SK3852001A3 - 4-Aminopyrrolopyrimidines as kinase inhibitors - Google Patents

Description

4-Aminopyrolopyrimidíny a ich použitie ako kinázové inhibítory

Oblasť techniky

Vynález sa týka 4-aminopyrolopyrimidínov štruktúrneho vzorca I a ich fyzicky prijateľných solí, ktoré sú inhibítormi serín/treonín a tyrozín kynázovej aktivity a ich použitia.

Súvisiace prihlášky

Táto prihláška súvisí s prihláškou USA č. 60/100,954 podanou 18. septembra 1998 a je pokračovaním prihlášky USA č. 09/042,702 podanej 17. marca 1998, pričom celý obsah týchto uvedených prihlášok sa týmto zahŕňa odkazom.

Doterajší stav techniky

Existuje najmenej 400 enzýmov, ktoré sú identifikované ako kinázy. Tieto enzýmy katalyzujú fosforyláciu cieľových proteínových substrátov. Fosforylácia je obyčajne reakciou transferu fosfátovej skupiny z ATP na proteínový substrát. Špecifická štruktúra v cieľovom substráte, na ktorú sa fosfát prenáša, je tyrozínový, serínový alebo treonínový zvyšok. Keďže tieto aminokyselinové zvyšky sú cieľové štruktúry pre transfer fosforylu, tieto proteín kinázové enzýmy sa bežne označujú ako tyrozín kinázy alebo serín/treonín kinázy.

Fosforylačné reakcie a opačné fosfatázové reakcie na tyrozínových, serínových a treonínových zvyškoch sú zapojené do nespočetných bunkových procesov, ktoré sú základom odoziev na najrôznejšie medzibunkové signály (typicky sprostredkované cez bunkové receptory), regulácie bunkových funkcií a aktivácie alebo deaktivácie bunkových procesov. Kaskáda proteín kináz sa často zúčastňuje na medzibunkovom prenose signálu a je potrebná na realizáciu týchto bunkových procesov. Vzhľadom na svoju všadeprítomnosť v týchto procesoch možno proteín kinázy nájsť ako integrálnu súčasť plazmovej membrány alebo ako cytoplazmatické enzýmy alebo lokalizované v jadre, často ako komponenty enzýmových komplexov. V mnohých prípadoch sú tieto proteín kinázy podstatným prvkom enzýmových a štrutkúrnych proteínových komplexov, ktoré určujú, kde a kedy sa v bunke odohrá bunkový proces.

1a

Proteínové tyrozín kinázy. Proteínové tyrozín kinázy (PTK) sú enzýmy, ktoré katalyzujú fosforyláciu špecifických tyrozínových zvyškov v bunkových proteínoch. Táto posttranslačná modifikácia týchto substrátových proteínov, často enzýmov samotných, pôsobí ako molekulový spínač regulujúci proliferáciu, aktiváciu alebo diferenciáciu buniek (prehľadný článok pozrite v Schlessinger a Ulrich, 1992, Neurón 9:383-391). Aberantná alebo nadbytočná aktivita PTK bola pozorovaná v mnohých chorobných stavoch vrátane benígnych a malígnych proliferatívnych porúch ako aj chorôb vyplývajúcich z neadekvátnej aktivácie imunitného systému (napr. autoimunitné poruchy), Odmietnutí aloimplantátu a chorobe štep verzus hostiteľ. Okrem toho receptorové PTK špecifické pre endotelové bunky, ako sú napríklad KDR a Tie-2, sprostredkujú angiogénny proces a sú teda zapojené do podpory progresu rakovín a iných chorôb zahŕňajúcich neadekvátnu vaskularizáciu (napr. diabetická retinopatia, neurovaskularizácia cievovky v dôsledku s vekom súvisiacej makulárnej degenerácie, psoriáza, artritída, retinopatia nedonosených, infantilné hemangiómy).

Tyrozín kinázy môžu byť receptorového typu (s extracelulárnymi, transmembránovými a intracelulárnymi doménami) alebo nereceptorového typu (úplne intracelulárne).

Receptorové tyrozín kinázy (RTK). RTK predstavujú veľkú rodinu transmembránových receptorov s najrôznejšími biologickými aktivitami. V súčasnosti je identifikovaných najmenej devätnásť (19) rôznych podrodín RTK. Rodina receptorových tyrozín kináz (RTK) zahŕňa receptory, ktoré sú kľúčové pre rast a diferenciáciu radu bunkových typov (Yarden a Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich a Schlessinger, Ce//61:243-254, 1990). Vnútorná funkcia RTK sa aktivuje viazaním ligandu, ktoré vedie k fosforylácii receptora a viacerých bunkových substrátov a následne k radu bunkových odoziev (Ullrich a Schlessinger, 1990, Celí 61:203-212). Teda prenos signálu sprostredkovaný receptorovou tyrozín kinázou je iniciovaný extracelulárnou interakciou so špecifickým rastovým faktorom (ligandom), po ktorom väčšinou nasleduje dimerizácia receptora, stimulácia vnútornej aktivity proteínovej tyrozín kinázy a transfosforylácia receptora. Tým sa vytvoria väzobné miesta pre molekuly intracelulárneho prenosu signálu a to vedie k tvorbe komplexov so spektrom cytoplazmatických signalizačných molekúl, ktoré uľahčujú príslušnú bunkovú odozvu. Napr. delenie buniek, diferenciácia, metabolické efekty, zmeny v c ľ extracelulárnom mikroprostredí), pozrite Schlessinger a Ullrich, 1992, Neurón 9:120.

Proteíny s väzobnými doménami viažucimi SH2 (src homológia -2) alebo fosfotyrozín (PTB) viažu aktivované tyrozín kinázové receptory a ich substráty s vysokou afinitou a propagujú signály do bunky. Obe tieto domény rozpoznávajú fosfotyrozín. (Fantl etal., 1992, Ce//69:413-423; Songyang et al., 1994, Mol. Celí. Biol. 14:2777-2785; Songyang et al., 1993, Celí 72:767-778; a Koch et al., 1991, Science 252:668-678; Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol. (1997), 1(2), 227-234; Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol. (1997), 7(6),'835-838). Bolo identifikovaných niekoľko intracelulárnych substrátových proteínov, ktoré sa asociujú s receptorovými tyrozín kinázami (RTK). Možno ich rozdeliť do dvoch základných skupín: (1) substráty, ktoré majú katalytickú doménu; a (2) substráty, ktoré takú doménu nemajú, ale ktoré slúžia ako adaptéry a asociujú sa s katalytický aktívnymi molekulami (Songyang et al., 1993, Ce//72:767-778). Špecifickosť interakcií medzi receptormi alebo proteínmi a SH2 alebo PTB doménami ich substrátov je určená aminokyselinovými zvyškami bezprostredne obkolesujúcimi fosforylovaný tyrozínový zvyšok. Napríklad rozdiely vo väzobných afinitách medzi SH2 doménami a aminokyselinovými sekvenciami obkolesujúcimi fosfotyrozínové zvyšky na konkrétnych receptoroch korelujú s pozorovanými rozdielmi v ich profiloch fosforylácie substrátu (Songyang et al., 1993, Celí 72.7Q7-778). Pozorovania naznačujú, že funkcia každej receptorovej tyrozín kinázy je určená nielen jej vzorcom expresie a ligandovej dostupnosti, ale aj radom prenosových ciest signálu smerom nadol, ktoré sú aktivované konkrétnym receptorom ako aj načasovaním a trvaním týchto stimulov. Fosforylácia takto poskytuje dôležitý regulačný krok, ktorý určuje selektivitu signalizačných dráh získavaných špecifickými rastovými receptormi ako aj diferenciáciu faktorových receptorov.

Uvádza sa, že niekoľko receptorových tyrozín kináz, ako FGFR-1, PDGFR, TIE-2 a c-Met, a rastových faktorov, ktoré sa na ne viažu, hrajú úlohu v angiogenéze, hoci niektoré môžu podporovať angiogenézu nepriamo (Mustonen a Alitalo, J. Celí Biol. 129:895-898, 1995). Jedna z takých receptorových tyrozín kináz, známa ako „fetal liver kinase 1“ (kináza fetálnej pečene 1) (FLK-1), je členom podtriedy RTK typu III. Alternatívne označenie pre ľudskú FLK-1 je „kinase insert domain-containing receptor“ (receptor obsahujúci doménu kinázového inzertu) (KDR) (Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991). Ďalším alternatívnym označením pre FLK-1/KDR je „vascular endothelial celí growth factor receptor 2“ (receptor rastového faktora buniek vaskulárneho endotelu) (VEGFR-2), pretože viaže VEGF s vysokou afinitou. Myšacia verzia FLK-1/VEGFR-2 sa nazýva aj NYK (Oelrichs et al, Oncogene 8(1):11-15, 1993). Izolovali sa DNA kódujúce myšaciu, potkaniu a ľudskú FLK-1 a uviedli sa nukleotidové a kódované aminokyselinové sekvencie (Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026-30, 1991; Terman et al., 1991, supra; Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579-86, 1992; Sarzani et al., supra; a Millauer et al., Celí 72:835-846, 1993). Početné štúdie, napríklad štúdia uvedená v Millauer et al., supra, naznačujú, že VEGF a FLK-1/KDR/VEGFR-2 sú párom ligand - receptor, ktorý hrá dôležitú úlohu v proliferácii vaskulárnych endotelových buniek a tvorbe a rozvetvovaní ciev, teda vaskulogenéze a angiogenéze.

Ďalšia RKT podtriedy typu III označená ako „fms-like tyrosine kinase-1“ (tyrozin kináza 1 podobná fms) (Flt-1) je príbuzná s FLK-1/KDR (DeVries et al. Science 255;989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990). Alternatívnym označením pre Flt-1 je „vascular endothelial celí growth factor receptor 1“ (receptor rastového faktora buniek vaskulárneho endotelu 1) (VEGFR1). Doposiaľ sa členy podrodín FLK-1/KDR/VEGFR-2 a FIM/VEGFR-1 nachádzali ako produkty expresie na endotelových bunkách. Tieto členy podtried sú špecificky stimulované členmi rodiny ligandov rastového faktora buniek vaskulárneho endotelu (VEGF) (Klagsburn and D’Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 7: 259-270, 1996). Rastový faktor buniek vaskulárneho endotelu (VEGF) sa viaže na Flt-1 s vyššou afinitou ako na FLK-1/KDR a je mitogénny voči bunkám vaskulárneho endotelu (Terman et al., 1992, supra; Mustonen et al. supra; DeVries et al., supra). Predpokladá sa, že Flt-1 je podstatný pre organizáciu endotelu počas vaskulárneho vývoja. Expresia Flt-1 je spojená s raným vaskulárnym rozvojom u myšacích embryí a s neovaskularizáciou počas hojenia rán (Mustonen and Alitalo, supra). Expresia Flt-1 v monocytoch, osteoklastoch a osteoblastoch ako aj v dospelých tkanivách ako obličkové glomeruly naznačuje ďalšiu funkciu pre tento receptor, ktorá nesúvisí s rastom buniek (Mustonen a Alitalo, supra).

Ako bolo uvedené už skôr, nové údaje naznačujú, že VEGF hrá úlohu v stimulácii normálnej aj patogenetickej angiogenézy (Jakeman et al., Endocrinology 133: 848-859, 1993; Kolch et al., Breast Cancer Research and Treatment 36: 139155, 1995; Ferrara et al., Endocrine Reviews 18(1); 4-25, 1997; Ferrara et al., Regulation of Angiogenesis (ed. L. D. Goldberg a E.M. Rosen), 209-232, 1997). Okrem toho bol VEGF implikovaný v kontrole a zlepšovaní vaskulárnej priepustnosti (Connolly, et al., J. Biol. Chem. 264: 20017-20024, 1989; Brown et al., Regulation of Angiogenesis (ed. L.D. Goldberg a E.M. Rosen), 233-269, 1997). Boli udávané rôzne formy VEGF pochádzajúce z alternatívneho štiepenia mRNA vrátane štyroch foriem, ktoré opísal Ferrara et al. (J. Celí. Biochem. 47:211-218, 1991). Obe vylučované a prevažne s bunkami spojené typy VEGF identifikoval Ferrara et al. supra a o proteíne je známe, že existuje vo forme disulfidom spojených dimérov.

Nedávno bolo identifikovaných niekoľko príbuzných homológov VEGF. Ich úlohy v normálnych fyziologických a chorobných procesoch však ešte neboli vysvetlené. Okrem toho členy rodiny VEGF sa často koexprimujú s VEGF v niekoľkých tkanivých a sú vo všeobecnosti schopné tvoriť heterodiméry s VEGF. Táto vlastnosť pravdepodobne mení. špecifickosť receptora a biologické účinky heterodimérov a ďalej komplikuje vysvetlenie ich špecifických funkcií, ako je ilustrované nižšie (Korpelainen a Alitalo, Curr. Opin. Celí Biol., 159-164,1998 a tam citované odkazy).

Placentový rastový faktor (PIGF) má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá vykazuje významnú homológiu voči sekvencií VEGF (Park et al., J. Biol. Chem. 269:25646-54, 1994; Maglione et al. Oncogene 8:925-31, 1993). Rovnako ako pri VEGF, z alternatívneho štiepenia mRNA pochádzajú rôzne druhy PIGF a proteín existuje v dimérnej forme (Park et al., supra). PIGF-1 a PIGF-2 sa viažu na Flt-1 s vysokou afinitou a PIGF-2 sa tiež intenzívne viaže na neuropilin-1 (Migdal et al, J. Biol. Chem. 273 (35): 22272-22278), ale žiadny z nich sa neviaže na FLK-1/KDR (Park et al., supra). Uvádza sa, že PIGF potenciuje vaskulárnu priepustnosť aj

C r r c r ľ r n c r r r r o r r r r ,λ ' mitogénny efekt VEGF na endotelové bunky, keď je VEGF prítomný v nízkych koncentráciách (údajne v dôsledku tvorby heterodiméru) (Park et al., supra).

VEGF-B sa produkuje v dvoch izoformách (167 a 185 zvyškov), ktoré, ako sa zdá, tiež viažu Flt-1/VEGFR-1. Môže hrať úlohu v regulácii degradácie extracelulárnej matrix, adhézii buriiek a migrácii cez moduláciu expresie a aktivity aktivátora plazminogénu urokinázového typu a inhibítora aktivátora plazminogénu 1 (Peppere/a/, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998), 95(20): 11709-11714).

VEGF-C bol pôvodne naklonovaný ako ligand pre VEGFR-3/Flt-4, ktorý sa primárne exprimuje lymfatickými endotelovými bunkami. Vo svojej plne spracovanej forme môže VEGF-C viazať aj KDR/VEGFR-2 a stimulovať proliferáciu a migráciu endotelových buniek in vitro a angiogenézu v in vivo modeloch (Lymboussaki et al, Am. J. Pathol. (1998), 153(2): 395-403; Witzenbichler et al, Am. J. Pathol. (1998), 153(2), 381-394). Transgénna nadmerná expresia VEGF-C spôsobuje proliferáciu a zväčšovanie len lymfatických ciev, zatiaľ čo krvné cievy ostávajú nepostihnuté. Na rozdiel od VEGF nie je expresia VEGF-C indukovaná hypoxiou (Ristimaki et al, J. Biol. Chem. (1998), 273(14), 8413-8418).

Najnovšie objavený VEGF-D je štruktúrne veľmi podobný VEGF-C. Udáva sa, že VEGF-D sa viaže a aktivuje aspoň dve VEGFR, VEGFR-3/Flt-4 a KDR/VEGFR-2. Pôvodne bol klonovaný ako mitogén indukovateľný c-fos pre fibroblasty a najviac sa exprimuje v mezenchymálnych bunkách pľúc a kože (Achen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998), 95(2), 548-553 a tam citované odkazy).

Čo sa týka VEGF, tvrdí sa, že VEGF-C a VEGF-D indukujú zvýšenia vaskulárnej priepustnosti in vivo v Milesovom teste pri injekcii do kutánneho tkaniva (PCT/US97/14696; WO98/07832, Witzenbichler et al., suprä). Fyziologická úloha a význam týchto ligandov pri modulácii vaskulárnej hyperpermeability a endotelových odoziev v tkanivách, kde sa exprimujú, ostáva neistá.

Nedávno sa objavil virálne kódovaný nový typ rastového faktora vaskulárneho endotelu, VEGF-E (NZ-7 VEGF), ktorý preferenčne využíva receptor • · i lír • e c e e c r e c f. c r.

KDR/Flk-1 a má potentnú mitotickú aktivitu bez domény viazania heparínu (Meyer eŕa/, EMBO J. (1999), 18(2), 363-374; Ogawa etal, J. Biol. Chem. (1998), 273(47), 31273-31282.). Sekvencia VEGF-E majú 25 % homológiu s cicavčím VEGF a sú kódované parapoxvírusom Orfovým vírusom (OV). Tento parapoxvírus, ktorý postihuje ovce a kozy a príležitostne ľudí, generuje lézie s angiogenézou. VEGF-E je dimér s hmotnosťou asi 20 kDa bez základnej domény alebo afinity pre heparín, ale má charakteristický cysteínový uzlový motív prítomný vo všetkých cicavčích VEGFs a prekvapujúco sa zistilo, že má potenciu a bioaktivity podobné heparín viažucej VEGF165 izoforme VEGF-A, t.j. oba faktory stimulujú uvoľňovanie tkanivového faktora (TF), proliferáciu, chemotaxu a pučanie kultivovaných vaskulárnych endotelových buniek in vitro a angiogenézu in vivo. Zistilo sa, že podobne ako VEGF165 aj VEGF-E sa viaže s vysokou afinitou na VEGF receptor-2 (KDR), čo vedie k autofosforylácii receptora a dvojfázovému nárastu v koncentráciách voľného intracelulárneho Ca²⁺, zatiaľ čo na rozdiel od VEGF165 sa VEGF-E neviazal na VEGF receptor-1 (Flt-1).

Na základe objavujúcich sa objavoch iných homológov VEGF a VEGFR a precedensoch pre heterodimerizáciu ligandov a receptorov, akcie takých homológov VEGF môžu zahŕňať tvorbu heterodimérov ligandov VEGF a/alebo heterodimerizáciu receptorov alebo viazanie na ešte neobjavený VEGFR (Witzenbichler et al., supra). Nedávne práce tiež naznačujú, že neuropilin-1 (Migdal et al, supra) alebo VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbichler et al., supra) alebo receptory iné ako KDR/VEGFR-2 môžu byť zapojené do indukcie vaskulárnej priepustnosti (Stacker, S. A., Vítali, A., Domagala, T., Nice, E., a Wilks, A. F., „Angiogenesis and Cancer“ konferencia, Amer. Assoc. Cancer Res., Jan. 1998, Orlando, FL; Williams, Diabetelogia 40: S118-120 (1997)).

Tie-2 (TEK) je členom nedávno objavenej rodiny receptorových tyrozín kináz špecifických pre endotelové bunky, ktorá je zapojená do kritických angiogenických procesov, ako je rozvetvovanie, pučanie, preformovanie, dozrievanie a stabilita ciev. Tie-2 je prvou cicavčou receptorovou tyrozín kinázou, pre ktorú boli identifikované agonistické ligandy (napr. Angiopoietinl („Ang1“), ktorý stimuluje autofosforyláciu receptorov a prenos signálov), aj antagonistické ligandy (napr.

η r ŕ r r r r p r n r c r c r ^r ‘ r r »· c <·

Angiopoietin2 („Ang2“)). Knock-outová a transgénna manipulácia expresie Tie-2 a jej ligandov indikuje, že prísna priestorová a časová kontrola signalizácie Tie-2 je podstatná pre správny vývoj novej vaskulatúry. Aktuálny model naznačuje, že stimulácia Tie-2 kinázy ligandom Ang1 je priamo zapojená do vetvenia, pučania a rastu nových ciev a zosilnenia a interakcie periendotelových podporných buniek dôležitých v udržiavaní integrity ciev a indukovaní pokoja. Neprítomnosť Ang1 stimulácie Tie-2 alebo inhibícia autofosforylácie Tie-2 pomocou Ang2, ktorá sa produkuje vo vysokých hladinách na miestach vaskulárnej regresie, môže spôsobiť stratu vaskulárnej štruktúry a kontaktov matrix, čo vedie k umieraniu endotelových buniek, najmä za neprítomnosti rastových stimulov alebo stimulov prežitia. Situácia je však ešte zložitejšia, pretože nedávno boli uvedené najmenej dva dodatočné ligandy Tie-2 (Ang3 a Ang4) a bola preukázaná schopnosť heterooligomerizácie rôznych agonistických a antagonistických angiopoietínov a tým modifikovania ich aktivity. Zameranie sa na interakcie ligand - receptor Tie-2 ako antiangiogénny terapeutický prístup je teda menej uprednostňované a preferuje sa kinázová inhibičná stratégia.

Rozpustná extracelulárna doména Tie-2 („ExTek) môže pôsobiť tak, že naruší zakladanie nádorovej vaskulatúre v xenoimplantáte rakoviny prsníka a modeloch pľúcnych metastáz a v okulárnej neovaskularizácii sprostredkovanej nádorovými bunkami. In vivo produkciu v hladinách mg/ml ExTek u hlodavcov možno dosiahnuť adenovírusovou infekciou na 7 - 10 dní bez nepriaznivých vedľajších účinkov. Tieto výsledky naznačujú, že narušenie signalizačných dráh Tie-2 u normálnych zdravých zvierat môže byť dobre tolerované. Tieto inhibičné odozvy Tie-2 na ExTek môžu byť dôsledkom sekvestrácie ligandov a/alebo generácie neproduktívneho heterodiméra s Tie-2 plnej dĺžky.

Nedávno sa významná regulácia expresie Tie-2 nahor zistila vo vaskulárnom synoviálnom panuse artritických kĺbov ľudí, čo je konzistentné s úlohou v neadekvátnej neovaskularizácii. Toto zistenie naznačuje, že Tie-2 hrá úlohu v progresii reumatoidnej artritídy. Bodové mutácie produkujúce konštitutívne aktivované formy Tie-2 boli identifikované v spojení s ľudskými poruchami r c venóznych malformácií. Inhibítory Tie-2 sú teda užitočné v liečbe takých chorôb a v iných situáciách neadekvátnej neovaskularizácie.

Nereceptorové tyrozín kinázy. Nereceptorové tyrozín kinázy predstavujú súbor bunkových enzýmov, ktoré nemajú extracelulárne a transmembránové sekvencie. Momentálne je identifikovaných vyše dvadsaťštyri nereceptorových tyrozín kináz obsahujúcich jedenásť (11) podrodín (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack a LIMK). V súčasnosti podrodina Src nereceptorových tyrozín kináz obsahuje najväčší počet PTK a zahŕňa Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr a Yrk. Podrodina enzýmov Src sa spája s onkogenézou a imunitnými odpoveďami. Podrobnejšia diskusia nereceptorových tyrozín kináz je uvedená v práci Bohlen, 1993, Oncogene 8:2025-2031, ktorá sa týmto zahŕňa odkazom.

Zistilo sa, že mnohé tyrozín kinázy, či RTK alebo nereceptorové tyrozín kinázy, sú zapojené do bunkových signalizačných dráh zúčastňujúcich sa na početných patogénnych stavoch vrátane rakoviny, psoriázy a iných hyperproliferatívnych chorôb alebo hyperimunitných odpovedí.

Vývoj zlúčenín na moduláciu PTK. S ohľadom na predpokladanú dôležitosť PTK pre kontrolu, reguláciu a moduláciu proliferácie buniek, choroby a poruchy spojené s abnormálnou proliferáciou buniek, uskutočnilo sa mnoho pokusov o identifikáciu „inhibítorov“ receptorových a nereceptorových tyrozín kináz pomocou radu prístupov vrátane použitia mutantných ligandov (prihláška USA č. 4,966,849), rozpustných receptorov a protilátok (prihláška č. WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci 90:10705-09; Kim et al., 1993, Náture 362:841-844), RNA ligands (Jellinek, et al., Biochemistry 33:10450-56; Takano, et al., 1993, Mol. Bio. Celí 4:358A; Kinsella, et al. 1992, Exp. Celí Res. 199:56-62; Wright, eŕ al., 1992, J. Cellular Phys. 152:448-57) a tyrozín kinázových inhibítorov (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; patent USA č. 5,330,992; Mariani, et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268).

Nedávno sa uskutočnili pokusy o identifikáciu malých molekúl, ktoré pôsobia ako inhibítory tyrozín kinázy. Ako inhibítory tyrozín kinázy boli napríklad všeobecne opísané bis-monocyklické, bicyklické alebo heterocyklické arylzlúčeniny (PCT WO

Γ Γ _Γ;, , - ^{r r}. '

92/20642) a vinylén-azaindolové deriváty (PCT WO 94/14808). Styrylové zlúčeniny (patent USA č. 5,217,999), styrylom substituované pyridylové zlúčeniny (patent USA č. 5,302,606), isté chinazolínové deriváty (prihláška EP č. 0 566 266 A1; Expert Opin. Ther. Pat. (1998), 8(4): 475-478), selenoindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické poly hydroxy love zlúčeniny (PCT WO 92/21660) a zlúčeniny kyseliny benzylfosforitej (PCT WO 91/15495) boli opísané ako zlúčeniny na použitie ako tyrozín kinázové inhibítory na použitie pri liečbe rakoviny. Anilinocinolíny (PCT WO97/34876) a chinazolínové deriváty (PCT WO97/22596; PCT WO97/42187) boli opísané ako inhibítory angiogenézy a vaskulárnej priepustnosti.

Okrem toho sa uskutočnili pokusy o identifikáciu malých molekúl, ktoré pôsobia ako inhibítory serín/treonín kinázy. Napríklad bis(indolylmaleimid)ové zlúčeniny boli opísané ako inhibítory konkrétnych izoforiem PKC serín/treonín kinázy, ktorých funkcia prenosu signálu je spojená so zmenenou vaskulárnou priepustnosťou pri chorobách súvisiacich s VEGF (PCT W097/40830; PCT WO97/40831).

Inhibítory kinázy Plk-1

Plk-1 je serín/treonín kináza, ktorá je dôležitým regulátorom progresie bunkového cyklu. Hrá kritickú úlohu v zostavovaní a dynamickej funkcii aparátu mitotického vretena. Ukázalo sa, že Plk-1 a príbuzné kinázy sú tiež úzko zapojené do aktivácie a deaktivácie iných regulátorov bunkového cyklu, ako sú napríklad od cyklínu závislé kinázy. Vysoké hladiny expresie Plk-1 sú spojené s aktivitami bunkovej proliferácie. Často sa nachádzajú v malígnych nádoroch rôzneho pôvodu. Očakáva sa, že inhibítory Plk-1 budú blokovať proliferáciu rakovinových buniek narušením procesov zahŕňajúcich mitotické vretená a neadekvátne aktivované kinázy závislé od cyklínu.

Inhibítory Cdc2/Cyklín B kinázy (Cdc2 je známa aj ako cdk1)

Cdc2/cyklín B je ďalší serín/treonín kinázový enzým, ktorý patrí do rodiny od cyklínu závislých kináz (cdks - cyclin-dependent kinase). Tieto enzýmy sú zapojené do kritického prechodu medzi rôznymi fázami progresie bunkového cyklu. Predpokladá sa, že nekontrolovaná proliferácia buniek, ktorá je kritériom rakoviny, e e · c · e« « ^Λ ' e © r e r r f dl r e f r , r. r ¹¹ r c c^r f c r c c c · <* ·' závisí od zvýšených aktivít cdk v týchto bunkách. Inhibícia zvýšených aktivít cdk v rakovinových bunkách inhibítormi cdc2/cyklín B kinázy by mohla potlačiť proliferáciu a môže obnoviť normálnu kontrolu progresie bunkového cyklu.

Regulácia aktivácie CDK je zložitá, ale vyžaduje asociáciu CDK s členom cyklínovej rodiny regulačných podjednotiek (Draetta, Trends in Celí Biology,.3:287289 (1993)); Murray a Kirschner, Náture, 339:275-280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Celí, 3:13-27 (1992)). Ďalšia úroveň regulácie prebieha cez aktiváciu a deaktiváciu fosforylácií podjednotky CDK (Draetta, Trends in Celí Biology, 3:287-289 (1993)); Murray a Kirschner, Náture, 339:275-280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Celí, 3:13-27 (1992); Ducommun et al., EMBO Journal, 10:3311-3319 (1991); Gautier et al., Náture 339:626-629 (1989); Gould a Nurse, Náture, 342:39-45 (1989); Krek a Nigg, EMBO Journal, 10:33313341 (1991); Solomon et al., Celí, 63:1013-1024 (1990)). Koordinovaná aktivácia a deaktivácia rôznych komplexov cyklínu a CDK je potrebná pre normálnu progresiu cez bunkový cyklus (Pines, Trends in Biochemical Sciences, 18:195-197 (1993); Sherr, Celí, 73:1059-1065 (1993)). Kritické prechody G1-S a G 2-M sú kontrolované aktiváciou rôznych aktivít cyklínu a CDK. Predpokladá sa, že v G1 cyklín D/CDK4 aj cyklín E/CDK2 sprostredkujú nástup fázy S (Matsushima et al., Molecular & Cellular Biology, 14:2066-2076 (1994); Ohtsubo a Roberts, Science, 259:1908-1912 (1993); Quelle et al., Genes & Development, 7:1559-1571 (1993); Resnitzky et al., Molecular & Cellular Biology, 14:1669-1679 (1994)). Progresia cez fázu S vyžaduje aktivitu cyklínu A/CDK2 (Girard et al., Celí, 67:1169-1179 (1991); Pagano et al., EMBO Journal, 11:961-971 (1992); Rosenblatt et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, 89:2824-2828 (1992); Walker a Maller, Náture, 354:314-317 (1991); Zindy et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 182:1144-1154 (1992)), zatiaľ čo aktivácia cyklínu A/cdc2 (CDK1) a cyklínu B/je potrebná na nástup metafázy (Draetta, Trends in Celí Biology, 3:287-289 (1993)); Murray a Kirschner, Náture, 339:275-280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Celí, 3:13-27 (1992); Girard et al., Celí, 67:1169-1179 (1991); Pagano et al., EMBO Journal, 11:961-971 (1992); Rosenblatt et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, 89:28242828 (1992); Walker a Maller, Náture, 354:314-317 (1991); Zindy et al., c r

C r r Γr f .· r r r

Biochemical & Biophysical Research Communications, 182:1144-1154 (1992)). Preto nie je prekvapujúce, že strata kontroly regulácie CDK je častou udalosťou pri hyperproliferatívnych chorobách a rakovine. (Pines, Current Opinion in Celí Biology, 4:144-148 (1992); Lees, Current Opinion in Celí Biology, 7:773-780 (1995); Hunter a Pines, Celí, 79:573-582 (1994)).

Inhibítory kináz zapojených do sprostredkovania alebo udržiavania chorobných stavov predstavujú nové terapie pre tieto poruchy. Medzi príklady takýchto kináz patria okrem iných nasledujúce: (1) inhibícia c-Src (Brickell, Critical Reviews in Oncogenesis, 3:401-406 (1992); Courtneidge, Seminars in Cancer Biology, 5:236-246 (1994), raf (Powis, Pharmacology & Therapeutics, 62:57-95 (1994)) a od cyklínu závislých kináz (CDKs) 1, 2 a 4 pri rakovine (Pines, Current Opinion in Celí Biology, 4:144-148 (1992); Lees, Current Opinion in Celí Biology, 7:773-780 (1995); Hunter and Pines, Celí, 79:573-582 (1994)), (2) inhibícia CDK2 alebo PDGF-R kinázy pri restenóze (Buchdunger et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, 92:2258-2262 (1995)), (3) inhibícia CDK5 a GSK3 kináz pri Alzheimerovej chorobe (Hosoi et al., Journal of Biochemistry (Tokyo), 117:741-749 (1995); Aplin et al., Journal of Neurochemistry, 67:699-707 (1996), (4) inhibícia c-Src kinázy pri osteoporóze (Tanaka eŕ al., Náture, 383:528531 (1996), (5) inhibícia GSK-3 kinázy pri diabetes typu 2 (Borthwick eŕ al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 210:738-745 (1995), (6) inhibícia p38 kinázy pri zápale (Badger eŕ al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 279:1453-1461 (1996)), (7) inhibícia VEGF-R 1-3 a TIE-1 a -2 kináz pri chorobách, ktoré zahŕňajú angiogenézu (Shawver eŕ al., Drug Discovery Today, 2:50-63 (1997)), (8) inhibícia UL97 kinázy pri vírusových infekciách (He et al., Journal of Virology, 71:405-411 (1997)), (9) inhibícia CSF-1R kinázy pri kostných a hematopoetických chorobách (Myers eŕ al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7:421-424 (1997) a (10) inhibícia Lek kinázy pri autoimunitných chorobách a odmietaní transplantátu (Myers eŕ al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7:417-420 (1997)).

Okrem toho je možné, že inhibítory istých kináz sú použiteľné pri liečbe chorôb, kedy kináza nie je deregulovaná, ale napriek tomu je dôležitá pre udržanie chorobného stavu. V tomto prípade by inhibícia aktivity kinázy pôsobila buď ako liečba alebo utišujúci prostriedok pre tieto choroby. Napríklad mnohé vírusy, ako je vírus ľudského papilómu, narušujú bunkový cyklus a ženú bunky do fázy S bunkového cyklu (Vousden, FASEB Journal, 7:8720879 (1993)). Keď sa bunkám zabráni vstúpiť do syntézy DNA po infekcii vírusom inhibíciou esenciálnej fázy S iniciovaním aktivít ako CDK2, môže to narušiť životný cyklus vírusu zabránením replikácie vírusu. Tento istý princíp možno použiť na ochranu normálnych buniek tela pred toxicitou cyklovo špecifických chemoterapeutických prostriedkov (Stone et al., Cancer Research, 56:3199-3202 (1996); Kohn et al., Journal of Cellular Biochemistry, 54:44-452 (1994)). Inhibícia CDK 2 alebo 4 zäbráni progresii do cyklu v normálnych bunkách a obmedzí toxicitu cytotoxík, ktoré pôsobia vo fáze S, G2 alebo v mitóze. Navyše sa ukázalo, že aktivita CDK2/cyklínu E reguluje aj NFkB. Inhibícia aktivity CDK2 stimuluje génovú expresiu závislú od NF-kB, čo je udalosť sprostredkovaná cez interakcie s koaktivátorom p300 (Perkins et al., Science, 275:523-527 (1997)). NF-kB reguluje gény zapojené do zápalových odpovedí (ako sú hematopoetické rastové faktory, chemokíny a leukocytové adhézne molekuly) (Baeuerle a Henkel, Annual Review of Immunology, 12:141-179 (1994)) a môžu byť zapojené do potláčania apoptotických signálov v bunke (Beg a Baltimore, Science, 274:782-784 (1996); Wang et al., Science, 274:784-787 (1996); Van Antwerp et al., Science, 274:787-789 (1996)). Teda inhibícia CDK2 môže potlačiť apoptózu indukovanou cytotoxickými liečivami mechanizmom, ktorý zahŕňa NF-kB. To teda naznačuje, že inhibícia aktivity CDK2 môže mať využitie aj v iných prípadoch, kde regulácia NF-kB hrá úlohu v etiológii choroby. Ďalší príklad si možno vziať z hubových infekcií: Aspergilóza bežnou infekciou u imunitné narušených pacientov (Armstrong, Clinical Infectious Diseases, 16:1-7 (1993)). Inhibícia kináz Aspergillus Cdc2/CDC28 alebo Nim A (Osmani et al., EMBO Journal, 10:2669-2679 (1991); Osmani et al., Celí, 67:283-291 (1991)) môže spôsobiť zastavenie rozvoja alebo smrť húb, čím zlepší terapeutický výsledok pre pacientov s týmito infekciami.

Je preto žiaduca identifikácia účinných malých zlúčenín, ktoré špecificky inhibujú prenos signálu a bunkovú proliferáciu modulovaním aktivity receptorových a nereceptorových tyrozín a serín/treonín kináz, aby regulovali abnormálnu alebo neadekvátnu bunkovú proliferáciu, diferenciáciu alebo metabolizmus. Prospešná by bola najmä identifikácia metód a zlúčenín, ktoré špecificky inhibujú funkciu tyrozín kinázy, ktorá je podstatná pre angiogénne procesy alebo tvorbu vaskulárnej hyperpermeability vedúcej k edému, ascites, efúziám, exsudátom a makromolekulárnej extravazácii a depozícii matrixu ako aj súvisiacim chorobám. Podstata vynálezu

Predložený vynález poskytuje 4-aminopyrolopyrimidíny vzorca I

' a ich farmaceutický prijateľné soli.

Vo vzorci I je kruh A šesťčlenný aromatický kruh alebo päť- alebo šesťčlenný heteroaromatický kruh. Kruh A je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými z nasledujúcich substituentov: substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina, halogén, substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaralkyl, kyano, nitro, -NR⁴R⁵, -C(O)₂H, -OH, substituovaný alebo nesubstituovaný alkoxykarbonyl, -C(O)₂-haloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný alkyltioéter, substituovaný alebo nesubstituovaný alkylsulfoxid, substituovaný alebo nesubstituovaný alkylsulfón, substituovaný alebo nesubstituovaný aryltioéter, substituovaný alebo nesubstituovaný arylsulfoxid, substituovaný alebo nesubstituovaný arylsulfón, substituovaný alebo nesubstituovaný alkylkarbonyl, -C(O)-haloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný alifatický éter, substituovaný alebo nesubstituovaný aromatický éter, substituovaný alebo nesubstituovaný karboxamido, tetrazolyl, trifluórmetylsulfonamido, trifluórmetylkarbonylamino, substituovaný alebo r r.

• · «e r • t · f. r ' n r r c c β · β Γ r· r r ľ r . _ e f- o P - o r p i k n e p ·?

* 'J r«o p. r, c ''s ' nesubstituovaný alkinyl, substituovaný alebo nesubstituovaný alkylamido, substituovaný alebo nesubstituovaný arylamido, substituovaný alebo nesubstituovaný styryl a substituovaný alebo nesubstituovaný aralkylamido.

L je jedným z nasledujúcich linkerov: -O-; -S-; -S(O)-; -S(O)₂-; -N(R)-; N(C(O)OR)-; -N(C(O)R)-; -N(SO₂R)-; -CH₂O-; -CH₂S-; -CH₂N(R)-; -CH(NR)-;CH₂N(C(O)R))-; -CH₂N(C(O)OR)-; -CH₂N(SO₂R)-; -CH(NHR)-; -CH(NHC(O)R)-; CH(NHSO₂R)-; -CH(NHC(O)OR)-; -CH(OC(O)R)-; -CH(OC(O)NHR)-; -CH=CH-; C(=NOR)-; -C(O)-; -CH(OR)-;-C(O)N(R)-; -N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)₂-; OC(O)N(R)-;-N(R)C(O)N(R)-; -NRC(O)O-; -S(O)N(R)-; -S(O)₂N(R)-; N(C(O)R)S(O)-; N(C(O)R)S(O)₂-; -N(R)S(O)N(R)-í -N(R)S(O)₂N(R)-; -C(O)N(R)C(O)-;

-S(O)N(R)C(O)-; -S(O)₂N(R)C(O)-; -OS(O)N(R)-; -OS(O)₂N(R)-; -N(R)S(O)O-; -N(R)S(O)₂O-; -N(R)S(O)C(O)-; -N(R)S(O)₂C(O)-; -SON(C(O)R)-; -SO₂N(C(O)R)-; -N(R)SON(R)-; -N(R)SO₂N(R)-; -C(O)O-; -N(R)P(OR’)O-; -N(R)P(OR’)-;

-N(R)P(O)(OR’)O-; -N(R)P(O)(OR’)-; -N(C(O)R)P(OR’)O-; -N(C(O)R)P(OR’)-;

-N(C(O)R)P(O)(OR’)O- alebo -N(C(O)R)P(OR’)-. R a R’ sú každé nezávisle -H, acyl, substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina alebo substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl.

Alternatívne L je -R^bN(R)S(O)²-, -R^bN(R)P(O)- alebo -R^bN(R)P(O)O-. R_b je alkylénová skupina, ktorá vzatá spolu so sulfónamidovou, fosfínamidovou alebo fosfónamidovou skupinou, na ktorú je naviazaná, tvorí päť- alebo šesťčlenný kruh nakondenzovaný na kruh A.

Alternatívne je L zastúpené jedným z nasledujúcich štruktúrnych vzorcov:

N—Ρ

Ν-Ρ

R85-O

R85-Q

R85-O ο

R85-O

R85

R85 alebo

R⁸⁵ dopĺňa 5-, 6- alebo 7-členný aromatický, heteroaromatický alebo heterocykloalkylový kruh.

Vo vzorci I R¹ je -H, 2-fenyl-1,3-dioxan-5-yl, C^Cg alkyl, C3-C8 cykloalkyl, C5C7 cykloalkenyl alebo voliteľne substituovaný aryKC^Ce alkyl). Keď R¹ je alkyl, cykloalkyl a cykloalkenyl, môže byť voliteľne substituovaný jednou alebo viacerými skupinami vzorca -OR^a za predpokladu, že -OR^a sa nenachádza na uhlíku pripojenom na dusík. R^a je -H alebo C^Cg alkyl alebo C3-C₆ cykloalkyl.

Vo vzorci I R² je -H, substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, halogén, -OH, kyano, substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaralkyl, -NR⁴R⁵, alebo -C(O)NR⁴R⁵.

Vo vzorci I R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina alebo substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl. Keď L je NRSO₂-, NRC(O)-, -NRC(O)O-, S(O)₂NR-, -C(O)NR- alebo -OC(O)NR-, R³ môže okrem toho byť alkyl, alkenyl alebo aralkyl.

Vo vzorci I R⁴, R⁵ a dusíkový atóm spolu tvoria 3, 4, 5, 6 alebo 7-členný substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl alebo substituovanú alebo nesubstituovanú heteroaromatickú skupinu.

Alternatívne je R⁴ a R⁵ nezávisle -H, azabicykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo Y-Z.

Y je -C(O)-, -(CH₂)_p-, -S(O)₂-, -C(O)O-, -SO₂NH-, -CONH-, (CH₂)_PO-, (CH₂)_pNH-, -(CH₂)_pS-, -(CH₂)_pS(O)- alebo -(CH₂)_pS(O)₂-.

p je celé číslo od 0 do 6.

Z je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný amino, substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl alebo substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl.

j je celé číslo od 0 do 6.

Keď však L je -CH₂NR-, -C(O)NR- alebo -NRC(O)- a R³ je azacykloalkyl alebo azaheteroaryl, j je 0. Okrem toho keď L je -O- a R³ je fenyl, j je 0.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú užitočné ako inhibítory serín/treonín a tyrozín kináz. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú konkrétne užitočné ako inhibítory tyrozín kináz, ktoré sú dôležité pri hyperproliferatívnych chorobách, najmä pri rakovine a procese angiogenézy. Niektoré z týchto zlúčenín sú napríklad inhibítormi takých receptorových kináz ako KDR, Flt-1, FGFR, PDGFR, c-Met, TIE2 alebo 1GF-1-R. Keďže niektoré z týchto zlúčenín sú antiangiogénne, sú dôležitými látkami na inhibíciu progresie chorobných stavov, kde je angiogenéza dôležitým komponentom. Isté zlúčeniny podľa vynálezu sú účinné ako inhibítory takých serín/treonín kináz ako PKCs, erk, MAP kinázy, MAP kináza kinázy, MAP kináza kináza kinázy, cdks, Plk-1 alebo Raf-1. Tieto zlúčeniny sú užitočné pri liečbe rakoviny a hyperproliferatívnych chorôb. Okrem toho sú isté zlúčeniny účinnými inhibítormi nereceptorových kináz, ako napríklad kinázy z rodín Src (napríklad lck, blk a lyn), Tec, Csk, Jak, Map, Nik a Syk. Tieto zlúčeniny sú užitočné pri liečbe rakoviny, hyperproliferatívnych chorôb a imunologických chorôb.

Isté zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú selektívne inhibítory kinázy TIE-2, ktoré môžu byť antiangiogénne (najmä v kombinácii s jedným alebo viacerými inhibitormi VEGFR) alebo proangiogénne, keď sa používajú za prítomnosti alebo v spojení so stimulom súvisiacim s VEGF. Takýmto spôsobom možno také inhibítory použiť pri podpore terapeutickej angiogenézy na liečenie napríklad ischémie, infarktu alebo oklúzie alebo na podporu hojenia rán.

Predložený vynález poskytuje použitie zlúčeniny predstavovanej vzorcom I pre kinázu v koncentrácii dostatočnej na inhibíciu enzýmovej aktivity kinázy na prípravu lieku na inhibíciu kinázovej aktivity tyrozín kináz a serín/treonín kináz.

Predložený vynález ďalej zahŕňa použitie týchto zlúčenín vo farmaceutických kompozíciách s farmaceutický účinným množstvom vyššie opísaných zlúčenín a farmaceutický prijateľným nosičom alebo vehikulom. Tieto farmaceutické kompozície možno podávať jednotlivcom na spomalenie alebo zastavenie procesu angiogenézy pri chorobách podporovaných angiogenézou alebo na liečbu edému, efúzií, exsudátov alebo ascites a iných stavov spojených s vaskulárnou hyperpermeabilitou. Isté farmaceutické kompozície možno podávať jednotlivcom na liečbu rakoviny a hyperproliferatívnych porúch inhibíciou serín/treonín kináz ako cdk, Plk-1, erk atď.

Podrobný opis vynálezu

Hodnoty substituentov v prvej výhodnej skupiny zlúčenín vzorca I sú uvedené nižšie.

L je s výhodou -N(R)S(O)₂- -S(O)₂N(R)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -NH-, NR- alebo -O-.

R³ je s výhodou substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný alebo nesubstituovaný naftyl, substituovaný alebo nesubstituovaný pyridyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tienyl, substituovaný alebo nesubstituovaný r r

c. C nesubstituovaný pyrol, substituovaný alebo benzotriazol, substituovaný alebo nesubstituovaný tetrahydropyranyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tetrahydrofuranyl, substituovaný alebo nesubstituovaný dioxán, substituovaný alebo nesubstituovaný dioxolán, substituovaný alebo nesubstituovaný chinolín, substituovaný alebo nesubstituovaný tiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný izoxazol, substituovaný alebo nesubstituovaný cyklopentyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzofurán, substituovaný alebo nesubstituovaný benzotiofén, substituovaný alebo nesubstituovaný imidazol, substituovaný alebo substituovaný alebo nesubstituovaný pyrimidinyl, nesubstituovaný indolinyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzizoxazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzizotiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzotiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzoxazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzimidazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzoxadiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzotiadiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný izochinolinyl, substituovaný alebo nesubstituovaný chinoxalinyl, substituovaný alebo nesubstituovaný indol alebo substituovaný alebo nesubstituovaný pyrazol, substituovaný alebo nesubstituovaný fenoxy, substituovaný alebo nesubstituovaný pyridyloxy. V jednom uskutočnení je R³ substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl.

R³ môže byť substituované jedným alebo viacerými substituentmi. Výhodnými substituentmi pre R³ sú F, ČI, Br, I, CH3, NO2, OCF3, OCH3, CN, -CHO, CO2CH3, CF3i t-butyl, pyridyl, pyridyloxy, substituovaný alebo nesubstituovaný oxazolyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tiazolyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzénsulfonyl, substituovaný alebo nesubstituovaný fenoxy, substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný alebo nesubstituovaný amino, karboxyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tetrazolyl, styryl, -S(O)x-(substituovaný alebo nesubstituovaný aryl), -S(O)X kde x = 0, 1, 2-(substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl), substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, alkinyl, -C(O)NR^fR⁹, R^c a CH2OR^C.

r r ,A'_r.ď

R^f, R⁹ a dusíkový atóm spolu tvoria 3-, 4-, 5-, 6- alebo 7-členný substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl alebo substituovanú alebo nesubstituovanú heteroaromatickú skupinu.

Alternatívne sú R^f a R⁹ každé nezávisle -H, substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina alebo substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina.

R^c je vodík alebo substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, -W-(CH2)t-NR^dR^e, -W-(CH2)_t-O-alkyl, -W(CH₂)_t-S-alkyl, -W-(CH₂)_t-OH alebo-W-(CH₂),NH-C(O)R^f.

t je celé číslo od 0 do asi 6.

W je väzba alebo -0-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂- alebo -NR^k-.

R^k je -H alebo alkyl.

R^d, R^e a atóm dusíka, na ktorý sú napojené, spolu tvoria 3, 4, 5, 6 alebo 7členný substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl alebo substituovanú alebo nesubstituovanú heterobicyklickú skupinu.

Alternatívne sú R^d a R^e každé nezávisle -H, alkyl, alkanoyl alebo -K-D.

K je -S(O)₂-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)₂- alebo priama väzba.

D is substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný alebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaralkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaná alebo nesubstituovaná amínoskupina, substituovaný alebo nesubstituovaný aminoalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aminocykloalkyl, COOR¹ alebo substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl.

C 1'

C * «· · n

’’ r i

R' je substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina alebo substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina.

Výhodnejšími substituentmi pre R₃ sú F, Cl, Br, I, kyano, nitro, OCF₃, CH₃ a

CF₃.

I

Kruh A je s výhodou substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tienyl, substituovaný alebo nesubstituovaný naftyl, substituovaný alebo nesubstituovaný pyridyl alebo substituovaný alebo nesubstituovaný indol. V jednom uskutočnení je kruh A substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl.

Kruh A môže byť substituované jedným alebo viacerými substituentmi. Výhodnými substituentmi pre kruh A sú F, Cl, Br, I, CH₃, NO₂, OCF₃, OCH₃, CN, CO₂CH₃, CF₃, t-butyl, pyridyl, substituovaný alebo nesubstituovaný oxazolyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzénsulfonyl, substituovaný alebo nesubstituovaný fenoxy, substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl, substituovaná alebo nesubstituovaná amínoskupina, karboxyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tetrazolyl, styryl, -S-(substituovaný alebo nesubstituovaný aryl), -S-(substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl), substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, alkinyl, -C(O)NR^fR⁹, R^c a CH₂OR^C. R^f, R⁹ a R^c majú vyššie uvedený význam.

Kruh A je s väčšou výhodou substituovaný F, Cl a nitroskupinou.

R² je s výhodou vodík.

R¹ je s výhodou cyklopentyl alebo izopropyl.

V tu používanom význame aromatické skupiny zahŕňajú karbocyklické kruhy (napr. benzyl a cinamyl) a kondenzované polycyklické aromatické kruhy (napr. naftyl a 1,2,3,4-tetrahydronaftyl). Aryl v tu používanom význame znamená aromatickú skupinu.

Heteroaromatické skupiny v tu používanom význame zahŕňajú heteroaryly (napr. tíenyl, pyridyl, pyrazol, izoxazolyl, tiadiazolyl, oxadiazolyl, indazolyl, furány, pyroly, imidazoly, pyrazoly, triazoly, pyrimidíny, pyrazíny, tiazoly, izoxazoly, izotiazoly, tetrazoly alebo oxadiazoly) a heteroaryly, v ktorých je karbocyklický aromatický kruh, karbocyklický nearomatický kruh alebo heteroaryl nakondenzovaný na jeden alebo viacero ďalších heteroarylov (napr. benzo(b)tienyl, benzimidazol, benzoxazolyl, benzotiazolyl, benzotiadiazolyl, benzoxadiazolyl, indol, tetrahydroindol, azaindol, indazol, chinolín, imidazopyridín, purín, pyrolo[2,3djpyrimidín, pyrazolo[3,4-d]pyrimidín) a ich N-oxidy.

Aralkyl v tu používanom význame je aromatický substituent, ktorý je pripojený na zlúčeninu alifatickou skupinou s jednou až asi šiestimi atómami uhlíka.

Heteroaralkyl v tu používanom význame je heteroaromatický substituent, ktorý je pripojený na zlúčeninu alifatickou skupinou s jednou až asi šiestimi atómami uhlíka.

Heterocykloalkyl v tu používanom význame je nearomatický kruh, ktorý má 3 až 8 atómov a obsahuje aspoň jeden heteroatóm, napríklad dusík, kyslík alebo síru.

Acyl v tu používanom význame je -C(O)NR_XR_Z, -C(O)OR_X, -C(O)R_X, v ktorých R_x a R_z sú navzájom nezávisle -H, substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina alebo substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina.

V tu používanom význame medzi alifatické skupiny patria lineárne, rozvetvené alebo cyklické C_rC₈ uhľovodíky, ktoré sú úplne nasýtené, alebo ktoré obsahujú jednu alebo viac jednotiek nenasýtenosti. „Nižší alkyl“ je nasýtená alifatická skupina majúca 1 až 6 atómov uhlíka.

Zlúčeniny vzorca I môžu existovať ako soli s farmaceutický prijateľnými kyselinami. Predložený vynález také soli zahŕňa. Medzi príklady na také soli patria hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, metánsulfonáty, nitráty, maleáty, acetáty, citráty, fumaráty, tartaráty [napr. (+)-tartaráty, (-)-tartaráty alebo ich zmesi vrátane racemických zmesí], sukcináty, benzoáty a soli s aminokyselinami, napríklad s n e kyselinou glutámovou. Tieto soli možno pripraviť metódami známymi odborníkom v danej oblasti.

Isté zlúčeniny vzorca I, ktoré majú kyselinové substituenty, môžu existovať ako soli s farmaceutický prijateľnými bázami. Predložený vynález také soli zahŕňa. Medzi príklady takých Solí patria sodné soli, draselné soli, lyzínové soli a arginínové soli. Tieto soli možno pripraviť metódami známymi odborníkom v danej oblasti.

Isté zlúčeniny vzorca I a ich soli môžu existovať vo viac ako jednej kryštalickej forme a predložený vynález zahŕňa každú kryštalickú formu a ich zmesi.

Isté zlúčeniny vzorca I a ich soli môžu existovať aj vo forme solvátov, napríklad hydrátov, a predložený vynález zahŕňa každý solvát a ich zmesi.

Isté zlúčeniny vzorca I môžu obsahovať jedno alebo viacero chirálnych centier a existovať v rôznych opticky aktívnych formách. Keď zlúčeniny vzorca I obsahujú jedno chirálne centrum, tieto zlúčeniny existujú v dvoch enantiomérnych formách a predložený vynález zahŕňa enantioméry aj zmesi enantiomérov, napríklad racemické zmesi. Enantioméry možno rozdeliť spôsobmi známymi odborníkom, napríklad tvorbou diastereoizomérnych solí alebo komplexov, ktoré sa dajú oddeliť napríklad kryštalizáciou; vytvorením diastereoizomérnych derivátov, ktoré sa dajú oddeliť napríklad kryštalizáciou, plynovo-kvapalnou alebo kvapalnou chromatografiou; selektívnou reakciou jedného enantioméru s enantiomérovošpecifickým reagentom, napríklad enzymatickou esterifikáciou; alebo plynovokvapalinovou alebo kvapalinovou chromatografiou v chirálnom prostredí, napríklad na chirálnom nosiči, napríklad oxide kremičitom s naviazaným chirálnym ligandom alebo v prítomnosti chirálneho rozpúšťadla. Je zrejmé, že keď sa žiadaný enantiomér konvertuje na inú chemickú entitu jedným zo separačných postupov opísaných vyššie, je potrebný ďalší krok na uvoľnenie žiadanej enantiomérnej formy. Alternatívne možno špecifické enantioméry syntetizovať asymetrickou syntézou pomocou opticky aktívnych činidiel, substrátov, katalyzátorov alebo r r rozpúšťadiel, alebo konvertovaním jedného enantioméru na druhý asymetrickou transformáciou.

Keď zlúčenina vzorca I obsahuje viac ako jedno chirálne centrum, môže existovať v diastereomérnych formách. Páry diastereomérov možno rozdeliť metódami známymi odborníkom v oblasti, napríklad chromatografiou alebo kryštalizáciou a jednotlivé enantioméry v rámci každého páru možno oddeliť tak, ako je opísané vyššie. Predložený vynález zahŕňa každý diastereoizomér zlúčenín vzorca 1 a ich zmesi.

Isté zlúčeniny vzorca I môžu existovať v rôznych tautomérnych formách alebo ako rôzne geometrické izoméry a predložený vynález zahŕňa každý tautomér a/alebo geometrický izomér zlúčenín vzorca I a ich zmesi.

Isté zlúčeniny vzorca I môžu existovať v rôznych stabilných konformačných formách, ktoré môžu byť oddeliteľné. Torzná asymetria v dôsledku obmedzenej rotácie okolo asymetrickej jednoduchej väzby napríklad v dôsledku sférického bránenia alebo pnutia kruhu môže umožniť oddelenie rôznych konformérov. Predložený vynález zahŕňa každý konformačný izomér zlúčenín vzorca I a ich zmesi.

Isté zlúčeniny vzorca I môžu existovať v zwitteriónovej forme a predložený vynález zahŕňa každú zwitteriónovú formu zlúčenín vzorca I a ich zmesi.

Medzi výhodné zlúčeniny vzorca I patria nasledujúce: N1-(4-(4-amino-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2-(trifluórmetoxy)-1benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl)-2-chlór-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-2-fluór-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2-chlór-1benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl)-3-fluór-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-nitrofenyl)-1-benzénsulfónamid, N1e e <* r c c e r- c n · r ·' r r· r r a · f · ’ L · . ' (4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-3(trifluórmetyl)-l-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3

d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-4-chlór-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7 cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-2-kyano-1benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2 fluórfenyl)-2-nitro-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,6-difluór-1 -benzénsulfónamid, N1-(4-(4 amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl)-1benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2 fluórfenyl)-2,3,4-trifluór-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fIuórfenyl)-4-bróm-2-fIuór-1-benzénsulfónamid, N1-(4 (4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,5-difluór-1benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2 fluórfenyl)-3,4-difluór-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H pyrolo[2,3-d]pyrimiďin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2-bróm-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4 amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,6-dichlór-1benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2 fluórfenyl)-2,4,6-trichlór-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,4-dichlór-1 -benzénsulfónamid, N1-(4-(4 amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2-chlór-4-fluór-1benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2 fIuórfenyl)-2,4-difluór-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2-jód-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino 7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,3-dichlór-1benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2 fluórfenyl)-4-bróm-2,5-difluór-1 -benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl 7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2-chlór-4-kyano-1-benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2-chlór-6 metyl-1 -benzénsulfónamid, N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3

d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-3-chlór-2-metyl-1-benzénsulfónamid, N2-(4-(4-amino 7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-4,5-dibróm-2tiofénsulfónamid, N2-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2 r c e r * . r· ^r ς r r- r f C _r e Q r , , t. ľ- fIuórfenyl)-5-bróm-2-tiofénsulfónamid, N2-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-3-bróm-5-chlór-2-tiofénsulfónamid, N3-(4-(4-amino-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2₁3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,5-díchlór-3tiofénsulfónamid, N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2fluórfenyl)-2,1,3-benzotiadiazol-4-sulfónamid, N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,1,3-benzoxadiazol-4-sulfónamid, N4-(4(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-7-chlór-2,1,3benzoxadiazol-4-sulfónamid, N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-7-metyl-2,1,3-benzotiadiazol-4-sulfónamid, N4-(4-(4amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-5-metyl-2,1,3benzotiadiazol-4-sulfónamid, N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-5-chlór-2,1,3-benzotiadiazol-4-sulfónamid, N-(4-(4amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-(2nitrofenyl)metánsulfónamid, and N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,5-dibróm-3,6-difluór-1-benzénsulfónamid.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu majú antiangiogénne vlastnosti. Tieto antiangiogénne vlastnosti sú spôsobené aspoň čiastočne inhibíciou proteín tyrozín kináz esenciálnych pre angiogénne procesy. Z tohto dôvodu možno tieto zlúčeniny použiť ako účinné látky proti takým chorobným stavom ako artritída, ateroskleróza, restenóza, psoriáza, hemangiómy, angiogenéza myokardu, koronárne a cerebrálne kolaterály, ischemická angiogenéza končatín, ischémia/reperfúzia po úrazoch, hojenie rán, peptický vred, choroby súvisiace s organizmom Helicobacter, vírusovo indukované angiogénne poruchy, fraktúry, Crow-Fukasov syndróm (POEMS), preeklampsia, menometrorágia, mačací týfus, rubeóza, neovaskulárny glaukóm a retinopatie ako tie, ktoré sú spojené s diabetickou retinopatiou, retinopatiou nedonosených alebo s vekom súvisiacou makulárnou degeneráciou. Okrem toho niektoré z týchto zlúčenín možno použiť ako účinné látky proti tuhým nádorom, malígnych ascites, von Hippel Lindauovej chorobe, hematopoetickým rakovinám a hyperproliferatívnym chorobám ako hyperplázia štítnej žľazy (najmä Graveho choroba) a cystám (napríklad hypervaskularita ovariálnej stromy charakteristická pre syndróm polycystických ovárií (Stein-Leventhalov syndróm)) a polycystická obličková choroba.

e p r r e co r ŕ. t·, r C r n ' f..-c· r r r r s r- r· ; >' r

Ďalej možno niektoré z týchto zlúčenín použiť ako účinné látky proti popáleninám, chronickej chorobe pľúc, porážke, polypom, anafylaxii, chronickému a alergickému zápalu, precitlivenosti oneskoreného typu, syndrómu nadmernej stimulácie ovárií, cerebrálnemu edému spojenému s mozgovým nádorom, vysokou nadmorskou výškou, úrazom alebo hypoxiou indukovanému cerebrálnemu alebo pľúcnemu edému, očnému a makulárnemu edému, ascites, glomerulonefritíde a iným chorobám, kde prejavom choroby je vaskulárna hyperpermeabilita, efúzie, exsudáty, extravazácia proteínov alebo edém. Tieto zlúčeniny budú užitočné aj pri liečbe chorôb, pri ktorých extravazácia proteínov vedie k ukladaniu fibrínu a extracelulárnej matrix, čo podporuje stromálnu proliferáciu (napr. keloid, fibróza, cirhóza a syndróm karpálneho kanála). Zvýšená produkcia VEGF potencuje zápalové procesy, napríklad posilňovanie a aktiváciu monocytov. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu budú užitočné aj pri liečbe zápalových porúch, napríklad zápalová črevná choroba (IBD) a Crohnova choroba.

VEGF sú jedinečné v tom, že sú jedinými angiogénnymi Rastovými faktormi, o ktorých je známe, že prispievajú k vaskulárnej hyperpermeabilite a tvorbe edému. Skutočne sa zdá, že vaskulárna hyperpermeabilita a edém, ktoré sú spojené s expresiou alebo podávaním mnohých iných rastových faktorov, sú sprostredkované cez produkciu VEGF. Zápalové cytokíny stimulujú produkciu VEGF. Hypoxia vedie k výraznej regulácii VEGF nahor v početných tkanivách, preto situácie zahŕňajúce infarkt, oklúziu, ischémiu, anémiu alebo narušenie obehového systému typicky vyvolávajú odozvy, ktoré sprostredkuje VEGF/VPF. Vaskulárna hyperpermeabilita, asociovaný edém, zmenená transendotelová výmena a makromolekulárna extravazácia, ktorá je často sprevádzaná diapedézou, môže viesť k nadmernému deponovaniu matrix, aberantnej stromálnej proliferácii, fibróze atď. Preto hyperpermeabilita, ktorú sprostredkuje VEGF, môže významne prispieť k poruchám s týmito etiologickými črtami.

Pretože implantácia blastocysty, rozvoj placenty a embryogenéza sú závislé od angiogenézy, isté zlúčeniny podľa vynálezu sú užitočné ako antikoncepčné prostriedky a prostriedky proti plodnosti.

e · r · • · · r » c e c c r o o

C C c c cr

Predpokladá sa, že vyššie uvedené poruchy sú sprostredkované do značnej miery proteín tyrozín kinázovou aktivitou zahŕňajúcou KDR/VEGFR-2 a/alebo Flt1/VEGFR-1 a/alebo TIE-2 tyrozín kinázy. Inhibíciou aktivity týchto tyrozín kináz sa inhibuje progresia týchto porúch, pretože komponent angiogénnosti alebo vaskulárnej hyperpermeability chorobného stavu je značne obmedzený. Pôsobenie istých zlúčenín podľa tohto vynálezu vzhľadom na ich selektivitu pre špecifické tyrozín kinázy vedie k minimalizácii vedľajších účinkov, ku ktorým by došlo, keby sa použili menej selektívne inhibítory tyrozín kinázy. Isté zlúčeniny podľa vynálezu sú aj účinnými inhibítormi FGFR, PDGFR, c-Met a IGF-1-R. Tieto receptorové kinázy môžu priamo alebo nepriamo potencovať angiogénne a hyperproliferatívne odozvy pri rôznych poruchách, preto ich inhibícia môže brániť progresii choroby.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu majú inhibičnú aktivitu proti proteín kinázam. To znamená, že tieto zlúčeniny modulujú prenos signálu proteín kinázami. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu inhibujú proteín kinázy zo serín/treonínových a tyrozín kinázových tried. Tieto zlúčeniny konkrétne selektívne inhibujú aktivitu tyrozín kináz KDR/FLK-1/VEGFR-2. Isté zlúčeniny podľa tohto vynálezu inhibujú aj aktivitu ďalších tyrozín kináz ako kinázy podrodín Flt-1/VEGFR-1, Tie-2, FGFR; PDGFR, IGF-1R, c-Met, Src, ako sú Lck, Src, fyn, yes atď. Okrem toho niektoré zlúčeniny podľa tohto vynálezu významne inhibujú serín/treonín kinázy ako PKC, MAP kinázy, erk, CDKs, Plk-1 alebo Raf-1, ktoré hrajú podstatnú úlohu v proliferácii buniek a progresii bunkového cyklu. Potencia a špecificita generických zlúčenín podľa tohto vynálezu voči konkrétnej proteín kináze sa môže často zmeniť a optimalizovať rôznymi obmenami v povahe, počte a usporiadaní substituentov (t.j., R¹, R², R³, A a kruhu 1) a konformačnými obmedzeniami. Okrem toho metabolity istých zlúčenín môžu tiež mať významnú aktivitu inhibície proteín kináz.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu pri podaní jednotlivcom s potrebou takých zlúčenín inhibujú vaskulárnu hyperpermeabilitu a tvorbu edému u týchto jednotlivcov. Tieto zlúčeniny pôsobia, ako sa predpokladá, inhibíciou aktivity KDR tyrozín kinázy, ktorá je zapojená do procesu vaskulárnej hyperpermeability a tvorby edému. KDR tyrozín kináza sa môže označovať aj ako FLK-1 tyrozín kináza, NYK tyrozín kináza alebo VEGFR-2 tyrozín kináza. KDR tyrozín kináza sa aktivuje, keď

Γ r f C C C r . r e Γ Γ Γ G C ²⁹ 'T. ^{Γ ;} sa vaskulárny endotelový rastový faktor (VEGF) alebo iný aktivačný ligand (ako je VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E alebo HIV Tatov proteín) viaže na receptor KDR tyrozín kinázy, ktorý leží na povrchu vaskulárnych endotelových buniek. Po takej aktivácii KDR tyrozín kinázy dochádza k hyperpermeabilite ciev a tekutina sa dostáva z krvného riečiska cez steny ciev do intersticiálnych priestorov, čím sa tvorí oblasť edému. Túto odozvu často sprevádza diapedéza. Podobne aj nadbytočná vaskulárna hyperpermeabilita môže narušiť normálnu molekulovú výmenu cez endotel v kriticky dôležitých tkanivách a orgánoch (napr. pľúca a obličky), čím spôsobí makromolekulárnu extravazáciu a deponovanie. Po tejto akútnej odozve na simuláciu KDR, o ktorej sa predpokladá, že uľahčuje následný angiogénny proces, predĺžená stimuláciu KDR tyrozín kinázy vedie k proliferácii a chemotaxe vaskulárnych endotelových buniek a tvorbe nových ciev. Inhibíciou aktivity KDR tyrozín kinázy buď blokovaním produkcie aktivujúceho ligandu, blokovaním viazania aktivujúceho ligandu na KDR tyrozín kinázový receptor, zabránením dimerizácie a transfosforylácie receptora, inhibíciou enzýmovej aktivity KDR tyrozín kinázy (inhibíciou fosforylačnej funkcie enzýmu) alebo nejakým iným mechanizmom, ktorý prerušuje jej signalizáciu (D. Mukhopedhyay et al., Cancer Res. 58:1278-1284 (1998) a tam citované odkazy), možno inhibovať a minimalizovať hyperpermeabilitu ako aj s ňou spojenú extravazáciu, následnú tvorbu edému a ukladanie matrix, a angiogénne odozvy.

Jedna skupina výhodných zlúčenín podľa tohto vynálezu má vlastnosť inhibície KDR tyrozín kinázovej aktivity bez signifikantnej inhibície Flt-1 tyrozín kinázovej aktivity (Flt-1 tyrozín kináza sa označuje aj ako VEGFR-1 tyrozín kináza). KDR tyrozín kináza aj Flt-1 tyrozín kináza sú aktivované viazaním VEGF na KDR tyrozín kinázové receptory, respektíve na Flt-1 tyrozín kinázové receptory. Isté výhodné zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú jedinečné, pretože inhibujú aktivitu jednej VEGF receptorovej tyrozín kinázy (KDR), ktorá je aktivovaná aktivujúcimi ligandami, ale neinhibuje iné receptorové tyrozín kinázy, ako je Flt-1, ktoré sú tiež aktivované istými aktivujúcimi ligandami. Takýmto spôsobom sú isté výhodné zlúčeniny podľa tohto vynálezu preto selektívne vo svojej inhibičnej aktivite tyrozín kinázy.

Vynález sa ďalej týka použitia zlúčenín vzorca I na prípravu lieku na inhibíciu proteínkinázovej aktivity.

„Proteín kinázou sprostredkovaný stav“ je zdravotný stav, napríklad choroba alebo iný nežiaduci fyzický stav, genéza alebo progresia ktorého závisí aspoň čiastočne od aktivity aspoň jednej proteín kinázy. Proteín kináza môže byť napríklad proteín tyrozín kináza alebo proteín serín/treonín kináza.

Liečeným pacientom môže byť akýkoľvek živočích a s výhodou ide o cicavca, napríklad domáce zviera alebo dobytok. S väčšou výhodou je pacientom človek.

„Terapeuticky účinné množstvo“ je množstvo zlúčeniny vzorca I alebo kombinácie dvoch alebo viacerých takých zlúčenín, ktoré inhibuje, úplne alebo čiastočne, progresiu stavu alebo aspoň čiastočne zmierňuje jeden alebo viacero symptómov stavu. Terapeuticky účinným množstvom môže byť aj množstvo, ktoré je profylaktický účinné. Množstvo, ktoré je terapeuticky účinné, bude závisieť od veľkosti a pohlavia pacienta, liečeného stavu, závažnosti stavu a želaného výsledku. Pre daného pacienta možno terapeuticky účinné množstvo určiť spôsobmi známymi odborníkom.

Použitie podľa predloženého vynálezu je užitočné na prípravu lieku na liečenie proteín kinázou sprostredkovaných stavov, napríklad ktoréhokoľvek zo stavov opísaných vyššie. V jednom uskutočnení je protéín kinázou sprostredkovaný stav charakterizovaný nežiaducou angiogenézou, edémom alebo stromálnou depozíciou. Stavom môže byť jeden alebo viacero vredov, napríklad vredy spôsobené bakteriálnymi alebo hubovými infekciami, Morrenove vredy a vredová kolitída. Stav môže byť spôsobený aj mikrobiálnou infekciou, napríklad Lymeho choroba, sepsa, septický šok alebo infekcie spôsobené Herpes simplex, Herpes Zoster, vírusom ľudskej imunitnej nedostatočnosti, protozoa, toxoplasmóza alebo parapoxvírus; angiogénne choroby, napríklad von Hippel Lindauova choroba, choroba polycystických obličiek, pemfigoid, Pagetova choroba a psoriáza; reprodukčná choroba, napríklad endometrióza, syndróm nadmernej stimulácie ovárií, preeklampsia alebo menometrorágia; fibrotický a edemický stav, napríklad sarkozidóza, fibróza, cirhóza, tyroiditída, syndróm systémovej hyperviskozity, Osler-Weber-Renduova choroba, chronická okluzívna pulmonárna choroba, astma a edém nasledujúci po popáleninách, trauma, ožiarenie, mŕtvica, hypoxia alebo ischémia; alebo zápalový/imunologický stav, napríklad systémový lupus, chronický zápal, glomerulonefritída, synovitída, zápalová črevná choroba, Crohnova choroba, reumatoidná artritída, osteoartritída, roztrúsená skleróza a odmietanie štepu. Medzi vhodné proteín kinázou sprostredkované stavy patrí aj kosáčikovitá anémia, osteoporóza, nádorom indukovaná hyperkalcémia a kostné metastázy. Ďalšie proteín kinázou sprostredkované stavy zahŕňajú očné stavy ako očný a makulárny edém, okulárna neovaskulárna choroba, skleritída, radiálna keratotómia, uveitída, vitritis, myopia, exkavácia papily, chronické odlúčenie sietnice, post-laserové komplikácie, konjunktivitída, Stargardtova choroba a Ealesova choroba popri retinopatii a makulárnej degenerácii.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú užitočné na prípravu lieku na liečenie kardiovaskulárnych chorôb ako ateroskleróza, restenóza, vaskulárna oklúzia a choroba obštrukcie karotídy.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú užitočné aj na prípravu lieku na liečenie indikácií súvisiacich s rakovinou, ako sú tuhé nádory, sarkómy (najmä Ewingov sarkóm a osteosarkóm), retinoblastóm, rabdomyosarkómy, neuroblastóm, hematopoetické malígne ochorenia vrátane leukémie a lymfómu, nádorom indukované pleurálne alebo perikardiálne efúzie a malígny ascites.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú užitočné aj na prípravu lieku na liečenie Crow-Fukasovho syndrómu (POEMS) a diabetických stavov ako glaukóm, diabetická retinopatia a mikroangiopatia.

Rodiny kináz Src, Tec, Jak, Map, Csk, NFkB a Syk hrajú ústrednú úlohu v regulácii imunitnej funkcie. Do rodiny Src momentálne patrí Fyn, Lck, Fgr, Fes, Lyn, Src, Yrk, Fyk, Yes, Hck a Blk. Rodina Syk sa momentálne chápe ako zahŕňajúca len Zap a Syk. Rodina TEC zahŕňa Tec, Btk, Rlk a Itk. Janusova rodina kináz je zapojená do prenosu rastového faktoru a pro-zápalových cytokínových signálov cez niekoľko receptorov. Hoci BTK a ITK, členovia rodiny kináz Tec, hrajú menej dobre chápanú úlohu v imunobiológii, ich modulácia inhibítorom sa môže ukázať terapeuticky prospešná. Rodina Csk sa momentálne chápe ako zahŕňajúca len Csk a Chk. Kinázy RIP, IRAK-1, IRAK-2, NIK, p38 MAP kinázy, Jnk, IKK-1 a IKK-2 sú zapojené do signalizačných prenosových dráh pre kľúčové, zápal podporujúce cytokíny, ako je TNF a IL-1. Vzhľadom na svoju schopnosť inhibovať jednu alebo viacero z týchto kináz, zlúčeniny vzorca I môžu fungovať ako imunomodulačné prostriedky užitočné na udržiavanie aloimplantátov, na prípravu lieku na liečenie autoimunitných chorôb, sepsy a septického šoku. Prostredníctvom svojej schopnosti regulovať migráciu alebo aktiváciu lymfocytov T, lymfocytov B, heparinocytov, monocytov a neutrofilov by sa mohli tieto zlúčeniny používať na na prípravu lieku na liečenie takých autoimunitných chorôb a sepsy. Prevencia odmietania transplantátu, buď hostiteľ verzus implantát pre pevné orgány alebo implantát verzus hostiteľ pre kostnú dreň, je obmedzená toxicitou aktuálne dostupných imunosupresívnych prostriedkov a účinné liečivo so zlepšeným terapeutickým indexom by bolo prínosom. Experimenty zameriavajúce sa na gény ukázali podstatnú úlohu Src v biológii osteoklastov, buniek zodpovedných za resorpciu kostí. Zlúčeniny vzorca I prostredníctvom svojej schopnosti regulovať Src môžu byť užitočné aj na prípravu lieku na liečenie osteoporózy, Pagetovej choroby, nádorom indukovanej hyperkalcémii a kostných metastáz.

Ukázalo sa, že niekoľko proteín kináz je protoonkogénnych. Štiepenie chromozómu (na bode štiepenia Itk kinázy na chromozóme 5), translokácia ako v prípade génu Abl s BCR (filadelfský chromozóm), skrátenie v prípadoch ako c-Kit alebo EGFR, alebo mutácia (napr. Met) vedú k tvorbe dysregulovaných proteínov konvertujúc ich z protoonkogénnych na onkogénne produkty. V iných nádoroch sú hnacou silou onkogenézy interakcie receptorov pre autokrinný alebo parakrinný ligand/rastový faktor. Členovia rodiny kináz src sú typicky zapojení do prenosu signálu, čím potencujú onkogenézu a môžu sa sami stať onkogénmi nadmernou expresiou alebo mutáciou. Inhibíciou proteín kinázovej aktivity týchto proteínov možno narušiť proces choroby. Vaskulárna restenóza môže zahŕňať FGF a/alebo PDGF - podporovanú proliferáciu buniek hladkej svaloviny a endotelu. Ligandová f' r r r c r - - r - r r r • r r r r.'* r ( c λ f ; - c ' ^c y stimulácia FGFR, PDGFR, IGF1-R a c-Met in vivo je proangiogénna a potencuje choroby závislé od angiogenézy. Inhibícia aktivít kináz FGFr, PDGFr, c-Met alebo IGF1-R individuálne alebo v kombinácii môže byť účinnou stratégiou inhibície týchto javov. Zlúčeniny vzorca I, ktoré inhibujú kinázovú aktivitu normálnych alebo aberantných c-kit, c-met, c-fms, členov rodiny src, EGFr, erbB2, erbB4, BCR-Abl, PDGFr, FGFr, IGF1-R a iných receptorových alebo cytosolických tyrozín kináz, môžu byť hodnotné pri liečbe benígnych a neoplastických proliferatívnych chorôb.

V mnohých patologických stavoch (napríklad tuhé primárne nádory a metastázy, 'Kaposiho sarkóm, reumatoidná artritída, slepota v dôsledku neadekvátnej okulárnej neovaskularizácie, psoriáza a ateroskleróza) závisí postup choroby od pretrvávajúcej angiogenézy. Polypeptidové rastové faktory často produkované chorým tkanivom alebo príslušnými zápalovými bunkami a ich zodpovedajúce receptorové tyrozín kinázy špecifické pre endotelové bunky (napr. KDR/VEGFR-2, Flt-1/VEGFR-1, Tie-2/Tek a Tie) sú podstatné pre stimuláciu rastu endotelových buniek, ich migráciu, organizáciu, diferenciáciu a zakladanie potrebnej novej funkčnej vaskulatúry. V dôsledku aktivity faktora vaskulárnej permeability vo VEGF pri sprostredkovaní vaskulárnej hyperpermeability sa tiež predpokladá, že VEGF stimulácia VEGFR kinázy hrá dôležitú úlohu v tvorbe nádorového ascites, cerebrálneho a pulmonárneho edému, pleurálnych a perikardiálnych efúzií, reakcií precitlivenosti oneskoreného typu, edémov tkanív a dysfunkcie orgánov po traume, spáleninách, ischémii, diabetických komplikáciách, endometrióze, syndróme respiračnej poruchy dospelých (ARDS - adult respirátory distress syndróme), post-kardiopulmonárnej hypotenzii a hyperpermeability súvisiacej s bypassom a okulárnom edéme vedúcom ku glaukómu alebo slepote v ¹ í dôsledku neadekvátnej neovaskularizácie. Popri VEGF môžu nedávne identifikované VEGF-C a VEGF-D a virálne kódované VEGF-E alebo HIV-Tat proteíny tiež spôsobovať odozvu vaskulárnej hyperpermeability prostredníctvom stimulácie VEGFR kinázy. KDR/VEGFR-2 a/alebo Tie-2 sa exprimujú aj vo vybranej populácii hematopoetických kmeňových buniek. Istí členovia tejto populácie sú pluripotentné svojou povahou a možno ich stimulovať rastovými faktormi, aby sa diferencovali na endotelové bunky a zúčastnili sa na vaskulogenetických angiogénnych procesoch. Z tohto dôvodu boli nazvané endotelovými progenitorovými bunkami (EPC) (J. Clin. Investig. 103 : 1231-1236 (1999)). V niektorých progenitoroch môže hrať úlohu Tie-2 v ich posilňovaní, adhézii, regulácii a diferenciácii (Blood , 4317-4326 (1997)). Niektoré látky podľa vzorca I schopné blokovať kinázovú aktivitu kináz špecifických pre endotelové bunky by preto mohli inhibovať progresiu choroby zahŕňajúcej tieto situácie.

Predpokladá sa, že vaskulárna destabilizácia antagonistického ligandu Tie2 (Ang2) indukuje nestabilný „plastický“ stav v endoteli. Za prítomnosti vysokých hladín VEGF sa môže vyskytnúť silná angiogénna odozva; avšak za neprítomnosti VEGF alebo s VEGF súvisiaceho stimulu, môže dôjsť ku klinicky jasnej regresii ciev a endotelovej apoptóze (Genes and Devel. 13: 1055-1066 (1999)). Analogicky, inhibitor kinázy Tie-2 môže byť propangiogénny alebo antiangiogénny za prítomnosti respektíve neprítomnosti stimulu súvisiaceho s VEGF. Inhibítory Tie-2 sa môžu preto použiť s vhodnými proangiogénnymi stimulmi, napríklad VEGF, aby sa podporila terapeutická angiogenéza v situáciách ako je hojenie rán, infarkt a ischémia.

Zlúčeniny vzorca l alebo ich soli alebo farmaceutické kompozície obsahujúce ich terapeuticky _túčinné množstvo možno použiť na prípravu lieku na liečenie stavov sprostredkovaných proteín kinázou, napríklad benígne a neoplastické proliferatívne choroby a poruchy imunitného systému, ako je opísané vyššie. Medzi také choroby napríklad patria autoimunitné choroby, napríklad reumatoidná artritída, tyroitída, diabetes typu 1, roztrúsená skleróza, sarkoidóza, zápalová črevná choroba, Crohnova choroba, myasthenia gravis a systémový lupus erythematosus; psoriáza, odmietanie transplantovaného orgánu (napr. odmietnutie obličky, choroba štep verzus hostiteľ), benígne a neoplastické proliferatívne choroby, ľudské rakoviny ako rakovina pľúc, prsníka, žalúdka, močového mechúra, hrubého čreva, pankreasu, vaječníkov, prostaty a rekta a hematopoetícké malígne nádory (leukémia a lymfóm), a choroby zahŕňajúce neadekvátnu vaskularizáciu, napríklad diabetická retinopatia, retinopatia nedonosených, choroidná neovaskularizácia v dôsledku makulárnej degenerácie súvisiacej s vekom a infantilné hemangiómy u človeka. Okrem toho môžu byť také ingibítory užitočné aj na prípravu lieku na liečenie porúch zahŕňajúcich edém sprostredkovaný cez VEGF, ascites, efúzie a exsudáty vrátane napríklad makulárneho edému, cerebrálneho edému, akútneho zranenia pľúc a syndrómu respiračnej poruchy dospelých (ARDS).

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu môžu byť užitočné aj pri profylaxii vyššie uvedených chorôb.

Predpokladá sa, že vyššie uvedené poruchy sú sprostredkované do značnej miery proteín tyrozín kinázovou aktivitou zahŕňajúcou VEGF receptory (napr. KDR, Flt-1 a/alebo Tie-2). Inhibíciou aktivity týchto receptorových tyrozín kináz sa inhibuje progresia uvedených porúch, pretože komponent angiogénnosti chorobného stavu je značne obmedzený. Pôsobenie zlúčenín podľa tohto vynálezu vzhľadom na ich selektivitu pre špecifické tyrozín kinázy vedie k minimalizácii vedľajších účinkov, ku ktorým by došlo, keby sa použili menej selektívne inhibítory tyrozín kinázy.

Podľa ďalšieho aspektu predložený vynález poskytuje zlúčeniny vzorca I s vyššie uvedeným významom na použitie ako liečivá, najmä ako inhibítory proteín kinázovej aktivity, napríklad tyrozín kinázovej aktivity, serín kinázovej aktivity a treonín kinázovej aktivity. Podľa ďalšieho vynálezu predložený vynález poskytuje použitie zlúčenín vzorca I s vyššie uvedeným významom na prípravu liečiva na použitie pri inhibícii proteín kinázovej aktivity.

V tejto prihláške platia nasledujúce definície:

„Fyziologicky prijateľné soli“ sú tie soli, ktoré si zachovávajú biologickú účinnosť a vlastnosti voľných báz a ktoré sa získavajú reakciou s anorganickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná alebo organické kyseliny ako kyselina arylsulfónová, karboxylová kyselina, organická kyselina fosforečná, kyselina metánsulfónová, kyselina etánsulfónová, kyselina p-tolué nsulfónová, kyselina salicylová, kyselina mliečna, kyselina vínna, kyselina maleínová a podobne.

„Alkyl“ znamená nasýtený alifatický uhľovodík vrátane lineárnych a rozvetvených skupín s 1 až 6 uhlíkmi alebo cyklické uhľovodíky s 3 až 6 uhlíkmi.

• e c r • e • R r r r r o r r c· r r r r <· r r r f r' „Alkoxy“ znamená skupinu O-alkyl, kde alkyl má vyššie uvedený význam.

Farmaceutické formulácie

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu možno podávať humánnemu pacientovi samotné alebo vo farmaceutických kompozíciách, kde sa miešajú s vhodnými nosičmi alebo vehikulami v dávkach, ktoré liečia alebo zmierňujú vaskulárnu hyperpermeabilitu, edém a pridružené poruchy. Zmesi týchto zlúčenín možno podávať pacientovi aj ako jednoduché zmesi alebo vo vhodne formulovaných farmaceutických kompozíciách. Terapeuticky účinná dávka je také množstvo zlúčeniny alebo zlúčenín, ktoré je dostatočné na zabránenie alebo zmiernenie neadekvátnej neovaskularizácie, progresie hyperproliferatívnych chorôb, edému, hyperpermeability spojenej s VEGF a/alebo hypotenzie súvisiacej s VEGF. Techniky formulácie a podávania zlúčenín podľa predloženej prihlášky možno nájsť v publikácii „Remington's Pharmaceutical Sciences“, Mack Publishing Co., Easton, PA, najnovšie vydanie.

Cesty podania

Vhodnými cestami podania môže byť napríklad orálne, podanie očnými kvapkami, rektálne, transmukozálne, lokálne alebo intestinálne podanie; parenterálne podávanie vrátane intramuskulárneho, subkutánneho, intramedulárnych injekcií ako aj intratekálne, priame intraventrikulárne, intravenózne, intraperitoneálne, intranazálne alebo intraokulárne injekcie.

Alternatívne možno zlúčeninu podávať lokálne namiesto systémovo, napríklad injekciou zlúčeniny priamo do edematózneho miesta, často vo formulácii s depozíciou alebo stálym uvoľňovaním.

Liečivo možno navyše podávať systémom cieleného podania lieku, napríklad v lipozóme obalenom protilátkou špecifickou pre endotelové bunky.

Kompozícia a formulácia

Farmaceutické kompozície podľa predloženého vynálezu možno vyrábať známym spôsobom, napr. pomocou konvenčného miešania, rozpúšťania, granulovania, výroby dražé, drvenia, emulgovania, okludovania alebo lyofilizačnými procesmi.

r π • o r r p

r. r e r.

Farmaceutické kompozície na použitie podľa predloženého vynálezu možno teda formulovať konvenčným spôsobom pomocou jedného alebo viacerých fyziologicky prijateľných nosičov obsahujúcich vehikulá a pomocné látky, ktoré uľahčujú spracovanie aktívnych zlúčenín na prípravky, ktoré možno použiť farmaceutický. Adekvátna formulácia závisí od zvolenej cesty podania.

Na injekciu možno látky podľa vynálezu formulovať vo vodných roztokoch, s výhodou vo fyziologicky kompatibilných tlmivých roztokoch ako je Hankov roztok, Ringerov roztok alebo fyziologický tlmivý roztok. Na transmukozálne podanie sa vo formulácii používajú penetranty vhodné pre príslušnú bariéru. Také penetranty sú všeobecne známe v danej oblasti techniky.

Na orálne podanie možno zlúčeniny formulovať jednoducho kombináciou účinných zlúčenín s farmaceutický prijateľnými nosičmi známymi v danej oblasti techniky. Také nosiče umožňujú formulovať zlúčeniny podľa vynálezu ako tablety, pilulky, dražé, kapsule, kvapaliny, gély, sirupy, suspenzie a podobne na orálne požitie liečeným pacientom. Farmaceutické prípravky na orálne použitie možno získať kombináciou aktívnej zlúčeniny s tuhým vehikulom, voliteľne pomletím získanej zmesi a spracovaním zmesi granúl po pridaní vhodných pomocných látok v prípade potreby, aby sa získali tablety alebo jadrá dražé. Vhodnými vehikulami sú najmä plnivá ako cukry vrátane laktózy, sacharózy, manitolu alebo sorbitolu; celulózové prípravky ako napríklad kukuričný škrob, pšeničný škrob, ryžový škrob, zemiakový škrob, želatína, tragant, metylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, nátrium karboxymetylcelulóza a/alebo polyvinylpyrolidón (PVP). V prípade potreby možno pridať dezintegrátory, ako je zosieťovaný polyvinylpyrolidón, agar alebo kyselina algínová alebo jej soľ, napríklad alginát sodný.

Jadrá dražé sa obaľujú vhodnými povlakmi. Na tento účel možno použiť koncentrované roztoky cukru, ktoré môžu voliteľne obsahovať arabskú gumu, mastenec, polyvinylpyrolidón, karbopolový gél, polyetylénglykol a/alebo oxid titaničitý, roztoky laku a vhodné organické rozpúšťadlá alebo zmesi rozpúšťadiel. Do povlakov tabliet alebo dražé možno pridať farbivá alebo pigmenty kvôli identifikácii alebo na charakterizáciu rôznych kombinácií dávok účinných zlúčenín.

Γ 1* e c r p r e r r r r38 ' i

Medzi farmaceutické prípravky, ktoré možno použiť orálne, patria dvojdielne kapsule vyrobené z želatíny ako aj mäkké zlepené kapsule vyrobené zo želatíny a plastikátora, napríklad glycerolu alebo sorbitolu. Dvojdielne kapsuly môžu obsahovať účinné zložky v zmesi s plnivom, napríklad laktózou, spojivami ako škroby a/alebo mazadlami ako mastenec alebo stearan horečnatý a voliteľne stabilizátormi. V mäkkých kapsulách môžu byť účinné zlúčeniny rozpustené alebo suspendované vo vhodných kvapalinách, napríklad v mastných olejoch, kvapalnom parafíne alebo v kvapalných polyetylénglykoloch. Okrem toho možno pridať stabilizátory. Všetky formulácie pre orálne podanie by mali byť v dávkach vhodných na také podávanie.

Na bukálne podanie môžu mať kompozície formu tabliet alebo pastiliek formulovaných konvenčným spôsobom.

Na podanie inhaláciou sa zlúčeniny na použitie podľa predloženého vynálezu výhodne podávajú vo forme aerosólového spreja z tlakových obalov alebo nebulizéra s použitím vhodného vytláčacieho média, napr. dichlórdifluórmetánu, trichlórfluórmetánu, dichlórtetrafluóretánu, oxidu uhličitého alebo iného vhodného plynu. V prípade tlakového aerosólu možno jednotku dávky určiť zabezpečením ventilu na podávanie odmeranej dávky. Kapsule a zásobníky napr. zo želatíny na použitie v inhalátore alebo insuflátore možno formulovať s obsahom práškovej zmesi zlúčeniny a vhodnej práškovej bázy, napríklad laktózy alebo škrobu.

Zlúčeniny môžu byť formulované pre parenterálne podanie injekciou, napr. injekciou bolusu alebo kontinuálnou infúziou. Formulácie pre injekciu môžu byť vo jednotkovej liekovej forme, napr. v ampulkách, alebo vo viacdávkových zásobníkoch s prídavkom konzervačnej látky. Kompozície môžu mať formy ako suspenzie, roztoky alebo emulzie v olejovitých alebo vodných vehikulách a môžu obsahovať formulačné činidlá ako suspenzačné, stabilizačné a/alebo dispergačné činidlá.

Farmaceutické formulácie pre parenterálne podanie zahŕňajú vodné roztoky účinných zlúčenín vo forme rozpustnej vo vode. Okrem toho možno suspenzie c p r f r <· r r účinných zlúčenín pripraviť ako vhodné olejovité injekčné suspenzie. Medzi vhodné lipofilné rozpúšťadlá alebo vehikulá patria mastné oleje, napr. sezamový olej, alebo syntetické estery mastných kyselín, napr. etyloleát alebo triglyceridy, alebo lipozómy. Vodné injekčné suspenzie môžu obsahovať látky, ktoré zvyšujú viskozitu suspenzie, napríklad nátrium karboxymetylcelulózu, sorbitol alebo dextrán. Voliteľne môže suspenzia obsahovať aj vhodné stabilizátory alebo činidlá, ktoré zvyšujú rozpustnosť zlúčenín, aby sa umožnila príprava vysoko koncentrovaných roztokov.

Alternatívne môže byť účinná zložka v práškovej forme na konštitúciu s vhodným vehikulom, napr. sterilnou pyrogény neobsahujúcou vodou, pred použitím.

Zlúčeniny môžu byť formulované aj v rektálnych kompozíciách, napríklad supozitóriách alebo retenčných črevných nálevoch, napr. obsahujúcich konvenčné bázy supozitórií, ako je kakaové maslo alebo iné glyceridy.

Okrem skôr opísaných formulácií môžu byť zlúčeniny formulované aj ako deponované prípravky. Také dlhodobo pôsobiace formulácie možno podávať implantáciou (napr. subkutánne alebo intramuskulárne alebo intramuskulárnou injekciou). Takto možno zlúčeniny napríklad formulovať s vhodnými polymérnymi alebo hydrofóbnymi materiálmi (napríklad ako emulziu v prijateľnom oleji) alebo iónovýmenné živice, alebo ako slabo rozpustné deriváty, napríklad ako slabo rozpustnú soľ.

Príkladom farmaceutického nosiča pre hydrofóbne zlúčeniny podľa vynálezu je systém rozpúšťadiel obsahujúci benzylalkohol, nepolámu povrchovo aktívnu látku, s vodou miešateľný organický polymér a vodnú fázu. Systémom rozpúšťadiel môže byť systém rozpúšťadiel VPD. VPD je roztok 3 % hmotnosť/objem benzylalkoholu, 8 % hmotnosť/objem nepolárnej povrchovo aktívnej látky polysorbát 80 a 65 % hmotnosť/objem polyetylénglykolu 300, doplnené na potrebný objem absolútnym etanolom. Systém rozpúšťadiel VPD (VPD:5W) pozostáva z VPD riedeného 1:1 5 % dextrózou vo vodnom roztoku. Tento systém rozpúšťadiel rozpúšťa aj hydrofóbne zlúčeniny a sám má nízku toxicitu pri r r r r· • e o r r r r.

ŕ r r f O » ^{r r} c n r c ' r r ' · .....

systémovom podávaní. Pomery systému rozpúšťadiel sa môžu prirodzene značne líšiť bez narušenia charakteristík rozpustnosti a toxicity. Navyše sa môže meniť aj totožnosť komponentov systému rozpúšťadiel: namiesto polysorbátu 80 možno napríklad použiť iné nízkotoxické nepoláme povrchovo aktívne látky; trakčná veľkosť polyetylénglykolu sa môže meniť; polyetylénglykol môžu nahradiť iné biologicky kompatibilné polyméry, napr. polyvinylpyrolidón; a náhradou dextrózy môžu byť iné cukry alebo polysacharidy.

Alternatívne možno použiť aj iné systémy dodávania pre hydrofóbne farmaceutické zlúčeniny. Lipozómy a emulzie sú známymi príkladmi podávacích vehikúl alebo nosičov pre hydrofóbne liečivá. Možno použiť aj isté organické rozpúšťadlá, napríklad dimetylsulfoxid, hoci za cenu vyššej toxicity. Okrem toho možno zlúčeniny dodávať pomocou systémov stáleho uvoľňovania, napríklad polopriepustné základy z tuhých hydrofóbnych polymérov obsahujúce terapeutický prostriedok. Sú zavedené rôzne materiály s trvalým uvoľňovaním a sú známe odborníkom v danej oblasti. Kapsule so stálym uvoľňovaním, v závislosti od svojej chemickej povahy, môžu uvoľňovať zlúčeniny niekoľko týždňov až do vyše 100 dní. V závislosti od chemickej povahy a biologickej stability terapeutického činidla možno použiť ďalšie stratégie na stabilizáciu proteínov.

Farmaceutické kompozície môžu obsahovať aj vhodné tuhé alebo gélové nosiče alebo vehikulá. Medzi príklady takých nosičov alebo vehikúl patria okrem iných uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, rôzne cukry, škroby, deriváty celulózy, želatína a polyméry ako polyetylénglykoly.

Mnoho zlúčenín podľa vynálezu možno podávať ako soli s farmaceutický kompatibilnými kontraiónmi. Farmaceutický kompatibilné soli môžu byť tvorené s mnohými kyselinami vrátane okrem iných kyseliny chlorovodíkovej, sírovej, octovej, mliečnej, vínnej, jablčnej, jantárovej atď. Soli majú tendenciu k vyššej rozpustnosti vo vodných alebo iných protických rozpúšťadlách v porovnaní so zodpovedajúcimi formami voľných báz.

Účinné dávky

Farmaceutické kompozície vhodné na použitie v predloženom vynáleze zahŕňajú kompozície, kde sú účinné zložky obsiahnuté v účinnom množstve na dosiahnutie zamýšľaného účelu. Konkrétnejšie, terapeuticky účinné množstvo znamená množstvo účinné na zabránenie rozvoja alebo uľahčenie existujúcich symptómov liečeného subjektu. Určenie účinných množstiev je elementárnou úlohou pre odborníkov v danej oblasti.

Pre akúkoľvek zlúčeninu použitú v metóde podľa vynálezu možno terapeuticky účinnú dávku odhadnúť spočiatku na základe bunkových testov. Dávku možno napríklad formluovať v bunkových a zvieracích modeloch, aby sa dosiahlo rozmedzie obehových koncentrácií, ktoré zahŕňa IC₅₀ podľa určenia v bunkových testoch (t.j. koncentrácia testovanej zlúčeniny, ktorá dosahuje polovicu maximálnej inhibície aktivity danej proteín kinázy). V niektorých prípadoch je vhodné určiť IC₅₀ za prítomnosti 3 až 5 % sérového albumínu, keďže také určenie aproximuje efekty viazania plazmového proteínu na zlúčeninu. Také informácie možno použiť na presnejšie určenie užitočných dávok u ľudí. Navyše najvýhodnejšie zlúčeniny na systémové podanie účinne inhibujú signalizáciu proteín kinázy v intaktných bunkách pri hladinách, ktoré sa dajú bezpečne dosiahnuť v plazme.

Terapeuticky účinná dávka znamená také množstvo zlúčeniny, ktoré vedie k zmierneniu symptómov u pacienta. Toxicitu a terapeutickú účinnosť takých zlúčenín možno určiť štandardnými farmaceutickými postupmi v bunkových kultúrach alebo na pokusných zvieratách, napr. aby sa určila maximálna tolerovaná dávka (MTD) a ED₅₀ (účinná dávka pre 50 % maximálnu odozvu). Pomer dávok medzi toxickými a terapeutickými účinkami je terapeutický index a možno ho vyjadriť ako pomer medzi MTD a ED₅₀. Uprednostňujú sa zlúčeniny, ktoré vykazujú vysoké terapeutické indexy. Dáta získané z týchto testov na bunkových kultúrach a zvieracích štúdií možno použiť pri formulovaní rozmedzia dávkovania na použitie u ľudí. Dávkovanie takých zlúčenín leží s výhodou v intervale obehových koncentrácií, ktoré zahŕňajú ED₅₀ s malou alebo žiadnou toxicitou. Dávkovanie sa môže pohybovať v tomto rozmedzí v závislosti od použitej liekovej formy a cesty podania. Presná formulácia, cesta podania a dávkovanie môže vybrať konkrétny lekár s prihliadnutím na stav pacienta. (Pozrite napr. Fingl et al., 1975, in The Pharmacological Basis of Therapeutics, kap. 1, str. 1). Pri liečbe kríz môže byť potrebné podanie akútneho bolusu alebo infúziu blížiacu sa MTD, aby sa dosiahla rýchla reakcia.

Množstvo a interval dávky možno upraviť individuálne, aby sa zabezpečili plazmové hladiny aktívneho zoskupenia, ktoré sú dostatočné na udržanie efektov modulovania kinázy alebo minimálnej účinnej koncentrácie (MEC - minimal effective concentration). MEC sa bude meniť s každou zlúčeninou, ale možno ju odhadnúť na základe in vitro dát, napr. na základe koncentrácie potrebnej na dosiahnutie 50 - 90 % inhibície proteín kinázy pomocou testov tu opísaných. Dávky potrebné na dosiahnutie MEC budú závisieť od charakteristík jednotlivca a cesty podania. Na určenie plazmových koncentrácií však možno použiť skúšky HPLC alebo biologické skúšky.

Intervaly dávok možno určiť aj pomocou hodnoty MEC. Zlúčeniny by sa mali podávať použitím režimu, ktorý udržiava plazmové hladiny nad MEC počas 10 90 % času, s výhodou medzi 30 - 90 % a s najväčšou výhodou medzi 50 - 90 %, kým sa nedosiahne zmiernenie symptómov. V prípade lokálneho podania alebo selektívneho príjmu nemusí byť účinná lokálna koncentrácia vztiahnutá na plazmovú koncentráciu.

Množstvo podanej kompozície bude samozrejme závisieť od liečeného subjektu, od váhy subjektu, od závažnosti postihnutia, spôsobu podania a úsudku predpisujúceho lekára.

Balenie

Kompozície možno v prípade potreby dodávať v balení alebo dispenzári, ktorý môže obsahovať jednu alebo viacero jednotkových liekových foriem obsahujúcich účinnú zložku. Balenie môže napríklad pozostávať z kovu alebo plastovej fólie, napríklad blistrové balenie. K baleniu alebo dispenzáru môžu byť priložené pokyny na podávanie. Možno tiež pripraviť kompozície obsahujúce

C- r , zlúčeninu podľa vynálezu formulovanú v kompatibilnom farmaceutickom nosiči, umiestniť do vhodného obalu a označiť na liečbu indikovaného stavu.

V niektorých formuláciách môže byť výhodné použiť zlúčeniny podľa predloženého vynálezu vo forme častíc veľmi malej veľkosti, napríklad častíc získaných mletím za mokra.

Použitie zlúčenín podľa predloženého vynálezu pri výrobe farmaceutických kompozícií je ilustrované nasledujúcim popisom. V tomto popise pojem „účinná zlúčenina“ označuje akúkoľvek zlúčeninu podľa vynálezu, ale najmä akúkoľvek zlúčeninu, ktorá je konečným produktom jedného z predchádzajúcich príkladov.

a) Kapsule

Pri príprave kapsúl možno deagregovať a zmiešať 10 hmotnostných dielov účinnej zlúčeniny a 240 dielov laktózy. Zmes možno naplniť do tvrdých želatínových kapsúl, pričom každá kapsula bude obsahovať jednotkovú dávku alebo časť jednotkovej dávky účinnej zlúčeniny.

b) Tablety

Tablety možno pripraviť z nasledujúcich zložiek.

	Hmotnostné diely
Účinná zlúčenina	10
Laktóza	190
Kukuričný škrob	22
Polyvinylpyrolidón	10
Stearan horečnatý	3

Účinná zlúčenina, laktóza a časť škrobu možno deagregovať, zmiešať a získanú zmes možno granulovať s roztokom polyvinylpyrolidónu v etanole. Suchý granulát možno zmiešať so stearanom horečnatým a zvyškom škrobu. Zmes sa potom komprimuje v tabletovacom stroji, aby sa získali tablety, z ktorých každá obsahuje jednotkovú dávku alebo časť jednotkovej dávky účinnej zlúčeniny.

c r

c) Entericky obaľované tablety

Tablety možno pripraviť spôsobom opísaným pod bodom b) vyššie. Tablety sa môžu entericky obaliť konvenčným spôsobom pomocou roztoku 20 % celulózoacetát ftalátu a 3 % dietylftalátu v zmesi etanolu a dichlórmetánu (1:1).

d) Supozitóriá

Pri príprave supozitórií možno použiť 100 hmotnostných dielov účinnej zlúčeniny v 1300 hmotnostných dieloch triglyceridovej bázy supozitórií a zmes vytvarovať do supozitórií, pričom každé bude obsahovať terapeuticky účinné množstvo aktívnej látky.

V kompozíciách podľa predloženého vynálezu môže byť aktívna zlúčenina v prípade potreby spojená s inými kompatibilnými farmakologicky aktívnymi zložkami. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu možno napríklad podávať v kombinácii s jedným alebo viacerými farmaceutickými prípravkami, ktoré inhibujú alebo bránia produkcii VEGF alebo angiopoietínov, zoslabujú vnútrobunkové reakcie na VEGF alebo angiopoietíny, blokujú vnútrobunkový prenos signálov, inhibujú vaskulárnu hyperpermeabilitu, znižujú zápal alebo inhibujú alebo bránia tvorbe edému alebo neovaskularizácii. Zlúčeniny podľa vynálezu možno podávať pred podaním dodatočného farmaceutického prostriedku, po ňom alebo súbežne s ním podľa toho, ktorá cesta podania je vhodná. Tieto dodatočné farmaceutické prostriedky zahŕňajú okrem iných protizápalové alebo protiedémové steroidy, NSAIDS, inhibítory ras, anti-TNF prostriedky, anti-IL1 prostriedky, antihistaminiká, PAFantagonistov, inhibítory COX-1, inhibítory COX-2, inhibítory NO syntézy, inhibítory Akt/PTB, inhibítory IGF-1R, inhibítory PKC a inhibítory PI3 kinázy. Zlúčeniny podľa vynálezu a dodatočné farmaceutické prostriedky pôsobia buď aditívne alebo synergicky. Takto podanie takej kombinácie látok, ktoré inhibujú angiogenézu, vaskulárnu hyperpermeability a/alebo inhibujú tvorbu edému, môže poskytnúť väčšiu úľavu od škodlivých účinkov hyperproliferatívnej poruchy, angiogenézy, vaskulárnej hyperpermeability alebo edému ako podanie jednej zo zlúčenín samotnej. Pri liečbe malígnych porúch sa predpokladajú kombinácie s antiproliferatívnymi alebo cytotoxickými chemoterapiami, hypertermiou, hyperoxiou alebo ožarovaním.

Predložený vynález obsahuje aj použitie zlúčeniny I ako lieku.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje použitie zlúčeniny vzorca I alebo jej soli pri výrobe liečiva na liečbu vaskulárnej hyperpermeability, porúch závislých od angiogenézy, proliferatívnych chorôb a/alebo porúch imunitného systému u cicavcov, najmä u ľudí.

In vitro potenciu zlúčenín pri inhibícii týchto proteín kináz možno určiť postupmi opísanými nižšie.

Potenciu zlúčenín možno určiť podľa množstva inhibície fosforylácie exogénneho substrátu, napr. syntetického peptidu (Z. Songyang et al., Náture, 373:536-539) testovanou zlúčeninou v porovnaní s kontrolou.

Produkcia KDR tyrozín kinázy pomocou baculovírusového systému:

Kódovacia sekvencia pre ľudskú KDR vnútrobunkovú doménu (aa789-1354) bola generovaná cez PCR pomocou cDNA izolovaných z buniek HUVEC. Sekvencia poly-His6 bola zavedená aj na N-konci tohto proteínu. Tento fragment bol klonovaný do transfekčného vektora pVL1393 na mieste Xba 1 a Not 1. Rekombinantný baculovírus (BV) bol generovaný kotransfekciou pomocou transfekčného reagentu BaculoGold (PharMingen). Rekombinantný BV bol plakovo vyčistený a overený pomocou Western analýzy. Na produkciu proteínu sa kultivovali bunky SF-9 v médiu SF-900-II pri 2 x 106/ml a infikovali sa pri 0,5 plak tvoriacich jednotiek na jednu bunku (MOI). Bunky sa oddelili 48 hodín po infekcii.

Čistenie KDR

Bunky SF-9 exprimujúce (His)₆KDR(aa789-1354) sa lýzovali pridaním 50 ml lýzneho tlmivého roztoku Triton X-100 (20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 pg/ml aprotinín, 1 pg/ml leupeptín) do bunkovej pelety z 1 I bunkovej kultúry. Lyzát sa centrifugoval pri 19 000 ot./min. v

|.

rotore Sorval SS-34 počas 30 minút pri 4 °C. Bunkový lyzát sa aplikoval na 5 ml NiCI₂ chelátovaciu sefarózovu kolónu, ekvilibroval sa pomocou 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl. KDR sa eluoval pomocou toho istého tlmivého roztoku obsahujúceho 0,25 M imidazol. Frakcie z kolóny sa analyzovali pomocou SDSPAGE a ELISA testu (nižšie), ktorý meria kinázovú aktivitu. Vyčistený KDR sa vymenil do tlmivého roztoku 25 mM HEPES, pH 7,5, 25 mM NaCl, 5 mM DTT a uložil sa pri -80 °C.

Produkcia a čistenie ľudskej Tie-2 kinázy

Kódovacia sekvencia pre ľudskú Tie-2 vnútrobunkovú doménu (aa775-1124) bola generovaná cez PCR pomocou cDNA izolovaných z ľudskej placenty ako šablóny. Na N-konci bola zavedená sekvencia poly-His₆ a tento konštrukt sa klonoval do transfekčného vektora pVL 1939 na mieste Xba 1 a Not 1. Rekombinantný BV bol generovaný kotransfekciou pomocou transfekčného reagentu BaculoGold (PharMingen). Rekombinantný BV bol plakovo vyčistený a overený pomocou Western analýzy. Na produkciu proteínu sa kultivovali hmyzie bunky SF-9 v médiu SF-900-II pri 2 x 106/ml a infikovali sa pri MOI 0,5. Čistenie kinázy označenej pomocou His použitej pri skríningu bolo analogické ako pri KDR.

Produkcia a čistenie ľudskej Flt-1 tyrozín kinázy

Použil sa baculovírusový expresný vektor pVL1393 (Phar Mingen, Los Angeles, CA). Nukleotidová sekvencia kódujúca poly-His6 bola umiestnená 5' voči nukleotidovému regiónu kódujúcemu celú intracelulárnu kinázovú doménu ľudskej Flt-1 (aminokyseliny 786-1338). Nukleotidová sekvencia kódujúca kinázovú doménu bola generovaná cez PCR pomocou knižníc cDNA izolovaných z buniek HUVEC. Histidínové zvyšky umožnili afinitné čistenie proteínu ako spôsob analogický spôsobu pre KDR a ZAP70. Hmyzie bunky SF-9 sa infikovali pri multiplicite 0,5 a oddelili sa 48 hodín po infekcii.

Zdroj EGFR tyrozín kinázy

EGFR bol zakúpený od firmy Sigma (kat. č. E-3641; 500 jednotiek/50 μΙ) a ligand EGF bol získaný od Oncogene Research Products/Calbiochem (kat. č. PF011-100).

f σ

Expresia ZAP70

Použitým baculovírusovým expresným vektorom bol pVL1393. (Pharmingen, Los Angeles, Ca.) Nukleotidová sekvencia kódujúca aminokyseliny M(H)6 LVPR_gS bola umiestnená 5' voči regiónu kódujúcemu celú ZAP70 (aminokyseliny 1-619). Nukleotidová sekvencia kódujúca región kódujúci ZAP70 bola generovaná cez PCR pomocou knižníc cDNA izolovaných z Jurkatových imortalizovaných lymfocytov T. Histidínové zvyšky umožnili afinitné vyčistenie proteínu (vide infra). Mostík LVPRgS tvorí rozpoznávaciu sekvenciu pre proteolytické štiepenie trombínom, čo umožňuje odstránenie afinitného prívesku z enzýmu. Hmyzie bunky SF-9 sa infikovali pri multiplicite infekcie 0,5 a oddelili sa 48 hodín po infekcii.

Extrakcia a čistenie ZAP70

Bunky SF-9 sa lýzovali v tlmivom roztoku pozostávajúcom z 20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% glycerolu, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 pg/ml leupeptínu, 10 pg/ml aprotinínu a 1 mM ortovanadičnanu sodného. Rozpustný lyzát sa aplikoval na chelátovaciu sefarózovú kolónu HiTrap (Pharmacia) ekvilibrovanú v 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl. Fúzny proteín sa eluoval pomocou 250 mM imidazolu. Enzým sa uložil v tlmivom roztoku obsahujúcom 50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl a 5 mM DTT.

Zdroj proteín kinázy

Lck, Fyn, Src, Blk, Csk a Lyn a ich skrátené formy možno komerčne získať (napr. od Upstate Biotechnology Inc. (Saranac Lake, N.Y) a Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Ca.)) alebo vyčistiť zo známych prírodných alebo rekombinantných zdrojov pomocou konvenčných metód.

ELISA (Enzýme Linked Immunosorbent Assay) pre PTK

Na detekciu a meranie prítomnosti tyrozín kinázovej aktivity sa použili testy ELISA (enzýme linked immunosorbent assay). Testy ELISA sa uskutočnili podľa známych protokolov, ktoré sú opísané napríklad vo Voliér, et al., 1980, EnzymeLinked Immunosorbent Assay, In: Manual of Clinical Immunology, 2d ed., edited by Rose and Friedman, s. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.

r r

Uvedený protokol bol prispôsobený na určenie aktivity vzhľadom na špecifickú PTK. Výhodné protokoly na uskutočňovanie experimentov ELISA sú ako príklad uvedené nižšie. Adaptácia týchto protokolov na určenie aktivity zlúčeniny pre iných členov rodiny receptorových PTK ako aj nereceptorových tyrozín kináz je elementárnou úlohou pre odborníkov v danej oblasti. Na účely určenia selektivity inhibítorov sa použil univerzálny substrát PTK (napr. náhodný kopolymér poly(Glu₄ Tyr), molekulová hmotnosť 20 000 - 50 000) spolu s ATP (typicky 5 μΜ) pri koncentráciách približne dvojnásobku zjavnej Km v teste.

Na testovanie inhibičného účinku zlúčenín podľa tohto vynálezu na KDR, Flt1, Tie-2, EGFR, FGFR, PDGFR, IGF-1-R, c-Met, Lck, Blk, Csk, Src, Lyn, Fyn a ZAP70 tyrozín kinázovej aktivity sa použil nasledujúci postup:

Pufre a roztoky:

PGTPoly (Glu,Tyr) 4:1

Prášok uložiť pri -20 °C. Rozpustiť prášok v fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) na 50 mg/ml roztok. 1 ml alikvóty uložiť pri -20 °C. Pri príprave platničiek rozriediť na 250 pg/ml v Gibco PBS.

Reakčný tlmivý roztok: 100 mM Hepes, 20 mM MgCI₂, 4 mM MnCI₂, 5 mM DTT, 0,02 % BSA, 200 μΜ NaVO₄, pH 7,10

ATP: Alikvóty 100 mM uložiť pri -20 °C. Zriediť na 20 μΜ vo vode

Premývací tlmivý roztok: PBS s 0,1 % Tween 20

Tlmivý roztok na riedenie protilátok: 0,1 % hovädzí sérový albumín (BSA) v

PBS

Substrát TMB: zmes substrátu TMB a peroxidových roztokov 9:1 bezprostredne pred použitím alebo použite K-Blue Substráte od firmy Neogen

Stop roztok: 1M kyselina fosforečná /

C C <’ cer r c i » r P f) r

Postup

1. Príprava platničky:

Zrieďte zásobný roztok PGT (50 mg/ml, zmrazený) v PBS na 250 pg/ml. Pridajte 125 μΙ na jednu jamku Corningových modifikovaných vysokoafinitných platničiek ELISA s plochým dnom (Corningovo č. 25805-96). Pridajte 125 μΙ PBS do prázdnych jamiek. Zakryte lepiacou páskou a inkubujte cez noc pri 37 °C. Premyte 1 x 250 μΙ premývacieho tlmivého roztoku a sušte asi 2 hodiny v 37 °C suchom inkubátore.

Uložte pokryté platničky v zatavenom vrecku pri 4 °C až do použitia.

2. Tyrozín kinázová reakcia:

- Pripravte roztoky inhibítorov so 4-násobnou koncentráciou v 20 % DMSO vo vode.

- Pripravte reakčný tlmivý roztok

- Pripravte enzýmový roztok tak, aby požadované jednotky boli v 50 μΙ, napr. pre KDR doplňte na 1 ng/μΙ pre celkovo 50 ng na jamku v reakciách. Uložte na ľad.

- Doplňte 4x roztok ATP na 20 μΜ zo 100 mM zásobného roztoku vo vode. Uložte na ľad.

- Pridajte 50 μΙ enzýmového roztoku na jamku (väčšinou 5-50 ng enzýmu na jamku v závislosti od špecifickej aktivity kinázy)

- Pridajte 25 μΙ 4x inhibítora

- Pridajte 25 μΙ 4x ATP pa test inhibítora

- Inkubujte 10 minút pri teplote miestnosti

- Zastavte reakciu pridaním 50 μΙ 0,05 N HCI na jamku

- Premyte platničku **Konečné koncentrácie pre reakciu: 5 μΜ ATP, 5 % DMSO

3. Viazanie protilátok

- Zrieďte 1 mg/ml alikvót protilátky PY20-HRP (Pierce) (fosfotyrozínová protilátka) do 50 ng/ml v 0,1 % BSA v PBS dvojstupňovým riedením (100 x, potom 200 x)

- Pridajte 100 μΙ Ab na jamku. Inkubujte 1 hodinu pri teplote miestnosti. Inkubujte 1 hodinu pri 4 °C.

- 4 x premyte platničku

4. Farebná reakcia

- Pripravte substrát TMB a pridajte 100 μΙ na jamku

- Monitorujte OD pri 650 nm, kým sa nedosiahne 0,6

- Zastavte 1 M kyselinou fosforečnou. Pretrepávajte na čítačke platničiek.

- Odčítajte OD bezprostredne pri 450 nm

Optimálne časy inkubácie a podmienky enzýmovej reakcie sa mierne menia s enzýmovými prípravkami a určujú sa empiricky pre každú dávku.

Pre Lck sa ako reakčný tlmivý roztok použil 100 mM MOPSO, pH 6,5, 4 mM MnCI₂, 20 mM MgCI₂, 5 mM DTT, 0,2 % BSA, 200 mM NaVO₄ za analogických podmienok testu.

Zlúčeniny vzorca I môžu mať terapeutické využitie pri liečbe chorôb zahŕňajúcich identifikované, vrátane tu uvedených, ako aj doposiaľ neidentifikované proteín tyrozín kinázy, ktoré sú inhibované zlúčeninami vzorca I. Všetky zlúčeniny tu uvedené významne inhibujú buď FGFR, PDGFR, KDR, Tie-2, Lck, Fyn, Blk, Lyn alebo Src pri koncentráciách 50 mikromólov alebo menej. Niektoré zlúčeniny podľa tohto vynálezu tiež významne inhibujú iné tyrozín alebo serín/treonín kinázy, napríklad cdc2 (cdk1) pri koncentráciách 50 mikromólov alebo menej.

r /· ŕ C c ·;

r r. _{( (} r e Q n <* r , cc.· e r t CC C C n .·

Zdroj Cdc2

Ľudský rekombinantný enzým a testový tlmivý roztok možno získať komerčne (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) alebo vyčistiť zo známych prírodných alebo rekombinantných zdrojov pomocou konvenčných metód.

Test Cdc2

Použil sa protokol priložený ku kúpeným reagentom s malými modifikáciami. V stručnosti, reakcia sa uskutočnila v timivom roztoku pozostávajúcom z 50mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0,01 % Brij, 5 % DMSO a 10 mM MgCI₂ (komerčný tlmivý roztok) doplnenom čerstvým 300 μΜ ATP (31 μΟϊ/ιτιΙ) a 30 μθ/ml histónu typ lllss v konečných koncentráciách. Reakčný objem 80 μΙ obsahujúci jednotky enzýmu, sa spustil na 20 minút pri 25 °C za prítomnosti alebo neprítomnosti inhibítora. Reakcia sa ukončila pridaním 120 μΙ 10% kyseliny octovej. Substrát sa oddelil od nezabudovenej značky nanesením zmesi na fosfocelulózový papier a trojnásobným premytím po 5 minút pomocou 75 mM kyseliny fosforečnej. Počty sa merali beta počítadlom za prítomnosti kvapalného scintilantu.

Isté zlúčeniny podľa predloženého vynálezu významne inhibujú cdc2 pri koncentráciách pod 50 μΜ.

Zdroj PKC kinázy

Katalytickú podjednotku PKC možno získať komerčne (Calbiochem).

Test PKC kinázy

Použil sa test rádioaktívnej kinázy podľa publikovaného postupu (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y. Biochemical and Biophysical Research Communication 3:166, 1220-1227 (1990)). V stručnosti, všetky reakcie sa uskutočnili v kinázovom timivom roztoku pozostávajúcom z 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM MgCI₂, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 100 μΜ ATP, 8 μΜ peptidu, 5 % DMSO a ³³P ATP (8 Ci/mM). Zlúčenina a enzým sa zmiešali v reakčnej nádobe a reakcia sa iniciovala pridaním zmesi ATP a substrátu. Po ukončení reakcie pridaním 10 μΙ zastavovacieho tlmivého roztoku (5 mM ATP v 75 mM kyseline fosforečnej) sa časť zmesi naniesla na fosfocelulózové filtre.

Nanesené vzorky sa premývali 3 krát v 75 mM kyseline fosforečnej pri teplote miestnosti 5 až 15 minút. Zabudovanie rádioaktívnej značky sa kvantifikovalo kvapalinovým scintilačným počítaním.

Zdroj erk2 enzýmu

Rekombinantný myšací enzým a testový tlmivý roztok možno získať komerčne (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) alebo vyčistiť zo známych prírodných alebo rekombinantných zdrojov pomocou konvenčných metód.

Test erk2 enzýmu

V stručnosti, reakcia sa uskutočnila v tlmivom roztoku pozostávajúcom z 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0,01 % Brij, 5 % DMSO a 10 mM MgCI₂ (komerčný tlmivý roztok) doplnenom čerstvým 100 μΜ ATP (31 μΟί/ιτιΙ) a 30 μΜ myelínového bázického proteínu za podmienok odporúčaných dodávateľom. Reakčné objemy a metóda hodnotenia zabudovanej rádioaktivity boli podľa popisu pre test PKC (vide supra).

In vitro modely pre aktiváciu lymfocytov T

Po aktivácii mitogénom alebo antigénom sa v iymfocytoch T indukuje sekrécia IL-2, rastového faktora, ktorý podporuje ich následnú proliferatívnu fázu. Preto možno merať buď produkciu IL-2 z bunkovej proliferácie primárnych lymfocytov T alebo vhodných línií lymfocytov T ako náhradu za aktiváciu lymfocytov T. Oba tieto testy sú dobre opísané v literatúre a ich parametre sú dobre dokumentované (Current Protocols in Immunology, zv. 2, 7.10.1-7.11.2).

V stručnosti, lymfocyty T možno aktivovať spoločnou kultiváciou s alogénnymi stimulačnými bunkami ako proces nazývaný jednosmerná zmiešaná lymfocytová reakcia. Respondérové a stimulátorové mononukleárne krvinky periférnej krvi sa čistia Ficoll-Hypaque gradientom (Pharmacia) podľa návodu výrobcu. Stimulátorové bunky sa mitoticky inaktivujú pôsobením mitomycínu C (Sigma) alebo gama žiarením. Respondérové a stimulátorové bunky sa spoločne kultivujú v pomere dva ku jednej za prítomnosti a neprítomnosti testovanej zlúčeniny. Typicky sa zmieša 10⁵ respondérov s 5 x 10⁴ stimulátorov a naplatničkuje sa (objem 200 μΙ) v mikrotitračnej platničke s okrúhlym dnom (Costar r> c p e r r n « f e r r · · n p r c r λ r c r r í* c cc c r c .· r r '

Scientific). Bunky sa kultivujú v RPMI 1640 doplnenom buď tepelne inaktivovaným hovädzím sérom (Hyclone Laboratories), alebo kombinovaným ľudským AB sérom z darcov - mužov, 5 x 10'⁵M 2-merkaptoetanolu a 0,5 % DMSO. Kultúry sa pulzujú 0,5 pCi ³H tymidínu (Amersham) jeden deň pred oddelením (väčšinou deň tri). Kultúry sa oddelia (Betaplate harvester, Wallac) a absorpcia izotopu sa vyhodnotí kvapalinovou scintiláciou (Betaplate, Wallac).

Ten istý systém kultivácie možno použiť na hodnotenie aktivácie lymfocytov T meraním produkcie IL-2. Osemnásť až dvadsaťštyri hodín po iniciácii kultivácie sa supernatanty odstránia a koncentrácia IL-2 sa zmeria pomocou testu ELISA (R and D Systems) podľa pokynov výrobcu.

In vivo modely aktivácie lymfocytov T

In vivo účinnosť zlúčenín možno testovať na zvieracích modeloch, o ktorých je známe, že priamo merajú aktiváciu lymfocytov T, alebo pre ktoré sa lymfocyty T dokázali ako efektory. Lymfocyty T možno aktivovať in vivo ligáciou konštantnej časti receptora lymfocytu T s monoklonálnou anti-CD3 protilátkou (Ab). V tomto modeli sa myšiam BALB/c podáva 10 pg anti-CD3 Ab intraperitoneálne dve hodiny pred exsangvináciou. Zvieratám, ktoré majú dostávať testovanú zlúčeninu, sa podá jedna dávka zlúčeniny jednu hodinu pred podaním anti-CD3 Ab. Sérové hladiny prozápalových cytokínov interferón-γ (IFN- γ) a faktora nádorovej nekrózy-α (TNF-a), indikátorov aktivácie lymfocytov T, sa zmerajú pomocou testu ELISA. Podobný model využíva in vivo prípravu lymfocytov T špecifickým antigénom, napríklad KLH (keyhole limpet hemocyanin) nasledovanú sekundárnou in vitro expozíciou buniek odvodnej lymfatickej uzliny na ten istý antigén. Rovnako ako predtým, meranie produkcie cytokínu sa používa na hodnotenie stavu aktivácie kultivovaných buniek. V stručnosti, myši C57BL/6 sa imunizujú subkutánne 100 pg KLH emulgovaného v kompletnom Freundovom adjuvans (CFA) v deň nula. Zvieratám sa najprv podá zlúčenina jeden deň pred imunizáciou a následne v dni jeden, dva a tri po imunizácii. Odvodné lymfatické uzliny sa odoberú v deň 4 a ich bunky sa kultivujú pri 6 x 10⁶ na ml v tkanivovom kultivačnom médiu (RPMI 1640 doplnenom tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom (Hyclone Laboratories) 5 x 10'⁵ M 2-merkaptoetanolu a 0,5% DMSO) dvadsaťštyri a štyridsaťosem hodín. Kultivačné supernatanty sa potom hodnotia na hladiny autokrinného rastového faktora lymfocytov T interleukínu-2 (IĽ-2) a/alebo IFN-γ pomocou testu ELISA.

Vedúce zlúčeniny možno testovať aj na zvieracích modeloch ľudskej choroby. Príkladmi týchto sú experimentálna autoimunitná encefalomyelitída (EAE) a kolagénom indukovaná artritída (CIA). Modely EAE, ktoré napodobňujú aspekty ľudskej rozstrúsenej sklerózy, boli opísané u potkanov aj myší (prehľadný článok FASEB J. 5:2560-2566, 1991; myšací model: Lab. Invest. 4(3):278, 1981; model hlodavcov: J. Immunol 146(4):1163-8, 1991). V stručnosti, myši alebo potkany sa imunizujú emulziou myelínového bázického proteínu (MBP) alebo jeho neurogénnymi peptidovými derivátmi a CFA. Akútnu chorobu možno indukovať pridaním bakteriálnych toxínov, napríklad bordetella pertussis. Relapsujúca/recidivujúca choroba sa indukuje adoptívnym transferom lymfocytov T z MBP/peptidom imunizovaných zvierat.

CIA možno indukovať v myšiach DBA/1 imunizáciou kolagénom typu II (J. Immunol: 142(7):2237-2243). U myší sa vyvinú príznaky artritídy už desať dní po expozícii na antigén a môže sa skórovať až deväťdesiat dní po imunizácii. V modeli EAE aj CIA sa zlúčenina môže podať buď profylaktický alebo v čase nástupu choroby. Účinné liečivá by mali znížiť závažnosť a/alebo incidenciu.

Isté zlúčeniny podľa tohto vynálezu, ktoré inhibujú jeden alebo viacero angiogénnych receptorových PTK a/alebo proteín kinázu ako lck zapojenú do sprostredkovania zápalových odoziev môžu znížiť závažnosť a incidenciu artritídy v týchto modeloch.

Zlúčeniny možno testovať aj v myšacích aloimplantátoch - buď kožných (prehľad v Ann. Rev. Immunol., 10:333-58, 1992; Transplantation: 57(12): 1701-17D6, 1994) alebo srdcových (Am. J. Anat.: 113:273, 1963). V stručnosti, kožné štepy plnej hrúbky sa transplantujú z myší C57BL/6 na myši BALB/c. Štepy možno kontrolovať na známky odmietnutia denne počnúc dňom šesť. V modeli transplantátu srdca neonatálnej myši sa neonatálne srdcia ektopicky transplantujú z myši C57BL/6 do ušnice dospelej myši CBA/J. Srdcia začínajú biť štyri až sedem

Ο Γ Γ f r r r c ri ί· ,- r - r _ι - .· r f r Γ f Γ <· < r ,· r r c r r t' (' f r ,· _r dní po transplantácii a odmietnutie možno hodnotiť vizuálne pomocou pitevného mikroskopu sledovaním ustania bitia.

Testy bunkových receptorových PTK

Nasledujúci bunkový test sa použil na určenie úrovne aktivity a účinku rôznych zlúčenín podľa predloženého vynálezu na KDR/VEGFR2. Podobné receptorové PTK testy využívajúce špecifický ligandový stimul možno postaviť podobným spôsobom pre iné tyrozín kinázy použitím techník známych v danej oblasti.

Fosforylácia KDR indukovaná pomocou VEGF v endotelových bunkách ľudskej pupočnej žily (HUVEC - Human Umbilical Vein Endothelial Celíš) podľa ¹ merania pomocou Western Blots:

1. Bunky HUVEC (kombinované z viacerých darcov) sa zakúpili od Clonetics (San Diego, CA) a kultivovali sa podľa pokynov výrobcu. Na tento test sa použili len skoré pasáže (3-8). Bunky sa kultivovali v 100 mm miskách (Falcon na tkanivovú kultúru; Becton Dickinson; Plymouth, Anglicko) pomocou kompletného média EBM (Clonetics).

2. Na vyhodnotenie inhibičnej aktivity zlúčeniny sa bunky trypsinizovali a nasadili pri 0,5-1,0 x 10⁵ buniek/jamku v každej jamke 6-jamkových skupinových platničkách (Costar; Cambridge, MA).

3. 3-4 dni po nasadení boli platničky 90-100 % konfluentné. Médium sa odstránilo zo všetkých jamiek, bunky sa prepláchli 5-10 ml PBS a inkubovali sa 1824 h 5 ml média bázy EBM bez prídavkov (t.j. hladovanie séra).

4. Sériové zriedenia inhibítorov sa pridali v 1 ml média EBM (25 μΜ, 5 μΜ alebo 1 μΜ konečnej koncentrácie) k bunkám a inkubovali sa jednu hodinu pri 37 °C. Ľudský rekombinantný VEGF₁₆₅ (R & D Systems) sa potom pridal do všetkých jamiek v 2 ml média EBM pri konečnej koncentrácii 50 ng/ml a inkuboval sa pri 37 °C počas 10 minút. Kontrolné bunky neošetrené alebo ošetrené len pomocou VEGF sa použili na hodnotenie pozad’ovej fosforylácie a indukcie fosforylácie zo strany VEGF.

C. r r nr - .·. · r f c r í r r f · r cl·?,· Λ l·

Všetky jamky sa potom premyli 5 - 10 ml studeného PBS obsahujúceho 1 mM ortovanadičnanu sodného (Sigma) a bunky sa lýzovali a zoškriabali v 200 pl tlmivého roztoku RIPA (50 mM Tris-HCl) pH 7, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,25 % deoxycholátu sodného, 1 mM EDTA) obsahujúceho inhibítory (PMSF 1 mM, aprotinín 1 pg/ml, pepstatín 1g/ml, leupeptín 1gg/ml, vanadičnan sodný 1 mM, fluorid sodný 1 mM) a 1 pg/ml Dnázy (všetky chemikálie od Sigma Chemical Company, St Louis, MO). Lyzát sa centrifugoval pri 14 000 ot./min počas 30 min, aby sa odstránili jadrá.

Rovnaké množstvá proteínov sa potom vyzrážali pridaním studeného (20 °C) etanolu (2 objemy) počas minimálne 1 hodiny alebo maximálne cez noc. Pelety sa rekonštituovali vo vzorkovom tlmivom roztoku Laemli obsahujúcom 5 % merkaptoetanolu (BioRad; Hercules, CA) a varili sa 5 min. Proteíny sa rozdelili elektroforézou na polyakrylamidovom géle (6 %, 1,5 mm Novex, San Deigo, CA) a preniesli sa na nitrocelulózovú membránu pomocou systému Novex. Po zablokovaní albumínom hovädzieho séra (3 %) sa proteíny sondovali cez noc antiKDR polyklonälnou protilátkou (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) alebo anti-fosfotyrozínovou monoklonálnou protilátkou (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) pri 4 °C. Po premytí a inkubovaní počas 1 hodiny pomocou HRP-konjugovaného F(ab)₂ kozieho anti-králičieho alebo kozieho antimyšacieho IgG sa pásy zviditeľnili pomocou systému emisnej chemiluminiscencie (ECL) (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL).

I

Isté príklady predloženého vynálezu významne inhibujú fosforyláciu KDR tyrozin kinázy indukovanú bunkovým VEGF pri koncentráciách menej ako 50 μΜ.

In vivo model maternicového edému

Tento test meria schopnosť zlúčeniny inhibovať akútne zvýšenie maternicovej hmotnosti u myší, ku ktorému dochádza v prvých niekoľkých hodinách po stimulácii estrogénom. Je známe, že tento skorý nástup zvýšenia hmotnosti maternice je spôsobený edémom spôsobeným zvýšenou priepustnosťou maternicovej vaskulatúry. Cullinan-Bove a Koss (Endocrinology (1993), 733:829837) ukázali úzky časový vzťah medzi estrogénom stimulovaným edémom maternice a zvýšenou expresiou mRNA VEGF v maternici. Tieto výsledky boli e e ŕ e c e e r ŕ o e c f· c r

C β r r r- c oc potvrdené použitím neutralizačnej monoklonálnej protilátky na VEGF, čo významne znížilo akútne zvýšenie hmotnosti maternice po stimulácii estrogénom (WO 97/42187). Teda tento systém môže slúžiť ako model pre in vivo inhibíciu signalizácie VEGF a súvisiacej hyperpermeability a edému.

I

Materiály: Všetky hormóny boli zakúpené od firmy Sigma (St. Louis, MO) alebo Cal Biochem (La Jolla, CA) ako lyofilizované prášky a pripravené podľa pokynov dodávateľa.

Komponenty vehikúl (DMSO, Cremaphor EL) boli zakúpené od firmy Sigma (St. Louis, MO).

Myši (Balb/c, 8-12 týždňov staré) boli zakúpené od Taconic (Germantown, NY) a chované v zariadení bez patogénov v súlade so smernicami Výboru pre inštitucionálnu starostlivosť a použitie zvierat.

Metóda:

Deňl.Myšiam Balb/c sa podala (i.p.) intraperitoneálna injekcia 12,5 jednotiek sérového gonadotrofínu gravidnej kobyly (PMSG - pregnant mare's sérum gonadotropin).

Deň 3:Myši dostali 15 jednotiek ľudského chorionického gonadotrofínu (hCG) i.p.

Deň 4: Myši sa náhodne rozdelili do skupín po 5 - 10. Testované zlúčeniny sa podali i.p., i.v. alebo p.o. cestami v závislosti od rozpustnosti a vehikule v dávkach od 1 do 100 mg/kg. Kontrolná skupina vehikula dostávala len vehikulum a dve skupiny boli bez ošetrenia.

O tridsať minút neskôr experimentálna, vehikulová a 1 z neliečených skupín dostala i.p. injekciu 17-estradiolu (500 pg/kg). Po 2 - 3 hodinách boli zvieratá usmrtené inhaláciou CO₂. Po stredovej incízii sa každý uterus izoloval a odstránil odrezaním hneď pod krčkom a pripojeniami maternice s vajcovodmi. Tukové a spojovacie tkanivo sa opatrne odstránilo, aby sa neporušila celistvosť maternice pred vážením (hmotnosť zamokra). Z materníc sa odstránili tekutiny stlačením

Γ Γ

Γ* f medi dvoma hárkami filtračného papiera sklenenou litrovou fľašou naplnenou vodou. Maternice sa vážili po biottingu (blottovaná hmotnosť). Rozdiel medzi hmotnosťou zamokra a blottovanou hmotnosťou bol vzatý ako obsah tekutiny uteru. Stredný obsah tekutiny ošetrených skupín bol porovnaný s neošetrenými alebo vehikulom ošetrenými skupinami. Významnosť bola určená Študentovým testom. Ňestimulovaná kontrolná skupina bola použitá na monitorovanie estradiolovej odozvy.

Výsledky ukazujú, že isté zlúčeniny podľa predloženého vynálezu inhibujú tvorbu edému pri podaní systematicky rôznymi cestami.

Isté zlúčeniny podľa tohto vynálezu, ktoré sú inhibítormi angiogénnych receptorových tyrozín kináz, môžu byť aktívne aj v Matrigelovom implantátovom modeli neovaskularizácie. Model Matrigelovej neovaskularizácie zahŕňa tvorbu nových ciev v rámci čistého „mramoru“ extracelulárneho matrixu implantovaného subkutánne, ktorý je indukovaný prítomnosťou proangiogénneho faktora produkujúceho nádorové bunky (príklady pozrite v: Passaniti, A., et al, Lab. Investig. (1992), 67(4), 519-528; Anat. Rec. (1997), 249(1), 63-73; Int. J. Cancer (1995), 63(5), 694-701; Vasc. Biol. (1995), 15(11), 1857-6). Tento model s výhodou beží 3 - 4 dni a končí makroskopickým vizuálnym alebo obrazovým skórovaním neovaskularizácie, mikroskopickými určeniami hustoty mikrociev alebo kvantifikáciou hemoglobínu (Drabkinova metóda) po odstránení implantátu oproti kontrolám zo zvierat neošetrených inhibítormi. Model môže alternatívne využívať bFGF alebo HGF ako stimul.

Isté zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, ktoré inhibujú jednu alebo viacero onkogénnych, protoonkogénnych alebo od proliferácie závislých proteín kináz alebo angiogénnu receptorovú PTK, inhibujú aj rast primárnych myšacích, potkaních alebo ľudských xenoimplantátových nádorov u myší, alebo inhibujú metastázy v myšacích modeloch.

Γ Γ e e r r ľ c r r r.

Γ C?

Príklady uskutočnenia vynálezu

Teraz budú opísané postupy prípravy zlúčenín vzorca I. Tieto postupy tvoria ďalší aspekt predloženého vynálezu. Tieto postupy sa s výhodou uskutočňujú za atmosférického tlaku.

Zlúčeniny vzorca I možno pripraviť kondenzovaním zlúčeniny vzorca

v ktorej R¹, R², R³, L a kruh A majú vyššie uvedený význam, s formamidom pri teplote v rozmedzí od 50 do 250 °C voliteľne za prítomnosti katalyzátora, napríklad 4-dimetylaminopyridínu.

Zlúčeniny vzorca I možno pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca (III)

kde R^x je bróm alebo jód, s jednou z nasledujúcich zlúčenín: R₃B(OH)₂, R₃SnCH₃ alebo zlúčeninou, ktorú predstavuje vzorec III

R3-(CH₂)j-L-F A

R3-(CH₂)j-L-F A

B(OH)₂

SnCH₃ r, r

R3-(CH₂)j

-F A r f 1' r r r r > r f r r f r r?

alebo

kde R³ má vyššie uvedený význam, za prítomnosti katalyzátora, napríklad zlúčenín kovového paládia, napr. Pd(PPh₃)₄.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorých R¹ predstavuje aikyl alebo aralkyl, možno pripraviť alkyláciou zlúčeniny vzorca (IV)

kde R¹ predstavuje aikyl alebo aralkyl a X’ predstavuje odchádzajúcu skupinu, napríklad halogén, mezyloxy alebo tozyloxy.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorých R¹ predstavuje voliteľne substituovaný cyklický éter, napríklad tetrahydrofuryl alebo tetrahydropyranyl, možno pripraviť alkyláciou zlúčeniny vzorca IV r c

v ktorej R² a R³ majú vyššie uvedený význam, so zlúčeninou vzorca R¹X’, v ktorej X’ má vyššie uvedený význam a R¹ je voliteľne substituovaný cyklický éter.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorých R¹ predstavuje cyklický éter, napríklad tetrahydrofuryl alebo tetrahydropyranyl, voliteľne substituovaný formylom, možno pripraviť alkyláciou zlúčeniny vzorca IV zlúčeninou R¹X, v ktorej R¹ predstavuje cyklický éter substituovaný formylovou skupinou, ktorá bola chránená, metódou známou odborníkom v danej oblasti, napríklad pomocou acetálu, (pozrite napríklad Tet. Letts. 30 (46) 1989, 6259-6262) s nasledujúcim odstránením chrániacej skupiny. Zlúčeniny, v ktorých R¹ predstavuje cyklický éter, napríklad tetrahydrofuryl alebo tetrahydropyranyl, substituovaný (voliteľne substituovaným amino)metylom, možno pripraviť redukčnou amináciou zlúčeniny, v ktorej R¹ predstavuje cyklický éter substituovaný formylom.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorom R¹ predstavuje voliteľne substituovaný furyl, tienyl alebo pyrolyl, možno pripraviť reakciou 4-chlór-5-jód-7/-/-pyrolo[2,3d]pyrimidínu s vhodnou heteroarylboritou kyselinou za prítomnosti katalyzátora na báze soli medi, napríklad octanu meďnatého za prítomnosti rozpúšťadla pre reaktanty, napr. halogenovaného rozpúšťadla, napríklad dichlórmetánu, za prítomnosti sušidla, napríklad 4A molekulových sít, za prítomnosti organickej bázy, napr. trietylamínu alebo pyridínu, pri teplote v rozmedzí 0-50 °C, s výhodou pri teplote miestnosti. (Podmienky pozrite v Tet. Letts. (1998), zväzok 39:2942-2944 a referencie tam citované. Táto práca sa týmto zahŕňa odkazom.) Tieto zlúčeniny možno formulovať metódami známymi odborníkom v danej oblasti, aby sa získali zlúčeniny, v ktorých R¹ predstavuje furyl, tienyl alebo pyrolyl substituovaný formylom. Formylová skupina v týchto zlúčeninách sa môže produktívne aminovať metódami známymi odborníkom v danej oblasti, aby sa získali zlúčeniny, v ktorých R¹ predstavuje furyl, tienyl alebo pyrolyl substituovaný aminometylovými skupinami.

Alternatívne možno intermediáty, v ktorých R¹ predstavuje furyl, tienyl alebo pyrolyl, podrobiť Mannichovej reakcii za vzniku intermediátov, v ktorých R¹ predstavuje furyl, tienyl alebo pyrolyl substituovaný aminometylovou skupinou.

Zlúčeniny vzorca I možno pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca V

v ktorých R¹, R², R³, L a kruh A majú vyššie uvedený význam a R^y predstavuje odchádzajúcu skupinu, napríklad halogén alebo fenoxy, s amoniakom alebo amóniovou soľou, napríklad octanom amónnym, pri teplote v rozmedzí 15 250 °C, s výhodou v tlakovej nádobe.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorých R² predstavuje chlór, bróm alebo jód, možno pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca VI

v ktorom R¹, R³ L a kruh A majú vyššie uvedený význam, s halogenačným činidlom, napríklad jodačným činidlom, napr. N-brómsukcínimidom, alebo chloračným činidlom, napr. N-chlórsukcínimidom.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorých -L-R³ predstavuje -NHC(O)R³, možno pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca VII r r

(VII) v ktorom R¹, R² a kruh A majú vyššie uvedený význam a Y predstavuje chránený amín, so zlúčeninou vzorca R³COR^X, v ktorej R^x predstavuje odchádzajúcu skupinu, napríklad chlór. Alternatívne možno nechať zlúčeniny vzorca VII, v ktorom Y predstavuje halogén, napríklad chlór, reagovať so zlúčeninou vzorca R³COR^X a produkt nechať reagovať s amoniakom, čím sa získa zlúčenina vzorca I. Analogické metódy možno použiť na prípravu zlúčenín vzorca I, v ktorých -L-R³ je -NRSO2R³. Analogické metódy možno použiť na prípravu zlúčeniny vzorca I, v ktorom -L-R³ je -NRCO2-R³ alebo -NRCONR’. R a R’ majú vyššie uvedený význam.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorých -L-R³ predstavuje -OSO₂-, možno pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca VIII

(VIII) v ktorom R¹, R² a kruh A majú vyššie uvedený význam, so zlúčeninou vzorca R⁴SO₂R^x.

Zlúčeniny vzorca I možno potom pripraviť z takých intermediátov podľa schémy 2 alebo alternatívy schémy 2, ktorá je opísaná ďalej.

Zlúčeniny vzorca II možno pripraviť podľa schémy 1, v ktorej IPA predstavuje propán-2-ol.

r- c

R3 (CH₂)j

1) NaOCH₂CH₃/CH₃CH₂OH

2) NCCH₂CN/NaOCH₂CH₃, CH₃CH₂OH, 50°C

Odborníkom v danej oblasti bude zrejmé, že zlúčeniny vzorca I možno skonvertovať na iné zlúčeniny vzorca I známymi chemickými reakciami. Napríklad alkoxyl možno štiepiť za vzniku hydroxylu, nitroskupiny možno redukovať na amíny, amíny možno acetylovať, sulfonylovať alebo fosforylovať a N-acylzlúčeniny možno hydrolyzovať na amíny. Zlúčeniny vzorca I, v ktorom -L- je S, možno oxidovať za vzniku zlúčenín vzorca I, v ktorom -L- predstavuje SO a SO₂, metódami známymi odborníkom v danej oblasti.

1 · · • · · • · ♦ · e · c n < r « » r r

Zlúčeniny vzorca III sú komerčne dostupné, alebo ich metódami známymi odborníkom v danej oblasti.

možno pripraviť

Zlúčeniny vzorca IV, v ktorom R² predstavuje vodík, možno pripraviť podľa schémy 2. Aminoskupinu možno chrániť pred konečným krokom a potom chrániacu skupinu odstrániť po konečnom kroku schémy 2 metódami známymi odborníkom v danej oblasti. Zlúčeniny vzorca IV, v ktorých R² je niečo iné ako vodík, možno pripraviť analogickými metódami, (pozrite J. Med. Chem. (1990), 33, 1984.)

Schéma 2

Alternatívne možno pred amináciou v schéme 2 najprv spojiť (kruh A)-L-R³. Alternatívne môže byť pred uskutočnením jedného z procesov prítomný aj substituent R¹ s vyššie uvedeným významom.

Zlúčeniny vzorca V možno pripraviť podľa schémy 3.

Γ Γ r e β e ·.' r f C r r <· ⁶⁶ -Ľ

Schéma 3

Ri

Zlúčeniny, v ktorých (kruh A)-L-R³ chýba, možno pripraviť podľa schémy 4 a podľa popisu v J.Med. Chem., (1988), 31:390 a tam citovaných odkazov. Zlúčeniny, v ktorých (kruh A)-L-R³ je niečo iné ako vodík, možno pripraviť analogickými metódami.

Schéma 4

Zlúčeniny vzorca VII možno pripraviť syntézou 5-jódzlúčeniny spôsobom analogickým tomu, ktorý je opísaný pri príprave zlúčenín vzorca IV.

Odborníkom v danej oblasti bude zrejmé, že v prípade, kedy je substituent identický alebo podobný funkčnej skupine, ktorá bola modifikovaná v jednom z vyššie uvedených procesov, že tieto substituenty budú vyžadovať ochranu pred začatím tohto procesu s nasledujúcim odstránením chrániacej skupiny. Inak dôjde ku konkurenčným vedľajším reakciám. Alternatívne možno použiť iné ako vyššie opísané procesy, pri ktorých substituent neprekáža. Príklady vhodných chrániacich skupín a metódy ich pridávania a odstraňovania možno nájsť v učebnici „Protective f r r o ~ r f r r ^; Groups in Organic Synthesis“, T. W. Green, John Wiley and Sons, 1981. Napríklad vhodnými chrániacimi skupinami pre amíny sú formyl alebo acetyl.

Nasledujúce príklady boli pripravené podľa všeobecných metód prípravy načrtnutých vyššie.

Príklad 1: N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-4-kyano-1-benzénsulfónamid

a) terc-Butyl N-(4-bróm-2-metoxyfenyl)karbamát

Zmes 4-bróm-2-metoxyanilínu (34,0 g, 0,17 mol) a di-terc-butyl dikarbonátu (44,5 g, 0,20 mol) v tetrahydrofuráne (350 ml) sa zahrievala na reflux 22 h. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Zvyšok sa rozpustil v etylacetáte (350 ml) a premyl sa 1 N kyselinou citrónovou (200 ml), vysušil sa nad síranom horečnatým, prefiltroval a odparil, čím sa získal terc-butyl N-(4-bróm-2-metoxyfenyl)karbamát ako žltý olej (80 % čistota, 57,10 g, 0,15 mol): ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 8,01 (s, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,17 (d, 1H), 7,07 (dd, 1H), 3,82 (s, 3H), 1,45 (s, 9H); TLC (nheptán/etylacetát = 2:1) R_f 0,67.

b) terc-Butyl N-[2-metoxy-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2yl)fenyl]karbamát

Zmes terc-butyl N-(4-bróm-2-metoxyfenyl)karbamátu (80 % čistota) (6,25 g, 16,56 mmol), dibórpinakolesteru (5,05 g, 19,88 mmol), [1,ľbis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládnatého komplexu s dichlórmetánom. (1:1) (0,41 g, 0,50 mmol) a octan draselný (4,88 g, 49,80 mmol) v N,N-dimetylformamide (100 ml) sa zahrieval na 80 °C pod dusíkovou atmosférou cez noc. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a väčšina rozpúšťadla sa potom odstránila za zníženého tlaku. K zvyšku sa pridal dichlórmetán (100 ml) a získané tuhé látky sa oddelili filtráciou cez vrstvu celitu. Filtrát sa nakoncentroval, čím sa získal tmavý olej, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chrómatografiou na oxide kremičitom s použitím zmesi dichlórmetán/n-heptán (1:2) s 2,5 % trietylamínu ako mobilnej fázy, čím sa získal terc-butyl N-[2-metoxy-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamát ako biela tuhá látka (65 % čistota, 4,25 g, 7,92 mmol): ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 7,93(s, 1H), 7,83 (d, 1 H), 7,25 (d, 1H), 7,16 r r c r t < r r r c r r r c r ? c .·. n r · r ,-r rr r(s, 1H), 3,83 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,30(s, 12H); RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 50%-100% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) R_t 18,28 min.

c) terc-Butyl N-[4-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxy-fenyljkarbamát

Zmes vody (25 ml) a terc-butyl N-[2-metoxy-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamátu (65 % čistota) (4,25 g, 7,92 mmol) sa zmrazila a vystavila pôsobeniu vákua s nasledujúcim zaplnením dusíkom počas rozmrazovania. Pridal sa 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidín (1,83 g, 5,28 mmol), tetrakis (trifenylfosfín)paládium(O) (0,37 g, 0,32 mmol), uhličitan sodný (1,40 g, 13,20 mmol) a etylénglykoldimetyléter (50 ml) a získaná zmes sa zahrievala na 80 °C pod dusíkovou atmosférou cez noc. Zmes sa nechala ochladiť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku, čim sa získal zvyšok, ktorý sa rozdelil medzi vodu a etylacetát. Organická vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa ďalej extrahovala etylacetátom (dvakrát). Spojené etylacetátové extrakty sa vysušili nad síranom horečnatým a odparili sa, čím sa získal tmavý olej, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom s použitím n-heptánu a etylacetátu (3:1) s 2 % trietylamínu ako mobilnej fázy. Príslušné frakcie sa skombinovali a nakoncentrovali, čím sa získal terc-butyl N-[4-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl] karbamát ako biela tuhá látka (Í ,90 g, 4,29 mmol): ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 8,65 (s, 1H), 7,94 (s, 2H), 7,74 (d, 1H), 7,19 (d, 1H), 7,07 (dd, 1H), 5,22 (m, 1H), 3,87 (s, 3H), 2,19 (m, 2H), 1,99 (m, 2H), 1,91 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 1,48 (s, 9H); TLC (nheptán/etylacetát = 1:1) R, 0,58.

d) 4-(4-Chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyanilín

Kyselina trifluóroctová (2 ml) sa pridala po kvapkách do roztoku terc-butyl N[4-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamátu (0,58 g, 1,31 mmol) v dichlórmetáne (20 ml) pri 0 °C. Ľadový kúpeľ sa odstránil a reakčná zmes sa miešala pri teplote miestnosti 3 hodiny. Väčšina kyseliny trifluóroctovej a dichlórmetánu sa odstránila za zníženého tlaku. Zvyšok sa znova rozpustil v dichlórmetáne a premyl nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, vysušil sa nad síranom horečnatým, prefiltroval a r f e · e c c t f c odparil, čím sa získal 4-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyanilín ako biela tuhá látka (0,45 g, 1,31 mmol): ¹H NMR (DMSO-d₆ 400 MHz) δ 8,61 (s, 1 H), 7,78 (s, 1H), 6,97 (d, 1H), 6,85 (dd, 1H), 6,67 (d, 1H), 5,20 (m, 1H), 4,78 (široký, 2H), 3,81 (s, 3H), 2,18 (m, 2H), 1,88-2,00 (m, 4H), 1,72 (m, 2H); MH⁺343.

e) 5-(4-Amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín

Zmes 4-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyanilínu (0,45 g, 1,31 mmol), amoniaku (15 ml, SG 0,88) a 1,4-dioxánu (15 ml) sa zahrievala a miešala pri 120 °C v tlakovej nádobe cez noc. Zmes sa nechala ochladiť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok, ktorý sa rozdelil medzi vodu a etylacetát. Organická vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa ďalej extrahovala etylacetátom (dvakrát). Kombinované etylacetátové extrakty sa premyli nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, vysušili nad síranom horečnatým, prefiltrovali a odparili, čím sa získal 5-(4-amino-3metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín ako hnedá tuhá látka (0,32 g, 0,99 mmol): ¹H NMR (DMSO-d₆ 400 MHz) δ 8,09 (s, 1 H), 7,24 (s, 1H), 6,88 (d, 1H), 6,79 (dd, 1H), 6,71 (d, 1H), 6,01 (široký, 2H), 5,06 (m, 1H), 4,79 (široký, 2H), 3,81 (s, 3H), 2,10 (m, 2H), 1,87-1,92 (m, 4H), 1,68 (m, 2H); MH⁺324.

f) N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenylj4-kyano-1-benzénsulfónamid

Zmes 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4amínu (0,026 g, 0,08 mmol), 4-kyanobenzénsulfonylchloridu (0,019 g, 0,10 mmol) a pyridínu (0,40 ml) sa miešala pri teplote miestnosti cez noc. Väčšina pyridínu sa odstránila za zníženého tlaku a zvyšok sa vyčistil preparatívnou RP-HPLC (Rainin C18, 8 pm, 300 A, 25 cm; 25% - 100% acetonitrilu - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 21 ml/min), čím sa získal N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxy-fenyl]-4-kyano-1-benzénsulfónamid ako žltá tuhá látka (0,018 g, 0,04 mmol): ¹H NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ 9,91 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,05 (d, 2H), 7,89 (d, 2H), 7,44 (s, 1H), 7,27 (d, 1 H), 7,00 (dd, 1H), 6,98 (d, 1H), 6,07 (široký, 2H), 5,07 (m, 1H), 3,49 (s, 3H), 2,11 (m, 2H), 1,88 (m, 4H), 1,69 (m, 2H); MH⁺489; TLC (etylacetát/metanol = 9:1) Rf 0,49; RP-HPLC (Hypersil C18, c· .70 pm, 200 A, 25 cm; 25%-100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) R_t 14,65 min.

Príklad 2 N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-4-(trifluórmetyl)-1-benzénsulfónamid

Zlúčenina príkladu 2 sa syntetizovala tou istou metódou ako N1-[4-(4-Amino7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]-4-kyano-1benzénsulfónamid.

¹H NMR (DMSO-d₆ 400 MHz) δ 9,90 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,96 (s, 4H), 7,55 (m, 1H), 7,29 (d, 2H), 7,01 (m, 2H), 5,09 (m, 1H), 3,49 (s, 3H), 2,10 (m, 2H), 1,90 (m, 4H), 1,69 (m, 2H); MH’530; TLC (etyl acetát/metanol = 9:1) R, 0,64; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25 % - 98 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) R, 17,78 min.

Príklad 3 N1 -[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-4-(trifluórmetoxy)-1-benzénsulfónamid

Zlúčenina príkladu 3 sa syntetizovala tou istou metódou ako N1-[4-(4-Amino7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]-4-kyano-1benzénsulfónamid.

¹H NMR (CDCI3,400 MHz) δ 8,30 (s, 1H), 7,86 (d, 2H), 7,59 (d, 1H), 7,27 (d, 2H), 7,13 (široký, 1H), 7,05 (dd, 1H), 7,00 (s, 1H), 6,86 (d, 1H), 5,26 (s, 2H), 5,19 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 2,26 (m, 2H), 1,89 (m, 4H), 1,79 (m, 2H); MH⁺ 548; TLC (etylacetát) R, 0,34; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25 % - 98 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) Rt 18,18 min.

Príklad 4 N2-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenylj-2-pyridínsulfónamid

a) 2-Pyridínsulfonyl chlorid bol pripravený podľa popisu v Heterocycles, 1989, 28, 1115. Plynný chlór sa prebublával do roztoku 2-pyridíntiolu (2,00 g, 17,99 mmol) v koncentrovanej kyseline chlorovodíkovej (30 ml) pri 0 °C počas 3 h. Reakčná zmes sa vyliala do ľadovo studenej vody (40 ml) a získaná zrazenina sa oddelila filtráciou. Zrazenina sa ďalej premyla ľadovou vodou a potom sa vysušila n r r - - r ·· . ' r r r - r < - · ' ? L.

nad oxidom fosforečným vo vákuu pri 0 °C počas 2 h, Čím sa získal 2pyridínsulfonyl chlorid vo forme bielej tuhej látky (2,00 g, 11,26 mmol).

b) N2-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-2-pyridínsulfónamid. Zmes 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amínu (0,040 g, 0,12 mmol), 2-pyridínsulfonylchloridu (0,026 g, 0,15 mmol) a pyridínu (0,40 ml) sa miešala pri teplote miestnosti pri 0 °C počas 3 hodín. Reakčná zmes sa zriedila éterom a získaný roztok sa premyl postupne 2 N kyselinou chlorovodíkovou a nasýteným vodným roztokom chloridu sodného. Organická vrstva sa nakoncentrovala, čím sa získal zvyšok, ktorý sa vyčistil preparatívnou RP-HPLC (Rainin C18, 8 gm, 300 A, 25 cm; 25 % - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 21 ml/min), čím sa získal N2[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]-2pyridínsulfónamid ako biela tuhá látka (0,022 g, 0,05 mmol): ¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz) δ 8,71 (d, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,01 (d, 1H), 7,87 (m, 1H), 7,64 (d, 1H), 7,47 (m, 1H), 7,41 (m, 1H), 6,99 (m, 2H), 6,87 (s, 1H), 5,19 (m, 1H), 5,07 (s, 2H), 3,79 (s, 3H), 2,23 (m, 2H), 1,76-1,88 (m, 4H), 1,63 (m, 2H); MH⁺465; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25 % - 98 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) R, 12,65 min.

Príklad 5: N3-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-3-pyridínsulfónamid

a) 3-Pyridínsulfonyl chlorid bol pripravený podľa popisu v J. Heterocyclo. Chem. 1992, 29, 61. Zmes kyseliny 3-pyridínsulfónovej (1,45 g, 9,01 mmol) a chloridu fosforečného (2,00 g, 9,62 mmol) sa zahrievala na 110 °C počas 3 hodín. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu miestnosti a predestilovala sa (t. v. 60 65 °C) za zníženého tlaku (0,1 mm Hg), Čím sa získal 3-pyridínsulfonylchlorid ako biela tuhá látka (1,12 g, 6,31 mmol), ktorá sa použila priamo bez ďalšieho čistenia.

b) N3-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-3-pyridínsulfónamid. Zmes 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amínu (0,040 g, 0,12 mmol), 3-pyridínsulfonylchloridu (0,030 g, 0,17 mmol) a pyridínu (0,40 ml) sa miešala pri teplote miestnosti pri 0 °C počas 0,5 hodiny. Do reakčnej zmesi sa pridala voda a nasledovalo odstránenie r r r r r r r r c r r r r c c r r väčšiny pyridínu a vody za zníženého tlaku. Zvyšok sa vyčistil preparatívnou RPHPLC (Rainin C18, 8 :m, 300 A, 25 cm; 25 % - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 21 ml/min), čím sa získal N3-[4-(4-amino-7-cyklopentyl7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]-3-pyridínsulfónamid ako biela tuhá látka (0,020 g, 0,04 mmol); ¹H NMR (CDCI₃,400 MHz) δ 8,97 (d, 1 H), 8,76 (d, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,10 (dd, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,40 (m, 1H), 7,05 (d, 1H), 7,00 (s, 1H),

6,85 (s, 1H), 5,31 (broad, 2H), 5,20 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 2,26 (m, 2H), 1,80-2,00 (m, 6H); MH⁺ 465; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 gm, 200 A, 25 cm; 25 % - 98 % acetonitril - 0,1 M octan amónny over 25 min, 1 ml/min) R, 12,23 min.

Príklad 6: N1-[5-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2(trifluórmetyl)fenyl]-1-benzénsulfónamid

a) N1-[4-bróm-2-(trifluórmetyl)fenyl]-1-benzénsulfónamid. Benzénsulfonylchlorid (1,06 g, 6,00 mmol) sa pridal po kvapkách do miešaného roztoku 4-bróm-2-(trifluórmetyl)-anilínu (1,20 g, 5,00 mmol) a pyridínu (1,98 g, 25,0 mmol) v dichlórmetáne (10 ml) pri 0 °C pod dusíkovou atmosférou. Zmes sa ohriala na teplotu miestnosti a miešala sa 16 hodín. Zmes sa zriedila etylacetátom (35 ml), premyla vodou (3x10 ml), 2 N kyselinou citrónovou (3 x 10 ml) a soľankou (10 ml), potom sa odparila vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom s použitím zmesi heptánu a dichlórmetánu 3:2 ako eluentu, čím sa získal N1-[4-bróm-2-(trifluórmetyl)fenyl]-1-benzénsulfónamid (1,3 g) ako biela tuhá látka. Ή NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 10,10 (1H, s), 7,60-8,16 (7H, m), 6,9 (1H, dd); t_R= 24,27 min (RP-HPLČ, 5-100 % acetonitril - 0,1 % TFA, 30 min)

b) N1-[5-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2(trifluórmetyl)fenyl]-1-benzénsulfónamid. Zmes N1-[4-bróm-2-(trifluórmetyl)fenyl]-1benzénsulfónamidu (0,5 g, 1,31 mmol), bis(pinakoláto)dibóru (0,402 g, 1,58 mmol), octanu draselného (0,387 g, 3,95 mmol) a [1,ľbis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládia(ll) (32 mg, 0,040 mmol) v DMF (10 ml) sa zahrievala pod dusíkovou atmosférou pri 100 °C počas 17 hodín. Zmes sa ochladila, pridalo sa [1,T-bis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládium(ll) (32 mg, 0,040 mmol) a zahrievanie na 100 °C pokračovalo ďalších 24 hodín. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a zvyšok sa rozotrel s 25 ml zmesi heptánu a r c r · <p ft r c r r r e « c .· r t t- r r e r r e r '· · c n r r r r f í O r r. C r- r r Γ r. r f - f dichlórmetánu 4:1 a tuhé látky sa oddelili filtráciou cez vrstvu celitu. Odstránením rozpúšťadla vo vákuu sa získal gumovitý zvyšok (0,42 g), z ktorého 123 mg (0,28 mmol) sa pridalo do zmesi 1,2-dimetoxyetánu (2,5 ml) a vody (1,25 ml). Uhličitan sodný (39 mg, 0,36 mmol), 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidín (50 mg, 0,144 mmol) a tetrakis (trifenylfosfín)paládium(O) (9,0 mg, 0,008 mol) sa pridali do zmesi, ktorá sa potom zahrievala na reflux pod dusíkovou atmosférou 16 hodín, ochladila sa a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (10 ml) a vodu (6 ml). Vodná vrstva sa oddelila a premyla etylacetátom (10 ml). Skombinované organické vrstvy sa odparili a zvyšok sa rozpustil v 1,4dioxáne (5 ml) a koncentrovanom vodnom hydroxide amónnom (5 ml) a potom sa zahrievali na 120 °C v zatavenej ampule počas 16 hodín. Rozpúšťadlá sa odstránili vo vákuu a čistením MPLC na reverznej fáze s použitím kolóny C18 a 25 - 75 % acetonitrilu - 0,1 % TFA, 25 min ako eluentu s nasledujúcou lyofilizáciou sa získal N1-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-(trifluórmetyl) fenylj1- benzénsulfónamid (9 mg) ako hnedastá amorfná látka. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 10,05 (1H,brs), 8,38 (1 H,s), 7,57-7,87 (10H, m), 7,09 (1H, d), 5,11 (1H, m),

2,14 (2H, m), 1,95 (4H, m), 1,7 (2H, m); MS s nízkym rozlíšením, m/e (MH⁺), 502; t_R = 16,78 min (RP-HPLC, 25-100 % acetonitril - 0,1 % TFA, 25 min)

Príklad 7: N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-djpyrimidin-5-yl)-2-fenylfeny I]-1 -benzénsulfónamid

a) 2-Amino-5-brómbifenyl. 2,4,4,6-tetrabróm-2,5-cyklohexadien-1-ón (12,1 g, 29,55 mmol) sa pridal po častiach do roztoku 2-aminobifenylu (5,0 g, 29,55 mmol) v dichlórmetáne (65 ml), pričom teplota sa udržiavala medzi -5 °C a -10 °C. Zmes sa nechala ohriať na teplotu miestnosti a miešala sa 20 hodín. Roztok sa extrahoval dvakrát 1 N hydroxidom sodným (1x 50 ml, 1 x 20 ml), potom sa vysušil nad MgSO₄, pridalo sa aktívne uhlie, prefiltroval sa cez celit a odparil, čím sa získal

2- amino-5-brómbifenyl (7,2 g) ako čierny olej, ktorý pri státí stuhol. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 7,36-7,48 (5H, m), 7,2 (1H, dd), 7,08 (1H, d), 6,7 (1H, d),

4,95 (2H, bs); MS s nízkym rozlíšením m/e 249 (MH⁺); tR = 16,03 min (RP-HPLC, 25 - 100% acetonitril - 0,1 % TFA, 25 min); ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) * 144,5, 138,2, 131,9, 130,6, 128,8, 128,5, 127,7, 127,3, 117,1, 107,1

Γ Γ f

Γ r. r r r Γ Γ f Γ f r r Γ

b) 1-(4-bróm-2-fenyl-fenyl)-1-benzénsulfónamid. Benzénsulfonylchlorid (1,71 g, 9,67 mmol) sa pridal po kvapkách pod dusíkovou atmosférou do miešaného roztoku 2-amino-5-brómbifenylu (2,0 g, 8,06 mmol) a pyridínu (3,19 g,

40,3 mmol) v dichlórmetáne (20 ml) pri < 0 °C. Zmes sa ohriala na teplotu miestnosti a miešala sa 16 hodín. Zmes sa potom zriedila etylacetátom (75 ml) a premyla vodou (3 x 15 ml), 2 N vodným roztokom kyseliny citrónovej (3 x 15 ml), soľankou (15 ml), vysušila sa nad MgSO₄, pridalo sa aktívne uhlie a prefiltrovala sa cez celit. Odparením rozpúšťadla vo vákuu sa získal N1-(4-bróm-2-fenylbenzén)-1benzénsulfónamid (2,9 g) ako hnedá tuhá látka. ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) * 9,62 (1 H, s), 7,34-8,07 (10 H, m), 7,19 (2 H, m), 7,01 (1 H, d); MS s nízkym rozlíšením m/e 388 (MH⁺); tR = 21,2 min (RP-HPLC, 25- 100 % acetonitril - 0,1 % TFA, 25 min)

c) N1-[2-fenyl-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-fenyl]-1benzénsulfónamide. Zmes N1-(4-bróm-2-fenylbenzén)-1-benzénsulfónamidu (0,388 g, 1,00 mmol), bis(pinakoláto)dibóru (0,305 g, 1,20 mmol), octanu draselného (0,294g, 3,00 mmol) a (1,ľ-bis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládia(ll) (25 mg, 0,030 mmol) v DMF (10 ml) sa zahrievala pod dusíkovou atmosférou pri 100 °C počas 16,5 hodiny. DMF sa odparil vo vákuu a zvyšok sa vyčistil flash chrómatografiou na oxide kremičitom s použitím dichlórmetánu a heptánu 7:3 plus 2 % trietylamínu, čím sa získal N1 -(4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-2fenylbenzén]-1-benzénsulfónamid (0,135 g) ako olej, t_R = 23,13 min (RP-HPLC, 25 -100 % acetonitril - 0,1 % TFA, 25 min); MS s nízkym rozlíšením m/e 434 (M-H⁺)

d) N1 -[4-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fenylfenyl]-1-benzénsulfónamid. Zmes uhličitanu sodného (57 mg, 0,54 mmol), 4-chlór7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (75 mg, 0,216 mmol), N1-[4(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-2-fenylbenzén]-1-benzénsulfónamidu (135 mg, 0,269mmol), tetrakis (trifenylfosfín)paládia(O) (12,5 mg, 0,0108 mmol), vody (1,25 ml) a DME (2,5 ml) sa zahrievala na reflux pod dusíkovou atmosférou počas 16 hodín, ochladila sa a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (10 ml) a vodu (5 ml). Organická vrstva sa odparila a zvyšok sa vyčistil flash chrómatografiou na silikagéle, čím sa získal N 1-(4-(2Γ Λ Γ C C r r f e ,> r r . r (. r c,'/·.· ' ' .í, ’ < ' J benzén-4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-fenyl]-1benzénsulfónamid (55 mg) ako hnedastá tuhá látka. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 9,56 (1H, s), 8,65 (1H, s), 8,03 (1H, s), 7,3-7,65 (12H, m), 7,08 (1H, d), 5,21 (1H, m), 2,17 (2H, m), 1,92 (4H, m), 1,71 (2H, m); t_R = 23,77 min (RP-HPLC, 25-100 % acetonitril - 0,1 % TFA, 25 min)

e) N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fenylfenyl]-1-benzénsulfónamid. Zmes N1-[4-(2-benzén-4-chlór-7-cyklopentyI-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-fenyl]-1-benzénsulfónamidu (55 mg, 0,104 mmol), koncentrovaného vodného roztoku hydroxidu amónneho (5 ml) a 1,4-dioxánu (5 ml) sa zahrievala na 120 °C v zatavenej ampule počas 16 hodín. Roztok sa ochladil na teplotu miestnosti a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Vyčistením pomocou MPLC na kolóne C18 eluentom 25 - 100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min s nasledujúcou lyofilizáciou sa získal N1-[4-(4-amino-2-benzén-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-fenyl]-1-benzénsulfónamid (14 mg) ako hnedastá tuhá látka. Ή NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 9,56 (1H, s), 8,13 (1H, s), 7,31-7,65 (13H, m), 7,1 (1H, d), 6,08 (2H, s), 5,07 (1H, m), 2,08 (2H, m), 1,9 (4H, m), 1,67 (2H, m); MS s nízkym rozlíšením m/e 510 (MH⁺); t_R = 19,22 min (RPHPLC, 25-100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min)

Príklad 8: 7-cyklopentyl-5-[1 -(fenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 H-5-indolyl]-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín

a) 5-bróm-1-(fenylsulfonyl)indolín. Benzénsulfonylchlorid (1,85 g, 10,53 mmol) sa pridal po kvapkách pod dusíkovou atmosférou do miešaného roztoku 5-, brómindolínu (2,0 g, 8,77 mmol) a pyridínu (3,47 g, 43,9 mmol) v dlchlórmetáne (30 ml) pri < 0 °C. Zmes sa ohriala na teplotu miestnosti a miešala sa 16 hodín. Zmes sa potom zriedila dichlórmetánom (30 ml) a premyla 2 N vodným roztokom kyseliny citrónovej (3 x 20 ml), soľankou (20 ml), vysušila sa nad MgSO₄, pridalo sa aktívne uhlie a prefiltrovala sa cez celit. Odparením rozpúšťadla vo vákuu sa získal 5-bróm1-(fenylsulfonyl)indolín (3,2 g). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 7,83 (2H, d), 7,68 (1H, t), 7,61 (2H, t), 7,31-7,43 (3H, m), 3,93 (2H, t), 2,92 (2H, t); t_R = 19,30 min (RPHPLC, 25-100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min)

C Γ

C r

b) 1 -(fenylsulfonyl)-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)indolín. Zmes 5-bróm-1-(fenylsulfonyl)indolínu (1,0 g, 3,07 mmol), bis(pinakoláto)dibóru (0,935 g, 3,68 mmol), octanu draselného (0,902 g, 9,202 mmol) a [1,ľbis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládia(ll) (88 mg, 0,092 mmol) v DMF (20 ml) sa zahrievala v dusíkovej atmosfére na 100 °C 16 hodín. DMF sa odparil vo vákuu, zvyšok sa rozotrel s toluénom (20 ml) a tuhý podiel sa oddelil filtráciou cez celit. Filtrát sa premyl vodou (3x15 ml), vysušil nad MgSO₄, prefiltroval a odparil, čím sa získal zvyšok, ktorý sa použil v surovom stave v nasledujúcom kroku. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 7,83 (2H, d), 7,43-7,68 (6H, m), 3,94 (2H, t), 2,94 (2H, t), 1,26 (12H, s); t_R = 21,23 min (RP-HPLC, 25 - 100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min;

c) 7-cyklopentyl-5-[1-(fenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-5-indolyl]-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín. Zmes uhličitanu sodného (92 mg, 0,087 mmol), 4chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (100 mg, 0,288 mmol), 1(fenylsulfonyl)-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)indolínu (200 mg, 0,431 mmol), tetrakis(trifenylfosfín)paládia(O) (17 mg, 0,0144 mmol), vody (3 ml) a DME (6 ml) sa zahrievala na reflux pod dusíkovou atmosférou počas 16 hodin, ochladila sa a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (10 ml) a vodu (5 ml). Organická vrstva sa odparila a zvyšok sa rozpustil v 1,4-dioxáne (6 ml) a koncentrovanom vodnom hydroxide amónnom (6 ml) a potom sa zahrievala na 120 °C v zatavenej ampule počas 16 hodín. Roztok sa ochladil a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Vyčistením na MPLC s reverznou fázou na kolóne C18, eluent 25 - 75 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min, s nasledujúcou lyofilizáciou sa získal 7-cyklopentyl-5-[1-(fenylsulfonyl)-2,3-dihydro1H-5-indolyl]-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (23 mg) ako hnedastá tuhá látka. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 8,11 (1 H, d), 7,85 (2H, d), 7,70 (1H, t), 7,54-7,61 (3H, m), 7,25-7,33 (3H, m), 6,0 (2H, s), 5,06 (1H, m), 3,96 (2H, t), 2,95 (2H, t), 2,11 (2H, m), 1,90 (4 H, m), 1,67 (2H, m); t_R = 16,37 min (RP-HPLC, 25- 100 % acetonitril 0,1 N octan amónny, 25min)

Príklad 9: N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl]-N 1 -metyl-1 -benzénsulfónamid

a) N1 -(4-bróm-2-chlórfenyl)-1 -benzénsulfónamid. Benzénsulfonylchlorid (2,11 g, 12,0 mmol) sa pridal po kvapkách pod dusíkovou atmosférou do miešaného roztoku 4-bróm-2-chlóranilínu (2,06 g, 10,0 mmol), pyridínu (3,95 g, 50 mmol) a dichlórmetánu (15 ml). Zmes sa miešala 3 hodiny, zriedila sa etylacetátom (75 ml) a premyla sa vodou (3 x 20 ml), soľankou (20 ml) a potom sa vysušila nad MgSO₄, prefiltrovala a odparila, čím sa získalo 3,2 g (92%) N1-(4-bróm-2chlórfenyl)-1-benzénsulfónamidu vo forme oranžovej tuhej látky. ¹H NMR (DMSOdg, 400 MHz) * 10,10 (1H, s), 7,7 (2H, d), 7,53-7,65 (4H, m), 7,46 (1H, d), 7,18 (1H,

d); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) * 140,0, 131,1, 133,0, 132,0, 130,8, 130,3, 129,2, 128,8, 126,6, 119,0; MS s nízkym rozlíšením m/e 346 (M-H⁺)

b) N 1-(4-bróm-2-chlórfenyl)-N1 -metyl-1 -benzénsulfónamid. N1-(4-bróm2-chlórfenyl)-1-benzénsulfónamid (1,0 g, 2,89 mmol) v DMF (8 ml) sa pridal pod dusíkovou atmosférou do zmesi hydridu sodného (0,14 g 60 % disperzie v minerálnom oleji, 3,47 mmol) v DMF (7 ml) pri 0 °C. K zmesi sa potom pridal jódmetán (0,452 g, 3,18 mmol), pričom teplota sa udržiavala na < 0 °C. Zmes sa ohriala na teplotu miestnosti, miešala sa 16 hodín a pridala sa voda (100 ml). Zmes sa extrahovala etylacetátom (3 x 20 ml) a spojené organické vrstvy sa premyli vodou (3 x 20 ml), vysušili nad MgSO₄, prefiltrovali a odparili, čím sa získal N1-(4bróm-2-chlórfenyl)-N1 -metyl-1 -benzénsulfónamid (0,55 g). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 7,87 (1H, s), 7,55-7,80 (6H, m), 7,00 (1H, d), 3,11 (3H, s); t_R = 19,58 min (RP-HPLC, 25-100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min)

c) N1-[2-chlór-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]-N1metyl-1-benzénsulfónamid. Zmes N1-(4-bróm-2-chlórfenyl)-N1-metyl-1benzénsulfónamidu (0,5 g, 1,389 mmol), bis(pinakoláto)dibóru (0,423 g, 1,66 mmol), octanu draselného (0,408 g, 4,167 mmol) a [1,ľbis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládia(ll) (34 mg, 0,042 mmol) v DMF (20 ml) sa zahrievala pod dusíkovou atmosférou pri 100 °C počas 16 hodín. DMF sa odparil vo vákuu, zvyšok sa rozotrel s toluénom (15 ml) a prefiltroval cez celit, čím sa získal N1-[2-chlór-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]-N1-metyl-178 ee e t e e e t e e e r e e c c e e e· r r r r f rr r r r r r f benzénsulfónamid (0,25 g) ako tmavý olej, ktorý sa použil v surovom stave v ďalšom kroku. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 7,93 (2H, d), 7,57-7,75 (5H, m), 7,07 (1H, d), 3,12 (3H, s), 1,29 (12H, s)

d) N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl]-N1-metyl-1 -benzénsulfónamid. Zmes uhličitanu sodného (92 mg, 0,087 mmol), 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (100 mg, 0,288 mmol), N1-[2-chlór-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]-N1-metyl-1benzénsulfónamidu (244 mg (72 % hmotnostných čistota), 0,432 mmol), tetrakis(trifenylfosfín)paládia(0) (17 mg, 0,0144 mmol), vody (3 ml) a DME (6 ml) sa zahrievala na reflux pod dusíkovou atmosférou 16 hodín, ochladila sa a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (20 ml) a vodu (10 ml). Organická vrstva sa odparila a zvyšok sa rozpustil v 1,4-dioxáne (7 ml) a koncentrovanom vodnom hydroxide amónnom (7 ml) a potom sa zahrievala na 120 °C v zatavenej ampule počas 16 hodín. Roztok sa ochladil a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Vyčistením pomocou MPLC s reverznou fázou na kolóne C18 eluentom 25 - 75% acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min s nasledujúcou lyofilizáciou sa získal N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)2-chlórfenyl]-N1-metyl-1-benzénsulfónamid (20 mg) ako hnedastá tuhá látka. ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 8,15 (1H, s), 7,74-7,80 (3H, m), 7,64-7,66 (2H, m), 7,60 (1H, s), 7,39 (1H, d), 7,08 (1H, d), 6,20 (2H, s), 3,16 (3H, s), 2,14 (2H, m), 1,91 (4 H, m), 1,69 (2H, m); MS s nízkym rozlíšením m/e 481 (M-H⁺); t_R = 22,45 min (RP-HPLC, 25 - 75 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min)

Príklad 10: N1-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2pyridyl]-1-benzénsulfónamid.

a) terc-Butyl N-(5-bróm-2-pyridyl)karbamát. Zmes 5-bróm-2pyridínamínu (4,0 g, 23,1 mmol) a di-terc-butyldikarbonátu (6,31 g, 28,9 mmol) v tetrahydrofuráne (50 ml) sa zahrievala na reflux 20 hodín. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Pridal sa dichlórmetán (30 ml) a etylacetát (30 ml) a zmes sa extrahovala nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (25 ml). Organická vrstva sa odparila vo vákuu a približne štvrtina zvyšku sa vyčistila flash e e chromatografiou na silikagéle použitím 95:5 n-heptánu/etyl acetátu ako eluentu, čím sa získal terc-butyl N-(5-bróm-2-pyridyl)karbamát (0,61 g) vo forme oleja. ’H NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 9,96 (1H,s), 8,34 (1H, d), 7,93 (1H, dd), 7,77 (1H, d), 1,47 (9H, s)

b) terc-Butyl N-[5-(1,1,1-trimetylstannyl)-2-pyridyl]karbamát. Zmes teŕcbutyl N-(5-bróm-2-pyridyl)karbamátu (0,5 g, 1,83 mmol), hexametyldicínu (0,6 g, 1,832 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)paládia(0) (130 mg, 0,107 mmol) a dimetoxyetánu (10 ml) sa zahrievala na 80 °C pod dusíkovou atmosférou 15 hodín. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Zvyšok sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom s použitím zmesi heptánu a etylacetátu (95:5) ako eluentu, čím sa získal terc-butyl N-fS-^JJ-trimetylstannyl^-pyridyljkarbamát (242 mg) ako olej: ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 9,31 (1H, s), 8,15 (1H, s), 7,65-7,72 (2H, m), 1,44 (9H, s), 0,24 (9H, s); MS s nízkym rozlíšením m/e 481

c) terc-Butyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)2-pyridyl]karbamát. Zmes terc-butyl N-[5-(1,1,1-trimetylstannyl)-2-pyridyl]karbamátu (230 mg, 0,644 mmol), 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (225 mg, 0,644 mmol), tris(dibenzylidénacetón)dipaládia(O) (30 mg, 0,0322 mmol), trifenylarzínu (50 mg, 0,161 mmol) a DMF (8 ml) sa zahrievala na 80 °C pod dusíkovou atmosférou počas 18 hodín. Zmes sa nechala ochladiť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok, ktorý sa rozdelil medzi vodu (5 ml) a etylacetát (20 ml). Organická vrstva sa oddelila a organická vrstva sa ďalej extrahovala vodou (5 ml) soľankou (5 ml), vysušila sa nad MgSO₄, prefiltrovala a odparila, čím sa získal zvyšok, ktorý sa vyčistil flash chromatografiou na silikagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (8:2) ako eluentu, čím sa získal terc-butyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamát (170 mg) ako hnedastá tuhá látka. ¹H NMR (DMSO-dg 400 MHz) δ 9,66 (1H, s), 8,58 (1H, s), 8,35 (1H, s), 7,89 (1H, s), 7,82 (2H, m), 5,2 (1H, m), 2,16 (2H, m), 1,92 (4H, m), 1,71 (2H, m), 1,47 (9H, s);

c: η « C

d) 5-(4-Chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2pyridinamín. Kyselina trifluóroctová (2 ml) sa pridala po kvapkách do roztoku tercbutyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2pyridyljkarbamátu (165 mg, 0,4 mmol) v dichlórmetáne (7 ml) pri 0 °C. Ľadový kúpeľ sa odstránil a reakčná zmes sa miešala pri teplote miestnosti 6 hodín. Rozpúšťadlá sa odstránili vo vákuu a zvyšok sa znova rozpustil v etylacetáte (55 ml) a premyl sa nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (10 ml), vysušil sa nad síranom horečnatým, prefiltroval a odparil, čím sa získal 5-(4-chlór7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinamín (133 mg): ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 8,63 (1H, s), 8,05 (1H, dd), 7,86 (1H, d), 7,55 (1H, d), 6,52 (1H, d), 6,06 (2H, bs), 5,20 (2H, m), 2,16 (2H, m), 1,97 (4H, m), 1,72 (2H, m); MS s nízkym rozlíšením, m/e (MH⁺) 314.

e) N1-[5-(4-chIór-7-cykIopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyľj1-benzénsulfónamid. Benzénsulfonylchlorid (366 mg, 2,07 mmol) sa pridal pod dusíkovou atmosférou do miešaného roztoku 5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinamínu (125 mg, 0,4 mmol) a pyridínu (294 mg,

3,7 mmol) v dichlórmetáne (10 ml). Zmes sa zahrievala na 80 °C počas 20 hodín v zatavenej ampule. Zmes sa ochladila a rozpúšťadlá sa odparili vo vákuu. Zvyšok sa znova rozpustil v dichlórmetáne (50 ml) a premyl sa nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (15 ml), vysušil sa nad MgSO₄, prefiltroval a odparil na zvyšok, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na sillkagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu ako eluentu, čím sa získal N1-[5-(4-chlór-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]-1-benzénsulfonamid (90 mg) ako hnedastá tuhá látka. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 11,3 (1 H, bs), 8,66 (1H, s), 8,2 (1H, bs), 7,89 -7,99 (4H, m), 7,54-7,62 (3H, m), 7,2 (1H, bs), 5,2 (1H, m), 2,16 (2H, m), 1,92 (4H, m), 1,71 (2H, m); MS s nízkym rozlíšením, m/e (MH⁺) 454.

f) N1-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2pyridyl]-1 -benzénsulfonamid. Zmes N1-[5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]-1-benzénsulfónamidu (90 mg), koncentrovaného vodného roztoku hydroxidu amónneho (5 ml) a 1,4-dioxánu (5 ml) sa zahrievala na 120 °C v zatavenej ampule počas 16 hodín. Roztok sa ochladil na teplotu miestnosti a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Vyčistením pomocou MPLC na kolóne C18 eluentom 25 - 100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min s nasledujúcou lyofilizáciou sa získal N1-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]-1-benzénsulfónamid (20 mg) ako hnedastá tuhá látka. ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 8,12 (1H, s), 8,08 (1H, bs), 7,92 (2H, d), 7,79 (2H, d), 7,60 (3H, m), 7,44 (1 H, s), 7,23 (1H, d), 6,19 (2H, bs), 5,05 (1H, m), 2,10 (2H, m), 1,91 (4H, m), 1,67 (2H, m); MS s nízkym rozlíšením m/e 435 (MH⁺).

Príklad 11: N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl]-2-kyano-1-benzénsulfónamid

a) 5-(4-Amino-3-chlórfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidín-4amín. Príklad 11 bol pripravený pomocou rovnakej metódy ako pre 5-(4-amino-3metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín. ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,10 (s, 1H), 7,29 (s, 2H), 7,12 (dd, 1H), 6,88 (d, 1H), 6,00 (broad, 2H), 5,41 (s, 2H), 5,06 (m, 1H), 2,09 (m, 2H), 1,87 (m, 4H), 1,68 (m, 2H); MH⁺329; TLC (etylacetát) R, 0,27; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 μπι, 200 A, 25 cm; 25 % - 100 % acetonitril - 0,1 M amónium acetát v priebehu 25 min, 1 ml/min) R, 14,02 min.

b) N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl]-2-kyano-1-benzénsulfónamid. Zmes 5-(4-amino-3-chlórfenyl)-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amínu (0,098 g, 0,30 mmol), 2kyanobenzénsulfonylchloridu (0,072 g, 0,36 mmol) a pyridínu (0,98 ml) sa miešala pri teplote miestnosti počas 16 h. Väčšina pyridínu sa odstránila za zníženého tlaku a zvyšok sa vyčistil preparatívnou RP-HPLC (Rainin C18, 8 :m, 300 A, 25 cm; 25 % - 100 % acetonitrilu - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 21 ml/min), čím sa získal N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl]-2kyano-1-benzénsulfónamid ako biela tuhá látka (0,025 g, 0,05 mmol): ’H NMR (CDCI₃, 400 MHz) δ 8,31 (s, 1H), 8,17 (d, 1H), 7,70-7,82 (m, 5H), 7,44 (s, 1H), 7,40(dd, 1H), 7,00 (s, 1H), 5,27 (široký, 2H), 5,00 (m, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,79-1,90 (m, 6H); MH⁺493; TLC (etylacetát) R, 0,30; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25%-100% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) R, 15,27 min.

r f:

Príklad 12: N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl]-3-kyano-1-benzénsulfónamid.

Zlúčenina príkladu 12 sa pripravila tou istou metódou ako N1-[4-(4-Amino-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidÍn-5-yl)-2-chlórfenyl]-2-kyano-1benzénsulfónamid (príklad 11).

¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8,30 (s, 1H), 8,07 (m, 2H), 7,86 (d, 1H), 7,73 (d, 1H), 7,65 (dd, 1H), 7,43 (s, 2H), 7,05 (s, 1H), 5,30 (široký, 2H), 5,20 (m, 1H), 2,44 (m, 2H), 1,77-1,89 (m, 6H); MH⁺493; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25%-98% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) Rt 15,52 min.

Príklad 13: N3-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl]-3-pyridínsulfónamid.

Zlúčenina príkladu 13 sa pripravila tou istou metódou ako N1-[4-(4-Amino-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl]-2-kyano-1benzénsulfónamid I (príklad 11).

¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8,97 (s, 1H), 8,81 (dd, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,13 (dd, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,02 (s, 1H), 5,21 (m, 1H), 5,06 (široký, 2H),

2,24 (m, 2H), 1,78-1,89 (m, 6H); MH⁺469; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25%-98% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) R, 13,03 min.

Príklad 14: N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl]-2-trifluôrmetyl-1-benzénsulfónamid.

Zlúčenina príkladu 14 sa pripravila tou istou metódou ako N1-[4-(4-Amino-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl]-2-kyano-1benzénsulfónamid (príklad 11).

¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz) δ 8,33 (s, 1H), 8,09 (d, 1H), 7,92 (d, 1H), 7,72 (m, 2H), 7,64 (m, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,36 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 5,21 (viacnásobný, 1H), 5,01 (široký, 2H), 2,25 (m, 2H), 1,77-1,91 (m, 6H); MH⁺ 536; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25%-98% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) R, 18,15 min.

Príklad 15: N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2chlórfenyl]-3-trifluórmetyl-1-benzénsulfónamid.

Zlúčenina príkladu 15 sa pripravila tou istou metódou ako N1-[4-(4-Amino-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl]-2-kyano-1benzénsulfónamid (príklad 11).

¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz) δ 8,29 (s, 1H), 8,04 (d, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,65 (m, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,07 (s, 1H), 6,01 (široký, 2H), 5,20 (m, 1H), 2,27 (m, 2H), 1,79-1,90 (m, 6H); MH⁺536; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25%-98% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) R, 18,43 min.

Príklad 16: N1-4-[4-amino-7-(3-hydroxycyklopentyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl]-2-chlórfenyl-1-benzénsulfónamid

a) 4-(4-chlór-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-2-cyklopenten-1-ol. Dimetylsulfoxid (3,5 ml) sa zbavil plynov a potom sa miešal pod dusíkovou atmosférou. Reakčná nádoba sa chránila pred svetlom a pridal sa 4-chlór-5-jód-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidín (570 mg, 2,03 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)paládium(0) (0,05 g, 0,041 mmol). Reakčná zmes sa miešala 2 minúty a potom sa ochladila na 0 °C. K zmesi sa potom pridal 2,4a-dihydro-1aH-cyklopenta[b]oxirén (200 mg, 2,44 mmol), ktorý bol rozpustený v tetrahydrofuráne (3,5 ml) a pridal sa po kvapkách v priebehu približne 15 minút. Reakčná zmes sa miešala pri 0 °C tri hodiny, potom sa ohriala na teplotu prostredia a miešala sa 15 hodín. K zmesi sa potom pridala ďalšia dávka epoxidu (85 mg, 1,04 mmol) a tetrakis(trifenylfosfín)paládia(0) (0,025 g, 0,020 mmol) a miešania pokračovalo ďalších 24 hodín. Zmes sa potom rozdelila medzi etylacetát (20 ml) a vodu (20 ml). Vrstvy sa oddelili a vodná vrstva sa premyla dichlórmetánom (3 x 20 ml). Organické vrstvy sa spojili, premyli sa vodou (20 ml), vysušili sa síranom horečnatým, prefiltrovali a odparili. Vyčistením zvyšku MPLC na reverznej fáze pomocou kolóny C18 a 25 - 50 % acetonitrilu - 0,1 N octanu amónneho, 15 min, ako eluentu s nasledujúcim odparením acetonitrilu a oddelením získanej tuhej látky filtráciou sa získal 4-(4-chlór-5-jód-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-7-yl)-2-cyklopenten-1-ol (365 mg) ako hnedastá tuhá látka. ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 8,66 (1H, s), 7,87 (1H, s), 6,20 (1H, m), 5,93 (1H, m), 5,77 o r .f,.· ..

(1H, m), 5,27 (1H, d), 4,72 (1H, m), 2,89 (1H, m), 1,62 (1H, m);¹³C NMR (DMSO-d_e, 100 MHz) * 150,9, 150,4, 149,9, 139,7, 133,8, 130,9, 116,2, 73,5, 57,8, 52,2, 41,1; MS s nízkym rozlíšením m/e 362 (MH⁺).

b) N1-2-chlór-4-[4-chlór-7-(4-hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yljfenyl-1-benzénsulfónamid. Zmes uhličitanu sodného (130 mg, 1,213 mmol), 4-(4-chlór-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-2-cyklopenten-1-olu (175 mg, 0,485 mmol), N1-[2-chlór-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2yl)fenyl]-1-benzénsulfónamidu (475 mg, 0,727 mmol), tetrakis(trifenylfosfín)paládia(0) (30 mg, 0,024 mmol), vody (4 ml) a DME (8 ml) sa zahrievala na reflux pod atmosférou dusíka 16 hodín, ochladila sa a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (20 ml) a vodu (5ml). Vodná vrstva sa premyla ďalším etylacetátom (20 ml) a dichlórmetánom (2 x 20 ml). Spojené organické vrstvy sa vysušili nad MgSO₄, prefiltroval a odparili, čím sa získal olej, ktorý počas státia stuhol. Vyčistením flash chromatografiou na silikagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (7:3) ako eluentu sa získal N1-2-chlór-4-[4chlór-7-(4-hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrolo[2,3-djpyrimidin-5-yljfenyl-1benzénsulfónamid (45 mg) vo forme hnedastej tuhej látky. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 10,06 (1H, s), 8,69 (1H, s), 7,29-7,80 (9H, m), 6,19 (1H, m), 5,96 (1H, m),

5,85 (1H, m), 5,22 (1H, d), 2,92 (1H, m), 1,68 (1H, m); MS s nízkym rozlíšením m/e 501 (MH⁺); t_R = 14,82 min (RP-HPLC, 25-100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min).

c) N1-4-[4-amino-7-(4-hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl]-2-chlórfenyl-1-benzénsulfónamid. N1-2-chlór-4-[4-chlór-7-(4hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]fenyl-1-benzénsulfónamid (45 mg) sa rozpustil v 1,4-dioxáne (7 ml) a vodnom koncentrovanom hydroxide amónnom (7 ml) a zahrieval sa na 120 °C v zatavenej ampule 16 hodín. Roztok sa ochladil a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu, čím sa získal N1-4-[4-amino-7-(4hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-chlórfenyl-1benzénsulfónamid, ktorý sa použil bez ďalšieho čistenia v nasledujúcom kroku. MS s nízkym rozlíšením m/e 482 (MH⁺); t_R = 10,75 min (RP-HPLC, 25 - 100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min).

Γ I“

Γ Id) N1-4-[4-amino-7-(3-hydroxycyklopentyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl]-2-chlórfenyl-1-benzénsulfónamid. Zmes alkénu (45 mg) a 10% paládia na uhlíku (25 mg) sa miešala pod atmosférou vodíka pri teplote miestnosti a atmosférickom tlaku 19 hodín, prefiltrovala sa cez 0,2 pm filtračnú vložku a rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Vyčistením pomocou MPLC s reverznou fázou na kolóne C18 eluentom 25 - 100 % acetonitril - 0,1 N octan amónny, 25 min s nasledujúcou lyofilizáciou sa získal N1-4-[4-amino-7-(3-hydroxycyklopentyl)-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-chlórfenyl-1-benzénsulfónamid (20 mg) ako hnedastá tuhá látka. Ή NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) * 10,03 (1H, bs), 8,15 (1H, s), 7,77 (2H, d), 7,29-7,67 (7H, m), 6,12 (1H, bs), 5,14 (1H, m), 4,98 (1H, d), 4,23 (1H, d), 2,37 (1H, m), 2,02-2,12 (2H, m) < 1,77 (3H, m); MS s nízkym rozlíšením m/e 484(MH⁺); t_R =11,00 min (RP-HPLC, 25-100 % acetonitril - 0,1 N octan sodný, 25 min)

Príklad 17: Neopentyl N-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)-2-metoxyfenyl)karbamát

Neopentylchlórformiát (28 μΙ, 0,186 mmol) sa pridal po kvapkách do miešaného roztoku 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-amínu (50 mg, 0,155 mmol) v pyridíne (1 ml) a dichlórmetáne (1 ml) pod dusíkom pri 0 °C. Po 10 minútach sa kúpeľ s ľadovou vodou odstránil a získaná zmes sa miešala 4 hodiny. Rozpúšťadlo sa odparilo a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte. Organická vrstva sa premyla, vysušila a odparila. Tuhá látka sa vyčistila preparatívnou TLC pomocou zmesi dichlórmetánu a metanolu (95:5) ako mobilnej fázy, čím sa získal neopentyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát. ¹H NMR (CDCI₃) * 1,00 (s 9H), 1,78 (m, 2H), 1,90 (m, 4H), 2,26 (m, 2H), 3,91 (s, 2H), 3,94 (s, 3H), 5,22 (m, 3H), 6,22 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 7,08 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,25 (s, 1H), 8,17 (br, d, 1H), 8,32 (s, 1H); LC/MS (MH⁺= 438).

Príklad 18: 3-Pyridylmetyl N-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin5-yl)-2-metoxyfenyl)karbamát

a) 4-Nitrofenyl (3-pyridylmetyl)karbonát. N-Metylmorfolín (2,0 ml, 18,5 mmol) sa pridal po kvapkách do roztoku p-nitrofenylchlórformiátu (2,49 g, 12,3 mmol) v dichlórmetáne (20 ml) s miešaním pod dusíkom pri 0 °C. Po 20 minútach sa kúpeľ s ľadovou vodou odstránil a zmes sa nechala ohriať na teplotu prostredia.

t! β o «' r n r o e · n e o · t r e e r r e r r r r C r

Do zmesi sa pridal 3-pyridylkarbinol (1,0 ml, 10,3 mmol) a získaný roztok sa miešal 30 minút. Reakčná zmes sa zriedila etylacetátom a premyla vodou, nasýteným hydrogenuhličitanom sodným a soľankou. Organická vrstva sa vysušila (MgSOJ, prefiltrovala a odparila, čím sa získala tmavohnedá tuhá látka. Táto tuhá látka sa prekryštalizovala z etylacetátu a heptánu, čím sa získal 4-nitrofenyl (3pyridylmetyl)karbonát. ¹H NMR (CDCI₃) * 5,32 (s, 2H), 7,38 (m, 3H), 7,79 (m 1H), 7,28 (m, 2H), 8,66 (d, J = 4 Hz, 1 H), 8,72 (s, 1H).

b) 3-Pyridylmetyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát. 4-Nitrofenyl (3-pyridylmetyl)karbonát (111 mg, 0,405 mmol) sa pridal do roztoku 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-amínu (79 mg, 0,244 mmol) v pyridíne (1 ml) a po ňom katalytické množstvo Ν,Ν-dimetylpyridínu. Získaná zmes sa miešala pod dusíkom pri teplote miestnosti 2 dni. Rozpúšťadlo sa odparilo a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte. Organická vrstva sa premyla, vysušila a odparila. Tuhá látka sa vyčistila preparatívnou TLC pomocou zmesi dichlórmetánu a metanolu (95:5) ako mobilnej fázy, čím sa získal 3-pyridylmetyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát. ¹H NMR (CDCI₃) * 1,78 (m, 2H), 1,90 (m, 4H), 2,26 (m, 2H), 3,91 (s, 3H), 5,25 (m, 5H), 6,98 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 7,09 (d, J= 8 Hz, 1 H) 7,32 (m, 1H), 7,77 (d, J=8 Hz, 1H), 8,20 (br, d, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,64 (m, 1H), 8,70 (s, 1H); LC/MS (MH⁺= 459).

c) 3-Pyridylmetyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát hydrochlorid. 3-Pyridylmetyl N-[4-(4-amino-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyI]karbamát (50 mg, 0,109 mmol) sa rozpustil v etylacetáte (3,0 ml). Zmes sa ochladila na 0 °C a nechal sa ňou prechádzať plynný chlorovodík počas pol minúty. Okamžite sa vytvorila zrazenina. Banka sa uzavrela a roztok sa miešal ďalších 10 minút pri 0 °C. Tuhá látka sa oddelila filtráciou, čím sa získal 3-pyridylmetyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát hydrochlorid. ’H NMR (DMSO-d₆) * 1,72 (m, 2H), 1,93 (m, 4H), 2,16 (m, 2H), 3,87 (s, 3H), 5,15 (m, 1H), 5,26 (s, 1H), 7,06 (d, J=2 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 7,64 (d, J= 5 Hz, 1 H) 7,81 (m, 2H), r c

8,10 (d, J=8 Hz, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,66 (d, J=5 Hz1H), 8,78 (s,1H), 8,87 (s, 1H); LC/MS (MH⁺=459)

Príklad 19: 3-Chlórcyklohexyl N-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl)karbamát

3-Chlórcyklohexylchlórformiát (34 mg, 0,186 mmol) sa pridal po kvapkách do miešaného roztoku 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-amínu (50 mg, 0,155 mmol) v pyridíne (1 ml) a dichlórmetáne (1 ml) pod dusíkom pri 0 °C. Po 10 minútach sa kúpeľ s ľadovou vodou odstránil a získaná zmes sa miešala 4 hodiny. Rozpúšťadlo sa odparilo a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte. Organická vrstva sa premyla, vysušila a odparila. Tuhá látka sa vyčistila preparativnou TLC pomocou zmesi dichlórmetánu a metanolu (95:5) ako mobilnej fázy, čím sa získal 3-chlórcyklohexyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyŕolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát. ¹H NMR (CDCI₃) * 1,46 (m, 2H), 1,78 (m, 4H), 1,88 (m, 4H), 2,00 (m, 2H), 2,28 (m, 4H), 3,93 (m, 4H), 4,84 (m, 1H), 5,22 (m, 1 H),5,27 (s, 2H), 6,97 (s, 1H), 7,03 (s, 1H), 7,08 (d, J= 8 Hz, 1 H),

7,31 (s, 1H), 8,18 (br, d, 1H), 8,32 (s, 1H); LC/MS (MH⁺= 484).

Príklad 20: N-(4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl)-N'-benzylmočovina

Benzylizokyanát (24 μΙ, 0,194 mmol) in dichlórmetáne (1 ml) sa pridal po kvapkách do miešaného roztoku 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amínu (50 mg, 0,155 mmol) v N.N-diizopropyletylamíne (153 μΙ, 0,881 mmol) a dichlórmetáne (2 ml) pod dusíkom. Získaná zmes sa miešala 24 hodín. Rozpúšťadlo sa odparilo a tuhá látka sa vyčistila preparativnou TLC pomocou zmesi dichlórmetánu a metanolu (95:5) ako mobilnej fázy, čím sa získala N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]N'-benzylmočovina. ¹H NMR (CDCI₃) * 1,78 (m, 2H), 1,90 (m, 4H), 2,26 (m, 2H),

3,86 (s, 3H), 4,48 (d, J=6 Hz, 3H), 5,24 (m, 4H), 6,93 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,04 (d, J= 8 Hz, 1 H), 7,29 (m, 5H), 8,17 (d, J=8 Hz, 1H), 8,31 (s, 1H); LC/MS (MH⁺= 457).

r c

3·3, ..··

Príklad 21: Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfe nyl]ka rba mát.

Zmes 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4amínu (0,025 g, 0,08 mmol), benzylchlórformiátu (0,016 g, 0,09 mmol), pyridínu (0,50 ml) a dichlórmetánu (0,50 ml) sa miešala pri teplote miestnosti cez víkend a vyliala sa do vody. Získaná zrazenina sa oddelila filtráciou a vyčistila stĺpcovou flash chrómatografiou na oxide kremičitom pomocou zmesi etylacetátu a n-heptánu (9:1) ako mobilnej fázy, čím sa získal benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát ako biela tuhá látka (0,002 g, 0,004 mmol): ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8,64 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,34-7,45 (m, 6H), 7,10 (d, 1H), 7,02 (dd, 1H), 6,08 (široký, 2H), 5,16 (s, 2H), 5,08 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 2,11 (m, 2H), 1,91 (m, 4H), 1,69 (m, 2H); MH⁺458; TLC (etylacetát) R, 0,32; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25 % - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) Rt 19,00 min.

Príklad 22: Benzyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyljkarbamát

a) 5-bróm-2-metoxyanilín. Zmes 4-bróm-1-metoxy-2-nitrobenzénu (3,0 g, 12,9 mmol) a ľadovej kyseliny octovej (25 ml) sa zahrievala na 100 °C pod dusíkovou atmosférou. Pridalo sa práškové železo (2,2 g, 38,8 mmol) a zmes sa miešala jednu hodinu pri teplote 100 °C. Zmes sa ochladila na teplotu miestnosti, pridala sa voda (100 ml) a zmes sa extrahovala etylacetátom (3 x 25 ml). Spojené organické extrakty sa premyli nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (3 x 25 ml) a potom soľankou. Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok. Vyčistením látky flash chrómatografiou na silikagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (6:4) ako eluentu sa získal 5-bróm-2-metoxyanilín (2,0 g): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 6,76 (s, 1H), 6,71 (d, 1H), 6,61 (d, 1H), 4,99 (bs, 2H), 3,74 (s, 3H); (TLC (heptán/etyl acetát 1:1) R_f 0,5; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan sodný v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t=13,33 min; MS: MH⁺ 443.

Γ. π

b) ŕerc-Butyl N-(5-bróm-2-metoxyfenyl)karbamát. Zmes 5-bróm-2metoxyanilínu (1,50 g, 7,43 mmol) a di-ŕerc-butyldikarbonátu (1,95 g, 8,91 mmol) v THF (20 ml) sa zahrievala na reflux 20 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Získaný olej sa vyčistil flash chromatografiou na silikagéle pomocou zmesi etylacetátu a heptánu (1:9) ako eluentu, čím sa získal ŕerc-butyl N-(5-bróm-2-metoxyfenyl)karbamát (2,19 g) ako bezfarebný olej: ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,05 (s, 1H), 7,93 (d, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,95 (d, 1H), 3,8 (s, 1H), 1,47 (s, 9H); TLC (etylacetát/heptán 2:8) R, 0,4; RPHPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 21,8 min.

c) ŕerc-butyl N-[2-metoxy-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2yl)fenyl]karbamát. Zmes ŕerc-butyl N-(5-bróm-2-metoxyfenyl)karbamátu (1,10 g,

3,64 mmol), dibórpinacolesteru (1,11 g, 4,37 mmol), [1,ľbis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládnatého komplexu s dichlórmetánom (1:1) (0,09 g, 0,11 mol) a octan draselný (1,07 g, 10,9 mol) v N,N-dimetylformamide (20 ml) sa zahrievala na 80 °C pod dusíkovou atmosférou 16 hodín. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. K zvyšku sa pridal dichlórmetán (20 ml) a získaná tuhá látka sa oddelila filtráciou cez vrstvu celitu. Filtrát sa nakoncentroval a zanechal žltý olej, ktorý sa vyčistil flash chromatografiou na oxide kremičitom pomocou zmesi etylacetátu a heptánu (2:8) ako mobilnej fázy, čím sa získal ŕerc-butyl N-[2-metoxy-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamát (0,96 g): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,03 (s, 1H), 7,86 (s, 1H) , 7,35 (d, 1H), 7,0 (d, 1H), 3,82 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,28 (s, 12H); TLC (etyl acetát/heptán 2:8) R, = 0,35; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t=22,8 min

d) ŕerc-butyl N-(5-(chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl)karbamát. Zmes 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3djpyrimidínu (0,35 g, 1,0 mmol), ŕerc-butyl N-[2-metoxy-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamátu (0,524 g, 1,5 mmol), tetrakis(trifenylfosfín)paládia (0,07 g, 0,06 mmol) a uhličitanu sodného (0,265 g, 2,5 r r r o

f. e c ♦* o e o i r

C r r < e ,· r C

ΟΠ Γ e c n r ( □ U .· c r r o n r r O < C r mmol) sa zahrievala v zmesi etylénglykoldimetyléteru (10 ml) a vody (5 ml) na 80 °C 18 hodín pod dusíkovou atmosférou. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlá sa odstránili za zníženého tlaku. Zmes sa rozdelila medzi vodu (15 ml) a etylacetát (25 ml), organická vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa ďalej extrahovala etylacetátom (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty sa premyli vodou (3 x 20 ml), vysušili nad síranom horečnatým, prefiltrovali a filtrát sa nakoncentroval na olejovitý zvyšok za zníženého tlaku. Materiál sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (5:1) ako eluentu, čím sa získal ŕerc-butyl N-(5-(chlór-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl)karbamát (0,325 g): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,64 (s, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,87 (m, 2H), 7,17 (d, 1H), 7,06 (d, 1H), 5,21 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 1,65-2,25 (m, 8H), 1,45 (s, 9H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan sodný v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t=24,25 min, MS: MH* 443.

e) 5-(3-Amino-4-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4amín. Roztok ŕerc-butyl N-(5-(chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl)karbamátu (0,325 g, 0,735 mmol) v dichlórmetáne (14 ml) sa ochladil na 0 °C a pridala sa kyselina trifluóroctová (1,4 ml). Roztok sa miešal pri 0 °C 5 minút, potom sa ohrial na teplotu prostredia a miešal sa ďalších 16 hodín. Rozpúšťadlá sa odparili za zníženého tlaku, zvyšok sa rozdelil medzi dichlórmetán (30 ml) a nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného (10 ml). Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získala pena. Materiál sa potom rozpustil v dioxáne (4 ml) a koncentrovanom (28 - 30 %) hydroxide amónnom (4 ml) a získaný roztok sa zahrieval na 120 C v zatavenej tlakovej ampule 20 hodin. Rozpúšťadlá sa odparili a zvyšok sa vyčistil preparatívnou C18 RP-HPLC, čím sa po lyofilizácii získal 5-(3amino-4-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (85 mg): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,10 (s,1H), 7,21 (s, 1H), 6,87 (d, 1H), 6,74 (s,1H), 6,58 (d, 1H), 5,06 (1H, m), 4,87 (bs, 2H), 3,8 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t =11,87 min; MS: MH⁺ 324.

c. r r r r r f r c

C r ľ r r r .

ľ..' A A

f) Benzyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]karbamát. Roztok 5-(3-amino-4-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amínu (40 mg, 0,124 mmol) v dichlórmetáne (1 ml) a pyridíne (1 ml) sa ochladil na 0 °C a potom sa pridal benzylchlórformiát (32 mg, 0,186 mmol), pričom sa udržiavala teplota menej ako 5 °C. Roztok sa miešal ďalšiu 1 hodinu a rozpúšťadlá sa odstránili za zníženého tlaku. Vyčistením preparatívnou C-18 RP-HPLC a lyofilizáciou sa získal benzyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát (25 mg) vo forme bieleho prášku: ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,75 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,17,4 (m, 8H), 6,2 (bs, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,07 (m, 1H), 3,8 (s 3H), 1,6-2,2 (m, 8H), RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 18,63 min; MS: MH⁺458.

Príklad 23: Benzyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2pyridyljkarbamát

a) ŕerc-Butyl N-(5-bróm-2-pyridyl)karbamát. Zlúčenina sa pripravila z 5bróm-2-pyridínamínu spôsobom opísaným pre zlúčeninu (2): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,96 (s, 1H), 8,49 (d, 1H), 7,93 (dd, 1H), 7,78 (d, 1H), 1,47 (s, 9H); TLC (etylacetát/heptán 5:95) R, 0,28; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 18,50 min.

b) ŕerc-Butyl N-[5-(1,1,1-trimetylstannyl)-2-pyridyl]karbamát. Zmes tercbutyl N-(5-bróm-2-pyridyl)karbamátu (1,67 g, 6,12 mmol), hexametyldicínu (2,0 g, 6,12 mmol) a tetrakis(trifenylfosfín)paládia (0,424 g, 0,367 mmol) v etylénglykoldimetyléteri (30 ml) sa zahrievala na 80 °C pod dusíkovou atmosférou 15 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Získaný materiál sa vyčistil flash chrómatografiou na silikagéle s použitím zmesi heptánu a etylacetátu (95:5) ako eluentu, čím sa získal ŕerc-butyl N[5-(1,1,1-trimetylstannyl)-2-pyridyl]karbamát (1,11 g): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,98 (s, 1H), 8,2 (t, 1H), 7,74 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 0,30 (t, 9H); TLC (heptán/etylacetát 95:5) R, 0,2; MS: MH⁺ 359.

r r c r r r f. r r :Λλί''·^:

c) terc-Butyl N-[5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)2-pyridyl]karbamát. Zmes 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (0,25 g, 0,72 mmol), terc-butyl N-[5-(1,1,1-trimetylstannyl)-2-pyridyl)karbamátu (0,386 g, 1,08 mmol), tris(dibenzylidénacetón)dipaládia(O) (0,033 g, 0,076 mmol) a trifenylarzínu (0,055 g, 0,18 mmol) v N,N-dimetylformamide (8 ml) sa zahrievala na 65 °C pod dusíkovou atmosférou 18 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Získaný materiál sa vyčistil flash chromatografiou na silikagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (75:25) ako eluentu, čím sa získal terc-butyl N-[5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamát (0,13 g): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,83 (s, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,85-7,93 (m, 2H), 5,21 (m, 1H), 1,65-2,25 (m, 8H), 1,49 (s, 9H); TLC (heptán/etyl acetát 8:2) R_f 0,18; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t_r = 21,68 min.

d) 5-(4-Chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridín-4amín. Roztok terc-butyl N-[5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)2-pyridyl]karbamátu (0,13 g, 0,315 mmol) v dichlórmetáne (5,5 ml) sa ochladil na 0 °C a pridala sa kyselina trifluóroctová (0,6 ml). Roztok sa miešal pri 0 °C 5 minút, potom sa ohrial na teplotu prostredia a miešal sa ďalších 18 hodín. Rozpúšťadlá sa odparili za zníženého tlaku, zvyšok sa rozdelil medzi dichlórmetán (30 ml) a nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného (10 ml). Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal 5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridín-4amín (92 mg): RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t=10,73 min; MS: MH⁺314.

e) 5-(6-Amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín. 5-(4-Chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridín-4-amín (92 mg, 0,291 mmol) sa rozpustil v dioxáne (2 ml) a koncentrovanom (28 - 30 %) hydroxide amónnom (2 ml) a získaný roztok sa zahrieval na 120 °C v zatavenej tlakovej ampule 24 hodín. Rozpúšťadlá sa odparili, čím sa získal 5-(6-amino-3-pyridyl)-7r f

P .' f C ·>

r r f c c c r r r r c c cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (105 mg): RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t_r = 10,73 min; MS: MH⁺ 295.

f) N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2pyridyl]karbamát. Roztok 5-(6-amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-amínu (105 mg, 0,29 mmol) v dichlórmetáne (1,5 ml) a pyridine (1,5 ml) sa ochladil na 0 °C a potom sa pridal benzylchlórformiát (75 mg, 0,44 mmol), pričom sa udržiavala teplota menej ako 5 °C. Roztok sa ohrial na teplotu miestnosti a miešal sa 3 hodiny. Pridal sa benzylchlórformiát (75 mg, 0,44 mmol) a zmes sa miešala 18 hodín, pridal sa ďalší benzylchlórformiát (75 mg, 0,44 mmol) a zmes sa miešala ďalších 24 hodín. Pridal sa benzylchlórformiát (150 mg, 0,88 mmol) a pyridín (1 ml) a zmes sa miešala ďalších 24 hodín. Rozpúšťadlá sa odparili za zníženého tlaku a zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (25 ml) a vodu (10 ml). Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok. Vyčistením preparatívnou C-18 RPHPLC a rozotretím s dietyléterom sa získal N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamát (21 mg) vo forme bieleho prášku: ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 10,33 (s, 1H), 8,36 (d, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,91 (d, 1H),

7,84 (d, 1H), 7,33-7,47 (m, 6H), 6,11 (bs, 2H), 5,2 (s, 2H), 5,06 (m, 1H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 gm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 16,22 min; MS: MH⁺429.

Príklad 24: Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3metoxyfenyljkarbamát

a) 4-bróm-3-metoxyanilín. Zmes 1-bróm-2-metoxy-2-metoxy-4nitrobenzénu (3,0 g, 12,9 mmol) a ľadovej kyseliny octovej (25 ml) sa zahrievala na 100 °C pod dusíkovou atmosférou. Pridalo sa práškové železo (2,2 g, 38,8 mmol) a zmes sa miešala jednu hodinu pri teplote 100 °C. Zmes sa ochladila na teplotu miestnosti, pridala sa voda (100 ml) a zmes sa extrahovala etylacetátom (3 x 25 ml). Spojené organické extrakty sa premyli nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (3 x 25 ml) a potom soľankou. Organický roztok sa e·· ··<-<- rr e e f · e «- r f f e r e r * *»*<·. c r r r r r c rec r r.

vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok. Vyčistením látky flash chromatografiou na silikagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (6:4) ako eluentu sa získal 4-bróm-3-metoxyanilín (1,22 g): ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7,1 (d, 1H), 6,31 (s, 1H), 6,1 (d, 1H), 5,27 (bs, 2H), 3,72 (s, 3H); TLC (heptán/etyl acetát 1:1) R_f 0,33; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan sodný v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_f = 11,05 min.

b) ŕerc-Butyl N-(4-bróm-3-metoxyfenyl)karbamát. Zlúčenina sa pripravila z 4-bróm-3-metoxyanilínu spôsobom opísaným pre zlúčeninu (2): ’H NMR (DMSOde, 400 MHz) δ 9,46 (s, 1H), 7,4 (d, 1H), 7,35 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 3,78 (s, 3H), 1,48 (s, 9H); TLC (heptán/etyl acetát 8:2) R_f 0,37; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 18,60 min.

c) ŕerc-butyl N-[3-metoxy-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2yl)fenyl]karbamát. Zlúčenina sa pripravila z ŕerc-butyl N-(4-bróm-3metoxyfenyl)karbamátu spôsobom opísaným pre zlúčeninu (3): ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,44 (s, 1H), 7,41 (d, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,01 (d, 1H), 3,68 (s, 3H), 1,48 (s, 9H), 1,24 (s, 12 H); TLC (heptán/etylacetát 8:2) R, 0,28; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 18,83 min.

d) ŕerc-Butyl N-[4-(4-(chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)3-metoxyfenyl)karbamát. Zlúčenina bola pripravená z ŕerc-butyl N-[3-metoxy-4(4,4,5,5-tetrametyM ,3,2-dioxaborólan-2-yl)fenyl]karbamátu a 4-chlór-7-cyklopentyl5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu spôsobom opísaným pre zlúčeninu (4): ’H NMR (DMSO-d_6l 400 MHz) δ 9,41 (s, 1H) < 8,59 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,15 (d, 1H), 7,04 (d, 1H), 5,17 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 3H), 1,49 (s, 9H); RPHPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 21,22 min; MS: MH⁺ 443.

Cer r r r r C C r. ľ

- c r Γ e r c r

../ ' J, / fý J

e) Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3metoxyfenyljkarbamát. Zlúčenina bola pripravená z terc-butyl N-[4-(4-(chlór-7cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3-metoxyfenyl)karbamátu spôsobom opísaným pre konverziu zlúčeniny (4) na zlúčeninu (6): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,87 (s, 1 H), 8,08 (s, 1 H), 7,34-7,45 (m, 6H), 7,09-7,18 (m, 3H), 5,79 (bs,

2H), 5,18 (s, 2H), 5,04 (m, 1H), 3,7 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t_r = 16,87 min; MS: MH⁺ 458.

Príklad 25: Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2fluórfenyl]karbamát

a) 4-[{[7-Cyklopentyl-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxabórolan-2-yl)-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]amino}(2,4-dimetoxyfenyl)metyl]fenoxy živica. Z Rinkovej amidovej živice [4-(2’,4’-dimetoxyfenyl-Fmoc-aminometyl)-fenoxy živica s nasýtením 0,66 mmol/g] (6,55 g, 4,32 mmol) sa odstránili chrániace skupiny premytím N,N-dimetylformamidom (2x2 min), 20 % piperidínu v N,Ndimetylformamide (1x5 min, 1 x 15 min), N,N-dimetylformamidom (5x2 min), dichlórmetánom (3x2 min), a metanolom (3x2 min). Živica sa potom vysušila pri teplote 40 °C za zníženého tlaku. Živica s odstránenými chrániacimi skupinami, 4chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidín (1,80 g, 5,19 mmol), dimetylsulfoxid (100 ml) a Ν,Ν-diizopropyletylamín (4,5 ml) sa zahrievali na 100 °C 3 dni, ochladili sa na teplotu prostredia a živica sa oddelila filtráciou a premyla N,Ndimetylformamidom. Živica sa potom miešala 30 min s kyselinou octovou (0,13 g,

2,16 mmol), O-benzotiazol-1-yl-N,N,N’,N’-tetrametylurónium tetrafluórborátom (0,69 g, 2,16 mmol), N,N-diizopropyletylamínom (0,56 g, 4,32 mmol) a N,Ndimetylformamidom (30 ml). Živica sa oddelila filtráciou a premyla sa N,Ndimetylformamidom, dichlórmetánom a metanolom. Živica sa potom vysušila na konštantnú hmotnosť (6,25 g) za zníženého tlaku. Živica, dibórpinakolester (1,11 g,

4,37 mmol), octan draselný (0,822 g, 8,39 mmol) a tetrakis(trifenylfosfín)paládium (0,24 g, 0,21 mmol) v dimetylsulfoxide (125 ml) sa zahrievali na 85 °C pod dusíkovou atmosférou 17 hodín. Živica sa oddelila filtráciou a premyla sa N,Ndimetylformamidom, dichlórmetánom, etylacetátom a éterom. Živica sa vysušila za zníženého tlaku na hmotnosť 5,49 gramov.

'· Γ

b) Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2fluórfenyljkarbamát. Zmes 4-[{[7-cyklopentyl-5-(4,4_l5,5-tetrametyl-1,3,2dioxaborolan-2-yl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]amino}(2,4dimetoxyfenyl)metyl]fenoxy živice (0,5 g, 0,254 mmol), 4-bróm-2-fluóranilínu (0,484 g, 2,54 mmol), tetrakis(trifenylfosfín)paládia (0,044 g, 0,038 mmol), 2 M vodného fosforečnanu draselného (1,27 ml, 2,54 mmol) a dimetylsulfoxidu (10 ml) sa zahrievala na 85 °C 18 hodín. Zmes sa ochladila, živica sa oddelila filtráciou a premyla sa Ν,Ν-dimetylformamidom a dichlórmetánom. Živica sa druhýkrát podrobila podmienkam syntézy opísaným vyššie. Živica sa suspendovala v dlchlórmetáne (2 ml) a pyridíne (2 ml), zmes sa ochladila na 0 °C a pridal sa benzylchlórformiát (0,44 g, 2,6 mmol). Po hodine miešania pri 0 °C sa zmes nechala ohriať na teplotu prostredia na 18 hodín. Živica sa oddelila filtráciou a potom sa na ňu pôsobilo 5% kyselinou trifluoroctovou v dlchlórmetáne (10 ml) počas 30 minút. Odstránením živice filtráciou sa získal filtrát, ktorý sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok, ktorý sa vyčistil preparatívnou C-18 RPHPLC, čím sa získal benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin5-yl)-2-fIuórfenyl]karbamát (~10 mg): RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 11,47 min; MS: MH⁺ 446.

Príklad 27: Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2(trifluórmetyl)fenyl]karbamát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v príklade 25: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 12,07 min; MS: MH⁺ 496.

Príklad 28: Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2kyanofenyl]karbamát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v príklade 25: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 10,93 min; MS: MH⁺ 453.

r r.

Príklad 29: Metyl 5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2{[(benzyloxy)karbonyl]amino}benzoát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v príklade 25: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 13,28 min; MS: MH⁺ 486.

Príklad 30: Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metylfenyl]karbamát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v príklade 25: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 11,25 min; MS: MH⁺ 442.

Príklad 31: Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenyl]karbamát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v príklade 25: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 11,27 min; MS: MH⁺ 428.

Príklad 32: N-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyljfenylmetánsulfónamid

5-(4-Amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (27 mg, 0,083 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (0,8 ml). Pridal sa pyridín (0,8 ml) a po ňom fenylmetánsulfonylchlorid (19 mg, 0,105 mmol). Po miešaní cez noc sa pridalo ďalších 19 mg fenylmetánsulfonylchloridu a reakčná zmes sa miešala cez noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa vyčistil preparatívnou tenkovrstvovou chrómatografiou elúciou zmesou dichlórmetánu a metanolu (95:5), čím sa získal N[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyljfenylmetánsulfonamid (9 mg, 0,0188 mmol). 1H NMR (DMSO-d₆) *

1,89 (m, 6H), 2,28 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 4,38 (s, 2H), 5,23 (m, 3H), 6,08 (bs, 1H),

6,99 (m, 2H), 7,27, (m, 2H), 7,33 (m, 3H), 7,58 (d, J = 8,17 Hz, 1H), 8,34 (s, 1H). LC/MS MH⁺ = 478 r r, r r c « r r r f. r ' c r r. f ' r r r, ( r r f r · r.

„l· ' Príklad 33: N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-2-fenylacetamid

5-(4-Amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (28mg, 0,086 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (1 ml). Pridal sa pyridín (1 ml) a po ňom 2-fenyletanoylchlorid (14 μΙ, 0,105 mmol). Po miešaní cez noc sa pridalo ďalších 14 μΙ fenylmetánsulfonylchloridu a reakčná zmes sa miešala cez noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa vyčistil preparatívnou tenkovrstvovou chromatografiou elúciou zmesou dichlórmetánu a metanolu (95:5), čím sa získal N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyljfenylacetamid (7 mg, 0,0158 mmol). 1H NMR (DMSO-d₆) * 1,89 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 3,77(s, 3H), 3,79 (s,2H), 5,21 (m, 1H), 5,56 (bs, 2H), 6,89 (s, 1H), 6,99 (s, 1H), 7,05(d, J = 8,22, 1H), 7,36 (m, 5H), 7,81(s, 1H), 8,27 (s, 1H),

8,43 (d, J = 8,23 Hz, 1H). LC/MS MH⁺ = 442.

Príklad 34: N1-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-2-(2-tienyl)acetamid

5-(4-Amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (31mg, 0,096 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (1 ml). Pridal sa pyridín (1 ml) a po ňom 2-(2-tienyl)etanoylchlorid (14 μΙ, 0,113 mmol). Po miešaní cez noc sa pridalo ďalších 14 μΙ 2-(2-tienyl)ethanoylchloridu a reakčná zmes sa miešala cez noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa vyčistil preparatívnou tenkovrstvovou chromatografiou elúciou zmesou dichlórmetánu a metanolu (95:5), čím sa získal N1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]-2-(2tienyl)acetamid (14 mg, 0,031 mmol). 1H NMR (DMSO-d₆) * 1,89 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 3,82(s, 3H), 3,99 (s, 2H), 5,19 (bs, 2H), 5,21 (m, 1H), 6,93 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 7,06 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 8,02 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,42 (d, J = 8,22 Hz, 1H). LC/MS MH⁺= 448.

Príklady 35- 108 (všeobecná metóda)

Príklady uvedené v tabuľke J boli pripravené reakciou fenolu s fluórbenzénom uvedenými v tabuľke I podľa nižšie uvedenej schémy.

r r c r r r

R¹ je izopropyl. R¹⁰⁰ má vyššie uvedený význam.

5-(4-Hydroxyfenyl)-7-izopropylpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín (1 molárny ekvivalent) ako zásobný roztok v N,N-dimetylformamide (6 g v 240 ml) sa pridal do zmesi fluórbenzénu (1,25 molárnych ekvivalentov) a uhličitanu draselného (2 molárne ekvivalenty) v šeptom uzavretej skúmavke cez automatický dávkovač kvapalín Gilson 215. Reakčné zmesi sa zahrievali s trepaním na 120 °C 4 hodiny a na 140 °C ďalšiu 1 hodinu a potom sa odparili dosucha na centrifúgovej odparke.

Reakčné zvyšky sa rozpustili v zmesi etylacetátu a trietylamínu (1 ml) (9:1) a eluovali sa cez vrstvu oxidu kremičitého (3 g SiO₂, 12 mm priemer x 20 mm výška) zmesou etylacetátu a trietylamínu 9:1 (4x2 ml). Skombinované eluenty zo stĺpca sa odparili, čím sa získali produkty vo forme voskovitých tuhých látok, nánosov alebo expandovaných pien.

Tabuľka I

Príklad č.	Použitý fluórbenzén
35	4-fluór-3-(trifluórmetyl)benzaldehyd
36	3-chlór-4-fluóracetofenón

r r r r r r r r r r r

- t' ŕ r c · f

100 ' / P,

Príklad č.	Použitý fluórbenzén
37	3-chlór-4-fluórbenzaldehyd
38	4-fluóracetofenón
39	4-fluórbenzaldehyd
40	2-fluór-5-(trifluórmetyl)propiofenón
41	2-fluór-3-(trifluórmetyl)acetofenón
42	3-kyano-4-dimetylamino-2-fluórbenzaldehyd
43	2-fluór-3-(trifluórmetyl)benzaldehyd
44	2-fluór-4-metoxyacetofenón
45	4-chlór-2-fluórbenzaldehyd
46	2,5-difluóracetofenón
47	2-fIuór-5-metoxybenzaldehyd
48	2-fluór-4-metoxybenzaldehyd
49	2-fluórpropiofenón
50	2,3-difluórbenzaldehyd
51	2-fluóracetofenón
52	2-fluórbenzaldehyd
53	4-fluór-3-(trifluórmetyl)propiofenón
54	(4-fluórfenyl)-(2-tienyl)ketón
55	4-fluór-2-(trifluórmetyl)acetofenón
56	4-fluór-2-(trifluórmetyl)benzaldehyd
57	4'-fluór-1 '-acetonaftón
58	4-fluór-2-metoxybenzaldehyd
59	2-fluór-4-(trifluórmetyl)propiofenón

e o

101 r c Γ Γ Γ Γ

Príklad č.	Použitý fluórbenzén
60	2-fluór-4-(trifluórmetyl)acetofenón
61	2-fluór-5-(trifluórmetyl)acetofenón
62	4-chlór-2-fluór-5-metylacetofenón
63	2-fluór-5-nitrobenzaldehyd
64	4-(4-fluórbenzoyl)-1-metylpyrol-2-aIdehyd
65	4'-fluór-2-(metylsulfonyl)acetofenón
66	5-fluór-1-indanón
67	2-amino-5-chlór-2'-fluórbenzofenón
68	2,-fluór-5'-nitrooacetofenón
69	4-fluór-3-(trifluórmetyl)benzonitril
70	3-chlór-4-fluórbenzonitril
71	2-chlór-4-fluórbenzonitril
72	3,4-difluórbenzonitril
73	4-fluórbenzonitrii
74	2-fluór-6-(4-metylfenyltio)benzonitril
75	2-fluór-6-(2-pyridyltio)benzonitril
76	2-fluór-6-(metoxykarbonylmetyltio)benzonitril
77	2-fluór-3-(trifluórmetyl)benzonitril
78	2-fluór-5-(trifluórmetyl)benzonitril
79	2-fluór-6-(1 -pyrolo)benzonitril
80	2-fluór-5-nitrobenzonitril
81	2-fluórbenzonitril
82	5-fluór-2-nitrobenzaldehyd

f r r n r r r c c . r r r > r e r

102 -f ,.rP.P

Príklad č.	Použitý fluórbenzén
83	4-fluór-3-nitrofenylmetylsulfón
84	4-fluór-3-nitrobenzotrifluorid
85	2'-chlór-4'-fluóracetofenón
86	4'-fluór-2'-metylacetofenón
87	3-fenyl-7-fluórindan-1 -ón
88	2-fluór-6-(trifluórmetyl)acetofenón
89	1-fluór-9-fluorenón
90	6-fluórveratraldehyd
91	2-fluór-5-metylacetofenón
92	2-fluór-6-(2-oxoazepin-3-ylamino)benzonitril
93	2-fluór-6-(4-karbamoylpiperidin-1 -y l)benzon itri I
94	2-fluór-6-[3-(imidazol-1-yl)propylamino]benzonitril
95	2-fluór-6-[2-(4-pyridyl)etylamino]benzonitril
96	2-fluór-6-(2-tienylmetylamino)benzonitril
97	2-fluór-6-(4-kyanopiperidin-1 -y l)benzon itri I
98	2-fluór-6-(3-pyridylmetylamino)benzonitril
99	2-fluór-6-(4-metylfenoxy)benzonitril
100	2-fluór-6-tiamorfolinobenzonitril
101	2-fluór-6-[(3-dimetylamino)propylamino]benzonitril
102	2-fluór-6-(2,2,2-trifluóretoxy)benzonitril
103	2-fluór-6-(3-metoxypropylamino)benzonitril
104	2-dimetylamino-6-fluórbenzonitril
105	2-fluór-5-metoxybenzonitril

103

Γ 1 Γ r. p <- r r r c

C c ^ľ- C r

Príklad č.	Použitý fluórbenzén
106	2,5-difluórbenzonitril
107	2-fluór-5-nitrobenzotrifluorid
108	3-chlór-4-fluór-5-nitrobenzotrifluorid ;I_L

Získané produkty sú uvedené v tabuľke J. R¹⁰⁰má vyššie uvedený význam.

Podmienky použité v LCMS sú uvedené ďalej. HPLC RT (min) je retenčný čas HPLC v minútach.

Tabuľka J

Pr.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT (min)
35	cf3	H	CHO	H	H	4.45
36	Cl	H	COCH3	H	H	4.44
37	Cl	H	CHO	H	H	4.4
38	H	H	coch3	H	H	4.13
39	H	H	CHO	H	H	4.1
40	COC2H 5	H	cf3	H	H	4.91
41	COCH3	H	H	H	cf3	4.35

104

Pr.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT (min)
42	CHO	H	H	N(CH3)2	CN	3.88
43	CHO	H	H	H	cf3	4.39
44	COCH3	H	H	OCH3	H	4.16
45	CHO	H	H	c,	H	4.57
46	coch3	H	F	H	H	4.29
47	CHO	H	OCH3	H	H	4.27
48	CHO	H	H	och3	H	4.12
49	COC2H 5	H	H	H	H	4.46
50	CHO	H	H	H	F	4.12
51	COCH3	H	H	H	H	4.14
52	CHO	H	H	H	H	4.15
53	cf3	H	COC2H5	H	H	5.61
54	H	H	2-ThCO 1	H	H	5.37
55	H	cf3	COCH3	H	H	5.17
56	H	cf3	CHO	H	H	5.40
57	H	H	COCH3	-CH = CH-CH = CH-2	5.42
58	H	och3	CHO	H	H	4.64
59	COC2H 5	H	H	cf3	H	5.63
60	COCH3	H	H	cf3	H	5.28

105

Pr.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT (min)
61	COCH3	H	cf3	H	H	5.38
62	COCHg	H	ch3	Cl	H	5.57
63	CHO	H	no2	H	H	4.74
64	H	H	P3	H	H	4.17
65	H	H	coch2s o2ch3	H	H	3.73
66	H	-CH2-CH2-CO-		H	H	4.00
67	COA4	H	H	H	H	4.80
68	COCH3	H	no2	H	H	4.25
69	cf3	H	CN	H	H	4.51
70	Cl	H	CN	H	H	4.74
71	H	Cl	CN	H	H	4.52
72	F	H	CN	H	H	4.22
73	H	H	CN	H	H	4.21
74	CN	4- metylfenyltio	H	H	H	5.25
75	CN	2-pyridyltio	H	H	H	4.29
76	CN	Metoxykarbo- nylmetyltio	H	H	H	4.85
77	CN	H	H	H	cf3	4.31
78	CN	H	cf3	H	H	4.51
79	CN	Pyrrol-1-yl	H	H	H	4.47

C r r e r c rt r- r c r r · c'· f* C f c r

106 ^f-^r .ľ

Pr.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT (min)
80	CN	H	NO2	H	H	4.14
81	CN	H	H	H	H	4.09
82	H	CHO	no2	H	H	4.22
83	no2	H	so2ch3	H	H	3.78
84	no2	H	cf3	H	H	4.60
85	H	Cl	COCH3	H	H	4.39
86	H	ch3	COCH3	H	H	4.96
87	3-fenylindan-1 -οη-7-yl	H	H	H	5.57
88	COCH3	cf3	H	H	H	5.23
89	Fluoren-9-one-1-yl	H	H	H	5.23
90	CHO	H	OCH3	OCH3	H	4.20
91	COCH3	H	ch3	H	H	5.02
92	CN	2-oxoazepin-3- ylamino	H	H	H	4.47
93	CN	4-karbamoyl piperidin-1 -yl	H	H	H	3.81
94	CN	3-(imidazol-1- yl)propylamin 0	H	H	H	3.56
95	CN	2-(4-pyridyl) etylamino	H	H	H	4.36
96	CN	2-tienylmetyl- amino	H	H	H	5.32

107 r r r c I- r

Pr.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT (min)
97	CN	4- kyanopiperi- din-1-yl	H	H	H	4.89
98	CN	3- pyridylmetyl- amino	H	H	H	4.22
99	CN	4- metylfenoxy	H	H	H	4.89
100	CN	tiamorfolino	H	H	H	5.32
101	CN	3- (dimetylamino )propylamino	H	H	H	3.35
102	CN	OCH2CF3	H	H	H	5.01
103	CN	3-metoxypro- pylamino	H	H	H	4.92
104	CN	N(CH3)2	H	H	H	4.91
105	CN	H	OCH3	H	H	4.75
106	C N	H	F	H	H	4.74
107	cf3	H	no2	H	H	5.51
108	no2	H	cf3	H	Cl	5.56

RT = Retenčný čas v minútach = 2-tenoyl

2. = premostený kruh dávajúci naftylovú skupinu

3. P = 2-formyl-1-metylpyrol-4-ylkarbonyl ľ r r r

108

4. A = 2-amino-5-chlórfenyl

Zlúčeniny pripravené v príkladoch 35-108 sú nasledovné.

Príklad 35

4-[4-(4-Amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3trifluórmetylbenzaldehyd.

Príklad 36

4-[4-(4-Amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3chlóracetofenón.

Príklad 37

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yyl)fenoxy]-3chlórbenzaldehyd.

Príklad 38

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]acetofenón.

Príklad 39

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]benzaldehyd.

Príklad 40

2^,-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5’trifluórmetylpropiofenón.

Príklad 41

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3’trifluórmetyl-acetofenón.

Príklad 42

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2₎3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-formyl-6dimetylaminobenzonitril.

r- r

109

Príklad 43

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3trifluórmetylbenzaldehyd.

Príklad 44

2’-[4-(47amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2₁3-d]pyrimidin-5-yl)fehoxy]-4’metoxyacetofenón.

Príklad 45

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4chlórbenzaldehyd.

Príklad 46

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5’fluóracetofenón.

Príklad 47

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5metoxyacetofenón.

Príklad 48

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4metoxybenzaldehyd.

Príklad 49

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]propiofenón

Príklad 50

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3fluórbenzaldehyd.

Príklad 51

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]acetofenón.

Príklad 52

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]benzaldehyd.

r r

110 r r * e r or e -r r r r r r r r r *>

f r. c r e c

V ľ

Príklad 53

4’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2trifluórmetylpropiofenón.

Príklad 54

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]fenyl 2tienyl-ketón.

Príklad 55

4’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2’trifluórmetyl-acetofenón.

Príklad 56

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrímidin-5-yl)fenoxy]-2trifluórmetylbenzaldehyd.

Príklad 57

4’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-ľacetonaftón.

Príklad 58

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2metoxybenzaldehyd.

Príklad 59

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4trifluórmetylpropiofenón.

Príklad 60

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4trifluórmetylacetofenón.

Príklad 61

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5trifluórmetylacetofenón.

ŕ e

P C C r r ľ r. e· r p r. e f ** · .·>

r C r ŕ¹'. r r r f ~ r r c ,’· c

111

Príklad 62

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-chlór-5metylacetofenón.

Príklad 63

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2₁3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5nitrobenzaldehyd.

Príklad 64

4- [4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzoyl-1metylpyrol-2-aldehyd.

Príklad 65

4’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy] 2(metylsulfonyl)acetofenón.

Príklad 66

5- [4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2_l3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-1-indanón.

Príklad 67

2-amino-2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5chlórbenzofenón.

Príklad 68 .

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-dÍpyrimidin-5-yl)fenoxy]-5nitroacetofenón.

Príklad 69

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3trifluórmetylbenzonitril.

Príklad 70

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3chlórbenzonitril

Príklad 71

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2chlórbenzonitril.

112 r> r r r f r r r r p r· r < r r * p r t r·

Príklad 72

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-fluórbenzonitril

Príklad 73

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2_l3;d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzonitril.

Príklad 74

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(4metylfenyltio)benzonitril..

Príklad 75

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(2pyridyltio) benzonitril.

Príklad 76

Metyl {3-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2kyanofenyltiojacetát.

Príklad 77

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2₎3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3trifluórmetylbenzonitril

Príklad 78

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5trifluórmetylbenzonitril.

Príklad 79

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]6-(pyrol-1yl)benzonitril.

Príklad 80

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5nitrobenzonitril.

Príklad 81

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzonitril.

r r r C c f c r, r· r ,·

113 - - ^r r : ' ľ : ;

• - r r r ^r - ' r r

Príklad 82

544-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2nitrobenzaldehyd.

Príklad 83

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2₎3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3nitrofenylmetylsulfón.

Príklad 84

1- [4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-nitro-4trifluórmetylbenzén.

Príklad 85

4^,-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2’chlóracetofenón.

Príklad 86

4’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2’metylacetofenón.

Príklad 87

7-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3fenylindan-1-ón.

Príklad 88

2- [4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6trifluórmetylacetofenón.

Príklad 89

1- [4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2_l3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-9-fluorenón.

Príklad 90

6-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3,4dimetoxybenzaldehyd.

Príklad 91

2- [4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-metyl acetofenón.

114 c r.

r> e n

Príklad 92

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(2oxoazepin-3-ylamino)benzonitril.

Príklad 93

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(4karbamoylpiperidin-1-yl)benzonitril.

Príklad 94

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(3imidazol-1-yl)propylamino]benzonitril.

Príklad 95

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-[2-(4pyridyl)etylamino]benzonitril.

Príklad 96

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(2-tienylmetylamino)benzonitril.

Príklad 97

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(4kyanopiperidin-1 -y l) be nzo n itril.

Príklad 98

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2₁3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(3-pyridyl metylamino)benzonitril

Príklad 99

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(4metylfenoxy)benzonitril.

Príklad 100

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6tiamorfolinobenzonitril r- O r r e ť c ŕ rt rt c f *

115

Príklad 101

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-[(3dimetylamino)propylamino]benzonitril.

Príklad 102

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(2,2,2,trifluóretoxy)benzonitril.

Príklad 103

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(3metoxypropylamino)benzonitril.

Príklad 104

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6dimetylaminobenzonitril.

Príklad 105 '2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5metoxybenzonitril.

Príklad 106

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5fluórbenzonitril.

Príklad 107

1-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-nitro-2trifluórmetylbenzén.

Príklad 108

1-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2_l3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-chlór-2nitro-4-trifluórmetylbenzén.

Príklady 109- 137 boli pripravené všeobecnou metódou opísanou nižšie.

Všeobecná metóda

Karbonylová zlúčenina (približne 50 mg) uvedená v tabuľke J sa rozpustila v metanole (2 ml) a pridal sa bórhydrid sodný na polymérovom nosiči [na Amberlite;

r r r r p r r n p

116

IRA-400; 2,5 mmol bórhydridu na g živice; 2 ekvivalenty (50 mg východiskových látok od 0,106 mmol do 0,1345 mmol)].

Zmesi sa pretrepávali (krúživá trepačka) pri teplote miestnosti 24 h, prefiltrovali sa, živice sa premyli metanolom (2 x 1 ml), filtráty sa odparili a zvyšky analyzovali. Získané produkty sú uvedené v tabuľke K. HPLC RT je retenčný čas v minútach.

C(OH)RW1

COR101

R

(CO)

R (CHOH)

Table K

SM Pr.	PD Pr.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT
35	109	cf3	H	CH2OH	H	H	3.96
36	110	Cl	H	CH(OH)CH3	H	H	3.99
37	111	Cl	H	ch2oh	H	H	3.81
38	112	H	H	CH(OH)CH3	H	H	3.75
39	113	H	H	ch2oh	H	H	3.57
40	114	CH(OH)C2H5	H	cf3	H	H	4.57
41	115	CH(OH)CH3	H	H	H	cf3	4.14
42	116	ch2oh	H	H	N(CH3)2	CN	3.57
43	117	ch2oh	H	H	H	cf3	3.99
44	118	CH(OH)CH3	H	H	och3	H	3.79
45	119	ch2oh	H	H	Cl	H	4.01

117 c r r r r r r i* C f r r r t r

SM Pr.	PD Pr.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT
46	120	CH(OH)CH3	H	F	H	H	3.97
47	121	ch2oh	H	och3	H	H	3.68
48	122	ch2oh	H	H	och3	H	3.61
49	123	CH(OH)C2H5	H	H	H	H	4.08
50	.124 -	ch2oh	H	H	H	F	3.63
51	125	CH(OH)CH3	H	H	H	H	3.83
52	126	ch2oh	H	H	H	H	3.64
53	127	cf3	H	CH(OH)C2H5	H	H	4.85
54	128	H	H	2-ThCHOH 1.	H	H	4.66
55	129	H	cf3	CH(OH)CH3	H	H	4.74
56	130	H	cf3	ch2oh	H	H	4.48
57	131	H	H	CH(OH)CH3	-ch=ch-ch=ch-2	4.65
58	132	H	och3	ch2oh	H	H	3.82
59	133	CH(OH)C2H5	H	H	O -n W	H	5.03
60	134	CH(OH)CH3	H	H	cf3	H	4.72
61	135	CH(OH)CH3	H	cf3	H	H	4.81
62	136	CH(OH)CH3	H	ch3	Cl	H	4.87
63	137	ch2oh	H	no2	H	H	3.96

- Th = Tienyl 2 = premostený kruh dávajúci naftyl. Zlúčeniny pripravené v tabuľke K sú uvedené nižšie:

Príklad 109

4-[4-(4-Amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3trifluórmetylbenzylalkohol.

c r c f118

Príklad 110

4-[4-(4-Amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-chlór-ametylbenzylalkohol.

Príklad 111

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3chlórbenzylalkohol.

Príklad 112

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]acetofenón.

Príklad 113

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]benzylalkohol.

Príklad 114

2^,-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5’trifluórmetyl-a-etylbenzylalkohol.

Príklad 115

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3’trifluórmetyl-a-metylbenzylalkohol.

Príklad 116

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3hydroxymetyl-6-(dimetylamino)benzonitril.

Príklad 117

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3trifluórmetylbenzylalkohol.

Príklad 118

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4’-metoxya-metylbenzylalkohol.

Príklad 119

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4chlórbenzylalkohol.

r c

119 c * » í ŕf f ŕ β

Príklad 120

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5’-fluór-ametylbenzylalkohol.

Príklad 121

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-metoxya-metylbenzylalkohol.

Príklad 122

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4metoxybenzylalkohol.

Príklad 123

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-aetylbenzylalkohol.

Príklad 124

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3fluórbenzylalkohol.

Príklad 125

2’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrinnidin-5-yl)fenoxy]-ametylbenzylalkohol.

Príklad 126

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]benzylalkohol.

Príklad 127

4’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2trifluórmetyl-a-etylbenzylalkohol.

Príklad 128

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-a-(2tienyl)benzylalkohol.

120

Príklad 129

4’-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2’“ trifluórmetyl-a-metylbenzylalkohol.

Príklad 130

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2- , trifluórmetylbenzyialkohol.

Príklad 131

-{1 -4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]naftyl}etanol.

Príklad 132

4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2metoxybenzylalkohol.

Príklad 133

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4trifluórmetyl-a-etylbenzylalkohol.

Príklad 134

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4trifluórmetyl-a-metylbenzylalkohol.

Príklad 135

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5trifluórmetyl-a-metylbenzylalkohol.

Príklad 136

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-chlór-5metyl-a-metylbenzylalkohol.

Príklad 137

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2₁3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5nitrobenzylalkohol.

r r

121

Príklady uvedené v tabuľke L boli pripravené reakciou aldehydov vzorca (AL) s dietylamínom za prítomnosti Na(OAc)₃BH, čím sa získali zlúčeniny vzorca (AM) . Východiskový aldehyd bol pripravený v skôr opísanom príklade, ktorý je uvedený v tabuľke.

R100

Všeobecná metóda

Na aldehyd sa pôsobilo 1 ml zásobného roztoku THF (50 ml) a dietylamínom (2 ml) [ekvivalent 40 : 1 dietylamínu] a zmes sa nechala pri teplote miestnosti 1 hodinu v šeptom uzavretej skúmavke. Do každej reakčnej zmesi sa pridal Na(OAc)₃BH (20 mg ± 2 mg), tie sa potom prepláchli N₂, znova, sa uzavreli a nechali pri teplote prostredia 24 hodín. Do každej z ketónových reakcií sa pridal roztok kyseliny octovej (3 ml) v 100 ml THF a tá sa nechala pri teplote miestnosti cez víkend. Reakcie sa ukončili pridaním nasýteného vodného roztoku Na₂CO₃ (1 ml) a extrahovali sa do dichlórmetánu (2 ml) trepaním v uzavretej skúmavke, ktorý sa oddelil a nechal odpariť. V každej reakcii sa uskutočnila LCMS a zistila sa cieľová hmotnosť.

Re

R100Rd

-Rc

Produkt

Rá

Rb

Tabuľka L

SM

PD

Produkt r CC r Γ r r r

C Γ. r r r

122 PP <- -

EX	Pr.	Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT
65	138	H	H	CO(P) 1	H	H	3,62
35	139	cf3	H	CH2N(C2H5)2	H	H	3,83
40	140	H	H	CH2N(C2Hs)2	H	H	3,36
43	141	CH2N(C2H5)2	H	H	N(CH3)2	CN	3,34
44	142	CH2N(C2Hs)2	H	H	H	cf3	3,80
49	143	CH2N(C2H5)2	H	H	och3	H	3,42
51	144	CH2N(C2H5)2	H	H	H	F	3,27
53	145	CH2N(C2Hs)2	H	H	H	H	3,31
57	146	H	cf3	CH2N(C2H5)2	H	H	4,12
59	147	H	och3	CH2N(C2H5)2	H	H	3,52
91	148	CH2N(C2H5)2	H	och3	och3	H	3,25

1. P = 1-metyl-2-(dietylaminometyl)pyrol-3-karbonyl

Zlúčeniny pripravené v tabuľke L sú uvedené nižšie.

Príklad 138

4- [4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzoyl-1metyl-2-(dietylaminómetyl)pyrol.

Príklad 139

5- [4-(4-dietylaminometyl-2-trifluórmetylfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín.

Príklad 140

5-[4-(4-dietylaminometylfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin

4-ylamín.

Príklad 141

2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3dietylaminometyl-6-(dimetylamino)benzonÍtril.

123

CO r fi C e r. e ζ r

r. ttn f t' ·' ne c f r r ( f

- e r c . · c r- r c n o ' ' ' «·

Príklad 142

5-[4-(2-dietylaminometyl-6-trifluórmetylfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín.

Príklad 143

5-[4-(2-dietylaminometyl-5-metoxyfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-ylamín.

Príklad 144

5-[4-(2-dietylaminometyl-6-fluórfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3djpyrimid in-4-ylamí n.

Príklad 145

5-[4-(2-dietylaminometylfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin4-ylamín.

Príklad 146

5-[4-(4-dietylaminometyl-3-trifluórmetylfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín.

Príklad 147

5-[4-(2-dietylaminometyl-5-metoxyfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-ylamín.

Príklad 148

5-[4-(2-dietylaminometyl-4,5-dimetoxyfenoxy)fenyl]-7-izopropyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín.

Všeobecný vzorec Q

Príklady 149 až 158 boli pripravené reakciou zlúčenín vzorca (AL2) s amínom vzorca (AM2) podľa nižšie uvedenej schémy, v ktorej R¹⁰⁰ má vyššie uvedený význam pomocou postupu opísaného vo všeobecnej metóde. Získané produkty sú uvedené v tabuľke Q.

r r r r r r

124

R105 /

(AL2) (AM2) (AP2)

Všeobecná metóda Q

Zásobný roztok acetaldehydu (440 mg) v THF (11 ml) sa rozdelil rovnomerne do 11 šeptom uzavretých ampuliek. Do každej reakčnej zmesi (obsahujúcej 40 mg CHO, 0,1075 mmol) sa pridal nadbytok amínu (3-10 mólekvivalentov) uvedeného v tabuľke Q a Na(OAc)₃BH (113 mg; 0,5375 mmol) a zmes sa nechala pri teplote miestnosti 48 hodín. Reakcia sa ukončila nasýteným vodným roztokom Na₂CO₃ (1 ml), zmes sa trepala 1 hodinu, extrahovala dichlórmetánom (3 ml) a oddelila pomocou vložky Empore. Organická vrstva sa nechala odpariť pri teplote miestnosti cez noc a zvyšky sa rozpustili v EtOAc (2 ml) a extrahovali 2N HCI (1 ml) pri vírivom miešaní. Kyselinová vrstva sa odpipetovala, premyla EtOAc (2x1 ml) a pH sa zmenilo na bázické pomocou 4N NaOH. Zmes sa extrahovala do EtOAc (2 ml) pomocou vírivého miešania a oddeľovania pipetou a premyla sa vodou (2 x 1 ml). Konečná vrstva EtOAc sa vysušila prechodom cez malú vložku Empore a odparila sa dosucha.

Tabuľka Q

Príklad č.	NR105R106	HPLC RT
149	—N\ /N - CO2C2H5	4,36
150	-0	5,37
	/— co2c2h5

125

O r P c· r r r c c r r < I· C r r r ,· t

Príklad č.	NR105R106	HPLC RT
151	—hnx^xco2c2h5	3,64
152	.OH -HI\K	2,95
153	-HN-	3,24
154	-HN-j] s-J	4,55
155	-N N-Me V_/	3,35
156	-\ /°	3,47
157	-0	3,39
158	-nO	3,25

Zlúčeniny pripravené v tabuľke Q sú nasledovné:

Príklad 149

Etyl 4-{4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5 yl)fenoxy]fenyl}-piperazín-1-karboxylát.

Príklad 150

Etyl-1-{[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]fenyl]piperidín-2-karboxylát.

r o

126 r c r r- c r f r r r.

r r. c .· ^r c

Príklad 151

Etyl N-{4-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5 yl)fenoxy]fenylaminoacetát.

Príklad 152

N-{2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]fenylmetyl}-2-aminoetanol.

Príklad 153

7-lzopropyl-5-[4-(2-dimetylaminometylfenoxy)fenyl]-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-ylamín.

Príklad 154

7-lzopropyl-5-[4-(2-(2-tiazolylaminometylfenoxy)fenyl]-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín.

Príklad 155

7-lzopropyl-5-[4-(2-(4-metylpiperazin-1-ylmetyl)fenoxy)fenyl]-7H-pyrolo[2,3d]-pyrimidin-4-ylamín.

Príklad 156

7-lzopropyl-5-[4-(2-morfolinometylfenoxy)fenyl]-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4ylamín.

Príklad 157

7-lzopropyl-5-[4-(2-piperidinometylfenoxy)fenyl]-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4ylamín.

Príklad 158

7-lzopropyl-5-[4’(2-pyrolodinometylfenoxy)fenyl]-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4 ylamín.

Podmienky použité pri LCMS pre príklady 35- 158 sú uvedené nižšie.

Príklady 35 - 52, 64 - 84 a 109 - 126.

Kolóna: Peco R Activity 3mm x 3xm C18-PK/5 (Perkin Elmer)

0,1 M tlmivý roztok na báze octanu amónneho [pH 4,55]:

Mobilná fáza:

127

Podmienky:

Rozmedzie vlnových dĺžok:

Prietok:

Vstrekovací objem:

MS

Metóda:

Ionizácia

Rozmedzie hmotností:

Príklady 53 - 63, 85 Kolóna:

Mobilná fáza:

Podmienky:

Rozmedzie vlnových dĺžok:

Prietok:

Vstrekovací objem: MS

Metóda:

Ionizácia

Rozmedzie hmotností

Príklady 138-158

Kolóna:

acetonitril (gradient pozrite nižšie).

- 100 % MeCN v priebehu 5 minút.

100 % MeCN počas 1 minúty.

100 - 10 % MeCN v priebehu 2 minút.

(Celkový čas analýzy 8 minút.) ,

250 - 320 nm.

ml/minútu.

μΙ.

APCI11H.

APcI +ve/-ve.

100-700 m/z.

108 a 126-137 μΙ Hypersil 100 x 2,1 mm BDS C18

0,1 M tlmivý roztok na báze octanu amónneho [pH 4,55] acetonitril (gradient pozrite nižšie).

- 100 % MeCN v priebehu 8 minút.

100 - 10 % MeCN počas 3 minút (Celkový čas analýzy 11 minút.)

250 - 320 nm.

ml/minútu.

20° μΙ.

APCI11H.

APcI +ve/-ve.

100 -700 m/z.

μΙ Hypersil 100 x 2,1 mm BDS C18 f r

128 r r r r r r r f

Mobilná fáza: 0,1 M tlmivý roztok na báze octanu amónneho [pH 4,55]:

acetonitril (gradient pozrite nižšie).

Podmienky: 10 - 100 % MeCN v priebehu 8 minút.

100 % MeCN počas 1 minúty.

100 - 10 % MeCN počas 2 minút.

(Celkový čas analýzy 11 minút.)

Rozmedzie vlnových 250 - 320 nm.

dĺžok:

Prietok: 1 ml/minútu.

Vstrekovací objem: 20° μΙ.

MS

Metóda:

Ionizácia

Rozmedzie hmotností

APCI11H.

APcI +ve/-ve. 100-700 m/z.

Príklad 159: 7-izopropyl-5-(4-(pyrimidin-2-yloxy)fenyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4ylamín

a) Jód (52,9 g) sa pridal do miešaného roztoku 4-chlór-7H-pyrolo[2,3-djpyrimidínu (29,1 g, J. Chem. Soc. 1960, 131) v Ν,Ν-dimetylformamide (400 ml). Do chladenej zmesi sa po častiach pridali pelety hydroxidu draselného (31,9 g) tak, aby sa teplota reakčnej zmesi udržiavala okolo 20 °C, a táto zmes sa miešala pri teplote miestnosti 2 hodiny. Pravidelným prúdom sa pridal roztok tiosíranu sodného (900 ml 10 % vodného roztoku), pričom sa teplota udržiavala na 30 °C vonkajším chladením. Zmes sa extrahovala etylacetátom a spojené extrakty sa vysušili, prefiltrovali a odparili za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok, ktorý sa pridal do vody (1 I) a extrahoval sa etylacetátom (2 x 150 ml). Spojené etylacetátové extrakty sa vysušili a odparili, čím sa získala tuhá látka, ktorá sa rekryštalizovala z etylacetátu. Získaná tuhá látka sa miešala s metanolom (800 ml) a prefiltrovala, aby sa odstránili nerozpustné látky. Filtrát sa odparil dosucha, čím sa získala svetložltá tuhá látka, ktorá bola identifikovaná ako 4-chlór-5-jód-7H-pyrolo[2,3-djpyrimidin, 1.1. 219 _ 221 °C.

c «

b) 4-Chlór-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidín (10,0 g, pozrite príklad 17) sa pridal po častiach s miešaním pod dusíkom pri 0 °C do suspenzie hydridu sodného (1,6 g 60 % disperzie v minerálnom oleji) v N,N-dimetylformamide (250 ml). Keď sa skončilo pridávanie, zmes sa nechala ohriať na teplotu prostredia a keď sa už nepozoroval vývoj plynu, po kvapkách sa pridal roztok izopropylbromidu (34,0 ml) v N,N-dimetylformamide (20 ml). Zmes sa miešala pri teplote prostredia cez hoc a reakcia sa ukončila pridaním vody (300 ml) za vonkajšieho chladenia ľadom. Zmes sa potom premyla etylacetátom (3 x 300 ml), spojené organické vrstvy sa premyli vodou, vysušili, prefiltrovali a odparili, čím sa získal 4-chlór-5-jód-7-izopropyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidín vo forme žltej tuhej látky, t. t. 116 - 118 °C. Štruktúra bola potvrdená pomocou ¹H NMR.

c) Zmes 4-chlór-5-jód-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (2,8 g), kyseliny 4-metoxybenzénboritej (1,32 g), chloridu bis(trifenylfosfín)paládnatého (625 mg), toluénu (85 ml), etanolu (11 ml), vody (22 ml) a hydrogénuhličitanu sodného (2,2 g) sa zahrievala pod dusíkom na 105 °C 18 hodín. Zmes sa nechala ochladiť na teplotu prostredia a potom sa rozdelila medzi etylacetát (100 ml) a soľanku (100 ml). Organická vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa premyla etylacetátom (2 x 50 ml). Spojené organické vrstvy sa premyli vodou, vysušili, prefiltrovali a odparili za zníženého tlaku, čím sa získal čierny olej, ktorý pri ochladení stuhol. Tento materiál sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom pomocou cyklohexánu a etylacetátu (7:3) ako mobilnej fázy. Príslušné frakcie sa spojili a nakoncentrovali za zníženého tlaku, čím sa získal žltý olej, ktorý státím stuhol, čím sa získal 4-chlór-7-izopropyl-5-(4-metoxyfenyl)-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidín. Štruktúra bola potvrdená pomocou ¹H NMR.

d) Zmes 4-chlór-7-izopropyl-5-(4-metoxyfenyl)-7H-pyrolo-[2,3-d]pyrimidínu (1,6 g), koncentrovaného amoniaku (80 ml, merná hmotnosť 0,880) a

1,4-dioxánu (80 ml) sa zahrievala v tlakovej nádobe na 120 °C 18 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku, čím sa získal tuhý zvyšok, ktorý sa rozdelil medzi etylacetát (100 ml) a vodu (100 ml). Vodná vrstva sa extrahovala etylacetátom a spojené organické vrstvy sa premyli vodou, vysušili, prefiltrovali a odparili, čím sa získal 4-amino-7-izopropyl-5-(4r r r f ⁿ » o r r. r n f _r ^{r r} ' r . , _r

130 ---'A y, . 7 metoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]-pyrimidín. Štruktúra bola potvrdená pomocou ¹H NMR.

e) Roztok bromidu boritého (14,4 ml 1 M roztoku v dichlórmetáne) sa pridal po kvapkách do miešaného roztoku 4-amino-7-izopropyl-5-(4metoxyfenyl)pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (1,35 g) v dichlórmetáne (100 ml) pri -10 °C pod dusíkom. Reakčná zmes sa nechala ohriať na 0 °C a miešala sa pri tejto teplote jednu hodinu. Pridal sa ďalší bromid boritý (9,6 ml 1 M roztoku v dichlórmetáne) pri -10 °C, zmes sa nechala ohriať na 0 °C a miešala sa ďalšiu hodinu. Reakcia sa ukončila prikvapkaním nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného (50 ml). Zmes sa nechala stáť cez noc a dichlórmetánová vrstva sa oddelila. Nerozpustné látky na rozhraní sa oddelili filtráciou a vysušili, čím sa získal 4-amino-5-(4-hydroxyfenyl)-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidín. Štruktúra bola potvrdená pomocou ¹H NMR.

f) 4-amino-5-(4-hydroxyfenyl)-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidín (0,05 g), 2-chlórpyrimidín (23 mg), uhličitan draselný (39 mg) a dimetylformamid (3 ml) sa zahrievali na 90 °C s trepaním počas 26,5 hodiny. Zmes sa potom trepala ďalších 24 hodín pri teplote prostredia. Reakčná zmes sa rozdelila medzi etylacetát (20 ml) a 2 M roztok hydroxidu sodného (20 ml). Vodná vrstva sa oddelila a extrahovala etylacetátom. Spojené etylacetátové extrakty a roztoky získané premývaním sa spojili, vysušili, prefiltrovali a odparili, čím sa získala tuhá látka, ktorá sa vyčistila stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom pomocou zmesi dichlórmetánu a metanolu (95 : 5) ako mobilnej fázy, čím sa získala tuhá látka, ktorá bola identifikovaná pomocou kvapalinovej chromatografie LCMS ako 7izopropyl-5-(4-(pyrimidin-2-yloxy)fenyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín. Štruktúra bola potvrdená pomocou ¹H NMR spektroskopie.

Príklad 160: 4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)benzaldehyd

a) Zmes 4-chlór-5-jód-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (0,50 g), kyseliny 4-formylbenzénboritej (0,48 g), chloridu bis(trifenylfosfín)paládnatého (112 mg), toluénu (15 ml), etanolu (2 ml), vody (4 ml) a hydrogénuhličitanu sodného (0,40 g) sa zahrievala na 105 °C 8 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia, zriedila sa soľankou a extrahovala etylacetátom, čím sa získal olej, ktorý sa vyčistil c r r r f o

131 stĺpcovou flash chrómatografiou na oxide kremičitom použitím stúpajúcich množstiev etylacetátu v cyklohexáne od 20 % do 40 %, čím sa získal 4-(4-chlór-7izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)benzaldehyd, 1.1.138 - 140 °C.

b) Zmes produktu z časti a) (2,7 g), koncentrovaného vodného amoniaku (75 ml, merná hmotnosť 0,880) a 1,4-dioxánu (50 ml) sa zahrievala na 120 °C 16 hodín v tlakovej nádobe. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Pridala sa voda a zmes sa extrahovala etylacetátom, čím sa získala tuhá látka, ktorá sa rozotrela s etylacetátom a prefiltrovala, čím sa získala tuhá látka, ktorá bola identifikovaná pomocou LCMS ako 4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)benzaldehyd, 1.1. 198-200 °C.

Príklad 161 : oc-[4-(4-amino-7-izôpropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenyl]benzylalkohol

Fenylmagnéziumchlorid (1,5 ml 2 M roztoku v THF) sa pridal po kvapkách za miešania pod dusíkom do roztoku 4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)benzaldehydu (0,25 g) v toluéne/THF (1 : 1, 16 ml) pri mínus 78 °C pod dusíkom. Po pridaní sa zmes nechala ohriať na 0 °C a udržiavala sa pri tejto teplote 40 minút. Reakcia sa ukončila prikvapkaním nasýteného roztoku chloridu amónneho (4 ml) pri 0 °C. Zmes sa nechala ohriať na teplotu miestnosti a stáť cez noc pri tejto teplote. Rozpúšťadlo sa odparilo za zníženého tlaku a získaný tuhý ' zvyšok sa premyl vodou a prefiltroval. Zvyšok sa rozotrel s horúcim etylacetátom, oddelil filtráciou a identifikoval pomocou LCMS ako oc-[4-(4-amino-7-izopropyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenyl]benzylalkohol, 1.1. 279 - 281 °C.

Príklad 162: 7-izopropyl-5-(3-[(fenyl-4-yl)metylén]-2-oxindol)-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-ylamín

Zmes 4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)benzaldehydu (0,2 g), 2-oxindolu (95 mg), piperidínu (0,02 ml) a etanolu (5 ml) sa zahrievala na reflux 3 hodiny. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a tuhá látka, ktorá vznikla, sa oddelila filtráciou a rekryštalizovala z etanolu, čím sa získal 7-izopropyl-5-(3[(fenyl-4-yl)metylén]-2-oxindol)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín.

C r

r. r

Príklad 163: 5-[4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2fenoxybenzylalkohol

a) Zmes 5-bróm-2-fluórbenzaldehydu (20,0 g), fenolu (9,26 g), uhličitanu draselného (16,4 g) a dimetylformamidu (200 ml) sa zahrievala na 160 °C 5 hodín. Zmes sa ochladila, zriedila vodou a extrahovala etylacetátom, čím sa získal 5bróm-2-fenoxybenzaldehyd ako olej.

b) Zmes produktu z časti a) (5,71 g), hexametyldicín (10,0 g), tetrakis(trifenylfosfín)paládium (0) (1,5 g) a toluén (200 ml) sa zahrievala na reflux s miešaním 5 hodín. Zmes sa ochladila, prefiltrovala a filtrát sa odparil, čím sa získal zvyšok, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou petroléterom s teplotou varu 40 - 60 °C s rastúcimi množstvami dietyléteru od 2,5 - 7,5 % ako mobilnou fázou, čím sa získal 5-trimetylstannyl-2-fenoxybenzaldehyd.

c) Zmes produktu z časti b) (2,0 g), 4-chlór-5-jód-7-izopropyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidínu (0,99 g), trifenylarzínu (0,235 g), tris(dibenzylidénacetón)dipaládia(O) (0,41 g) a dimetylformamidu (20 ml) sa zahrievala na 65 °C pod dusíkom 18 hodín s miešaním. Zmes sa ochladila a pridala sa voda. Zmes sa extrahovala etylacetátom, čím sa získal zvyšok, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom s použitím zvyšujúcich sa množstiev etylacetátu (5 - 20 %) v cyklohexáne ako mobilnej fázy, čím sa získal 5-[4-chlór-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-fenoxybenzaldehyd.

d) Zmes produktu z časti c) (0,325 g), bórhydridu sodného (32 mg) a metanolu (5 ml) sa miešala pri 0 °C 30 minút, ohriala sa na teplotu prostredia a miešala pri tejto teplote jednu hodinu. Reakcia sa ukončila 50 % kyselinou octovou (2 ml). Rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a k zvyšku sa pridala voda, ktorá sa potom extrahovala etylacetátom, čím sa získal 5-[4-chlór-7-izopropyl-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-fenoxybenzylalkohol ako tuhá látka s t t. 157 159 °C.

e) Zmes produktu z časti d) (0,18 g), koncentrovaného vodného roztoku amoniaku (20 ml, merná hmotnosť 0,880) a 1,4-dioxánu (20 ml) sa zahrievala s miešaním v tlakovej nádobe na 120 °C 16 hodín. Zmes sa ochladila a rozdelila n r

133 ,3 medzi etylacetát a vodu. Odparením etylacetátového extraktu sa získal olej, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chrómatografiou, čím sa získal 5-[4-amino-7-izopropyl7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-fenoxybenzylalkohol, 1.1. 92 - 94 °C.

Príklad 164: 4-amino-7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo-[2,3-d]pyrimidin-6ylkarbonitril

a) 4-Fenoxyacetofenón (150,0 g) sa rozpustil v kyseline octovej (2 I) a miešal sa pri 50 °C, pričom sa po častiach pridal pyridíniumtribromid (251,6 g). Tento hnedý roztok sa pridal do vody (3 I) a zmes sa extrahovala toluénom (1 x 800 ml a potom 2 x 400 ml). Spojené toluénové extrakty sa premyli vodou a potom sa premývali vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, kým neustala tvorba bubliniek. Spojené toluénové extrakty sa oddelili, vysušili, prefiltrovali a použili priamo v nižšie uvedenej časti b).

b) Roztok 2-bróm-4’-fenoxyacetofenónu v toluéne získaný v a) sa pridal do roztoku cyklopentylamínu (154 ml) v toluéne (1 I) s miešaním pod dusíkom v priebehu 1,5 hodiny, pričom sa teplota udržiavala pod 5 °C. Zmes sa potom miešala 2,5 hodiny, pričom teplota sa udržiavala pod 10 °C a zmes sa potom prefiltrovala. K filtrátu sa po kvapkách pridala koncentrovaná kyselina chlorovodíková (120 ml), pričom teplota sa udržiavala pod 10 °C. Zrazenina sa oddelila filtráciou a rozotrela so zmesou propan-2-olu a éteru (1 : 1), čím sa získala tuhá látka, ktorá sa vysušila vo vákuu pri 40 °C počas 6,5 hodiny, čím sa získal 2cyklopentylamino-4’-fenoxyacetofenón hydrochlorid.

c) Produkt z b) (35,1 g) sa pridal do roztoku nitrilu kyseliny malónovej (9,5 g) v metanole (500 ml) pod dusíkom a potom sa po kvapkách pridal vodný roztok hydroxidu draselného (17,0 g) vo vode (75 ml) v priebehu 30 minút, pričom teplota sa udržiavala medzi 0 a 5 °C. Zmes sa potom zahrievala na reflux 2,5 hodiny. Pridal sa ďalší nitril kyseliny malónovej (1,0 g) v metanole (10 ml) a zmes sa zahrievala na reflux ďalšie 3 hodiny. Zmes sa nechala stáť pri teplote prostredia 18 hodín, metanol sa odstránil za zníženého tlaku a zvyšok sa udržiaval pod dusíkom. Zvyšok sa rozpustil v dichlórmetáne (600 ml) a premyl vodou, potom soľankou a vysušil, prefiltroval a odparil, čím sa získala hnedá tuhá látka, ktorá sa ft c e γ^P f * r r _r r r r c r , _r

1' r p r Γ , r .· ;

134 7P //. · · ·, rozotrela s dietyléterom, čím sa získal 2-amino-3-kyano-1-cyklopentyl-4-(4fenoxyfenyl)pyrol, ktorý sa použil priamo v ďalšej časti tohto príkladu.

d) Produkt z c) (25,9 g) sa rozpustil v zmesi formamidu (155 ml), N,Ndimetylformamidu (52 ml) a kyseliny mravčej (20,2 ml) a zmes sa zahrievala pod ' I dusíkom pri vnútornej teplote 166 °C štyri hodiny. Zmes sa ochladila a vyliala do vody (3,5 I) a extrahovala sa etylacetátom (3 x 1500 ml). Spojené etylacetátové extrakty sa premyli vodou, vysušili, prefiltrovali a odparili, čím sa získala tuhá látka, ktorá sa rozotrela s éterom a prefiltrovala, získaná tuhá látka sa rekryštalizovala z technického metylalkoholu, čím sa získal 7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín, 1.1. 178 - 179 °C.

e) Produkt z d) (3,7 g) sa miešal v suchom dimetylformamide (120 ml) pod dusíkom, pričom sa potme po častiach pridal N-brómsukcínimid (1,8 g). Zmes sa miešala 18 hodín potme a potom sa spracovala, čím sa získal 6-bróm-7cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d] pyrimidin-4-ylamín, t. t. 161,5 162.5 °C.

f) Na zmes produktu z e) (449 mg), kyanidu zinočnatého (75 mg) a Nmetylpyrolidónu (10 ml) sa pôsobilo tri(2-furyl)fosfínom (63 mg), zmes sa potom dôkladne odkysličila pod dusíkom a pridalo sa tris(dibenzylidénacetón)paládium(O) (45 mg). Zmes sa zahrievala na 90 °C a udržiavala sa pri tejto teplote 20 hodín. Pridal sa etylacetát (20 ml) a vodný roztok amoniaku (20 ml 2 M roztoku). Zmes sa miešala, etylacetátové vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa ďalej extrahovala etylacetátom. Spojené etylacetátové vrstvy sa vysušili, prefiltrovali a odparili, čím sa získal zvyšok, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom pomocou etylacetátu ako mobilnej fázy, čím sa získal 4-amino-7cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo-[2,3-d]pyrimidin-6-ylkarbonitril, t. t. 117,5 118.5 °C.

Príklad 165: 6-aminometyl-7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-ylamín

Produkt z predchádzajúceho príkladu (0,881 g) sa rozpustil v teplom etanole (20 ml) a tento roztok sa pridal do etanolu nasýteného amoniakom (200 ml). Pridal

135 Pty _rp χ χ sa Raneyov nikel (2x1 ml) a zmes sa trepala pod vodíkom 6 hodín. Vytváral sa pretlak, ktorý sa z aparatúry pravidelne uvoľňoval. Po 2 hodinách sa nádoba niekoľkokrát evakuovala a naplnila vodíkom. Po ďalších 2 hodinách sa tento postup opakoval. Nakoniec sa zmes miešala ďalších 1,5 hodiny a potom sa prefiltrovala. Filtrát sa odparil, čím sa získala tuhá látka, ktorá sa rozotrela s éterom a oddelila filtráciou, čím sa získal surový produkt, ktorý sa rozpustil v etylacetáte. Po častiach sa pridávala kyselina maleínová (0,2 g) v etylacetáte, kým dochádzalo k zrážaniu. Získaná zmes sa zahriala a rozotierala a potom sa nechala vychladnúť v priebehu 16 hodín. Tuhá látka sa oddelila filtráciou, čím sa získal 6-aminometyl7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín, t. t. 196,5 197,5 °C.

Príklad 166: 7-ŕerc-butyl-5-(N-formyl-4-fenylaminofenyl)pyrolo[2,3-d]pyrimidín

Zmes 7-terc-butyl-5-(4-jódfenyl)pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamínu (1,0 g), formanilidu (1,0 g), bezvodého uhličitanu draselného (1,0 g), jodidu medného (100 mg), práškovej medi (80 mg) a N-metylpyrolidínu (5 ml) sa zahrievala na 107 °C s miešaním pod dusíkom 22 hodín. Zmes sa ochladila a pridala sa voda. Zmes sa extrahovala etylacetátom a získaný zvyšok sa vyčistil preparatívnou HPLC s reverznou fázou, čím sa získal 7-terc-butyl-5-(N-formyl-4-fenylaminofenyl) pyrolo[2,3-d]pyrimidín, 1.1. 163 - 164 °C.

Príklad 167: 3-{4-[4-amino-7-ŕerc-butyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-7yljbenzylalkohol

Podobne ako v predchádzajúcom príklade reagoval 7-terc-butyl-5-(4jódfenyl)-pyrolo[2,3-]pyrimidin-4-ylamín (392 mg) s 3-hydroxybenzylalkoholom (372 mg) za vzniku 3-{4-[4-amino-7-ŕerc-butyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-7yljbenzylalkoholu.

Príklad 168: N-[2-[(4-amino-7-izopropylpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]fenyl}močovina

Zmes 5-[4-(2-aminofenoxy)fenyl]-7H-izopropylpyrolo[2,3-d]-pyrimidin-4ylamínu (43 mg), uhličitanu draselného (11 mg), ľadovej kyseliny octovej (7 ml) a etanolu (3 ml) sa miešala a zahrievala na 70 °C 2 hodiny. Pridala sa ďalšia ľadová kyselina octová (7 ml) a kyanatan draselný (11 mg) a zahrievanie pokračovalo pri

136 F... pj .· °C 6 hodín. Zmes sa odparila za zníženého tlaku. K zvyšku sa pridala voda a zmes sa extrahovala dichlórmetánom, čím sa získala N-[2-[(4-amino-7izopropylpyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]fenyl}močovina ako tuhá látka.

Príklad 169: 7-(2-Hydroxyetyl)-5-{4-[4-(2-hydroxyetoxy)fenoxy]fenyl} pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín

7-(2-Hydroxyetyl)-5-{4-[4-(2-hydroxyetoxy)fenoxy]fenyl}pyrolo[2,3-djpyrimidin-4-ylamín, t. t. 166 - 166,5 °C sa pripravil reakciou 5-{4-[4-(2-hydroxy)fenoxy]fenyl}-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamínu s etylénkarbonátom v N,Ndimetylformamide obsahujúcom katalytické množstvo práškového hydroxidu sodného pri teplote varu počas 1 hodiny. Produkt sa získal po spracovaní a vyčistení stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom.

Príklad 170: 5-[4-(4-Amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]indan-1-ol

5- [4-(4-Amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]indan-1-ol bol pripravený redukciou produktu z príkladu 32 podľa postupu z príkladov 109 až 137.

Príklad 171: 6-Amino-2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]benzonitril

6- Amino-2-[4-(4-amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)fenoxy]benzonitril bol pripravený podľa postupu z príkladov 35 až 108.

Príklad 172: 2-[4-(4-Amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5metylbenzonitril

2-[4-(4-Amino-7-izopropyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5metylbenzonitril bol pripravený podľa postupu z príkladov 35 až 108.

Príklad 173: 7-izopropylsulfonyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4ylamín

5-(4-Fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín (1,57 g) sa rozpustil v suchom dimetylformamide (30 ml) a potom sa za miešania pridal hydrid sodný (0,22 g 60 % disperzie v minerálnom oleji). Zmes sa miešala 30 minút, pridal sa izopropylsulfonylchlorid (0,74 g) a zmes sa miešala pri teplote prostredia 18 hodín. Do zmesi sa pridávala voda, kým dochádzalo k zrážaniu. Tuhá látka sa oddelila c c ^{Γ e} r r r ' r r c c « .

c· r r r Ĺ

137 cc .y r filtráciou a vyčistila stĺpcovou flash chrómatografiou na oxide kremičitom pomocou zmesi dichlórmetánu a metanolu (9:1) ako mobilnej fázy, čím sa získal 7izopropylsulfonyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín, t. t. 162 —

162,5 °C.

I

Príklad 174: 7-[4-amino-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-7yl]bicyklo[3,3,0joktan-3-ol

a) Bórhydrid sodný (547 mg) sa pridal po častiach do roztoku cisbicyklo[3,3,0]oktán-3,7-diónu, (2,0 g) v metanole (20 ml) pri 0 °C. Zmes sa miešala pri 0 °C 1 hodinu, nechala sa ohriať na teplotu prostredia a potom sa nechala pri tejto teplote stáť 18 hodín. Reakcia sa ukončila pridaním 2 M roztoku hydroxidu sodného (5 ml) a potom sa nakoncentrovala za zníženého tlaku. Zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (50 ml) a vodu (50 ml). Vodná vrstva sa oddelila a extrahovala etylacetátom. Spojené etylacetátové extrakty sa vysušili, prefiltrovali a odparili na olej, ktorý počas státia vykryštalizoval, čím sa získal cis-bicyklo[3,3,0]oktán-3,7-diol.

b) Zmes diolu z časti a) (0,8 g), pyridínu (10 ml) a ptoluénsulfonylchloridu (1,17 g) sa miešala pri 0 °C 2 hodiny a nechala sa stáť pri teplote prostredia 18 hodín. Zmes sa vyliala do 5 M kyseliny chlorovodíkovej a extrahovala sa etylacetátom. Spojené etylacetátové extrakty sa premyli 2 M kyselinou chlorovodíkovou, vysušili, prefiltrovali a odparili na olej obsahujúci najmä cis-7-toluénsulfonyloxybicyklo[3,3,0]oktan-3-ol, ktorý sa použil priamo v nasledujúcej časti tohto príkladu.

c) 5-(4-Fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamín (193 mg) sa pridal do zmesi hydridu sodného (52 mg 60 % disperzie v minerálnom oleji) v dimetylformamide (10 ml) s miešaním pri 0 °C pod dusíkom. Zmes sa miešala pri teplote prostredia 1 hodinu a potom sa za miešania pridal produkt z c) (190 mg). Zmes sa zahriala na 90 °C a udržiavala sa pri tejto teplote 6 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozdelila medzi etylacetát a vodu. Etylacetátové vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa extrahovala etylacetátom. Spojené etylacetátové extrakty sa premyli vodou, vysušili, prefiltrovali a odparili, čím sa získal olej, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chrómatografiou na oxide kremičitom pomocou etylacetátu a potom so stúpajúcimi množstvami metanolu až do 10% r r

f) ft c r e r r r ' c r r r , ₍ f ^r- C < ľ Z ( <

138 .l·' ,/ .

metanolu v etylacetáte ako mobilnej fázy. Príslušné frakcie sa oddelili, spojili a odparili na tuhú látku, ktorá sa premyla studeným éterom, čím sa získal 7-[4-amino5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]bicyklo[3,3,0]oktan-3-ol, t. t. 193 — 194 °C.

Príklad 175: 4-[4-amino-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-7yljcyklohexanol

Bórhydrid sodný (500 mg, 13 mmol) sa pridal naraz do miešaného roztoku 4-[4-amíno-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimin-7-yl]cyklohexan-1-ónu (780 mg, 2,0 mmol) v metanole (500 ml), zmes sa miešala pod dusíkovou atmosférou 1 hodinu a nechala sa stáť cez noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a zvyšok sa rozdelil medzi 2 M vodný roztok hydroxidu sodného (100 ml) a dichlórmetán (100 ml). Organická vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa ďalej extrahovala dichlórmetánom (2 x 100 ml). Spojené organické extrakty sa premyli vodou (150 ml), vysušili nad uhličitanom draselným a vyčistili chromatografiou na kolóne Biotage 40S pomocou zmesi etylacetátu a trietylamínu (98 : 2 až 95 : 5) a etylacetátu a etanolu (95 : 5) ako mobilnej fázy, čím sa získal 4-[4-amino-5-(4fenoxyfenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]cyklohexanol ako biela tuhá látka (750 mg, 1,9 mmol), teplota topenia: 199 - 200 °C. LC/MS: Hypersil BDS c18 (100 x 2,1 mm) 0,1 M octan amónny/acetonitril, 10 - 100 % acetonitril v priebehu 8 min), MH⁺ 401 , t_r = 4,12 min.

Príklad 176: Benzyl /V-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7W-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyljkarbamát

a) 5-bróm-2-metoxyanilín (1)

Zmes 4-bróm-1-metoxy-2-nitrobenzénu (3,0 g, 12,9 mmol) a ľadovej kyseliny octovej (25 ml) sa zahrievala na 100 °C pod dusíkovou atmosférou. Pridalo sa práškové železo (2,2 g, 38,8 mmol) a zmes sa miešala jednu hodinu pri teplote 100 °C. Zmes sa ochladila na teplotu miestnosti, pridala sa voda (100 ml) a zmes sa extrahovala etylacetátom (3 x 25 ml). Spojené organické extrakty sa premyli nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (3 x 25 ml) a potom soľankou. Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok. Vyčistením látky flash chromatografiou na silikagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (6:4) ako eluentu sa získal 5r r

139 -; - rr. ^r bróm-2-metoxyanilín (2,0 g): ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 6,76 (s, 1H), 6,71 (d, 1H), 6,61 (d, 1H), 4,99 (bs, 2H), 3,74 (s, 3H); (TLC (heptán/etyl acetát 1:1) R, 0,5; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan sodný v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t=13,33 min; MS: MH⁺ 443.

b) terc-Butyl N-(5-bróm-2-metoxyfenyl)karbamát (2)

Zmes 5-bróm-2-metoxyanilínu (1,50 g, 7,43 mmol) a di-terc-butyldikarbonátu (1,95 g, 8,91 mmol) v THF (20 ml) sa zahrievala na reflux 20 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Získaný olej sa vyčistil flash chrómatografiou na silikagéle pomocou zmesi etylacetátu a heptánu (1:9) ako eluentu, čím sa získal terc-butyl N-(5-bróm-2metoxyfenyl)karbamát (2,19 g) ako bezfarebný olej: ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,05 (s, 1H), 7,93 (d, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,95 (d, 1H), 3,8 (s, 1H), 1,47 (s, 9H); TLC (etylacetát/heptán 2:8) R_f 0,4; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 21,8 min.

c) terc-butyl N-[2-metoxy-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2yl)fenyl]karbamát (3)

Zmes terc-butyl N-(5-bróm-2-metoxyfenyl)karbamátu (1,10 g, 3,64 mmol), dibórpinacolesteru (1,11 g, 4,37 mmol), [1,ľbis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládnatého komplexu s dichlórmetánom (1:1) (0,09 g, 0,11 mol) a octan draselný (1,07 g, 10,9 mol) v N,N-dimetylformamide (20 ml) sa zahrievala na 80 °C pod dusíkovou atmosférou 16 hodín. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. K zvyšku sa pridal dichlórmetán (20 ml) a získaná tuhá látka sa oddelila filtráciou cez vrstvu celitu. Filtrát sa nakoncentroval a zanechal žltý olej, ktorý sa vyčistil flash chrómatografiou na oxide kremičitom pomocou zmesi etylacetátu a heptánu (2:8) ako mobilnej fázy, čím sa získal terc-butyl N-[2-metoxy-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamát (0,96 g): ’H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,03 (s, 1H), 7,86 (s, 1H) , 7,35 (d, 1H), 7,0 (d, 1H), 3,82 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,28 (s, 12H); TLC (etyl acetát/heptán 2:8) R, = 0,35; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite

140

Τ'- c p

Γ r <? (Γι’ o ^r r r

C18, 5 μιη, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t=22,8 min

d) ferc-butyl N-(5-(chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl)karbamát (4)

Zmes 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (0,35 g, 1,0 mmol), ferc-buty I N-[2-metoxy-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2yl)fenyl]karbamátu (0,524 g, 1,5 mmol), tetrakis(trifenylfosfín)paládia (0,07 g, 0,06 mmol) a uhličitanu sodného (0,265 g, 2,5 mmol) sa zahrievala v zmesi etylénglykoldimetyléteru (10 ml) a vody (5 ml) na 80 °C 18 hodín pod dusíkovou atmosférou. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlá sa odstránili za zníženého tlaku. Zmes sa rozdelila medzi vodu (15 ml) a etylacetát (25 ml), organická vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa ďalej extrahovala etylacetátom (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty sa premyli vodou (3 x 20 ml), vysušili nad síranom horečnatým, prefiltrovali a filtrát sa nakoncentroval na olejovitý zvyšok za zníženého tlaku. Materiál sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na oxide kremičitom pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (5:1) ako eluentu, čím sa získal ferc-butyl N-(5-(chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-djpyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl)karbamát (0,325 g): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,64 (s, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,87 (m, 2H), 7,17 (d, 1H), 7,06 (d, 1H), 5,21 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 1,652,25 (m, 8H), 1,45 (s, 9H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan sodný v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t =24,25 min, MS: MH⁺ 443.

e) 5-(3-Amino-4-metoxyfenyl)-7-cyk!opentyl-7H-pyrolo[2,3-djpyrimidin-4-amín

Roztok ferc-butyl N-(5-(chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl)karbamátu (0,325 g, 0,735 mmol) v dichlórmetáne (14 ml) sa ochladil na 0 °C a pridala sa kyselina trifluóroctová (1,4 ml). Roztok sa miešal pri 0 °C 5 minút, potom sa ohrial na teplotu prostredia a miešal sa ďalších 16 hodín. Rozpúšťadlá sa odparili za zníženého tlaku, zvyšok sa rozdelil medzi dichlórmetán (30 ml) a nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného (10 ml). Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získala pena. Materiál sa potom rozpustil v dioxáne (4 ml) a koncentrovanom (28 - 30 %) hydroxide amónnom (4 ml) a získaný roztok sa

141 r- r zahrieval na 120 C v zatavenej tlakovej ampule 20 hodín. Rozpúšťadlá sa odparili a zvyšok sa vyčistil preparatívnou C18 RP-HPLC, čím sa po lyofilizácii získal 5-(3amino-4-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7/7-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (85 mg): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,10 (s,1H), 7,21 (s, 1H), 6,87 (d, 1H), 6,74 (s,1H), 6,58 (d, 1H), 5,06 (1H, m), 4,87 (bs, 2H), 3,8 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t =11,87 min; MS: MH⁺ 324.

f) benzyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyljkarbamát

Roztok 5-(3-amino-4-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-4amínu (40 mg, 0,124 mmol) v dichlórmetáne (1 ml) a pyridíne (1 ml) sa ochladil na 0 °C a potom sa pridal benzylchlórformiát (32 mg, 0,186 mmol), pričom sa udržiavala teplota menej ako 5 °C. Roztok sa miešal ďalšiu 1 hodinu a rozpúšťadlá sa odstránili za zníženého tlaku. Vyčistením preparatívnou C-18 RP-HPLC a lyofilizáciou sa získal benzyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7/-/-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin5-yl)-2-metoxyfenyl]karbamát (25 mg) vo forme bieleho prášku: ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,75 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,1-7,4 (m, 8H), 6,2 (bs, 2H),

5,15 (s, 2H), 5,07 (m, 1H), 3,8 (s 3H), 1,6-2,2 (m, 8H), RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100% acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 18,63 min; MS: MH⁺ 458.

Príklad 177: Benzyl /V-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-5-yl)-2pyridyljkarbamát

a) ŕerc-Butyl N-(5-bróm-2-pyridyl)karbamát

Zlúčenina sa pripravila z 5-bróm-2-pyridínamínu spôsobom opísaným pre zlúčeninu (2): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,96 (s, 1H), 8,49 (d, 1H), 7,93 (dd, 1H), 7,78 (d, 1H), 1,47 (s, 9H); TLC (etylacetáVheptán 5:95) R, 0,28; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 18,50 min.

b) ŕerc-butyl N-[5-(1,1,1-trimetylstannyl)-2-pyridyl]karbamát

Zmes ŕerc-butyl /V-(5-bróm-2-pyridyl)karbamátu (1,67 g, 6,12 mmol), hexametyldicínu (2,0 g, 6,12 mmol) a tetrakis(trifenylfosfín)paládia (0,424 g, 0,367 r r mmol) v etylénglykoldimetyléteri (30 ml) sa zahrievala na 80 °C pod dusíkovou atmosférou 15 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Získaný materiál sa vyčistil flash chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi heptánu a etylacetátu (95:5) ako eluentu, čím sa získal terc-butyl /V-[5-(1,1,1-trimetylstannyl)-2-pyridyl]karbamát (1,11 g): ¹H NMR (DMSOdg, 400 MHz) δ 9,98 (s, 1H), 8,2 (t, 1H), 7,74 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 0,30 (t, 9H); TLC (heptán/etylacetát 95:5) R_f 0,2; MS: MH⁺ 359.

c) terc-butyl N-[5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2pyridyljkarbamát

Zmes 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidínu (0,25 g, 0,72 mmol), terc-butyl N-[5-(1,1,1-trimetylstannyl)-2-pyridyl)karbamátu (0,386 g, 1,08 mmol), tris(dibenzylidénacetón)dipaládia(O) (0,033 g, 0,076 mmol) a trifenylarzínu (0,055 g, 0,18 mmol) v Ν,Ν-dimetylformamide (8 ml) sa zahrievala na 65 °C pod dusíkovou atmosférou 18 hodín. Zmes sa ochladila na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Získaný materiál sa vyčistil flash chromatografiou na silikagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (75:25) ako eluentu, čím sa získal terc-butyl A/-[5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d] pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamát (0,13 g): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,83 (s, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,85-7,93 (m, 2H), 5,21 (m, 1H), 1,65-2,25 (m, 8H), 1,49 (s, 9H); TLC (heptán/etyl acetát 8:2) R, 0,18; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t_r = 21,68 min.

d) 5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinamín

Roztok terc-butyl /V-[5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-5-yl)2-pyridyl]karbamátu (0,13 g, 0,315 mmol) v dichlórmetáne (5,5 ml) sa ochladil na 0 °C a pridala sa kyselina trifluóroctová (0,6 ml). Roztok sa miešal pri 0 °C 5 minút, potom sa ohrial na teplotu prostredia a miešal sa ďalších 18 hodín. Rozpúšťadlá sa odparili za zníženého tlaku, zvyšok sa rozdelil medzi dichlórmetán (30 ml) a nasýtený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal 5-(4-chlór-7-cyklopentyl-7/7-pyrolo[2,3-Gŕ]pyrimidÍn-5-yl)-2-pyridínamín (92 mg): RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 143 r r e e

r. c p e r r c· r ^r e r r r

WO % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t=10,73 min; MS: MH⁺ 314.

e) 5-(6-amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín

5-(4-Chlór-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridínamín (92 mg, 0,291 mmol) sa rozpustil v dioxáne (2 ml) a koncentrovanom (28 - 30 %) hydroxide amónnom (2 ml) a získaný roztok sa zahrieval na 120 °C v zatavenej tlakovej ampule 24 hodín. Rozpúšťadlá sa odparili, čím sa získal 5-(6-amino-3pyridyl)-7-cyklopentyl-7/-/-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-4-amín (105 mg): RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t_r = 6,33 min; MS: MH⁺ 295.

1) Benzyl /V-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2pyridyljkarbamát

Roztok 5-(6-amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7/7-pyrolo[2,3-c/)pyrimidin-4amínu (105 mg, 0,29 mmol) v dlchlórmetáne (1,5 ml) a pyridíne (1,5 ml) sa ochladil na 0 °C a potom sa pridal benzylchlórformiát (75 mg, 0,44 mmol), pričom sa udržiavala teplota menej ako 5 °C. Roztok sa ohrial na teplotu miestnosti a miešal sa 3 hodiny. Pridal sa benzylchlórformiát (75 mg, 0,44 mmol) a zmes sa miešala 18 hodín, pridal sa ďalší benzylchlórformiát (75 mg, 0,44 mmol) a zmes sa miešala dalších 24 hodín. Pridal sa benzylchlórformiát (150 mg, 0,88 mmol) a pyridín (1 ml) a zmes sa miešala ďalších 24 hodín.. Rozpúšťadlá sa odparili za zníženého tlaku a zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (25 ml) a vodu (10 ml). Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok. Vyčistením preparatívnou C-18 RP-HPLC a rozotretím s dietyléterom sa získal benzyl N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamát (21 mg) vo forme bieleho prášku: ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 10,33 (s, 1H), 8,36 (d, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,91 (d, 1H), 7,84 (d, 1H), 7,33-7,47 (m, 6H), 6,11 (bs, 2H), 5,2 (s, 2H), 5,06 (m, 1H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 16,22 min; MS: MH⁺ 429.

144

Príklad 178: Benzyl /V-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7/-/-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3metoxyfenyl]karbamát

a) 4-bróm-3-metoxyanilín

Zmes 1-bróm-2-metoxy-2-metoxy-4-nitrobenzénu (3,0 g, 12,9 mmol) a ľadovej kyseliny octovej (25 ml) sa zahrievala na 100 °C pod dusíkovou atmosférou. Pridalo sa práškové železo (2,2 g, 38,8 mmol) a zmes ,sa miešala jednu hodinu pri teplote 100 °C. Zmes sa ochladila na teplotu miestnosti, pridala sa voda (100 ml) a zmes sa extrahovala etylacetátom (3 x 25 ml). Spojené organické extrakty sa premyli nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (3 x 25 ml) a potom soľankou. Organický roztok sa vysušil nad síranom horečnatým, prefiltroval a filtrát sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok. Vyčistením látky flash chromatografiou na silikagéle pomocou zmesi heptánu a etylacetátu (6:4) ako eluentu sa získal 4-bróm-3-metoxyanilín (1,22 g): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ

7,1 (d, 1H), 6,31 (s, 1H), 6,1 (d, 1H), 5,27 (bs, 2H), 3,72 (s, 3H); TLC (heptán/etyl acetát 1:1) R_f 0,33; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan sodný v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 11,05 min.

b) terc-butyl N-(4-bróm-3-metoxyfenyl)karbamát

Zlúčenina sa pripravila z 4-bróm-3-metoxyanilínu spôsobom opísaným pre zlúčeninu (2): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,46 (s, 1H), 7,4 (d, 1H), 7,35 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 3,78 (s, 3H), 1,48 (s, 9H); TLC (heptán/etyl acetát 8:2) R, 0,37; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 18,60 min.

c) terc-butyl /V-[3-metoxy-4-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2yl)fenyl]karbamát

Zlúčenina sa pripravila z terc-butyl A/-(4-bróm-3-metoxyfenyl)karbamátu spôsobom opísaným pre zlúčeninu (3): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,44 (s, 1H), 7,41 (d, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,01 (d, 1H), 3,68 (s, 3H), 1,48 (s, 9H), 1,24 (s, 12 H); TLC (heptán/etylacetát 8:2) R, 0,28; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 18,83 min.

145

d) ŕerc-butyl /V-[4-(4-(chlór-7-cyklopentyl-7/7-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3metoxyfenyl)karbamát

Zlúčenina bola pripravená z ŕerc-butyl /V-[3-metoxy-4-(4,4,5,5-tetrametyl1,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamátu a 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidínu spôsobom opísaným pre zlúčeninu (4): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,41 (s, 1H) < 8,59 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,15 (d, 1H), 7,04 (d, 1H), 5,17 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 3H), 1,49 (s, 9H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min ) t_r = 21,22 min; MS: MH⁺ 443.

e) benzyl /V-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7/-/-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3metoxyfenyl]karbamát

Zlúčenina bola pripravená z ŕerc-butyl /V-[4-(4-(chlór-7-cyklopentyl-7/-/pyrolo[2,3-c/]pyrimidin-5-yl)-3-metoxyfenyl)karbamátu spôsobom opísaným pre konverziu zlúčeniny (4) na zlúčeninu (6): ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,87 (s, 1H), 8,08 (s, 1H), 7,34-7,45 (m, 6H), 7,09-7,18 (m, 3H), 5,79 (bs, 2H), 5,18 (s, 2H), 5,04 (m, 1H), 3,7 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elite C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 25 min, 1 ml/min) t_r = 16,87 min; MS: MH⁺ 458.

Príklad 179: Benzyl N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-c/]pyrimidin-5-yl)-2fluórfenyljkarbamát ^a) 4-[{[7-Cyklopentyl-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-7Hpyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]amino}(2,4-dimetoxyfenyl)metyl]fenoxy živica

Z Rinkovej amidovej živice [4-(2’,4’-dimetoxyfenyl-Fmoc-aminometyl)-fenoxy živica s nasýtením 0,66 mmol/g] (6,55 g, 4,32 mmol) sa odstránili chrániace skupiny premytím /V,A/-dimetylformamidom (2x2 min), 20 % piperidínu v N,Ndimetylformamide (1x5 min, 1 x 15 min), Λ/,/V-dimetylformamidom (5x2 min), dichlórmetánom (3x2 min), a metanolom (3x2 min). Živica sa potom vysušila pri teplote 40 °C za zníženého tlaku. Živica s odstránenými chrániacimi skupinami, 4chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7/-/-pyrolo[2,3-cŕ]pyrimidín (1,80 g, 5,19 mmol), dimetylsulfoxid (100 ml) a Λ/,/V-diizopropyletylamín (4,5 ml) sa zahrievali na 100 °C 3 dni, ochladili sa na teplotu prostredia a živica sa oddelila filtráciou a premyla N,Ndimetylformamidom. Živica sa potom miešala 30 min s kyselinou octovou (0,13 g, r c

C r

146

2,16 mmol), O-benzotiazol-1-yl-/V,/V,/V’,/V-tetrametylurónium tetrafluórborátom (0,69 g, 2,16 mmol), Λ/,/V-diizopropyletylamínom (0,56 g, 4,32 mmol) a N,Ndimetylformamidom (30 ml). Živica sa oddelila filtráciou a premyla sa N,Ndimetylformamidom, dichlórmetánom a metanolom. Živica sa potom vysušila na konštantnú hmotnosť (6,25 g) za zníženého tlaku. Živica, dibórpinakolester (1,11 g, 4,37 mmol), octan draselný (0,822 g, 8,39 mmol) a tetrakis(trifenylfosfín)paládium (0,24 g, 0,21 mmol) v dimetylsulfoxide (125 ml) sa zahrievali na 85 °C pod dusíkovou atmosférou 17 hodín. Živica sa oddelila filtráciou a premyla sa N,Ndimetylformamidom, dichlórmetánom, etylacetátom a éterom. Živica sa vysušila za zníženého tlaku na hmotnosť 5,49 gramov.

b) Benzyl A/-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7A7-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2fluórfenyljkarbamát

Zmes 4-[{[7-cyklopentyl-5-(4,4,5,5-tetrametyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-7/-/pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]amino}(2,4-dimetoxyfenyl)metyl]fenoxy živice (0,5 g, 0,254 mmol), 4-bróm-2-fluóranilínu (0,484 g, 2,54 mmol), tetrakis(trifenylfosfín)paládia (0,044 g, 0,038 mmol), 2 M vodného fosforečnanu draselného (1,27 ml, 2,54 mmol) a dimetylsulfoxidu (10 ml) sa zahrievala na 85 °C 18 hodín. Zmes sa ochladila, živica sa oddelila filtráciou a premyla sa N,Ndimetylformamidom a dichlórmetánom. Živica sa druhýkrát podrobila podmienkam syntézy opísaným vyššie. Živica sa suspendovala v dichlórmetáne (2 ml) a pyridíne (2 ml), zmes sa ochladila na 0 °C a pridal sa benzylchlórformiát (0,44 g, 2,6 mmol). Po hodine miešania pri 0 °C sa zmes nechala ohriať na teplotu prostredia na 18 hodín. Živica sa oddelila filtráciou a potom sa na ňu pôsobilo 5 % kyselinou trifluóroctovou v dichlórmetáne (10 ml) počas 30 minút. Odstránením živice filtráciou sa získal filtrát, ktorý sa odparil za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok, ktorý sa vyčistil preparativnou C-18 RP-HPLC, čím sa získal benzyl A/-[4-(4-amino7-cyklopentyl-7A7-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl]karbamát (~10 mg): RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 11,47 min; MS: MH⁺ 446.

rr ee e e c e e e f c c r c c

147

Príklad 180: Benzyl A/-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-5-yl)-2(trifluórmetyl)fenyl]karbamát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v PH 454098: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 12,07 min; MS: MH⁺ 496.

Príklad 181: Benzyl /\/-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7/-/-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-5-yl)-2kyanofenyljkarbamát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v PH 454098: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 10,93 min; MS: MH⁺ 453.

Príklad 182: Metyl 5-(4-amino-7-cyklopentyl-7/-/-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2{[(benzyloxy)karbonyl]amino}benzoát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v PH 454098: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 13,28 min; MS: MH⁺486.

Príklad 183: Benzyl /\/-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-5-yl)-2metylfenyljkarbamát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v PH 454098: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25- 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_f = 11,25 min; MS: MH⁺ 442.

Príklad 184: Benzyl A/-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-5yl)fenyl]karbamát

Táto zlúčenina bola pripravená rovnakým spôsobom ako v PH 454098: RPHPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 - 100 % acetonitril - 0,1 M octan amónny v priebehu 10 min, 1 ml/min) t_r = 11,27 min; MS: MH⁺ 428.

Príklad 185: A/-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]fenylmetánsulfónamid

5-(4-Amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (27 mg, 0,083 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (0,8 ml). Pridal sa pyridín (0,8 ml) a po ňom fenylmetánsulfonylchlorid (19 mg, 0,105 mmol). Po miešaní cez noc sa pridalo ďalších 19 mg fenylmetánsulfonylchloridu a reakčná zmes sa miešala cez r C η c

148 r c ^r r· r

Γ Γ·

Λ · noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa vyčistil preparatívnou tenkovrstvovou chromatografiou elúciou zmesou dichlórmetánu a metanolu (95:5), čím sa získal N[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyljfenylmetánsulfonamid (9 mg, 0,0188 mmol). 1H NMR (DMSO-d₆) δ

1,89 (m, 6H), 2,28 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 4,38 (s, 2H), 5,23 (m, 3H), 6,08 (bs, 1H),

6,99 (m, 2H), 7,27, (m, 2H), 7,33 (m, 3H), 7,58 (d, J = 8,17 Hz, 1H), 8,34 (s, 1H). LC/MS MH⁺=478

Príklad 186: Λ/1 -[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-2-fenylacetamid

5-(4-Amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (28mg, 0,086 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (1 ml). Pridal sa pyridín (1 ml) a po ňom 2-fenyletanoylchlorid (14 μΙ, 0,105 mmol). Po miešaní cez noc sa pridalo ďalších 14 μΙ fenylmetánsulfonylchloridu a reakčná zmes sa miešala cez noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa vyčistil preparatívnou tenkovrstvovou chromatografiou elúciou zmesou dichlórmetánu a metanolu (95:5), čím sa získal A/1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7/7-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2metoxyfenyljfenylacetamid (7 mg, 0,0158 mmol). ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,89 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 3,77(s, 3H), 3,79 (s,2H), 5,21 (m, 1H), 5,56 (bs, 2H), 6,89 (s, 1H), 6,99 (s, 1H), 7,05(d, J = 8,22, 1H), 7,36 (m, 5H), 7,81(s, 1H), 8,27 (s, 1H),

8,43 (d, J = 8,23 Hz, 1H). LC/MS MH⁺=442.

149

Príklad 187: Λ/1 -[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-ď]pyrinnidin-5-yl)-2metoxyfenyl]-2-(2-tienyl)acetamid

5-(4-Amino-3-métoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amín (31 mg, 0,096 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (1 ml). Pridal sa pyridín (1 ml) a po ňom 2-(2-tienyi)etanoylchlorid (14 μΙ, 0,113 mmol). Pp miešaní cez noc sa pridalo ďalších 14 μΙ 2-(2-tienyl)ethanoylchloridu a reakčná zmes sa miešala cez noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa vyčistil preparatívnou tenkovrstvovou chrómatografiou elúciou zmesou dichlórmetánu a metanolu (95:5), čím sa získal A/1-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7/-/-pyrolo[2,3-djpyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl]-2-(2tienyl)acetamid (14 mg, 0,031 mmol). 1H NMR (DMSO-d₆) δ 1,89 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 3,82(s, 3H), 3,99 (s, 2H), 5,19 (bs, 2H), 5,21 (m, 1H), 6,93 (s, 1H), 6,94 (s, 1 H), 7,06 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 8,02 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,42 (d, J = 8,22 Hz, 1H). LC/MS MH⁺=448.

Nasledujúce zlúčeniny boli pripravené vyššie opísanými metódami:

Príklad 177

Príklad 176

150

Príklad 178

Príklad 180

Príklad 182

Príklad 183 r r.

e β

Príklad 184

Príklad 185

Príklad 186

Príklad 187

Všeobecný postup na prípravu pyrolopyrimidínarylsulfónamidov: Do 0,225 M roztoku 5-(4-amino-3-fluórfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo [2,3-d] pyrimidin-4-amínu v pyridíne sa pridal jeden ekvivalent substituovaného arylsulfonylchloridu. Táto zmes sa zahrievala s miešaním na 45 °C 24 hodín. Produkt sa oddelil z reakčnej zmesi preparatívnou RP-HPLC (Hypersil BDS C18, (5 pm náplň; 100 x 21,2 mm) použitím gradientu 0,05 M, pH 4,5 vodného octanu amónneho a acetonitrilu (0-100 % v priebehu 12,5 min pri 25 ml/min).

Príklady 188 -249 boli pripravené všeobecnou metódou opísanou vyššie.

Molekulová hmotnosť podľa určenia hmotnostnou spektrometriou (MH⁺) a retenčné časy HPLC (RT) v minútach sú uvedené pri každom príklade.

c o

	r λ e e n r c c <.. c r t' c r c β c C ζ f 152 -Γ· o r o / ( r ι ξ C r. · r <·. r < r c r· r r.
ofA NH2 yý w . 0	0 AY ψέ'-Μ Fy_ľ 0 nh2 νΆΆ ^ιΛν' ύ
Príklad 188	Príklad 189
MH+ 469,9	MH+ 469,92
RT 3,03	RT 2,99

H XT F 0 nh2 \X νΆΆ w 0	^-vch3 o íl R-s'AX F Γ* 0 NH2 νΆΆ W ύ
Príklad 190	Príklad 191
MH+ 485,89	MH+ 465,9
RT 3,12	RT 3,11

r r <“ ο

Príklad 192 ΜΗ+ 501,97 RT 3,22

Príklad 193 MH+ 519,88 RT3.15

Príklad 195 MH+ 561,73 RT 3,2

Príklad 194

ΜΗ+ 519,84

RT 3,19 r p

Príklad 196 MH+ 555,77 RT 3,45

Príklad 197 MH+ 476,89 RT 2,85

Príklad 198 MH+ 469,9 RT 2,92

Príklad 199 MH+ 496,93 RT 3,65 f π

Príklad 200 MH+ 496,94 RT 3,66

Príklad 201 MH+ 485,87

RT 3,79 o

Príklad 202 MH+ 496,9 RT 3,65

Príklad 203 MH+ 487,9 RT 3,55 c c η e r c

156

Príklad 204 MH+ 535,9 RT 3,82

Príklad 205 MH+ 530,92 RT 3,43 o

Príklad 206 MH+ 541,95 RT 3,35

Príklad 207 MH+ 465,89 RT 3,45 r r r

157

Príklad 208 MH⁺ 602,99 RT 3,56

Príklad 209 MH⁺ 503,85 RT 3,48

Príklad 210 MH⁺ 503,88 RT 3,53

Príklad 211

MH⁺ 483,9

RT 3,47 € r

158

Príklad 212 MH⁺ 567,74 RT 3,53

Príklad 213 MH⁺ 577,88 RT 3,65

Príklad 215 MH⁺ 501,93 RT 3,16

Príklad 214

MH⁺ 603,05

RT 3,4 f A

Γ C r r r. r

159 .

Príklad 216 MH⁺ 564,96 RT 3,34

Príklad 217 MH⁺ 577,88

Príklad 219

MH⁺ 545,04

RT 3,58

Príklad 218

MH⁺ 545,01

RT 3,5 r r c r

160 ľ í

Príklad 220 MH⁺ 487,9 RT 3,43

Príklad 221 MH⁺ 499,92 RT 3,46

Príklad 222 MH⁺ 510,88 RT 3,41

MH⁺ 505,93 RT 3,46 r r

161 r

C .··

Príklad 224 MH⁺ 553,96 RT 3,55

Príklad 225 MH⁺ 587,97 RT 3,6

Príklad 227

MH⁺ 487,9

RT 3,6

Príklad 226

MH⁺ 553,9

RT 3,88 r r.

162

Príklad 228 MH* 587,9 RT 3,9

Príklad 229 MH* 545,8 RT 3,93

Príklad 231

MH* 487,9

RT 3,6

Príklad 230

MH* 615,8

RT 4,02 r r r r

163

Príklad 232 MH⁺ 549,8 RT 3,82

Príklad 233 MH⁺ 533,8 RT 3,89

Príklad 235 MH⁺ 555,8 RT 3,93

Príklad 234

MH⁺ 519,9

RT 3,74 r r

164 r < r c c e p r f. r r e

C r

C -· r. f f p r c .· c r r ,· c . <

r t o v f ^r r. r r f. ' r

C Γ ·· Γ , - *

Príklad 236 MH⁺ 496 RT 3,49

Príklad 237 MH⁺ 514 RT 3,92

Príklad 239 MK⁺ 528 RT 3,84

Príklad 238

MH⁺ 519,9

RT 3,78 r r

165

Cer C ζ c

Príklad 240 MH⁺ 502 RT 3,66

Príklad 241 MH⁺ 532 RT 3,85

Príklad 242 MH⁺ 4,16 RT 4,16

Príklad 243 MH⁺ 3,97 RT 3,97 r c

166

Príklad 244 MH⁺ 547,9 RT 2,72

Príklad 245 MH⁺ 503 RT 3,64

Príklad 246

Príklad 247 c e

167

Príklad 248 Príklad 249

Všeobecná syntéza pre príklady 250 - 269

Do 0,225 M roztoku 5-(4-amino-3-metoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-amínu (alebo 5-(4-amino-3-fluórfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-amínu alebo 5-(4-amino-3-chlórfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3d]pyrimidin-4-amínu) v pyridíne sa pridal jeden ekvivalent substituovaného arylsulfonylchloridu. Táto zmes sa zahrievala s miešaním na 45 °C 24 hodín. Produkt sa z reakčnej zmesi oddelil preparatívnou C18 RP-HPLC. Analytické RPHPLC RT uvedené v tabuľke sa získali na kolóne Hypersil HyPurity Elite C18 ((5 pm, 200 A) 250 x 4,6 mm) pomocou lineárneho gradientu 25 - 100% acetonitril/0,1 M octan amónny v priebehu 25 min pri 1 ml/min.

Pri zavádzaní reaktívnych substituentov môžu byť potrebné vhodné ochranné skupiny.

Zlúčeniny 250 - 269 boli pripravené všeobecnou metódou opísanou vyššie. Molekulová hmotnosť podľa určenia hmotnostnou spektrometriou (MH⁺) a retenčné časy HPLC (RT) v minútach sú uvedené pri každom príklade.

e s

168

HjC O

o.

s

Príklad 250 MH⁺ 478,1 RT 13,9

Príklad 251 MH⁺ 494,1 RT 15,68

Príklad 252 MH⁺ 498,0 RT 15,12

Príklad 253 MH⁺ 514,0 RT 17,7 e e

169 c Λ O c e r c c c n c o r r r.

Príklad 254 MH* 464,1 RT 10,4

Príklad 255

MH* 480,1

RT 11,2

Pripravené z príkladu 251 pôsobením BBr₃ v dichlórmetáne.

Príklad 257 MH* 542,1,544,0 RT 17,45

Príklad 256

MH* 482,1

RT 15,65

170 n r e o r r c r r n e r f c r. c r r r

Príklad 258 MH⁺ 509,2 RT 15,8

Príklad 259 MH⁺ 557,2 RT 19,55

Príklad 260 Príklad 261

MH⁺ 477,1 MH⁺ 512,0

RT 11,6 RT 17,62

Vyrobené hydrogenáciou príkladu 258 nad Pd/C tí e e

171 r c e c c n r r _r

-r r r p n p r

Príklad 262 MH* 506,0 RT 9,93

Príklad 263 MH⁺ 502,0 RT 18,23

Príklad 265 MH⁺ 502,0 RT 17,6

Príklad 264

MH⁺ 502,0

RT 18,02 * e

172 f C C ( r c e r ť Λ r f c ·'. r o c

Príklad 266 Príklad 267

MH⁺ 507,1 Mhľ 486,1

RT 12,2 RT 15,68

Vyrobené z príkladu

262 pôsobením EDC, HOAt,

ME₂NH v DMF.

Príklad 268 MH⁺ 486,1 RT 16,35

Príklad 269 MH⁺ 486,1 RT 16,7

173 r *

Zlúčeniny 270 až 282 boli syntetizované nasledujúcimi metódami.

Prístup 1

a) Zmes príslušného brómarylsulfónamidu (0,735 mmol), bispinakolatodiboránu (0,225 g, 0,88 mmol), [1,ľbis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládnatého komplexu s dichlórmetánom (1:1) (2 mg, 0,002 mol) a octanu draselného (0,216 g, 2,205 mol) v A/./V-dimetylformamide (5 ml) sa zahrievala na 100°C pod dusíkovou atmosférou 16 hodín. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. K zvyšku sa pridal dichlórmetán (20 ml) a získaná tuhá látka sa oddelila filtráciou cez vrstvu celitu. Filtrát sa nakoncentroval na žltý olej, ktorý sa vyčistil flash chromatografiou na silikagéle, čím sa získal sulfónamidoarylborát.

b) Zmes 4-chlór-7-cyklopentyl-5-jód-7H-pyrolo[2,3-c0pyrimidínu (0,35 g, 1,0 mmol), sulfónamidoarylborátu, (1,5 mmol; z vyššie uvedeného 1(a)), tetrakis(trifenylfosfín)paládia (0,07 g, 0,06 mmol) a uhličitanu sodného (0,265 g, 2,5 mmol) sa zahrievala v zmesi etylénglykoldimetyléteru (10 ml) a vody (5 ml) na 80 °C 18 hodín pod dusíkovou atmosférou. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlá sa odstránili za zníženého tlaku. Zmes sa rozdelila medzi vodu (15 ml) a etylacetát (25 ml), organická vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa ďalej extrahovala etylacetátom (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty sa premyli vodou (3 x 20 ml), vysušili sa nad síranom horečnatým, prefiltrovali a filtrát sa za zníženého tlaku nakoncentroval na olejovitý zvyšok, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chromatografiou na silikagéle, čím sa získal príslušný sulfonamidoaryl-4-chlórpyrolo[2,3-d]pyrimidín.

c) 4-Chlór-pyrolo[2,3-d]pyrimidín (väčšinou 10-20 mmol; z vyššie uvedeného 1(b)) sa zmiešal s dioxánom (100 ml) a koncentrovaným hydroxidom amónnym (100 ml) v tlakovej nádobe. Zmes sa zahrievala na 120 °C cez noc.

174 e r

Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa vyčistil RP-HPLC, čím sa získal požadovaný konečný 4-amino-pyrolo[2,3-d]pyrimidínový produkt.

Prístup 2

a) Zmes príslušného brómanilínu (2,4 mmol), bispinakolatodiboránu (0,735 g, 2,88 mmol), [1,ľ-bis(difenylfosfino)ferocén]dichlórpaládnatého komplexu s dichlórmetánom (1:1) (59 mg, 0,072 mol) a octanu draselného (0,707 g, 7,205 mol) v M/V-dimetylformamide (15 ml) sa zahrievala na 100 °C pod dusíkovou atmosférou 16 hodín. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku. Pridal sa toluén (20 ml) a zmes sa premyla vodou (2 x 15 ml). Organické fázy sa vysušili nad MgSO₄(s), nakoncentrovali vo vákuu a vyčistili flash chrómatografiou na silikagéle, čím sa získal príslušný anilinoborát.

b) Zmes anilinoborátu, (1,01 mmol; z vyššie uvedeného 2(a)), 4-chlór-7cyklopentyl-5-jód-7/-/-pyrolo[2,3-ď]pyrimidínu (0,24 g, 0,67 mmol), tetrakls(trifenylfosfín)paládia (0,04 g, 0,033 mmol) a uhličitanu sodného (0,215 g, 2,03 mmol) sa zahrievala v zmesi etylénglykoldimetyléteru (10 ml) a vody (5 ml) na 80 °C 18 hodín pod dusíkovou atmosférou. Zmes sa nechala vychladnúť na teplotu prostredia a rozpúšťadlá sa odstránili za zníženého tlaku. Zmes sa rozdelila medzi vodu (15 ml) a etylacetát (25 ml), organická vrstva sa oddelila a vodná vrstva sa ďalej extrahovala etylacetátom (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty sa premyli vodou (3 x 20 ml), vysušili nad síranom horečnatým a prefiltrovali. Filtrát sa za zníženého tlaku nakoncentroval na olejovitý zvyšok, ktorý sa vyčistil stĺpcovou flash chrómatografiou na silikagéle, čím sa získal požadovaný 4-chlór-7-cyklopentyl-5-(4aminofenyl)-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimid í n.

c) Zmes 4-chlór-7-cyklopentyl-5-(4-aminofenyl)-7H-pyrolo[2,3c/jpyrimidínu (0,201 mmol; z vyššie uvedeného 2(b)), arylsulfonylchlorid (0,402 mmol) a pyridín (1,005 mmol) v dichlórmetáne sa miešala pri teplote miestnosti 16 hodín. Rozpúšťadlá sa oddelili filtráciou a sulfónamido-4-chlór-pyrolopyrimidínový produkt sa vyčistil pomocou RP-HPLC.

e e e e

175

d) Sulfónamido 4-chlór-pyrolo[2,3-d]pyrimidín (väčšinou 10-20 mmol; z vyššie uvedeného 2(c)) sa zmiešal s dioxánom (100 ml) a koncentrovaným hydroxidom amónnym (100 ml) v tlakovej nádobe. Zmes sa zahrievala na 120 °C cez noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa vyčistil RP-HPLC, čím sa získal požadovaný konečný sufónamido-4-amino-pyrolo[2,3-d]pyrimidínový produkt.

Analytické RP-HPLC RT uvedené v tabuľke sa získali na kolóne Hypersil HyPurity Elite C18 ((5 pm, 200 A) 250 x 4,6 mm) pomocou lineárneho gradientu 25 - 100 % acetonitril/O, 1 M octan amónny v priebehu 25 min pri 1 ml/min.

Pri zavádzaní reaktívnych substituentov môžu byť potrebné vhodné ochranné skupiny.

Príklad 270 MH* 422,2 RT 14,03

Príklad 271 MH* 452 RT 16,28

176

Príklad 272 MH⁺ 468,1 RT 17,12

Príklad 273 MH⁺ 448,2

Príklad 274 MH⁺ 477,1 RT 20,53

Príklad 275 Mhľ 432,1 RT 18,85

Príklad 276 MH⁺ 476 RT 13,26

Príklad 277 MH⁺ 488,2 RT 17,7 r r r r

177-

Príklad 278 MH⁺ 477,1 RT 13,45

Príklad 279 MH⁺ 492,1 RT 17,52

Príklad 280 MH⁺ 470,1 RT 15,08

Príklad 281 MH⁺ 464,2 RT 14,82 o c r c r r r

17£ í;

Príklad 282 MH* 464,2 RT 14,15

Aj nasledujúce zlúčeniny boli pripravené pomocou všeobecnej metódy podľa popisu pre príklady 188 - 249.

Príklad 283 MH* 645,8 RT 3,66

1^

Príklad 284 MH⁺ 673,1 RT 3,73

Príklad 285 MH⁺ 524 RT 3,52 r c r, c· r r e r ti c C r c

CO r ,

C p ť f

P ť Γ f c o c '· r c r ô

r.· o >. · · o r .-

MH⁺ 516,1 RT 3,42

Príklad 287

Príklad 289 r r

18λ>

Príklad 291

Príklad 292 r r

Príklad 293

Príkla					Štruktúra			HPLC	MS
d								RT	MH+
294						F		3,65	534,1
					0		T
						Z\
					N \\			F
				r	/ 0	~y
	ľ	J ·
	r	r			>
		y		'N

Γ Ω

184-

r f

HPLC

RT

MS

MH⁺

18Γ

2,23

3,39

455,9

503,92 o ΓΠ ,·· r r c

186* |· G r f f f C P

r. r r c <, ' Γ Γ <·

c r

187·

Príkla d	Štruktúra	HPLC RT	MS MH+
301					Ck		3,16	531,86
					θ	v-—N y
				F	H. w /N w j 0	C / \s \=J
					o
		ľ	4H2
	ľ	r			>
				N b

e r

18ž?

W

c Γ

190 f r r A r r e ’ o r r- ľ f f í* Γ »· e r r. ,· f. ; .f

• r o r:

c c f.

194 r r.

19P-

<r ŕ

19$

e r

19l· e c r

r e r r r r r r r _r r

195· / 'i.’' /.:

e r

19S e fr f n ŕ • í c

Γ r * e

Príkla d

3Ϊ8

Štruktúra

HPLC

RT

MS

MH⁺

3,72

566,7

Br

e n

193C · r r r r. ľ

Γ <·

198

Príkla d

Štruktúra

HPLC

RT

MS

MH⁺

I

TT*

Claims (45)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. 4-Aminopyrolopyrimidíny štruktúrneho vzorca I a ich farmaceutický prijateľné soli, kde:

   Kruh A je šesťčlenný aromatický kruh alebo päť- alebo šesťčlenný heteroaromatický kruh, ktorý je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi vybranými zo skupiny, ktorú tvorí substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina, halogén, substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaralkyl, kyano, nitro, -NR⁴R⁵, -C(O)₂H, -OH, substituovaný alebo nesubstituovaný alkoxykarbonyl, -C(O)₂-haloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný alkyltioéter, substituovaný alebo nesubstituovaný alkylsulfoxid, substituovaný alebo nesubstituovaný alkylsulfón, substituovaný alebo nesubstituovaný aryltioéter, substituovaný alebo nesubstituovaný arylsulfoxid, substituovaný alebo nesubstituovaný arylsulfón, substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl karbonyl, -C(O)-haloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný alifatický éter, substituovaný alebo nesubstituovaný aromatický éter, substituovaný alebo nesubstituovaný karboxamido, tetrazolyl, trifluórmetylsulfonamido, trifluórmetylkarbonylamino, substituovaný alebo nesubstituovaný alkinyl, substituovaný alebo nesubstituovaný alkylamido alebo alkylkarboxamido; substituovaný alebo nesubstituovaný arylamido alebo arylkarboxamido,

   204

   C ' Γ í r r r·

   O C r f . r r r e r r r

   1- r r r r. c r Γ r· substituovaný alebo nesubstituovaný styryl and substituovaný alebo nesubstituovaný aralkylamido alebo aralkylkarboxamido;

   L je -O-; -S-; -S(O)-; -S(O)₂-; -N(R)-; -N(C(O)OR)-; -N(C(O)R)-; -N(SO₂R)-; CH₂O; -CH₂S-; -CH₂N(R)-; -CH(NR)-;-CH₂N(C(O)R))-; -CH₂N(C(O)OR)-;QH₂N(SO₂R)-; -CH(NHR)-; -CH(NHC(O)R)-; -CH(NHSO₂R)-; CH(NHC(O)OR)-;-CH(OC(O)R)-; CH(OC(O)NHR)-; -CH=CH-; -C(=NOR)-; C(O)-; -CH(OR)-;-C(O)N(R)-; -N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-;-N(R)S(O)₂-;OC(O)N(R)-;-N(R)C(O)N(R)-; -NRC(O)O-;-S(O)N(R)-;-S(O)₂N(R)-;

   N(C(O)R)S(O)-; N(C(O)R)S(O)₂-; -N(R)S(O)N(R)-; -N(R)S(O)₂N(R)-;

   -C(O)N(R)C(O)-; -S(O)N(R)C(O)-; -S(O)₂N(R)C(O)-; -OS(O)N(R)-; OS(O)₂N(R)-; -N(R)S(O)O-; -N(R)S(O)₂O-; -N(R)S(O)C(O)-; -N(R)S(O)₂C(O)-; -SON(C(O)R)-; -SO₂N(C(O)R)-; -N(R)SON(R)-; -N(R)SO₂N(R)-; -C(O)O-; N(R)P(OR’)O-; -N(R)P(OR’)-; -N(R)P(O)(OR’)O-; -N(R)P(O)(OR’)-; N(C(O)R)P(OR’)O-; -N(C(O)R)P(OR>; -N(C(O)R)P(O)(OR’)O- alebo N(C(O)R)P(OR’)-, kde R a R’ sú každé nezávisle -H, acyl, substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina alebo substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl; alebo

   L je -R^bN(R)S(O)₂-, -R^bN(R)P(O)- alebo -R^bN(R)P(O)O-, kde R^b je alkylénová skupina, ktorá vzatá spolu so sulfónamidovou, fosfínamidovou alebo fosfónamidovou skupinou, na ktorú je viazaná, tvorí päť- alebo šesťčlenný kruh nakondenzovaný na kruh A; alebo

   L je zastúpené jedným z nasledujúcich štruktúrnych vzorcov:

   Γ· Γ·

   Ο

   Ν-Ρ
2. 2 ΟΧ } Λ. Λ Λ

   R85-Q

   R85-O

   R85-O ο

   R85 alebo

   R85 kde R⁸⁵ vzaté spolu s fosfínamidom alebo fosfónamidom je 5-, 6- alebo 7,členný aromatický, heteroaromatický alebo heterocykloalkylový kruh;

   R¹ je -H, 2-fenyl-1,3-dioxan-5-yl, C^Cg alkyl, C₃-C₈ cykloalkyl, C₅-C₇ cykloalkenyl alebo voliteľne substituovaný fenylíC^Cg-alkyl), kde alkyl, cykloalkyl a cykloalkenyl je voliteľne substituovaný jednou alebo viacerými skupinami vzorca -OR^a; za predpokladu, že -OR^a sa nenachádza na uhlíku pripojenom ná dusík;

   R^a je -H alebo C_rC₆ alkyl alebo C₃-C₆ cykloalkyl;

   R² je -H, substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, halogén, -OH, kyano, substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaralkyl, -NR⁴R⁵ alebo -C(O)NR⁴R⁵;

   R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina alebo substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl; alebo L je NRSO₂-, NRC(O)-, -NRC(O)O-, -S(O)₂NR-, C(O)NR- alebo -OC(O)NR- a R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl, ’· f. O r r · C f .· r. <* λ i* r

   20á / ^: ‘ ¹ '· . r substituovaný alebo nesubstituovaný alkenyl alebo substituovaný alebo nesubstituovaný aralkyl;

   za prepokladu, že j je 0, keď L je -CH₂NR-, -C(O)NR- alebo -NRC(O)- a R³ je azacykloalkyl alebo azaheteroaryl; a

   I za predpokladu, že j je 0, keď L je -O- a R³ je fenyl;

   R⁴, R⁵ a dusíkový atóm spolu tvoria 3, 4, 5, 6 alebo 7-členný substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl alebo substituovanú alebo nesubstituovanú heteroaromatickú skupinu; alebo

   R⁴ a R⁵ sú každé nezávisle -H, azabicykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo Y-Z;

   Y je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z -C(O)-, -(CH₂)_P-, -S(O)₂-, -C(O)O-, SO₂NH-, -CONH-, (CH₂)_pO-, -(CH₂)_pNH-, -(CH₂)_pS-, -(CH₂)_pS(O)- a (CH₂)_pS(O)₂-;

   p je celé číslo od 0 do 6;

   Z je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný amino, substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl alebo substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl; a j je celé číslo od 0 do 6.

   2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R³ je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nasledujúcich: substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný alebo nesubstituovaný naftyl, substituovaný alebo nesubstituovaný pyridyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tienyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzotriazol, substituovaný alebo nesubstituovaný tetrahydropyranyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tetrahydrofuranyl, ŕ o

   20¼ substituovaný alebo nesubstituovaný dioxán, substituovaný alebo nesubstituovaný dioxolán, substituovaný alebo nesubstituovaný chinolín, substituovaný alebo nesubstituovaný tiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný izoxazol, substituovaný alebo nesubstituovaný cyklopentanyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzofurän, substituovaný alebo nesubstituovaný benzotiofén, substituovaný alebo nesubstituovaný benzizoxazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzizotiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzotiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzoxazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzimidazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzoxadiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný benzotiadiazol, substituovaný alebo nesubstituovaný izochinolín, substituovaný alebo nesubstituovaný chinoxalín, substituovaný alebo nesubstituovaný indol and substituovaný alebo nesubstituovaný pyrazol.
3. 3. Zlúčenina podľa nároku 2, kde R³ je substituované jedným alebo viacerými substituentmi vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nasledujúcich: F, Cl, Br, I, CH₃, NO₂, OCF_3i OCH_3i CN, -CHO, CO₂CH₃, CF₃, t-butyl, pyridyl, substituovaný alebo nesubstituovaný oxazolyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzénsulfonyl, substituovaný alebo nesubstituovaný fenoxy, substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný alebo nesubstituovaný amino, karboxyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tetrazolyl, styryl, -S-(substituovaný alebo nesubstituovaný aryl), -S-(substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl), substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, alkinyl, -C(O)NR^fR⁹, R^c a CH₂OR^C.

   R^f, R⁹ a dusíkový atóm spolu tvoria 3-, 4-, 5-, 6- alebo 7-členný substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl alebo substituovanú alebo nesubstituovanú heteroaromatickú skupinu

   r. * r> r,

   205

   R^f a R⁹ sú každé nezávisle -H, substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina alebo substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina; a

   R^c je vodík alebo substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, -W-(CH2)t-NR^dR^e, -W-(CH2),-O-alkyl, -W-(CH₂)_t-S-alkyl, -W-(CH₂)_t-OH;

   t je celé číslo od 0 do 6;

   W je väzba alebo -0-, -S-, -S(0)-, -S(0)₂- alebo -NR^k-;

   R^k je H alebo alkyl; a

   R^d, R^e a atóm dusíka, na ktorý sú napojené, spolu tvoria 3, 4, 5, 6 alebo 7členný substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl alebo substituovanú alebo nesubstituovanú heterobicyklickú skupinu; alebo

   R^d a R^e sú každé nezávisle -H, alkyl, alkanoyl alebo -K-D;

   K je -S(O)₂-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)₂- alebo priama väzba;

   D is substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný alebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaná alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaralkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný cykioalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaná alebo nesubstituovaná amínoskupina, substituovaný alebo nesubstituovaný aminoalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aminocykloalkyl, COOR' alebo substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl; a

   R¹ je substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina alebo substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina.

   Γ Γ

   206*
4. 4. Zlúčenina podľa nároku 3, kde R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný fenyltienyl, benzoxadiazolyl alebo benzotiadiazolyl.
5. 5. Zlúčenina podľa nároku 1, kde kruh A je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z nasledujúcich: substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný alebo nesubstituovaný naftyl, substituovaný alebo nesubstituovaný pyridyl a substituovaný alebo nesubstituovaný indol.
6. 6. Zlúčenina podľa nároku 5, kde kruh A je substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nasledujúcich: F, Cl, Br, I, CH₃, NO_2i OCF_3i OCH_3i CN, CO₂CH₃, CF₃, t-butyl, pyridyl, substituovaný alebo nesubstituovaný oxazolyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzyl, substituovaný alebo nesubstituovaný benzénsulfonyl, substituovaný alebo nesubstituovaný fenoxy, substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný alebo nesubstituovaný amino, karboxyl, substituovaný alebo nesubstituovaný tetrazolyl, styryl, -S-(substituovaný alebo nesubstituovaný aryl), -S-(substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl), substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, alkinyl, -C(O)NR^fR⁹, R^c a CH₂OR^C.

   R^f, R⁹ a dusíkový atóm spolu tvoria 3-, 4-, 5-, 6- alebo 7-členný substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl alebo substituovanú alebo nesubstituovanú heteroaromatickú skupinu; alebo

   R^f a R⁹ sú každé nezávisle -H, substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina alebo substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina; a

   R^c je vodík alebo substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, -W-(CH2),-NR^dR^e, -W-(CH2)_t-O-alkyl, -W-(CH₂)_t-Salkyl alebo -W-(CH₂),-OH;

   t je celé číslo od 0 do 6;

   20?

   Wje väzba alebo -0-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- alebo -NR^k-;

   R^k je H alebo alkyl; a

   R^d, R^e a atóm dusíka, na ktorý sú napojené, spolu tvoria 3, 4, 5, 6 alebo 7členný substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl alebo substituovaný alebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl alebo substituovanú alebo nesubstituovanú heteroaromatickú skupinu; alebo

   R^d a R^e sú každé nezávisle -H, alkyl, alkanoyl alebo -K-D;

   K je -S(O)₂-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)₂- alebo priama väzba;

   D je substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný alebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaná . alebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaralkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaná alebo nesubstituovaná aminoskupina, substituovaný alebo nesubstituovaný aminoalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aminocykloalkyl, COOR¹ alebo substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl; a

   R' je substituovaná alebo nesubstituovaná alifatická skupina alebo substituovaná alebo nesubstituovaná aromatická skupina.
7. 7. Zlúčenina podľa nároku 6, kde kruh A je substituovaný alebo nesubstituovaný fenyl.
8. 8. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R¹ je cyklopentyl, hydroxycyklopentyl alebo izopropyl.
9. 9. Zlúčenina podľa nároku 1 vybraná zo skupiny pozostávajúcej z nasledujúcich:

   f « Γ β · c ο t r r · Π r r*;

   r r c r n r r_{A A} — ^{r r} n c o r .·

   208 ľ,- ^r ° ' ^{w r} · c . < c· c o f

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2(trifluórmetoxy)-l-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-2chlór-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-2fluór-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2chlór-1 -benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-3fluór-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-1benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2₎3-d]pyrimidin-5-yl)-2-nitrofenyl)-1benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidÍn-5-yl)-2-chlórfenyl)-3(trifluórmetyl)-l-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-4chlór-1 -benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlórfenyl)-2kyano-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2nitro-1 -benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fIuórfenyl)-2,6difluór-1 -benzénsulfónamid;

   209

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-metoxyfenyl)1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)2,3,4-trifluór-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-4bróm-2-fluór-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,5difluór-1 -benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-3,4difluór-1 -benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2bróm-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,6dichlór-1 -benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)2,4,6-trichlór-l-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,4dichlór-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2chlór-4-fluór-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,4difluór-1 -benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2jód-1-benzénsulfónamid;

   r r

   210 ./ N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,3dichlór-1 -benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-4bróm-2,5-difIuór-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2chlór-4-kyano-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2chlór-6-metyl-1-benzénsulfónamid;

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-3chlór-2-metyl-1 -benzénsulfónamid;

   N2-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-4,5dibróm-2-tiofénsulfónamid,

   N2-(4-(4-amino-7-cykiopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-5bróm-2-tiofénsulfónamid,

   N2-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-3bróm-5-chlór-2-tiofénsulfónamid,

   N3-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-2,5dichlór-3-tiofénsulfónamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)2.1.3- benzotiadiazol-4-sulfónamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)2.1.3- benzoxadiazol-4-sulfónamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fIuórfenyl)-7chlór-2,1,3-benzoxadiazol-4-sulfónamid,

   214

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-7metyl-2,1,3-benzotiadiazol-4-sulfónamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-5metyl-2,1,3-benzotiadiazol-4-sulfónamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-5chlór-2,1,3-benzotiadiazol-4-sulfónamid,

   N-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)-(2nitrofenyl)metánsulfónamid; a

   N1-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluórfenyl)2,5-dibróm-3,6-difluór-1-benzénsulfónamid;

   a ich farmaceutický prijateľné soli.
10. 10. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R² je -H.
11. 11. Zlúčenina podľa nároku 1, kde L je -0-, -NHS0₂R-, -NHC(O)O- alebo -NHC(O)R-.
12. 12. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli, prekurzora alebo biologicky aktívnych metabolitov na prípravu lieku na inhibíciu proteínkinázovej aktivity.
13. 13. Použitie podľa nároku 12, kde uvedená proteín kináza je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z nasledujúcich: KDR, FGFR-1, PDGFRp, PDGFRa, IGF-1R, c-Met, Flt-1, TIE-2, Lek, Src, fyn, Lyn, Blk a yes.
14. 14. Použitie podľa nároku 12, kde aktivita uvedenej proteín kinázy ovplyvňuje hyperproliferatívne choroby.
15. 15. Použitie podľa nároku 12, kde aktivita uvedenej proteín kinázy ovplyvňuje angiogenézu, vaskulárnu permeabilitu, imunitné odpovede alebo zápal.

    212.
16. 16. Použitie zlúčeniny I s významom podľa nároku 1 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli, prekurzora alebo biologicky aktívneho metabolitu na prípravu lieku na liečenie pacienta trpiaceho stavom, ktorý je sprostredkovaný proteínkinázovou aktivitou.
17. 17. Použitie podľa nároku 16, kde uvedená proteín kináza je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z nasledujúcich: KDR, Flt-1, PDGFRp, PDGFRa, IGF-1R, cMet, TIE-2, Lck, Src, fyn, Lyn, Blk a yes.
18. 18. Použitie podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je hyperproliferatívna choroba.
19. 19. Použitie podľa nároku 16, kde aktivita uvedenej proteín kinázy ovplyvňuje angiogenézu, vaskulárnu permeabilitu, imunitné odpovede alebo zápal.
20. 20. Použitie podľa nároku 16, kde aktivita uvedenej proteín kinázy ovplyvňuje angiogenézu alebo vaskulárnu permeabilitu.
21. 21. Použitie podľa nároku 16, kde proteín kinázou je proteín serín/treonín kináza alebo proteín tyrozín kináza.
22. 22. Použitie podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je jeden alebo viacero vredov.
23. 23. Použitie podľa nároku 22, kde vred alebo vredy sú spôsobené bakteriálnou alebo hubovou infekciou; alebo vred alebo vredy sú Moorenove vredy; alebo vred alebo vredy sú symptómom ulceróznej kolitídy.
24. 24. Použitie podľa nároku 16, kde stavom sprostredkovaným proteínkinázovou aktivitou je Lymeho choroba, sepsa alebo infekcia Herpes simplex, Herpes Zoster, vírusom ľudskej imunitnej nedostatočnosti, parapoxvírusom, protozoami alebo toxoplazmózou.

    21Ó
25. 25. Použitie podľa nároku 16, kde stavom sprostredkovaným proteínkinázovou aktivitou je von Hippel Lindauova choroba, pemfigoid, psoriáza, Pagetova choroba alebo polycystická obličková choroba.
26. 26. Použitie podľa nároku 16, kde stavom sprostredkovaným proteínkinázovou aktivitou je fibróza, sarkoidóza, cirhóza, tyreoiditída, chronická okluzívna pulmonárna choroba, astma, exsudáty, ascites, pleurálne efúzie, perikardiálne efúzie, pulmonárny edém, cerebrálny edém alebo edém v dôsledku popálenín, úraz, ožiarenie, porážka, hypoxia alebo ischémia.
27. 27. Použitie podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je syndróm nadmernej stimulácie ovárií, preeklampsia, menometrorágia alebo endometrióza.
28. 28. Použitie podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je chronický zápal, systémový lupus, glomerulonefritída, synovitída, zápalová črevná choroba, Crohnova choroba, reumatoidná artritída a osteoartritída, roztrúsená skleróza alebo odmietanie štepu.
29. 29. Použitie podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je kosáčikovitá anémia.
30. 30. Použitie podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je okulárny stav.
31. 31. Použitie podľa nároku 30, kde okulárnym stavom je okulárny alebo makulárny edém, okulárna neovaskulárna choroba, skleritída, radiálna keratotómia, uveitída, vitritída, myopia, exkavácia papily, chronické odlúčenie sietnice, post-laserové komplikácie, konjunktivitída, Stargardtova choroba, Ealesova choroba, retinopatia alebo makulárna degenerácia.
32. 32. Použitie podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je kardiovaskulárny stav.

    214/
33. 33. Použitie podľa nároku 32, kde stavom sprostredkovaným proteínkinázovou aktivitou je ateroskleróza, restenóza, ischémia/reperfúzia po úrazoch, vaskulárna oklúzia, venózna malformácia alebo choroba obštrukcie karotídy.
34. 34. Použiite podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je rakovina.

    I ( · ·
35. 35. Použitie podľa nároku 34, kde rakovinou je tuhý nádor, sarkóm, fibrosarkóm, osteóm, melanóm, retinoblastóm, rabdomyosarkóm, glioblastóm, neuroblastóm, teratokarcinóm, hematopoetické malígne nádory a malígny ascites.
36. 36. Použitie podľa nároku 34, kde rakovinou je Kaposiho sarkóm, Hodgkinova choroba, lymfóm, myelóm alebo leukémia.
37. 37. Použitie podľa nároku 16, kde stav sprostredkovaný uvedenou proteín kinázou je Crow-Fukaseho syndróm (POEMS) alebo diabetický stav.
38. 38. Použitie podľa nároku 37, kde diabetickým stavom je od inzulínu závislý diabetes mellitus, glaukóm, diabetická retinopatia alebo mikroangiopatia.
39. 39. Použitie zlúčeniny I s významom podľa nároku 1 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli, prekurzora alebo biologicky aktívneho metabolitu na prípravu lieku na zníženie plodnosti pacienta.
40. 40. Použitie podľa nároku 16 na podporu angiogenézy alebo vaskulogenézy.
41. 41. Použitie podľa nároku 40, kde proteín kinázou je Tie-2.
42. 42. Použitie podľa nároku 40 v kombinácii s proangiogénnym rastovým faktorom.
43. 43. Použitie podľa nároku 42, kde proangiogénny rastový faktor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, HGF, FGF-1, FGF-2, ich derivátov a antiidiotypických protilátok.

    2ir
44. 44. Použitie podľa nároku 40, kde proteínkinázou sprostredkovaným stavom je anémia, ischémia, infarkt, odmietanie transplantátu, rana, gangréna alebo nekróza.
45. 45. Použitie podľa nároku 16, kde proteínkinázová aktivita je zapojená do aktivácie lymfocytov T, aktivácie buniek B, degranulácie žírnych buniek, aktivácie monocytov, potenciácie zápalovej odpovede alebo ich kombinácie.