О4 Изобретение относитс к гуанидиновым производным, вл юи имс антагонистами гистамина Н-2 и ингибирующим секрецию кислоты желудочйого сока формулы (I) СГзСН2-«Н (СН2Ъ-С-БН2 : где или 5(1а и 16) Целью изобретени вл етс расширение арсенала средств, вл ющихс антагонистами гистамина Н-2 и про вл ющих более сильное подавление действию гистамина Н-2. Пример 1. Триэтиламин (0,082 г) добавл ют к суспензии 5{3- 2- (2,2,2-трифторэтил)гуанидиноJ пиразол-1-ил1валериановой кислоты (0,25 г) в тетрагидрофуране (10 мл) при , добавл ют аммиак (0,015 г), этилхлорформиат (0,088 г) и смесь перемешивают в течение 30 мин. Добавл ют раствор в тетрагидрофуране (5 мл) и смесь перемешивают в течени 30 мин, при этом температура повышаетс до комнатной. Смесь выЛаривают в вакууме, добавл ют к ней водный раствор бикарбоната натри (5 мл) и экстрагируют этилацетатом ( мл) После сушки над MgSO раствор фильтру ют и фильтрат выпаривают, в результа те чего получают бледно-желтый твердый продукт, который очищают посред ством жидкостной хроматографии умерен ного давлени с использованием сили кагел , и элюируют смесью метанола и в соотношении 1:10 (об/об), в-результате чего получают твердый матв риал. Этот твердьй материал раствор ют в этилацетате (ЗА), содержащем следы этилового спирта, и добавл ют избыточное количество раствора малеи новой кислоты в ЗА. Выпавший в резул тате осадок извлекают путем фильтрации и перекристаллизовывают из этанола , в результате чего получают малеат 5- 3-(2,2, 2-трифторэтил)гуани1;и но пиразол-1-ил-валерамида, с т.пл. 130°С (выход 30%). ЯМР в dgWCO:7,39(d, IH); 5,66 (d, IH) 4,03 (q, 2Н); 3,94(t, 2Н); 2,08(t, 2Н); l,6(m, 4Н). Пример 2. Провод т испытани по методике примера 1, использу 6-{3- 2-(2,2,2-трифторэтил)гуанидино пиразол-1 ил}гексанамид (16). Получают малеиновую соль с т.пл. 130-131°С ЯМР в d ДМСО: 7,75(d, IH); 6,02 (d, IH); 4,3(q, 2H),- 4,06(t, 2H); 2,03(t, 2H); l,5(m, 6H). Биологические испытани . Испытани на морских свинках осуществл ют следующим образом. Правое предсердие морской свинки подве111ивают с нат жением 1 г (изометрическое нат жение) в тканевой ванне с термостатическим регулированием (30 С) емкостью 25 мл, содержащей насыщеннмй кислородом (95% 0,, 5/, СО) буфер Krebs-Henseleit (,4). Ткань стабилизируют в течение ч и в течение этого времени ее промывают 24 раза. Отдельные сокращени регистрируют посредством датчика силового смещени , с использованием измерител деформации, мгновенные частоты . сокращени регистрируют посредством кардиотахометра. Получают значение контрольной ответной реакции на I мкмоль гистамина, после чего ткань промывают три раза и снова привод т в равновесное состо ние до основного показател частоты. После установлени равновеси , дл щегос 15 мин, ввод т испытываемое соединение до желаемой конечной концентрации. Через 10 мин после введени соединени снова ввод т гистамин (1 мкмоль) и ответную реакцию на гистамин в присутствии антагониста сравнивают с контрольной ответной реакцией на гистамин (результат выражают в процентах от контрольной реакции на гистамин). После этого стандартными методами определ ют кажущуюс константу диссог циации антагониста гистамина Н-2. Испытание с аминопирином осуществл ют следующим образом. Удал ют слизистую оболочку желудка из мышцы дна желудка и промывают ее в буфере t, содержащем на 1 л раствора, г: NaCl 8,077; КС1 0,201; NaHP040,I13, rai,Pq,0,204; CaCl х X 2 HgO 0,132; ,10i; глюкоза 1, с регулированием величины рН до 7,4 посредством NaOH. Ткань тонко измельчают, суспензируют в буфере 1 и промывают в нем тр)и раза. Затем ткань суспензируют в диспергирующей среде: коллагеназа (Sigma Chemical Со, тип V) 100 мг и альбумкн коровьей сыворотки (Miles Laborairories Ltd, фракци V) 100 мг в буфере 1 (100 мл); 50 мл на 10 г чистого веса ткани и термостатируют при 30С и рН 7,4 ( поддерживают при непрерывном регулировании ) при перемешивании в атмосфере кислорода. Через 30 мин тка ни дают возможность осесть и поверх ностный жидкостный слой удал ют. Ввод т свежую порцию диспергирующей среды и продолжают термостатировани с использованием ткани, котора в большей своей части диспергируетс в железы и целые клетки через 4060 мин. Оставшиес большие кусочки ткани удал ют путем фильтрации чере нейлоновую сетку. Смесь желез и кле ток извлекают центрифугированием при 200 X g и суспензируют в буфер 1, содержащем 15 альбумина коровьей сыворотки (Miles Laboratories Ltd, фракци V), Затем железы и клетки промывают три раза буфером 1 и суспензируют в буфере 2, содержащем Eagles MEM (500 мл), апротин ,(Sigma Chemical Со, 10 мг) и HEPES (( оксиэтил)пиперазин-I-ил этансульфокислоты , 150 моль, 20 мл) при поддер жании величины рН 7,4 посредством NaOH; 150 мл на 10 г чистого веса ткани. Эту тканевую суспензию перемешивают в атмосфере кислорода при ,32°С в течение по меньшей мере 1 ч. после чего ее можно использовать. Тканевую суспензию, термостатируют вместе с испытываемым соединением и аминопирином (10 мкмоль), меченым С в диметиламиновой группе (0,1 мкКи/мл) в течение 20 мин. Затем поглощение аминопирина стимулируют путем добавлени гистамина и ин гибитора фосфодиэстеразы (IC1 63197 Bio chem.Soc. Special Publucation, 1973, стр. 127-133) до конечных концентраций 10 и 5x10 моль соответственно . Через 18 мин клетки/железы извлекают из термостатированной среды путем фильтрации суспензии через стекл нный микрофибрильный фильтр. Клетки/железы быстро (в течение менее чем 10 с) промывают три раза охлажденным льдом буфером 1. Аминопирин ,меченый С/ , удерживаемый тканью, измер ют с помощью сцинтилл ционного счетчика, степень инги бировани поглощени испытываемым соединением рассчитывают путем сопро тивлени с контрольным образцом. Затем с помощью графиков, полученных в р де испытаний, проводимых при раз личных концентраци х, рассчитывают концентрацию испытываемого соединени , дающую ингибирование на 50%. Соединени испытывают либо в экспериментах с предсердием морских свинок , либо в экспериментах с аминопирином . Все соединени , подвергнутые испытанию в экспериментах с предсердием морских свинок, вл ютс активными при концентрации в тканевой ванне 10 мкмоль или ниже этой концентрации и более активные соединени показывают полное ингибирование ответной реакции при этой концентрации. Все соединени , подвергнутые испытанию в экспериментах с аминопирином, показывают 50%-ное ингибирование поглощени аминопирина при концентрации 3 мкмоль или менее. Ингибирование секреции кислоты желудочного сока может быть продемонстрировано стандартными испытани ми , например, но способоности соединени предлагаемой формулы при вводе его путем внутривенной инъекции, че- , рез желудок или через рот ингибировать секрецию кислотного желудочного сока, например, у крыс или.у собак, у которых имеетс желудочный свищ или денервированные углублени дна желудка и у которых секреци желудочного сока, стимулируетс путем ввода секретогенного агента, например гистамина, пентагастрина, бетанехола или пищи. Испытание на крысах провод т следующим образом. Самок крыс (весом 200-230 г) анестезируют путем внутримьш1ечного уретана (1,5 г/кг) и в трахею ввод т полную хирургическую иглу. Гибкую трубку пропуркают через пищевод в желудок и укрепл ют ее путем ст гивани ; в области шеи. Многодырочную пластмассовую трубку (диаметром 3 мм) пропускают в полостную зону желудка через надрез и в двенадцатиперстной кишке закрепл ют, прив зыва ее посредством хирургической нити к привратнику желудка. Солевой раствор (9 г/лНаС1) пропускают через желудок (посредством вставленной в пищевод полой иглы со скоростью 7 мл/мин, извлекают его из пилорического отвода через каждые 10 мин и собирают в химических стаканах. Секреци кислоты стимулируетс путем подкожного ввода специфиеского антагониста Н-2 димаприта, водимого дозой 10 мг/кг, с последующим вливанием 30 мг/кг/ч. Вьщеление ислоты рассчитывают путем титроваи 20 ммоль гидрата окиси натри 512 10 мин образцов до конечного значени рН 6,4 (выдел емых в течение 10 мин). Когда секреци достигает посто нного значени (плато на кривой, три последовательных показани с расхождением в пределах 5%), испытываемое соединение ввод т путем внутривенной инъекции через полую иглу, введенную в левую наружную ремную вену. Затем измер ют секрецию в течение последующих 2 ч. Приготавливают основной раствор каждого испытываемого соединени (10 мг/мл в диметилсульфоксиде) и , разбавл ют соответствующим образом соленым раствором так, чтобы обеспечивалась возможность ввода в организм дозы 1 мг/кг (диметилсульфоксид 2%). Испытание на собаках с хроническим свищем осуществл ют следующим образом. Испытани провод т на самках собак чистой бельгийской породы весом 9-12 кг, имеющих хронический желудочный свищ. В течение ночи их не корм т , при желании дают воду. В ходе эксперимента собаки слегка сдержанны в сто чем положении. При вводе испытываемого соединени путем внутривенной инъекции свищ открываетс и посше полного убеждени в том, что базапьна секреци не происходит в течение 30 мин, начинают осуществл ть непрерывное внутривенное вливание секретогенного агента (гистамина, 0,5 мкмоль/ /кг/ч). Пробы желудочной кислоты соби рают каждые 15 мин. Измер ют объем каждой пробы. 1 мл аликвотнуто пробу титру)Т до нейтральной 100 ммоль NaOH с целью определени концентрации кис лоты. Когда достигаетс посто нна секреци (плато кривой,1-2 ч) путем внутривенной инъекции ввод т испытываемое соединение в солевом растворе, пробы кислоты желудочного сока робира ют в течение дальнейших 2-3 ч, в ходе чего непрерывно продолжаетс вливание секретогениого агента. При исследовании испытываемого соединени путем внутрижелудочного BBOда . после полной убежденности 1з отсутствии базальной секреции в течение 30 мин испытываемое соединение, содер жащеес в 25 МП 0,5%-ной (вес/об.) оксипропилметилцеллкшозы и 0,1%-ного ( вес./об.) Твина 80 в воде ЧТвин тор гова марка), вливаетс по капл м в желудок через дозирующую трубку. 786 вставленную в свищ. Через 1 ч свищ снова открываетс и сразу же начинает вливание секретогенного агента аналогично описанному выше. Пробы кислоты желудочного сока измер ют аналогично описанному и приближение секреции кислоты к посто нному значению сравнивают с приближением сек рации кислоты к посто нному значению дл контрольного животного, в организм которого не ввод т испытуемое соединение. При изучении испытываемого соединени , вводимого чефез рот, оно используетс в форме желатиновых капсул вместе с 15 мл воды. Через 1 ч после ввода свищ открываетс и сразу же начинаетс внутривенное вливание секретогенного агента. Пробы желудочной кислоты измер ют аналогично описанному и приближение секреции кислоты к посто нному значению (к плато кривой) сравнивают с приближением секреции дл контрольного животного, в которое не ввод т испытываемое соединение . Испытание на собаках с денервироBa HHi .iM углублением дна желудка осу- ществл ют следуюг.гим образом. Испытани провод т на самцах собак коротконогой гончей весом 14-22 кг. Денервированные углублени в области железы дна желудка у этих собак получаютс при подготовке их к испытани м способом Rudick и др. В течение 4-6 недель животным дают возможность оправитьс от операции и затем еще в течение 2-3 мес до обычного использовани , чтобы позволить им привыкнуть к процедуре испытаний и секреторным реакци м. Собак не корм т в течение 23 ч перед экспериментом (но они имеют свободный доступ к воде) и в процессе эксперимента они слегка поддерживаютс тканевой пов зкой. После промывки углублени теплой водой путем подкожной инъекции вливают гистамин со скоростью 10 мкг/мин. Така доза приводит к менее чем максимальному (60-90% от максимального) увеличению выделени кислоты при всех используемых собаках. Выделени желудочного сока из углублени собирают через казкдые 15 мин в градуированные стекл нные пробирки и измер ют объем секреторных вьщелений, прибли- , жающийс к 0,1 мл. Пробу в количестве 500 мкл разбавл ют 5 мл .солевого раствора и величину рН доводУ1т до 7,0 посредством 100 ммоль NaOH. Общее вьщеление кислоты рассчитывают как произведение концентрации кислоты на объем выделенногб желудочного сока. Испытываемые соединени ввод т внутривенно (0,1 мл/кг) через лучевую подкожную вену или через рот в виде желатиновой капсулы после достижени посто нной секреции (расхождение в трех последовательных показани х в . пределах 10%). Секрецию измер ют в течение 3 ч после ввода испытываемого соединени .
Результаты, полученные при испытании на предсердии и с использованием аминопирина, позвол ют предска
зать активность данных соединений дл испытываемых крыс и собак.
Результаты биологических испытаний .
Соединени испытывают аналогично описанному методу дл аминопирина по сравнению с 2-гуанидин-4- 2-(2-циaн3-мeтилгyaш дин )-зтилтиoмeтил тиaзoлoм (соединение А), аналогом по структуре. Соединение А дает 50%-ное подавление действи гистамина Н-2 при концентрации 0,057 мкмоль. Соединени 1 а и 16 дают подавление при 0,0036 и 0,0087 мкмоль соответстве ннр , что на пор док меньше, чем сравнительное соединение и свидетельствует о более высокой актив кости данных соединений как антагони стов гистамина .