논의 FGF-7 발현 항진 효과를, 약제 첨가 2시간 후의 FGF-7 상대 발현량으로서 나타낸다(실시간 PCR : n=3).

도 6은 모유두 세포에서 3-메틸플라바논의 FGF-7 발현 항진 효과를, 약제 첨가 2시간 후의 FGF-7 상대 발현량으로서 나타낸다(실시간 PCR : n=4).

도 7은 아데노신 함유 육모료의 태모화 효과(80 μm 이상의 태모율)를 나타낸다.

도 8은 인간 불사화 모유두 세포에서 아데노신의 FGF-7 발현 항진 효과를, 약제 첨가 2시간 후의 FGF-7 상대 발현량으로서 나타낸다.

도 9는 외모근초 세포에 있어서의 아데노신의 FGF-7 발현 항진 효과를, 약제 첨가 3시간 후의 FGF-7 상대 발현량으로서 나타낸다.

이하, 본 발명의 구체예에 관해서 설명한다.

본 발명은, 모포 세포, 바람직하게는 모유두 세포에서 케라티노사이트 증식 인자(FGF-7)의 발현을 항진시키는 것을 특징으로 하는, 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 말하는 태모화(太毛化)란, 일반적으로 모근의 왜소화에 의해 솜털 같은 머리칼로 되는 것이 억제되어, 모발의 굵기가 유지되거나 또는 굵게 되는 것을 말한다. 태모화 효과의 유무 판정은, 모발의 굵기나 질에 개인차가 있으며, 따라서 개인별로 되는 것이 바람직하지만, 일반적으로는, 두부의 소정 면적의 영역, 예컨대 1 cm², 2 cm², 5 cm²에서 소정 직경의 모발, 예컨대 직경 40 μm, 60 μm, 80 μm 또는 100 μm 이상의 모발의 가닥수가, 본 발명에 따른 FGF-7 발현 항진제의 두피에의 적용, 예컨대 1개월, 3개월, 또는 6개월 이상의 계속적인 적용의 결과, 실질적으로 감소하지 않은 경우, 예컨대 그 감소율이 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만인 경우, 태모가 유지되었다고 판정되며, 예컨대 직경 40 μm, 60 μm, 80 μm 또는 100 μm의 모발의 가닥수가 실질적으로 증가한 경우, 예컨대 그 증가율이 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상인 경우, 태모화가 촉진된 것으로 판정할 수 있다.

모포 세포, 바람직하게는 모유두 세포에서 FGF-7 발현의 항진은, 아데노신 및 그 유도체, 예컨대, 아데노신 5'-인산, 아데노신 5'-인산염 및 CCPA, Cl-IB-MECA 및 NECA로 이루어지는 군에서 선택된 모포 세포에서 FGF-7의 발현을 항진시키는 1 종 이상의 약제를 함유하는 피부 외용제를 두피에 도포함으로써 달성된다.

아데노신은, 리보뉴클레오시드의 하나로 염기 부분에 퓨린 유도체인 아데닌을 포함하는 것이다. 아데노신 5'-인산은, 5'-아데닐산이라고도 불리며, 아데노신 리보스의 5' 위치의 히드록실기에 인산이 1 분자 결합한 뉴클레오티드이다.

또한, 아데노신 5'-인산염에 있어서, 염을 형성하는 쌍이온으로서는, 산과 쌍이온을 형성하는 물질이라면 어떤 물질이라도 좋으며, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘 등을 예로 들 수 있다. 또한, 아데노신 5'-인산염으로서는, 그 수화물을 사용할 수도 있다.

CCPA, Cl-IB-MECA, NECA는 아데노신 유사체(analogue)이다. CCPA, Cl-IB-MECA, NECA는 시그마사에서 입수할 수 있다.

상기 아데노신, 아데노신 5'-인산 및 아데노신 5'-인산염, CCPA, Cl-IB-MECA 및 NECA는 시약으로서 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 FGF-7 발현 항진 조성물은, 피부 외용제, 바람직하게는 두피 외용제, 예컨대 육모료 또는 양모료일 수 있다.

본 발명에 따른 FGF-7 발현 항진 조성물은, 상기 FGF-7 발현 항진제를 전량 중, 예컨대 0.01∼20.0 질량%, 바람직하게는 0.1∼10.0 질량%로 포함한다. 이 배합량이 상기 조성물 전량의 0.01 질량% 미만이면 상기 성분에 의한 태모화 효과가 충분히 발휘되지 않기 때문에 바람직하지 못하며, 또한 20.0 질량%을 넘으면 조제상 지장을 초래하는 경향이 현저하게 되어, 바람직하지 못한 경우가 있다.

본 발명에 따른 FGF-7 발현 항진 조성물, 특히 피부 외용제는, 피부에 직접 도포 또는 살포하는 경피 투여에 의해 투여할 수 있다. 또한, 그 투여량은, 외용제의 구체적 형태, 사용자의 연령, 증상 등에 따라 변화되기 때문에 명확하게는 특정할 수는 없지만, 인간에게 투여하는 경우, 상기 FGF-7 발현 항진제가, 체중 1 Kg 및 1일 당, 일반적으로 0.01∼100.0 mg, 바람직하게는 O.1∼10.0 mg 투여되는 양이며, 이 양을 하루 1 회 또는 2∼4 회로 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 FGF-7 발현 항진 조성물, 특히 피부 외용제는, 인간을 비롯한 포유동물에게 있어서, 우수한 태모화 유지 및 촉진 작용을 보여, 헤어케어용의 의약품, 의약부외품 또는 화장품으로서 유용하다.

본 발명에 따른 FGF-7 발현 항진 조성물, 특히 피부 외용제가 채용할 수 있는 제형은, 바람직하게는 외피에 적용 가능한 외용제의 제형, 예컨대, 액상, 유액상, 크림형, 에어졸형 등의 제형을 선택할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물의 형태도 임의이며, 예컨대, 토닉, 헤어크림, 무스, 샴푸, 린스, 유액, 화장수, 팩, 에어졸제 등의 형태를 채용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 외피에 도포하여 사용하는 것이 특히 바람직하다. 도포 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 두피에 하루 1 회 이상, 예컨대 하루 1∼3 회, 도포하는 피부 면적에 따라서 적량, 예컨대 1∼5 ㎖ 도포하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 FGF-7 발현 항진 조성물, 특히 피부 외용제에 있어서는, 필수 성분인 상기 향료에 더하여, 필요에 따라서, 또한 본 발명의 소기의 효과를 손상하지 않는 한, 화장품, 의약부외품, 의약품 등에서 일반적으로 이용되는, 각종 유성 또는 수성 성분, 보습제, 증점제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색제, 각종 약제 등을 배합할 수 있다.

예컨대, 고급 지방산, 고형 파라핀, 유동 파라핀, 실리콘유, 스쿠알렌, 모노올레인산글리세릴, 올리브유, 이소프로필미리스테이트, 고급 알콜 등의 기름 성분 ; 글리세린, 히알루론산, 프로필렌 글리콜, 말티톨, 아테로콜라겐, 젖산나트륨 등의 보습제 ; 마르멜로(quince) 점질물, 카르복시비닐 중합체, 크산탄 검 등의 증점제 ; 니코틴산 아미드, 니코틴산벤질, 비타민 E 아세테이트, 쓴풀(swertia) 추출물, 염화카르프로늄, 아세틸콜린 유도체 등의 혈관 확장제 ; 세린, 메티오닌, 아르기닌 등의 아미노산류 ; 비타민 B6, 비타민 E류, 비오틴, 판토텐산류 등의 비타민류 ; 니코틴산, 니코틴산메틸, 니코틴산토코페롤 등의 니코틴산 에스테르류 ; 세파란틴 등의 피부 기능 항진제 ; 에스트라디올 등의 여성 호르몬제 ; 글리시리진산, 글리시레틴산, 아줄렌 등의 소염제 ; 히노키티올, 헥사클로로펜, 벤잘코늄 염화물, 세틸피리디늄 염화물, 운데실렌산, 트리클로로카르바닐리드, 비티오놀 등의 항균제 ; 멘톨 등의 청량제 ; 살리실산, 아연류, 젖산류 등 ; 시트르산 등의 유기산류를 배합할 수 있다.

본 발명에 따른 FGF-7 발현 항진 조성물, 특히 피부 외용제는 또한 상기 FGF-7 발현 항진제 이외에 육모 작용이 인정되고 있다, 기지의 육모 성분, 예컨대 미녹시딜, 사이클로스포린 등을 가함으로써, 더욱 효과적인 육모 효과를 기대할 수 있다.

본 발명은 또한 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 약제의 스크리닝 방법을 제공한다. 이 방법은, 후보 약제를 세포, 바람직하게는 모포 세포, 보다 바람직하게는 모유두 세포 또는 외모근초 세포에 적용하여, 그 세포에서 FGF-7 발현을 항진시키는 약제를 선정하는 것을 특징으로 한다.

모유두 세포로서, 인간 유래의 정상적인 모유두 세포, 혹은 입수가 용이하고, 또 증식 속도가 빠르다는 점에서 유리한 불사화 모유두 세포, 예컨대 일본 특허 공개 평11-89565호 공보에 기재된 바와 같이, SV40 large T 항원 유전자에 의한 형질 전환에 의해 얻어지는 불사화 인간 모유두 세포 등을 사용할 수도 있다. 또한, 스크리닝을 함에 있어서는, 모유두 세포 외에, FGF-7을 생산하는 간엽계 세포, 예컨대 인간으로부터 단리된 피부 선유아 세포나, 다른 모포 유래의 세포, 예컨대 외모근초 세포 등을 이용하는 것도 가능하다.

세포 중의 FGF-7 발현의 항진은, 예컨대 세포 중의 FGF-7의 양을 측정함으로써 결정된다. 바람직하게는, 이 측정은 인간 FGF-7에 특이적인 항체를 이용하여, 당업계에 있어서 주지의 방법, 예컨대 형광 물질, 색소, 효소 등을 이용하는 면역염색법, 웨스턴블롯법, 면역 측정 방법, 예컨대 ELISA법, RIA법 등, 여러 가지 방법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 세포로부터 RNA를 추출하여, 인간 FGF-7을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정할 수도 있다. mRNA의 추출, 그 양의 측정도 당업계에 있어서 주지이며, 예컨대 RNA의 정량은 역전사 반응 후, 정량 폴리머라제 연쇄 반응법(RT-PCR)에 의해 이루어진다. 예컨대, 정량 PCR은 이하의 프라이머의 조합을 이용하여 실시할 수 있다.

조합 1

정방향 프라이머 : 5'-CATGAACACCCGGAGCACTAC-3'(NM_002009 : 419-439)(서열 번호 1)

역방향 프라이머 : 5'-CACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTC-3'(NM_O02009 : 669-646)(서열 번호 2)

PCR 산물의 크기: 251 bp

조합 2

정방향 프라이머 : 5'-CACAAATGGATACTGACATGGA-3'(NM_002009 : 449-470)(서열 번호 3)

역방향 프라이머 : 5'-TCACTCTTATATCCCCTCCTTC-3'(NM_O02009 : 644-623)(서열 번호 4)

PCR 산물의 크기: 196 bp (J Clin Endocrinol Metab 88(2), 773-, 2003)

조합 3

정방향 프라이머 : 5'-CTTTGCTCTACAGATCATGCTTTC-3'(NM_002009 : 480-503)(서열 번호 5)

역방향 프라이머 : 5'-TTGCCATAGGAAGAAAGTGGGCTG-3'(NM_002009 : 1022-999)(서열 번호 6)

PCR 산물의 크기: 543 bp (J Clin Invest 92, 2408-, 1993)

이하, 실시예에 의해, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 이 실시예에 의해, 본 발명의 기술적 범위가 한정적으로 해석되는 것은 아니다. 한편, 이하의 실시예 등에서, 배합량을 나타내는 수치는 특별히 언급하지 않는 한, 배합되는 대상 전체에 대한 질량%로 나타내어진다.

실험 1 : 정량 PCR 실험에 의한 FGF-7의 발현 항진의 검토(1)

1) 세포의 배양

인간 모유두 세포(dermal papillae cell ; DPC)는 성형 수술의 부산물로서 생긴 인간 두피로부터 단리·배양한 후 동결 보존해 둔, 34세 여성에게서 유래한 DPC를 이용하였다. 세포 밀도가 1.0∼1.5×10⁴ 개/cm²가 되도록 시딩(seeding)하여, MEM(GIBC0)+10%FBS 중, 37℃, 5% C0₂의 조건 하에서 배양하였다. 2회/주의 비율로 배지 교환을 하여, 세포가 집밀(集密)에 달했을 때는(파종으로부터 10일∼20일 후) 0.25% 트립신으로 세포를 디시로부터 분리 회수하고, 다시 1.O∼1.5×10⁴개/cm²의 밀도로 시딩하였다.

2) 배양 세포의 약제 처리

해동한 후 1∼3회 계대·배양한 DPC를 24 웰 플레이트에 4.0×10⁴ 개/웰의 밀도로 시딩하고, 4일 후, 버금가게 집밀된 세포에 아데노신을 100 μM의 농도로 용해한 MEM(혈청 무첨가)으로 교환하였다. 대조군 세포는 MEM(혈청 무첨가)만을 이용하여, 같은 식으로 처리하였다.

3) RT-PCR

아데노신 첨가 2, 4, 8, 24시간 후, MagNAPureLC(로슈·다이아그노스틱스 주식회사)로 배양 세포로부터 mRNA를 추출하고, 역전사 효소 SuperScriptII(Invitrogen)의 키트를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA를 주형에 LightCycler(로슈·다이아그노스틱스 주식회사)로 이중쇄 DNA의 부구(副溝, minor groove)에 결합하는 형광 색소 CyberGreen I을 이용하여 실시간 PCR로 발현량을 비 교하였다. 자세히 설명하면, LightCycler-FastStart DNA 마스터 SYBR Green I 키트(로슈·다이아그노스틱스 주식회사)를 이용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 전량 20 μl의 반응액(MgCl₂ 2 mM, 전방향 및 역방향 프라이머 각 0.25 μM)을 조제하여, LightCycler로 PCR 반응(효소 활성화 95℃/10분, 열 변성 95℃/15초, 어닐링 58℃/5초, 신장 반응 72℃/10초, 열 변성∼신장 반응 사이클을 40회)을 행하여, 각 사이클의 신장 반응 종료시의 형광 강도를 모니터링하였다. 이 형광 강도는 그 시점에서의 PCR 산물량을 반영하고 있다. 유전자의 발현량은, PCR 산물의 지수 함수적 증폭기에 있어서 초기 주형량 A의 PCR 산물 Y가 PCR의 사이클수 X에 대하여 Y=A×2^X를 만족하면서 증폭되는 것으로 가정하여, 일정량의 PCR 산물을 얻을 수 있을 때까지의 사이클 수로부터 상대치를 산출하였다. 이하에 본 연구에서 이용한 FGF-7 증폭용 프라이머를 나타낸다.

역방향 프라이머 : 5'-CACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTC-3'(NM_002009 : 669-646)(서열 번호 2)

PCR 산물의 크기: 251 bp

도 1에 그 결과를 도시한다. 이 도면으로부터 분명한 바와 같이, 아데노신으로 처리된 모유두 세포에서 FGF-7 발현의 현저한 항진이 인정되었다.

실험 2 : 정량 PCR 실험에 의한 FGF-7의 발현 항진의 검토(2)

실험 1과 같은 식으로 하되, 단 아데노신의 농도를 10 μM 및 100 μM의 2가지로 하고, 아데노신 처리 시간을 3시간으로 하여, RT-PCR 실험을 하였다. 그 결과를 도 2에 도시한다. 이 도면으로부터 분명한 바와 같이, 아데노신으로 처리된 모유두 세포에 있어서 FGF-7의 발현이, 아데노신 농도 의존적으로 항진하는 것이 확인되었다.

실험 3-1 : 정량 PCR 실험에 의한 FGF-7의 발현 항진의 검토(3)

실험 1과 같은 식으로 하되, 단 아데노신 대신에 아데노신 유사체인 CCPA (2-클로로-N⁶-시클로펜틸아데노신)(100 μM), Cl-IB-MECA (2-클로로-N⁶-(3-요오도벤질)-9-[5-(메틸카르바모일)-β-D-리보푸라노실]아데닌)(50 μM) 또는 NECA (N-에틸카르복시아미도아데노신)(10 μM)를 이용하고, 약제 처리 시간을 3시간으로 하여, RT-PCR 실험을 하였다. (한편, 약제의 용해성이 낮은 경우에는 약제 무첨가의 대조군을 포함한 모든 약제가 들어가는 배지에 있어서 DMSO 최종 농도가 0.1%가 되도록 조제하여도 좋다.)

그 결과를 도 3에 도시한다. 이 도면으로부터 분명한 바와 같이, CCPA, Cl-IB-MECA 또는 NECA로 처리된 모유두 세포에 있어서도 FGF-7 발현의 현저한 항진이 인정되었다.

실험 3-2 : 정량 PCR 실험에 의한 FGF-7의 발현 항진의 검토(4)

실험 1과 같은 식으로 하되, 단 아데노신 대신 플라바논, 3,4'-디메틸플라바논(YGU427), 3-메틸플라바논(YGU429)을 각각 100 μM 이용하고, 약제 처리 시간을 2시간으로 하여 RT-PCR 실험을 실시하였다. 그 결과를 도 4, 도 5, 도 6에 각각 도시한다. 모두 FGF-7 유전자의 발현 항진 결과를 보였지만, 아데노신 수용체의 저해제인 8-SPT(8-술포닐테오필린)에 의한 저해가 인정되지 않으므로, FGF-7의 발현 항진에는 반드시 아데노신 수용체가 필요한 것은 아님을 나타낸다.

실험 4 : 아데노신의 모발에 대한 태모화 효과의 검토

이상의 FGF-7 항진 효과가 발견된 각종 약제 중 아데노신을, 모발의 태모화 효과에 관해서 이하의 방법으로 검토하였다.

하기의 조성 1을 갖는 아데노신 함유 육모료 및 대조군으로서 하기의 조성 2를 갖는 니코틴산 아미드-함유 육모료를, 30∼50세의 남성형 탈모를 보이는 남성 피험자(각 군 51명)의 피발 두부에 대하여 하루 2회, 적량(약 2∼3 ㎖)으로 6개월에 걸쳐 도포 사용하여, 사용을 시작했을 때와의 비교에서 아데노신의 태모화 효과에 관해서 조사하였다. 본 실험에서는, 솜털 같은 머리털은 40 μm 미만의 직경을 갖는 모발로 하고, 직경 60 μm 이상인 것을 태모로 하고, 직경 80 μm 이상의 것은 현저히 태모화된 모발로 하였다. 아데노신 함유 육모료를 사용하고 나서 6개월이 되었을 때에, 사용을 시작했을 때와 비교하여, 솜털 같은 털은 7% 이상 감소하고, 또한 직경 60 μm 이상인 태모는 10% 이상 증가하였다. 또한, 직경 80 μm 이상의 태모는 5% 이상 증가하였다. 아데노신 함유 육모료를 계속적으로 사용하면, 니코틴산 아미드-함유 육모료를 사용했을 때와 비교하여, 이들 태모의 증가량이 현저히 높았다. 그 결과를 도 7에 도시한다.

또한, 아데노신 함유 육모료와 니코틴산 아미드-함유 육모료의 모발 밀도에 대한 효과를 조사한 바, 양자 사이에 통계학적으로 의미 있는 차는 인정되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, 배양 모유두 세포에서 FGF-7 발현 항진 효과를 보이는 아데노신이 특히 모발 태모화의 유지 및 촉진에 유효하다는 것이 분명하게 되었다.

아데노신 함유 육모료(조성 1)

성분 배합량(질량%)

아데노신 0.75

이소스테아릴 알코올 0.50

폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 0.50

비닐피롤리돈-N,N-디메틸 에틸 메타크릴산 공중합체 디에틸 황산염액

0.50

디프로필렌 글리콜 10.0

에탄올 50.0

정제수 잔량

DL-말산 적량

니코틴산 아미드-함유 육모료(조성 2)

성분 배합량(질량%)

니코틴산 아미드 0.10

이소스테아릴 알코올 0.50

폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 0.50

0.50

디프로필렌 글리콜 10.0

에탄올 50.0

정제수 잔량

DL-말산 적량

실험 5 : 정량 PCR 실험에 의한 FGF-7의 발현 항진의 검토(4)

실험 1과 같은 식으로 하되, 단 DPC로서 인간 불사화 모유두 세포(일본 특허 공개 평11-89565호 공보에 기재된 SV40 large T 항원 유전자에 의한 형질 전환에 의해 얻어지는 불사화 인간 모유두 세포)를 이용하고, 약제 처리 시간을 2시간으로 하여, RT-PCR 실험을 하였다.

그 결과를 도 8에 도시한다. 이 도면으로부터 분명한 바와 같이, 모유두 세포로서 인간 불사화 모유두 세포를 이용하더라도, 아데노신에 의한 FGF-7 발현의 항진이 확인되었다. 따라서, FGF-7 발현 항진제의 스크리닝에서, 인간 불사화 모유두 세포를 이용할 수도 있음이 분명하게 되었다.

실험 6 :정량 PCR 실험에 의한 FGF-7의 발현 항진의 검토(5)

1) 세포의 배양

인간 외모근초 세포(outer root sheath cell : ORS)는 성형 수술의 부산물로서 생긴 인간 두피로부터 단리·배양한 후 동결 보존해 둔 40세 여성에게서 유래한 ORS를 이용하였다. 세포 밀도가 1.0∼1.5×10⁴ 개/cm²가 되도록 시딩하여, K-SFM 배지(GIBC0) 중, 37℃, 5% C0₂의 조건 하에서 배양하였다. P3의 ORS를 24 웰 플레이트에 2.0×10⁴ 개/웰의 밀도로 파종하여 3일 후, 버금가는 집밀한 세포에 아데노신을 10 또는 100 μM의 농도로 용해한 KBM 배지(쿠라보)로 교환하였다. 대조군 세포는 KBM 배지만을 이용하여 같은 식으로 처리하였다. RT-PCR은 실험 1과 같은 식으로 행하였다.

도 9에 그 결과를 도시한다. 이 도면으로부터 분명한 바와 같이, 아데노신으로 처리된 외모근초 세포에서도, 모유두 세포와 마찬가지로 FGF-7 발현의 현저한 항진이 인정되었다.

본 발명은, 모발 태모화의 유지 및 촉진에 효과적인 방법 및 그를 위한 조성물을 제공할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> SHISEIDO COMPANY, LTD. <120> Method and Composition for Thickening Hair <130> P907 <150> JP2003-381470 <151> 2003-11-11 <160> 6 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 1 catgaacacc cggagcacta c 21 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 2 cactgtgttc gacagaagag tcttc 25 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 3 cacaaatgga tactgacatg ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 4 tcactcttat atcccctcct tc 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 5 ctttgctcta cagatcatgc tttc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 6 ttgccatagg aagaaagtgg gctg 24

Claims

모포 세포에서 케라티노사이트 증식 인자(FGF-7)의 발현을 항진시키는 것을 특징으로 하는, 모발의 태모화(太毛化)를 유지하고 촉진시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 FGF-7의 발현은 아데노신, 아데노신 5'-인산, 아데노신 5'-인산염, CCPA (2-클로로-N⁶-시클로펜틸아데노신), Cl-IB-MECA (2-클로로-N⁶-(3-요오도벤질)-9-[5-(메틸카르바모일)-β-D-리보푸라노실]아데닌) 및 NECA (N-에틸카르복시아미도아데노신)로 이루어지는 군에서 선택되는, 모포 세포에서 FGF-7의 발현을 항진시키는 1 종 이상의 약제를 함유하는 피부 외용제를 두피에 도포함으로써 항진시키는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 모포 세포에서 FGF-7의 발현을 항진시키는 약제 중 적어도 1 종의 약제가 아데노신인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모포 세포가 모유두 세포(dermal papilla cell) 또는 외모근초 세포(outer root sheath cell)인 방법.
아데노신, 아데노신 5'-인산, 아데노신 5'-인산염, CCPA, Cl-IB-MECA 및 NECA로 이루어지는 군에서 선택되는 약제를 활성 성분으로서 함유하는, FGF-7 발현의 항진을 위한 조성물.
제5항에 있어서, 상기 약제 중 적어도 1종의 약제가 아데노신인 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서, 두피에 도포함으로써 모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 피부 외용제인 조성물.
모발의 태모화를 유지하고 촉진시키는 약제의 스크리닝 방법으로서, 후보 약제를 세포에 적용하여, 상기 세포에서 FGF-7의 발현을 항진시키는 약제를 선정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 세포에서 FGF-7 발현의 항진이 세포로부터 추출된 FGF-7을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정되는 것인 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 세포가 모유두 세포, 불사화(immortalized) 모유두 세포 또는 외모근초 세포인 방법.