SK8999A3 - Antifreeze proteins - afp substances, method for attaining them, a vector, transformed organisms, frozen confection products and pre-mixture containing them - Google Patents

Description

Doterajší stav techniky

Anti-mrazové peptidy (AFP) boli navrhnuté na zlepšenie tolerancie k zmrazeniu potravín.

Na účely tohto vynálezu má výraz „AFP“ význam, ako je v tomto odbore známe, menovite znamená tie proteiny, ktoré vykazujú aktivitu inhibovania rastu ľadových kryštálov. Pozri napríklad US patent 5,118,792,

WO 90/13571 opisuje anti-mrazové peptidy vyrábané chemicky alebo pomocou techniky rekombinantnej DNA. AFP látky sa môžu vhodne použiť v potravinových produktoch. Príklad 3B ukazuje modifikované tvary kryštálov ľadu, ak sa zmes vody a ľadu zmrazí na film v spojení s 0,01 % hmotnostného AFP látky.

WO 92/22581 opisuje AFP látky z rastlín, ktoré sa môžu použiť na riadenie tvaru kryštálov ľadu v zmrzline. Tento dokument tiež opisuje spôsob extrahovania polypeptidovej zmesi z extracelulárnych priestorov rastlín pomocou infiltrovania listov s extrakčným činidlom bez rozrušenia rastlín.

WO 94/03617 opisuje výrobu AFP látok z kvasiniek a ich možné, použitie v zmrzline. WO 96/11586 opisuje rybacie AFP látky vyrábané pomocou mikróbov.

Viaceré miesta v literatúre tiež uvádzajú izoláciu a/alebo použitie rastlinných proteínov na kryoochranu. Kryoochranné proteiny majú úlohu pri ochrane rastlinných membrán proti poškodeniu mrazom. Tieto proteiny však nemajú vlastnosti inhibície rekryštalizácie a preto nie sú zahrnuté do pojmu AFP.

Hincha v Journal of Plánt Physiology, 1992, 140, 236 až 240 opisuje izoláciu kryoochranných proteínov z kapusty.

-2Volger v Biochimica et Biiophysica Acta, 412 (1975), 335 až 349 opisuje izoláciu kryoochranných listových proteínov zo špenátu.

Boothe v Plánt Physiol (1995), 108: 759 až 803 opisuje izoláciu proteínov z Brassica napus (kapusty repkovej). Znova sa tieto proteíny považujú skôr za kryoochranné proteíny než za AFP látky.

Neven v Plánt Molecular Biology 21: 291 až 305, 1993 opisuje DNA charakterizáciu špenátového kryoochranného proteínu.

Salzman v Abstracts and Reviews z 18-teho výročného stretnutia ASEV/Eastern Sekcie v Am. J. Enol. Vitie., Vol. 44, No. 4, 1993 opisuje prítomnosť polypeptidov stabilných za varu v púčikoch viniča. Hoci sú proteíny analogické k rybacím anti-mrazovým peptidom, sú to kryoochranné proteíny a nie AFP látky.

Lin v Biochemical and Biophysical Research Communiication, Vol. 183, No. 3, 1992, strany 1103 až 1108 a v Lin, Plánt Physiology (1992) 99, 519 až 525 opisuje 15 kDa kryoochranný polypeptid z Arabidopsis Hakaira (arábkovka Hakairaova).

Houde v The Plánt Journal (1995) 8(4), 583 až 593 spomína kryoochranné proteíny zo pšenice.

Ďalej, ako je ilustrované v príklade VII, extrakty kapusty, špenátu, kapusty repkovej a arábkovky nemajú po zahriati proteíny inhibujúce rekryštalizáciu.

Doteraz však použitie AFP látok nebolo aplikované v komerčne dostupných potravinových produktoch. Jedným z dôvodov pre to sú vysoké náklady a komplikovaný spôsob získania AFP látok. Iným dôvodom je, že AFP látky, ktoré boli doteraz navrhnuté na použitie v zmrazených potravinových produktoch, nemôžu byť včlenené v zmesiach štandardných prípravkov, pretože majú sklon k destabilizácii počas spracovania zvlášť počas kroku pasterizácie. Predpokladá sa, že táto destabilizácia je spôsobená denaturáciou AFP látok; čo je dobre známy efekt bežne pozorovaný pre peptidy a proteíny.

Tento vynález má za cieľ poskytnúť riešeniatýchto problémov.

Prekvapivo sa zistilo, že AFP látky sa môžu izolovať z prírodných zdrojov, ako napríklad z rastlín aklimatizovaných na chlad, pomocou nového relatívne jednoduchého procesu. Tento spôsob vedie najprv k identifikácii AFP látok, ktoré sa

-3môžu vhodne včleniť do zmesi na prípravu zmrazených produktov pred ich pasterizáciou.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob získania AFP látok z prírodných zdrojov a tento spôsob zahrnuje kroky:

a) izolovanie šťavy, obsahujúcej AFP látky z prírodného zdroja;

b) tepelné opracovanie prírodného zdroja alebo šťavy obsahujúcej AFP látky teplotou najmenej 60 °C;

c) odstránenie nerozpustnej časti.

Krok c vyššie uvedeného spôsobu bude obvykle po krokoch a a b. Kroky a a b môžu byť urobené v akomkoľvek požadovanom poradí, napríklad krok a nasledovaný krokom b (v tom prípade sa bude zahrievať šťava bohatá na AFP látky) alebo krok b nasledovaný krokom a (v tom prípade sa bude zahrievať prírodný zdroj) alebo sú krok a a b simultánne.

Prekvapivo sme zistili, že proces izolácie podľa tohto vynálezu má početné výhody.

Po prvé použitím tohto spôsobu už nie je potrebné zabrániť rozrušeniu prírodného zdroja, ako napríklad rastlín, ako sa požadovalo v spôsoboch podľa WO 92/22581. To ihneď významne zvyšuje komerčnú použiteľnosť tohto procesu, napríklad v porovnaní s WO 92/22581, pretože už nie sú potrebné vysoké investičné náklady na špecifické spracovanie.

Tiež sa týmto použitím vysokých teplôt zdá byť možné extrahovať z veľkej skupiny peptidov prítomných v prírodných zdrojoch nový výber veľmi aktívnych AFP látok prírodného materiálu, tieto AFP látky zahrnujú peptidy, ktoré sú veľmi aktívne vzhľadom na vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu.

Po tretie, oproti očakávaniam použitie vysokých teplôt nedenaturuje celý proteínový materiál, ale zdá sa, že denaturuje len niektoré z proteínov, pričom zostávajúce AFP látky majú zvýšenú tepelnú stabilitu. To poskytuje možnosť

-4zahrnúť izolované AFP látky v zmesiach, ktoré sa majú podrobiť vyšším teplotám, napríklad pasterizačnému kroku. To je zvlášť prekvapivé, pretože napríklad AFP látky z WO 92/22581 sa nejavia stabilnými za podmienok zahrievania (pozri príklad VI).

Spôsob podľa tohto vynálezu zahrnuje v kroku b zahrievanie prírodného zdroja alebo šťavy bohatej na AFP látky pri teplote viac ako 60 °C. Výhodne je teplota od 60 do 110 °C, najvýhodnejšie od 80 do 105 °C. Krok zahrievania sa môže uskutočniť po izolácii šťavy bohatej na proteíny (krok a) alebo pred izoláciou šťavy bohatej na proteíny. Môže sa použiť akýkoľvek vhodný spôsob zahrievania šťavy, napríklad konvenčné alebo mikrovlnové zahrievanie, zahrievanie voliteľne s pridaným extrakčným činidlom, parou atď.

Ak sa použije extrakčné činidlo, výhodne je použité v malých objemoch, aby sa zabránilo nepotrebnému zriedeniu AFP frakcie. Môže sa použiť akékoľvek vhodné extrakčné činidlo, avšak použitie vody je zvlášť výhodné. Ak sa to požaduje, môžu sa pridať do vody aditíva pred jej použitím ako extrakčného činidla. Najvýhodnejšie sa však používa voda v podstate bez prídavkov.

Spôsob podľa tohto vynálezu sa môže aplikovať na akýkoľvek prírodný zdroj tepelne stabilných AFP látok. V tomto zozname sú zahrnuté rastliny, ryby, hmyz a mikroorganizmy. Môžu sa použiť aj prirodzene sa vyskytujúce látky a aj látky, ktoré boli získané pomocou genetickej modifikácie. Napríklad mikroorganizmy alebo rastliny sa môžu geneticky modifikovať tak, aby došlo k expresii AFP látok a tieto AFP látky sa potom môžu izolovať v zhode s týmto vynálezom. Takto môžu byť získané AFP látky, ktoré majú najmenej 80 %, výhodnejšie viac ako 95 %, najvýhodnejšie 100 % homológiu na AFP látky priamo získané z prírodných zdrojov. Pre účely vynálezu proteíny, ktoré majú túto vysokú úroveň homológie, sú tiež zahrnuté do pojmu AFP látok. Do rozsahu tohto vynálezu sú tiež zahrnuté tieto transformované mikroorganizmy alebo rastliny schopné expresie génov kódujúcej AFP látky.

Na výrobu tepelne stabilných AFP látok opísaných v tomto vynáleze sa môžu použiť genetické manipulačné techniky. Príslušná hostiteľská bunka alebo organizmus by sa mohol transformovať pomocou génového konštruktora, ktorý

-5kóduje požadovaný tepelne stabilný polypeptid. Nukleotidová sekvencia kódujúca tepelne stabilný polypeptid sa môže vložiť do vhodného expresného vektora, obsahujúceho potrebné prvky na transkripciu a transláciu a to takým spôsobom, že expresia bude vykonaná za príslušných podmienok (napríklad vo vhodnej orientácii a správnom čítacom rámci ä s príslušnými cieľovými a expresnými sekvenciami). Metódy vyžadované na konštrukciu týchto vektorov expresie sú dobre známe odborníkom v tejto oblasti.

Na expresiu sekvencie kódujúcej tepelne stabilný polypeptid sa môžu použiť mnohé systémy expresie. Tieto systémy zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, baktérie, bunkové systémy kvasiniek hmyzu, systémy rastlinných bunkových kultúr a rastliny, všetko transformované s príslušnými expresnými vektormi.

Rôzne rastliny a rastlinné bunkové systémy sa môžu transformovať s konštruktorom nukleových kyselín polypeptidov izolovaných z tepelne stabilného extraktu. Výhodné uskutočnenia by zahrnovali, ale nie sú na ne obmedzené, kukuricu, rajčiny, tabak, karotku, jahody, repku a cukrovú repu.

Výhodne je AFP látka získaná z rastliny (to znamená, že buď je táto AFP látka priamo získaná z rastliny ako prírodného zdroja alebo AFP látky, ktoré majú vysoký stupeň homológie na tieto AFP látky, sú transgeneticky produkované v iných organizmoch). Môže sa použiť akákoľvek rastlina obsahujúca tepelne stabilné AFP látky, výhodne sú to však prírodné sa vyskytujúce rastliny (alebo ich geneticky modifikované verzie), ktoré sú schopné rásť za chladných podmienok, takže obsahujú AFP látky. Zvlášť výhodné je použitie ozimnej raži, viacročných tráv a ostrice. Ďalšie vhodné rastliny môžu napríklad byť zó skupiny drevených rastlín, ozimných cereálií atď.

Zvlášť výhodne sú tepelne stabilné AFP látky získané z cukrového javora, bambusu, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Pererine, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta a Poa annua.

Šťava bohatá na AFP látky sa môže separovať zo svojho zdroja pomocou

-6akéhokoľvek vhodného procesu, napríklad lisovaním, filtrovaním, homogenizovaním, extrakciou atď. Výhodne sa prírodný zdroj AFP látky, ako napríklad rastlinný materiál, upravuje na malé kúsky alebo na kašu, predtým ako sa na proteín bohatá frakcia oddelí, napríklad pomocou filtrovania. Táto macerácia môže byť urobená pomocou akejkoľvek vhodnej metódy, napríklad v zmiešavači. Odborník bude určite schopný zvoliť materiál v takej forme, že sa oddelenie šťavy bohatej na proteíny môže ľahko uskutočniť.

Po oddelení a zahrievaní (v požadovanom poradí) sa proteínová frakcia výslednej AFP látky obsahujúcej vzorky môže potom opracovať pomocou akéhokoľvek vhodného procesu v takom poradí, aby sa odstránila nerozpustná frakcia a zachytila na AFP látky bohatá kvapalná frakcia. Nerozpustná frakcia sa môže odstrániť, napríklad filtrovaním, zrážaním, atď. Na AFP látky bohatá kvapalina sa môže potom výhodne ďalej spracovať tak, aby sa skoncentrovali alebo izolovali AFP látky, čím sa uvedú do formy vhodnej na ďalšie použitie. Príkladmi vhodných procesov sú sušenie, čím sa získa prášok alebo pasta, ďalej skoncentrovanie, čím sa získa koncentrát AFP látok, chromatografia, čím sa odseparujú AFP látky od extrakčného činidla atď. Odborník bude opäť schopný určiť vhodné prostriedky a podmienky na príslušnú izoláciu.

Pre niektoré prírodné zdroje, AFP látky získané pomocou vyššie opísaných metód môžu pozostávať zo zmesi dvoch alebo viacerých rôznych AFP látok. Ak sa to požaduje, môžu sa tieto AFP látky separovať pomocou akéhokoľvek konvenčného procesu, napríklad chromatografiou alebo inými procesmi založenými na rozdieloch vo fyzikálno/chemických vlastnostiach, ako je napríklad molekulová hmotnosť.

Ak sa to tiež požaduje, môže sa určiť aminokyselinové zloženie a sekvencia izolovaných AFP látok. Na tieto ciele sa môže použiť akákoľvek vhodná metóda. Príklady vhodných metód sú opísané v Príkladoch. Ak sa to tiež požaduje, môže sa určiť sekvencia nukleových kyselín, ktorá kóduje AFP látky. Vektor obsahujúci sekvenciu nukleových kyselín schopný kódovať aminokyseliny je tiež zahrnutý v rozsahu tohto vynálezu.

Na základe vyššie opísanej informácie je tiež možné geneticky modifikovať

-7 iné prírodné zdroje, napríklad tak, aby produkovali výhodné AFP látky, ako sú identifikované vyššie v tomto dokumente. Príklady vhodných AFP látok sú opísané v príkladoch.

Zistilo sa, že AFP látky získané pomocou vyššie opísaných procesov mali zvýšenú schopnosť vydržať tepelné opracovanie. Predpokladá sa, že takéto AFP látky doteraz neboli izolované. Ako je opísané vyššie, táto zvýšená tepelná odolnosť je zvlášť zaujímavá na použitie v potravinových produktoch, ktoré sa podrobujú kroku zahrievania, napríklad pri pasterizácii.

Podľa ďalšieho aspektu sa vynález týka AFP látok, ktoré majú tepelnú stabilitu, podľa dôkazu pomocou nevýznamného zníženia vlastnosti inhibície rekryštalizácie po tepelnom-opracovaní počas jednej hodiny pri 80 °C alebo 10 minút pri 100 °C. Vhodný test na určenie zníženia vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu je opísaný v príkladoch a zahrnuje rýchle zmrazenie na -40 °C, po čom nasleduje uskladnenie počas jednej hodiny pri -6 °C. Výhodne spôsobujú AFP látky, ktoré sú podrobené tomuto testu po tepelnom opracovaní, veľkosť častíc kryštálov ľadu, ktorá je o menej ako 5 pm väčšia ako veľkosť kryštálov ľadu vzorky s rovnakou AFP látkou, ktorá nebola tepelne opracovaná. Výhodne je rozdiel menej ako 3 pm, najvýhodnejšie menej ako 1 pm.

Výhodne sú ako tieto AFP látky vybrané tie, ktoré majú významné vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu. Vhodný test na určenie vlastnosti inhibície rekryštalizácie je naznačený v príklade VI. Výhodne AFP látky podľa tohto vynálezu poskytujú veľkosť častíc ľadu po skúške inhibície rekryštalizácie, ako je opísané v príkladoch, 15 pm alebo menej, výhodnejšie od 5 do 15 pm.

AFP látky sa môžu vhodne použiť v potravinových produktoch, výhodne v potravinových produktoch, ktoré sú zmrazené alebo určené na zmrazenie. Zvlášť výhodné je použitie AFP látky v produktoch, ktoré sú zahrievané, napríklad pri pasterizácii alebo sterilizácii pred zmrazením. Zvlášť výhodné je použitie v zmrazených cukrárenských produktoch.

Príkladmi takýchto potravinových produktov sú: zmrazené cukrárenské zmesi, ako napríklad smotanové zmrzlinové zmesi a zmrzlinové zmesi, ktoré sú

-8určené na pasterizáciu pred zmrazením. Takéto zmesi sú obvykle uskladnené pri teplote okolia. Vhodné formy produktu sú napríklad: prášková zmes, ktorá je balená napríklad v balíčku alebo v sáčkoch. Táto zmes je schopná tvoriť základ zmrazeného potravinového produktu, napríklad po pridaní vody a voliteľne iných zložiek a voliteľne po prevzdušnení.

Ďalším príkladom vhodnej zmesi by mohla byť kvapalná zmes (voliteľne prevzdušnená), ktorá, ak je to potrebné, po pridaní ďalších zložiek a voliteľne ďalšom prevzdušnení, sa môže zmraziť.

Jasná výhoda vyššie uvedených zmesí je, že prítomnosť AFP zložky spôsobí, že zmesi môžu byť zmrazené za podmienok kľudu, napríklad v podniku alebo v domácej mrazničke bez tvorby neprijateľných tvarov kryštálov ľadu a teda s textúrou odlišnou od produktov normálne získaných pomocou zmrazenia v kľude.

Veľmi vhodne sa tieto zmesi balia do uzavretých kontajnerov (napríklad kartónov, vreciek, krabie, plastových kontajnerov atď). Pre jednotlivé porcie bude veľkosť balenia všeobecne od 10 do 1000 g. Pre viacnásobné porcie môže byť výhodná veľkosť balenia do 500 kg. Všeobecne bude veľkosť balenia od 10 g do 5000 g.

Ako je naznačené vyššie výhodné produkty, kde sú použité AFP látky, sú zmrazené cukrárenské produkty. Ako napríklad smotanová zmrzlina alebo zmrzlinová dreň. Výhodne je hladina AFP látky od 0,0001 do 0,5 % hmotnostného z konečného produktu. Ak sú použité suché zmesi alebo koncentráty, koncentrácia môže byť vyššia, aby sa zabezpečilo, že hladina v koncovom zmrazenom produkte je vo vyššie opísaných rozsahoch.

, >

Prekvapivo sa zistilo, že zmesi podľa tohto vynálezu môžu obsahovať veľmi malé množstvá AFP látky, a pritom majú dobrú kvalitu.

Prekvapivo sa zistilo, že hladina AFP látky môže byť nízka až 0,1 až 50 ppm, pričom sa ešte stále poskytujú adekvátne vlastnosti rekryštalizácie a teplotnej tolerancie v zmrazených cukrárenských produktoch. Hoci si prihlasovatelia neželajú byť viazaní akoukoľvek teóriou, dôvodom pre to môže byť, že interakcia medzi tuhými látkami zmrazených cukroviniek a AFP látkami poskytuje vynikajúci mechanizmus inhibovania rastu kryštálov. Najvhodnejšie hladina AFP látky je od 1

-9do 40 ppm, zvlášť výhodne od 2 do 10 ppm.

Na účely vynálezu pojem „zmrazené cukrárenské produkty“ zahrnuje zmrazené sladkosti, obsahujúce mlieko, ako je napríklad smotanová zmrzlina, zmrazený jogurt, šerbet, ovocná zmrzlina, mliečna zmrzlina a zmrazený vaječný krém, zmrzliny, granity a zmrazené ovocné pyré. Na niektoré aplikácie je použitie vo fermentovaných potravinových produktoch menej výhodné.

Výhodne je hladina tuhých látok v zmrazených sladkostiach (napríklad cukor, tuk, príchuť atď) viac ako 4 % hmotnostné, napríklad viac ako 30 % hmotnostných, najvýhodnejšie od 40 do 70 % hmotnostných.

Zmrazené cukrárenské produkty podľa tohto vynálezu sa môžu vyrábať pomocou akejkoľvek metódy vhodnej na výrobu zmrazených cukroviniek. Zvlášť výhodne sa však všetky zložky prípravku úplne zmiešajú pred pasterizáciou a pred tým, ako začne proces zmrazenia. Proces zmrazenia môže výhodne zahrnovať krok stuhnutia, napríklad na teplotu -1 °C (-30 °Fahrenheita) alebo nižšie.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia AFP látok najprv oddelením šťavy nasledovaným tepelným opracovaním a izoláciou AFP látok.

Ozimná raž (Halo varieta) sa skosila v januári (priemerná teplote v tomto mesiaci bola 3,5 °C, čo zabezpečuje vhodnú studenú aklimatizáciu rastlín). Tkanivo sa rýchlo prenieslo do laboratória na ďalšie spracovanie a premylo sa dôkladne na odstránenie špiny.

400 g odrezkov sa homogenizovalo pri teplote okolia v zariadení Waring blender s 800 g vody, kým sa listové tkanivo úplne nerozrušilo. Šťava bohatá na AFP látky sa oddelila filtráciou cez 4 vrstvy mušelínu.

Šťava bohatá na AFP látky sa potom podrobila teplotnému opracovaniu varom počas 10 minút. To spôsobilo zrážanie proteínu, kým AFP látky na použitie podľa tohto vynálezu zostali v roztoku. Supernatant sa oddelil od zrazeniny

- 10pomocou centrifugácie pri 15000 g počas 20 minút alebo pomocou ďalšej filtrácie cez mušelín.

AFP sa môžu izolovať z tohto supernatantu pomocou vymrazovacieho sušenia.

Na kontrolné účely sa apoplastický extrakt (extracelulárny extrakt) ozimnej raži môže získať takto: Listy z rastliny aklimatizovanej 30 dní v chlade sa narezali na 3 cm dĺžky a starostlivo sa premyli v destilovanej vode, aby sa odstránil bunkový obsah. Kúsky listov sa poklepaním vysušili na papierovej utierke a úplne sa ponorili do extrakčného činidla 5 mmol/l EDTA, 10 mmol/l kyseliny askorbovej, 2 mmol/l kyseliny kaprónovej, 2 mmol/l benzamidínu a 1 mmol/l fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Potom sa vákuovo filtrovali v Buchnerovej banke počas 60 minút a po tejto dobe sa listy odstránili a poklepaním sa úplne vysušili. Potom sa usporiadali pozdĺžne v odrezanom obale plastovej striekačky a jemne sa centrifugovali pri 2000 X g počas 30 minút. Apoplastický extrakt sa oddelil do Eppendorfovej skúmavky pod striekačkou. ¹

Príklad 2

Izolácia AFP najprv zahriatím prírodného zdroja, po čom nasleduje izolovanie šťavy bohatej na AFP a izolovanie AFP látky.

Zmiešané trávové tkanivo (obsahujúce Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus a Bromus sterilis) sa skosilo v januári (priemerná teplote v tomto mesiaci bola 3,5 °C, čo zabezpečuje vhodnú studenú aklimatizáciu rastlín). Tkanivo trávy sa rýchlo prenieslo do laboratória na ďalšie spracovanie a premylo sa dôkladne na odstránenie špiny.

500 g odrezkov trávy sa umiestnilo do 650 Wattovej mikrovlnovej piecky a zahrievalo sa pri plnom výkone počas 5 minút, pričom teplota vzrástla na 85 až 100 °C. Odrezky trávy sa potom ochladili na laboratórnu teplotu.

Alternatívne sa odrezky trávy zmiešali s 500 g vriacej vody a zmes sa znova zahriala na 100 °C, po čom nasleduje var počas 10 minút za premiešavania a potom sa ponechali ochladiť na 60 °C.

- 11 Po kroku zahrievania sa na AFP látky bohatá šťava oddelila od odrezkov pomocou filtrácie. Táto hmota sa kontinuálne premiešavala počas 5 minút v prítomnosti rovnakého objemu vody a potom sa pretlačila cez 3 vrstvy mušelínu.

Tento supernatant sa môže sušiť vymrazením tak, aby sa odstránila voda, po čom nasleduje uskladnenie. Alternatívne sa na uskladnenie môže zmraziť supernatant.

Príklad 3

Kvapalná pred-zmes na prípravu smotanovej zmrzliny sa pripravila zmiešaním:

Zložka	% hmotnostné
sušené odstredené mlieko	11,390
sacharóza	3,410
maltodextrírí (MD40)	4,000
guma rohovníka obyčajného	0,072
obilný sirup 63DE	20,705
guarová guma	0,048
Genulacta L100	0,020
maslo	9,015
Avicel RC581	0,240
želatína	0,140
monoglycerid (palmitan)	0,450
vanilín	0,010
AFP (z Príkladu I*)	0,010 alebo žiadne (kontrolná vzorka)
voda	doplnok

* Poznámka: AFP látka sa pridáva ako koncentrovaný roztok použitím trochu pridanej vody ako zrieďovadla; percentá zodpovedajú množstvu AFP látky

Táto zmes sa môže vhodne pasterizovať pri 85 °C počas 15 sekúnd a

- 12uskladniť v chladenej nádobe.

Zmes sa môže použiť na prípravu smotanovej zmrzliny šľahaním s konvenčným domácim mixérom na našľahanie asi 100 %, po čom nasleduje zmrazenie v kľude v domácej mrazničke. Zmesi podľa tohto vynálezu mali význačne lepšiu textúru ako kontrolná vzorka.

Veľmi dobré výsledky sa získali použitím AFP látok z Príkladu 2 namiesto AFP látok z Príkladu 1.

Príklad 4

Kvapalná pred-zmes na prípravu smotanovej zmrzliny sa pripravila zmiešaním:

Zložka	% hmotnostné
sušené odstredené mlieko	10,00
sacharóza	13,00
maltodextrín (MD40)	4,00
guma rohovníka obyčajného	0,14
maslový olej	8,00
monoglycerid (palmitan)	0,30
vanilín	0,01
AFP (z Príkladu I*)	0,01 alebo žiadne (kontrolná vzorka)
voda	doplnok

* Poznámka: AFP látka sa pridáva ako koncentrovaný roztok v trochu vody; percentá zodpovedajú množstvu AFP látky.

Zložky sa zmiešali pri teplote okolia, po čom nasledovala pasterizácia počas 60 sekúnd pri 89 °C. Zmes sa aseptický plnila do balení po 500 ml, uzavrela a uskladnila pri teplotách okolia.

Zmes sa môže použiť na prípravu smotanovej zmrzliny šľahaním s konvenčným domácim mixérom na našľahanie asi 70 %, po čom nasleduje

- 13zmrazenie v pokoji v domácej mrazničke.

Po dvoch mesiacoch uskladnenia mala zmes podľa tohto vynálezu značne lepšiu textúru než kontrolná vzorka.

Veľmi dobré výsledky sa získali použitím AFP látok z Príkladu 2 namiesto AFP látok z Príkladu 1.

Príklad 5

Zopakoval sa Príklad 4, ale teraz sa smotanová zmrzlinová zmes predvzdušnila na našľahanie 70 % pred aseptickým plnením a uzavretím.

Výsledný produkt sa môže uskladniť pri teplote okolia a smotanová zmrzlina sa môže vyrobiť umiestnením zmesi v domácej mrazničke a zmraziť za podmienok pokoja.

Príklad 6

Vlastnosti inhibície rekryštalizácie AFP látok sa môžu určiť takto:

Vzorka AFP obsahujúceho roztoku vo vode sa upravila na hladinu obsahu sacharózy 30 % hmotnostných (ak východisková hladina vzorky je viac ako 30 % hmotnostných, dosiahlo sa to zriedením, ak východisková hladina bola nižšia, pridala sa sacharóza do hladiny 30 % hmotnostných).

μΙ kvapka vzorky sa umiestnila na 22 mm krycie sklíčko. Potom sa na vrch položí krycie sklíčko 16 mm priemeru a na vzorku sa umiestni 200 g hmotnosť, aby sa zabezpečila vrstva s rovnomernou hrúbkou. Hrany krycieho sklíčka sa uzavrú s čírym lakom na nechty.

Preparát sa umiestni na plošinu Linkham THM 600 teplotné riadeného mikroskopu. Plocha sa rýchlo chladí (50 °C za minútu) na -40 °C, aby sa vytvorila veľká populácia malých kryštálov. Teplota plochy sa potom rýchlo zvyšuje (50 °C za minútu) do -6 °C a udržuje sa pri tejto teplote.

Ľadová fáza sa pozoruje pri -6 °C použitím Leica Aristoplan mikroskopu. Podmienky polarizovaného svetla v spojení s lambda platňou boli použité na

- 14zlepšenie kontrastu kryštálov ľadu. Stav ľadovej fázy (veľkosť kryštálov ľadu) sa zaznamenáva pomocou 35 mm fotomikrografie pri T = 0 a T = 1 hodina.

Všeobecne sa test môže aplikovať na akúkoľvek vhodnú zmes zahrnujúcu AFP látku a vodu. Všeobecne hladina obsahu AFP látky v tejto testovej zmesi nie je veľmi kritická a môže napríklad byť od 0,0001 do 0,5 % hmotnostného, výhodnejšie 0,0005 až 0,1 % hmotnostného, najvýhodnejšie 0,001 až 0,05 % hmotnostného, napríklad 0,01 % hmotnostného.

Akákoľvek vhodná zmes obsahujúca AFP látku a vodu sa môže použiť na vykonanie tohto testu. Všeobecne však nebude potrebné získať AFP látky v čistenej forme. Pre praktické aplikácie by normálne stačilo pripraviť kvapalný extrakt alebo šťavu prírodného materiálu, pričom sa potom môže testovať tento extrakt alebo šťava.

Táto metóda sa môže aplikovať napríklad na extrakty obsahujúce AFP, ako sú získané v Príklade I alebo II, s krokom alebo bez kroku skoncentrovania.

Merali sa vlastnosti inhibicie rekryštalizácie viacerých vzoriek. Vzorky sa získali z raži, ktorá sa zberala vo viacerých momentoch počas roka. Šťavy AFP získané po extrakcii a zahrievaní v zhode s Príkladom I sa merali z hľadiska rekryštalizačných vlastností, ako je uvedené vyššie. Ako porovnanie sa použila raž, ktorá narástla v skleníku (pri teplotách, ktoré normálne nevyvolávajú tvorbu AFP látok)

Namerali sa nasledujúce veľkosti kryštálov

Vzorka	Veľkosti kryštálov ľadu po 1 hodine (pm)
Kontrolná vzorka	25
vzorka December	17
vzorka Január	10
vzorka Február	15
vzorka Marec	18
vzorka Apríl	18
vzorka Máj	25

- 15Tieto merania ukazujú, že pre dobrú AFP aktivitu by sa rastliny mali zberať počas zimných mesiacov, napríklad od decembra do apríla. Zvlášť výhodné sú vzorky schopné poskytnúť veľkosti kryštálov ľadu 15 μιτι alebo menej. V tomto prípade sa to môže dosiahnuť zberaním rastliny v januári alebo februári.

Rovnaké merania sa urobili pre AFP vzorky z januára, ktoré sa tepelne opracovali (1 hodina pri 60 °C). Nebolo pozorované žiadne významné zníženie vlastností rekryštalizácie.

Ako porovnanie sa použil apoplastický extrakt z Príkladu I. To spôsobilo konečnú veľkosť kryštálov ľadu po 1 hodine 11,1 pm; po tepelnom opracovaní varom počas 10 minút pri 100 °C, test poskytol po 1 hodine veľkosť kryštálov ľadu 16,8 μητ Tento príklad ukazuje, že apoplastický extrakt z ozimnej raži nie je tepelne stabilný.

Príklad 7

Extrakt tráv neopracovaný tepelne z tráv pozberaných v januári sa získal zo Silsoe (UK). Extrakt sa centrifugoval počas 1 hodiny, aby sa odstránilo znečistenie a nerozpustné zlomky týmto postupom, Centrifúga: Sorvall RC3C, Rotor :H6000A, Teplota: +5 °C, Rýchlosť rotora: 5000 otáčok./minútu (7268 g).

Vzorka extraktu sa vysušila zmrazením, aby sa určil jej celkový obsah tuhých látok. Zistila sa hodnota 11,48 mg/ml. Vysušený extrakt sa potom rehydratoval s roztokom 30 % hmotnostných sacharózy na svoju pôvodnú celkovú koncentráciu tuhých látok. Viaceré roztoky sa pripravili pomocou zriedenia podľa potreby s roztokom 30 % hmotnostných sacharózy.

Protimrazová aktivita sa merala použitím skúšky z Príkladu VI.

Na obrazoch z hodiny T = 0 a T = 1 zo skúšok inhibície rekryštalizácie sa ich stredné veľkosti kryštálov ľadu merali použitím analyzátora Zeiss TGA 10. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke nižšie.

Vzorky	Celkové tuhé látky (mg/ml)	Veľkosť kryštálov ľadu (pm)	Rast kryštálov ľadu za 1 hodinu pri -6 °C (pm)
T= 0	T= 1 hodina pri -6 °C
Nezdedená	11,48	5,2	7,3	2,1
50 % Extrakt	5,74	5,5	7,6	2,1
25 % Extrakt	2,87	6,3	8,9	2,6
12,5 % Extrakt	1,435	6,6	13,1	6,5
6,25 % Extrakt	0,7175	8.1	14,7	6,6
3.125 % Extrakt	0,359	7,4	17,0	9,6
1,5625 % Extrakt	0,179	9,0	20,3	11,3

Tieto výsledky ukazujú zmeny v konečnej veľkosti kryštálov a zmenu veľkosti kryštálov ľadu po 1 hodine pri -6 °C pre rôzne zriedenia extraktu trávy. Možno vidieť, že hladina tuhých látok v trávovom extrakte sa môže meniť v širokom rozsahu, pričom sa ešte získajú dobré vlastnosti inhibície rekryštalizácie. Výhodne sa vyberajú tie koncentrácie, ktoré spôsobujú veľkosť kryštálov ľadu po 1 hodine 15 mikrometrov alebo menej.

Podobný test sa urobil s trávovým extraktom, ktorý sa podrobil tepelnému opracovaniu (10 minút pri 100 °C). Nepozorovalo sa významné zhoršenie vlastností inhibície rekryštalizácie.

Ďalšie trávové extrakty z Príkladu II sa testovali použitím rovnakého testu inhibície rekryštalizácie. Získali sa nasledujúce výsledky:

Tepelné opracovanie

Veľkosť kryštálov v pm

	T=0	T=1
60 °C 1 hodiny	9,6	11,1
Var 10 minút	9,8	11,3

- 17Tieto výsledky ukazujú, že aj po zahrievaní si extrakt v chlade aklimatizovanej trávy zachoval schopnosť inhibovať rast kryštálov ľadu.

Príklad 8

Viaceré AFP látky obsahujúce rastliny sa zbierali v januári. Extrakty boli získané rozomletím čerstvého tkaniva, napríklad koreňov, stoniek, púčikov alebo listov v trecej miske s piestikom (ochladené na 4 °C) v rovnakom objeme pufra A (10 mmol/l EDTA, 20 mmol/l kyseliny askorbovej, pufrované s Tris na pH 7,4) udržiavanom na ľade. Homogenáty sa prefiltrovali cez jednu alebo viaceré vrstvy mušelínu a udržiavali sa na ľade pred ďalším použitím.

Extrakty sa podrobili testu inhibície rekryštalizácie z Príkladu VI aj po zahrievaní na 60 °C počas 1 hodiny aj po varení počas 10 minút.

Nasledujúce rastliny obsahovali tepelne stabilné AFP látky, podľa dôkazu pomocou zachovania vlastností inhibície rekryštalizácie: cukrový javor, bambus, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta a Poa annua.

Nasledujúce rastliny neobsahovali tepelne stabilné AIFP látky: kel, špenát, Brassica napus a Arabinopsis.

Príklad 9

Vlastnosť tepelnej hysterézy AFP látok sa môže testovať takto:

ml vzorky sa umiestnia v Eppendorfových skúmavkách v horúcom vodnom kúpeli a zahrievajú sa počas 1 hodiny pri 60 °C. Vlastnosti tepelnej hysterézy vzoriek sa potom merali takto:

Roztopený produkt sa umiestni na mikroskopovacie sklíčko (Camlab

-18Cambridge, hrúbka 0,1 mm). Konce mikrosklíčok sa uzatvoria s petrolejovým želé.

Do vzoriek sa pridá ľad použitím aerosólového zrnrazovacieho spreja. Sklíčko sa potom ponorilo do etanolového teplotné regulovaného kúpeľa pri -0,1 °C. Po 5 minútach sa kontrolovalo dosiahnutie rovnováhy vzorky. Ak sa ľad roztopil úplne teplota kúpeľa sa znížila po krokoch 0,1 °C po dosiahnutí rovnováhy. Tieto kroky sa opakujú, kým sa nedosiahne teplota, pri ktorej vo vzorke existuje malé množstvo kryštálov ľadu. Po dosiahnutí rovnováhy pri tejto teplote sa teplota kúpeľa znižovala po krokoch 0,01 °C za minútu. Teplota zmrznutia vzorky sa zaznamenáva ako teplota, pri ktorej sa začína šírenie ľadu z kryštálov v rovnováhe.

Teplota topenia vzorky sa potom určí zvýšením teploty začínajúc od teploty zmrazenia v krokoch 0,01 °C za minútu, kým sa všetky ľadové kryštály neroztopia. Táto teplota je teplota topenia vzorky.

Tepelná hysteréza vzorky je rozdiel medzi teplotami topenia a teplotou zmrazenie.

Tento testovací postup sa robí na prvej vzorke (pred tepelným opracovaním) a na druhej vzorke po tepelnom opracovaní nasledovanom chladením.

Podobne sa tepelná stabilita môže určiť pomocou vyššie opísaného testu, kde sa vzorka varí vo vode počas 30 sekúnd, po čom nasleduje určenie tepelnej hysterézy. Tepelná hysteréza sa merala pre viaceré vzorky.

Získali sa vzorky ozimnej raži, ktorá sa zberala pri viacerých časových momentoch počas roka. AFP šťavy získané po extrakcii a zahrievaní v zhode s Príkladom I sa merali z hľadiska ich tepelnej hysterézy ako v Príklade VI. Ako porovnanie sa použila Ozimná raž, ktorá rástla v skleníku (pri teplotách, ktoré normálne nevyvolávajú tvorbu AFP látok).

Namerali sa nasledujúce tepelné hysterézy

Vzorka	Tepelná hysteréza (°C)
kontrolná vzorka	0,04
vzorky december	0,18

vzorky január	0,21
vzorky február	0,17
vzorky marec	0,15
vzorky apríl	0,12
vzorky máj	0,05

Tieto merania ukazujú, že pre dobrú AFP aktivitu sa rastliny majú zberať počas zimných mesiacov, napríklad v decembri až marci.

Rovnaké merania sa robili na AFP vzorkách z januára, ktoré sa tepelne opracovali (1 hodina pri 60 °C). Nepozorovali sa žiadne významné zníženia v tepelnej hysteréze.

Príklad 10

Určenie aminokyselinovej sekvencia AFP látky

Tepelne stabilný trávový extrakt z Príkladu H sa skoncentroval približne desať krát použitím ultrafiltračnej komory Amicon s membránou rezu 10 kDa. Výsledný koncentrát sa dávkoval na Mono Q (Pharmacia) HR 5/5 FPLC kolónu s vymieňačom aniónom. Viazanie na kolónu bolo z pufra 50 mmol/l Tris/HCI pH 8,5 a Rl aktívna frakcia sa eluovala s lineárnym gradientom NaCI do konečnej koncentrácie 0,5 mol/l v tom istom pufri pH 8,5 Tris. Chromatografia sa vykonala pri prietokul ml/min a odoberali sa 1 ml frakcie a skúšali sa z hľadiska aktivity inhibície rekryštalizácie (ako v Príklade IX). s

Aktívne frakcie sa spojili dohromady a skoncentrovali sa na objem 0,05 ml na centrifugačnom koncentrátore centricon PM10 (Amicon) centrifugovaním pri 10000 otáčok/minútu počas 10 minút v rotore Sorvall SS 34 (8 x 50 ml). Koncentrát sa dávkoval na Superdex 75 PC 3.2/30 gélovú filtračnú kolónu pracujúcu v SMART mikroseparačnom systéme (Pharmacia). Kolóna sa eluovala s 50 mmol/l Tris/HCI pufrom pH 8,5 pri prietoku 0,05 ml/min. Odoberali sa frakcie 0,05 ml po tom, ako sa nadávkoval celkový objem 3,5 ml. Skúšala sa aktivita inhibície rekryštalizácie frakcií

-20(ako v Príklade IX) a najaktívnejšie frakcie sa podrobili separácii SDS PAGE gélom a elektropijakovaniu pred N-terminálnym sekvencovaním.

Aktívne Superdex 75 frakcie sa rozpustili v pufri na dávkovanie na gél (50 mmol/l Tris/HCI, pH 6,8, 10 % hmotnostných glycerolu, 10 mmol/l ditiotreitolu, 2 % hmotnostné SDS) a potom sa separovali na 10 % polyakrylamidovom géli podľa Laemmli metódy. Po elektroforéze sa gél navrstvil oproti listu metanolom zvlhčenej Problott (Perkin Elmer) membrány a elektropijakovali sa pri 20 voltoch počas 16 hodín v 10 mmol/l pufru kyseliny 3-(cyklohexylamino)-1-propánsulfónovej (CAPS) (pH 11,0) obsahujúcom 10 % hmotnostných metanolu. Po pija'kovaní sa membrána premyla mierne s metanolom a potom s vodou milli Q (Millipore) a naviazané proteiny sa vizualizovali s roztokom 0,1 % (hmot./objem.) Coomassie briliantovej modrej.

Dva proteínové pásy zdanlivej molekulovej hmotnosti 25 kDa a 35 kDa sa vizualizovali pomocou vyfarbenia s Coomassie. 35 kDa proteíri sa javil zvlášť blízko korelovaný s väčšinou Rl aktívnych frakcií. Oba tieto pásy sa vyrezali s čepeľou skalpela a sekvencovali sa. Nevyfarbený priestor membrány zodpovedajúci zdanlivej molekulovej hmotnosti 65 až 75 kDa sa tiež podrobil sekvencovaniu, lebo striebrom vyfarbené gély najaktívnejších frakcií už skôr ukázali proteínový pás tejto molekulovej hmotnosti.

Všetky tri vyrezané plochy membrány sa sekvencovali nanesením na Blott sekvencujúcu patrónu a sekvencia sa určila použitím reakcie a konverzných cyklov, ako je opísané výrobcom (Perkin-Elmer). Zoznamy N-terminálnych sekvencií sú dané nižšie.

kDa AFP látky obsahujú, sekvenciu z N terminálu v podstate homologickú s: ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VALX-IĽE-VAL- PRO-THR kDa AFP látky obsahujú sekvenciu z N terminálu v podstate homologickú s:

ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP ALA-ALA-X-VAĽ-PRO

-21 65-70 kDa AFP látky obsahujú sekvenciu z N terminálu v podstate homologickú s:

X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR

V každej sekvencii X označuje neznámu, ktorou môže byť akákoľvek aminokyselina nachádzajúca sa v rastlinných proteínoch. Pre účely tohto vynálezu pojem „v podstate homologický“ zodpovedá najmenej 80 % prekrytiu aminokyselín, výhodnejšie viac ako 90 %, najvýhodnejšie 95 až 100 %.

Claims (9)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Protimrazové proteíny - AFP látky získateľné z rastlín, ktoré majú tepelnú stabilitu podľa dôkazu pomocou nevýznamného zníženia vlastností inhibície t

rekryštalizácie ľadu, čo je dokázané tým, že veľkosť kryštálov ľadu zmesi tepelne opracovanej AFP látky vo vode po rýchlom zmrazení na -40 °C, nasledovanom uskladnením pri -6 °C počas 1 hodiny je menej ako 5 pm väčšia než veľkosť kryštálov ľadu rovnakej AFP látky, ktorá nie je tepelne opracovaná, po tepelnom opracovaní počas 1 hodiny pri 60 °C, jednej hodiny pri 80 °C alebo 10 minút pri 100 °C.

2. Protimrazové proteíny - AFP látky podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že veľkosť kryštálov ľadu zmesi AFP látky vo vode po rýchlom zmrazení na -40 °C, nasledovanom uskladnením pri -6 °C počas 1 hodiny je menej ako 15 pm alebo menej.

3. Protimrazové proteíny - AFP látky podľa nároku 2, vyznačujúce sa tým, že zahrnujú jeden alebo viaceré proteíny, ktoré majú molekulovú hmotnosť 25 kDa, 35 kDa a 65 až 75 kDa, a majú N-terminálovú sekvenciu v podstate homologickú s:

25 kDa AFP: ΑΙΑ-ΤΗΡ-ΙίΕ-ΤΗΡ-ΑΙΑ-νΑΙ-ΑίΑ-νΑΙ-ΙΕυ-ΙΥδ-Χ-ΤΗΡ-νΑΙ-6Ι_υ VAL-X- ILE-VAL-PRO-THR

35 kDa AFP:

ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP ALA-ALA-X-VAL-PRO

65-70 kDa AFP:

X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR

4. Spôsob získavania protimrazových proteínov - AFP látok podľa jedného

-23alebo viacerých z nárokov 1 až 3 z prírodných zdrojov, vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje kroky la) izolovanie stavy, obsahujúcej AFP látky z prírodného zdroja a potom tepelné opracovanie šťavy na teplotu najmenej 60 °C; alebo lb) tepelné opracovanie prírodného zdroja pri teplote najmenej 60 °C, po čom nasleduje izolovanie šťavy, obsahujúcej AFP látky z tohto prírodného zdroja;

II) odstránenie nerozpustnej frakcie, pričom krok la alebo Ib je pred krokom II.

5. Vektor obsahujúci sekvenciu nukleových kyselín schopnú kódovať najmenej jednu z AFP látok podľa nároku 3.

6. Transformované organizmy schopné expresie najmenej jednej z AFP látok podľa nároku 3.

7. Zmrazené cukrárenské produkty, vyznačujúce sa tým, že obsahujú od 0,0001 do 0,5 % hmotnostných AFP látky podľa nároku 1.

8. Pred-zmes vhodná na použitie pri výrobe zmrazeného cukrárenského produktu podľa nároku 7, obsahujúca AFP látky podľa nároku 1.

9. Spôsob prípravy zmrazeného cukrárenského produktu, vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje prípravu zmesi, ktorá obsahuje 0,0001 až 0,5 % hmótnostného AFP látky, táto AFP látka má tepelnú stabilitu podľa dôkazu pomocou nevýznamného zníženia vlastností inhibície rekryštalizácie ľadu, po tepelnom opracovaní počas 1 hodiny pri 60 °C, jednej hodiny pri 80 °C alebo 10 minút pri 100 °C, po čom nasleduje zmrazenie zmesi za podmienok pokoja.