SK4152002A3

SK4152002A3 - Method for production of proteinaceous substances

Info

Publication number: SK4152002A3
Application number: SK415-2002A
Authority: SK
Inventors: Ralf Reski; Gilbert Gorr
Original assignee: Greenovation Biotech Gmbh
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2003-01-09
Also published as: HUP0202628A2; NZ517996A; AU781920B2; EP1206561A2; CA2381995A1; HK1054053A1; RU2002111666A; BR0014671A; BG106547A; IL148638A; HRP20020250A2; SK287740B6; PL200252B1; PT1206561E; KR100671217B1; KR20020065478A; AU1129501A; WO2001025456A2; HUP0202628A3; NO20021201L

Description

Oblasť techniky.

Predložený vynález sa všeobecne týka oblasti výroby bielkovinových látok v rastlinnom materiáli. Vynález sa týka osobitne nového spôsobu výroby požadovaných bielkovinových látok v machoch.

Doterajší stav techniky

Využívanie biotechnologických metód na výrobné účely je pre ľudstvo dôležitou možnosťou výroby látok, ktoré nemôžu byť vyrábané ekonomicky inými spôsobmi pokiaľ vôbec môžu byť vyrábané - napríklad chemickou syntézou, a ktoré sú ako suroviny dostupné z prirodzených zdrojov v nedostatočnom množstve. I keď je známych cez 10 000 sekundárnych metabolitov rastlinných látok, v priemyselnom meradle sa vyrábaj pomocou rastlinných bunkových kultúr iba niekoľko týchto zlúčenín. Tieto látky sú prevažne farmaceutický účinné sekundárne metabolity. Medzi príklady, o ktorých je potrebné sa zmieniť patrí a) berberín (výroba v meradle 4000I), ktorý má bakteriostatické a fungicídne účinky (Fujita, Y. a Tabata, M. in: Plánt tissue and celí culture, Plánt Science, 3, 169; Green, C. E., et al., (Ed.), A. R. Liss Inc., New York, 1987), b) shikonin (v meradle 750 I), ktorý má antibiotické a protizápalové účinky (Tabata, M. a Fujita, Y., in: Biotechnology in plánt Science, 207 - 218, Day, P., et al., (Ed.), Academic Press, Orlando, 1985), a c) paclitaxel (v meradle 75000 I) známy viac pod názvom taxol, ktorý má protinádorové účinky (Jaziri, M., et al., Taxus sp. celí, tissue and organ cultures as alternatíve sources for taxoids production: a literatúre survey, Plánt Cel Tiss. Org. Cult., 46, 59 - 75, 1996).

Ďalšou dôležitou biotechnologickou metódou, v ktorej sa využívajú rastlinné bunkové kultúry, je biotransformácia digitoxínu na digoxín - liečivo na srdce a krvný obeh. Táto stereošpecifická hydroxylačná reakcia sa úspešne vykonáva v bioreaktore s kultúrami Digitalis lanata (Reinhard, E. a Kreis, W., Kultivierung von pflanziichen Zellen im Bioreaktor [Kultivácia rastlinných buniek v bioreaktore]; Bio. Engin., 5, 135 - 136, 1989) s vysokými výťažkami. Doterajšiu a rozsiahlu rešerš využitia rastlinných bunkových kultúr v biotechnológii je možné nájsť v Muhlbach, H.-P.,

Use of plánt celí cultures in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 4, 113- 176, 1998).

-2Vývoj metód genetickej transformácie u vyšších rastlín na počiatku deväťdesiatych rokov umožnil významne zvýšiť produktivitu špecifických sekundárnych zložiek rastlinami transformáciou génov špecifickými kľúčovými enzýmami zodpovedajúcimi metabolickými cestami. Boli využité nielen transgenné intaktné rastliny, ale tiež rastlinné bunkové kultúry. Ako príklady je možné uviesť zmeny expresie bakteriálnej lysindekarboxylázy v transgenných kultúrach koreňových vlákien Nicotiana tabacum, ktoré zvýšili výťažok biogenných amínov kadaverínu a anabazínu až 14 krát (Berlín, J., et al., Genetic modification of plánt secondary metabolism. Alternation of product levels by overexpression of amino acid decarboxylases, in: Advances in Plánt Biology, Studies in Plánt Science, 4, 57 - 81, Ryu, D. D. Y. a Furasaki, S. (Ed.), Elsevier, Amsterdam, 1994).

Možnosť transféru DNK do rastlín nielenže otvorila kvantitatívne a kvalitatívne zmeny súčastí rastlín, ale rastliny a rastlinné bunkové kultúry sa naviac stali zaujímavejšie pre výrobu heterologných proteínov (Moffat, A. S., High-Tech plants promise a bumber crop of new products, Science, 256, 770 - 771, 1992) a na to boli zvolené dva principiálne odlišné prístupy.

Jeden prístup spočíva vo výrobe heterologných proteínov v transgenných intaktných rastlinách. Vedľa výroby protilátok v transgenných tabakových rastlinách (Ma, J. K.-C., et al., Generation and assembly of secretory antibodies in plants, Science, 268, 716 719, 1995), bola popísaná expresia a regulované spracovanie ľudského serumalbumínu ako v transgenných tabakových rastlinách, tak v transgenných rastlinách zemiakov (Sijmons, P. C., et al., Production of correctly processed human sérum albumín in transgenic plants, Bio/Techn., 8, 217 - 221, 1990). Ľudský epidermálny rastový faktor (hEGF) bol v transgenných tabakových rastlinách expresovaný tiež (Salmanian, A.-H., et al., Synthesis and expression of the gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants, Biotechnol. Lett., 18, 1095 1098, 1996). Boli však využité aj iné rastliny. Leu-encefalín bol úspešne vyrobený s použitím Arabidopsis thaliana a Brassica napus (Krebbers, E. a Vandekerckhove, J., Production of peptides in plánt seeds, Tibtech, 8, 1 - 3, 1990). Ďalej boli na expresiu chimérických vírusových častíc, ktoré pôsobia ako vakcíny, využité transgenné rastliny Vigna unguiculata (Dalsgaard, K., et al., Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease, Nat. Biotech., 15, 248 - 252, 1997).

- 3Principiálnou nevýhodou používania intaktných rastlín ako sú rastliny uvedené vyššie ako príklady, je nutnosť ich rastu, ktorý je časovo náročný a nákladný a pri výrobe v priemyselnom meradle vyžadujú veľkú kultivačnú plochu. Izolácia požadovaných cieľových látok z intaktných rastlín vyžaduje naviac obvykle zložité výrobné postupy, zvlášť, pokiaľ musia zloženie a akosť výrobku spľňať vysoké požiadavky, ako je tomu v prípade látok, ktoré sa majú používať na farmaceutické alebo potravinárske účely.

Druhý prístup spočíva vo využití transgenných tabakových bunkových kultúr na výrobu protilátok. Popísané sú napríklad expresie protilátok a ich vylučovanie do média (Magnuson, N. S., et al., Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco celíš, Prot. Expr. Pur., 7, 220 - 228, 1996). Pretože čistenie heterologných proteínov z buniek je naviac zložité, poskytuje vylučovanie cielového pretínu do média významné zlepšenie. Výroba rekombinantov farmaceutický vyhovujúcich proteínov v bunkových kultúrach je tiež zaujímavá z bezpečnostného hľadiska, pretože transgenné rastlinné bunky môžu rásť výhradne v bioreaktoroch a nemusia sa vypúšťať. Nevyhnutnú kultivačnú hmotu bolo umožnené vyrobiť pri vývoji bioreaktorov pre rastlinné heterotropné bunkové kultúry vo väčšom meradle (napríklad Shuler, M. L., et al., Bioreactor engineering as an enabling technology to tap biodiversity: The čase of taxol., Ann. N. Y. Acad. Sci., 745, 455 - 461, 1994).

Základnou nevýhodou tohto druhého prístupu, v ktorom sa používajú suspenzie rastlinných kultúr je malá rýchlosť rastu, pomerne pomalá tvorba sekundárnych metabolitov, inhibícia vytvárania produktov pri vysokých hustotách buniek, a z toho vyplývajúca nízka objemová produktivita, tvorba agregátov a zložiek bunkových stien a zvýšená citlivosť buniek na šmykové napätie. Tiež je nutné vziať do úvahy, že sa pri používaní heterotropných bunkových kultúr musia vybavovať komplexné médiá viacerými zložkami, z ktorých mnohé sú drahé. Najzávažnejšou nevýhodou, o ktorej je však nutné sa zmieniť, je výskyt somaklonálnych zmien v rastlinných bunkových kultúrach in vitro, ktoré so sebou pri výrobe heterologných proteínov prinášajú kvantitatívne a kvalitatívne zmeny (viď napríklad Jones, M. G. K. a Lindsey, K., Plánt biotechnology, in: Molecular biology and biotechnology; Walker, J. M. a Gingold, E. W. (Eds.), 2. vyd., Royal Soc. of Chem., Burlington House, London, 1988). Heterogenita vytvorených produktov a ich funkčných vlastností nie je možné akceptovať, zvlášť v

-4spojení s výrobou farmaceutických a ďalších požadovaných látok, ktorých úradné schválenie vyžaduje zabezpečenie spoľahlivej akosti a normalizovaný výrobný postup.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu je teda zabezpečenie spôsobu normalizovanej výroby heterologných bielkovinových látok v rastlinných materiáloch, ktoré nevyhnutne eliminujú nielen vyššie popisované nevýhody používania intaktných rastlín, ale tiež nevýhody používania systémov bunkových kultúr.

Tento predmet je podľa vynálezu dosiahnutý zavedením nového spôsobu výroby heterologných bielkovinových látok v rastlinnom materiáli, v ktorom sa plne diferencované rastliny machov ponechávajú rásť pri normalizovaných podmienkach a vytvorené bielkovinové látky sa získavajú z kultivačného média bez porušenia produkčných tkanív či buniek.

Termín „bielkovinová látka“ tak, ako sa tu používa, predstavuje peptidy, polypeptidy a proteíny a tiež ich fragmenty, ktoré sú vhodné zvlášť na diagnostické, klinické, farmaceutické a potravinárske účely. Zahŕňa tiež molekuly, ktoré majú peptídovú väzbu a ktorých informácia je rastlinným materiálom prenášaná.

Pri riešení, ktorému sa podľa predloženého vynálezu dáva prednosť, sa požadované heterologné bielkovinové látky uvoľňujú do kultivačného média v biologicky aktívnej forme.

Termínom „biologicky aktívny“ tak, ako používa v predloženom popise, sa myslí to, že cieľové látky vybavené týmto atribútom majú funkčné vlastnosti požadované či vyžadované na zodpovedajúci účel. Pokiaľ sa napríklad vyžaduje vyrobiť protilátky, je vyrobený proteín alebo jeho funkčný fragment biologicky aktívny pokiaľ je schopný vyvolať predpokladanú šepcifickú väzbu s antigénom. Skúseným pracovníkom je jasné, že sa nie vždy na takýto účel požaduje úplný proteín, ale že je možné vyhľadávať epitópy či nízkomolekulárne štruktúry, ktoré zabezpečia požadovanú biologickú aktivitu alebo funkciu. Enzým je napríklad biologicky aktívny, pokiaľ je schopný konvertovať svoj cieľový substrát.

-5V ďalšom riešení podľa vynálezu, ktorému sa dáva prednosť, sa ponecháva rastlinný materiál rásť vo forme intaktných rastlín machov v kultivačnom médiu, ktoré je absolútne bez cukrov, vitamínov a fytohormónov či ich funkčných fragmentov.

Spôsob podľa vynálezu umožňuje rast intaktných a plne diferencovaných rastlín pri fotoautotropných podmienok, ktoré je možné normalizovať, tj. bez požiadaviek na prídavok cukrov, vitamínov a fytohormónov a podobných tak, ako to bolo pri predchádzajúcom systéme využívajúcom heterotropné suspenzie bunkových kultúr. Keďže je využívané lacné a jednoduché kultivačné médium, docieľuje sa jednotlivými stupňami získavanie a čistenie požadovaných cieľových látok vo významnom množstve.

Rastlinným materiálom, ktorý sa podľa spôsobu tohto vynálezu používa, je prednostne intaktná machová rastlina vyberaná zo skupiny machov zahrnujúcich druhy ľadviníkov rodu Physcomitrella, Funaria, Sphagnum a Ceratodon a také Marchantia a Sphaerocarpos, ktorým sa dává zvlášť prednosť. Spôsob podľa vynálezu sa najlepšie uskutočňuje s využitím machu Physcomitrella patens.

V ďalšom riešení, ktorému sa dáva prednosť, sa skelet kyseliny nukleovej používa na transformačné kódovanie nielen požadovaných bielkovinových látok, ale tiež na prevod peptidov na vylučovanie látky z hostiteľskej bunky do kultivačného média. Ako je odborníkom zrejmé, podľa tohto vynálezu môže byť použitá akákoľvek autológna a heterológna sekvencia kyseliny nukleovej, ktorá sa môže použiť na vytvorenie expresnej kazety na transformovanie pracovného tkaniva. Pri transporte endoplasmického retikula či buniek sa dáva prednosť zvlášť využívaniu signálnych peptidov.

Práce vykonané v predloženom vynáleze potvrdzujú, že vyššie popísaný problém somaklonálnej variácie, s ktorým sa ráta . v bunkových kultúrach, neexistuje vo fotoautotrofických kvapalných kultúrach machov. Machy použité podľa vynálezu majú ďalej pred inými systémami jasnú sekvenciu presne definovaných diferenciačných stupňov (chloronéma, caulonéma, očko, gamatofory), ktoré môžu byť ovplyvnené prídavkom hormónov (kyselina . indol-3-octová vyvoláva vznik caulonémy, isopentenyladenín vyvoláva vznik očiek (viď napríklad Ashton, N. W., et al., Analysis of gametophytic development in the moss, Physcomitrella patens, using auxin and cytokinine resistant mutants, Planta, 144, 427 - 435, 1979). V kultivačných bioreaktoroch je teda možná smerovaná diferenciačno-špecifická expresia

-6heterologných proteínov a synchrónne delená, čistá, a tým homogénna kultúra chloronéma je podľa vynálezu zvlášť vhodná pre svoju kontrolovateľnú a rovnomernú produkciu proteínu v bioreaktore a pre svoju vhodnosť využitia na hormónoch závislých či diferenciálne špecifických promótorov.

Vedľa takých expresných systémov je možné tiež podľa vynálezu použiť systém indukovateľných promótorov, osobitne na výrobu proteínov s krátkym poločasom rozpadu, alebo cytotoxických, kde sa prednostne používa ľ -promótor Agrobacterium tumefaciens.

Kultivácia machov navrhnutá podľa vynálezu na výrobu heterologných proteínov pri ekonomických podmienkach môže byť realizovaná napríklad pri použití Physcomitrelly v objemoch od 20 ml cez 6 I až do 10 I a vyššie v miešaných kultúrach alebo v prevzdušňovaných sklenných nádržiach (viď napríklad Reski, R., Zell- und molekularbioligische Untersuchungen der cytokinin-induzierbaren

Gewebedifferenzierung und Chloroplastenteilung bei Physcomitrella patens (Hedw.) B.

S. G., [Bunkové a molekulárno-biologické štúdie diferenciácie cytokininom indukovateľných tkanív a delenia chloroplastov vo Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G.j doktorská dizertácia, Universita Hamburg, 1990). Keďže je to kultúra diferencovaných fotoautotropných rastlín, nevyžaduje médium ani dodávanie rastlinných hormónov, ani vitamínov či cukrov. V porovnaní s požiadavkami na komplexné médiá, napríklad zvieracie bunkové kultúry, je cena nižšia až stokrát. Podľa vynálezu sa ukazuje, že výťažok biologicky aktívneho heterologného proteínu je možné v kultivačnom médiu zvýšiť v prítomnosti PVP až 35 krát, a preto sa podľa vynálezu dáva prednosť PVP v kultivačnom médiu.

Podrobné informácie o kultivácii ďalších machov v bioreaktoroch, ktoré sú podľa vynálezu vhodné, ako napríklad Leptobryum pyriforme a Sphagnum magellanicum, sú popísané v predchádzajúcich prácach (viď napríklad Wilbert, E., Biotechnologische Studien zur Massenkultur von Moosen unter besonderer Berucksichtigung des Arachidonsäurestoffwechsels [Biotechnologické štúdie týkajúce sa kultúr machov s osobitným ohľadom na metabolizmus kyseliny arachidónovejj, doktorská dizertácia, Universita v Mainzi, 1991; Rudolph, H. a Rasmussen, S., Studies on secondary metabolism of Sphagnum cultivated in bioreactors, Crypt. Bot., 3, 67 - 73, 1992). Na účely predloženého vynálezu sa dáva osobitne prednosť použitiu Physcomitrelly, a to osobitne preto, že pri tomto organizme sú už preskúmané všetky obvyklé molekulárno

-Ί biologické technológie (rešerše viď Reski, R., Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111,1 - 15,1998).

Na biotechnologické využívanie Physcomitrelly boli na výrobu heterologných proteínov vyvinuté vhodné transformačné systémy. Úspešné transformácie boli vykonané napríklad priamym prenosom DNK do tkaniva photonéma s použitím nastreľovania častíc. Úspešný bol tiež transfér DNK do machových protoplastov sprostredkovaný PEG. Táto transformačná metóda bola opakovane popísaná pri Physcomitrelle a viedla ako k prechodovým, tak stabilným transformantom (viď napríklad Reutter, K. a Reski, R., Production of a heterologous proteín in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants, Pl. Tissue culture, Biotech., 2, 142 - 147, 1996).

Aj keď je predložený vynález principiálne vhodný na výrobu akejkoľvek bielkovinovej látky, bude tu ukázaná výroba zodpovedajúceho farmaceutického proteínu s osobitným zreteľom na ľudský vaskulárny endotheliálny rastový (VEGF).

VEGF bo po prvýkrát izolovaný Ferrarom, N. a Henzelom, W. J. (Pituitary follicular celíš secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial celíš, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, 851 - 858, 1989) a charakterizovaný ako regulačný faktor pre riadenú angiogenézu a endotheliálne delenie buniek pri bežných fyziologických podmienkach (Ferrara, N., et al., The vascular endothelial growth factor family of polypeptides, J. Celí. Biochem., 47, 211 - 218, 1991). Autori tiež uvádzajú, že tento rastový faktor pôsobí vysoko špecificky na vasklárne endotheliálne bunky a je inaktívny vzhľadom na iné bunkové typy. VEGF je homodimerický glykoproteín viazaný disulfidovými mostíkmi. Sú známe štyri formy ľudského VEGF. Štyri izomerné formy sú aminokyseliny dlhé 121, 165, 189 a 206 a sú tvorené alternatívne previazanými VEGF RNK. VEGF206 bol zistený iba vo fetálnej pečeňovej cDNK, zatiaľčo VEGF₁₂i, VEGF₁₆₅a VEGF₁₈₉ boli zistené vo veľkom počte nádorových buniek a nádorových tkanív. Všetky izomerné formy VEGF mali navádzacie sekvencie k sekrécii, avšak účinne sú vylučované iba dve najmenšie formy (viď napríklad Martiny - Barón, G. a Marmé, D., VEGF-mediated tumor angiogenesis: A new target for cancer therapy, Curr. Opin. Bíotechnol.', 6, 675 - 680, 1995).

Podstatné množstvo VEGF bolo a je stále vyžadované ako pre vývoj a zdokonaľovanie súčasných požiadaviek pri terapii nádorov a na charakterizáciu VEGF. V ranných štádiách práce na predloženom vynáleze všetko, čo bolo do tejto doby popísané, bola výroba rekombinantu VEGF v bunkách hmyzu expresiou systému bacilovírusu

-8(napríklad Fiebich, B. L., et al., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect celíš, Eur. J. Biochem., 211, 19 - 26, 1993). Nasledovali Saccharomyces cerevisiae (Kondo, S., et al., The shortest isoform of human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF₁₃₁) produced by Saccharomyces cerevisiae promotes both angiogenesis and vascular permeability, Biochim.. Biophys. Acta, 1243, 195 - 202, 1995), kvasinky Pichia pastoris (Mohanraj, D., et al., Expression of biologically active vascular endothelial growth factor in Yeast, Growth factors, 12, 17 -27, 1995) a Escherichia coli (Siemeister, G., et al., Expression of biologically active isoforms of the tumor angiogenesis factor VEGF in Escherichia coli, Biochem.Biophys. Res. Commun., 222, 249 - 255, 1996) ako ďalšie produkčné organizmy. Biologicky aktívny VEGF bol vyrobený všetkými týmito rekombinačnými systémami. Expresný systém E. coli je však komplikovaný čo sa týka čistenia a rekonštitúcie proteínu, pretože sa uzatvára do telových dutín.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Zhrnutie

Zavedenie kontrolovateľných masových kultúr Physcomitrella patens (Reuter a Reski, loc. cit.) a spôsoby transféru DNK do machu Physcomitralla patens (Reutter, K., Expression heterologer Gene in Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. [Expresia heterologných génov po Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G.], doktorská dizertácia na Universite v Hamburgu, 1994) vytvoril základný predpoklad na biotechnologické využívanie tejto rastliny.

Práce vykonané na začiatku dokázali dlhodobú stabilitu integrácie pri použití transgenných línii Physcomítrelly pôvodom od Reuterra (loc. cit., 1994). Expresia heterologných génov npt II a gus, ktoré boli ako príklad použité na tento účel bola ešte detekovateľná po štyroch rokoch. Bola optimalizovaná bioreaktorová kultivácia Physcomítrelly. Bolo vyvinuté miešadlo, ktoré drvilo protonemát a tým zabezpečovalo požadovanú homogenitu kultúry pri stabilných obrátkach 300 až 500 l.min'¹. Bolo tak umožnené normalizované vzorkovanie. Súčasne privádzaný vzduch bol v kvapalnej kultúre distribuovaný rovnomernejšie. Za týchto podmienok bolo dokázané, že vývoj biomasy a proteínu prebieha bez vonkajšej regulácie pH rovnakým spôsobom ako pri

-9regulácii pH; je prekvapivé, že regulácia pH nie je teda nutná. V poloprevádzkovom meradle sa týždenne vyprodukovalo 500 mg sušiny biomasy alebo 22 mg celkového proteínu na liter. To znamená päťnásobný nárast produkcie biomasy v kultúre v 5 I sklennej banke. Znížením koncentrácie soli v Knopovom médiu na desatinu viedlo k podobným hodnotám, a tým k zníženiu nákladov.

Prídavok 5 mM vínanu amónneho urýchlilo vývoj biomasy skrátením lag fázy. Prídavok vínanu amónneho vydal súbežné kultúry, ktoré virtuálne pozostávali výlučne z buniek chloronéma. Pomocou prietokovej cytometrie, bolo dokázané, že virtuálne sto percent buniek týchto kultúr bolo vo fáze G2/M bunkového cyklu. Tento výsledok bol potvrdený ďalšími fyziologickými štúdiami s auxínom a štúdiami s diferenciačno-špecifickými mutantami cal 112 a cal 113 a bolo zistené, že bunky caulonéma sú vo fáze G1/G0 väčšinu času, zatiaľčo bunky chloronéma sú prevažne vo fáze G2/M.

Promótor bol skúmaný na možnú indukovateľnosť do machu za použitia agrobakteriálneho 1 '-promótoru. Ako markerový gén bol použitý gén β-glukuronidázy (gus). V prechodne transformovaných machových protoplastoch (transformačná rýchlosť = 3.10'⁴) bola po indukcii 5 μΜ kyselinou indol-3-octovou pozorovaná expresia génu gus. V kontrolných vzorkávh nebola pozorovaná žiadna expresia.

Gen pre „zostrihnutú “ formu ľudského vaskulárneho endotheliálneho rastového faktora (VEGF,₂i) aminokyseliny 121 bol prevedený do Physcomitrelly transformačnou rýchlosťou 0,5.10'⁵ a 3,3.10'⁶. Až potiaľ bol gén klonovaný z konštitutívneho promótora 35S a do transformačného vektora pRT99, ktorý je preo rastliny vhodný. Pri druhom prístupe bolo sekvenčné kódovanie zodpovedajúceho ľudského tranzitného peptidu ER dodatočne klonované. Analýzou Southern bola potvrdená integrácia heterolognej DNK a popísaný typ integrácie získaných stabilných transformantov. Iná analýza (Nothern analysis) v týchto transformantoch potvrdila existenciu npt II a dvoch VEGF transskriptov. Expresia VEGF₁₂i v bunkách machu byla dokázaná nepriamou imunofluorescenciou. Proteín bol nepochybne lokalizovaný v bunkách pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu. Tieto štúdie odhalili na transformantoch bez tranzitných peptidov, že proteín je lokalizovaný najmä v cytoplazme. U transformantov, ktoré naviac obsahovali tranzitný peptid ER bolo možné zistiť proteín v oblasti jadra a v apikálnych oblastiach apikálnych buniek oblasti s veľmi vysokým obsahom ER. Biologická aktivita heterologných proteínov

- 10produkovaných podľa vynálezu bola overená vykonaním skúšky ELISA a dvoch funkčných skúšok s proteínom VEGF získaných z kultivačného média.

Materiály a metódy

Pokiaľ nie je v ďalšom texte uvedené inak, boli použité chemikálie analytickej čistoty a boli získané od firmy Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) a Sigma (Deisenhofen).

Roztoky boli pripravené z prečistenej apyrogénnej vody, ďalej označovanej H₂O získanej z prístroja Milli-Q water purification systém (Milipore, Eschborn).

Reštrikčné endonukleázy, enzýmy modifikujúce DNK a súpravy pre molekulárnu biológiu boli získané od AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Applied Biosystems (Weiterstadt), Biometra (Góttingen), Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) a Stratagene (Heidelberg). Pokiaľ nie je uvedené inak, boli použité v súlade s pokynmi výrobcu.

Vektory a štruktúry

Plasmid pCYTEXP-VEGF₁₂₁ je derivátom pCYTEXPI (Belev, T. N., et al., A fully modular vector systém for the optimization of gene expression in Escherichia coli, Plasmid, 26, 147 - 150, 1991), v ktorom je integrovaná cDNK ľudské VEGF₁₂i pre expresiu do E. coli. VEGF121 cDNK je excizovaný z pCYTEXP-VEGF₁₂₁ pri použití reštrikčnej endonukleázy Nde I a Sal I, prečistený, zatupený a klonovaný do štiepnej Srna I polohy pRT101 (Tópfer, R., et al., A set of plánt expression vectors for transcriptional and translational fusions, Nucleic Acids Res., 15, 5890, 1987) medzi promótor 35S a polyadenýlačnú sekvenciu CaMV. Pri použití Hin dlll je takto získaná kazeta opäť excizovaná a klonovaná do reštrikčné štiepnej polohy Hin dlll transformačného vektora pRT99. pRT99 obsahuje nielen viaceré klonovacie miesta, ale tiež gén neomycínovej fosfotransferázy pri riadení promótorom 35S a zodpovedajúcou polyadenylačnou sekvenciou CaMV (Tópfer, R., et al., Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plánt celíš, Nucleic Acids Res., 16, 8725, 1988). Tento gén prepožičiava antibiotiku G418 v stabilných transformovaných rastlinách odolnosť. Plasmidy boli replikované na kmeni

- 11 DH5( Escherichia coli (Sambrook, J., et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

Pri použití reštrikčného enzýmu Bam Hl a Big II je cDNK excizovaná z vektora pVE121, ktorý bol pôvodne pripravený na expresiu VEGF₁₂₁ v bunkách hmyzu, a ktorý naviac vedľa sekvencie VEGF₁₂₁ obsahuje kódovanie DNK prirodzeného tranzitného peptidu, ktorý v systémoch zvieracích buniek sprostredkuje sekréciu do média cez endoplazmové retikulum (Fiebich, et al., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect celíš, Eur. J. Biochem., 211, 19-26, 1993) a pri použití RT101 je klonovaný na pRT99 a verifikovaný.

Plasmid pNA201 je derivátem binárneho vektora pBI101 (Jefferson, A. R., et al., Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion systém, Plánt Mol. Rep., 5, 387 - 405, 1987). Ako marker pre rastliny obsahuje gén nptll v nopalin synthásovom promótore. Gén gus, ktorý je tiež prítomný, je regulovaný ľ- promótorom z Agrobactériom tumefaciens. pNA201 je vhodný na priamu transformáciu Physcomitrella patens.

Protilátky

Proti proteínu VEGF sa používaj! dve rôzne protilátky. Prvá protilátka je králičia antiVEGF protilátka a je smerovaná proti syntetickému peptidu, ktorý zodpovedá aminokyselinám 1 až 20 VEGF ľudského pôvodu (Fiebich, et al., loc. cit., 1993). Druhou protilátkou je monoklonálna myšia protilátka smerovaná proti ľudskému proteinu VEGF₁₂₁ (R(D Systems, Wiesbaden).

Rastlinný materiál

Použité sú divoké kmene machu Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G., ktoré pochádzajú zo zbierky genetickej skupiny katedry všeobecnej botaniky univerzity v Hamburgu. Pôvodný kmeň 16/14 bol odobratý H. L. K. Whitehouse v Gransden Wood, Huntíngdonshire (Anglie) a dalej kultivovovaný zo spór.

Divoký kmeň rastie buď v kapalnej kultúre s Knopovým médiom (Reski, R. a Ábel, W. O., Induction of budding on chloronemata and caulonémata of the moss, Physcomitrella patens, using isopentenyladenine, Planta, 165, 354 - 358, 1985) alebo na pevnom Knopovom médiu s s 1 % agarom Oxoid (Unipath, Basingstroke, Anglicko). S kvapalnými kultúrami sa zaobchádzalo podľa popisu Reskiho (loc. cit., 1990).

Kultivácia v bioreaktore

- 12Na masovú kultiváciu bol materiál zavedený do 7 I bioreaktora realizovaného sklennou bankou s guľatým dnom vybavenou dvojitým plášťom (Applikon Biotek, Knullwald). Do tohto systému bioreaktora bol zavedený zhora otvormi vo veku do kultivačného priestoru vzduchový chladič, trubica na prevzdušňovanie, pH elektróda (Conducta, Gerlingen), teplotné čidlo, miešacie zariadenie, vzorkovacia trubička a vstupy pre kyselinu, bázu a médium. Kultúry boli ponechané pri 25 °C a táto teplota bola regulovaná vhodne nastaveným vodným kúpelom pripojenom na dvojitý plášť. Pri pokusoch prebiehajúcich pri riadenom pH bolo pH pomocoou titračnej jednotky udržiavané na hodnote 5,8. Teplotné meranie a regulácia pH bola vykonávaná zariadením Biocontroller ADI 1030 (Applikon Biotek, Knullwald). Rýchlosť miešadla je možné meniť regulátorom motora ADI 1012 (Applikon Biotek, Kndllwald). Kultivačné médium sa prevzdušňuje konštantným tlakom vzduchu 1 bar poréznym vstrekovacím prvkom. Na zabezpečenie sterility kultivačnej nádoby sú všetky prívodné a odťahové potrubia vybavené filtračnými strelizačnými jednotkami (Midisart, 0,2 (m; Sartorius, Gottingen). Kultivácia v bioreaktore sa vykonáva v priestore s riadeným prostredím s bočným osvetlením (biele svetlo; Osram L 40 W/20; max. 100 (mol.s'¹.m'²). Kultúry sa v sterilných podmienkach inokulujú 0,5 až 1g nesušeného rastlinného materiálu na liter bioreaktorovej kultúry. Vzorkovacia trubica je umiestnená v rovnakej úrovni ako miešadlo a tak zabezpečuje rovnomerné vzorkovanie pri miešaní. Malé vzorky (<100 ml) sa odoberajú cez Luerovu zámkovú prípojku striekačkou, zatiaľčo velkoobjemové vzorky sa odoberajú napríklad peristaltickým čerpadom typu 302/3A vybaveným hlavou 501 Rl (Sartorius, Gottingen).

Kultury chloronémy divokého typu sa vyvíjajú dodávaním Knopovho média s s 5 mM vinanom amónnym.

Výťažok biologicky aktívneho heterologného proteínu, ktorý sa vylučuje, je možné výrazne zvýšiť v prítomnosti stabilizátora polyvinylpyrrolidónu (PVP) v kultivačnom médiu.

Diferenciáciu caulonémy, ktorá nastáva v priebehu vývoja fotonémy, je možné vyvolať a zvýšiť exogenným prídavkom fyziologického množstva auxínu vhodnej koncentrácie ako napríklad 5i{mol.r¹ kyseliny indol-3-octovej (IAA).

Na prevádzku kvapalnej kultúry transformantov pod tlakom sa ku Knopovmu médiu pridáva 50 mg.ľ¹ antibiotika G418 (Calbiochem, Bad Soden). Nakoniec sa kultúry odvádzajú filtráciou cez sterilné 100 pm sitá (Wilson Sieves, Nottingham, Anglicko)

-13každých desať dní tesne pred drobením a prevedú sa do Erlenmeyerovej banky naplnenej vybraným médiom.

K pokusom s nutričnými prvkami sa Knopovo médium riedi 1:10 vodou.

Transformácia

Zvoleným spôsobom transformácie je priamy transfér DNK do protoplastov sprostredkovaný PEG, ako to popisuje Reutter a Reski (loc. cit., 1996). Na každú transformáciu sa na 3.10⁵ protoplastov použije 50 qg plasmidu DNK. Regenerácia protoplastov a výber stabilných transformantov sa robí podľa popisu Reutera a Reskiho (loc. cit., 1996), pokiaľ nie je uvedené inak.

Nepriama imunofluorescencia

Ústojný roztok: MSB: 100 mM PIPES: 5-10 mM EGTA, 5 mM MgSO₄₎ pH 6,8

F-MSB: MSB + 5 % DMSO

E-MSB: MSB + 5 % DMSO + 5 % Nonidet

W- MSB: MSB zriedený H₂O 1 : 2 (preplachovací ústojný roztok)

Roztok enzýmu: 1 % celuláza, 1 % pektináza, 2 % driseláza v MSB, pH 5,6 (všetky od Sigmy, Deisenhofen).

Machové fotonematá sa fixujú v 1,25 % glutaraldehyde v F-MSB (obj/obj) inkubáciou nie dlhšou než 10 minút a krátko sa prepláchnu vo W-MSB. Potom se fotonematá inkubujú s 2 % paraformaldehydom v MSB (obj/obj) po dobu 40 minút a 3x prepláchnu W-MSB (1x vypláchnutie; 2x premývanie po dobu 5 minút).

Voľné aldehydy, ktoré sa nemôžu odstrániť propreplachovanim sa zredukujú prídavkem MSB a pevným hydridom boru v množstve na špičku noža pri inkubačnej dobe10 minút. Hydrid boru sa odstráni trojitým prepláchnutím W-MSB.

V ďalšom stupni sa bunkové steny spriepustnia ďalším prídavkom roztoku enzýmu na dobu 10 minút. Enzymatická reakcia sa zastaví zmenou pH (MSB, pH 6,8). Zmes sa opäť 3x prepláchne W-MSB.

Chlorofyly sa extrahujú inkubáciou s roztokom detergentu po dobu 120 minút. Potom sa roztok odstráni trojitýmdo extrahují inkubaci s roztokem detergentu po dobu 120 minút. Potom se roztok odstráni trojitým prepláchnutím W-MSB.

- 14 Po tejto príprave sa machové fotonematá môžu inkubovať s primárnou protilátkou (anti-VEGF; riedenie 1 : 50). To sa robí pri 37 °C po dobu 45 minút. Po troch prepláchnutiach W--MSB sa na 45 minút pri 37 °C pridá značená sekundárna protilátka (králičia alebo myšia; riedenie 1 : 30; značená fluoresceín isothiokyanátom (FITC) (Molecular Probes, Leiden, Nizozemsko)). Vedľa troch vyššie uvedených preplachovacích stupňov sa zmes ešte raz prepláchne W-MSB + 0,1 % Tritónu. Fotonematá sa následne dajú do W-MSB a uložia se pri 4 °C aspoň cez noc.

Materiál sa vyhodnotí pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu (CLSM) typ TCS 4D (Leica Lasertechnik, Heidelberg) a softwaru Scanware 5.0 (Leica Lasertechnik, Heidelberg).

Kvôli analýze vzoriek CLSM sa tieto umiestnia na sklíčko do montážneho roztoku (Dabco, Sigma, Deisenhofen). Excitácia väzby fluorescenčného farbiva FITC so sekundárnou protilátkou sa vykoná pomocou argón - kryptónového laseru pri vlnovej dĺžke 488 nm. FITC emituje žiarenie o vlnovej dĺžke 528 nm.

Skúška ELISA

Protein VEGF v kultivačnom médiu, ktorý sa vytvorí vo vhodne transformovaných machový rastlinách sa kvalitatívne určí a kvantitatívne stanoví bežnými spôsobmi pri použití skúšok ELISA a vyššie popísaných protilátok. Na skúšku ELISA sa použije priamo kultivačné médium v množstve 200 ql.

Funkčné skúšky

Biologická aktivita rekombinačne vytvoreného VEGF získaného z kultivačného média sa skontroluje mitogénnou skúškou (Miyazono, et al., Purification and properties of an endothelial celí growth factor from human platelets, J. Biol. Chem., 262, 4098 - 4103, 1987) a „13 dňovou chorioallanto-membránovou angiogénnou skúškou“ (Wilting, et al., A morphological study of rabbit corneal assay, Anat. Embtyol., 183, 1167 - 1174, 1991). Predtým sa kultivačné médium podrobí ultrafiltrácii, potom lyofilizácii a následne sa resuspenduje v ústojnom roztoku. Pokiaľ sa to vyžaduje, môže sa použiť ešte ďalší stupeň čistenia na katexovej kolóne.

Indukovateľnost 1promótora

- 15Indukovateľnosť ľ-promótora auxínom se skúša 5i[ mol.ľ¹ kyselinou indol-3-octovou (IAA). Päť dní po transformácii sa prevedú lOOq alikvotné protoplastové podiely transformačnej reakcie s pNA201 do jamiek 96 miestnej mikrotitračnej doštičky (Nunc, Wiesbaden). Suspenzia protoplastov sa inkubuje po dobu piatich hodín s IAA (výsledná koncentrácia = 514M). Indukčné pokusy sa vyhodntoia priamo po inkubačnej perióde pomocou kvalitatívnej skúšky s β-glukuronidázou.

Kvalitatívna skúška s β-glukuronidázou

Aktivita β-glukuronidázy sa určuje kvalitatívnou skúškou (Jefferson, A. R., Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion systém, Plánt Mol. Rep., 5, 387 - 405, 1987).

Substrátový ústojný roztok: 50 mM K₃Fe(CN)₆ mM Na₂HPO₄ mM K₄Fe(CN)₆ % Triton X-100 (obj/obj) mM NaH₂PO₄ mM EDTA, pH 7,0 mg.ml'¹ PVP (m. hm. 10000)

Farbiaci roztok: 12,5 mg kyseliny 5-bróm-4-chlór-3-indolylglukuronovej (Biomol, Hamburg) sa rozpustí v 250 14I Ν,Ν-dimethylformamidu s 50 ml substrátového ústojného roztoku.

Machové fotonematá a machové protoplasty v Kopovom alebo regeneračnom médiu sa inkubujú po dobu 72 hodín pri 37 °C v rovnakom objeme farbiaceho roztoku a ihneď sa mikroskopicky vyhodnotia.

Výsledky

Homogenita kultúry v bioreaktore; vzorkovanie

Iba homogénne kultúry zabezpečia, aby sa mohlo vzorkovanie bunkových kultúr znormalizovať. Pri predĺženej kultivácii vedie často rast fotonémy do dlhých vlákien k agregátom buniek a tým k nehomogénnemu rozdeleniu rastlinnného materiálu v kvapalných kultúrach. Aby sa zabránilo takým agregáciám, fotonematá sa v určitých časových intervaloch drobia, a to v bioreaktore každý deň nasledujúci po 10. Dni a vmiešaných kultúrach každý 12. deň pomocou vysokoobrátkových miešadiel homogenizátorov. Aby bolo možné v bioreaktore dodržiavať plynulé podmienky pri súčasnom normalizovanom vzorkovaní i počas predĺženej kultivačnej doby, odporúča sa upraviť turbínové miešadlo troma miešacími nožmi zabrúsením hrán miešacích

- 16ramien a tým ich previesť na strihacie ramená. Konštantné „miešanie pri 300 až 500

1.min’¹ umožní udržiavať v bioreaktore homogénne kultúry.

Vývoj biomasy (v DW [mg.ľ¹]) po dobu 35 dní (840 hod) pri 500 l.min’¹ v kontrolných kultúrach s turbinovým miešadlom je rovnaký ako u kultúr v bioreaktore miešanom miešadlom s nožnicovými ramenami.

Homogenita kultúry sa skúša porovnávaním vždy šiestich súbežných vzoriek. Sušina rastlinného materiálu zo vzorkovacieho objemu 100 ml sa stanoví ako pomerná hodnota. Pri použití neupraveného miešadla sa súčasne so zvyšovaním koncentrácie biomasy zvyšuje štandardná odchýlka. Ako dôsledok miešania miešadlom strihacími ramenami zostáva štandardná odchýlka odoberaných vzoriek nízka. To umožňuje urobiť záver, že s upraveným miešadlom je možné v priebehu 35 dní získať rovnomernú homogénnu kultúru.

Štúdia indukovatelnosti 1promótora

V plasmide pNA201 je 1promótor umiestnený nad génom gus a pôsobí ako regulačný prvok. Pri indukčných pokusoch s machom je známa β-glukuronidázová skúška vhodná ako detekčná skúška. Pokusy s transgenným tabakom ukazujú že 1 -promótor vedie k expresii β-glukuronidázy v tkanive s vysokým obsahom auxínu a je teda možné usúdiť, že tento promótor je závislý na auxíne. Indukovateľnosť 1 '-promótora auxínom vo Physcomitrella patens sa študuje v tranzitne transformovaných protoplastoch.

Transformačné reakcie sú podrobené β-glukuronidázovej skúške s 5 hodinovou inkubáciou a bez nej s 5 gM kyselinou indol-3-octovou (IAA). Pri kontrolných skúškach bez prídavku IAA sa nezistili pri hodnotení pod mikroskopom žiadne modré protoplasy pri žiadnej reakcii. Oproti tomu hodnotené protoplasty inkubované s auxínom potvrdzujú expresiu génu gus. Na základe hodnotenia modrých protoplast sa docielila transformačná rýchlosť 3.10’⁴ To je jasné znamenie, že ľ- promótor je v tranzite transformovaných machových protoplastov indukovateľný rastlinným hormónom auxínom.

Generácia vektorov pre transformáciu VEGF

Pre transformáciu cDNK proteínov VEGF₁₂₁ bez vodiacej sekvencie tu nazývanej ďalej VEGFC a cDNK proteínu VEGF121 s vodiacou sekvenciou tu ďalej nazývanou

VEGFP do Physcomitreil je nevyhnutné sekvencie klonovať medzi jednotkami promótora a terminátora, čo je pre rastliny vhodné. Na tento účel sa zvolil promótor 35S

- 17 CaMV a zodpovedajúci polyadenylačný signál. Vhodne pripravené sekvencie VEGF cDNK sa klonujú na reštrikčnú štiepnu polohu Sma I násobne klonovaných polôh vektora pRT101.

Výsledné vektory (pRT101VEGFC 3 a VEGFP 21) sa sekvencujú priemerom odvodeným od terminálnej oblasti promótora 35S a overuje sa správna integrácia medzi promótorom a polyadenylačnou polohou.

Výsledné kazety se excizujú reštrikčným enzýmom Hin dlll a klonujú sa na aktuálny transformačný vektor pRT99 do štiepnej polohy Hin dlll (pRT99VEGFC 3 a VEGFP 21). Orientácia kaziet vzhlľadom na kazetu NPTII môže byť stanovená reštrikcia so Sma I a Hinc II. V prípade orientácie promótora k polyadenylačnej orientácii signálu sa získa fragment 5250 (VEGFC) a 5380 bp (VEGFP), zatiaľčo opačná orientácia poskytne fragment 1100 (VEGFC)/1230 (VEGFP) a 4150 bp (VEGFC a P). Reštrikčná analýza poskytne iba fragment 5250/5380 bp a kazety VEGFC/P tak môžu byť inkorporované do porovnateľnej orientácie promótora k orientácii polyadenylačného signálu s nptll génu pRT99.

Transformácia VEGFC do Physcomitrelly

Absolútna rýchlosť transformácie pri transformácii štruktúry VEGFC pri protoplastoch divokého typu po opakovaných prechodoch z Knopovho média do vybraného média je 0,5.10'⁵ pri trvalej stabilite transformantov.

Potvrdenie integrácie transformovaných plazmidov

Úspéšná integrace do rastlinných genómov sa potvrdila hybridizácou Southern.

Použité vzorky sú jednak fragmentom Neo I génu npt II z pRT99 a jednak fragmentom Nde l/Sal I VEGFC z pCYTEXP-VEGF₁₂,.

Signály detekované v celej nerozštiepenej DNK transformantov potvrdzujú úspešnú integráciu plazmidov DNK do rastlinného genómu. Či sa získa celá kazeta 35S VEGFC PolyA i po integrácii sa skúša s reštrikciou Hin dlll. Pokiaľ zostáva kazeta pri integrácii intaktná, excizuje tento reštrikčný enzým fragment 1100bp z úplnej DNK.

Hybridizačná šablóna so vzorkou VEGFC prezrádza fragment 1100 bp u všetkých transformantov. Bola tak preukázaná integrácia úplnej expresnej jednotky VEGFC, ktorá je predurčujúca pre správnu transkripciu a expresiu VEGF₁₂₁ do machu.

Preukazovanie transkripcie heterologných génov

- 18Transkripcia heterologných génov VEGFC a NPTII transformantov sa určuje nerádioakíivnym detekčným systémom DIG pri použití vzoriek VEGF a NPTII. S nukleotidmi 760 pre transkripciu VEGFC a nukleotidov 1100 pre transkripciu NPTII sa na fluórograme zisťovala miera transkripcie radovej v medziach očakávaných pre každý prípad. Ako sa očakávalo, pri kontrolnej WT nebola detekovaná žiadna z dvoch heterologných transkripcií.

Analýza transformantov s ľudským tranzitným peptidom

Transfér DNK sprostredkovaný PEG 50 (g pRT99P 21 plazmidu DNK pre jednu transformačnú reakciu vytvorí transformanty, ktoré sú na vybranom médiu trvalo stabilné. Výsledná rýchlosť stabilnej transformácie je 3,3.10'⁶.

Preukazovanie integrácie transformovaného plazmidu

Integrácia vyššie popisovaných transformantov s tranzitným peptidom sa preukazuje, ako bolo popísané vyššie, hybridizáciou Southern pri použití popisovaných vzoriek a hybridizácie celej DNK rozštiepenej Hin dlll so vzorkou VEGF prezradzuje fragment 1230 bp: dôkaz kompletnosti integrovanej kazety 35S VEGFP PolyA.

Preukázanie transkripcie heterologných génov

Spôsobom uvedeným vyššie je možné detekovať ako NPTII, tak VEGFP transkripcie.

Detekcia ľudskej VEGF₁₂₁ v bunkách transgenných machov pri použití konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu.

Týmto spôsobom sa skúšaný protein označí priamo v zložených bunkách. Vyhnotenie sa vykonáva pod konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom, ktorý má v porovnaní s bežným svetelným mikroskopom zlepšenú rozlišovaciu schopnosť.

Rekombinant VEGF₁₂₁ protein - pokiaľ je v machových bunkách detekovateľný - musí byť akumulovaný v cytoplazme v transformantoch VEGFC. Vo VEGFP transformantoch musí byť detekovateľný v ER systéme, pokiaľ tranzitný peptid v machu funguje ako signálny.

Expresia ľudského VEGF¹²¹ v transgenných bunkách machu bola úspéšne preukázaná nepriamou imunofluorescenčnou metódou a počítačovým vyhodnotením konfokálnym, laserovým skenovacím mikroskopom. Naviac bolo dokázané, že v transgennom machu sa VEGF₁₂i úspešne transportuje do endoplazmického retikula v prítomnosti zodpovedajúceho ľudského tranzitného peptidu.

- 19Skúška na prítomnosť VEGF v kultivačnom médiu

200 14I alikvotný podiel kultivačného média v prítomnosti PVP sa skúša skúškou ELISA a ukazuje, že machové rastliny transformované expresnou kazetou, vrátane tranzitného peptidu kódujúce sekvencie sú schopné uvoľňovať VEGF do média. Pozitívne výsledky umožňujú vyjadriť záver, že je prítomný protein VEGF.

Skúšky vykonané na verifikáciu biologickej aktivity proteínu VEGF uvoľneného do kultivačného média dávajú tak pozitívne výsledky, ako potvrdzujú, že VEGF vytvorený podľa vynálezu je možné z kultivačného média získať s požadovanou biologickou aktivitou.

Claims

1. Spôsob výroby heterologných bielkovinových látok v rastlinnom materiáli vyznačujúci sa tým, že ako rastlinný materiál sa využije fotonemické tkanivo machu, a že sa vyrobené bielkovinové látky získajú z kultivačného média bez porušenia produkčného tkaniva alebo buniek.

2. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že bielkovinová látka uvoľnená do kultivačného média je biologicky aktívna.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2 vyznačujúci sa tým, že sa použije kultivačné médium, ktoré je bez cukrov, vitamínov a fytohormónov či ich funkčných fragmentov.

4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 vyznačujúci sa tým, že tkanivo machu sa vyberá zo skupiny machov zahrnujúcich ľadviníky.

5. Spôsob podľa nároku 4 vyznačujúci sa tým, že tkanivo machu sa vyberá z machov skupiny obsahujúcej Physcomitrella, Funaria, Sphagnum a Ceratodon.

6. Spôsob podľa nároku 4 vyznačujúci sa tým, že tkanivo machu sa vyberá zo skupiny ľadviníkov, do ktorých patrí Marchantia a Sphaerocarpos.