CZ2001959A3 - 4-Aminopyrrolopyrimidiny jako inhibitory kinasy - Google Patents

Description

A61P 29/00

4-Aminopyrrolopyriniidiny jako inhibitory kinasy

Související přihlášky

Tato patentová přihláška se vztahuje k US předběžné přihlášce č. 60/100 954 podané 18. září 1998 a je částečným pokračováním US patentové přihlášky č. 09/042 702 podané 17. března 1998, přičemž veškeré poznatky těchto přihlášek jsou zde zahrnuty formou odkazu.

Dosavadní stav techniky

Existuje nejméně 400 enzymů identifikovaných jako proteinkinasy. Tyto enzymy katalyzují fosforylaci cílových proteinových substrátů. Fosforylace je obvykle přenosová reakce fosfátové skupiny z ATP na proteinový substrát. Specifickou strukturou v cílovém substrátu, na niž se fosfát přenáší je zbytek tyrosinu, šeřinu nebo threoninu. Jelikož jsou tyto zbytky aminokyselin cílovými strukturami pro přenos fosforylu, jsou tyto proteinkinasové enzymy obvykle označovány jako tyrosinkinasy nebo serin/threoninkinasy.

Fosforylační reakce a protipůsobící fosfatasové reakce na zbytcích tyrosinu, šeřinu a threoninu jsou zahrnuty v nesčetných buněčných procesech, které zprostředkovávají odpovědi na různé intracelulární signály (obvykle zprostředkované prostřednictvím buněčných receptorů), regulaci buněčných funkcí a aktivaci nebo deaktivaci buněčných procesů. Kaskáda proteinkinas se často účastní intracelulárního přenosu signálu a jsou nezbytné pro uskutečnění těchto buněčných procesů. V důsledku jejich všudypřítomnosti v těchto procesech lze proteinkinasy najít jako • ·

·· ·♦ ··· • · · · ·· • · · · ·· · • · ·· • ·· ····· ·· · · · integrální součást plasmatické membrány nebo cytoplasmatických enzymů nebo lokalizované v jádře, často jako složky enzymových komplexů. V mnoha případech jsou tyto proteinkinasy nezbytným prvkem enzymových a strukturálních proteinových komplexů, které určují, kde a kdy se buněčný proces vyskytne v rámci proteinových komplexů, které určují, kde a kdy k buněčnému procesu v buňce dojde.

Proteinové tyrosinkinasy. Proteinové tyrosinkinasy (PTKs) jsou enzymy, které katalyzují fosforylaci specifických zbytků tyrosinu v buněčných proteinech. Tato posttranslační modifikace těchto substrátových proteinů, které jsou často samy enzymy, působí jako molekulární spínač regulující buněčnou proliferaci, aktivaci nebo diferenciaci (pro přehled viz Schlessinger a Ulrich, Neuron, _9, 383 - 391 (1992)). Aberantní nebo nadměrná aktivita proteinové tyrosinkinasy byla pozorována při mnoha chorobných stavech včetně benigních a maligních proliferativních poruch stejně jako chorob, které jsou výsledkem nepříhodné aktivace imunitního systému (např. autoimunních poruch), odmítnutí štěpu a choroby z reakce štěpu proti hostiteli. Navíc specifické receptorové proteinové tyrosinkinasy endotheliálních buněk, jako je KDR a Tie-2, zprostředkovávají angiogenni proces a jsou tedy účastny podpory progrese rakovin a jiných chorob zahrnujících nepříhodnou vaskularizaci (např. diabetické retinopatie, choroidální neovaskularizace v důsledku makulární degenerace související s věkem, psoriázy, artritidy, retinopatie u předčasně narozených dětí a infantilních hemangiomů).

Tyrosinkinasy mohou být receptorového typu (mají extracelulární, transmembránové a intracelulární domény) nebo nereceptorového typu (jsou zcela intracelulární).

• · * · • · • · · · · · · • · · · · · ·

Receptorové tyrosinkinasy (RTKs). Receptorové tyrosinkinasy zahrnuji velkou rodinu transmembránových receptorů s rozličnými biologickými aktivitami. V současnosti je identifikováno alespoň devatenáct (19) různých podrodin receptorových tyrosinkinas. Rodina receptorových tyrosinkinas zahrnuje receptory, které jsou rozhodující pro růst a diferenciaci různých buněčných typů (Yarden a Ullrich, Ann. Rev. Biochem., 57, 433 - 478 (1988), Ullrich a Schlessinger, Cell, 61, 243 - 254 (1990)). Vnitřní funkce receptorových tyrosinkinas je aktivována při vazbě ligandu, což vedek fosforylaci receptorů a četných buněčných substrátů, a následně k řadě buněčných odpovědi (Ullrich a Schlessinger, Cell, 61, 203 - 212 (1990). Transdukce signálu zprostředkovaného receptorovou tyrosinkinasou je tedy iniciována extracelulární interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), což je obvykle následováno dimerizací receptorů, stimulací vnitřní tyrosinkinasové aktivity a transfosforylací receptorů. Tím se vytvoří vazebná místa pro molekuly intracelulární transdukce signálu a vede to k tvorbě komplexů se spektrem cytoplasmatických signálních molekul, které usnadňují příslušnou buněčnou odpověď (např. dělení buněk, diferenciaci, metabolické účinky, změny extracelulárního mikroprostředí). Viz Schlessinger a Ullrich, Neuron, 9,1 - 20 (1992).

Proteiny s doménami SH2 (src homologie - 2) nebo fosfotyrosin (PTB) váží aktivované proteinkinasové receptory a jejich substráty s vysokou afinitou k propagaci signálů do buňky. Obě domény rozpoznávají fosfotyrosin. (Fantl a kol., Cell, 69, 413 - 423 (1992); Songyang a kol., Mol. Cell. Biol., 14, 2777 - 2785 (1994); Songyang a kol., Cell, 72,767 - 778 (1993) a Koch a kol., Science 252, 668 -4···· ···· · • · · · · · · • · · ·· · · · · · ···

678 (1991); Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol., 1(2), 227 234 (1997); Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol., 7(6), 835 838 (1997)). Bylo identifikováno několik intracelulárních substrátových proteinů, které se spojuji s receptorovými tyrosinkinasami. Lze je rozdělit do dvou základních skupin:

1) substráty, které mají katalytickou doménu a

2) substráty, které takovou doménu postrádají, ale slouží jako adaptéry a spojují se s katalyticky aktivními molekulami (Songyang a kol., Cell, 72, 767 - 778 (1993)). Specificita interakcí mezi receptory nebo proteiny a doménami SH2 nebo PTB jejich substrátů je určena zbytky aminokyselin bezprostředně obklopujícími fosforylovaný zbytek tyrosinu. Například rozdíly ve vazebných afinitách mezi doménami SH2 a sekvencemi aminokyselin obklopujícími fosfotyrosinové zbytky jednotlivých recpetorů korelují s pozorovanými rozdíly v jejich fosforylace substrátu (Songyang a kol., Cell, 7 2, 767 - 778 (1993)). Pozorování naznačují, že funkce každé receptorové tyrosinkinasy je určena nikoli pouze způsobem její exprese a dostupností ligandu, ale také uspořádáním následných cest transdukce signálu, které jsou aktivovány příslušným receptorem stejně jako načasováním a trváním těchto stimulů. Fosforylace tedy poskytuje důležitý regulační krok, který určuje selektivitu signálních cest využitých specifickými receptory růstových faktorů, stejně jako diferenciaci receptorů faktorů.

Bylo navrženo, že různé receptorové tyrosinkinasy, jako je FGFR-1, PDGFR, TIE-2 a c-Met, a růstové faktory, které se na ně váží, hrají roli při angiogenezi, ačkoliv některé mohou usnadňovat angiogenezi nepřímo. (Mustonen a Alitalo, J. Cell Biol., 129, 895 - 898 (19953).

Jedna taková receptorová tyrosinkinasa, známá jako „fetálLní ·· ·« ·· ···· ·· · • · · · · · · · · · · _ · ······ · · ·

-5- · · · · · ···· · • · ·· · · ♦ · ········ ·· · · · · · · · · jaterní kinasa 1 (FLK-1) je členem typu III podtřidy receptorových tyrosinkinas. Alternativní označeni lidské FLK-1 je „receptor obsahující kinasovou vloženou doménu (KDR) (Terman a kol., Oncogene, 6, 1677 - 1683 (1991)). Dalším alternativním označením FLK-l/KDR je receptor 2 růstového faktoru vaskulárních endotheliálních buněk (VEGFR-2), jelikož váže VEGF s vysokou afinitou. Myší verze FLK1/VEGFR-2 byla rovněž nazvána NYK (Oelrichs a kol., Oncogene, 8(1), 11 - 15 (1993)). Byly isolovány DNA, které kódují myší, krysí a lidskou FLK-1 a sděleny sekvence nukleotidů a kódovaných aminokyselin (Matthews a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 9026 - 9030 (1991); Terman a kol., viz výše; Terman a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1579 - 1586 (1992); Sarzani a kol., viz výše a Millauer a kol., Cell, 72, 835 - 846 (1993)). Četné studie, jako je studie Millauera a kol., viz výše, navrhují, že VEGF a FLK-I/KDR/VEGFR-2 jsou ligand-receptorovým párem, který hraje důležitou roli při proliferaci vaskulárních endoteliálních buněk nebo tvorbě a pučení cév, což se označuje vaskulogeneze nebo angiogeneze.

Další podtřída receptorové tyrosinkinasy typu III označovaná „tyrosinkinasa - 1 podobná fms (Flt-1) je příbuzná FLK-l/KDR (DeVries a kol., Science, 255, 989 - 991 (1992); Shibuya a kol., Oncogene, 5, 519 - 524 (1990)). Alternativní označení Flt-1 je receptor 1 růstového faktoru vaskulárních endotheliálních buněk (VEGFR-1). Do současnosti bylo u členů podrodin FLK-l/KDR/VEGFR-2 a Flt1/VEGFR-l zjištěno, že jsou exprimovány převážně v buňkách endothelu. Tito členové podtřidy jsou specificky stimulováni členy rodiny ligandů růstového faktoru vaskulárních endotheliálních buněk (VEGF) (Klagsburn a D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews, 7, 259 - 270

-6• * ·· ·« · · · · · · * ···· ··· · · ·· • · · · · · · · · · • · · · · · · · · · • · ·· ···· ········ ·· ··· *· ··· (1996)). Růstový faktor vaskulárních endotheliálnich buněk (VEGF) se váže na Flt-1 s vyšší afinitou než na FLK-l/KDR a je mitogenní vůči vaskulárním endotheliálním buňkám (Terman a kol., viz výše (1992); Mustonen a kol., viz výše, DeVries a kol., viz výše). 0 Flt-1 se má zato, že je nezbytná pro organizaci endothelu během vývoje cév. Exprese Flt-1 je spojena s časným cévním vývojem v myších embryích a s neovaskularizací při hojení ran (Mustonen a Alitalo, viz výše). Exprese Flt-1 v monocytech, osteoklastech a osteoblastech, stejně jako v dospělých tkáních, jako jsou glomeruly ledvin, naznačuje, že tento receptor má další funkci, která nemá vztah k růstu buněk(Mustonen a Alitalo, viz výše).

Jak bylo uvedeno výše, současné důkazy naznačují, že VEGF hraje roli při stimulaci jak normální, tak patologické angiogeneze (Jakeman a kol., Endocrinology,

133, 848 - 859 (1993); Kolch a kol., Breast Cancer Research and Treatment, 36, 139 - 155 (1995); Ferrara a kol., Endocrine Reviews, 18(1) , 4 - 25 (1997); Ferrara a kol., Regulation of Angiogenesis (redaktoři L.D. Goldberg a E.M. Rosen), 209 - 232 (1997)). Navíc byl VEGF účasten řízení a usnadňování vaskulární permeability (Connolly a kol., J. Biol. Chem., 264, 20017 - 20024 (1989); Brown a kol., Regulation of Angiogenesis (redaktoři L.D. Goldberg a E.N. Rosen), 233-269 (1997)). Existují zprávy o různých formách VEGF pocházejících z alternativního spojování mRNA, včetně 4 druhů, které popsal Ferrara et al. (J. Cell. Biochem.,

47, 211 - 218 (1991)). Ferrara a kol., viz výše, identifikoval jak secernované, tak převážně s buňkami spojené druhy VEGF, přičemž o proteinu je známo, že existuje ve formě dimerů spojených disulfidovými můstky.

-7 • 4 ·· « 4 * ·

V současnosti bylo identifikováno několik příbuzných homologů VEGF. Jejich role v normálních fyziologických a chorobných procesech však dosud nebyly vysvětleny. Navíc členové rodiny VEGF jsou často exprimováni současně s VEGF v četných tkáních a jsou, obecně, schopny tvorby heterodimerů s VEGF. Tato vlastnost pravděpodobně mění receptorovou specificitu a biologické účinky heterodimerů a dále komplikuje vysvětlení jejich specifických funkcí, jak je ilustrováno dále (Korpelainen a Alitalo, Curr. Opin. Cell Biol., 159 - 164 (1998) a tam citované odkazy).

Placentární růstový faktor (P1GF) má sekvenci aminokyselin, která vykazuje významnou homologii se sekvencí VEGF (Park a kol., J. Biol. Chem., 269, 25646 25654 (1994); Maglione a kol., Oncogene, _8, 925 - 931 (1993)). Stejně jako u VEGF pocházejí z různého spojování mRNA různé druhy P1GF, přičemž tento protein existuje v dimerní formě (Park a kol., viz výše). P1GF-1 a P1GF-2 se váží na Flt-1 s vysokou afinitou, přičemž P1GF-2 se rovněž silně váže na neuropilin-1 (Migdal a kol., J. Biol. Chem., 27 3 (35), 22272 - 22278), ale žádný z nich se neváže na FLK-l/KDR (Park a kol., viz výše). 0 P1GF existují zprávy, že potenciuje jak vaskulární permeabilitu, tak mitogenní účinek VEGF na endotheliální buňky, když je VEGF přítomen v nízkých koncentracích (lze se domnívat, že v důsledku tvorby heterodimerů)(Park a kol., viz výše).

VEGF-B se tvoří ve dvou isoformách (167 a 185 zbytků), jež rovněž zdá se váží Flt-l/VEGFR-1. To může hrát roli při regulaci degradace extracelulární matrix, buněčné adheze a migrace prostřednictvím modulace exprese a

aktivity aktivátoru plasminogenu urokinasového typu a inhibitoru 1 aktivátoru plasminogenu (Pepper a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 95 (20), 11709 - 11714 (1998)).

VEGF-C byl původně klonován jako ligand pro VEGFR-3/Flt-4, který je primárně exprimován buňkami lymfatického endothelu. Ve své plně zpracované formě VEGF-C může rovněž vázat KDR/VEGFR-2 a stimulovat proliferaci a migraci endotheliálnich buněk v in vitro a angiogenesi v in vivo modelech (Lymboussaki a kol., Am. J. Pathol., 153(2), 395 - 403 (1998); Witzenbichler a kol., Am. J. Pathol·., 153 (2), 381 - 394 (1998)). Transgenni nadměrné exprese VEGF-C způsobuje proliferaci a zvětšení pouze lymfatických cév, zatímco krevní cévy nejsou ovlivněny. Na rozdíl od VEGF není exprese VEGF-C indukována hypoxií (Ristimaki a kol., J. Biol. Chem., 273(14), 8413 - 8418 (1998)).

Nejnověji nalezený VEGF-D je strukturně velmi podobný VEGF-C. 0 VEGF-D existují zprávy, že se váže na a aktivuje alespoň dvě VEGFR, VEGFR-3/Flt-4 a KDR/VEGFR-2, Původně byl klonován jako mitogen fibroblastů indukovatelný c-fos a je nejvíce exprimován v mezenchymálních buňkách plic a kůže (Achen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 95(2), 548 - 553 (1998) a odkazy tam uvedené).

Stejně jako v případě VEGF se v případě VEGF-C a VEGF-D tvrdí, že zvyšují vaskulární permeabilitu in vivo v Milesově stanovení při injikaci do kožní tkáně (PCT/US97/14696; WO98/07832, Witzenbichler a kol., viz výše). Fyziologická role a význam těchto ligandů při modulaci vaskulární hyperpermeability a endotheliálnich odpovědí v tkáních, kde se exprimují zůstávají nejasné.

9« · · · · · · ·· · • ···· ····· • · ·· ···· ········ ·· ··· · · ···

V současnosti byl sdělen virově kódovaný, nový typ vaskulárniho endotheliálního růstového faktoru, VEGF-E (NZ-7 VEGF), který preferenčně využívá receptor KDR/Flk-1 a nese mocnou mitotickou aktivitu bez domény vážící heparin (Meyer a kol., EMBO J., 18(2), 363 - 374 (1999); Ogawa a kol., J. Biol. Chem., 273(47), 31273 - 31282 (1998)). Sekvence VEGF-E vykazují 25% homologii se savčím VEGF a jsou kódovány virem parapoxvirus Orf (OV). Tento parapoxvirus, který infikuje ovce a kozy a příležitostně lidi, vede ke vzniku lézí s angiogenezí. VEGF-E je dimer s hmotností okolo 20 kDa bez základní domény a bez afinity k heparinu, ale má charakteristický cysteinový uzlový motiv, který je přítomen v savčích VEGF a u nějž bylo překvapivě nalezeno, že má potenci a biologické aktivity podobné s heparin vážící isoformou VEGF165 podtypu VEGF-Ά, tj. že oba faktory stimulují uvolňování tkáňového faktoru (TF), proliferaci, chemotaxi a pučení kultivovaných vaskulárních endotheliálních buněk in vitro a angiogenezí in vivo. Podobně jako v případě VEGF165 bylo u VEGF-E nalezeno, že se s vysokou afinitou váže na receptor 2 VEGF (KDR), což vede k autofosforylaci receptoru a dvoufázovému vzestupu vnitrobuněčných koncentrací vápníkového iontu, zatímco oproti VEGF165 se VEGF-E neváže na receptor 1 VEGF (Flt-1).

Na základě přicházejících zjištění dalších homologů VEGF a VEGFR a stavebních kamenů pro heterodimerizaci ligandů a receptorů, přičemž působení takových homologů VEGF může zahrnovat tvorbu heterodimerů ligandů VEGF a/nebo heterodimerizaci receptorů nebo vazbu na dosud nenalezené VEGFR (Witzenbichler a kol., viz výše). Rovněž tak současné zprávy naznačují, že neuropilin-1 (Migdal a kol., viz výše) nebo VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbichler a kol., • · · · ·· · · · · ·· · ···· · · · ···· • · ····· · · · -10_ · ···· ···· · ^{1 v} · ·· · · · · ········ ·· · ·· · · ··· viz výše) nebo receptory jiné než KDR/VEGFR-2 mohou být účastny indukce vaskulární permeability (Stacker, S.A., Vítali, A., Domagala, T., Nice, E., a Wilks, A.F., „Angiogenesis and Cancer Konference, Amer. Assoc. Cancer Res., leden 1998, Orlando, FL; Williams, Diabetelogia 40, 118 - 120 (1997)).

Tie-2 (TEK) je členem v současnosti objevené rodiny specifických receptorových tyrosinkinas endotheliálnich buněk, který se účastni kritických angiogenních procesů, jako jsou větvení cév, pučení, remodelování, zrání a stabilita. Tie-2 je první savčí receptorová tyrosinkinasa pro niž byl identifikován (identifikovány) jak ligand agonista (ligandy agonisté) (např. angiopoietinl (Angl), který (kteří) stimuluje (stimulují) autofosforylaci receptoru a transdukci signálu), tak ligand (ligandy) antagonista (antagonisté) (např. angiopoietin2 (Ang2)). Knock-outová a transgenní manipulace exprese Tie-2 a jejích ligandů ukazuje, že pro řádný vývoj nových cév je nezbytné tuhé prostorové a časové řízení signalizace Tie-2, Současný model naznačuje, že stimulace kinasy Tie-2 ligandem Angl je přímo účastno větvení, pučení a růstu nových cév a obstarávání a interakce periendotheliálních podpůrných buněk při udržování cévní integrity a indukci stavu klidu. Absence stimulace Tie-2 prostřednictvím Angl nebo inhibice Tie-2 autofosforylaci prostřednictvím Ang2, která je navozena při vysokých hladinách na místech vaskulární regrese, může způsobit ztrátu vaskulární struktury a kontaktů matrix, což vede ke smrti endotheliálních buněk, obzvláště za nepřítomnosti stimulů k růstu/přežití. Situace je však složitější, jelikož v současnosti byly sděleny zprávy o alespoň dvou dalších ligandech Tie-2 (Ang3 a Ang4)

- 11 •· ······ ·· · ··· · · · · ·· · • « ····· · ·· ···· · · · · · • · · * · ·· ····· ·· ··· ·· ··· a byla předvedena kapacita pro heterooligomerizaci různých agonistickch a antagonistických angiopoietinů, čímž se modifikuje jejich aktivita. Směřováním antiangiogenniho terapeutického přístupu na interakce ligand Tie-2 receptor je tedy méně upřednostňováno, a přičemž přednost se dává strategii inhibice kinasy.

Rozpustná extracelulární doména Tie-2 („ExTek) může působit tak, že rozruší uspořádání vaskulatury tumoru v modelech cizorodého štěpu rakoviny prsu a plicní metastázy a v nádorovými buňkami zprostředkované oční neovaskularizaci. Adenovirovou infekcí se dá na 7 až 10 dní u hlodavců dosáhnout in vivo. tvorby ExTek na úrovni mg/ml bez jakýchkoli vedlejších účinků. Tyto výsledky naznačují, že rozrušení signální cesty Tie-2 u normálních zdravých zvířat může být dobře snášeno. Tyto inhibiční odpovědi Tie-2 na ExTek mohou být následkem odříznutí ligandu (ligandů) a/nebo vytvoření neproduktivního heterodimeru s Tie-2 o plné délce.

V současnosti byla ve vaskulárním synoviálním pannu artritických kloubů lidí nalezena významná up-regulace exprese Tie-2, což je konsistentní s rolí při nepříhodné neovaskularizaci. Tento nález naznačuje, že Tie-2 hraje roli při vývoji revmatoidní artritidy. V souvislosti s lidskými venózními malformačními poruchami byly identifikovány bodové mutace vytvářející konstitutivně aktivované formy Tie-2. Inhibitory Tie-2 jsou tedy užitečné při léčbě takových poruch a jiných situací nepříhodné neovaskularizace.

Nereceptorové tyrosinkinasy. Nereceptorové tyrosinkinasy představují soubor buněčných enzymů, které ·· ·· ···· • · · * · · · · · · · _ · ······ ···

- 12 - · ···· ···· · • · ·· · · · · ···· ···· ·· ··· ·· ··· postrádají extracelulární a transmembránové sekvence. V současnosti je identifikováno 24 jednotlivých nereceptorových tyrosinkinas, které zahrnují jedenáct (11) podrodin (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack a LIMK). V současnosti se z největšího počtu proteinových tyrosinkinas skládá podrodina nereceprotových tyrosinkinas Src a zahrnuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk. Podrodina enzymů Src byla spojena s onkogenezí a imunitními odpověďmi. Detailnější diskuse nereceptorových tyrosinkinas je poskytnuta v Bohlen, Oncogene, 8^, 2025 2031 (1993), která je zde zahrnuta formou odkazu.

U mnohých tyrosinkinas, ať už RTK nebo tyrosinkinas nereceptorových, bylo nalezeno, že jsou účastny buněčných signálních cest účastnících se četných patogenních stavů, včetně rakoviny, psoriázy a dalších hyperproliferativních poruch nebo hyperimunitních odpovědí.

Vývoj sloučenin k modulaci proteinových tyrosinkinas. S ohledem na domnělou důležitost proteinových tyrosinkinas při řízení, regulaci a modulaci buněčné proliferace, chorob a poruch spojených s abnormální buněčnou proliferací, bylo učiněno mnoho pokusů identifikovat inhibitory receptorové a nereceptorové tyrosinkinasy za použití různých přístupů včetně použití mutantních ligandů (US patentu č. 4 966 849), rozpustných receptorů a protilátek (přihláška č. WO 94/10202; Kendall a Thomas, Proč. Nati. Acad. Sci., 90, 10705 -10709 (1994); Kim a kol., Nátuře, 362, 841 - 844 (1993)), RNA ligandů (Jellinek, a kol., Biochemistry, 33, 10450 - 10456; Takano, a kol., Mol. Bio. Cell, 4, 358A (1993); Kinsella, a kol., Exp. Cell Res., 199, 56 - 62 (1992); Wright, a kol., J. Cellular Phys., 152, 448 - 457 (1992)) a inhibitorů tyrosinkinasy

- 13 ···· · · · ···· • · ····· ·· · • ···· ···· · • · ·· ···· ···· ···· ·· ··· ·· ··· (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US patent č. 5 330 992; Mariani, a kol., Proč. Am. Assoc. Cancer Res., 35, 2268 (1994)).

V poslední době byly učiněny pokusy identifikovat malé molekuly, které působí jako inhibitory tyrosinkinasy. Například bismonocyklické, bicyklické nebo heterocyklické arylové sloučeniny (PCT WO92/20642) a deriváty vinylenazaindolu (PCT WO94/14808) byly obecně popsány jako inhibitory tyrosinkinasy. Styrylové sloučeniny (US patent č. 5 217 999), styrylem substituované pyridylové sloučeniny (US patent č. 5 302 606), jisté deriváty chinazolinu (EP přihláška č. 0 566 266 AI; Expert Opin. Ther. Pat., 8(4), 475 - 478 (1998)), selenoindoly a selenidy (PCT WO94/03427), tricyklické polyhydroxylové sloučeniny (PCT WO92/21660) a sloučeniny benzylfosfonové kyseliny (PCT WO91/15495) byly popsány jako sloučeniny pro použití jako inhibitory tyrosinkinasy pro použití při léčbě rakoviny. Anilinochinoliny (PCT WO97/34876) a sloučeniny derivátu chinazolinu (PCT WO97/22596; PCT WO97/42187) byly popsány jako inhibitory angiogenese a vaskulární permeability.

Navíc byly učiněny pokusy identifikovat malé molekuly, které působí jako inhibitory serin-/threoninkinasy. Například bis(indolylmaleimidové) sloučeniny byly popsány jako sloučeniny inhibující určité PKC isoformy serin-/threoninkinasy, jejichž funkce při transdukci signálu je spojena s porušenou vaskulární permeabilitou u nemocí spojených s VEGF (PCT W097/40830; PCT WO97/40831) .

Inhibitory Plk-1 kinasy

Plk-1 je serin-/threoninkinasa, která je

- 14···· · · · ···· • · · · · · · ·· · • · · · · ···· · • · · · ···· ········ · · ··· ·· ··· důležitým regulátorem vývoje buněčného cyklu. Hraje rozhodující role při sestavování a dynamické funkci aparátu mitotického vřeténka. U Plk-1 a souvisejících kinas bylo rovněž ukázáno, že jsou úzce účastny aktivace a inaktivace jiných regulátorů buněčného cyklu, jako jsou kinasy závislé na cyklinu. Vysoké úrovně exprese Plk-1 jsou spojeny s aktivitami buněčné proliferace. Často se nalézá v maligních tumorech různých původů. U inhibitorů Plk-1 se očekává, že budou blokovat proliferaci rakovinných buněk rozrušením procesů zahrnujících mitotická vřeténka a nepříhodně aktivované kinasy závislé na cyklinu.

Inhibitory kinasy Cdc2/cyklin B (Cdc2 je rovněž známa jako cdkl)

Cdc2/cyklin B je další serin-/threoninkinasový enzym, který patří do rodiny kinas závislých na cyklinu (cdks). Tyto enzymy jsou účastny rozhodujícího přechodu mezi různými fázemi vývoje buněčného cyklu. Má se zato, že neřízená proliferace buněk, která je charakteristickou známkou rakoviny, je závislá na zvýšených aktivitách cdk v těchto buňkách. Inhibice zvýšených aktivit cdk v rakovinných buňkách inhibitory kinasy cdc2/cyklin B by mohla potlačit proliferaci a mohla by obnovit normální řízení vývoje buněčného cyklu.

Regulace aktivace CDK je složitá, ale vyžaduje spojení CDK se členem cyklinové rodiny regulačních podjednotek (Draetta, Trends in Cell Biology, 3_, 287 - 2 89 (1993); Murray a Kirschner, Nátuře, 339, 275 - 280 (1989); Solomon a kol., Molecular Biology of the Cell, 3, 13-27 (1992)). Další úroveň regulace probíhá prostřednictvím jak aktivačních, tak inaktivačních fosforylací podjednotky CDK o » • · · ·

- 15 (Draetta,

Trends in Cell Biology, 3, 287 - 289 (1993);

Murray a Kirschner, Nátuře, 339, 275 - 280 (1989); Solomon a kol., Molecular Biology of the Cell, 3, 13 - 27 (1992);

Ducommun a kol., EMBO Journal, 10, 3311 - 3319 (1991);

Gautier a kol., Nátuře, 339, 626 - 629 (1989); Gould a

Nurse, Nátuře, 342, 39 - 45 (1989); Krek a Nigg, EMBO Journal, 10, 3331 - 3341 (1991); Solomon a kol., Cell, 63, 1013 - 1024 (1990)). Pro normální vývoj prostřednictvím buněčného cyklu je nezbytně nutná koordinovaná aktivace a inaktivace různých komplexů cyklin/CDK (Pines, Trends in

Biochemical Sciences, 18, 195 - 197 (1993); Sherr, Cell,

73, 1059 - 1065 (1993)). Jak rozhodující přechodná fáze βίε, tak G2-M jsou řízeny aktivací různých aktivit cyklinu/CDK. Ve fázi G1 se má zato, že jak cyklin D/CDK4, tak cyklin E/CDK2 zprostředkovávají nástup S-fáze (Matsushima a kol., Melecutar & Cellular Biology, 14, 2066 - 2076 (1994); Ohtsubo a Roberts, Science, 259, 1908 - 1912 (1993); Quelle a kol., Genes & Development, 1559 - 1571 (1993); Resnitzky a kol., Molecular & Cellular Biology, 14, 1669 - 1679 (1994)). Vývoj prostřednictvím S-fáze vyžaduje aktivitu cyklinu A/CDK2 (Girard a kol., Cell, 67, 1169 1179 (1991); Pagano a kol., EMBO Journal, 11, 961 - 971 (1992); Rosenblatt a kol., Proceedings of the National Academy of Science USA, 89, 2824 - 2828 (1992);

Walker a Maller, Nátuře, 354, 314 - 317 (1991); Zindy a kol., Biochemical & Biophysical Research Communications, 182, 1144 - 1154 (1992)), zatímco aktivace cyklinu A/cde2 (CDKI) a cyklinu B/cdc2 jsou vyžadovány pro nástup metafáze (Draetta, Trends in Cell Biology, _3, 287 - 289 (1993)); Murray a Kirschner, Nátuře, 339, 275 - 280 (1989); Solomon a kol., Molecular Biology of the Cell, 3, 13 - 27 (1992); Girard a kol., Cell, 67, 1169 - 1179 (1991); Pagano a kol., EMBO Journal, 11, 961 - 971 (1992); Rosenblatt a kol., • 4

-16- ···

Proceedings of the National Academy of Science USA, 89, 2824 - 2828 (1992); Walker a Maller, Nátuře, 354, 314 - 317 (1991); Zindy a kol., Biochemical & Biophysical Research Communications, 182, 1144 - 1154 (1992)). Není tudíž překvapuje!, že ztráta kontroly regulace CDK je častou událostí při hyperproliferativních chorobách a rakovině. (Pines, Current Opinion in Cell Biology, _4, 144 - 148 (1992); Lees, Current Opinion in Cell Biology, Ί_, 773 - 780 (1995); Hunter a Pines, Cell, 7 9, 573 - 582 (1994)). Inhibitory kinas účastnících se zprostředkování nebo udržování chorobných stavů představuje nové způsoby terapie těchto poruch. Příklady takových kinas zahrnují:

(1) inhibici c-Src (Brickell, Critical Reviews in

Oncogenesis, 3, 401 - 406 (1992); Courtneidge, Seminars in

Cancer Biology, 5, 236 - 246 (1994)), raf (Powis,

Pharmacology & Therapeutics, 62, 57 - 95 (1994)) a kinasy

závislé	na cyklinu	(CDKs) 1, 2 a	4	při rakovině (Pines,
Current	Opinion	in	Cell Biology,	4,	144 - 148	(1992); Lees,
Current	Opinion	in	Cell Biology,	7,	773 - 780	(1995);
Hunter	a Pines,	Cell, 79, 573 -	582	(1994)) ,

(2) inhibici kinasy CDK2 nebo PDGF-R při restenose (Buchdunger a kol., Proceedings of the National Academy of Science USA, 92, 2258 - 2262 (1995)), (3) inhibici kinas CDKS a GSK3 při Alzheimerově chorbě (Hosoi a kol., Journal of Biochemistry (Tokyo), 117, 741 749 (1995); Aplin a kol., Journal of Neurochemistry, 67, 699 - 707 (1996) , (4) inhibici kinasy c-Src při osteoporose (Tanaka a kol., Nátuře, 383, 528 - 531 (1996), (5) inhibici kinasy GSK-3 při diabetů typu 2 (Borthwick a kol., Biochemical & Biophysical Research Communications, 210, 738 - 745 (1995), (6) inhibici kinasy p38 při zánětu (Badger a kol., The

Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 279, 1453 - 1461 (1996) ) , (7) inhibici kinas VEGF-R 1 až 3 a TIE-1 a 2 při chorobách, které zahrnuji angiogenesi (Shawver a kol., Drug

Discovery Today, 2, 50 - 63 (1997)), (8) inhibici kinasy UL97 při virových infekcích (He a kol., Journal of virology, 71, 405 - 411 (1997)), (9) inhibici kinasy CSF-1R při chorobách kostí a hematopoetických chorobách (Myers a kol., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Ί_, 421 - 424 (1997) a (10) inhibici kinasy Lek při autoimunitních chorobách a odmítnutí transplantátu (Myers a kol., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7, 417 - 420 (1997)), výčet tím však není omezen.

Je navíc možné, že inhibitory jistých kinas mohou mít využití při léčbě chorob, při kterých není kinasa nesprávně regulována, ale je nicméně nezbytná pro udržování chorobného stavu. V tomto případě by inhibice kinasy působila buď jako příčinná nebo paliativní léčba těchto nemocí. Například mnoho virů, jako je virus lidského papilomu, rozrušuje buněčný cyklus a směřuje buňky do Sfáze buněčného cyklu (Vousden, FASEB Journal, 7, 8720879

-18·· · · ·· ···· ··· ···· ··« · ·· · • · ····· ··· • ···· ··«·· • · ·· · · ·· ···· ···· ·· ··· ·· ··· (1993)). Zabráněním buňkám vstoupit do syntézy DNA po infekci virem prostřednictvím inhibice nezbytných iniciačních aktivit S-fáze, jako je CDK2, může rozrušit životní cyklus viru tím, že se zabrání replikaci viru. Tento stejný princip se může použít k ochraně normálních buněk těla před toxicitou chemoterapeutických látek specifických pro určitý buněčný cyklus.(Stone a kol., Cancer Research, 56, 3199 - 3202 (1996); Kohn a kol., Journal of Cellular Biochemistry, 54, 44 - 452 (1994)). Inhibice CDK 2 nebo 4 zabrání vývoji do cyklu v normáních buňkách a omezí toxicitu cytotoxických látek, které působí v S-fázi, G2 nebo mitose. Navíc u aktivity CDK2/cyklinu E bylo také ukázáno, že reguluje NF-kB. Inhibice aktivity CDK2 stimuluje expresi genu závislou na NF-kB, což je událost zprostředkovaná interakcemi s koaktivátorem p300 (Perkins a kol., Science, 275, 523 - 527 (1997)). NF-kB reguluje geny účastnící se zánětlivých odpovědí (jako jsou hematopoetické růstové faktory, chemokiny a leukocytární adhesní molekuly) (Baeuerle a Henkel, Annual Review of Immunology, 12, 141 - 179 (1994)) a může se účastnit potlačování apoptotických signálů v buňce (Beg a Baltimore, Science, 274, 782 - 784 (1996); Wang a kol., Science, 274, 784 - 787 (1996); Van Antwerp a kol., Science, 274, 787 789 (1996)). Inhibice CDK2 může tedy potlačit apoptosu indukovanou cytotoxickými léčivy prostřednictvím mechanismu, který zahrnuje NF-kB. To tedy naznačuje, že inhibice aktivity CDK2 může být také užitečná při jiných případech, kde regulace NF-kB hraje roli v etiologii choroby. Dalším příkladem mohou být houbové infekce: aspergilosa je běžnou infekcí u pacientů s oslabenou imunitou (Armstrong, Clinical Infectious Diseases, 16, 1 7 (1993)). Inhibice kinas aspergilla Cdc2/CDC28 nebo Nim. A (Osmani a kol., EMBO Journal, 10, 2669 - 2679 (1991);

• · • · ···· >·· · · · · • · · ····· · ·

IQ · v · · ······ ' 17 - ₄ t · «····

4······· ·· ··· ·····

Osmani a kol., Cell, 67, 283 - 291 (1991)) může u houby způsobit blokádu nebo smrt, čímž se zlepší terapeutický výsledek u pacientů s těmito infekcemi.

Identifikace účinných malých sloučenin, které specificky inhibuji transdukci signálu a buněčnou proliferaci prostřednictvím modulace aktivity receptorových a nereceptorových tyrosin- a serin-/threoninkinas k regulaci a modulaci abnormální nebo nepříhodné buněčné proliferace, diferenciace nebo metabolismu je tedy žádoucí. Obzvláště by byly přínosné identifikace způsobů a sloučenin, které specificky inhibuji funkci tyrosinkinasy, která je nezbytná pro angiogenní procesy nebo pro tvorbu vaskulární hyperpermeability vedoucí k edému, ascitu, výpotkům, exsudátům a makromolekulární extravasaci a ukládání matrix, stejně jako pro související poruchy.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje sloučeniny obecného

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

V obecném vzorci I představuje kruh A šestičlenný • · • ·

-7Λ- · ···· ···· · ^υ · · ·· ···· ········ ·· · · · ·· ··· aromatický kruh nebo 5- nebo 6-členný heteroaromatický kruh. Kruh A je případně substituován jedním nebo více z následujících substituentů: substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina, atom halogenu, substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaralkyl, kyanoskupina, nitroskupina, -NR₄R₅, -C(O)₂H, -OH, substituovaný nebo nesubstituovaný alko-xykarbonyl, -C (0) ₂-halogenalkyl, substituovaný nebo nesubsti-tuovaný alkylthioether, substituovaný nebo nesubstituovaný alkylsulfoxid, substituovaný nebo nesubstituovaný alkylsulfon, substituovaný nebo nesubstituovaný arylthioether, substituovaný nebo nesubstituovaný arylsulfoxid, substituovaný nebo nesubstituovaný arylsulfon, substituovaný nebo nesubstituovaný alkylkarbonyl, -C(0)-halogenalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alifatický ether, substituovaný nebo nesubstituovaný aromatický ether, substituovaná nebo nesubstituovaná karboxamidoskupina, tetrazolyl, trifluormethylsulfonamidoskupína, trifluormethylkarbonylaminoskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný alkinyl, substituovaná nebo nesubstituovaná alkylamidoskupina, substituovaná nebo nesubstituovaná arylamidoskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný styryl a substituovaná nebo nesubstituovaná aralkylamidoskupina.

L je jedním z následujících spojovníků: -0-; -S-; -S(0)-; -S(0)₂-; -N(R)-; N(C(O)OR)-; -N(C(O)R)-; -N(SO₂R)-; -CH₂O-; -CH₂S-; -CH₂N(R)-; -CH(NR)-; CH₂N(C(O)R))-;

-CH₂N(C(0)OR)-; -CH₂N(SO₂R)-; -CH(NHR)-; -CH(NHC(0)R)-;

-21 ·· ·· ·* ···· · · · • · · ··· · · · · • · ····· ·· · • ···· ···· · • · · · ···· ······· ·· ··· ·· · · ·

CH(NHSO₂R)-; -CH (NHC (O) OR) -; -CH (OC (O) R) -; -CH(OC(O)NHR)- ; -CH=CH-; C(=NOR)-; -C(O)-; -CH(OR)-; -C(O)N(R)-;

-N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)₂-; OC(O)N(R)-;

-N (R) C (O) N (R) -; -NRC(O)O-; -S(O)N(R)-; -S(O)₂N(R)-;

N (C (O) R) S (O)-; N (C (O) R) S (O) 2-; -N(R)S(O)N(R)-;

-N (R) S (O) ₂N (R)-; C (O) N (R) C (O)-; -S(O)N(R)C(O)-;

-S (O) ₂N (R) C (O)-; -OS(O)N(R)-; -OS (O) ₂N (R) -; -N(R)S(O)O-;

-N (R) S (O) ₂O-; -N (R) S (O)C(O)-; -N(R)S(O)₂C(O)-;

-SON(C(O)R)SO₂N(C(O)R)-; -N (R) SON (R) -; -N(R)SO₂N(R)-; -C(O)O-; -N(R)P(OR')O-; -N (R) P (OR')-; -N (R) P (O) (OR') O-; -N(R)P(O) (OR')-; -N(C(O)R)P(OR')O-; N(C(O)R)P(OR’)-;

-N(C(O)R)P(O)(OR')O- nebo -N(C(O)R)P(OR')-. R a R' jsou každý nezávisle, atom vodíku, acylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituovaná cykloalkylová skupina.

Alternativně je L -R_bN (R) S (O),-, -R_bN(R)P(O)nebo -R_bN(R)P(0)O-. R_b je alkylenová skupina, která když se pojme spolu se sulfonamidovou, fosfinamidovou nebo fosfonamidovou skupinou, na kterou je navázána, tvoří 5nebo β-členný kruh kondenzovaný na kruh A.

Alternativně je L představován jedním z následujících strukturních vzorců:

R₈₅ tvoři 5-, 6- nebo 7-členný aromatický, heteroaromatický nebo heterocykloalkylový kruhový systém.

V obecném vzorci I Ri je atom vodíku, 2-fenyl-1,3-dioxan-5-yl, alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, cykloalkylová skupina se 3 až 8 atomy uhlíku, cykloalkenylová skupina s 5 až 7 atomy uhlíku nebo případně substituovaná aralkylskupina s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části. Pokud je R alkylová, cykloalkylová a cykloalkenylová skupina, může být případně substituována jednou nebo více skupinami obecného vzorce -0R^a, za předpokladu, že -OR^a není umístěn na atomu uhlíku připojeném na atomu dusíku. R^a je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku nebo cykloalkylová skupina se 3 až 6 atomy uhlíku.

V obecném vzorci I, R2 je atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina, ···· ··· ♦ · · · « · ····· ·· · oo · « · · · ····· “ xj ~ · · ······ ········ ·· · ·· ·· ··· substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, atom halogenu, -OH, kyanoskupina, substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaralkyl, -NR4R5 nebo -C(O)NR₄R_5í

V obecném vzorci I R₃ je substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina nebo substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl. Pokud L je NRSO2-, NRC(O)-, NRC(O)O-, -S(O)₂NR-, -C(O)NR- nebo -OC(O)NR-, R₃ může navíc být alkyl, alkenyl nebo aralkyl.

V obecném vzorci I R₄, R5 a atom dusíku dohromady tvoří a 3-, 4-, 5-, 6- nebo 7-členný, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl nebo substituovanou nebo nesubstituovanou heteroaromatickou skupinu.

Alternativně R₄ a R₅ jsou každý nezávisle atom vodíku, azabicykloalkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina nebo Y-Z.

V je -C(0)-, -(CH₂)_p ,-S(0)₂, -C(0)0-, -SO₂NH-, -CONH-, -(CH₂)_pO-, -(CH₂)_PNH-, -(CH₂)₂S-, -(CH₂)_PS(O)- nebo - (CH₂) ₂S (0)₂-.

p je celé číslo od 0 do 6.

Z je substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl,

-24·· ·· ·· ···· ·· · • · · · · · « ···· • · · · · · · · · · • ···· ···· · • · · · · · · · ···· ···· ·« ··· ·· ··· substituovaná nebo nesubstituovaná aminoskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl nebo substituovaná nebo nesubstituovaná heterocykloalkylová skupina.

j je celé číslo od 0 do 6.

Avšak pokud L je -CH2NR-, -C(O)NR- nebo

-NRC(O)- a R₃ je azacykloalkyl nebo azaheteroaryl, j je 0, Navíc pokud L je -O- a R₃ je fenyl, j je 0.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou užitečnými inhibitory serin-/threonin- a tyrosinkinas. Obzvláště jsou sloučeniny podle tohoto vynálezu užitečné jako inhibitory tyrosinkinas, které jsou důležité při hyperproliferativních chorobách, zvláště při rakovině a při procesech angiogeneze. Například jisté z těchto sloučenin jsou inhibitory takových receptorových kinas, jako je KDR, Flt-1, FGFR, PDGFR, c-Met, TIE-2 nebo IGF-l-R. Jelikož jisté z těchto sloučenin jsou antiangiogenní, jsou důležitými látkami pro inhibici rozvoje chorobných stavů, při kterých je angiogenese důležitou složkou. Jisté sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou účinné jako inhibitory takových serin-/threoninkinas, jako jsou PKC, erk, MAP kinasy, kinasy MAP kinas, kinasy kinas MAP kinas, cdks, Plk-1 nebo Raf-1. Tyto sloučeniny jsou užitečné při léčbě rakoviny a hyperprolif erat ivní ch poruch. Navíc jsou jisté sloučeniny účinnými inhibitory nereceptorových kinas, jako jsou kinasy z rodin Src (například lek, blk a lyn), Tec, Csk, Jak, Map, Nik a Syk. Tyto sloučeniny jsou užitečné při léčbě rakoviny a hyperproliferativních poruch a imunologických chorob.

Jisté sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou • · • · · · · · ♦ · ·· · • · «···· · ··

-25- · ··♦· ····· · · ·· · · ·· ···· ···· ·· ··· ·· ··· selektivními inhibitory kinasy TIE-2, které mohou být antiangiogenní (zvláště v kombinaci s jedním nebo více inhibitory VEGFR) nebo proangiogenní, pokud se použijí za přítomnosti nebo ve spojení se stimulem spojeným s VEGF. Tímto způsobem mohou takové inhibitory být použity při usnadňování terapeutické angiogenese k léčbě například ischemie, infarktu nebo okluzi nebo k usnadnění hojení ran.

Předložený vynález poskytuje způsob inhibice kinasové aktivity tyrosinkinas a serin-/threoninkinas zahrnující podávání sloučeniny představované obecným vzorcem I k uvedené kinase v dostatečné koncentraci k inhibici enzymové aktivity uvedené kinasy.

Předložený vynález dále zahrnuje použití těchto sloučenin ve farmaceutických přípravcích s farmaceuticky účinným množstvím výše popsaných sloučenin a farmaceuticky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou. Tyto farmaceutické přípravky mohou být podávány jednotlivcům ke zpomalení nebo zastavení procesu angiogenese při angiogenesí usnadňovaných chorobách nebo k léčbě edému, výpotků, exsudátů nebo ascitu a jiných stavů spjatých s vaskulární hyperpermeabilitou. Jisté farmaceutické přípravky mohou být podávány jednotlivcům k léčbě rakoviny a hyperproliferativnich poruch pomocí inhibice serin-/threoninkinas, jako jsou cdk, Plk-1, erk, atd.

Detailní popis vynálezu

Hodnoty substituentů v první výhodné skupině sloučenin obecného vzorce I jsou uvedeny dále.

Výhodně L je -N(R)S(O)₂-, -S(O)₂N(R)• · «· · · ···· ·· · ···· · · · ···· • · ····· · · · . 76 - · ···· ···· · · ♦ · ···· ···· ···· ·· ··· ·· ··· -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -NH-, NR- nebo -0-.

Výhodně R3 je substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný nebo nesubstituovaný naftyl, substituovaný nebo nesubstituovaný pyridyl, substituovaný nebo nesubstituovaný thienyl, substituovaný nebo nesubstituovaný benzotriazol, substituovaný nebo nesubstituovaný tetrahydropyranyl, substituovaný nebo nesubstituovaný tetrahydrofuranyl, substituovaný nebo nesubstituovaný dioxan, substituovaný nebo nesubstituovaný dioxolan, substituovaný nebo nesubstituovaný chinolin, substituovaný nebo nesubstituovaný thiazol, substituovaný nebo nesubstituovaný isoxazol, substituovaný nebo nesubstituovaný cyklopentyl, substituovaný nebo nesubstituovaný benzofuran, substituovaný nebo nesubstituovaný benzothiofen, substituovaný nebo nesubstituovaný imidazol, substituovaný nebo nesubstituovaný pyrrol, substituovaný nebo nesubstituovaný pyrimidinyl, substituovaný nebo nesubstituovaný indolinyl, substituovaný nebo nesubstituovaný benzisoxazol, substituovaný nebo nesubstituovaný benzisothiazol, substituovaný nebo nesubstituovaný benzothiazol, substituovaný nebo nesubstituovaný benzoxazol, substituovaný nebo nesubstituovaný benzimidazol, substituovaný nebo nesubstituovaný benzoxadiazol, substituovaný nebo nesubstituovaný benzothiadiazol, substituovaný nebo nesubstituovaný isochinolinyl, substituovaný nebo nesubstituovaný chinoxalinyl, substituovaný nebo nesubstituovaný indol nebo substituovaný nebo nesubstituovaný pyrazol, substituovaná nebo nesubstituovaná fenoxyskupina, substituovaná nebo nesubstituovaná pyridyloxyskupina. V jednom ztělesnění R3 je substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl.

• · ·· ··· · ·· · • * * · · · · • ···· · · · · ···· ···· · “ Z / “ · · · · ···· ···· ···· ·· ··· ·· ···

R₃ může být substituován jedním nebo více substituenty. Výhodnými substituenty pro R₃ jsou F, Cl, Br, I, CH₃, N0₂, OCF₃, OCH₃, CN, -CHO, CO₂CH₃, CF₃, terc.-butyl, pyridyl, pyridyloxyskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný oxazolyl, substituovaný nebo nesubstituovaný thiazolyl, substituovaný nebo nesubstituovaný benzyl, substituovaný nebo nesubstituovaný benzensulfonyl, substituovaná nebo nesubstituovaná fenoxyskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl, substituovaná nebo nesubstituovaná aminoskupina, karboxyl, substituovaný nebo nesubstituovaný tetrazolyl, styryl, -S (0)_x-(substituovaný nebo nesubstituovaný aryl), -S(0)_x, kde x = 0,1,2-(substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl), substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, alkinyl, -C(0)NR_fR_g, R_c a CH₂OR_c.

R_f, R_g a atom dusíku dohromady tvoří 3-, 4-, 5-,

6- nebo 7-členný substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaromatický kruh.

Alternativně R_f a R_g jsou každý nezávisle atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina.

R_c je atom vodíku nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, -W-(CH₂) _t-NR_dR_e, -W- (CH₂) _t ^-O-alkyl, -W- (CH₂) _t-S-alkyl, -W(CH₂)_t-OH nebo -W- (CH₂) _tNH-C (0) R_f.

• · · ···· ·····

- 2o - · · ······ ···· ···· ·· ··· ·· ··· t je celé číslo od O do asi 6,

W je vazba nebo -0-, -S-, -S(0)-, -S(0)₂- nebo -NR_k-.

R_k je atom vodíku nebo alkyl.

R_d, R_e a atom dusíku, na nějž jsou připojeny, dohromady tvoří 3-, 4-, 5-, 6- nebo 7-členný substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl nebo substituovanou nebo nesubstituovanou heterobicyklickou skupinu.

Alternativně R_d a R_e jsou každý nezávisle atom vodíku, alkyl, alkanoyl nebo -KD.

K je -S(0)₂-, —C(0)—, -C(O)NH~, -C(0)₂- nebo přímá vazba.

D je substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaralkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná aminoskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný aminoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aminocykloalkyl, COORj nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl.

Ri je substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina.

• · • ·

Výhodnějšími substituenty pro R₃ jsou F, Cl, Br,

I, kyanoskupina, nitroskupina, OCF3, CH3 a CF_3/

Výhodně kruh A je substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl, substituovaný nebo nesubstituovaný thienyl, substituovaný nebo nesubstituovaný naftyl, substituovaný nebo nesubstituovaný pyridyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný indol. V jednom ztělesnění A je substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl.

Kruh A může být substituován jedním nebo více substituenty. Výhodnými substituenty kruhu A jsou F, Cl, Br, I, CH₃, N0₂, OCF₃, OCH₃, CN, CO₂CH₃, CF₃, terc.-butyl, pyridyl, substituovaný nebo nesubstituovaný oxazolyl, substituovaný nebo nesubstituovaný benzyl, substituovaný nebo nesubstituovaný benzensulfonyl, substituovaná nebo nesubstituovaná fenoxyskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl, substituovaná nebo nesubstituovaná aminoskupina, karboxyl, substituovaný nebo nesubstituovaný tetrazolyl, styryl, -S-(substituovaný nebo nesubstituovaný aryl), -S-(substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl), substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, alkinyl, C(O)NRfR_g, R_c a CH₂OR_c. R_f, R_g a R_c mají význam uvedený výše.

Kruh A je výhodněji substituován F, Cl a nitroskupinou.

R₂ je výhodně atom vodíku.

Výhodně Ri je cyklopentylová skupina nebo iso-30• · • · · · · * ··«· • · · · · · «· • · ·»···· • · · · ···· • · » · »· • c······ · · ♦ « · propyl.

Jak je zde používáno, aromatické skupiny zahrnují karbocyklické kruhové systémy (např. benzyl a cinnamyl) a kondenzované polycyklické aromatické kruhové systémy (např. naftyl a 1,2,3,4-tetrahydronaftyl). Arylová skupina, jak je zde používáno, odkazuje na aromatickou skupinu.

Heteroaromatické skupiny, jak je zde používáno, zahrnují heteroarylové kruhové systémy (např. thienyl, pyridyl, pyrazol, isoxazolyl, thiadiazolyl, oxadiazolyl, indazolyl, furany, pyrroly, imidazoly, pyrazoly, triazoly, pyrimidiny, pyraziny, thiazoly, isoxazoly, isothiazoly, tetrazoly nebo oxadiazoly) a heteroarylové kruhové systémy, ve kterých je karbocyklický aromatický kruh, karbocyklický nearomatický kruh nebo heteroarylový kruh kondenzován na jeden nebo více dalších heteroarylových kruhů (např. benzo(b)thienyl, benzimidazol, benzoxazolyl, benzothiazolyl, benzothiadiozolyl, benzoxadiazolyl, indol, tetrahydroindol, azaindol, indazol, chinolin, imidazopyridin, purin, pyrrolo[2,3—d]pyrimidin, pyrazolo[3,4-d]pyrimidin) a jejich N-oxidy.

Aralkylová skupina, jak je zde používáno, je aromatický substituent, který je napojen na sloučeninu alifatickou skupinou, která má od 1 do asi 6 atomů uhlíku.

Heteroaralkylová skupina, jak je zde používáno,, je heteroaromatický substituent, který je napojen na sloučeninu alifatickou skupinou, která má 1 až asi 6 atomů uhlíku.

Heterocykloalkylová skupina, jak je zde ··

-31 používáno, je nearomatický kruhový systém, který má 3 až 8 atomů a zahrnuje alespoň 1 heteroatom, jako je atom dusíku, kyslíku nebo síry.

Acylová skupina, jak je zde používáno, je

-C(O)NR_XR_Z, -C(O)OR_X, -C(O)R_X, kde R_x a R_z jsou každý nezávisle atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina.

Jak je zde používáno, alifatické skupiny zahrnují uhlovodíky s přímým řetězcem, rozvětvené nebo cyklické, které všechny mají 1 až 8 atomů uhlíku, které jsou zcela nasycené nebo které obsahují jednu nebo více nenasycených jednotek. „Nižší alkylová skupina je nasycená alifatická skupina, která má 1 až 6 atomů uhlíku.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou existovat jako soli s farmaceuticky přijatelnými kyselinami. Předložený vynález takové soli zahrnuje. Příklady takových solí zahrnují hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, methansulfonaty, nitráty, maleaty, acetaty, citráty, fumaraty, tartraty [např. (+)-tartraty, (-)-tartraty nebo jejich směsi včetně racemických směsí], sukcinaty, benzoaty a soli s aminokyselinami, jako je kyselina glutamová. Tyto soli mohou být připraveny způsoby odborníkovi v oboru známými.

Jisté sloučeniny obecného vzorce I, které mají kyselé substituenty mohou existovat jako soli s farmaceuticky přijatelnými bázemi. Předložený vynález takové soli zahrnuje. Příklady takových solí zahrnují sodné soli, draselné soli, lysinové soli a argininové soli. Tyto soli mohou být připraveny způsoby odborníkovi v oboru známými .

-32• · ·« · · ···· • · · ♦ · · · e · · · · · · • · · · ·

Jisté sloučeniny obecného vzorce I a jejich soli mohou existovat ve více než jedné krystalové formě a předložený vynález zahrnuje každou krystalovou formu a jejich směsi.

Jisté sloučeniny obecného vzorce I a jejich soli mohou také existovat ve formě solvátů, například hydrátů, předložený vynález zahrnuje každý solvát a jejich směsi.

Jisté sloučeniny obecného vzorce I mohou obsahovat jedno nebo více chirálních center a existovat v různých opticky aktivních formách. Pokud sloučeniny obecného vzorce I obsahují 1 chirální centrum, existují tyto sloučeniny ve dvou enantiomerních formách a předložený vynález zahrnuje oba enantiomery a směsi enantiomerů, jako jsou racemické směsi. Enantiomery mohou být rozštěpeny způsoby odborníkovi v oboru známými, například tvorbou diastereoisomerních solí, které mohou být odděleny, například krystalizací, tvorbou diastereoisomerních derivátů nebo komplexů, které mohou být odděleny například krystalizací, plynovou-kapalinovou nebo kapalinovou chromatografií, selektivní reakcí jednoho enantiomerů s enantiomerně specifickým činidlem, například enzymatickou esterifikací, nebo plynovou-kapalinovou nebo kapalinovou chromatografií v chirálním prostředí, například na chirálním nosiči, například oxidu křemičitém s navázaným chirálním ligandem nebo za přítomnosti chirálního rozpouštědla. Zjistí se, že kde se požadovaný enantiomer převádí na jinou chemickou entitu některým z dělicích postupů popsaných výše, je vyžadován další krok k uvolnění požadované enantiomerní formy. Alternativně se mohou specifické enantiomery syntetizovat asymetrickou syntézou

-33• · ·· · ♦ · · · ♦ · · «·«· ··· · · · • · ····· «· • · · · · · · ········ ·· ··· · · 4 za použiti opticky aktivních činidel, substrátů, katalyzátorů nebo rozpouštědel, nebo konverzí jednoho enantiomeru na druhý asymetrickou transformací.

Pokud sloučeniny obecného vzorce I obsahují více než 1 chirální centrum, může existovat v diastereisomerních formách. Diastereoisomerní páry se mohou rozštěpit způsoby odborníkovi v oboru známými, například chromatografií nebo krystalizací a jednotlivé enantiomery v každém páru lze rozštěpit podle popisu uvedeného výše. Předložený vynález zahrnuje každý diastereoisomer sloučenin obecného vzorce I a jejich směsi.

Jisté sloučeniny obecného vzorce I mohou existovat v různých tautomerních formách nebo jako různé geometrické isomery, přičemž předložený vynález zahrnuje každý tautomer a/nebo geometrický isomer sloučenin obecného vzorce I a jejich směsi.

Jisté sloučeniny obecného vzorce I mohou existovat v různých stabilních konformačních formách, které mohou být oddělitelné. Torzní asymetrie v důsledku omezené rotace okolo asymetrické jednoduché vazby, například v důsledku sférického bránění nebo kruhového řetězce, může umožnit oddělení různých konformerů. Předložený vynález zahrnuje každý konformační isomer sloučenin obecného vzorce I a jejich směsi.

Jisté sloučeniny obecného vzorce I mohou existovat v zwitterionové formě, přičemž předložený vynález zahrnuje každou zwitterionovou formu sloučenin obecného vzorce I a jejich směsi.

• · • · ·· ·· ···· *··· · · « ·«·

Výhodné sloučeniny obecného vzorce I zahrnuji následující sloučeniny:

NI-(4 -(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2(trifluormethoxy)-1-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-2-chlor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-2-fluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-chlor-l-benzensulfonamid,

NI-(4 -(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-3-fluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-1-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-nitrofenyl)-1-benzensulfonamid,

NI-(4 -(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-3-(trifluormethyl)-1-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-4-chlor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-2-kyan-l-benzensulfonamid, • · · · · · • · · · « ·

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-nitro-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,β-difluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)1-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,3,4-trifluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-4-brom-2-fluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl}-2,5-difluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)3,4-difluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-brom-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)2,6-dichlor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[ 2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,4,6-trichlor-1-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)2,4-dichlor-l-benzensulfonamid, • ·

• · ···· ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ·· ·V·

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-chlor-4-fluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)2,4-difluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-jod-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) -2-fluorfenyl)2,3-dichlor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-4-brom-2,5-difluor-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-chlor-4-kyan-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-chlor-6-methyl-l-benzensulfonamid,

NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-3-chlor-2-methyl-l-benzensulfonamid,

N2-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-4,5-dibrom-2-thiofensulfonamid,

N2-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-5-brom-2-thiofensulfonamid,

N2-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-3-brom-5-chlor-2-thiofensulfonamid, • · • · · · ···· ·· • · · · ·«· ·

N3-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,5-dichlor-3-thiofensulfonamid,

N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,1,3-benzoíhiadiazol-4-sulfonamid,

N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,1,3-benzoxadiazol-4-sulfonamid,

N4-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-7-chlor-2,1,3-benzoxadiazol-4-sulfonamid,

N4-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-7-meíhyl-2,1,3-benzothiadiazol-4-sulfonamid,

N4-(4-(4-amino-7-cyklopeníy1-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-5-methyl-2,1,3-benzothiadiazol-4-sulfonamid,

N4-(4-(4-amino-7-cyklopeníy1-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-5-chlor-2,1,3-benzothiadiazol-4-sulfonamid,

N-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-(2-niírofenyl)methansulfonamid a

NI-(4 -(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,5-dibrom-3,6-difluor-l-benzensulfonamid.

• ·

38- .·.··: : : : : :

········ .. ... ,, ,,,

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají antiangiogenní vlastnosti. Tyto antiangiogenní vlastnosti jsou alespoň zčásti důsledkem inhibice proteinových tyrosinkinas nezbytných pro angiogenní procesy. Z tohoto důvodu se tyto sloučeniny mohou použít jako účinné látky proti takovým chorobným stavům, jako jsou arthritida, atherosklerosa, restenosa, psoriasa, hemangiomy, myokardiální angiogenese, koronární a cerebrální kolaterály, angiogenese ischemické končetiny, ischemické/reperfusní poškození, hojení ran, nemoci související s Helicobacterm peptického vředu, virově indukované angiogenní poruchy, zlomeniny, Crow-Fukaseův syndrom (POEMS), preeklampsie, menometrorrhagie, horečka z kočičího škrábnutí, rubeosa, neovaskulární glaukom a retinopatie, jako jsou retinopatie doprovázející diabetickou retinopatii, retinopatie předčasně narozených dětí nebo makulární degenerace související s věkem. Navíc některé z těchto sloučenin mohou být použity jako účinné látky proti solidním tumorům, malignímu ascitu, von Hippel Lindauově chorobě, hematopoietickým rakovinám a hyperproliferativním poruchám, jako je thyroidní hyperplasie (zvláště Gravesova choroba) a cystám (jako je hypervaskularita ovariálního stromatu charakteristická pro polycystický ovariální syndrom (Stein-Leventhalův syndrom) a polycystickou nemoc ledvin.

Dále mohou některé z těchto sloučenin být použity jako účinné látky proti popáleninám, chronické plicní chorobě, mrtvici, polypům, anafylaxi, chronickému a alergickému zánětu, hypersenzitivitě opožděného typu, ovariálnímu hyperstimulačnímu syndromu, cerebrálnímu edému provázejícímu mozkový tumor, vysokou nadmořskou výškou, traumatem nebo hypoxií navozenému cerebrálnímu nebo • ·

....... . . .:

• · · .... ,. . QO . * ···· ···.

- 39 - ·· ···...

········ .. ... ,, ,,, plicnímu edému, okulárnímu nebo makulárnímu edému, ascitu, glomerulonefritidě a jiným nemocím, kde je projevem choroby vaskulární hyperpermeabilita, výpotky, exsudáty, proteinová extravasace nebo edém. Tyto sloučeniny budou rovněž užitečné při léčení poruch, při kterých proteinová extravasace vede k ukládání fibrinu a extracelulární matrix, čímž se usnadňuje proliferace stromatu (např. keloidní, fibrotický, cirhotický syndrom a syndrom karpálního tunelu). Zvýšená tvorba VEGF potencuje zánětlivé procesy, jako je atrakce a aktivace monocytů. Sloučeniny podle tohoto vynálezu budou také užitečné při léčení zánětlivých poruch, jako jsou choroba zánětlivého střeva (IBD) a Crohnova choroba.

VEGF jsou jedinečné v tom, že jsou jediným známým angiogenním růstovým faktorem, o němž je známo, že přispívá k vaskulární hyperpermeabilitě a tvorbě edému. Vskutku se zdá, že vaskulární hyperpermeabilita a edém, které jsou spojeny s expresí nebo podáním mnohých růstových faktorů, jsou zprostředkovány cestou tvorby VEGF. Cytokiny zánětu stimulují tvorbu VEGF. Hypoxie vede k výrazné up-regulaci VEGF v mnohých tkáních a tedy situace zahrnující infarkt, okluzi, ischemii, anemii nebo oběhové zhoršení typicky vyvolávají odpovědi zprostředkované VEGF/VPF. Vaskulární hyperpermeabilita, doprovodný edém, poškozená transendotheliální výměna a makromolekulární extravasace, která je často doprovázena diapedesou, mohou vést v nadměrnému ukládání matrix, aberantní proliferaci stromatu, fibrose atd. Hyperpermeabilita zprostředkovaná VEGF tedy může významně přispívat k poruchám s těmito etiologickými rysy.

Jelikož uhnízdění blastocytu, vývoj placenty a embryogenese jsou závislé na angiogenesi, jsou jisté • · · · • · ···· ···· *··*···* · ,;_β sloučeniny podle tohoto vynálezu užitečné jako kontraceptivni látky a látky způsobující neplodnost.

Má se zato, že poruchy uvedené výše jsou zprostředkovány významnou měrou aktivitou proteinové tyrosinkinasy zahrnující tyrosinkinasy KDR/VEGFR-2 a/nebo Flt-l/VEGFR-1 a/nebo TIE-2, Inhibicí aktivity těchto tyrosinkinas se inhibuje rozvoj uvedených poruch, protože složka angiogenní nebo složka vaskulární hyperpermeability chorobného stavu je silně podvázána. Působení jistých sloučenin podle tohoto vynálezu, jejich selektivitou vůči specifickým tyrosinkinasám, vede k minimalizaci vedlejších účinků, které by se objevily pokud by se použilo méně selektivních inhibitorů tyrosinkinas. Jisté sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou rovněž účinnými inhibitory FGFR,. PDGFR, c-Met a IGF-l-R. Tyto receptorové kinasy mohou přímo nebo nepřímo potenciovat angiogenní a hyperproliferativní odpovědi při různých poruchách, takže jejich inhibicí mohou zbrzdit rozvoj choroby.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají inhibiční aktivitu vůči proteinovým proteinkinasám. To znamená, že tyto sloučeniny modulují transdukci signálu zprostředkovanou proteinkinasami. Sloučeniny podle tohoto vynálezu inhibují proteinové kinasy ze tříd serin-/threoninkinas a tyrosinkinas. Obzvláště tyto sloučeniny selektivně inhibují aktivitu tyrosinkinas KDR/FLK-l/VEGFR-2. Jisté sloučeniny podle tohoto vynálezu také inhibují aktivitu dalších tyrosinkinas, jako je Flt-l/VEGFR-1, Tie-2, FGFR, PDGFR, IGF-1R, c-Met a kinasy podrodiny Src, jako je Lek, Src, fyn, yes atd. Navíc některé sloučeniny podle tohoto vynálezu významně inhibují serin-/threoninové kinasy, jako je PKC, kinasy MAP, erk, kinasy CDK, Plk-1 nebo Raf-1, • · · · • ·

-41 - · · · : :

········ ·» ··.* *..* které hrají nezbytnou úlohu při buněčné proliferaci a rozvoji buněčného cyklu. Potence a specificita generických sloučenin podle tohoto vynálezu vůči určité proteinkinase může často být změněna a optimalizována změnami její povahy, počtu a uspořádání substituentů (tj. Ri, R₂, R3, A a kruhu 1) a konformačními omezeními. Navíc metabolity jistých sloučenin mohou také mít významnou inhibiční aktivitu vůči proteinkinase.

Pokud se sloučeniny podle tohoto vynálezu podávají jednotlivcům, kteří takové sloučeniny potřebují, inhibují u těchto jedinců vaskulární hyperpermeabilitu a tvorbu edému. Má se zato, že tyto sloučeniny působí inhibicí aktivity tyrosinkinasy KDR, která je účastna procesu vaskulární hyperpermeability a tvorby edému. Tyrosinkinasa KDR může také být označována jako tyrosinkinasa FLK-1, tyrosinkinasa NYK nebo jako tyrosinkinasa VEGFR-2, Tyrosinkinasa KDR se aktivuje, když se na receptor tyrosinkinasy KDR, který leží na povrchu vaskulárních endotheliálních buněk naváže růstový faktor vaskulárních endotheliálních buněk (VEGF) nebo jiný aktivační ligand (jako je VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E nebo protein HIV Tat).Po takové aktivaci tyrosinkinasy KDR se objeví hyperpermeabilita cév a kapalina se pohybuje z krevního řečiště skrz cévní stěny do intersticiálních prostorů, čímž se vytvoří oblast edému. Tuto odpověď často také doprovází diapedesa. Podobně může nadměrná vaskulární hyperpermeabilita v rozhodujících tkáních a orgánech (např. v plicích a ledvinách) rozrušit normální molekulární výměnu probíhaj ící přes endothelium, čímž způsobí makromolekulární extravasaci a ukládání. Po této akutní odpovědi na stimulaci KDR, o níž' se věří, že usnadňuje následný angiogenní proces, vede dlouhodobá stimulace tyrosinkinasy KDR k proliferaci a • ·

chemotaxi vaskulárních endotheliálních buněk a tvorbě nových cév. Inhibici aktivity tyrosinkinasy KDR, buď blokováním tvorby aktivujícího ligandu, nebo blokádou vazby aktivujícího ligandu na receptor tyrosinkinasy KDR, nebo zabráněním dimerizaci a transfosforylaci receptoru, nebo inhibici enzymové aktivity tyrosinkinasy KDR (inhibici fosforylační funkce enzymu) a nebo nějakým jiným mechanismem, který přerušuje další přenos signálu (D. Mukhopedhyay a kol., Cancer Res., 58, 1278 - 1284 (1998) a odkazy tam uvedené), se může inhibovat a minimalizovat hyperpermeabilita, stejně jako doprovázející extravasace, následná tvorba edému a ukládání matrix a angiogenní procesy.

Jedna skupina výhodných sloučenin podle tohoto vynálezu má schopnost inhibice aktivity tyrosinkinasy KDR aniž by významně inhibovala aktivity tyrosinkinasy Flt-1 (tyrosinkinasa Flt-1 je také označována jako tyrosinkinasa VEGFR-1). Jak tyrosinkinasa KDR, tak tyrosinkinasa Flt-1 jsou aktivovány vazbou VEGF na receptor tyrosinkinasy KDR nebo receptor tyrosinkinasy Flt-1, Jisté výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou jedinečné, neboť inhibují aktivitu jedné VEGF-receptorové tyrosinkinasy (KDR), která je aktivována aktivujícími ligandy, ale neinhibují jiné receptorové tyrosinkinasy, jako je Flt-1, které jsou také aktivovány jistými aktivujícími ligandy. Tímto způsobem jisté výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou tedy selektivní ve své inhibiční aktivitě vůči tyrosinkinasám.

V jednom ztělesnění poskytuje předložený vynález způsob léčby stavu pacienta zprostředkovaného proteinkinasou, který zahrnuje podávání pacientovi terapeuticky • ·

nebo profylakticky účinného množství jedné nebo více sloučenin obecného vzorce I.

„Stavem zprostředkovaným proteinkinasou je zdravotní stav, jako je choroba nebo jiný než nežádoucí fyzický stav, jehož genese nebo rozvoj závisí, alespoň z části, na aktivitě alespoň jedné proteinkinasy. Proteinkinasa může být například proteinová tyrosinkinasa nebo proteinová serin-/threoninkinasa.

Pacientem, který má být léčen může být jakýkoli živočich, výhodně savec, jako je domestikované zvíře nebo hospodářské zvíře. Výhodněji je pacientem člověk.

„Terapeuticky účinným množstvím je množství sloučeniny obecného vzorce I nebo kombinace dvou nebo více takových sloučenin, které inhibuje, úplně nebo zčásti, rozvoj stavu nebo zmírňuje, alespoň zčásti, jeden nebo více symptomů stavu. Terapeuticky účinným množstvím může být také množství, které je profylakticky účinné. Množství, které je terapeuticky účinné, bude záviset na velikosti a pohlaví pacienta, stavu, který má být léčen, závažnosti stavu a požadovaném výsledku. Pro daného pacienta se terapeuticky účinné množství může stanovit způsoby známými odborníkovi v oboru.

Způsob podle předloženého vynálezu je užitečný při léčbě stavů zprostředkovaných prosteinkinasou, jako je kterýkoli ze stavů popsaných výše. V jednom ztělesnění je stav zprostředkovaný proteinkinasou chrakterizován nežádoucí angiogenesí, edémem nebo deposicí stromatu. Například stavem může být jeden nebo více vředů, jako jsou vředy způsobené bakteriálnímu nebo houbovými infekcemi, ······ ..:

-44- · · . : :

.............* ,:.

Moorenovy vředy a ulcerativní kolitida. Stav může také být důsledkem mikrobiální infekce, jako je Lymeská choroba, sepse, septický šok nebo infekce Herpes simplex, Herpes Zoster, virem lidské imunodeficience, protozoy, toxoplasmaty nebo parapoxviry, angiogenní poruchy, jako je Hippel Lindauova choroba, polycystická choroba ledvin, pemfigoid, Pagetova choroba a psoriasa, reprodukčního stavu, jako je endometriosa, syndrom ovariální hyperstimulace, preeklamsie nebo menometrorhagie, fibrotického nebo edematózního stavu, jako je sarkoidosa, fibrosa, cirhosa, thyroiditida, systémový sysndrom hyperviskosity, Osler-Weber-Renduova choroba, chronická plicní oklusivní choroba, astma, edém po popáleninách, traumatu, ozáření, mrtvici, hypoxii nebo ischemii, nebo zánětlivý/imunologický stav, jako je systémový lupus, chronický zánět, glomerulonefritida, synovitida, choroba zánětlivého střeva,· Crohnova choroba, revmatoidní artritida, asteoartritida, roztroušená sklerosa a odmítnutí štěpu. Vhodné stavy zprostředkované proteinkinasou rovněž zahrnují srpkovitou anemii, osteroporosu, osteopetrosu, tumorem navozenou hyperkalcemii a kostní metastasy. Další stavy zprostředkované proteinkinasou, které mohou být léčeny způsobem podle tohoto vynálezu zahrnují oční stavy, jako jsou oční a' makulární edém, oční neovaskulární choroba, skleritida, radiální keratotomie, uveitida, vitritida, myopie, důlky na oku po neštovicích, chronické odchlipování retiny, komplikace po ošetření laserem, konjunktivitida, Stagardtova choroba a Ealesova choroba, vedle retinopatie a makulární degenerace.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou také užitečné při léčbě kardiovaskulárních stavů, jako je • · ·

-45 ·· ·· • · · · • 9 • * · « · • · « · · t · · ♦ · •· «· •· *· «· · •9 •· •· • · · atherosklerosa, restenosa, vaskulární okluze a obstrukční chroba karotid.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou také užitečné při léčbě indikací souvisejících s rakovinou, jako jsou solidní tumory, sarkomy (obzvláště Ewingův sarkom a osteosarkom), retinoblastom, rhabdomyosarkomy, neuroblastom, hematopoetické malignity včetně leukemie a lymfomu, tumorem navozené plurální a perikardiální výpotky a maligní ascites.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou také užitečné při léčbě Crow-Fukasova syndromu (POEMS) a diabetických stavů, jako je glaukom, diabetická retinopatie a mikroangiopatie.

Rodiny kinas Src, Tec, Jak, Map, Csk, NFkB a Syk hrají vedoucí role při regulaci imunitní funkce. Rodina Src v současnosti zahrnuje Fyn, Lek, Fgr, Fes, Lyn, Src, Yrk, Fyk, Yes, Hek a Blk. Rodinou Syk se v současnosti rozumí rodina zahrnující pouze Zap a Syk. Rodina TEC zahrnuje Tec, Btk, Rlk a Itk. Rodina kinas Janus je účastna transdukce signálů růstového faktoru a prozánětlivého cytokinu prostřednictvím četných receptorů. Ačkoliv BTK a ITK, členové rodiny kinas Tec, hrají v imunobiologii méně dobře poznanou roli, jejich modulace inhibitorem se může ukázat jako terapeutický přínosná. Rodinou Csk se v současnosti rozumí, ža zahrnuje Csk a Chk. Kinasy RIP, IRAK-1, IRAk-2, NIK, kinasy p38 MAP, Jnk, IKK-1 a IKK-2 jsou zahrnuty do cesty transdukce signálu klíčových prozánětlivých cytokinů, jako jsou TNF a IL-1, Z podstaty jejich schopnosti inhibovat jednu nebo více těchto kinas mohou sloučeniny obecného vzorce I působit jako imunomodulační činidla

-46·· «· ’ « ♦ >

• ·

r » < · • · • f ·

užitečná při udržování štěpů, léčbě autoimunitních poruch a léčbě sepse a septického šoku. Prostřednictvím schopnosti regulovat migraci nebo aktivaci T buněk, B-buněk, mastocytů, monocytů a neutrofilů mohou tyto sloučeniny být použity k léčbě autoimunitních chorob a sepse. Prevence odmítnutí štěpu, ať už reakce hostitele proti štěpu u orgánů nebo reakce štěpu proti hostiteli v případě kostní dřeně, je omezena toxicitou v současnosti dostupných imunosupresivních látek a účinné léčivo se zlepšeným terapeutickým indexem by bylo pro ni přínosem. Genově zacílené experimenty ukázaly, že Src hraje nezbytnou úlohu v biologii osteoklastů, buněk odpovědných za resorpci kosti. Sloučeniny obecného vzorce I, prostřednictvím své schopnosti regulovat Src, mohou být také užitečné při léčbě osteoporosy, osteopetrosy, Pagetovy choroby, tumorem navozené hyperkalcemie a při léčbě kostních metastaz.

U četných proteinkinas bylo ukázáno, že jsou protoonkogeny. Chromosomální zlomy (v bodě zlomu ltk kinasy na chromosomu č. 5) translokace jako v případě genu Abl při BOR zkrácení (chromosom Philadelphia) v případech, jako je c-Kit nebo EGFR, nebo mutace (např. Met) vede k tvorbě disregulovaných proteinů konvertujících je z protoonkogenů na onkogenní produkty. V jiných nádorech se onkogenese řízena interakcemi autokrinní nebo parakrinní ligand/růstový faktor receptor. Členové rodiny kinas src se typicky účastní transdukce signálu čímž potencují onkogenesi a samy se mohou stát onkogenní v důsledku nadměrné exprese nebo mutace. Inhibicí proteinkinasové aktivity těchto proteinů se může chorobný proces přerušit. Vaskulární restenosa může zahrnovat proliferaci hladkého svalu a endotheliálních buněk usnadněnou FGF a/nebo PDGF. Stimulace FGFR, PDGFR,

-47···· · · · * · · · • · ····· ·· · • ···· ···· · • · ·· ···· ········ ·· ··· ·· · ·o

IGFI-R a c-Met ligandem in vivo je proangiogenni a potencuje poruchy závislé na angiogenesi. Inhibice aktivit kinas FGFr, PDGFr, c-Met nebo IGFI-R individuálně nebo v kombinaci může být účinnou strategií pro inhibici tohoto jevu. Tedy sloučeniny obecného vzorce I, které inhibují kinasovou aktivitu normálních nebo aberantních členů rodin c-kit, c-met, c-fms a src, tedy EGFr, erbB2, erbB4, BCR-Abl, PDGFr, FGFr, IGFI-R a dalších receptorových nebo cytosolických tyrosinkinas, mohou být hodnotné při léčbě benigních a neoplastických proliferativních chorob.

U mnohých patologických stavů (například solidních primárních tumorů a metastas, Kaposiho sarkomu, revmatoidní' arthritidy, slepoty v důsledku nepříhodné okulární neovaskularizace, psoriasy a atherosklerosy) je rozvoj choroby závislý na přetrvávající angiogenesi. Polypeptidové růstové faktory často produkované chorobnou tkání nebo napojenými zánětlivými buňkami a jejich odpovídající specifické receptorové tyrosinkinasy endotheliálních buněk (např. KDR/VEGFR-2, Fltl/VEGFR-1, Tie-2/Tek a Tie) jsou nezbytné pro stimulaci růstu endotheliálních buněk, migraci, organizaci, diferenciaci a ustavení nezbytné nové funkční vaskulatury. Jako výsledek aktivity faktoru vaskulární permeability VEGF při zprostředkování vaskulární hyperpermeability se má zato, že stimulace VEGFR kinasy VEGF hraje důležitou roli při tvorbě tumorového ascitu, cerebrálniho a plicniho edému, pleurálních a perikardiálních výpotků, hypersensitivních reakcí opožděného typu, tkáňového edému a orgánové dysfunkce po traumatu, popálenin, ischemie, diabetických komplikací, endometriosy, syndromu dechové tísně dospělých (ARDS), post-kardiopulmonární hypotensí a hyperpermeabilitou související s bypassem a očního edému vedoucímu ke glaukomu nebo slepotě v důsledku nepříhodné neovaskularizace. Vedle VEGF, mohou • · ·· ·· ···· ·· · ···· ······· • · ······· ·

AQ · ···· · · · ·· “ T-O “ ·· ······ ········ ·· · ·· ·· ··· v současnosti identifikované VEGF-C a VEGF-D a virově kódovaný VEGF-E nebo protein HIV-Tat také způsobit vaskulárni hyperpermeabilitní odpověď prostřednictvím stimulace VEGFR kinasy. KDRNEGFR-2 a/nebo Tie-2 jsou také exprimovány ve vybrané populaci hematopoietických kmenových buněk. Jistí členové této populace jsou pluripotentní povahy a mohou být stimulovány růstovými faktory k diferenciaci na endotheliální buňky a účastnit se vaskulogenetických angiogenních procesů. Z tohoto důvodu jsou nazvány endotheliálními progenitorovými buňkami (EPC) (J. Ctin. Investig., 103, 1231 - 1236 (1999)). U některých progenitorů může při jejich opatřování, adhesi, regulaci a diferenciaci hrát roli Tie-2 (Blood, 4317-4326 (1997)). Jisté látky podle obecného vzorce I schopné blokády kinasové aktivity specifických kinas endotheliálních buněk mohou tedy inhibovat rozvoj choroby zahrnující tyto situace.

U vaskulárni destabilizace antagonistického ligandu Tie-2 (Ang2) se má zato, že indukuje nestabilní plastický stav v endotheliu. Za přítomnosti vysokých hladin VEGF může dojít k silné angiogenní odpovědi, avšak za nepřítomnosti VEGF nebo stimulu souvisejícího s VEGF se může objevit klinicky zjištěná regrese cévy a endotheliální apoptosa (Genes and Devel., 13, 1055 - 1066 (1999)). Analogickým způsobem může být inhibitor kinasy Tie2 proangiogenní nebo antiangiogenní za přítomnosti nebo nepřítomnosti stimulu souvisejícího s VEGF. Inhibitory Tie-2 mohou tedy být využity s příslušnými proangiogenními stimuly, jako je VEGF, k usnadnění terapeutické angiogenese v situacích, jako je hojení ran, infarkt a ischemie.

Sloučeniny obecného vzorce I nebo jejich soli

-49···· ··· · · · · • · ····· · · · • · ··· ···· · • · ·· ···· ········ ·· ··· ·· ··· nebo farmaceutické přípravky obsahující jejich účinné množství mohou být použity při léčbě stavů zprostředkovaných proteinkinasou, jako jsou benigní a neoplastické proliferativní choroby a poruchy imunitního systému, jak je popsáno výše. Takové choroby například zahrnují autoimmuní choroby, jako je revmatoidní arthritida, thyroiditida, diabetes typu 1, roztroušená sklerosa, sarkoidosa, zánětlivá choroba střev, Crohnova choroba, myaspotéia gravis a systémový lupus erythematosus; psoriasa, odmítnutí orgánového transplantátu (např. odmítnutí ledviny, choroba z reakce štěpu proti hostiteli), benigní a neoplastické proliferativní choroby, lidské rakoviny, jako je rakovina plic, prsu, žaludku, močového měchýře, tlustého střeva, pankreatu, vaječníků, prostaty a rekta a hematopoietické malignity (leukemie a lymfom), a nemoci zahrnující nepříhodnou vaskularizaci, například diabetická retinopatie, retinopatie předčasně narozených dětí, choroidální neovaskularizace v důsledku makulární degenerace související s věkem, a dětské hemangiomy u lidí. Takové inhibitory mohou být navíc užitečné při léčbě poruch zahrnujících edém zprostředkovaný VEGF, ascitu, výpotků, a exsudátů, včetně například makulárního edému, cerebrálního edému, akutního poškození plic a syndromu dechové tísně dospělých (ARDS).

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být také užitečné při profylaxi výše uvedených nemocí.

Předpokládá se, že výše uvedené poruchy jsou zprostředkovány významnou měrou aktivitou proteinové tyrosinkinasy zahrnující receptory VEGF (např. KDR, Flt-1 a/nebo Tie-2). Inhibici aktivity těchto receptorových tyrosinkinas se rozvoj uvedených poruch inhibuje, protože

-50·· · 4 ·· · · · · ·· · ···· ··· ···· • · ····· ·· · • ···· ···· · • · ·· ···· ········ ·· · · · * · ··· angiogenní složka chorobného stavuje je výrazně podvázána. Působeni sloučenin podle tohoto vynálezu, prostřednictvím jejich selektivity vůči specifickým tyrosinkinasám vede k minimalizaci vedlejších účinků, které by se objevily, kdyby se použilo méně selektivních inhibitorů tyrosinkinas.

V dalším aspektu poskytuje předložený vynález sloučeniny obecného vzorce I definovaných výše pro použití jako léčiv, obzvláště inhibitorů aktivity proteinových tyrosinkinas, například aktivity tyrosinkinas, aktivity serinkinas a aktivity threoninkinas. V ještě dalším aspektu poskytuje předložený vynález použití sloučenin obecného vzorce I definovaných výše pro výrobu léčiva pro použití při inhibici aktivity proteinkinas.

V tomto vynálezu jsou použitelné následující definice:

„Fyziologicky přijatelné soli odkazuje na ty soli, které si uchovávají biologickou účinnost a vlastnosti volných bází a které se získají reakcí s anorganickými kyselinami, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná a kyselina fosforečná, nebo organickými kyselinami, jako je kyselina arylsulfonová, kyselina karboxylová, organická fosforečná kyselina, kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina salicylová, kyselina mléčná, kyselina vinná, kyselina maleinová apod.

„Alkyl odkazuje na nasycený alifatický uhlovodík, včetně skupin s přímým a rozvětveným řetězcem, majících 1 až 6 atomů uhlíku nebo cyklických uhlovodíků, které mají 3 až 6 atomů uhlíku.

• · ···· ··· · · · • · ····· ·· „Alkoxyskupina odkazuje na na „O-alkylovou skupinu, kde „alkyl je definován jak je popsáno výše.

Farmaceutické přípravky

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány lidskému pacientovi jako takové nebo ve farmaceutických přípravcích, kde jsou smíseny s vhodnými nosiči nebo pomocnou látkou (pomocnými látkami) v dávkách k léčbě nebo zlepšení vaskulární hyperpermeability, edému a souvisejících poruch. Směsi těchto sloučenin mohou také být podávány pacientovi jako prosté směsi nebo vhodně formulované farmaceutické přípravky. Terapeuticky účinnou dávkou se dále označuje takové množství sloučeniny nebo sloučenin, které je dostatečné k tomu, aby vedlo k prevenci nebo oslabení nepříhodné neovaskularizace, rozvoje hyperproliferativních poruch, edému, hyperpermeability související s VEGF a/nebo hypotense související s VEGF. Techniky formulace a podávání sloučenin podle předloženého vynálezu mohou být nalezeny v „Remington's Pharmaceutica1 Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, poslední vydání.

Cesty podání

Vhodné cesty podání mohou například zahrnovat orální podání, podání očními kapkami, podání rektální, transmukosální, topické nebo střevní, parenterální podání včetně intramuskulárních, subkutánních a intramedulárních injekcí, stejně jako intrathekální, přímé intraventrikulární, intravenózní, intraperitoneální, intranasální nebo intraokulární injekce.

-52·· ·· · · ···· · · · ···· ··· · ·· · • · ····· · ♦· • · · · · ···· · • · · · · · ·· ···· ···· ·· ··· ·· ···

Alternativně lze podávat sloučeninu lokálně spíše než systémově, například prostřednictvím injekce sloučeniny přímo do místa edému, často v depotní formulaci nebo ve formulaci se zpožděným uvolňováním.

Dále lze léčivo podávat v cíleném systému dodávání léčiv, například v liposomu potaženém protilátkou specifickou proti endotheliálním buňkám.

Přípravek/formulace

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu mohou být vyrobeny způsobem, který je sám o sobě znám, např. prostředky obvyklého míšení, rozpouštění, granulace, dražování, leštění, emulzifikace, enkapsulace, zachycovacích nebo lyofilizačních způsobů.

Farmaceutické přípravky pro použití podle tohoto vynálezu mohou tedy být formulovány obvyklým způsobem za použití jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosičů obsahujících excipienty a pomocné látky, které usnadňují zpracování účinných sloučenin do přípravků, které mohou být farmaceuticky použity. Vlastni formulace je závislá na zvolené cestě podání.

Pro injekce mohou být sloučeniny podle tohoto vynálezu formulovány ve vodných roztocích, výhodně fyziologicky kompatibilních pufrech, jako je Hanksův roztok, Ringerův roztok nebo pufr fyziologického roztoku. Pro transmukosální podání se v přípravku použijí penetranty příhodné pro bariéru, která má být prostoupena. Takové penetranty jsou obecně v oboru známy.

·· · · ·« ···· ·· · ···· e · · ···· _ ······· ··· - 33 - · ···· ····· • · · · ···· ··♦····· ·· ··· · · ···

Pro orální podání mohou sloučeniny snadno být formulovány smísením účinných sloučenin s farmaceuticky přijatelnými nosiči v oboru dobře známými. Takové nosiče umožňují sloučeninám podle tohoto vynálezu být formulovány jako tablety, pilule, dražé, kapsle, kapaliny, gely, sirupy, suspenze apod. pro orální požití pacientem, který má být léčen. Farmaceutické přípravky pro orální užití se dají získat smísením účinné sloučeniny s tuhým excipientem, případně mletím výsledné směsi a zpracováním směsi granulí, po přidání vhodných pomocných látek, pokud je to žádoucí, k získání tablet nebo dražovacích jader. Vhodnými excipíenty jsou obzvláště plnidla, jako jsou cukry včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu, celulózové přípravky, jako je například kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, tragant, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, natriumkarboxymethylcelulóza a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP). Pokud je to žádoucí, mohou se přidat desintegrační činidla, jako je zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová nebo její sůl, jako je alginat sodný.

Dražovací jádra se poskytnou s vhodným potahem.

K tomuto účelu se mohou použít koncentrované roztoky cukrů, které mohou případně obsahovat klovatinu, mastek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, roztoky laků a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Do potahů tablet či dražé se mohou přidat barviva nebo pigmenty pro identifikaci nebo k charakterizaci různých kombinací dávek účinné sloučeniny.

Farmaceutické přípravky, které mohou být užity orálně zahrnují západkové kapsle vyrobené ze želatiny,

-54stejně jako měkké, zalepované kapsle vyrobené ze želatiny a plastikátoru, jako je glycerol nebo sorbitol. Západkové kapsle mohou obsahovat účinné sloučeniny ve směsi s plnidlem, jako je laktóza, pojivý, jako jsou škroby, a/nebo mazadly, jako je mastek nebo stearat horečnatý, a případně stabilizátory. V měkkých kapslích mohou být účinné sloučeniny rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných kapalinách, jako jsou mastné oleje, kapalný parafin nebo kapalné polyethylenglykoly. Navíc mohou být přidány stabilizátory. Všechny přípravky pro orální podáni musí být v dávkách vhodných pro takové podání.

Pro bukální podání mohou přípravky mít formu tablet nebo pokroutek formulovaných obvyklým způsobem.

Pro podání inhalační se sloučeniny podle tohoto vynálezu příhodně dodávají ve formě aerosolového sprejového přípravku z tlakových nádob nebo nebulizérů za použití příhodného vyháněcího plynu, např. dichlordifluormethanu, trichlorfluormethanu, tetrachlortetrafluorethanu, oxidu uhličitého nebo jiného vhodného plynu. V případě tlakovaného aerosolu se dávková jednotka může určit poskytnutím ventilu k dodání odměřeného množství. Mohou být formulovány kapsle a náplně např. ze želatiny pro použití v inhalátoru nebo insuflátoru obsahující směs prášku sloučeniny a vhodné práškové báze, jako je laktóza nebo škrob.

Sloučeniny mohou být formulovány pro parenterální použití injekcí, např. bolusovou injekcí nebo kontinuální infuzí. Přípravky pro injekci mohou být předloženy ve formě dávkové jednotky, např. v ampulích nebo vícedávkových nádobách s přidaným konzervanciem. Přípravky mohou mít takové formy, jako jsou suspenze, roztoky nebo emulze

-55• · ·♦ ·· «·«· ·· · »»·* * ♦ t <.··« • * · « « · · · ♦ · • ···* · J · · · • · · · ··«» ·*······ ·· · · ♦ ·· ··· v olejových nebo vodných vehikulech a mohou obsahovat formulační činidla, jako jsou suspendující, stabilizující a/nebo dispergační činidla.

Farmaceutické přípravky pro parenterální podání zahrnují vodné roztoky účinných sloučenin ve formě rozpustné ve vodě. Navíc se mohou připravit suspenze účinných sloučenin jako příslušné olejové injekční suspenze. Vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula zahrnují mastné oleje, jako je sezamový olej, nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je ethyloleat, nebo triglyceridy nebo liposomy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je karboxymethylcelulóza, sorbitol nebo dextran. Případně může suspenze také obsahovat vhodné stabilizátory nebo činidla, která zvašují solubilitu sloučenin k umožnění přípravy vysoce koncentrovaných roztoků.

Alternativně může být účinná látka v práškové formě pro konstituci před použitím s vhodným vehikulem, např. sterilní nepyrogenní vodou.

Sloučeniny mohou také být formulovány do rektálních přípravků, jako jsou čípky nebo retenční klystýry, např. obsahujících obvyklý čípkový základ, jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy.

Vedle přípravků popsaných výše mohou sloučeniny být také formulovány jako depotní přípravky. Takové dlouhodobě působící přípravky se mohou podávat implantací (např. subkutánně nebo intramuskulárně nebo intramuskulární injekcí). Sloučeniny mohou tedy například být formulovány s vhodnými polymerními nebo hydrofobními materiály (např.

• · jako emulze v přijatelném oleji) nebo iontoměniči nebo jako špatně rozpustné deriváty, například jako špatně rozpustná sůl.

Příkladem farmaceutického nosiče pro hydrofobní sloučeniny podle tohoto vynálezu je systém spolurozpouštědel obsahující benzylakohol, nepolární povrchově aktivní látku, s vodou mísitelný organický polymer a vodnou fázi. Systémem spolurozpouštědel může být systém spolurozpouštědel VPD. VPD je roztok 3 % hmotnost/objem benzylakoholu, 8 % hmotnost/objem nepolární povrchově aktivní látky polysorbatu 80 a 65 % hmotnost/objem polyethylenglykolu 300 doplněné na objem absolutním ethanolem. Systém spolurozpouštědel VPD (VPD:5W) sestává z VPD ředěného 1:1 5% dextrosou ve vodném roztoku. Tento systém spolurozpouštědel dobře rozpouští hydrofobní sloučeniny a sám je při systémovém podání málo toxický. Přirozeně se poměry systému spolurozpouštědel mohou výrazně měnit aniž by se porušily jeho charakteristiky rozpustnosti a toxicity. Navíc se identita složek systému spolu-rozpouštědel může měnit, například místo polysorbatu 80 se mohou použít jiné nepolární povrchově aktivní látky s nízkou toxicitou, může se měnit frakční velikost polyethylenglykolu, polethylenglykol může být nahrazen jinými biokompatibilními polymery, např. polyvinylpyrrolidonem, a dextrózu mohou nahradit jiné cukry nebo polysacharidy.

Alternativně se mohou pro hydrofobní farmaceutické sloučeniny použít jiné systémy dodávání. Liposomy a emulse jsou dobře známými příklady dodávacích vehikul nebo nosičů pro hydrofobní léčiva. Mohou se také použít jistá organická rozpouštědla, jako je dimethylsulfoxid, ačkoliv obvykle za cenu vyšší toxicity. Sloučeniny mohou navíc být • · ’ · ·· ···· ···· ···· ·· ··· ·· ··· dodávány za použiti systému se zpožděným uvolňováním, jako jsou semipermeabilní matrice tuhých hydrofobních polymerů obsahující terapeutickou látku. Byly určeny různé materiály se zpožděným uvolňováním a jsou odborníkovi v oboru dobře známy. Kapsle se zpožděným uvolňováním mohou v závislosti na jejich chemické povaze uvolňovat sloučeniny po několik týdnů až po více než 100 dnů. V závislosti na chemické povaze a biologické stabilitě terapeutické látky se mohou využít další strategie stabilizace proteinu.

Farmaceutické přípravky mohou také obsahovat vhodné tuhé nebo gelové nosiče nebo excipienty. Příklady takových nosičů nebo excipientů zahrnují uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, jako jsou polyethylenglykoly, výčet tím však není omezen.

Mnohé ze sloučenin podle tohoto vynálezu mohou být poskytnuty jako soli s farmaceuticky kompatibilními protiionty. Farmaceuticky přijatelné soli se mohou vytvořit s mnohými kyselinami včetně kyseliny chlorovodíkové, kyseliny sírové, kyseliny octové, kyseliny mléčné, kyseliny vinné, kyseliny jablečné, kyseliny jantarové atd., výčet tím však není omezen. Soli mají větší sklon k rozpustnosti ve vodných nebo jiných protonických rozpouštědlech než mají formy odpovídajících volných bází.

Účinné dávkování

Farmaceutické přípravky vhodné pro použití podle předloženého vynálezu zahrnují přípravky, kde je účinná látka obsažena v účinném množství k dosažení zamýšleného účelu. Specifičtěji znamená terapeuticky účinné množstvu • ·

-58• ··· ···· • · ····· ·· · • ···· ···· · • · · · · · · · ·♦····· ·· ··« ·· ··· množství účinné k zabránění rozvoje nebo ke zmírnění existujících symptomů subjektu, který je léčen. Stanovení účinných množství dobře spadá do schopností odborníka v oboru.

Pro jakoukoli sloučeninu použitou při způsobu podle tohoto vynálezu může být účinná dávka stanovena zpočátku na buněčných stanoveních. Například dávka může být formulována na buněčných a zvířecích modelech k dosažení rozmezí cirkulační koncentrace, která zahrnuje IC50 jak je stanovena v buněčných stanoveních (tj. koncentrace testované sloučeniny, která dosahuje polovinu maximální inhibice dané aktivity proteinkinasy). V některých případech je příhodné stanovit IC50 za přítomnosti od 3 do 5 % sérového albuminu, jelikož takové stanovení přibližuje vazebný účinek plasmatického proteinu pro sloučeninu. Takovou informaci lze použít k přesnějšímu stanovení užitečných dávek pro lidi. Nejvýhodnější sloučeniny pro systémové podání navíc účinně inhibují proteinkinasový přenos signálu v intaktních buňkách při hladinách, kterých lze bezpečně dosáhnout v plasmě.

Terapeuticky účinná dávka odkazuje na množství sloučeniny, které vede ke zlepšení symptomů pacienta. Toxicita a terapeutická účinnost takových sloučenin se může stanovit standardními farmaceutickými postupy na buněčných kulturách a experimentálních zvířatech, např. pro stanovení maximální tolerované dávky (MTD) a ED50 (účinné dávky k dosažení 50 % maximální odpovědi). Poměr dávek mezi toxickými a terapeutickými účinky je terapeutickým indexem a může se vyjádřit jako poměr mezi MTD a ED50, Sloučeniny, které vykazují vysoké terapeutické indexy jsou výhodné. Data získaná z těchto stanovení na buněčných kulturách a studiích na • · ·· ·· ···· ·· · • · · · ······· • * ······· · . 59 - ......· · ·· ^-⁷ · · ·· ···· r······· · · ··· ····· zvířatech mohou být využita při formulaci rozmezí dávek pro použití u lidí. Dávka takových sloučenin leží výhodně v rozmezí koncentrací v oběhu, které zahrnují ED₅₀ s nízkou nebo žádnou toxicitou. Dávka se může pohybovat v tomto rozmezí v závislosti na použité dávkové formě a použité cestě podání. Přesný přípravek, cesta podání a dávka mohou být zvoleny jednotlivým lékařem s ohledem na stav pacienta, (viz např. Fingl a kol., v „The Pharmacological Basis of Therapeutics, kapitola 1, str. 1 (1975)). Při léčbě krizových stavů se k dosažení rychlé odpovědi může vyžadovat podání akutního bolusu nebo infuse blížící se MTD.

Dávkové množství a interval mohou být upraveny individuálně k poskytnutí plasmatických hladin účinné sloučeniny, které jsou dostatečné k udržování účinků modulujících kinasu nebo minimální účinné koncentrace (MEC). MEC se bude pro každou sloučeninu lišit, ale může se určit z údajů in vitro, např. koncentrace nezbytné k dosažení 50 až 90% inhibice proteinkinasy za použití zde popsaných stanovení. Dávky nezbytné k dosažení MEC budou záviset na jednotlivých charakterisitikách a cestě podání. Ke stanovení plasmatických koncentrací se však může použít HPLC.

Dávkové intervaly se rovněž mohou stanovit za použití hodnoty MEC. Sloučeniny se musí podávat za použití režimu, který udržuje plasmatické hladiny nad MEC po 10 až 90 % času, výhodně po 30 až 90 % času a nejvýhodněji po 50 až 90 % času, až se dosáhne požadovaného zlepšení symptomů. V případech lokálního podání nebo selektivního příjmu nemusí být lokální koncentrace léčiva vztažena k plasmatické koncentraci.

-60•· · · · · ···· ·· · ···· ··· ···· • · ····· · · · • ···· ···· · • · ·· ···· ···· ···· ·· ··· ·· _ltl

Množství podaného přípravku bude samozřejmě závislé na léčeném subjektu, hmotnosti subjektu, závažnosti postižení, způsobu podání a úsudku předepisujícího lékaře.

Balení

Přípravky mohou pokud je to žádoucí být předloženy v balení nebo dispenzační pomůcce, která obsahuje jednu nebo více dávkových forem obsahujících účinnou složku. Balení může například obsahovat kovovou nebo plastovou folii, jako je blistr. Balení nebo dispenzační pomůcka mohou být doprovozeny instrukcí pro podání. Rovněž mohou být připraveny přípravky obsahující sloučeninu podle tohoto vynálezu formulovanou v kompatibilním farmaceutickém nosiči, umístěnou v příhodné nádobě a označenou k léčbě indikovaného stavu.

V některých přípravcích může být prospěšné použít sloučeniny podle předloženého vynálezu ve formě částic velmi malého rozměru, jak se například obdrží kapalinovým energetickým mletím.

Použití sloučenin podle předloženého vynálezu při výrobě farmaceutických přípravků je ilustrováno následujícím popisem. V tomto popise pojem „účinná sloučenina označuje jakoukoli sloučeninu podle tohoto vynálezu, ale obzvláště jakoukoli sloučeninu, která je konečným produktem jednoho z předcházejících příkladů.

a) Kapsle

Při přípravě kapslí se 10 dílů hmotnostních

-61 účinné sloučeniny a 240 dílů hmotnostních laktózy deagreguje a smísí. Směs se plní do tvrdých želatinových kapslí, přičemž každá kapsle obsahuje dávkovou jednotku nebo díl dávkové jednotky účinné sloučeniny.

b) Tablety

Tablety se mohou připravit z následujících

složek.
Díly hmotnostní
Účinná sloučenina	10
Laktóza	190
Kukuřičný škrob	22
Polyvinypyrrolidon	10
Stearat hořečnatý	3

Účinná sloučenina, laktóza a část škrobu se deagreguje, smísí a výsledná směs se granuluje s roztokem polyvinylpyrrolidonu v ethanolu. Suchý granulát se smísí se stearatem hořečnatým a zbytkem škrobu. Směs se poté slisuje v tabletovacím stroji k získání tablet, z nichž každá obsahuje dávkovou jednotku nebo část dávkové jednotky účinné sloučeniny.

c) Entericky potažené tablety

Tablety se připraví způsobem popsaným v příkladu (b) uvedeném výše. Tablety mohou být entericky potaženy obvyklým způsobem za použití roztoku 20 % acetat-ftalatu celulózy a 3 % diethylftalatu ve směsi ethanol:dichlormethan (1:1).

• · · « • · · ·

d) Čípky

Při přípravě čípků se 100 dílů hmotnostních účinné sloučeniny včlení do 1300 dílů hmotnostních triglyceridového čípkového základu a směs se vytvaruje do čípků, přičemž každý obsahuje terapeuticky účinné množství účinné složky.

V přípravcích podle předloženého vynálezu může být účinná sloučenina, pokud je to žádoucí, spojena s jinými kompatibilními farmaklogicky účinnými složkami. Například sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou podávat v kombinaci s jedím nebo více farmaceutickými činidly, která inhibují nebo zabraňují tvorbě VEGF nebo angiopoietinů, oslabují intracelulární odpovědi na VEGF nebo angiopoietiny, blokují intracelulární transdukci signálu, inhibují nebo zabraňují tvorbě edému nebo neovaskularizace. Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou podávat před, po nebo zároveň s dalším farmaceutickým činidlem, podle toho, který průběh podání je příhodný. Další farmaceutická činidla zahrnují protizánětlivé nebo protiedémové steroidy, nesteroidní protizánětlivá léčiva, inhibitory ras, činidla proti TNF, činidla proti IL-1, antihistaminika, antagonisty PAF, inhibitory COX-1, inhibitory COX-2, inhibitory syntasy oxidu dusnatého, inhibitory Akt/PTB, inhibitory IGF-1R, inhibitory PKC a inhibitory kinasy PI3, výčet tím však není omezen. Sloučeniny podle tohoto vynálezu a další farmaceutická činidla působí buď aditivně nebo synergicky. Podání takové kombinace látek, které inhibují angiogenesi, vaskulární hyperpermeabilitu a/nebo inhibují tvorbu edému tedy mohou poskytnout větší úlevu od škodlivých účinků hyperproliferativní poruchy, angiogenese, vaskuární hyperpermeability nebo edému, než podání každé z látek ··· ·· ··· ·· ···· ··· ···· ·· · · • ···♦ ···· · • · · ····· · · • · · · ··· ··· * · · ···· « · «« ··

-63 samotné. Při léčbě maligních poruch se očekávají kombinace s antiproliferativními nebo cytotoxickými chemoterapiemi, hypertermií, hyperoxií nebo ozařováním.

Předložený vynález také zahrnuje použití sloučeniny obecného vzorce I jako léčiva.

Další aspekt předloženého vynálezu poskytuje použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli pro výrobu léčiva pro léčbu vaskulární hyperpermeability, poruch závislých na angiogenesi, proliferativních chorob a/nebo poruch imunitního systému savců, obzvláště lidí.

Předložený vynález také poskytuje způsob léčby vaskulární hyperpermeability, nepříhodné neovaskularizace, proliferativních chorob a/nebo poruch imunitního systému, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny obecného vzorce I savci, obzvláště člověku, který to potřebuje.

In vitro potence sloučenin inhibujících tyto proteinkinasy se může stanovit postupy popsanými dále.

Potence sloučenin se může stanovit množstvím inhibice fosforylace exogenního substrátu (např. syntetického peptidu) (Z. Songyang a kol., Nátuře, 373, 536 - 539) testovanou sloučeninou ve vztahu ke kontrole.

Tvorba tyrosinkinasy KDR za použití systému Baculoviru

Kódovací sekvence lidské KDR intracelulární domény (aa789-1354) se vytvoří pomocí PCR za použití molekul cDNA isolovaných z buněk HUVEC. Stejně tak se na N• · · · · · • ··· · ··· • · ····· · · • · · · · · ··· ·· ···· ·· · ·

-64konec tohoto proteinu zavede poly-His6 sekvence. Tento fragment se klonuje do transfekčního vektoru pVL1393 na místě Xba 1 a Not 1, Rekombinantní baculovirus (BV) se vytvoří prostřednictvím kotransfekce za použití činidla BaculoGold Transfection (PharMingen). Rekombinantní BV se skvrnově vyčistí a ověří pomocí Western analýzy.

K vytvoření proteinu se pěstují buňky SF-9 v mediu SF-900II při 2 x 106/ml a infikují se 0,5 skvrnu tvořícími jednotkami na buňku (MOI). Buňky se shromáždí 48 hodin po infekci.

Čištění KDR

Buňky SF-9 exprimující (His)₆KDR(aa789-1354) se lysují přidáním 50 ml lysačního pufru Triton X-100 (20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 % Triton X-100, lmM PMSF, 10 μς/πιΐ aprotininu, 1 μ9/ιη1 leupeptinu) na buněčnou peletu z 1 litru buněčné kultury. Lysát se odstřeďuje při rychlosti otáček 19 000 za minutu v odstředivce Sorval SS-34 30 minut při teplotě 4 °C. Buněčný lysát se aplikuje na 5 ml NiCl₂ chelatačního sefarosového sloupce, vyváží se 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl. KDR se eluuje za použití stejného pufru obsahujícího 0,25 M imidazolu.

Sloupcové frakce se analyzují za použití stanovení SDS-PAGE a ELISA (dále), která měří aktivitu kinasy. vyčištěná KDR se vymění do pufru ze 25 mM HEPES, pH 7,5, 25 mM NaCl, 5 mM DTT a skladuje se při teplotě -80 °C.

Tvorba a čištění lidské kinasy Tie-2

Kódující sekvence intracelulární domény (aa775-l 124) lidské Tie-2 se generuje prostřednictvím PCR za použití molekul cDNA isolovaných z lidské placenty jako

• · · 4 • · · ·

-65templatu. Sekvence poly-His₆ se zavede na N-konec a tento konstrukt se klonuje do transfekčniho vektoru pVL 1939 na místě Xba 1 a Not 1. Rekombinantni BV se generuje prostřednictvím kotransfekce za použití činidla BaculoGold Transfection (PharMingen). Rekombinantni BV se skvrnově vyčistí a ověří pomocí Western analýzy. K vytvoření proteinu se pěstují hmyzí buňky SF-9 v mediu SF-900-II při 2 x 106/ml a infikují se při MOI 0,5. Vyčištění kinasy His označené smyčkou použité při screeningu je analogické vyčištění popsanému pro KDR.

Tvorba a čištění lidské tyrosinkinasy Flt-1

Použije se baculovirální expresní vektor pVL1393 (Phar Mingen, Los Angeles, CA). Nukleotidová sekvence kódující poly-His6 se umístí 5' do nukleotidové oblasti kódující celou intracelulární kinasovou doménu lidské Flt-1 (aminokyseliny 786-1338). Nukleotidová sekvence kódující kinasovou doménu se generuje prostřednictvím PCR za použití knihoven cDNA isolovaných z buněk HUVEC. Histidinové zbytky umožnily afinitní čištění proteinu způsobem analogickým způsobu pro KDR a ZAP70. Hmyzí buňky SF-9 se infikují při 0,5 násobku a seberou se 48 hodin po infekci.

Zdroj tyrosinkinasy EGFR

EGFR se koupí od firmy Sigma (Kat. č. E-3641; 500 jednotek/50 μΐ) a ligand EGF se získá od firmy Oncogene Research Products/Calbiochem (Kat. č. PFO11-100).

Exprese ZAP7O

Použitým baculovirálním expresním vektorem je • · · · ♦ · • · · ·

-66pVL1393, (Pharmingen, Los Angeles, Ca.) Nukleotidová sekvence kódující aminokyseliny M(H)6 LVPRgS se umístí 5' do oblasti kódující celou ZAP70 (aminokyseliny 1-619). Nukleotidová sekvence kódující region kódující ZAP70 se generuje prostřednictvím PCR za použití knihoven cDNA isolovaných z Jurkat nesmrtelných T-buněk. Histidinové zbytky umožní afinitní čištění proteinu (viz výše). Můstek LVPRgS vytváří rozpoznávací sekvenci pro proteolytické štěpení thrombinem, což umožňuje odstranění afinitní smyčky z enzymu. Hmyzí buňky SF-9 se infikují násobkem infekce 0,5 a shromáždí 48 hodin po infekci.

Extrakce a čištění ZAP70

Buňky SF-9 se lysují v pufru sestávajícím z mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10 % glycerolu, 1 % přípravku Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 pg/ml leupeptinu, 10 μρ/πιΐ aprotininu a 1 mM orthovanadatu sodného. Rozpustný lysat se aplikuje na chelatační sefarosový HiTrap sloupec (Pharmacia) vyvážený v 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl. Fušovaný protein se eluuje pomocí 250 mM imidazolu. Enzym se skladuje v pufru obsahujícím 50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl a 5 mM DTT.

Zdroj proteinkinasy

Lek, Fyn, Src, Blk, Csk a Lyn a jejich zkrácené formy se mohou získat komerčně (např. od firmy Upstate Biotechnology lne. (Saranac Lake, N.Y) a Santa Cruz Biotechnology lne. (Santa Cruz, Ca.)) nebo vyčistit ze známých přírodních nebo rekombinantních zdrojů za použití obvyklých postupů.

• · • · · · ·· · ·

-67Na enzym napojené imunosorbentni stanoveni (ELISA) proteinových tyrosinkinas

Na enzym napojené imunosorbentni stanoveni (ELISA) se použijí k detekci a stanovení přítomnosti tyrosinkinasové aktivity. ELISA se provádí podle známých protokolů, které jsou popsány například v Voliér, a kol., Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, v: Manual of Clinical Immunology, 2. vydání, redigoval Rose a Friedman, str. 359 - 371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C. (1980).

Popsaný protokol se upraví pro stanovení aktivity s ohledem na specifickou PTK. Například výhodné protokoly pro provádění experimentů ELISA jsou poskytnuty dále. Upravení těchto protokolů pro stanovení aktivity sloučenin pro jiné členy rodiny receptorové PTK, stejně jako nereceptorových tyrosinkinas, dobře spadají do rozsahu schopností odpborníka v oboru. Pro účely stanovení inhibitorové selektivity se použije universální substrát proteinové tyrosinkinasy (např. náhodný kopolymer poly(Glu₄ Tyr), 20 000 až 50 000 m.h.) spolu s ATP (typicky 5 μΜ) v koncentracích přibližně dvakrát vyšších, než je zjevná Km ve stanovení.

Ke stanovení inhibičního účinku sloučenin podle tohoto vynálezu na tyrosinkinasovou aktivitu KDR, Flt-1, Tie-2, EGFR, FGFR, PDGFR, IGF-1R, c-Met, Lek, Blk, Csk, Src, Lyn, Fyn a ZAP70 se použije následující postup.

Pufry a roztoky

PGTPoly (Glu,Tyr) 4:1

Prášek se skladuje při teplotě -20 °C. Prášek se

-68rozpusti ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) k vytvořeni roztoku o koncentraci 50 mg/ml. lml alikvoty se skladuji při teplotě -20 °C. Při přípravě plátů se naředí na koncentraci 250 μρ/ιηΐ v Gibco PBS.

Reakční pufr

100 mM Hepes, 20 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 5 mM DTT,

0,02 % BSA, 200 μΜ NaV0₄, pH 7,10.

ATP

Alikvoty 100 mM se skladují při teplotě -20 °C.

Naředí se na koncentraci 20 μΜ ve vodě.

Promývací pufr

PBS s 0,1 % Tween 20.

Pufr k ředění protilátek

0,1% hovězí sérový albumin (BSA) v PBS.

Substrát TBM

Substrát TBM se smísí s roztoky peroxidu 9:1 těsně před použitím nebo se použije K-Blue Substráte od firmy Neogen.

Zastavovací roztok • · · ·

-691M kyselina fosforečná.

Postup

1. Příprava desky

Zásobní roztok PGT se naředí (50 mg/ml, zmrazený) v PBS na koncentraci 250 μς^Ι. Přidá se 125 μΐ na jamku Corningových modifikovaných vysoce afinitních ELISA desek s plochým dnem (Corning č. 25805-96). Do slepých jamek se přidá 125 μΐ PBS. Potáhne se páskou a inkubuje se přes noc při teplotě 37 °C. 1-krát se promyje 250 μΐ promývacího pufru a asi 2 hodiny se suší v suchém inkubátoru při teplotě 37 °C. Potažené desky se skladují v uzavřeném sáčku do použití při teplotě 4 °C.

2. Tyrosinkinasová reakce

- Připraví se roztoky inhibitorů ve 4 koncentracích ve 20% DMSO ve vodě.

- Připraví se reakční pufr.

- Připraví se roztok enzymu tak, aby požadované jednotky byly v objemu 50 μΐ, např. pro KDR se připraví na 1 ng/μΐ pro celkových 50 ng na jamku v reakcích. Skladuje se na ledu.

- Připraví se 4 koncentrace roztoku ATP na 20 μΜ ze zásobního roztoku o koncentraci 100 mM ve vodě. Skladuje se na ledu.

- Přidá se 50 μΐ roztoku enzymu na jamku (typicky 5 až 50 ng enzymu na jamku v závislosti na specifické aktivitě kinasy).

• T · • « · · ·· · · ·· ···· ·· · • :· : : ::.. : : *:

.· .· · · ; : · : : :

········ ·· ··· ·· ···

- Přidá se 25 μΐ 4 koncentraci ATP pro inhibiční stanovení

- Inkubuje se 10 minut při teplotě místnosti

- Reakce se zastaví přidáním 50 μΐ 0,05N HC1 na jamku

- Deska se promyje **Konečné koncetrace pro reakci: 5 μΜ ATP, 5 % DMSO.

3. Vazba protilátek

- Dvoukrokovým ředěním (100-krát, poté 200-krát) se naředí mg/ml alikvot PY2O-HRP (Pierce) protilátky (protilátka proti fosfotyrosinu) na koncentraci 50 ng/ml ve 0,1 % BSA v PBS.

- Přidá se 100 μΐ protilátky na jamku. Inkubuje se 1 hodinu při teplotě místnosti. Inkubuje se 1 hodinu při teplotě 4 °C.

- Deska se 4-krát promyje.

4. Barevná reakce

- Připraví se substrát TMB a přidá se 100 μΐ na jamku

- Monitoruje se optická hustota při 650 nm až se dosáhne

0, 6

- Zastaví se pomocí 1M kyseliny fosforečné. Odečítač plátu se protřepe.

- Bezprostředně se odečte optická hustota při 450nm.

Optimální inkubační časy a podmínky enzymové reakce se mírně liší podle enzymových přípravků a jsou pro každý běh stanoveny empiricky.

Pro Lek se jako reakční pufr použije 100 mM • · · · • ·

-71 - ... _; • I·· ···· ·· ··· ·· ···

MOPSO, pH 6,5, 4 mM MnCl₂, 20 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,2 % BSA, 200 mM NaVCh za analogických podmínek stanovení.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou mít terapeutické využití při léčbě chorob zahrnujících jak identifikované, včetně těch, které zde nejsou zmíněny, tak dosud neidentifikované proteinové tyrosinkinasy, které jsou inhibovány sloučeninami obecného vzorce I. Všechny sloučeniny zde uvedené v příkladech významně inhibují buď FGFR, PDGFR, KDR, Tie-2, Lek, Fyn, Blk, Lyn nebo Src při koncentracích 50 mikromol nebo nižších. Některé sloučeniny podle tohoto vynálezu rovněž významně inhibují tyrosinnebo serin-/threoninkinasy, jako je cdc2 (cdkl) při koncentracích 50 mikromol nebo nižších.

Zdroj Cdc2

Lidský rekombinantní enzym a pufr pro stanovení se mohou získat komerčně (New England Biolabs, Beverly, MA. USA) nebo vyčistit ze známých přírodních nebo rekombinantních zdrojů za použití obvyklých způsobů.

Stanovení Cdc2

Použije se protokol poskytnutý se zakoupenými činidly s menšími obměnami. Stručně - reakce se provádí v pufru sestávajícím z 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 2mM DTT, 0,01% Brij, 5 % DMSO a 10 mM MgCl₂ (komerční pufr) doplněného čerstvými 300 μΜ ATP (0,1147.10⁷ Bq/ml) a 30 pg/ml histonu typu IIIss konečných koncentrací. Reakční objem 80 μΐ, obsahující jednotky enzymu, se 20 minut nechá běžet při teplotě 25 °C za přítomnosti nebo nepřítomnosti inhibitoru. Reakce se ukončí přidáním 120 μΐ • · ···· ··· · · • · .··»· ·· . · · · · ···· • · · · · ·..· ········ ·· ··· · oddělí od neinkorporofosfocelulózový papír,

-7210% kyseliny octové. Substrát se váných značek nanesením směsi na následují 3 promytí po 5 minutách, každé 75mM kyselinou fosforečnou. Impulsy se měří čítačem beta záření za přítomnosti kapalného scintilantu.

Jisté sloučeniny podle tohoto vynálezu významně inhibují cdc2 při koncentracích pod 50 μΜ.

Zdroj kinasy PKC

Katalytická podjednotka PKC se může získat komerčně (Calbiochem).

Stanovení kinasy PKC

Radioaktivní stanovení kinasy se použije podle publikovaného postupu (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y., Biochemical and Biophysical Research Communication 3, 166, 1220 - 1227 (1990)). Stručně řečeno - všechny reakce se provedou v kinasovém pufru sestávajícím z 50 mM TrisHCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 100 μΜ ATP, 8 μΜ peptidu, 5 % DMSO a ³³P ATP (29,6.10¹⁰/mM) . Sloučenina a enzym se smísí v reakční nádobě a reakce se zahájí přidáním směsi ATP a substrátu. Po ukončení reakce přidáním 10 μΐ ukončovacího pufru (5 mM ATP v 75 mM kyseliny fosforečné) se část směsi nanese na fosfocelulózové filtry. Nanesené vzorky se 3-krát promývají v 75mM kyselině fosforečné při teplotě místnosti 5 až 15 minut. Inkorporace radiačních značek se kvantifikuje čítáním scintilace kapalin.

Zdroj enzymu Erk2 • ·

-73• · ·

Rekombinantní myši enzym a pufr pro stanoveni se mohou získat komerčně (New England Biolabs, Beverly MA. USA) nebo vyčistit ze známých přírodních nebo rekombinantních zdrojů za použití obvyklých způsobů.

Stanovení enzymu Erk2

Stručně řečeno - reakce se provádí v pufru sestávajícím z 50 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0,01 % Brij, 5 % DMSO a 10 mM MgCl₂ (komerční pufr) doplněným čerstvými 100 μΜ ATP (1,147.10⁶ Bq/ml) a 30 μΜ myelinového základního proteinu za podmínek doporučených dodavatelem. Reakční objemy a způsob stanovení inkorporované radioaktivity jsou stejné, jak je popsáno pro stanovení PKC (viz výše).

In vitro modely aktivace T-buněk

Při aktivaci mitogenem nebo antigenem se T-buňky indukují k sekreci IL-2, což je růstový faktor, který podporuje jejich následnou proliferativní fázi. Lze tedy měřit jak tvorbu IL-2 primárními T-buňkami nebo příslušnými liniemi T-buněk, tak proliferaci primárních T-buněk nebo příslušných linií T-buněk jako zástupce aktivace T-buněk. Obě tato stanovení jsou v literatuře dobře popsána a jejich parametry jsou dobře zdokumentovány (v Current Protocols in Immunology, díl 2, 7.10.1 - 7.11.2).

Stručně řečeno - T-buňky mohou být aktivovány současnou kultivací s alogenními stimulátorovými buňkami, což je proces označovaný jako jednosměrná smíšená lymfocytární reakce. Responderové a stimulátorové • · • · ···· · · · .-- - ··· ···· e ♦····· · · ·

-74- · ···· ····· ·· ······ ········ · · · · · · · ··· mononukleární buňky z periferní krve se vyčistí pomocí gradientu Ficoll-Hypaque (Pharmacia) podle pokynů výrobce. Stimulátorové buňky se mitoticky inaktivují ošetřením mitomycinem C (Sigma) nebo gama zářením. Responderové a stimulátorové buňky se současně kultivují v poměru 2:1 za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované sloučeniny. Obvykle se 10⁵ responderových buněk smísí s 50 x 10³ stimulátorových buněk a umístí se (200 μΐ objem) na mikrotitrační desku s jamkami se dnem ve tvaru písmene U (Costar Scientific). Buňky se kultivují v RPMI 1640 doplněném buď teplem inaktivovaným fetálním hovězím sérem (Hyclone Laboratories) nebo slitým lidským AB sérem od mužských dárců, 50 x 10’⁶ M 2-merkaptoethanolu a 0,5 % DMSO. Kultury se jeden den před sběrem vybaví 18,5.10^{3 3}H thymidinu (Amersham) (obvykle den 3). Kultury se seberou (sběrač Betaplate, Wallac) a příjem isotopu se stanoví kapalinovou scintilací (Betaplate, Wallac).

Stejný systém kultur se může použít pro stanovení aktivace T-buněk měřením tvorby IL-2. 18 až 24 hodin po počátku kultivace se supernatanty odstraní a koncentrace IL-2 se změří pomocí ELISA (systémy R a D) podle pokynů výrobce.

In-vivo modely aktivace T-buněk

In vivo účinnost sloučenin může být testována na zvířecích modelech o nichž je známo, že přímo měří aktivaci T-buněk nebo u nichž bylo prokázáno, že T-buňky jsou u nich efektory. T-buňky mohou být aktivovány in vivo vazbou konstantního podílu receptoru T-buněk s monoklonální protilátkou proti CD3 (Ab). V tomto modelu se myším BALB/c podá 10 pg protilátky proti CD3 Ab intraperitoneálně 2 • ·

-75• · ·· • · · · • · • · • · • ·· • ·· · · • ·· • ·· • · · · · 'hodiny před odběrem testované léčivo se hodinu před podáním • · · • · · · • · · • · · · • · · • · · · · krve. Zvířata, kterým má být podáno premedikují jednou dávkou sloučeniny 1 protilátky proti CD3 Ab. Sérové hladiny prozánětlivých cytokinů interferon-γ (IFN-y)a faktoru nekrózy tumoru-a (TNF-a), což jsou indikátory aktivace T-buněk, se změří pomocí ELISA. Podobný model využívá in vivo startování T-buněk pomocí specifického antigenu, jako je hemocyanin kužalnatky Diodora aspera (keyhole limpet) následované sekundárním in vitro podrážděním buněk lymfatických uzlin stejným antigenem. Stejně jako v předchozím případě se měření tvorby cytokinů použije ke stanovení stavu aktivace kultivovaných buněk. Stručně řečeno - myši C57BL/6 se v den 0 subkutánně imunizují pomocí 100 pg KLH emulgovaného v úplném Freundově adjuvantu (CFA). Zvířata se premedikují sloučeninou jeden den před imunizací a následně v den 1, 2 a 3 po imunizaci. Uzliny se seberou v den 4 a jejich buňky se kultivují v množství 6 x 10⁶ na ml v mediu pro tkáňové kultury (RPMI 1640 doplněný teplem inaktivovaným fetálním hovězím sérem (Hyclone Laboratories) , 5 x 10^-5 M 2-merkaptoethanolu a 0,5 % DMSO) jak 24, tak 48 hodin. U supernatantů kultur se poté stanoví hladiny autokrinních růstových faktorů T-buněk interleukinu-2 (IL-2) a/nebo IFN-γ pomocí ELISA.

Nejúspěšnější sloučeniny mohou také být testovány na zvířecích modelech lidské choroby. Ty jsou představovány experimentální autoimunní encefalomyelitidou (EAE) a kolagenenem navozenou arthritidou (CIA). Modely EAE, které napodobují aspekty .lidské roztoroušené sklerózy jsou popsány jak u krys, tak u myší (přehled ve FASEB J., 5, 2560 - 2566, (1991); myší model: Lab. Invest., 4(3), 278, (1981); hlodavčí model: J. Immunol., 146 (4), 1163 - 1168, (1991)). Stručně řečeno - myši nebo krysy se imunizují

-76• · ····· ··· , ···· ····· • · ·· ·· · ········ »· ··· ··*·· emulsi myelinového bázického proteinu (MBP) nebo jeho neurogennimi peptidovými deriváty a CFA. Akutní chorobu lze indukovat přidáním bakteriálních toxinů, jako je bordetella pertus-sis. Relapsujicí/remitující choroba se indukuje adoptivním přenosem T-buněk ze zvířat imunizovaných MBP/peptidem.

CIA se může indukovat u myší DBA/1 imunizací kolagenem typu II (J. Immunol., 142 (7) , 2237 - 2243). U myší se vyvinou známky arthritidy již za 10 dní po antigenním podnětu a mohou se udržet až 90 dní po imunizaci. Jak u modelu EAE, tak u modelu CIA se sloučenina může podat buď profylakticky nebo v čase nástupu choroby. Účinná léčiva musí snížit závažnost a/nebo incidenci.

Jisté sloučeniny podle tohoto vynálezu, které inhibují jednu nebo více angiogenních receptorových proteinkinas a/nebo proteinkinasu, jako je lek účastná zprostředkování zánětlivých odpovědí, mohou v těchto modelech snížit závažnost a incidenci arthritidy.

Sloučeniny mohou také být testovány na modelech myších štěpů, buď kožních (přehled v Ann. Rev. Immunol., 10, 333 - 358 (1992); Transplantation, 57 (12), 1701 - 1706, (1994)) nebo srdečních (Am. J. Anat., 113, 273 (1963)). Stručně řečeno - kožní štěpy o celé tloušťce se transplantují z myší C57BL/6 na myši BALB/c. Štěpy se mohou pro důkaz odmítnutí vyšetřovat denně, počínaje dnem 6. U myšího neonatálního modelu transplantace srdce se neonatálni srdce ektopicky transplantuji z myší C57BL/6 do ušního boltce myší CBA/J. Srdce začnou bít 4 až 7 dní po transplantaci a odmítnutí se může stanovit vizuálně za použití anatomického mikroskopu při hledání ukončení tepu.

• «· 9 · 4 ·

Stanoveni buněčných receptorových proteinkinas

Následující buněčné stanovení se použije ke stanovení úrovně aktivity a účinku různých sloučenin podle předloženého vynálezu na KDR/VEGFR2. Podobná stanovení receptorových proteinkinas využívající podnět specifického ligandu mohou být navržena podle stejného modelu pro jiné tyrosinkinasy za použití postupů, které jsou odborníkovi v oboru dobře známy.

Fosforylace KDR navozená VEGF u lidských endotheliáních buněk pupečníkové vény (HUVEC) měřená metodou Western Blot

1. Buňky HUVEC (shromážděné od různých dárců) se zakoupí u firmy Clonetics (San Digo, CA) a kultivují se podle pokynů výrobce. K tomuto stanovení se použijí pouze časné pasáže (3 až 8). Buňky se kultivují na lOOmm deskách (Falcon pro tkáňové kultury; Becton Dickinson; Plymouth, Anglie) za požití úplného média EBM (Clonetics).

2. Pro vyhodnocení inhibiční aktivity sloučenin se buňky trypsinizují a očkují v koncentraci 0,5 až 1,0 x 10⁵ buněk na jamku do každé jamky 6-jamkových klastrových desek (Costar; Cambridge, MA).

3. 3 až 4 dny po očkování jsou desky 90 až 100% konfluentní. Médium se odstraní ze všech jamek, buňky se promyjí 5 až 10 ml PBS a inkubují se 18 až 24 hodin s 5 ml základního média EBM bez přidáni jakýchkoli doplňků (tj. sérové hladovění).

• 4 * « ·· ···· ·· · » · · · · ♦ · ···· • · ····· ·· · • ···· · 9 · · · • · · · · · · · ········ ·> ··· ·· ' · · ·

4. K buňkám se přidají sériová ředění inhibitorů v 1 ml média EBM (25 μΜ, 5 μΜ nebo 1 μΜ konečné koncentrace) a i inkubuje se 1 hodinu při teplotě 37 °C. Do všech jamek se poté ve 2 ml média EBM přidá lidský rekombinantní VEGFi₆₅ (R & D Systems) v konečné koncentraci 50 ng/ml a inkubuje se při teplotě 37 °C 10 minut. Ke stanovení základní fosforylace a indukce fosforylace VEGF se použijí kontrolní buňky neošetřené nebo ošetřené pouze VEGF.

Všechny jamky se pak promyjí 5 až 10 ml studeného

PBS obsahujícího 1 mM orthovanadatu sodného (Sigma) a buňky se lysují a seškrábou do 200 μΐ pufru RIPA (50 mM TrisHC1, pH 7, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25 % deoxycholatu sodného, 1 mM EDTA) obsahujícího inhibitory proteas (PMSF 1 mM, aprotinin 1 μg/ml, pepstatin 1 μg/ml, leupeptin 1 μρ/ιηΐ, vanadat sodný 1 mM, fluorid sodný 1 mM) a 1 μρ/πιΐ Dnasy (všechny chemikálie jsou od firmy Sigma Chemical Company, St Louis, MO)· Lysat se 30 minut odstřeďuje při frekvenci otáčení 14 000 otáček za minutu k odstranění j ader.

Shodná množství proteinů se poté vysrážejí

Přidáním studeného (-20 °C) ethanolu (2 objemy) alespoň na ' jednu hodinu nebo maximálně přes noc. Pelety se rekonstituují v Laemliho vzorkovém pufru obsahujícím 5 % 2-merkaptoethanolu (BioRad; Hercules, CA) a 5 minut se vaří. Proteiny se rozliší elektroforézou na polyakrylamidovém gelu (6%, 1,5 mm Novex, San Deigo, CA) a přenesou se na nitrocelulózovou membránu za použití systému Novex. Po blokádě pomocí hovězího sérového albuminu (3%) se proteiny sondují přes noc pomocí polyklonální protilátky proti KDR (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) nebo pomocí monoklonální protilátky proti fosfotyrosinu (4G10, Upstate

-79• · ·· · · ···· ··· «··· ···«··· • · ····· ··· • ···· <···· • · ·· · · ·· ····«··· · · ··· · · ··«

Biotechnology, Lake Placid, NY) při teplotě 4 °C. Po promytí a jednohodinové inkubaci s F(ab)2 konjugovaným s HRP kozího protikráličího nebo kozího protimyšího IgG se svazky vizualizují za použití systému emisní chemiluminescence (ECL) (Amersham Liře Sciences, Arlington Height, IL). Jisté příklady podle předloženého vynálezu významně inhibují buněčnou fosforylaci tyrosinkinasy KDR indukovanou VEGF při koncentracích nižších než 50 μΜ.

In vivo model děložního edému

Toto stanovení měří kapacitu sloučenin inhibovat akutní zvýšení hmotnosti dělohy u myší, které se objevuje během prvních několika hodin po estrogenní stimulaci. O tomto časném nástupu zvýšení hmotnosti dělohy je známo, že je důsledkem edému zpsobeného zvýšenou permeabilitou děložní vaskulatury. Cullinan-Bove a Koss (Endocrinology, 133, 829 - 837(1993)) ukázali úzký časový vztah mezi estrogenem stimulovaným edémem dělohy a zvýšenou expresí mRNA VEGF v děloze. Tyto výsledky byly potvrzeny použitím neutralizujících monoklonálních protilátek proti VEGF, které významně snížilo akutní zvýšení hmotnosti dělohy po estrogenní stimulaci (WO 97/42187). Tento systém tedy může sloužit jako model in vivo inhibice transdukce signálu VEGF a související hyperpermeability a edému.

Materiály

Veškeré hormony se zakoupí u firmy Sigma (St. Louis, MO) nebo Cal Biochem (La Jolla, CA) jako lyofilizované prášky a připraví se podle pokynů výrobce. Složky vehikul (DMSO, Cremaphor EL) se zakpoupí u firmy Sigma (St. Louis, MO).

-80• ««···· ··v • ··<···· • · ··«·· ··· α · · · ···«· • · · · · ·· ····· ·· · · · ·· ·· ·

Myši (Balb/c, 8 až 12 týdnů staré) se zakoupí u firmy Taconic (Germantown, NY) a chovají se v patogenů prostém zvěřinci podle ústavních pokynů Výboru pro péči o zvířata a zacházení s nimi (Animal Care and Use Committee Guidelines).

Postup

Den 1

Myším Balb/c se podá intraperitoneální (i.p.) injekce 12,5 jednotek sérového gonadotropinu březích klisen (PMSG).

Den 3

Myši dostanou 15 jednotek lidského choriového gonadotropinu (hCG) i.p.

Den 4

Myši se náhodně rozdělí do skupin o 5 až 10 jedincích. Testované sloučeniny se podávají i.p., i.v. nebo p.o. cestami v závislosti na rozpustnosti a vehikulu v dávkách v rozmezí od 1 do 100 mg/kg. Kontrolní skupina s vehikulem dostane pouze vehikulum a 2 skupiny se nechají neošetřené.

minut později se experimentálním skupinám, skupinám s vehikulem a skupinám neošetřeným podá .p. injekce 17-estradiolu (500 μρ/kg). Po 2 až 3 hodinách se zvířata usmrtí inhalací CO₂. Po podélné incisi se isoluje děloha a vyjme se odstřižením právě pod krčkem a napojeními • · · · ·· ···· ·· · • c · · ··· ····

-81- _s· : i”*..·. ; :

« · «· · · · · ···· ···· ·· ··· ·· ··· dělohy a vejcovodů. Tuk a pojivové tkáně se pečlivě odstraní tak, aby se před vážením (vlhká hmotnost) nenarušila integrita dělohy. Z děloh se vytlačí kapalina stlačením mezi dvěma archy filtračního papíru pomocí jednolitrové skleněné lahve naplněné vodou. Dělohy se po vytlačení kapaliny zváží (hmotnost po vytlačení kapaliny). Rozdíl mezi vlhkou hmotností a hmotností po vytlačení kapaliny se pojme jako obsah kapaliny v děloze. Střední obsah kapaliny ošetřených skupin se srovná s neošetřenými skupinami nebo se skupinami ošetřenými vehikulem. Významnost se stanoví pomocí Studentova testu. Nestimulovaná kontrolní skupina se použije k monitorování estradiolové odpovědi.

Výsledky ukazují, že jisté sloučeniny podle předloženého vynálezu inhibují tvorbu edému pokud se podají systémově různými cestami.

Jisté sloučeniny podle tohoto vynálezu, které jsou inhibitory angiogenních receptorových tyrosinkinas mohou také být ukázány jako účinné v matrigelovém implantačním modelu neovaskularizace. Matrigelový model neovaskularizace zahrnuje tvorbu nových cév uvnitř čiré „mramorové matrix implantované subkutánně, což je navozeno přítomností tumorových buněk vytvářejících proangiogenní faktor (viz například Passaniti, A., a kol., Lab.

Investig., 67(4), 519 - 528 (1992); Anat. Rec., 249(1), 63 - 73 (1997); Int. J. Cancer, 63 (5), 694 - 701 (1995); Vasc. Biol., 15(11), 1857 - 1856 (1995)). Model výhodně běží 3 až 4 dny a konečné výsledky zahrnují makroscopické visuální/obrázkové odečítání neovaskularizace, stanovení hustoty mikroscopických mikrocév a kvantifikaci hemoglobinu

-82• · ·· ·· ···· ··· • · · ······· • · ····· ··· « ···· · · · ·· • · · · · · ·· ······· · · · ·· · · · · · (Drabkinova metoda) po odstraněni implantátu proti kontrolám ze zvířat inhibitory neošetřených. Model může alternativně využít jako podnětu bFGF nebo HGF.

Jisté sloučeniny podle tohoto vynálezu, které inhibují jednu nebo více onkogenních, protoonkogenních nebo na proliferaci závislých proteinkinas nebo angiogenních receptorových proteinkinas také inhibují růst primárních myších, krysích nebo lidských cizorodých štěpů u myší nebo inhibují metastazování u myších modelů.

Nyní budou popsány způsoby přípravy sloučenin obecného vzorce I. Tyto způsoby tvoří další aspekt předloženého vynálezu. Způsoby se výhodně provádějí za atmosférického tlaku.

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou připravit kondenzací sloučeniny obecného vzorce II ve kterém

(Π)

Ri, R-2, R3, L a kruh A mají význam definovaný výše, s formamidem při teplotě v rozmezí od 50 do 250 °C případně za přítomnosti katalyzátoru, například 4-dimethylaminopyridinu.

-83 ·· · · ·· ···* ·· • · · · · · · ··· • · ····» ·· • · · · ···· ········ ·· ··· · · ···

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou připravit reakci sloučeniny obecného vzorce III

(ΠΙ) ve kterém

Rx je brom nebo jodbrom nebo jod, s jednou z následujících sloučenin: R3B(OH)₂, R3SnCH3 nebo sloučeninou představovanou obecným vzorce III

R3—	—(H2C)j----L---(	~ A	)	r3—	—(H2C)j---L—4	- A
			^B(OH)2				^SnCH3

nebo

ve kterém

R₃ má význam definovaný výše, za přítomnosti katalyzátoru, například palladiových (0) sloučenin, např. Pd(PPh₃)₄.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde Ri představuje alkylovou skupinu nebo aralkylovou skupinu, se mohou připravit alkylací sloučeniny obecného vzorce IV

- 84ve kterém

mají výše definovaný význam,

R.2 a R3 se sloučeninou obecného vzorce RjX', kde R_x představuje alkylovou skupinu nebo aralyklovou skupinu a X' představuje odstupující skupinu, například halogen, mesyloxyskupinu nebo tosyloxyskupinu.

Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém R_x představuje případně susbtituovaný cyklický ether, jako je tetrahydrofuryl nebo tetrahydropyranyl, se mohou připravit alkylací sloučeniny obecného vzorce IV

ve kterém

R₂ a R₃ mají význam definovaný výše, se sloučeninou obecného vzorce RjX', kde X' má význam definovaný výše a R_x je případně substituovaný cyklický ether.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde R_x představuje cyklický ether, jako je tetrahydrofuryl nebo tetrahydropyranyl, případně substituovaný formylem, se mohou při-85• · · · ·· · · · · ·· · ···· · · · ···· • · ····· ·· · • · · · · ···· · • · ·· ···· ········ ·· ··· ·· ··· pravit alkylaci sloučeniny obecného vzorce IV sloučeninou RiX, kde Ri představuje cyklický ether substituovaný formylovou skupinou, která je chráněna, způsobem odborníkovi v oboru známým, například prostřednictvím acetalu (viz např. Tet. Letts., 30 , (4 6), 6259 - 6262 (1989)), následovaným odstraněním chránící skupiny. Sloučeniny, ve kterých Ri představuje cyklický ether, jako je tetrahydrofuryl nebo tetrahydropyranyl, substituovaný (případně substituovanou amino)methylskupinou, se mohou připravit redukční aminací sloučeniny, ve které Ri představuje cyklický ether substituovaný formylem.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde Ri představuje případně substituovaný furyl, thienyl nebo pyrrolyl, se mohou připravit reakcí 4-chlor-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu s příslušnou heteroarylborovou kyselinou za přítomnosti katalyzátoru ze soli mědi, například octanu měďnatého, za přítomnosti rozpouštědla reaktantů, např. halogenovaného rozpouštědla, např. dichlormethanu, za přítomnosti vysoušecího činidla, např. 40nm molekulárních sít, za přítomnosti organické báze, např. triethylaminu nebo pyridinu, při teplotě v rozmezí od 0 do 50 °C, výhodně při teplotě místnosti. (Pokud jde o podmínky viz Tet. Letts., 39, 2942 - 2944 (1998)). Tyto sloučeniny se mohou formulovat způsoby odborníkovi v oboru známými k poskytnutí sloučenin, ve kterých R_x představuje furyl, thienyl nebo pyrrolyl substituovaný formylem. Formylová skupina v těchto sloučeninách může být produktivně aminována způsoby odborníkovi v oboru známými k získání sloučenin, ve kterých Ri představuje furyl, thienyl nebo pyrrolyl substituovaný aminomethylovými skupinami. Alternativně se mohou meziprodukty, ve kterých Ri představuje furyl, thienyl nebo pyrrolyl, vystavit působení Mannichovy reakce k získání

-86• · · . .. .··. .:

.· · · » ··· . i j ······ *··’ meziproduktů, ve kterých R_x představuje furyl, thienyl nebo pyrrolyl substituovaný aminomethylovou skupinou.

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou připravit reakcí sloučeniny obecného vzorce V ve kterém

Ri, R₂, R3, L a kruh A mají význam definovaný výše a

R_y představuje odstupující skupinu, například halogen nebo fenoxyskupinu, s amoniakem nebo amonnou solí, například octanem amonným, při teplotě v rozmezí od 15 do 250 °C, výhodně v tlakové nádobě.

Sloučeniny obecného vzorce

I, ve kterém R₂ představuje chlor, brom nebo jod, se sloučeniny mohou připravit reakcí obecného vzorce VI

ve kterém

Ri, R3, L a kruh A mají význam definovaný výše, • 4

s halogenačním činidlem, například jodačním činidlem, např. N-jodsukcinimidem, nebo bromačním činidlem, např. N-bromsukcinimidem, nebo chloračním činidlem, např. N-chlorsukcinimidem.

Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém -L-R₃ představuje -NHC(O)R₃, se mohou připravit reakcí sloučeniny obecného vzorce VII ve kterém

(vn)

Ri, R₂ a kruh A mají význam definovaný výše a

Y představuje chráněný amin, se sloučeninou obecného vzorce R₃COR_X, ve kterém R_x představuje odstupující skupinu, např. chlor. Alternativně se sloučeniny obecného vzorce VII, ve kterém Y představuje halogen, např. chlor, mohou nechat reagovat se sloučeninou obecného vzoce R₃COR_X a produkt se nechá reagovat s amoniakem k získání sloučeniny obecného vzorce I. K přípravě sloučenin obecného vzorce I, ve kterých -L-R₃ je -NRSO₂R₃ se mohou použít analogické postupy. K přípravě sloučenin obecného vzorce I, ve kterých -L-R₃ je -NRCO2R3 nebo NRCONR'se mohou použít analogické postupy. R a R' mají význam definovaný výše.

-88• · · * · · ···· ·· • · · · ···· • · · ····· • · · · · · ········ ·· ···· ·

Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém -L-R₃ je

-OSO?- se mohou připravit reakcí sloučeniny obecného vzorce

VIII

í Vlili ve kterém

R_lř R₂ a kruh A mají význam definovaný výše, se sloučeninou obecného vzorce R4SO2RX.

Sloučeniny obecného vzorce I se poté mohou připravit z takových meziproduktů podle schématu 2 nebo alternativy pro schéma 2, které jsou popsány dále.

Sloučeniny obecného vzorce II se mohou připravit podle schématu 1, kde IPA představuje 2-propanol.

Schéma 1

1) HjNRj.IPA nebo CH jCN

2) HO/IPA

HCl

NHR,

Α

R₃----------Ι-

-89·· · · ·· ···· · a • · · · · · *·« • · ····· ·· • · ·· ···· ··· ···· ·· ··· ·· ···

1) NaOCH₂CH₃/CH₃CH₂OH

2) NCCH₂CN/NaOCH₂CHj,

CH₃CH₃OH, 50°C

Odborník v oboru zjistí, že sloučeniny obecného vzorce I se mohou převést na jiné sloučeniny obecného vzorce I známými chemickými reakcemi. Například alkoxylová skupina se může štěpit k získání hydroxyskupiny, nitroskupiny se mohou redukovat na aminy, aminy se mohou acetylovat, sulfonylovat nebo fosforylovat a N-acylové sloučeniny se mohou hydrolyzovat na aminy. Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém -L- je S, se mohou způsoby odborníkovi v oboru známými oxidovat k získání sloučenin obecného vzorce I, ve kterém -L- představuje SO nebo SO2.

Sloučeniny obecného vzorce III jsou komerčně dostupné nebo se mohou připravit způsoby odborníkovi v oboru známými.

Sloučeniny obecného vzorce IV, ve kterém R₂ představuje vodík, se mohou připravit podle schématu 2. Aminoskupina se před posledním krokem může chránit a po posledním kroku schématu 2 se chránící skupina může odstranit způsoby odborníkovi v oboru známými. Sloučeniny obecného vzorce IV, ve kterém R₂ je jiný než vodík, se mohou připravit analogickými postupy '(viz J. Med. Chem. , 33, 1984 (1990)) .

Alternativně schématu 2 před aminaci muže (kruh A)-L-R₃ napřed kondenzovat. Alternativně může být před provedením kteréhokoli způsobu přítomen substituent Ri, jak je definován

B(OHh

výše.

Sloučeniny obecného vzorce V se mohou připravit podle schématu

3.

Schéma 3

Sloučeniny, ve kterých není přítomen (kruh A)-L• · ·· ·· ···· ·· · • · · · · · » ····

- 91 - · · ····· ·· · • · · · ···· ········ · · ··· · · ···

-R₃ se mohou připravit podle schématu 4, jak je popsáno v J. Med. Chem., 31, 390 (1988) a v odkazech tam citovaných. Sloučeniny, ve kterých je (kruh A)-L-R₃ jiný než vodík, se mohou připravit analogickými postupy.

Schéma 4

NH₃, CHjOH tlak

Sloučeniny obecného vzorce VII se mohou připravit kondenzací 5-jodované sloučeniny analogickým způsobem ke způsobu popsanému pro přípravu sloučenin obecného vzorce IV.

Odborník v oboru zjistí, že v případech, kde je substituent identický s funkční skupinou nebo podobný funkční skupině, která je modifikována jedním z výše uvedených způsobů, že tyto substituenty budou před podstoupením způsobu vyžadovat ochranu, následovanou odstraněním chránící skupiny po způsobu. Jinak dojde ke konkurenčním vedlejším reakcím. Alternativně se může použít jiný ze způsobů popsaných výše, ve kterém substituenty neinterferuji. Příklady vhodných chránících skupin a způsobů jejich zavedení a odstranění lze nalézt v učebnici • · · « · · · · « · · ···· · » · · · · ·

-92- .· í*”..í : :

• · ·· ···· ··«· «··· ·· ··· «« ···

Protective Groups in Organic Synthesis vydané T.W. Green, John Wiley and Sons, 1981. Například vhodné chránící skupiny pro aminy jsou formyl nebo acetyl.

Následující příklady se připravily za použití obecných způsobů přípravy popsaných výše.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

NI-[4 - (4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-4-kyan-l-benzensulfonamid

a) terč.-Butyl-[N-(4-brom-2-methoxyfenyl)karbamat]

Směs 4-brom-2-methoxyanilinu (34,0 g, 0,17 mol) a di-terc.-butyldikarbonatu (44,5 g, 0,20 mol) v tetrahydrofuranu (350 ml) se při teplotě zpětného toku zahřívá 22 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozpustí v ethylacetatu (350 ml) a promyje se 1N kyselinou citrónovou (200 ml), vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří k získání terc.-butyl-[N-(4-brom-2-methoxyfenyl)karbamatu] jako žlutého oleje (80% čistota,

57, 10	g, 0,15 mol)	: ΤΗ NMR (DMSO-dg, 400MHz) δ 8,01	(s, 1H),
7,63	(d, 1H), 7,17	(d, 1H), 7,07 (dd, 1H) , 3,82 (s,	3H) ,
1, 45	(s, 9H); TLC	(n-heptan/ethylacetat = 2:1) Rf 0,	67,

b) terč.-Butyl-[N- [2-methoxy-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamat]

-93* · · · 4 · · · · ·· ···· «·· · • · ····· · • · · » · C · · ········ ·· ··♦ · · ···

Směs terč.-butyl-(N-(4-brom-2-methoxyfenyl)karbamatu) (80% čistota) (6,25 g, 16,56 mmol), diborpinakolesteru (5,05 g, 19,88 mmol), komplexu [1,1'-bis(difenylfosfino)ferrocen]dichlorpalladia(II) s dichlormethanem (1:1) (0,41 g, 0,50 mmol) a octanem draselným (4,88 g, 49,80 mmol) v N,N-dimethylformamidu (100 ml) se přes noc zahřívá na teplotu 80 °C pod atmosférou dusíku. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a většina rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku. K odparku se přidá dichlormethan (100 ml) a výsledné tuhé látky se odstraní filtrací přes podložku z rozsivkové zeminy. Filtrát se odpaří k získání tmavého oleje, který se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi dichlormethan/n-heptan (1 : 2) s 2,5% triethylaminem jako mobilní fází k získání terč.-butyl-[N-[2-methoxy-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl] karbamatu] jako bílé tuhé látky (65% čistota, 4,25 g, 7,92 mmol): ^XH NMR (DMSO-d_s, 400 MHz) δ 7,93(s, 1H), 7,83 (d, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,16 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), l,30(s, 12H); RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 50% až 100% acetonitril - 0,lM octan amonný během 25 minut, 1 ml/min) R_t 18,28 min.

c) terč.-Butyl-[N-[4-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-

-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamat]

Směs vody (25 ml) a terč.-butyl-[N-[2-methoxy-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamatu] (65% čistota) (4,25 g, 7,92 mmol) se zmrazí a vystaví se působení vakua, následují plnění dusíkem během odmrazování. Přidá se 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-949· ···« • <

• · · t ·

• 4 « « e » · · • < · * ♦ ♦ · 4 · 9 • * · » ···· ···· ··>· · C- 9·* «9 4 4 4

-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (1,83 g, 5,28 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladium(0) (0,37 g, 0,32 mmol), uhličitan sodný (1,40 g, 13,20 mmol) a dimethylether ethylenglykolu (50 ml) a výsledná směs se přes noc zahřívá na teplotu 80 °C pod atmosférou dusíku. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku, který se rozdělí mezi vodu a ethylacetat. Organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se dále dvakrát extrahuje ethylacetatem. Spojené ethylacetatové extrakty se vysuší síranem hořečnatým a odpaří k získání tmavého oleje, který se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi n-heptan/ethylacetat (3 : 1) s 2% triethylaminem jako mobilní fází. Příslušné frakce se shromáždí, spojí a odpaří k získání terč.-butyl-[N-[4-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2

-methoxyfenyl]karbamatu] jako bílé tuhé látky (1,90 g, 4,29

mmol	) :	NMR	(DMSO-d6,	400	MHz)	δ 8,65	(s, 1 H), 7,94
2H) ,	7,74	(d,	1H), 7,19	(d,	1H) ,	7,07	(dd, 1H), 5,22
1H) ,	3,87	(s,	3H), 2,19	(m,	2H) ,	1, 99	(m, 2H), 1,91 (:
2H) ,	1,73	(m,	2H), 1,48	(s,	9H) ;	TLC (	n-heptan/ethyl-
acet	at =	1:1)	Rf 0,58,

d) 4-(4-Chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyanilin

Kyselina trifluoroctová (2 ml) se po kapkách přidá k roztoku terč.-butyl-[N-[4 (4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamatu] (0,58 g, 1,31 mmol) v dichlormethanu (20 ml) při teplotě 0 °C. Ledová lázeň se odstraní a reakční směs se míchá při teplotě místnosti 3 hodiny. Většina kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se * · · · · · ···· · · • · · · · · · ···

-95- · · ····· ·· znovu rozpustí v dichlormethanu a promyje se nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší se síranem horečnatým, zfiltruje a odpaří k získání 4—(4 — -chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3—d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyanilinu jako bílé tuhé látky (0,45 g, 1,31 mmol): ^ΧΗ NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,61 (s, 1H) , 7,78 (s, 1H) , 6,97

(d, 1H), 6,85	(dd,	i h:	), 6,67	(d,	1H), 5,20 (m, 1H), 4,78
(široký, 2H),	3, 81	(s,	3H) ,	2,	18	(m,	2H), 1,88-2,00 (m,
4H), 1,72 (m,	2H) ;	MH+	343.

e) 5-(4-Amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo-[2,3-d]pyrimidin-4-amin

Směs 4-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-ethoxyanilinu (0,45 g, 1,31 mmol), amoniaku (15 ml, měrná hmotnost 0,88 g/ml) a 1,4-dioxanu (15 ml) se přes noc zahřívá a míchá při teplotě 120 °C v tlakové nádobě. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku, který se rozdělí mezi vodu a ethylacetat. Organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se dále dvakrát extrahuje ethylacetatem. Spojené ethylacetatové extrakty se promyjí nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem horečnatým, zfiltrují a odpaří k získání 5—(4— -amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyri-

midin-4-aminu	jako	hnědé tuhé látky (0	,32 g, 0,99 mmol): 1H
NMR (DMSO-de,	400 MHz) δ 8,09 (s, 1H),	7,24 (s, 1H),	6, 88
(d, 1H), 6,79	(dd,	1H), 6,71 (d, 1H),	6,01 (široký,	2H) ,
5,06 (m, 1H) ,	4,79	(široký, 2H), 3,81	(s, 3H), 2,10	(m,
2H), 1,87-1,92 (m,	4H) , 1,68 (m, 2H) ;	MH+ 324.

f) NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidán-

-5-yl)-2-methoxyfenyl]-4-kyan-l-benzensulfonamid

-96Směs 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (0,026 g, 0,08 mmol), 4-kyanbenzensulfonylchloridu (0,019 g, 0,10 mmol) a pyridinu (0,40 ml) se míchá při teplotě místnosti přes noc. Většina pyridinu se odpaří za sníženého tlaku a odparek se vyčistí preparativní RP-HPLC (Rainin C18, 8 μτη, 300 A, 25 cm; 25% až 100% acetonitril - 0,lM octan amonný během 25 minut, 21 ml/min) k získání NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-4-kyan-1-benzensulfonamidu jako žluté tuhé látky (0,018 g, 0,04 mmol): ^ΧΗ NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9,91 (s, 1H), 8,13 (s, 1H) , 8,05 (d, 2H) , 7,89 (d, 2H), 7,44 (s, 1H), 7,27 (d, 1H), 7,00 (dd, 1H), 6,98 (d, 1H), 6,07 (široký, 2H), 5,07 (m, 1H), 3,49 (s, 3H), 2,11 (m, 2H), 1,88 (m, 4H), 1,69 (m, 2H); MH⁺ 489; TLC (ethylacetat/methanol = 9:1) Rf 0,49; RPHPLC (Hypersil C18, 5 μιη, 200 A, 25 cm; 25% až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min)

R_t 14,65 min.

Příklad 2

NI- [4- (4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) -2-methoxyf enyl]-4- (trif luormethyl) -1-benzensulf onamid

Příklad 2 se syntetizuje za použití stejného způsobu jako pro NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-4-kyan-l-benzensulfonamid.

^XH NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,90 (s, 1H) , 8,22 (s, 1H) , 7,96 (s, 4H), 7,55 (m, 1H), 7,29 (d, 2H) , 7,01 (m, 2H), 5,09 (m

-971,69 (m,

2H); ΜΗ 530; TLC (ethylacetat/methanol = 9:1)

Rf 0,64;

RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25%

98% acetonitril

O,1M octan amonný během 25 min, ml/min)

Příklad 3

NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5

-yl)-2-methoxyfenyl]-4-(trifluormethoxyl)-1-benzen sulfonamid

Příklad 3 se syntetizuje za použití stejného způsobu jako pro NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrro lo [2,3-d]pyrimidin-5-yl) -2-methoxyfenyl]-4-kyan-l-benzen sulfonamid.

NMR (CDC1₃,

7,27

H), (ethylacetat) Rf 0,34; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm,

200 A, 25 cm; 25% - 98% acetonitril

O,1M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) R_t 18,18 min.

Příklad 4

N2-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-2-pyridinsulfonamid

a) 2-Pyridinsulfonylchlorid se připraví podle popisu v • · · · ·· ···· ·· · • ••· 4·· · · · ·

98- .· . : : ···. .:::

• · ·· ···· ········ ·· ··· · · ···

Heterocycles, 28 , 1115 (1989). Do roztoku 2-pyridinthiolu (2,00 g, 17,99 mmol) v koncentrované kyselině chlorovodíkové (30 ml) při teplotě 0 °C se 3 hodiny probublává plynný chlor. Reakčni směs se vlije do ledově studené vody (40 ml) a výsledná sraženina se shromáždí filtrací. Sraženina se dále promyje ledově studenou vodou a poté se suší oxidem fosforečným ve vakuu při teplotě 0 °C 2 hodiny k získání 2-pyridinsulfonylchloridu jako bílé tuhé látky (2,00 g, 11,26 mmo1).

b) N2 - [ 4 - (4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-2-pyridinsulfonamid

Směs 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (0,040 g, 0,12 mmol), 2-pyridinsulfonylchloridu (0,026 g, 0,15 mmol) a pyridinu (0,40 ml) se míchá při teplotě 0 °C 3 hodiny. Reakčni směs se naředí etherem a výsledný roztok se promyje následně 2N kyselinou chlorovodíkovou, vodou a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Organická vrstva se odpaří k zanechání odparku, který se vyčistí preparativní RP-HPLC (Rainin C18, 8 μιη, 300 A, 25 cm; 25% - 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 minut, 21 ml/min) k získání N2-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-2-pyridinsulfon-

amidu jako bílé tuhé látky (0,022	g, 0,05 mmol): 1H NMR
(CDC13, 400 MHz) δ	8,71	(d, 1 H) ,	8,31 (s, 1 H) ,	, 8,01 (d,
H), 7,87 (m, 1 H),	7,64	(d, 1 H),	7,47 (m, 1 H)	, 7,41 (m,
1H), 6,99 (m, 2H),	6, 87	(s, 1H),	5,19 (m, 1H) ,	5,07 (s,
2H), 3,79 (s, 3H),	2,23	(m, 2H),	1,76-1,88 (m,	4H), 1,63

ím, 2H); MH⁺ 465; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25% - 98% acetonitril - 0,lM octan amonný během 25 minut, 1 ml/min) R_t 12,65 min.

-99Přiklad 5

N3-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-3-pyridinsulfonamid

a) 3-Pyridinsulfonylchlorid se připraví podle popisu v J. Heterocyclo. Chem., 29, 61 (1992). Směs kyseliny 3-pyridinsulfonové (1,45 g, 9,01 mmol) a chloridu fosforečného (2,00 g, 9,62 mmol) se zahřívá na teplotu 110°C 3 hodiny. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a destiluje se (teplota varu 60 až 65 °C) za sníženého tlaku (13,33 Pa) k získání 3-pyridinsulfonylchloridu jako bílé tuhé látky (1,12 g, 6,31 mmol) která se použije přímo bez dalšího čištění.

b) N3-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-3-pyridinsulfonamid

Směs 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (0,040 g, 0,12 mmol), 3-pyridinsulfonylchloridu (0,030 g, 0,17 mmol) a pyridinu (0,40 ml) se míchá při teplotě 0 °C 0,5 hodiny. Do reakční směsi se přidá voda a poté se většina pyridinu a vody odpaří za sníženého tlaku. Odparek se vyčistí preparativní RP-HPLC (Rainin C18, 8 μιη, 300 A, 25 cm; 25% - 100% acetonitril - 0,lM octan amonný během 25 min, 21 ml/min) k získání N3-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-3-pyridinsulfonamidu jako bílé

tuhé 8, 97	látky (0,020 g, 0,04 mmol):	XHNMR (CDCl3, 400 MHz) δ
(d,	1H) ,	8,76	(d, 1H), 8,29	(s,	1H) ,	8, 10	(dd, 1H),
7,62	(d,	1H) ,	7,40	(m, 1H), 7,05	(d,	1H) ,	7,00	(s, 1H),
6, 85	(s,	1H) ,	5,31	(široký, 2H),	5,20	(m,	1H) ,	3, 68 (s,
3H) ,	2,26	(m,	2H) ,	1,80-2,00 (m,	6H) ;	MH+	4 65;	RP-HPLC

ΠΛ · · · · · · · · · ·

- 1UU ” · ···· ····· • · · · ···· ········ ·· · · · ·· ··· (Hypersil C18, 5 μτη, 200 A, 25 cm; 25% - 98% acetonitril O,1M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) R_t 12,23 min.

Příklad 6

NI-[5-(4-Amino~7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-(trifluormethyl)fenyl]-1-benzensulfonamid

a) NI-[4-Brom-2-(trifluormethyl)fenyl]-1-benzenesulfon-amid

Benzensulfonylchlorid (1,06 g, 6,00 mmol) se po kapkách přidá k míchanému roztoku 4-brom-2-(trifluormethyl·) anilinu (1,20 g, 5,00 mmol) a pyridinu (1,98 g, 25,0 mmol) v dichlormethanu (10 ml) při teplotě 0 °C pod atmosférou dusíku. Směs se ohřeje na teplotu místnosti a míchá se 16 hodin. Směs se naředí ethylacetatem (35 ml), poté se promyje vodou (3x 10 ml), 2N kyselinou citrónovou (3x 10 ml) a roztokem chloridu sodného (10 ml), poté se odpaří ve vakuu. Odparek se vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi 3:2 heptanzmethylenchlorid jako eluentu k získání NI-[4-brom-2-(trifluormethyl)fenyl]-1-benzensulfonamidu (1,3 g) jako bílé tuhé látky. ^XH NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 10,10 (1H, s), 7,60-8,16 (7H, m), 6,9 (1H, dd) ; t_R =24,27 min (RP-HPLC, 5 až 100% acetonitril - 0,1 % TFA, 30 min).

b) NI-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-(trifluormethyl)fenyl]-1-benzensulfonamid

Směs NI-[4-brom-2-(trifluormethyl)fenyl]-1-benzensulfonamidu (0,5 g, 1,31 mmol), bis(pinakolato) diboru (0,402 g, 1,58 mmol), octanu draselného (0,387 g, • · • · • · · • · • · ···· · · · · · · · _ i n i - · ······ ···

1V1 φ ···· ···· · • · · · · · · · ········ ·· ··· ·· · · ·

3,95 mmol) a [1,1'-bis(difenylfosfino)ferrocen]dichlorpalladia(II) (32 mg, 0,040 mmol) v DMF (10 ml) se zahřívá pod atmosférou dusíku při teplotě 100 °C 17 hodin. Směs se ochladí a přidá se 1,1'bis(difenylfosfino)ferrocen]dichlorpalladium(II) (32 mg, 0,040 mmol), poté se v zahřívání na teplotu 100 °C pokračuje dalších 24 hodin. Rozpouštědlo se poté odpaří ve vakuu a odparek se trituruje 25 ml směsi 4:1 heptan:methylenchlorid a tuhé látky se odstraní filtrací přes podložku z rozsivkové zeminy. Odstranění rozpouštědla ve vakuu vede ke vzniku gumovitého odparku (0,42 g), z něhož se (123 mg, 0,28 mmol) přidá ke směsi 1,2-dimethoxyethanu (2,5 ml) a vody (1,25 ml). Ke směsi se přidá uhličitan sodný (39 mg, 0,36 mmol), 4-chlor7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (50 mg, 0,144 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)palladium(0) (9,0 mg,

0,008 mol), která se poté pod atmosférou dusíku 16 hodin zahřívá na teplotu zpětného toku, ochladí se a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Odparek se rozdělí mezi ethylacetat (10 ml) a vodu (6 ml). Vodná vrstva se oddělí a promyje se ethylacetatem (10 ml). Spojené organické vrstvy se odpaří a odparek se rozpustí v 1,4-dioxanu (5 ml) a koncentrovaném vodném roztoku hydroxidu amonného (5 ml), poté .se zahřívá na teplotu 120 °C v uzavřené zkumavce 16 hodin. Rozpouštědla se odpaří ve vakuu a vyčištěním MPLC s reverzní fází za použití sloupce C18 a 25 až 75% acetonitril - 0,1 % TFA, 25 minut jako eluentu, následované lyofilizací poskytne NI-[S-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-(trifluormethyl)fenyl]-1-benzensulfonamid (9 mg) jako hnědou amorfní tuhou látku.

^XH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 10,05( 1 H, široký s) , 8,38 (1H,

s), 7,57-7,87 (10H, m), 7,09 (1H, d), 5,11 (1H, m), 2,14 (2H, m), 1,95 (4H, m), 1,7 (2H, m); MS s nízkým rozlišením,

-102m/e (MH⁺) , 502; t_R = 16,78 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,1% TFA, 25 min)

Příklad 7

NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fenylfenyl]-1-benzensulfonamid

a) 2-Amino-5-brombifenyl

2,4,4,6-Tetrabrom-2,5-cyklohexadien-l-on (12,1 g, 29,55 mmol) se po částech přidá k roztoku 2-aminobifenylu (5,0 g, 29,55 mmol) v methylenchloridu (65 ml), zatímco se teplota udržuje mezi -5 °C a -10 °C. Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti a 20 hodin se míchá. Roztok se extrahuje dvakrát 1N roztokem hydroxidu sodného (1 x 50 ml, 1 x 20 ml), poté se vysuší MgSO₄, zpracuje se aktivním uhlím, zfiltruje se přes rozsivkovou zeminu a odpaří k získání 2-amino-5-brombifenylu (7,2 g) jako černého oleje, který během stání ztuhne. ’Ή NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7,36-7,48 (5H, m), 7,2 (1H, dd), 7,08 (1H, d), 6,7 (1H, d), 4,95 (2H, široký s); MS s nízkým rozlišením m/e 249 (MH+); t_R = 16,03 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,1 % TFA, 25 min); ¹³C NMR (DMSO-dg, 100 MHz) δ 144,5, 138,2, 131,9, 130, 6, 128,8, 128,5, 127,7, 127,3, 117,1, 107,1.

b) 1-(4-Brom-2-fenylfenyl)-1-benzensulfonamid

Benzensulfonylchlorid (1,71 g, 9,67 mmol) se po kapkách přidá pod atmosférou dusíku k míchanému roztoku 2-amino-5-brombifenylu (2,0 g, 8,06 mmol) a pyridinu (3,19 g, 40,3 mmol) v methylenchloridu (20 ml) při teplotě nižší než 0 °C. Směs se ohřeje na teplotu místnosti a 16 hodin se

- 103 ···· · · *···· • · ······· · • · · · · · ·· · · • · · ····· ········ · · · · · ·· ··· míchá. Směs se poté naředí ethylacetatem (75 ml) a promyje se vodou (3'x 15 ml), 2N vodnou kyselinou citrónovou (3 x 15 ml), roztokem chloridu sodného (15 ml), vysuší se síranem hořečnatým, zpracuje se aktivním uhlím a zfiltruje se přes rozsivkovou zeminu. Odpaření rozpouštědla ve vakuu poskytne NI-(4-brom-2-fenylbenzen)-1-benzensulfonamid (2,9 g) jako hnědou tuhou látku. ^XH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 9,62 (1H, s), 7,34-8,07 (10H, m), 7,19 (2H, m), 7,01 (1H, d); MS s nízkým rozlišením m/e 388 (MH⁺) ; t_R = 21,2 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,1 % TFA, 25 min).

c) NI-[2-Fenyl-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]-1-benzensulfonamid

Směs NI-(4-brom-2-fenylbenzen)-1-benzensulfonamidu (0,388 g, 1,00 mmol), bis(pinakolato)diboru (0,305 g, 1,20 mmol), octanu draselného (0,294 g, 3,00 mmol) a [ 1,1'bis(difenylfosfino)ferrocen]dichlorpalladia(II) (25 mg, 0,030 mmol) v DMF (10 ml) se zahřívá pod atmosférou dusíku při teplotě 100 °C 16,5 hodiny. DMF se odpaří ve vakuu a odparek se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi methylenchlorid/heptan 7:3 plus 2% triethylamin k poskytnutí NI-[4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl) -2-fenylbenzen]-l-benzensulfonamidu (0,135 g) jako oleje. t_R = 23,13 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,1% TFA, 25 min); MS s nízkým rozlišením m/e (M-H⁺) .

d) NI-[4-(4-Chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3—d]pyrimidin-5-yl)-2-fenylfenyl]-1-benzensulfonamid

Směs uhličitanu sodného (57 mg, 0,54 mmol), • · «· ·«··a· * a a · ·······

ΛA · · ····· ··· lv⁴* - » ·<·· · « · ·· • · · · ·· · · ateaaaaa a a a a a a a a a a

4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (75 mg, 0,216 mmol), NI-[4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)-2-fenylbenzen]-1-benzensulfonamidu (135 mg, 0,269 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladia(0) (12,5 mg,

0,0108 mmol), vody (1,25 ml) a DME (2,5 ml) se při teplotě zpětného toku zahřívá pod atmosférou dusíku 16 hodin, ochladí se a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Odparek se rozdělí mezi ethylacetat (10 ml) a vodu (5 ml). Organická vrstva se odpaří a odparek se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém k získání NI-[4-(2-benzen-4chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenyl]-1-benzensulfonamidu (55 mg) jako hnědé tuhé látky. ¹H NMR (DMSO-de, 400 MHz) δ 9,56 (1H, s) , 8,65 (1H, s), 8,03 (1H, s), 7,3-7,65 (12H, m), 7,08 (1H, d), 5,21 (1H, m), 2,17 (2H, m), 1,92 (4H, m) , 1,71 (2H, m) ; t_R = 23,77 min (RPHPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,1 % TFA, 25 min).

e) NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fenylfenyl]-1-benzensulfonamid

Směs NI-[4-(2-benzen-4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenyl]-1-benzensulfonamidu (55 mg, 0,104 mmol), koncentrovaného vodného roztoku hydroxidu amonného (5 ml) a 1,4-dioxanu (5 ml) se zahřívá na teplotu 120 °C v uzavřené zkumavce 16 hodin. Roztok se ochladí na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Vyčištění MPLC za použití sloupce C18 a 25 až 100% acetonitril - 0,lN octanu amonného, 25 minut jako eluentu, následováno lyofilizací, poskytne NI-[4-(4-amino-2-benzen-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenyl]-l-benzensulfonamid (14 mg) jako hnědou tuhou látku. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,56 (1H, s), 8,13 (1H, s), 7,31-7,65 * ·

- 105 (13H, m), 7,1 (1H, d),

6,08 (2H, s), 5,07 (1H, m) , 2,08 (2H, m), 1,9 (4H, m), 1,67 (2H, m); MS s nízkým rozlišením m/e 510 (MH⁺) ; t_R = 19,22 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - O,1N octan amonný, 25 minut).

Příklad 8

7-Cyklopentyl-5-[1-(fenylsulfonyl)-2,3-dihydro-lH-5-indolyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin

a) 5-Brom-l-(fenylsulfonyl)indolin

Benzensulfonylchlorid (1,85 g, 10,53 mmol) se po kapkách přidá pod atmosférou dusíku k míchanému roztoku

5-bromindolinu (2,0 g, 8,77 mmol) a pyridinu (3,47 g, 43,9 mmol) v methylenchloridu (30 ml) při teplotě nižší než 0 °C. Směs se ohřeje na teplotu místnosti a míchá 16 hodin. Směs se poté naředí methylenchloridem (30 ml) a promyje se 2N vodným roztokem kyseliny citrónové (3 x 20 ml), roztokem chloridu sodného (20 ml), vysuší se MgSO₄, zpracuje se aktivním uhlím a zfiltruje se přes rozsivkovou zeminu. Odpaření rozpouštědla ve vakuu poskytne 5-brom-l-(fenylsulfonyl) indolin (3,2 g) . ¹H NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 7,83 (2H, d), 7,68 (1H, t), 7,61 (2H, t), 7,31-7,43 (3H, m), 3,93 (2H, t), 2,92 (2H, t); t_R = 19,30 minut (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,lN octan amonný, 25 min).

b) 1-(Fenylsulfonyl)-5-(4,4,5,5-tetramethyl-l, 3,2-dioxaborolan-2-yl)indolin

Směs 5-brom-l-(fenylsulfonyl)indolinu (1,0 g, 3,07 mmol), bis(pinakolato)diboru (0,935 g, 3,68 mmol), octanu draselného (0,902g, 9,202 mmol) a [1,1'-bis(difenyl- 106• · · · ···*··· • · »···· ··· • ···· · · 4 ·· • · ·« · · ·· •4Φ4444· * · 4 4 4 » -·» 4 4 4 fosfino)ferrocen]dichlorpalladia(II) (88 mg, 0,092 mmol) v

DMF (20 ml) se zahřívá pod atmosférou dusíku při teplotě 100 °C 16 hodin. DMF se odpaří ve vakuu a odparek se trituruje toluenem (20 ml) poté se tuhé látky odstraní filtrací přes rozsivkovou zeminu. Filtrát se promyje vodou (3 x 15 ml), poté se vysuší MgSO₄, zfiltruje a odpaří na odparek, který se použije surový v příštím kroku. ^ΧΗ NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7,83 (2H, d) , 7,43-7, 68 (6H, m) , 3,94 (2H, t), 2,94 (2H, t), 1,26 (12H, s) ; t_R = 21,23 min (RPHPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,lN octan amonný, 25 minut.

c) 7-Cyklopentyl-5-[1-(fenylsulfonyl)-2,3-dihydro-lH-5-indolyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-4-amin

Směs uhličitanu sodného (92 mg, 0,087 mmol), 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (100 mg, 0,288 mmol), l-(fenylsulfonyl)-5-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)indolinu (200 mg, 0,431 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladia(0) (17 mg, 0,0144 mmol), vody (3 ml) a DME (6 ml) se při teplotě zpětného toku zahřívá pod atmosférou dusíku 16 hodin, ochladí se a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Odparek se rozdělí mezi ethylacetat. (10 ml) a vodu (5 ml). Organická vrstva se odpaří a odparek se rozpustí v 1,4-dioxanu (6 ml) a koncentrovaném vodném roztoku hydroxidu amonného (6 ml), poté se zahřívá na teplotu 120 °C v uzavřené zkumavce 16 hodin. Roztok se ochladí a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Vyčištění MPLC s reverzní fází za použití sloupce C18 a 25 až 75% acetonitril - 0,1 N octan amonný, 25 min jako eluentu, následováno lyofilizací poskytne 7-cyklopentyl-5-[1-(fenylsulfonyl)-2,3-dihydro-lH-5-indolyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin (23 mg) jako hnědou tuhou látku. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,11 (1H, d) , 7,85 (2H, d) , 7,70

- 107·· · * ·« · · · · ·« • · · · ·«· «·· • · ····· · * • · · · ···· ······· · · ··· · · ···

(1H, t),	7,54-7,61	(3H, m), 7,25-7,33	(3H, m) ,	6,0 (2H, s),
5,06 (1H,	m), 3,96	(2H, t), 2,95	(2H,	t), 2,11	2H, m) , 1,90
(4 H, m) ,	1,67 (2H,	m) ; tR = 16,37	min	(RP-HPLC,	25 až 100%
acetonitril - 0,lN	octan amonný,	25 minut).

Přiklad 9

NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-Nl-methyl-l-benzensulfonamid

a) NI-(4-Brom-2-chlorfenyl)-1-benzensulfonamid

Benzensulfonylchlorid (2,11 g, 12,0 mmol) se po kapkách přidá pod atmosférou dusíku k míchanému roztoku 4-brom-2-chloranilinu (2,06 g, 10,0 mmol), pyridinu (3,95 g, 50 mmol) a methylenchloridu (15 ml). Směs se míchá 3 hodiny a poté se naředí ethylacetatem (75 ml) a promyje se vodou (3 x 20 ml), roztokem chloridu sodného (20 ml) a poté se vysuší MgSO₄, zfiltruje a odpaří k získání 3,2 g (92 %) NI-(4-brom-2-chlorfenyl)-1-benzensulfonamidu jako oranžové tuhé látky. ^XH NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 10,10 (1H, s), 7,7 (2H, d), 7,53-7,65 (4H, m), 7,46 (1H, d), 7,18 (1H, d); ⁿC NMR (DMSO-dg, 100 MHz) δ 140,0, 131, 1, 133, 0, 132, 0, 130,8, 130,3, 129,2, 128,8, 126,6, 119,0; MS s nízkým rozlišením m/e 346 (M-H⁺) .

b) NI-(4-Brom-2-chlorfenyl)-Nl-methyl-l-benzensulfonamid

NI-(4-Bom-2-chlorfenyl)-1-benzensulfonamid (1,0 g, 2,89 mmol) v DMF (8 ml) se přidá pod atmosférou dusíku ke směsi hydridu sodného (0,14 g 60% disperse minerálním oleji, 3,47 mmol) v DMF (7 ml) při teplotě 0 °C. Směs se poté zpracuje jodmethanem (0,452 g, 3,18 mmol)

- 108• · ·· ·· · · · ♦ ·· · • · · « · * ···· • · ····· ·· · • ♦ · · · » · · · · • · ·· · · · · ······· · · ··· · ♦ ··· zatímco teplota se držuje na méně než 0 °C. Směs se ohřeje na teplotu místnosti, 16 hodin se míchá, poté se přidá voda (100 ml). Směs se extrahuje ethylacetatem (3 x 20 ml) a spojené organické vrstvy se promyji vodou (3 x 20 ml), vysuší se MgSO₄, zfiltrují a odpaří k získání Nl-(4-brom-2-chlorfenyl)-Nl-methyl-l-benzensulfonamidu (0,55 g) . ^ΧΗ NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7,87 (1H, s), 7,55-7,80 (6H, m), 7,00 (1H, d), 3,11 (3H, s); t_R = 19,58 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,lN octan amonný, 25 minut).

c) NI-[2-Chlor-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]-Nl-methyl-l-benzensulfonamid

Směs Nl-(4-brom-2-chlorfenyl)Nl-methyl-l-benzensulfonamidu (0,5 g, 1,389 mmol), bis(pinakolato)diboru (0,423 g, 1,66 mmol), octanu draselného (0,408 g, 4,167 mmol) a [ 1, 1' -bis (difenylfosfino) ferrocenjdichlorpalladia(II) (34 mg, 0,042 mmol) v DMF (20 ml) se zahřívá pod atmosférou dusíku při teplotě 100 °C 16 hodin. DMF se odpaří ve vakuu a odparek se trituruje toluenem (15 ml), poté se zfiltruje přes rozsivkovou zeminu k získání Nl-[2-chlor-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl ]-Nl-methyl-l-benzensulfonamidu (0,25 g) jako tmavého oleje, který se použije surový v příštím kroku. ^XH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 7,93 (2H, d), 7,57-7,75 (5H, m), 7,07 (1H, d), 3,12 (3H, s), 1,29 (12H, s).

d) Nl-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3—d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-Nl-methyl-l-benzensulfonamid

Směs uhličitanu sodného (92 mg, 0,087 mmol), ···· ·«» *· · · ·

- 109 ’ * ······ ··· « · ·· · · · · ········ ·· ··· ·· ···

4-chlor-7-cyklopentyl-5-j od-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (100 mg, 0,288 mmol), NI-[2-chlor-4-(4,4,5,5-tetramethyl1,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]-Nl-methyl-l-benzensulfonamidu (244 mg (72% čistota hmotnostně), 0,432 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladia(0) (17 mg, 0,0144 mmol), vody (3 ml) a DME (6 ml) se při teplotě zpětného toku zahřívá pod atmosférou dusíku 16 hodin, ochladí se a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Odparek se rozdělí mezi ethylacetat (20 ml) a vodu (10 ml). Organická vrstva se odpaří a odparek se rozpustí v 1,4-dioxanu (7 ml) a vodném koncentrovaném roztoku hydroxidu amonného (7 ml) poté se zahřívá na teplotu 120 °C v uzavřené zkumavce 16 hodin. Roztok se ochladí se a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Vyčištění MPLC s reverzní fází za použití sloupce C18 a 25 až 75% acetonitril - 0,1 N octan amonný, 25 minut jako eluentu, následované lyofilizací poskytne NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)2-chlorfenyl]-Nl-methyl-l-benzensulfonamid (20 mg) jako hnědou tuhou látku.

NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 8,15 (1H, s) , 7,74-7,80 (3H, m) , 7,64-7,66 (2H, m), 7,60 (1H, s), 7,39 (1H, d), 7,08 (1H,

d), 6,20 (2H, s), 3,16 (3H, s), 2,14 (2H,m), 1,91 (4H, m), 1,69 (2H, m); MS s nízkým rozlišením m/e 481 (M-H⁺) ; t_R = 22,45 min (RP-HPLC, 25 až 75% acetonitril - 0,lN octan amonný, 25 minut).

Příklad 10

NI-[5-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]-1-benzensulfonamid

a) terč. -Butyl[N- (5-brom-2-pyridyl) karbamat]

- 110• · ·· · · · · · · ·» · ··· · · · · · · · • · ····· ·· · • ···· ···· · « · ♦ · ···· ···«··· ·e ··· ·· ···

Směs 5-brom-2-pyridinaminu (4,0 g, 23,1 mmol) a di-terc.-butyldikarbonatu (6,31 g, 28,9 mmol) v tetrahydrofuranu (50 ml) se při teplotě zpětného toku zahřívá 20 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Přidá se methylenchlorid (30 ml) a ethylacetat (30 ml) a směs se extrahuje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (25 ml). Organická vrstva se odpaří ve vakuu a přibližně jedna čtvrtina odparku se vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi 95:5 n-heptan/ethylacetat jako eluentu k získání terc.-butyl N-(5-brom-2-pyridyl) karbamatu (0,61 g) jako oleje. ^XH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 9,96 (1H, s), 8,34 (1H, d), 7,93 (1H, dd), 7,77 (1H, d), 1,47 (9H, s).

b) terč. -Butyl-[N- [5-(1,1,1-trimethylstannyl) -2-pyridyl] karbamat]

Směs terc.-butyl N-(5-brom-2-pyridyl)karbamatu (0,5 g, 1,83 mmol), hexamethylditinu (0,6 g, 1,832 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)palladia(0) (130 mg, 0,107 mmol) a dimethoxyethanu (10 ml) se zahřívá na teplotu 80 °C pod atmosférou dusíku 15 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a poté se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku. Odparek se vyčisti bleskovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi heptan/ethylacetat (95:5) jako eluentu k získání terc.-butyl-[N- [5-(1,1,1-trimethylstannyl) -2-pyridyl]karbamatu] (242 mg) jako oleje: ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,31 (1H, s), 8,15 (1H, s), 7,65-7,72 (2H, m), 1,44 (9H, s), 0,24 (9H, s) ; MS s nízkým rozlišením m/e 481.

«· · · ···· ·· · ···· ·«· ♦ é · · • · «···· ·· ·

-111* · · · · · « · · ········ ·· · · » * · ···

c) terč.-Butyl-[N- [5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamat]

Směs terč. -butyl-[N- [5-(1,1,1-trimethylstannyl) -2-pyridyl]karbamatu] (230 mg, 0,644 mmol), 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (225 mg, 0,644 mmol), tris(dibenzylidenaceton)dipalladia(0) (30 mg,

0,0322 mmol), trifenylarsinu (50 mg, 0,161 mmol) a DMF (8 ml) se zahřívá na teplotu 80 °C pod atmosférou dusíku 18 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku, který se rozdělí mezi vodu (5 ml) a ethylacetat (20 ml). Organická vrstva se oddělí a organická vrstva se dále extrahuje vodou (5 ml), roztokem chloridu sodného (5 ml), vysuší se MgSCú, zfiltruje a odpaří k získání odparku, který se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (8:2) jako eluentu k získání terč. -butyl-[N- [5 - (4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamatu] (170 mg) jako hnědé tuhé látky. 'Ή NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,66 (1H, s), 8,58 (1H, s), 8,35 (1H, s), 7,89 (1H, s), 7,82 (2H, m), 5,2 (1H, m) , 2,16 (2H, m), 1,92 (4H, m), 1,71 (2H, m), 1,47 (9H, s).

d) 5-(4-Chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinamin

Kyselina trifluoroctová (2 ml) se po kapkách přidá k roztoku terč.-butyl-[N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamatu] (165 mg, 0,4 mmol) v dichlormethanu (7 ml) při teplotě 0 °C. Ledová lázeň se odstraní a reakční směs se míchá při

-112···· · · · · · · • · ··«·· · · • · · · · · · · ······· · · ··· ·· ··· teplotě místnosti 6 hodin. Rozpouštědla se odpaří ve vakuu, poté se odparek znovu rozpustí v ethylacetatu (55 ml) a promyje se nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (10 ml), vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří k získání 5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3—d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinaminu (133 mg). ^XH NMR (DMSO-d₆,400 MHz) Ó 8,63 (1H, s), 8,05 (1H, dd), 7,86 (1H,

d), 7,.	55 (1H, d), 6,52	(1H, d), 6,	06	(2H, široký s) , 5,20
(2H, m	), 2,16 (2H, m),	1,97 ( 4H,	m) ,	1,72 (2H, m); MS s
nízkým	rozlišením, m/e	(MH+) 314.

e) NI-[5-(4-Chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3—d]-pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]-1-benzensulfonamid

Benzensulfonylchlorid (366 mg, 2,07 mmol) se pod atmosférou dusíku přidá k míchanému roztoku 5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3—d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinaminu (125 mg, 0,4 mmol) a pyridinu (294 mg, 3,7 mmol) v methylenchloridu (10 ml). Směs se zahřívá na teplotu 80°C 20 hodin v uzavřené zkumavce. Směs se ochladí a rozpouštědla se odpaří ve vakuu. Odparek se znovu rozpustí v methylenchloridu (50 ml) a promyje se nasyceným roztokem hydrogeuhličitanu sodného (15 ml), vysuší se MgSO₄, zfiltruje a odpaří na odparek, který se vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat jako eluentu k získání NI-[5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)2-pyridyl]- 1-benzensulfonamidu (90 mg) jako hnědé tuhé látky. ^XH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 11,3 (1H, široký s), 8,66 (1H, s), 8,2 (1H, široký s), 7,89 -7, 99 (4H, m) , 7,54-7,62 (3H, m), 7,2 (1H, široký s), 5,2 (1H, m), 2,16 (2H, m), 1,92 (4H, m), 1,71 (2H, m); MS s nízkým rozlišením, m/e (MH⁺) 454.

«· ·· ···· · * · • ••4 ··· ···· • · ····· ·· ·

- 113 - ..........

* · · »· ···· ········ · · ··· · · ···

f) NI-[5-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]-1-benzensulfonamid

Směs NI-(5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]-1-benzensulfonamidu (90 mg), koncentrovaného vodného roztoku hydroxidu amonného (5 ml) a 1,4-dioxanu (5 ml) se zahřívá na teplotu 120°C v uzavřené zkumavce 16 hodin. Roztok se ochladí na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Vyčištění pomocí MPLC za použití sloupce C18 a 25 až 100% acetonitril - 0,lN octan amonný, 25 minut jako eluentu následované lyofilizací poskytne NI-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl) -2-pyridyl]-l-benzensulfonamid (20 mg) jako hnědou tuhou látku. ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8,12 (1H, s), 8,08 (1H, široký s), 7,92 (2H, d), 7,79 (2H, d), 7,60 (3H, m), 7,44 (1H, s), 7,23 (1H, d), 6,19 (2H, široký s), 5,05 (1H, m), 2,10 (2H, m), 1,91 (4H, m) , 1,67 (2H, m); MS s nízkým rozlišením m/e 435 (MH⁺) .

Příklad 11

Nl-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[ 2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-2-kyan-l-benzensulfonamid

a) 5-(4-Amino-3-chlorfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin

Příklad 11 se připraví za použití stejného způsobu jako 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin. ¹H NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 8,10 (s, 1H), 7,29 (s, 2H), 7,12 (dd, 1H) , 6,88 (d, 1H), 6,00 (široký, 2H), 5,41 (s, 2H), 5,06 (m, 1H), 2,09 (m, 2H), 1,87 (m, 4H), 1,68 (m, 2H); MH+ 329; TLC (ethyl-114• · · · ·· «··· ·· · • · · 9 · · ««·· • · ····· ·· · e «··· ···· · • · · · · · · · ······· · · ··· · · · · · acetat) R_f 0,27; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 jim, 200 A, 25 cm; 25% - 100% acetonitril - O,1M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) R_t 14,02 min.

b) NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-2-kyan-l-benzensulfonamid

Směs 5-(4-amino-3-chlorfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (0,098 g, 0,30 mmol), 2-kyanbenzensulfonylchloridu (0,072 g, 0,36 mmol) a pyridinu (0,98 ml) se míchá při teplotě místnosti 16 hodin. Většina pyridinu se odpaří za sníženého tlaku a odparek se vyčistí preparativní RP-HPLC (Rainin C18, 8 μπι, 300 A, 25 cm; 25% - 100% acetonitril - 0,lM octan amonný během 25 min, 21 ml/min) k pískání NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-2-kyan-l-benzensulfonamidu jako bílé tuhé látky (0,025 g, 0,05 mmol).

ΧΗ NMR (CDC13,	400	MHz)	δ 8,	31	(s, 1H)	, 8,	17 (	;d, ih)	, 7,70
7,82 (m, 5H),	7,44	(s,	1H) ,	7,	40 (dd,	1H)	, 7,	00 (s,	1H) ,
5,27 (široký,	2H) ,	5,00	(m,	1H	), 2,23	(m,	2H)	, 1,79	-1,90

(m, 6H); MH⁺ 493; TLC (ethylacetat) R_f 0,30; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 μη, 200 A, 25 cm; 25% - 100% acetonitril 0,lM octan amonný během 25 min, 1 ml/min) R_t 15,27 min.

Příklad 12

NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-3-kyan-l-benzensulfonamid

Příklad 12 se připraví za použití stejného způsobu jako NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-2-kyan-l-benzensulfonamid (Příklad 11).

• · · · · · ···· ·· • · · * ··· ·«· ^XH NMR (CDC1₃, 400 MHz) δ 8,30 (s, 1H) , 8,07 (m, 2H) , 7,86 (d, 1H), 7,73 (d,lH), 7,65 (dd, 1H), 7,43 (s, 2H) , 7,05 (s, 1H), 5,30 (široký, 2H), 5,20 (m, 1H), 2,44 (m, 2H), 1,77-

1,89 (m, 6H); MH⁺ 493; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25% - 98% acetonitril - O,1M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) R_t 15,52 min.

Příklad 13

N3-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-3-pyridinsulfonamid

Příklad 13 se připraví za použití stejného způsobu jako NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-2-kyan-l-benzensulfonamid I (Příklad 11).

^ΤΗ NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8,97 (s, 1H) , 8:81 (dd, 1H) , 8,33 (s, 1H), 8,13 (dd,lH), 7,77 (d, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,02 (s,

1H), 5,21 (m, 1H), 5,06 (široký, 2H), 2,24 (m, 2H), 1,78-

1,89 (m, 6H); MH⁺469; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 pm, 200 A, 25 cm; 25% - 98% acetonitril - 0,lM octan amonný během 25 min, 1 ml/min) R_t 13,03 min.

Příklad 14

NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-2-trifluormethyl-l-benzensulfonamid

Příklad 14 se připraví za použití stejného způsobu jako NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo-116- : · : : :

········ ·· ··· ·· ··· [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-2-kyan-l-benzensulfonamid (příklad 11).

^XH NMR (CDC1₃, 400 MHz) δ 8,33 (s, 1H) , 8,09 (d, 1H) , 7,92 (d, 1H), 7,72 (m, 2H), 7,64 (m, 1H), 7,41 (s, 1H) , 7,36 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 5,21 (mnohočetný, 1H), 5,01 (široký, 2H), 2,25 (m, 2H), 1,77-1,91 (m, 6H); MH⁺536; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 μιη, 200 A, 25 cm; 25% - 98% acetonitril 0,lM octan amonný během 25 min, 1 ml/min) R_t 18,15 min.

Přiklad 15

NI-[4 -(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-3-trifluormethyl-l-benzensulfonamid

Přiklad 15 se připraví za použití stejného způsobu jako NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl]-2-kyan-l-benzensulfonamid (příklad 11).

^TH NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8,29 (s, 1H) , 8,04 (d, ZH) , 7,85 (d, 1H) , 7,77 (d, 1H), 7,65 (m, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,07 (s, 1H), 6,01 (široký, 2H), 5,20 (m, 1H), 2,27 (m, 2H), 1,79-

1,90 (m, 6H); MH⁺536; RP-HPLC (Hypersil C18, 5 μη, 200 A, 25 cm; 25% - 98% acetonitril - 0,lM octan amonný během 25 min, 1 ml/min) R_t 18,43 min.

Příklad 16

Nl-4-[4-Amino-7-(3-hydroxycyklopentyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-chlorfenyl-1-benzensulfonamid

a) 4-(4-Chlor-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-2-117• ••· ··· · · · • · ····· ··

-cyklopenten-l-ol

Dimethylsulfoxid (3,5 ml) se probublává a poté míchá pod atmosférou dusíku. Reakční nádoba se chrání před světlem a poté se přidá 4-chlor-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (570 mg, 2,03 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)palladium^) (0,05 g, 0,041 mmol). Směs se míchá 2 minuty, poté se ochladí na teplotu 0 °C. Směs se poté zpracuje s 2,4a-dihydro-laH-cyklopenta[b]oxirenem (200 mg, 2,44 mmol), který se rozpustí v tetrahydrofuranu (3,5 ml) a během přibližně 15 minut se přidá po kapkách. Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C 3 hodiny a poté se ohřeje na teplotu místnosti a míchá se 15 hodin. Směs se poté zpracuje s dalším dílem epoxidu (85 mg, 1,04 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)palladia(0) (0,025 g, 0,020 mmol) a míchání pokračuje dalších 24 hodin. Směs se poté rozdělí mezi ethylacetat (20 ml) a vodu (20 ml). Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se promyje methylenchloridem (3 x 20 ml). Organické vrstvy se spojí, promyjí vodou (20 ml), vysuší síranem hořečnatým, zfiltrují a odpaří. Vyčištění odparku MPLC s reverzní fází za použití sloupce C18 a 25 až 50% acetonitril - 0,1 N octan amonný, 15 minut jako eluentu, následováno odpařením acetonitrilu a shromážděním výsledných tuhých látek filtrací poskytne 4-(4-chlor-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-2-cyklopenten-l-ol (365 mg) jako hnědou tuhou

látku. XH NMR (DMSO-d6, 400	MHz)	δ 8,66 (1H, s)	f	7,87 (1H,
s) , 6,20 (1H, m), 5,93 (1H,	m) ,	5,77 (1H, m),	5,	27 (1H, d),
4,72 (1H, m), 2,89 (1H, m),	1, 62	(1H, m);
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) s	150,	9, 150, 4, 149,	9,	139,7,

133,8, 130,9, 116,2, 73,5, 57,8, 52,2, 41,1; MS s nízkým rozlišením m/e 362 (MH⁺) .

b) Nl-2-Chlor-4-[4-chlor-7-(4-hydroxy-2-cyklopentenyl)-118• · · · ·· ···· • · · · · · · • · · · · · ·

-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]fenyl-l-benzensulfonamid

Směs uhličitanu sodného (130 mg, 1,213 mmol),

4-(4-chlor-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-2-cyklopenten-l-olu (175 mg, 0,485 mmol), NI-[2-chlor-4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]-1-benzensulfonamidu (475 mg, 0,727 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladia(0) (30 mg, 0,024 mmol), vody (4 ml) a DME (8 ml) se při teplotě zpětného toku zahřívá pod atmosférou dusíku 16 hodin, ochladí se a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Odparek se rozdělí mezi ethylacetat (20 ml) a vodu (5 ml). Vodná vrstva se dále promyje ethylacetatem (20 ml) a methylenchloridem (2 x 20 ml). Spojené organické vrstvy se vysuší MgSO₄, zfiltrují a odpaří k získání oleje, který při stání tuhne. Vyčištění bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (7:3) jako eluentu poskytne Nl-2-chlor-4-[4-chlor-7-(4-hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]fenyl-l-benzensulf onamid (45 mg) jako hnědou tuhou látku, ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 8 10,06 (1H, s) , 8,69 (1H, s), 7,29-7,80 (9H, m), 6,19 (1H, m), 5,96 (1H, m), 5,85 (1H, m), 5,22 (1H, d), 2,92 (1H, m), 1,68 (1H, m) ; MS s nízkým rozlišením m/e 501 (MH⁺) ; tR = 14,82 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,lN octan amonný, 25 minut).

c) Nl-4-[4-Amino-7-(4-hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-chlorfenyl-l-benzensulfonamid

Nl-2-Chlor-4-[4-chlor-7-(4-hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]fenyl-l-benzensulfonamid (45 mg) se rozpustí v 1,4-dioxanu (7 ml) a vodném koncentrovaném roztoku hydroxidu amonného (7 ml), poté se zahřívá na teplotu 120 °C v uzavřené zkumavce 16 hodin.

·· ·· «· · · · · · · · ···· · · · · · · · • · ····· ·· · 1 1 Q · ···· ····· ^{1 1} -⁷ · « · · ···· ········ · · · · · · · · · ·

Roztok se ochladí a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu k získání Nl-4-[4-amino-7-(4-hydroxy-2-cyklopentenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin5-yl]-2-chlorfenyl-l-benzensulfonamidu, který se použije bez dalšího čištění v příštím kroku. MS s nízkým rozlišením m/e 482 (MH⁺) ; t_R = 10,75 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - O,1N octan amonný, 25 minut).

d) Nl-4-[4-Amino-7-(3-hydroxycyklopentyl)-7H-pyrrolo- [2,3 — d]pyrimidin-5-yl]-2-chlorfenyl-1-benzensulfonamid

Směs alkenu (45 mg) a 10% paladia na aktivním uhlí (25 mg) se míchá pod atmosférou vodíku při teplotě místnosti a atmosférickém tlaku 19 hodin, poté se zfiltruje přes 0,2μιη kartridžový filtr a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Vyčištění MPLC s reverzní fází za použití sloupce C18 a 25 až 100% acetonitril - 0,1 N octan amonný, 25 minut jako eluentu následované lyofilizací poskytne Nl-4-[4-amino-7-(3-hydroxycyklopentyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-chlorfenyl-l-benzensulfonamid (20 mg) jako hnědou tuhou látku. ¹H NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 10,03 (1H, široký s), 8,15 (1H, s), 7,77 (2H, d) , 7,29-7, 67 (7H, m) , 6,12 (1H, široký s), 5, 14 1H, m), 4,98 (1H, d), 4,23 (1H, d) , 2,37 (1H, m), 2,02-2,12 (2H, m), méně než 1,77 (3H,m); MS s nízkým rozlišením m/e 484 (MH⁺); t_R = 11,00 min (RP-HPLC, 25 až 100% acetonitril - 0,lN octan amonný, 25 minut).

Příklad 17

Neopentyl-[N-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d] -pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamat]

Neopentylchloroformiat (28 μΐ, 0,186 mmol) se po

- 120- • · · · ·· · · v « ·· • · · · «·· · « • · ««··· «· • ···« · · · 1 • · · · » · · ········ · · « · · «· kapkách přidá k míchanému roztoku 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (50 mg, 0,155 mmol) v pyridinu (1 ml) a dichlormethanu (1 ml) pod atmosférou dusíku při teplotě 0 °C. Po 10 minutách se ledová vodní lázeň odstraní a výsledná směs se míchá 4 hodiny. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se vyjme ethylacetatem. Organická vrstva se promyje, vysuší a odpaří. Tuhá látka se vyčistí preparativní TLC za použití směsi dichlormethan/methanol (95:5) jako mobilní fáze k získání neopentyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamatu]. ¹H NMR (CDC1₃) δ 1,00 (s, 9H) , 1,78 (m, 2H) , 1,90 (m, 4H) , 2,26 (m, 2H), 3,91 (s, 2H), 3,94 (s, 3H), 5,22 (m, 3H), 6,22 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 7,08 (d, J - 8 Hz, 1H), 7,25 (s, 1H) , 8,17 (široký d, 1H), 8,32 (s, 1H); LC/MS (MH⁺= 438).

Příklad 18

3-Pyridylmethyl N- (4- (4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamat

a) 4-Nitrofenyl-(3-pyridylmethyl)karbonát

N-Methylmorfolin (2,0 ml, 18,5 mmol) se po kapkách přidá k roztoku p-nitrofenylchloroformiatu (2,49 g, 12,3 mmol) v dichlormethanu (20 ml) za míchání pod atmosférou dusíku při teplotě 0 °C. Po 20 minutách se ledová vodná lázeň odstraní a směs se nechá ohřát až na teplotu místnosti. 3-pyridylkarbinol (1,0 ml, 10,3 mmol) se přidá ke směsi a výsledný roztok se míchá 30 minut. Reakční směs se naředí ethylacetatem a promyje se vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a roztokem chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší (MgSO₄) , zfiltruje a • · · * ·>*·«· «V* **·· 9 * ♦ · ♦ · · • * · a ♦ · · a · * _ 191 . · ·*·€ 9 « · ·>

1A1 · · ······ ·»«>···· ·r ··· ♦ · * ♦ · odpaří k získáni tamvě hnědé tuhé látky. Tuhá látka se rekrystaluje z ethylacetatu a heptanu k získání 4-nitrofenyl-(3-pyridylmethyl)karbonátu. ¹H NMR(CDC1₃) δ 5,32(s,

2H), 7,38 (m, 3H), 7,79 (m 1H), 7,28 (m, 2H), 8,66 (d, J = 4Hz, 1 H), 8,72 (s, 1 H).

b) 3-Pyridylinethyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamat]

4-Nitrofenyl-(3-pyridylmethyl)karbonáte (111 mg, 0,405 mmol) se přidá k roztoku 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (79 mg, 0,244 mmol) v pyridinu (1 ml), následuje katalytické množství Ν,Ν-dimethylpyridinu. Výsledná směs se míchá pod atmosférou dusíku při teplotě místnosti 2 dny. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se vyjme ethylacetatem. Organická vrstva se promyje, vysuší a odpaří. Tuhá látka se vyčistí preparativní TLC za použití směsi dichlormethan/methanol (95:5) jako mobilní fáze k získání 3-pyridylmethyl-[N- [4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-

-methoxyfenyl]karbamatu]. XH	NMR	(CDC13) δ 1,78 (m, 2H) ,
1, 90	(m, 4H),	2,26	(m, 2H),	3,91	(s, 3H), 5,25 (m, 5H),
6, 98	(s, 1H),	7,01	(s, 1H),	7,09	(d, J = 8 Hz, 1H) 7,32 (m,
1H) ,	7,77 (d,	J = 8	Hz, 1H),	8,20 (široký d, 1H), 8,32 (s,
1H) ,	8,64 (m,	1H) ,	8,70 (s,	1H) ;	LC/MS (MHX = 459).

3-Pyridylmethyl-[N- [4-(4-amino7-cyklopentyl-7Hc) Hydrochlorid 3-pyridylmethyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamatu] ·· ·· · · ···· ·· • · · · · · · ···

-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl) -2-methoxyfenyl]karbamat] (50 mg, 0,109 mmol) se rozpustí v ethylacetatu (3,0 ml). Směs se ochladí na teplotu 0 °C a půl minuty se probublává plynný chlorovodík. Ihned se vytvoří sraženina. Nádoba se uzavře a roztok se míchá dalších 10 minut při teplotě 0 °C. Tuhá látka se shromáždí filtrací k získání hydrochloridu 3-pyridylmethyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamatu]. ¹H NMR (DMSO-dg) δ 1,72 (m, 2H) , 1,93 (m, 4H) , 2,16 (m, 2H) , 3,87 (s, 3H), 5,15 (m, 1H), 5,26 (s, 1H), 7,06 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,14 (s, 1 H), 7,64 (d, J = 5 Hz, 1H) 7,81 (m, 2H), 8,10 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,66 (d, J = 5 Hz, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,87 (s, 1H); (MH⁺= 459).

Příklad 19

3-Chlorcyklohexyl-[N-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamat]

3-Chlorcyklohexylchloroformiat (34 mg, 0,186 mmol) se po kapkách přidá k míchanému roztoku 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (50 mg, 0,155 mmol) v pyridinu (1 ml) a dichlormethanu (1 ml) pod atmosférou dusíku při teplotě 0 °C. Po 10 minutách se ledová vodná lázeň odstraní a výsledná směs se míchá 4 hodiny. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se vyjme ethylacetatem. Organická vrstva se promyje, vysuší a odpaří. Tuhá látka se vyčistí preparativní TLC za použití směsi dichlormethan/methanol (95:5) jako mobilní fáze k získání 3-chlorcyklohexyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamatu]. ^ΤΗ NMR (CDCls) δ 1,46 (m, 2H) , 1,78 (m, 4H), 1,88 (m, 4H) , • ♦

2,00	(m,	2H), 2,28	- 123 - (m, 4H) , 3,93	(m,	• · · • • •	• · · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · · 4,84 (m, 1H),
4H) ,
5,22	(m,	1H), 5,27	(s, 2H), 6,97	(s,	1H) ,	7,03 (s, 1H),
7,08	(d,	J = 8 Hz,	1 H) , 7,31 (s,	1H)	, 8,	18 (široký d, 1H),
8,32	(s,	1 H); LC/MS (MH+ = 484) .

Příklad 20

N-(4 -(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)-N'-benzylmočovina

Benzylisokyanat (24 μΐ, 0,194 mmol) v dichlormethanu (1 ml) se po kapkách přidá k míchanému roztoku

5-{4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (50 mg, 0,155 mmol) v N,N-diisopropylethylaminu (153 μΐ, 0,881 mmol) a methylenchloridu (2 ml) pod atmosférou dusíku. Výsledná směs se míchá 24 hodin. Rozpouštědlo se odpaří a tuhá látka se vyčistí preparativní TLC za použití směsi dichlormethan/methanol (95:5) jako mobilní fáze k získání N-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)-N'-benzylmočoviny. ^XH NMR (CDCI3) δ 1,78 (m, 2H) , 1,90 (m, 4H) , 2,26 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 4,48 (d, J = 6 Hz, 3H), 5,24 (m, 4H), 6,93 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,04 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,29 (m, 5H), 8,17 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,31 (s, 1H) ; LC/MS (MH⁺ = 457) .

Příklad 21

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamat]

Směs 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H• · ·· ···· ········ ·« ··· ·· ···

-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (0,025 g, 0,08 mmol), benzylchloroformiatu (0,016 g, 0,09 mmol), pyridinu (0,50 ml) a dichlormethanu (0,50 ml) se míchá při teplotě místnosti přes víkend a vlije se do vody. Výsledná sraženina se shromáždí filtrací a vyčistí se bleskovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi ethylace-tat/n-heptan (9:1) jako mobilní fáze k získání benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamatu] jako bílé tuhé látky (0,002 g, 0, 004 mmol). ^XH NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8,64 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,34-7,45 (m, 6H), 7,10 (d, 1H), 7,02 (dd, 1H), 6,08 (široký, 2H), 5,16 (s, 2H), 5,08 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 2,11 (m, 2H), 1,91 (m, 4H), 1,69 (m, 2H) ; MH⁺ 458; TLC (ethylacetat) Rf 0,32; RPHPLC (Hypersil C18, 5 μπι, 200 A, 25 cm; 25% - 100% acetonitril - 0,lM octan amonný během 25 min, lml/min) R_t 19,00 min.

Příklad 22

Benzyl-[N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamat]

a) 5-Brom-2-methoxyanilin

Směs 4-brom-l-methoxy-2-nitrobenzenu (3,0 g, 12,9 mmol) a ledové kyseliny octové (25 ml) se zahřívá na teplotu 100 °C pod atmosférou dusíku. Přidá se práškové železo (2,2 g, 38,8 mmol) a směs se 1 hodinu míchá při teplotě 100 °C. Směs se ochladí na teplotu místnosti, poté se přidá voda (100 ml) a směs se extrahuje ethyl-acetatem (3 x 25 ml). Spojené organické extrakty se promyjí

- 125·· ·· ·· ···· · · · • · · · 4 · · *··« • · ····· ·· « * ···· ·«·· · • · ·· ···· ········ ·· ··· ·· ··· nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3 x 25 ml) a poté roztokem chloridu sodného. Organický roztok se vysuší síranem horečnatým, zfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku. Vyčištění materiálu bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (6:4) jako eluentu poskytne 5-brom-2-methoxyanilin (2,0 g) . ^XH NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 6,76 (s, 1H) , 6,71 (d, 1H), 6,61 (d, 1H), 4,99 (široký s, 2H), 3,74 (s, 3H) ; (TLC (heptan/ethylacetat 1:1) Rf 0,5; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r =13,33 min.; MS: MH⁺ 443.

b) terč.-Butyl-[N-(5-brom-2-methoxyfenyl)karbamat]

Směs 5-brom-2-methoxyanilinu (1,50 g, 7,43 mmol) a di-terc.-butyldikarbonatu (1,95 g, 8,91 mmol) v THF (20 ml) se při teplotě zpětného toku zahřívá 20 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti a poté se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku. Výsledný olej se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetat/heptan (1:9) jako eluentu k získání terc.-butyl-[N-(5-brom-2-methoxyfenyl)karbamatu] (2,19g) jako bezbarvého oleje. ^XH NMR (DMSO-d₅, 400 MHz) δ 8,05 (s, 1H) , 7,93 (d, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,95 (d, 1H), 3,8 (s, 1H), 1,47 (s, 9H); TLC (ethylacetat/heptan 2:8) R_f 0,4; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_R = 21,8 min.

c) terč. -Butyl-[N- [2-methoxy-5- (4,4,5, 5-tertamethyl-l, 3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl] karbamat] • · · · · · ···· • · * · · · · · • · ····· · - 126 - ♦······· · · · a * .

Směs terč . -butyl-[N- (5-brom-2-methoxyfenyl) karbamatu] (1,10 g, 3,64 mmol), diborpinakolesteru (1,11 g, 4,37 mmol), komplexu [1,1’-bis(difenylfosfino)ferrocen]dichlorpalladia(II) s dichlormethanem (1:1) (0,09 g, 0,11 mol) a octanem draselným (1,07 g, 10,9 mol) v N,N-dimethylformamidu (20 ml) se zahřívá na teplotu 80° C pod atmosférou dusíku 16 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. K odparku se přidá dichlormethan (20 ml) a výsledná tuhá látka se odstraní filtrací přes podložku z rozsivkové zeminy. Filtrát se odpaří k poskytnutí žlutého oleje, který se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi ethylacetat/heptan (2:8) jako mobilní fáze k získání terč.-butyl-[N-[2-methoxy-5-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamatu] (0,96 g) . ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,03 (s, 1H) , 7,86 (s, 1H) , 7,35 (d, 1H), 7,0 (d, 1H), 3,82 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,28 (s, 12H) ; TLC (ethylacetat/heptan 2:8) R_f - 0,35; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r 22,8 min.

d) terč.-Butyl-[N- (5-(chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamat]

Směs 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (0,35 g, 1,0 mmol), terč.-butyl-[N-[2-methoxy-5-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl] karbamatu (0,524 g, 1,5 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladia (0,07 g, 0,06 mmol) a uhličitanu sodného (0,265 g, 2,5 mmol) se zahřívá ve směsi dimethylether

- 127 ethylenglykolu (10 ml) a vody (5 ml) j5ř’i’*£fe*ploťě’8Ό °0··18··· hodin pod atmosférou dusíku. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozdělí mezi vodu (15 ml) a ethylacetat (25 ml), organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se dále extrahuje ethylacetatem (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty se promyjí vodou (3 x 20 ml), poté vysuší síranem hořečnatým, zfiltrují a filtrát.se odpaří na olejový odparek za sníženého tlaku. Materiál se vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi heptan/ethylacetat (5:1) jako eluentu k získání terč.-butyl-[N-(5-(chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamatu] (0,325 g) . ^XH NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,64 (s, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,87 (m, 2H), 7,17 (d, 1H), 7,06 (d, 1H), 5,21 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 1,65-2,25 (m, 8H), 1,45 (s, 9H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 24,25 min. MS: MH⁺ 443.

e) 5-(3-Amino-4-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-4-amin

Roztok terč.-butyl-[N-(5-(chloro-7-cyklopentyl— -7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamatu] (0,325 g, 0,735 mmol) v dichlormethanu (14 ml) se ochladí na teplotu 0°C, poté se zpracuje kyselinou trifluoroctovou (1,4 ml). Roztok se míchá při teplotě 0 °C 5 minut, poté se ohřeje na teplotu místnosti a míchá dalších 16 hodin. Rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku, poté se odparek rozdělí mezi dichlormethan (30 ml) a nasycený vodný roztok ···· ··· ··· • · ····· ··

- 128hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Organický roztok se vysuší se síranem horečnatým, zfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku na pěnu. Materiál se poté rozpustí v dioxanu (4 ml) a koncentrovaném (28 až 30 %) hydroxidu amonném (4 ml) a výsledný roztok se zahřívá na teplotu 120 °C v uzavřené tlakové zkumavce 20 hodin. Rozpouštědla se odpaří a odparek se vyčistí preparativní C18 RP-HPLC k získání, po lyofilizaci, 5-(3-amino-4-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (85 mg).

1H NMR (DMSO-de, 400 MHz) δ 8,10 (s, 1H) ,	7,21	(s, 1H) , 6,87
(d, 1H), 6,74 (s,lH), 6,58 (d, 1H) , 5,06	(1H,	m) , 4,87
(široký s, 2H), 3,8 (s, 3H), 1,6-2,2 (m,	8H) ;	RP-HPLC
(Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μπι, 200A,	250	x 4,6 mm; 2 5

až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r=ll,87 min.; MS: MH⁺ 324.

f) Benzyl-[N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamat]

Roztok 5-(3-amino-4-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (40 mg, 0,124 mmol) v dichlormethanu (1 ml) a pyridinu (1 ml) se ochladí na teplotu 0 °C a poté se zpracuje benzylchloroformiatem (32 mg, 0,186 mmol), přičemž se teplota udržuje nižší než 5°C. Roztok se míchá další 1 hodinu při teplotě 0 °C, poté se rozpouštědla odpaří za sníženého tlaku. Vyčištění preparativní C-18 RP-HPLC, poté lyofilizace, poskytne benzyl-[N-[5-(4-amino7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamat] (25 mg) jako bílý prášek. ^XH NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,75 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,1-7,4 (m, 8H), 6,2 (široký s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,07 (m, 1H), 3,8 (s 3H), 1,6-2,2 (m, 8H), • · · · · · • · · · ···· • · ····· ·· ·

OQ · · · · · ♦··· ·

- · · ······ ········ ·· ··· ·· ···

RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 gm, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r=18,63 min.; MS: MH⁺ 458.

Příklad 23

Benzyl-[N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamat]

a) terč. -Butyl-[N- (5-brom-2-pyridyl) karbamat]

Sloučenina se připraví z 5-brom-2-pyridinaminu způsobem popsaným pro sloučeninu (2). NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 5 9,96 (s, 1H), 8,49 (d, 1H), 7,93 (dd, 1H), 7,78 (d, 1H) , 1,47 (s, 9H) ; TLC (ethylacetat/heptan 5:95) R_f 0,28; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μιη, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 18,50 min.

b) terč.-Butyl-[N- [5- (1,1,1-trimethylstannyl)-2-pyridyl]-karbamat]

Směs terč. -butyl-[N- (5-brom-2-pyridyl) karbamatu] (1,67 g, 6,12 mmol), hexamethylditinu (2,0 g, 6,12 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)palladia (0,424 g, 0,367 mmol) v dimethyletherethylenglykolu (30 ml) se zahřívá na teplotu 80 °C pod atmosférou dusíku for 15 hodiny. Směs se ochladí na teplotu místnosti a poté se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku. Výsledný materiál se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (95:5) jako eluentu k získání terc.-butyl-[N-[5-(1,1,1-trimethylstannyl)-2-pyridyl)karbamatu] (1,11 g) .

• · *· • · · · < « · · · • · ····· · · ^aH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 9,98 (s, 1H) , 8,2 (t, 1H) , 7,74 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 0,30 (t, 9H); TLC (heptan/ethylacetat 95:5) R_f 0,2; MS: MH⁺ 359.

c) terč.-Butyl-[N- [5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamat]

Směs 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (0,25 g, 0,72 mmol), terč.-butyl-[N-[ 5-(1,1,1-trimethylstannyl)-2-pyridyl)karbamatu] (0,386 g, 1,08 mmol), tetrakis(dibenzylidenaceton)dipalladia(0) (0,033 g, 0,076 mmol) a trifenylarsinu (0,055 g, 0,18 mmol) v N,N-dimethylformamidu (8 ml) se zahřívá na teplotu 65 °C pod atmosférou dusíku 18 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti a poté se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku. Výsledný materiál se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (75:25) jako eluentu k získání terč.-butyl-[N-[5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl) -2-pyridyl]karbamatu] (0,13

g) . ^XH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 9,83 (s, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,40 (d, 1H) , 8,02 (s, 1H), 7,85-7,93 (m, 2H), 5,21 (m, 1H), 1,65-2,25 (m, 8H), 1,49 (s, 9H); TLC (heptan/ethylacetat 8:2) R_t 0,18; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r= 21,68 min.

d) 5-(4-Chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridin-4-amin

Roztok terč.-butyl-[N-[5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl) -2-pyridyl]karbamatu] (0,13 g, 0,315 mmol) v dichlormethanu (5,5 ml) se ochladí na

- 131 • · ·· ·« ·»«· ·· · *·♦· ··« 4 ·· · * · · > · · · · »« • ·♦·* · « · «· * · ♦· « 9 1· ·«···»·· ·· ··· «· »·« teplotu 0 °C, poté se zpracuje kyselinou trifluoroctovou (0,6 ml). Roztok se míchá při teplotě 0 °C 5 minut, poté se ohřeje na teplotu místnosti a míchá dalších 18 hodin. Rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku, poté se odparek rozdělí mezi dichlormethan (30 ml) a-, nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým zfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku k získání 5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidín-5-yl)-2-pyridin-4-aminu (92 mg). RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μπι, 200A,250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 10,73 min; MS: MH⁺ 314.

e) 5-(6-Amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin

5-(4-Chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridin-4-amin (92 mg, 0,291 mmol) se rozpustí v dioxanu (2 ml) a koncentrovaném (28 až 30 %) m roztoku hydroxidu amonného (2 ml) a výsledný roztok se zahřívá na teplotu 120 °C v uzavřené tlakové zkumavce 24 hodin. Rozpouštědla se odpaří k získání 5-(6-amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (105 mg). RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μιη, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r - 6,33 min.; MS: MH⁺ 295.

f) N-[5-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamat

Roztok 5-(6-amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidín-4-amínu (105 mg, 0,29 mmol) v dichlormethanu (1,5 ml) a pyridinu (1,5 ml) se ochladí na f ·

-132- : : :

········ ·· ·«· ·· teplotu 0 °C a poté se zpracuje benzylchloroformiatem (75 mg, 0,44 mmol), zatímco se teplota udržuje nižší než 5 °C. Roztok se ohřeje na teplotu místnosti, poté se míchá 3 hodiny. Přidá se benzylchloroformiat (75 mg, 0,44 mmol) a směs míchá 18 hodin, přidá se další benzylchloroformiat (75 mg, 0,44 mmol) a směs se míchá další 24 hodiny. Přidá se benzylchloroformiat (150 mg, 0,88 mmol) a pyridin (1 ml) a směs se míchá další 24 hodiny. Rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku, poté se odparek rozdělí mezi ethylacetat (25 ml) a vodu (10 ml). Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku. Vyčištění preparativní C-18 RP-HPLC, poté triturace diethyletherem poskytne N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl] karbamat (21 mg) jako bílý prášek. ¹H NMR (DMSOd₆, 400 MHz) δ 10,33 (s, 1H) , 8,36 (d, 1H) , 8,14 (s, 1H) , 7,91 (d, 1H), 7,84 (d, 1H), 7,33-7,47 (m, 6H), 6,11 (široký s, 2H) , 5,2 (s, 2H), 5,06 (m, 1H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 16,22 min; MS: MH⁺ 429.

Příklad 24

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-5-yl)-3-methoxyfenyl]karbamat]

a) 4-Brom-3-methoxyanilin

Směs l-brom-2-methoxy-4-nitrobenzenu (3,0 g, 12,9 mmol) a ledové kyseliny octové (25 ml) se zahřívá na teplotu 100 °C pod atmosférou dusíku. Přidá se práškové železo (2,2 g, 38,8 mmol) a směs se míchá 1 hodinu míchá • · · 5 · · · · · ··· • · · · ···· · * • · · · · · ·· ·

-133- ······· ········ · · ··· · · · při teplotě 100 °C. Směs se ochladí na teplotu místnosti, přidá se voda (100 ml)a směs se poté extrahuje ethylacetatem (3 x 25 ml). Spojené organické extrakty se promyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3 x 25 ml) a poté roztokem chloridu sodného. Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku. Vyčištění materiálu bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (6:4) jako eluentu poskytne 4-brom-3-methoxyanilin (1,22 g). ^:Η NMR (DMSO-Č6, 400 MHz) δ 7,1 (d, 1H), 6,31 (s, 1H), 6,1 (d, 1H) , 5,27 (široký s, 2H), 3,72 (s, 3H); TLC (heptan/ethylacetat 1:1) R_t 0,33; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r= 11,05 min.

b) terč.-Butyl-[N- (4-brom-3-methoxyfenyl)karbamat]

Sloučenina se připraví z 4-brom-3-methoxyanilinu způsobem popsaným pro sloučeninu (2). ¹H NMR (DMSO-de, 400 MHz) δ 9,46 (s, 1H), 7,4 (d, 1H), 7,35 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 3,78 (s, 3H), 1,48 (s, 9H); TLC (heptan/ethylacetat 8:2) R_f 0,37; RPHPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μπι, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r - 18,60 min.

c) terč.-Butyl-[N-[3-methoxy-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamat

Sloučenina se připraví z terč.-butyl-[N-(4-brom-3-methoxyfenyl)karbamatu] způsobem popsaným pro sloučeninu (3). ²H NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 9,44 (s, 1H), 7,41 (d, 1H) , • · ·· ·· · · · ·· · « · · * · · ·· · * • · ····*· ·

- 134 ” ······· ·······» ·· · · · «· ·

7,17 (s, 1H), 7,01 (d, 1H), 3,68 (s, 3H), 1,48 (s, 9H),

1,24 (s, 12 H); TLC (heptan/ethylacetat 8:2) R_f 0,28; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μη, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r= 18,83 min.

d) terč.-Butyl-[N-[4-(4-(chloro-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3-methoxyfenyl)karbamat]

Sloučenina se připraví z terč. -butyl-[N- [3-methoxy-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl) fenyl]karbamatu] a 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu způsobem popsaným pro sloučeninu (4). ^XH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 9,41 (s, 1H) , 8,59 (s, 1H) , 7,72 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,15 (d, 1H), 7,04 (d, 1H) , 5,17 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 3H), 1,49 (s, 9H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 gm, 200A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 21,22 min; MS: MH⁺ 4 43.

e) Benzyl-[N- [4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d] pyrimidin-5-yl) -3-methoxyfenyl]karbamat]

Sloučenina se připraví z terč.-butyl-[N-[4-(4-(chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[ 2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3— -methoxyfenyl)karbamatu] způsobem popsaným pro konversi sloučeniny (4) na sloučeninu (6). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz)

δ 9,87 (s,	1H) , 8,08 (s, 1H),	7,34-7,45 (m, 6H),	7,09-7,18
(m, 3H), 5,	79 (široký s, 2H),	5,18 (s	, 2H), 5,04	(m, 1H) ,
3,7 (s, 3H)	, 1,6-2,2 (m, 8H);	RP-HPLC	(Hypersil	HyPurity
Elitě C18,	5 μιτι, 200 A, 250 x	4,6 mm;	25 až 100%

• 9 ···· ··· ··· * * ····· ·· “135“ · « ·· ··» ······· ·· ·· · · · acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 16,87 min; MS: MH⁺ 458.

Příklad 25

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) -2-fluorfenyljkarbamat]

a) 4-[[ (7-cyklopentyl-5- (4,4,5,5-tetramethyl-l, 3,2—dioxa borolan-2-yl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)amino]- (2,4-dimethoxyfenyl)methyl]fenoxypryskyřice

Umělá amidová pryskyřice (4-(2',4'-dimethoxyfenyl-Fmoc-aminomethyl)fenoxypryskyřice s náloží 0,66 mmol/g) (6,55 g, 4,32 mmol) se zbaví chránících skupin promytím N,N-dimethylformamidem (2x2 min), 20% piperidinem v N,N-dimethylformamidu (1x5 min, 1 x 15 min), N,N-dimethylformamidem (5x2 min), dichlormethanem (3x2 min) a poté methanolem (3x2 min). Pryskyřice se vysuší při teplotě 40 °C za sníženého tlaku. Pryskyřice s odstraněnými chránicími skupinami, 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (1,80 g, 5,19 mmol), dimethylsulfoxid (100 ml) a N,N-diisopropylethylamin (4,5 ml) se 3 dny zahřívají na teplotu 100 °C, ochladí na teplotu místnosti a poté se pryskyřice shromáždí filtrací a promyje se N,N-dimethylformamidem. Pryskřice se poté míchá 30 minut s kyselinou octovou (0,13g, 2,16 mmol), O-benzothiazol-l-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorboratem (0,69g, 2,16 mmol), N,N-diisopropylethylaminem (0,56g, 4,32 mmol) a N,N-dimethylformamidem (30 ml). Pryskyřice se shromáždí filtrací a promyje se N,N-dimethylformamidem, dichlormethanem a methanolem. Pryskyřice se suší do konstantní hmotnosti (6,25 g) za sníženého tlaku. Prysky• · · ·

- 136 - ······· ········ ·· · · · ·« řiče, diborpinakolester (1,11 g, 4,37 mmol), octan draselný (0,822g, 8,39 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)palladium (0,24 g, 0,21 mmol) v dimethylsulfoxidu (125 ml) se zahřívají na teplotu 85 °C pod atmosférou dusíku 17 hodin. Pryskyřice se shromáždí filtrací, poté se promyje N,Ndimethylformamidem, dichlormethanem, ethylacetatem a poté etherem. Pryskyřice se suší za sníženého tlaku na hmotnost 5,49 g.

b) Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl]karbamat]

Směs 4-[ [(7-cyklopentyl-5-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl) amino]- (2,4-dimethoxyfenyl)methyl]fenoxypryskřice (0,5 g, 0,254 mmol), 4-brom-2-fluoranilin (0,484 g, 2,54 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladium (0,044 g, 0,038 mmol), 2M vodný roztok fosforečnanu draselného (1,27 ml, 2,54 mmol) a dimethylsulfoxid (10 ml) se zahřívají na teplotu 85 °C 18 hodin. Směs se ochladí pryskyřice se shromáždí filtrací, poté se promyje N,N-dimethylformamidem a dichlormethanem. Pryskyřice se poté vystaví kondenzačním podmínkám popsaným výše podruhé. Pryskyřice se suspenduje v dichlormethanu (2 ml) a pyridinu (2 ml), poté se směs ochladí na teplotu 0 °C a vystaví se působení benzylchloroformiatu (0,44 g, 2,6 mmol). Po míchání při teplotě 0 °C 1 hodinu se směs nechá ohřívat na teplotu místnosti 18 hodin. Pryskyřice se shromáždí filtrací, poté se ošetřuje 5% kyselinou trifluoroctovou v dichlormethanu (10 ml) 30 minut. Odstranění pryskyřice filtrací poskytne a filtrát, který se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku, který se vyčistí preparativní C-18 RP-HPLC k získání benzyl-[N- 137·· · · · · · · ·· • · · · · r · • · ····· ·· • · · · · · ····· · · · · · ·· ·

-[4(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl]karbamatu] (přibližně 10 mg): RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r = 11,47 min; MS: MH⁺ 446.

Příklad 27

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-(trifluormethyl)fenyl]karbamat]

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jak je popsáno pro příklad 25. RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r= 12,07 min; MS: MH⁺ 496.

Příklad 28

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-kyanfenyl]karbamat]

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jak je popsáno pro přiklad 25. RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 pm, 100A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r = 10,93 min; MS: MH⁺ 453.

Příklad 29

Methyl-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) -2-[ [ (benzyloxy) karbony 1] amino]benzoat

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jak • ·

- 138je popsáno pro přiklad 25. RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 pm,

100A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,lM octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r = 13,28 min; MS: MH⁺ 486.

Příklad 30

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-5-yl)-2-methylfenyl]karbamat]

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jak je popsáno pro příklad 25. RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 μπι, 100A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,lM octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r = 11,25 min; MS: MH⁺ 442.

Příklad 31

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-5-yl)fenyl]karbamat]

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jak je popsáno pro příklad 25. RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 μη, 100A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,lM octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r = 11,27 min; MS: MH⁺ 42 8.

Příklad 32

N-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]fenylmethansulfonamid

5-(4-Amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin (27 mg, 0,083 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (0,8 ml). Přidá se pyridin (0,8 • · » · · · · · * ··· • · ····· ·· αο ········· i jy - ······· ········ ·· ··· · · · ml), následuje -fenylmethansulfonylchlorid (19 mg, 0,105 mmol). Po celonočnim mícháni se přidá 19 mg fenylmethansulfonylchloridu a reakční směs se míchá přes noc.

Rozpouštědlo se odpaří a odparek se vyčistí preparativní chromatografií na tenké vrstvě při eluci směsí dichlormethan/methanol (95:5) k získání N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]fenylmethansulfonamidu (9 mg, 0,0188 mmol). ^XH NMR (DMSO-de) δ 1,89 (m, 6H) , 2,28 (m, 2H) , 3,85 (s, 3H) , 4,38 (s, 2H), 5,23 (m, 3H), 6,08 (široký s, 1H), 6,99 (m, 2H), 7,27, (m, 2H), 7,33 (m, 3H), 7,58 (d, J= 8,17 Hz, 1H) ,

8,34 (s, 1H). LC/MS MH⁺ = 478.

Příklad 33

NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-2-fenylacetamid

5-(4-Amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin (28mg, 0,086 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (1 ml). Přidá se pyridin (1 ml), následuje 2-fenylethanoylchlorid (14 μΐ, 0,105 mmol). Po celonočnim míchání se přidá dalších 14 μΐ fenylmethansulfonylchloridu a reakční směs se míchá přes noc. Rozpouštědlo odpaří a odparek se vyčistí preparativní chromatografií na tenké vrstvě při eluci směsí dichlormethan/methanol (95:5) k získání NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-2-fenylacetamid (7 mg, 0,0158 mmol). ^XH NMR (DMSO-d₆) δ 1,89 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,79 (s,2H), 5,21 (m, 1H), 5,56 (široký s, 2H), 6,89 (s, 1H), 6,99 (s, 1H), 7,05(d, J = 8,22, 1H), 7,36 (m, 5H), 7,81 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,43 (d, J = 8,23 Hz, 1H).

• · • · • · ···· · · · * · · • · ····· · ·

-140- : · : :

Přiklad 34

NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-5-yl)-2-methaxyfenyl]-2-(2-thienyl)acetamid

5-(4-Amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin (31 mg, 0,096 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (1 ml). Přidá se pyridin (1 ml) , následuje 2-(2-thienyl)ethanoylchlorid (14 μΐ, 0,113 mmol). Po celonočním míchání se přidá dalších 14 μΐ 2-(2-thienyl)ethanoylchloridu a reakční směs se míchá přes noc. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se vyčistí preparativní chromatografií na tenké vrstvě při eluci směsí dichlormethan/methanol (95:5) k získání NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-2-(2-thienyl)acetamidu (14 mg, 0,031 mmol). ¹H NMR (DMSO-dg) δ 1,89 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,99 (s, 2H), 5,19 (široký s, 2H), 5,21 (m, 1H), 6,93 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 7,06 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 8,02 (s, 1H) , 8,32 (s, 1H), 8,42 (d, J = 8,22 Hz, 1H). LC/MS MH⁺ = 448.

Příklady 35 až 108 (Obecný způsob)

Příklady uvedené v tabulce J se připraví reakcí fenolu s fluorbenzenem uvedeným v tabulce I podle schématu uvedeného dále.

^100 • · • · · · • ·

- 141 -

Ri je isopropyl, Rioo je uveden dále.

5-(4-Hydroxyfenyl)-7-isopropylpyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin (1 molární ekvivalent) se jako zásobní roztok v N,N-dimethylformamidu (6 g ve 240 ml) přidá ke směsi fluorbenzenu (1,25 molárních ekvivalentů) a uhličitanu draselného (2 molární ekvivalenty) do přepážkou uzavřené zkumavky pomocí automatického dávkovače kapalin Gilson 215. Reakční směsi se zahřívají za současného třepání na teplotu 120 °C 4 hodiny a na teplotu 140 °C další 1 hodinu a poté se odpaří do sucha v odstředivkové sušárně.

Odparky se rozpustí ve směsi ethylacetat/triethylamin (1 ml) (9:1) a eluují se přes podložku z rozsivkové zeminy (3 g SÍO2: 12 mm průměr x 20 mm výška) směsí 9:1 ethylacetat/triethylamin (4x2 ml). Spojené eluenty ze sloupců se odpaří k získání produktů jako voskovitých tuhých látek, povlaků nebo expandovaných pěn.

• ·

- 142-

Tabulka I

Příklad č.	Použitý fluorbenzen
35	4-fluor-3-(trifluormethyl)benzaldehyd
36	3-chlor-4-fluoracetofenon
37	3-chlor-4-fluorbenzaldehyd
38	4-fluoracetofenon
39	4-fluorbenzaldehyd
40	2-fluor-5-(trifluormethyl)propiofenon
41	2-fluor-3-(trifluormethyl)acetofenon
42	3-kyan-4-dimethylamin-2-fluorbenzaldehyd
43	2-fluor-3-(trifluormethyl)benzaldehyd
44	2-fluor-4-methoxyacetofenon
45	4-chlor-2-fluorbenzaldehyd
46	2,5-difluoracetofenon
47	2-fluor-5-methoxybenzaldehyd
48	2-fluor-4-methoxybenzaldehyd
49	2-fluorpropiofenon
50	2,3-difluorbenzaldehyd
51	2-fluoracetofenon
52	2-fluorbenzaldehyd
53	4-fluor-3-(trifluormethyl)propiofenon
54	(4-fluorfenyl)-(2-thienyl)keton
55	4-fluor-2-(trifluormethyl)acetofenon
56	4-fluor-2-(trifluormethyl)benzaldehyd
57	4'-fluor-1'-acetonafton
58	4-fluor-2-methoxybenzaldehyd
59	2-fluor-4-(trifluormethyl)propiofenon
60	2-fluor-4-(trifluormethyl)acetofenon
61	5-fluor-1-indanon

• · • · · β · · · · · · «··· · · · · · · • · ····« · · · · · · · ····

- 143 - ·······

Tabulka I - pokračování

62	4-chlor-2-fluor-5-methylacetofenon
63	2-fluor-5-nitrobenzaldehyd
64	4-(4-fluorbenzoyl)-1-methyl pyrrol-2-aldehyd
65	4'-fluor-2-(methylsulfonyl)acetofenon
6 6	2-fluor-l-indanon
67	2-amin-5-chlor-2'-fluorbenzofenon
68	2'-fluor-5'-nitroacetofenon
69	4-fluor-3-(trifluormethyl)benzonitril
70	3-chlor-4-fluorbenzonitril
71	2-chlor-4-fluorbenzonitril
72	3,4-difluorbenzonitril
73	4-fluorbenzonitril
74	2-fluor-6-(4-methylfenylthio)benzonitril
75	2-fluor-6-(2-pyridylthio)benzonitril
76	2-fluor-6-(methoxykarbonylmethylthio)benzonitril
77	2-fluor-3-(trifluormethyl)benzonitril
78	2-fluor-5-(trifluormetyl)benzonitril
79	2-fluor-6-(1-pyrrol)benzonitril
80	2-fluor-5-nitrobenzonitrii
81	2-fluorbenzonitril
82	5-fluor-2-nitrobenzaldehyd
83	4-fluor-3-nitrofenylmethylsulfon
84	4-fluor-3-nitrobenzotrifluorid
85	2'-chlor-4'-fluoracetonfenon
86	4'-fluor-2'-methylacetonfenon
87	3-fenyl-7-fluorindan-l-on
88	2-fluor-6-(trifluormethyl)acetonfenon
89	1 —fluor-9-fluorenon
90	6-fluorveratraldehyd

• · · ·

- 144• · ·· ·· «··· · ♦ * · · · • · ····· · · • · · · · · · ··· ·· ··· ·· ···

Tabulka I - pokračování

91	2-fluor-5-methylacetonfenon
92	2-fluor-6-(2-oxo-azepin-3-ylamin)benzonitril
93	2-fluor-6-(4-karbamoylpiperídin-l-yl)benzonitril
94	2-f luor-6-[3- (imidazol-l-yl) propylaminjbenzonitril
95	2-fluor-6-[2- (4-pyridyl) ethylamin]benzonitril
96	2-fluor-6-(2-thienylmethylamin)benzonitril
97	2-fluor-6-(4-kyanopiperidin-l-yl)benzonitril
98	2-fluor-6-(3-pyridylmethylamin)benzonitril
99	2-fluor-6-(4-methylfenoxy)benzonitril
100	2-fluor-6-thiamorfolinbenzonitrii
101	2-f luor-6-[ (3-dimethylethyamin) propylamin]benzo- nitril
102	2-fluor-6-(2,2,2-trifluorethoxy)benzonitril
103	2-fluor-6-(3-methoxypropylamin)benzonitril
104	2-dimethylamin-6-fluorbenzonitril
105	2-fluor-5-methoxybenzonitrii
106	2,5-difluorbenzonitril
107	2-fluor-5-nitrobenzotrifluorid
108	3-chlor-4-fluor-5-nitrobenzotrifluorid

Získané produkty jsou ukázány v tabulce J. Ri₀o má význam uvedený výše.

Podmínky použité při LCMS jsou uvedeny dále. HPLC RT (minuty) znamená retenční čas HPLC v minutách.

Produkt

Ra ·· «· ·« · · · · ·· · • · · · · * » ···· • · ····· · · · 145- :·: : :

·····«·· ·· ··· ·· ···

Tabulka J

	Př.	Produkt j
	Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLCRT Minuty
35	cf3	H	CHO	H	H	4,45
	36	Cl	H	coch3	H	H	4.44	1 i
37	Cl	H	CHO	H	H	4r4
38	H	H	COCHj	H	H	4,13
39	H	H	CHO	H	H
40	COC2HS	H	cf3	H	H	4f91
41	coch3	H	H	H	cf3	4,35
42	CHO	H	H	N(CH3)2	CN	3,88
43	CHO	H	H	H	cf3	4,39
44	COCH3	H	H	OCH3	H	4,16
45	CHO	H	H	q	H	4,57
46	COCH3	H	F	H	H	4,29
47	CHO	H	och3	H	H	4,27
48	CHO	H	Η	OCH3	H	4,12
49	COC2H5.	H	H	H	H	4,46
50	CHO	H	H	H	F	4,12
51	COCH3	H	H	H	H	4,14
52	CHO	H	H	H	H	4,15
53	cf3	H	COC2H5	H	H	5,61
54	H	H	2-ThCO 1	H	H	5,37
55	H	cf3	coch3	H	H	5,17
56	H	cf3	CHO	H	H	5,40

- 146-

Př.	Produkt,
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLCRT (minuty) i
57	H	H	COCH3	-CH=CH-CH=CH- 2	5f42
58	H	OCH3	CHO	H	H	4,64
59	COC2H5	H	H	cf3	H	5(63
60	COCH3	H	H	cf3	H	5,28
61	coch3	H	cf3	H	H	5,38
62	COCH3	H	ch3	Cl	H	5f57
63	CHO	H	no2	H	H	4,74
64	H	H	P3	H	H	4,17
65	H	H	COCH2SO 2CH3	H	H	3,73
66	H	-CH2-CH2-CO-	H	H	4,00
67	COA4	H	H	H	H	4,80
68	coch3	H	no2	H	H	4,25
69	cf3	H	CN	H	H	4,51
70	Cl	H	CN	H	H	4,74
71	H	Cl	CN	H	H	4,52
72	F	H	CN	H	H	4,22
73	H	H	CN	H	H	4t21
74	CN	4-methyl— fenylthio	H	H	H	5,25

- 147-

Př.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLCRT (minuty)
75	CN	2-pyridylthio	H	H	H	4,29
76	CN	Methoxykarbonyimethylthio .	H	H	H	4f85
77	CN	H	H	H	cf3	4,31
78	CN	H	cf3	H	H	4(51
79	CN	Pyrrol-l-yl	H	H	H	4,47
80	CN	H	no2	H	H	4,14
81	CN	H	H	H	H	4,09
82	H	CHO	no2	H	H	4,22
83	no2	H	so2ch3	H	H	3,78
84	no2	H	cf3	H	H	4,60
85	H	Cl	COCHj	H	H	4,39
86	H	ch3	COCH3	H	H	4,96
87	3-fenyHndan-1 -on-7-yl,	H	H	H	5,57
88	COCH3	cf3	H	H	H	5,23
89	Fluoren-9-on ~ 1 -yl	H	H	H	5,23
90	CHO	H	och3	och3	H	4,20
91	coch3	H	ch3	H	H	5,02
92	CN	2-oxoazepin-3- •ylamino	H	H	H	4,47
93	CN	4-karbamoyl	H	H	H	3f81

• ·

- 148-

Př.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLCRT (minuty)
		piperidin-l-yl
94	CN	3-(imidazol-lyl)propylamino	H	H	H	3,56
95	CN	2-(4-pyridyl)ethylamino	H	H	H	4j36
96	CN	2-thienyl' methy lamino	H	H	H	5,32
97	CN	4-kyan piperidin-l-yl	H	H	H	oo kO
98	CN	3-pyridylmethylamino	H	H	H	4,22
99	CN	4- methyl*fenoky	H	H	H	4,89
100	CN	Thiamorfolino	H	H	H	5,32
101	CN .	3-(dimethyH amino)propyl~ amino	H	H	H	3,35
102	CN	OCH2CF3	H	H	H	5f01
103	CN	3-methoxypropylamino	H	H	H	4,92
104	CN	N(CH3),	H	H	H	4ř91
105	CN	H	OCH3	H	H	4,75

- 149• · ·· ···· • · · · · · • · · · · · · • · · • · · ·· ···

Př.	Produkt
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLCRT (minuty)
106	CN	H	F	H	H	4f74
107	cf3	H	no2	H	H	5,51
108	no2	H	cf3	H	Cl	5,56

^RT ^_ Retenční čas v minutách.

= 2-Thenoyl

2· ~ Kondenzovaný kruh k získání naftylové skupiny ³· ^{p =} 2-formyl-l-methylpyrrol-4-ylkarbonyl

4· A = 2-amino~5-chlorfenyl

Sloučeniny připravené v příkladech 35 až 108 jsou následuj ící.

Příklad 35

4-[4-(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-trifluormethyl-benzaldehyd

Příklad 36

4-[4-(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-chloracetofenon

Příklad 37 • · • · ···· ······ • · ······ ·

- 150 - ·· · · · ··

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-chlorbenzaldehyd

Přiklad 38

4- [ 4- (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy]acetofenon

Příklad 39

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzaldehyd

Příklad 40 ' - [4- (4-amin-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy]-5' -trifluormethylpropiofenon

Příklad 41

2'-[4-(4-amin-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-y1)fenoxy]-3'-trifluormethylacetofenon

Příklad 42

- [ 4 - (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-y1)fenoxy]-3-formyl-6-dimethylaminobenzonitril

Příklad 43

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-trifluormethylbenzaldehyd

- 151 - ·· ·.....

···· ···· ·· ··· ·· ···

Příklad 44

2'- [4 - (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4'-methoxyacetofenon

Příklad 45

2- [4- (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-chlorbenzaldehyd

Příklad 46

2'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-fenoxy]-5'-fluoracetofenon

Příklad 47

2'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-methoxyacetofenon

Příklad 48

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-methoxybenzaldehyd

Příklad 49

2’ — [ 4 — (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]propiofenon

Příklad 50 • · · ·

- 1522-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5

-yl)fenoxy]-3-fluorbenzaldehyd

Přiklad 51

2'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]acetofenon

Příklad 52

- [ 4 - (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy]benzaldehyd

Přiklad 53 ' - [4- (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-trifluormethylpropiofenon

Příklad 54

- { 4 - (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d] pyrimidin-5-yl) fenoxy]fenyl-2-thienylketon

Příklad 55

4'-(4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy]-2 ' -trifluormethylacetofenon

Příklad 56

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-trifluormethyl-benzaldehyd • · • · • · • · · · · · ·· · • · ······ ·

- 153 - · ········ ¹ * · · · · · · ········ · · ··· ··

Přiklad 57

4¹ -[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-1'-acetonafton

Příklad 58

4-(4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-methoxybenzaldehyd

Příklad 59

2—[4 —(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-y)fenoxy]-4-trifluormethylpropiofenon

Příklad 60

2- {4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-trifluormethylacetofenon

Příklad 61

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-trifluormethylacetofenon

Příklad 62

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy]-4-chlor-5-methylácetofenon

Příklad 63 ·· 4· • · · · • · • · • ·

- 154• · · · · · « · · · • · · · · · • · · · · • · · · ·· ·«·

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-nitrobenzaldehyd

Přiklad 64

4- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-

-yl)fenoxy]benzoyl-l-methylpyrrol-2-aldehyd

Příklad 65

4'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-(methylsulfonyl)acetofenon

Příklad 66

5- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-

-yl)fenoxy]-1-indanon

Příklad 67

2-amino-2'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3—d] — pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-chlorbenzofenon

Příklad 68

2'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-nitroacetofenon

Příklad 69

4- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy]-3-trifluormethylbenzonitril «4 4 4 4 4

- 155 Příklad 70 —[4 — {4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-chlorbenzonitril

Přiklad 71

4- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-chlorbenzonitril

Příklad 72

4- [4- (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d] pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-fluorbenzonitril

Příklad 73

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzonitril

Příklad 74

2- [4- (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(4-methylfenylthio)benzonitril

Příklad 75

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d)pyrimidin-5-yl)fenoxy)-6-(2-pyridylthio)benzonitril

Příklad 76 • · · ···· ····

- 156 Methyl-[3-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-kyanfenylthiojacetat

Přiklad 77

2-[4-{4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-trifluormethylbenzonitril

Přiklad 78

2-[4- (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-trifluormethylbenzonitril

Přiklad 79

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(pyrrol-l-yl)benzonitril

Příklad 80

2-(4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-nitrobenzonitril

Příklad 81

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzonitril

Příklad 82

5-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-nitrobenzaldehyd • · • · · · · «- ·· • · * · · * · · • · « · · · ········ ·· · · · » · · · ·

- 157 Příklad 83

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-nitrofenylmethylsulfon

Příklad 84

1- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)- fenoxy]-2-nitro-4-trifluormethylbenzen

Příklad 85

4'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)-fenoxy]-2'-chloracetofenon

Příklad 86

4'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5yl)-fenoxy]-2'-methylacetofenon

Příklad 87

7-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-y1) fenoxy]-3-fenylindan-l-on

Příklad 88

2- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) - fenoxy]-6-trifluormethylacetofenon

Příklad 89 • ·

- 158 -

1- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-9-fluorenon

Přiklad 90

6- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3,4-dimethoxybenzaldehyd

Příklad 91

2- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)- fenoxy]-5-methyl acetofenon

Příklad 92

2-(4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(2-oxoazepin-3-ylamino)benzonitril

Příklad 93

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(4-karbamoylpiperidin-l-yl)benzonitril

Příklad 94

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(3-imidazol-l-yl)propylamino]benzonitril

Příklad 95

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-y1)fenoxy]-6-[2-(4-pyridyl)ethylamino]benzonitril • · • · · · * · · · ·······* ·· ··· ·· · · ·

- 159Příklad 96

2-(4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(2-thienylmethylamino)benzonitril

Přiklad 97

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(4-kyanpiperidin-l-yl)benzonitril

Přiklad 98

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(3-pyridylmethylamino)benzonitril

Přiklad 99

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)f enoxy]-6-(4-methylfenoxy)benzonitril

Příklad 100

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-y1)fenoxy]-6-thiamorfolinobenzonitril

Příklad 101

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-[(3-dimethylamino)propylamino]benzonitril

Příklad 102 • ·

- 160 2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(2,2,2,-trifluorethoxy)benzonitril

Přiklad 103

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-(3-methoxypropylamino)benzonitril

Příklad 104

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-6-dimethylaminobenzonitril

Příklad 105

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrirnidin-5yl)fenoxy]-5-methoxybenzonitril

Příklad 106

- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-fluorbenzonitril

Příklad 107

1-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-nitro-2-trifluormethylbenzen

Příklad 108

1-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-y1)fenoxy]-6-chlor-2-nitro-4-trifluormethylbenzen

- 161 ·· ·· ·· *··· ·· · • : · · · .. , . .:

• * · ♦ · · · · · · · · · * * · Z ········ _{ete >φ a a #}

Příklady 109 až 137 se připraví obecným způsobem popsaným dále.

Obecný způsob

Karbonylová sloučenina (přibližně 50 mg) uvedená v tabulce J se rozpustí v methanolu (2 ml) a poté se přidá borohydrid sodný na polymerovém nosiči [na Amberlitu, IRA-400, 2,5 mmol borohydridu na gram pryskyřice, 2 ekvivalenty (50 mg výchozích materiálů je v rozmezí od 0,106 do 0,1345 mmol].

Směsi se protřepávají (kruhová třepačka) při teplotě místnosti 24 hodin, poté se zfiltrují a pryskyřice se promyjí methanolem (2x1 ml) a filtráty se odpaří a odparky se analyzují. Získané produkty jsou uvedeny v tabulce K. HPLC RT je retenční čas v minutách.

SM EX	PD EX	1 PRODUKT . 1
Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT
35	109	cf3	H	CH2OH	H	H	3t96
36	110	Cl	H	CH(OH)CH3	H	H	3.99 ě
37	111	Cl	H	CH2OH	H	H	3.81
38	112	H	H	CH(OH)CH3	H	H	3,75
39	113	H	H	ch2oh	H	H	3,57
40	114	CH(OH)C2H5	H	cf3	H	H	4.57
41	115	CH(OH)CH3	H	H	H	cf3	4t14

- 162• · · · ·· ···· ·· • · · ··· ·· • · ····· ·· • · · · · · · ··· ·· ··· ·· ···

Tabulka K - pokračování

42	116	ch2oh	H	H	N(CH3)2	CN	3t57
43	117	CH,OH	H	H	H -	CF3	3,99
44	118	CH(OH)CH3	H	H	och3	H	3,79
45	119	ch2oh	H	H	Cl	H	4.01
46	120	CH(OH)CH3	H	F	H	H	3t97
47	121	CHjOH	H	och3	H	H	3t68
48	122	CH2OH	H	H	och3	H	3,61
49	123	CH(OH)C2H5	H	H	H	H	4,08
50	124	ch2oh	H	H	H	F	3,63	i
51	125	CH(OH)CH3	H	H	H	H	3f83
52	126	ch2oh	H	H	H	H	3,64
53	127	cf3	H	CH(OH)C2H5	H	H	4,85
54	128	H	H	2-ThCHOH 1	H	H	4,66
55	129	H	cf3	CH(OH)CH3	H	H	4,74
56	130	H	cf3	ch2oh	H	H	4,48
57	131	H	H	CH(OH)CH3	-ch=ch-ch=ch-2	4,65
58	132	H	och3	ch2oh	H	H	3,82
59	133	CH(OH)C2H5	H	H	cf3	H	5,03
60	134	CH(OH)CH3	H	H	cf3	H	4,72
61	135	CH(OH)CH3	H	cf3	H	H	4,81
62	136	CH(OH)CH3	H	ch3	Cl	H	4,87
63	137	ch2oh	H	no2	H	H	3,96

• ·

- 163 • · · · « * · * · · · · · • · · · · ··· • · · · ·

Th = Thienyl = kondenzovaný kruh k získáni naftylu.

Sloučeniny připravené v tabulce K jsou uvedeny dále.

Příklad 109

4- [4- (4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyriinidin-5-yl) f enoxy]-3-trifluormethylbenzylalkohol

Příklad 110

4-[4-(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-chlor-a-methylbenzylalkohol

Příklad 111

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo(2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-chlor-benzylalkohol

Příklad 112

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-y1)f enoxy]acetof enon

Příklad 113

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzylalkohol

Příklad 114 • ·

• · · ·

- 164- .

• ·

2'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5'-trifluormethyl-a-ethylbenzylalkohol

Přiklad 115

2'- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3'-trifluormethyl-a-methylbenzylalkohol

Příklad 116

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-hydroxymethyl-6-(dimethylamino)benzonitril

Příklad 122

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[ 2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-methoxybenzylalkohol

Příklad 123

2' - [4-(4-amino-7-isopropýl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-a-ethylbenzylalkohol

Příklad 124

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-fluorbenzylalkohol

Příklad 125 ' -[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]- a-methylbenzylalkohol • · · · ··· ····

-165- .· .· . : : ···. .:::

• · ·· · · · . ♦······· ·· ··· .. ...

Přiklad 126

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzylalkohol

Příklad 127

4'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2-trifluormethyl-a-ethylbenzylalkohol

Přiklad 128

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-oc- (2-thienyl) benzylalkohol

Přiklad 129

4'-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-2'-trifluormethyl-a-methylbenzylalkohol

Příklad 130

4- [4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)- f enoxy]-2-trifluormethylbenzylalkohol

Příklad 131

1—[1 —4—[4—(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-

5- yl)fenoxy]naftyl]ethanol

Příklad 132 • 4

• · · • · · · · • · • · • · · ·· ·· ···

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy]-2-methoxybenzylalkohol

Přiklad 133

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-trifluormethyl-a-ethylbenzylalkohol

Příklad 134

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-trifluormethyl-a-methylbenzylalkohol

Příklad 135

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-trifluormethyl-a-methylbenzylalkohol

Příklad 136

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-4-chlor-5-methyl-a-methylbenzylalkohol

Příklad 137

2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-nitrobenzylalkohol

Příklady uvedené v tabulce L se připraví reakci aldehydů obecného vzorce (AL) s diethylaminem za přítomnosti Na(0Ac)3BH k získání sloučenin obecného vzorce (AM). Výchozí aldehyd se připraví v předchozím příkladu, který je uveden v tabulce.

• ·

Obecný způsob

Aldehyd se vystaví působení 1 ml zásobního roztoku THF (50 ml) a diethylaminu (2 ml) [ekvivalentní 40 μΐ diethylaminu] a nechá se při teplotě místnosti 1 hodinu v přepážkou uzavřené zkumavce. Do každé reakce se přidá Na(OAc)₃BH (20 mg + 2 mg), která se poté probublá N₂, znovu se uzavře a nechá se při teplotě místnosti 24 hodiny. Do každé z ketonových reakcí se přidá roztok kyseliny octové (3 ml) v 100 ml THF a nechá se při teplotě místnosti přes víkend.

Reakce se uhasí přidáním nasyceného vodného roztoku uhličitanu sodného (1 ml) a extrahují se dichloromethanem (2 ml) protřepáváním uzavřené zkumavky, shromáždí se a nechají se odpařit. U všech produktů a cílové hmoty nalezené v každém případě se provádí LCMS.

Produkt

Rc

Ra

Rb

- 168

Tabulka L

SM J	PD	Produkt
EX	EX	Ra	Rb	Rc	Rd	Re	HPLC RT
65	138	H	H	CO(P)1	H	H	3,62
35	139	cf3	H	CH2N(C2Hs)2	H	H	3,83
40	140	H	H	CHjNíCjH^	H	H	3,36
43	141	CH2N(C2H5)2	H	H	N(CH3)2	CN	3,34
44	142	CH2N(C2Hs)2	H	H	H	cf3	3,80
49	143	CH,N(C2Hs)2	H	H	och3	H	3,42
51	144	CH2N(C2Hs)2	H	H	H	F	3,27
53	145	CH2N(C2H5)2	H	H	H	H	3,31
57	146	H	cf3	CH2N(C2H5)2	H	H	4,12
59	147	H	och3	CH,N(C2H5)2	H	H	3,52
91	1148 }	CH2N(C2H5)2 t	H	och3	och3	H	1 3,25 i 1

1. P = l-methyl-2-(diethylaminomethyl)pyrrol-3-karbonyl

Sloučeniny připravené v tabulce L jsou uvedeny dále.

Příklad 138

4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzoyl-l-methyl-2-(diethylaminomethyl)pyrrol

Příklad 139

5-[4-(4-diethylaminomethyl-2-trifluormethylfenoxy)fenyl] •· ·· · · ··«· ·· · • · · · ··· ···· -169- .· .·. : : ··’. .:::

• · »· · · · · ········ ·· _<<β

-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Přiklad 140

5-[4-(4-diethylaminomethylfenoxy)fenyl]-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 141

2-[4 - (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-3-diethylaminomethyl-6-(dimethylamino)benzonitril

Příklad 142

5-[4-(2-diethylaminomethyl-6-trifluormethylfenoxy)fenyl]-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 143

5-[4-(2-diethylaminomethyl-5-methoxyfenoxy)fenyl]-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 144

5-[4-(2-diethylaminomethyl-6-fluorofenoxy)fenyl]-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 145

5- [4- (2-diethylaminomethylfenoxy) fenyl]-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 146

- 17099·· ···· · · . <··· • » 9 9 · 9 · » ·· ’ ···· 99999 • * ··4999 *999 9999 99 999 99l««

5-[4-(4-diethylaminomethyl-3-trifluormethylfenoxy)fenyl]-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 147

5-[4-(2-diethylaminomethyl-5-methoxyfenoxy)fenyl-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2, 3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 148

5-[4-(2-diethylaminomethyl-4,5-dimethoxyfenoxy)fenyl]-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Obecný vzorec obecného vzorce ukázáno ve použití produkty jsou uvedeny

CHO

Příklady 149 až 158 (AL2) s aminem obecného vzorce schématudále, kde Rioo rná způsobu popsaného v obecném v tabulce Q.

(AL2) (AM2) se připraví reakcí sloučenin (AM2) jak je výše uvedený význam, za způsobu. Získané

(AP2)

Obecný způsob Q

Zásobní roztok aldehydu (440 mg) v THF (11 ml) se rozdělí rovnoměrně do 11 přepážkou uzavřených skleniček. Každá reakční směs (obsahující 40 mg CHO 0,1075 mmol) se vystaví působení nadbytku aminu (3 až 10 molárních • · • ·

- 171 ·· ·· ·· · · · · • : · · · .. ....

• · ···.· .. , .· · . * . ...:;

· · · · · · _β ···· ···· ·· ··.

ekvivalentu) uvedených v tabulce Q a Na(0Ac)3BH (113 mg,

0,5375 mmol) a nechá se při teplotě místnosti 48 hodin. Směs se uhasí nasycenýn vodným roztokem Na2CO3 (1 ml) a 1 hodinu se protřepává a extrahuje dichlormethanem (3 ml) a oddělí se za použití kartridže Empore. Organické vrstvy se nechají odpařit při teplotě místnosti přes noc a odparky se rozpustí v EtOAc (2 ml) a extrahují 2N HC1 (1 ml) a vortexují. Kyselá vrstva se odpipetuje, promyje EtOAc (2 x 1 ml) pipetovými manipulacemi a poté se alkalizuje 4N NaOH Směs se extrahuje do EtOAc (2 ml) vortexování/pipetové dělení a promyje se vodou (2x1 ml). Konečná vrstva EtOAc se vysuší protlačením přes malou kartridž EMPORE a odpaří do sucha.

Tabulka Q

Ex. No.	^^105^106	HPLC RT
149	r~\ —N N—C0_C.H5	4f36
150	-Q co2c2h5	5f37
151	---HN''zZ'XCO2C2H5	3f64
152	.OH --HNT	2;95
153	--HN--	3f24
154	---HN---Jj	4f55
155	r~\ --N N—Me \_/	3f35

Sloučeniny připravené v tabulce Q jsou následující .

Příklad 149

Ethyl-[4-[4-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy] fenyl]piperazin-l-karboxylat]

Příklad 150

Ethyl-l-[[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy] fenyl]piperidin-2-karboxylat

Příklad 151

Ethyl-[N-[4- [4- (4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl)fenoxy]fenylaminoacetat]

Příklad 152

N—[2—[4—(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenoxy] fenylmethyl]-2-aminoethanol

Příklad 153 • · • ·

- 173 -

7-Isopropyl-5-[4-(2-dimethylaminomethylfenoxy)fenyl]-7H-

-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 154

7-Isopropyl-5- [4- (2- (2-thiazolylaminomethylfenoxy) fenyl] -7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-4-ylamin

Příklad 155

7-Isopropyl-5-[4-(2-(4-methylpiperazin-l-yl-methyl)fenoxy)fenyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-4-ylamin

Příklad 156

7-Isopropyl-5- [4- (2-morpholinomethylfenoxy) fenyl] -7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 157

7-Isopropyl-5-[4-(2-piperidinomethylfenoxy)fenyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Příklad 158

7-Isopropyl-5-[4-(2-pyrrolodinomethylfenoxy)fenyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Podmínky použité při LCMS pro příklady 35 až 158 jsou uvedeny dále.

Příklady 35 až 52, 64 až 84 a 109 až 126

Sloupec:

- 174• ·

Elmer).

Mobilní fáze: O,1M pufr, octan amonný [pH 4,55]: acetonitril (gradient - viz dále) .

Podmínky: 10 až 100% MeCN v 5 minutách. 100% MeCN 1 minutu. 100 až 10% MeCN ve 2 minutách.

(Celkový čas běhu analýzy - 8 minut).

Rozmezí vlno-
vých délek:	250 až 320 nm
Rychlost toku:	1 ml/minutu.
Inj ikovaný
obj em:	20 μΐ.
MS
Způsob:	APCI11H.
Ionisace:	APcI +ve/-ve.
Hmotové
spektrum:	100 až 700 m/

Příklady 53 až 63, 85 až 108 a 126 až 137

Sloupec:	5 μΐ Hypersil 100 x 2,1 mm BDS C18
Mobilní fáze:	0,lM pufr, octan amonný [pH 4,55]: acetonitril (gradient - viz dále).
Podmínky:	10 až 100% MeCN za 8 minut. 100 až 10% MeCN po dobu 3 minut. (Celkový čas analýzy - 11 minut).

Rozmezí vlno-

vých délek:	250 až 320 nm.
Rychlost toku:	1 ml/minuta.

Inj ikovaný

obj em:

20 μΐ.

MS

Způsob:

APCI11H.

	-175-	• · ·· ·· ···· • · · · · · · • · · · · · · • · · ♦ · · · • · · » · ········ · · · · ·	• · · • · · · • · · • · · • · · • · · · ·
Ionisace:	APcI +ve/-ve.
Hmotové
spektrum:	100 až 700 m/z.
Příklady 138	až 158
Sloupec:	5 μΐ Hypersil 100	x 2,1 mm BDS C18
Mobilní fáze:	0,1M pufr, octan	amonný [pH 4,55]
	acetonitril (gradient - viz dále).
Podmínky:	10 až 100% MeCN za	8 minut. 100% MeCN 1
	minutu. 100 až 10%	MeCN 2 minuty.	(Celkový
	čas běhu analýzy -	11 minut).
Rozmezí vlno-
vých délek:	250 až 320 nm.
Rychlost toku	: 1 ml/minuta.
Inj ikovaný
obj em:	20 μΐ.
MS
Způsob:	APCI11H.
Ionisace:	APcI +ve/-ve.
Hmotové
spektrum:	100 až 700 m/z.

Přiklad 159

7-Isopropyl-5-(4-(pyrimidin-2-yloxy)fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

a) Jod (52,9 g) se přidá k míchanému roztoku 4-chlor-7H-

-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (29,1 g, J. Chem. Soc., 131 (1960)) v N,N-dimethylformamidu (400 ml). Po částech se přidají pelety hydroxidu draselného (31,9 g) ke směsi chlazené tak, že teplota reakční směsi se udržuje okolo 20 • · • · • · · ·

- 176°C a tato směs se míchá při teplotě místnosti 2 hodiny.

Rovnoměrným proudem se přidává roztok thiosíranu sodného (900 ml 10% vodného roztoku), přičemž teplota se udržuje na °C externím chlazením. Směs se extrahuje ethylacetatem a spojené extrakty se vysuší, zfiltrují a odpaří za sníženého tlaku k získání odparku, který se přidá do vody (1 litr) a extrahuje se ethylacetatem (2 x 150 ml). Spojené ethylacetatové extrakty se vysuší a odpaří k získání tuhé látky, která se rekrystaluje z ethylacetatu. Získaná tuhá látka se míchá s methanolem (800 ml) a zfiltruje k odstranění části nerozpustného materiálu. Filtrát se odpaří do sucha k získání světle žluté tuhé látky, která se identifikuje jako 4-chlor-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin, teplota tání 219 až 221 °C.

b) 4-Chlor-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (10,0 g, viz příklad 17) se po částech přidá za míchání pod atmosférou dusíku při teplotě 0 °C do suspense hydridu sodného (1,6 g 60% disperse v minerálním oleji) v N,N-dimethylformamidu (250 ml). Po dokonční přidávání se směs nechá ohřát až na teplotu místnosti a když se nepozoruje žádný další vývin plynu, přidá se po kapkách roztok isopropylbromidu (34,0 ml) v N,N-dimethylformamidu (20 ml). Směs se míchá při teplotě místnosti přes noc, poté se uhasí přidávání vody (300 ml) po kapkách s externím chlazením ledem. Směs se poté promyje ethylacetatem (3 x 300 ml), spojené organické vrstvy se promyjí vodou, vysuší, zfiltrují a odpaří k získání 4-chlor-5-jod-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu jako žluté tuhé látky, teplota tání 116 až 118 °C. Struktura se potvrdí pomocí ¹H NMR.

c) Směs 4-chlor-5-jod-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyri• · • · • · · · • ·

- 177···· · · · ·* ·· ··· midinu (2,8 g), kyseliny 4-methoxybenzenborové (1,32 g) , chloridu bis(trifenylfosfin)palladia(II) (625 mg), toluenu (85 ml), ethanolu (11 ml), vody (22 ml) a hydrogenuhličitanu sodného (2,2 g) se zahřívá pod atmosférou dusíku při teplotě 105 °C 18 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a poté se rozdělí mezi ethylacetat (100 ml) a roztok chloridu sodného (100 ml). Organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se promyje ethylacetatem (2 x 50 ml). Spojené organické vrstvy se promyjí vodou, vysuší, zfiltrují a odpaří za sníženého tlaku k získání černého oleje, který při chlazení tuhne. Tento materiál se vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi cyklohexan/ethylacetat (7:3) jako mobilní fáze. Příslušné frakce se spojí a odpaří za sníženého tlaku k získání žlutého oleje, který tuhne při stání k získání 4-chlor-7-isopropyl-5-(4-methoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d] pyrimidinu. Struktura se potvrdí pomocí ¹H NMR.

d) Směs 4-chlor-7-isopropyl-5-(4-methoxyfenyl)-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidinu (1,6 g), koncentrovaného amoniaku (80 ml, S.G. .880) a 1,4-dioxanu (80 ml) se zahřívá v tlakové nádobě na teplotu 120 °C 18 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku k získání tuhého odparku, který se rozdělí mezi ethylacetat (100 ml) a vodu (100 ml). Vodná vrstva se extrahuje ethylacetatem a spojené organické vrstvy se promyjí vodou, vysuší, zfiltrují a odpaří k získání

4-amino-7-isopropyl-5-(4-methoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu. Struktura se potvrdí pomocí NMR.

e) Roztok bromidu boritého (14,4 ml 1M roztoku v dichlormethanu) se po kapkách přidá k míchanému roztoku 4-amino-7-isopropyl-5-(4-methoxyfenyl)pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (1,35 • ·

-178- • 4 ·· · · 4 4 4 4 • · · · 4··« • 4 4 4 4 4 44 * 4444444 • · 444444 ········ 44 4 44 44444

g) v dichlormethanu (100 ml) při tepote -10 C pod atmosférou dusíku. Reakční směs se nechá ohřát na teplotu 0 °C a míchá se při této teplotě 1 hodinu. Přidá se další bromid boritý (9,6 ml 1M roztoku v dichlormethanu) při teplotě -10 °C a směs se nechá ohřát na teplotu 0 °C a míchá se další hodinu. Reakční směs se zalije přidáním po kapkách nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (50 ml). Směs se nechá stát přes noc a dichlormethanová vrstva se oddělí. Nerozpustný materiál na rozhraní se odstraní filtrací a vysuší k získání 4-amino-5-(4-hydroxyfenyl) -7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu. Struktura se potvrdí pomocí 1H NMR.

f) 4-Amino-5-(4-hydroxyfenyl)-7-isopropyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin (0,05 g), 2-chlorpyrimidin (23 mg), uhličitan draselný (39 mg) a dimethylformamid (3 ml) se zahřívají na teplotu 90 °C za třepání 26,5 hodiny. Směs se poté protřepává další 24 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se rozdělí mezi ethylacetat (20 ml) a 2M roztok hydroxidu sodného (20 ml). Vodná vrstva se oddělí a extrahuje ethylacetatem. Spojené ethylacetatové extrakty a výplachy se spojí, vysuší, zfiltrují a odpaří k získání tuhé látky, která se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi dichlormethan/methanol (95:5) jako mobilní fáze k získání tuhé látky, která se identifikuje kapalinovou chromatografií LCMS jako 7-isopropyl-5-(4-(pyrimidin-2-yloxy)fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin. Struktura se potvrdí pomocí spektroskopie NMR.

Příklad 160

-179- .· ....... · · .

• · ·· · · · · ········ ·· ··· ·« «··

4-(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)benzaldehyd

a) Směs 4-chlor-5-jod-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyri- midinu (0,50 g) , kyseliny 4-formylbenzenborové (0,48 g) , chloridu bis(trifenylfosfin)palladia(II) (112 mg), toluenu (15 ml), ethanolu (2 ml), vody (4 ml) a hydrogenuhličitanu sodného (0,40 g) se zahřívá na teplotu 105 °C 8 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti, poté naředí roztokem chloridu sodného a extrahuje ethylacetatem k získání oleje, který se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití zvyšujících se množství ethylacetatu v cyklohexanu z 20 % na 40 % k získání 4-(4-chlor-7isopropyl-7H-pyrro-lo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)benzaldehydu, teplota tání 138 až 140 °C.

b) Směs produktu z části a) (2,7 g), koncentrovaný vodný roztok amoniaku (75 ml sg 0,880) a 1,4-dioxanu (50 ml) se zahřívá na teplotu 120 °C 16 hodin v tlakové nádobě. Směs se ochladí na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Přidá se voda a směs se extrahuje ethylacetatem k získání tuhé látky, která se trituruje ethylacetatem a zfiltruje k získání tuhé látky, která se identifikuje pomocí LCMS jako 4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)benzaldehyd, teplota tání 198 až 200 °C.

Příklad 161 cc-[4-(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenyl]benzylalkohol

Chlorid fenylhořečnatý (1,5 ml 2M roztoku v THF)

- 180se po kapkách přidá za míchání pod atmosférou dusíku k roztoku 4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin5-yl)benzaldehydu (0,25 g) ve směsi toluen/THF (1:1, 16 ml) při teplotě -78°C pod atmosférou dusíku. Po přidání se směs nechá ohřát na teplotu 0 °C a 40 minut se při této teplotě udržuje. Reakce se uhasí přidáním po kapkách nasyceného roztoku chloridu amonného (4 ml) při teplotě 0 °C. Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti a stát při této teplotě přes noc. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a získaný tuhý odparek se promyje vodou a zfiltruje. Odparek se trituruje horkým ethylacetatem, shromáždí filtrací a identifikuje pomocí LCMS jako oc-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenyl]benzylalkohol, teplota tání 279 až 281 °C.

Příklad 162

7-Isopropyl-5-(3-[(fenyl-4-yl)methylen]-2-oxindol)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Směs 4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)benzaldehydu (0,2 g), 2-oxindolu (95 mg), piperidinu (0,02 ml) a ethanolu (5 ml) se vaří 3 hodiny pod zpětným chladičem. Směs se ochladí na teplotu místnosti a tuhá látka, která se vytvoří se shromáždí filtrací a rekrystaluje se z ethanolu k získání 7-isopropyl-5-(3-[(fenyl-4-yl)methylen]-2-oxindol)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4 -ylaminu.

Příklad 163

5-[4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-fenoxybenzylalkohol • · · ·

- 181 -

a) Směs 5-brom-2-fluorbenzaldehydu (20,0 g) , fenolu (9,26

g), uhličitanu draselného (16,4 g) a dimethylformamidu (200 ml) se zahřívá na teplotu 160 °C 5.hodin. Směs se ochladí a naředí vodou, poté extrahuje ethylacetatem k získání

5-brom-2-fenoxybenzaldehydu jako oleje.

b) Směs produktu z části a) (5,71 g), hexamethylditinu (10,0 g) , tetrakis(trifenylfosfin)palladia (0) ( 1,5 g) a toluenu (200 ml) se vaří pod zpětným chladičem pod atmosférou dusíku za míchání 5 hodin. Směs se ochladí a zfiltruje a filtrát se odpaří k získání odparku, který se vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografií za použití petroletheru, teplota varu 40 až 60 °C se zvyšujícími se množstvími diethyletheru z 2,5 až 7,5 % jako mobilní fáze k získání 5-trimethylstannyl-2-fenoxybenzaldehydu.

c) Směs produktu z části b) (2,0 g), 4-chlor-5-jod-7-iso- propyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (0,99 g) , trifenylarsinu (0,235 g) a tris(dibenzylidenaceton)dipalladia(0) (0,41 g) a dimethylformamidu (20 ml) se zahřívá na teplotu 65 °C pod atmosférou dusíku 18 hodin za míchání. Směs se ochladí a přidá se voda. Směs se extrahuje ethylacetatem k získání odparku, který se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití zvyšujícíh se množství ethylacetatu (5 až 20 %) v cyklohexanu jako mobilní fází k získání 5-[4-chlor-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-fenoxybenzaldehydu.

c) Směs produktu z části c) (0,325 g), borohydridu sodného (32 mg) a methanolu (5 ml) se míchá pří teplotě 0 °C 30 minut a poté se ohřeje na teplotu místnosti a míchá při této teplotě 1 hodinu. Směs se zalije 50% ledovou kyselinou • · • ·

- 182··· ··· ···· • · ····· · · · ··· · ··· · · • · ·· ···· octovou (2 ml). Rozpouštědlo se odpaří za sníženého ťláku a k odparku se přidá voda, která se poté extrahuje ethylacetatem k získání 5-[4-chlor-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-fenoxybenzylalkoholu jako tuhé látky, teplota tání 157 až 159 °C.

e) Směs produktu z části d) (0,18 g), koncentrovaného vodného roztoku amoniaku (20 ml, sg 0,880) a 1,4-dioxanu (20 ml) se zahřívá v tlakové nádobě na teplotu 120 °C za míchání 16 hodin. Směs se ochladí a rozdělí mezi ethylacetat a vodu. Odpaření ethylacetatového extraktu poskytne olej, který se vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografii k získání 5-[4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-fenoxybenzylalkoholu, teplota tání 92 až 94 °C.

Přiklad 164

4-Amino-7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-ylkarbonitril

a) 4-Fenoxyacetofenon (150,0 g) se rozpustí v kyselině octové (2 litry) a míchá se při teplotě 50 °C zatímco se po částech přidává pyridiniumtribromid (251,6 g). Hnědý roztok se přidá do vody (3 litry) a směs se extrahuje toluenem (1 x 800 ml a poté 2 x 400 ml). Spojené toluenové extrakty se promývají vodou a poté vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného až šumění ustane. Spojené toluenové extrakty se oddělí, vysuší a zfiltrují a použijí přímo v části b) uvedené dále.

b) Roztok 2-brom-4'-fenoxyacetofenonu v toluenu získaný v bodě a) se přidá k roztoku cyklopentylaminu (154 ml) v toluenu (1 litr) za míchání pod atmosférou dusíku • · · ·

- 183- • · ·♦ ♦··· ··· · · · · • · ····· ·· · • ···· ···· · • · ·· ···· ··♦····· ·· ··· ·· ··· během 1,5 hodiny zatímco teplota se udržuje pod 5 °C. Směs se poté míchá 2,5 hodiny, přičemž teplota se udržuje pod 10 °C a poté se směs zfiltruje. Filtrát se po kapkách zpracuje koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (120 ml), přičemž teplota se udržuje pod 10 °C. Sraženina se shromáždí filtrací a trituruje se směsí 2-propanol/ether (1:1) k získání tuhé látky, která se suší ve vakuu při teplotě 40 °C 6,5 hodiny k získání hydrochoridu 2-cyklopentylamino-4'-fenoxyacetofenonu.

c) Produkt z části b) (35,1 g) se přidá k roztoku malononitrilu (9,5 g) v methanolu (500 ml) pod atmosférou dusíku a poté se po kapkách přidá vodný roztok hydroxidu draselného (17,0 g) ve vodě (75 ml) během 30 minut, zatímco teplota se udržuje mezi 0 a 5 °C. Směs se poté 2,5 hodiny vaří pod zpětným chladičem. Přidá se další malononitril (1,0 g) v methanolu (10 ml) a směs se další 3 hodiny vaří pod zpětným chladičem. Směs se nechá stát při teplotě místnosti 18 hodin a poté se methanol odpaří za sníženého tlaku a odparek se uchovává pod atmosférou dusíku. Odparek se rozpustí v dichlormethanu (600 ml) a promyje se vodou, poté roztokem chloridu sodného a poté se vysuší, zfiltruje a odpaří k získání hnědé tuhé látky, která se trituruje diethyletherem k získání 2-amino-3-kyan-l-cyklopentyl-4-(4-fenoxyfenyl)pyrrolu, který se použije přímo v příští části tohoto příkladu.

d) Produkt z části c) {25,9 g) se rozpustí ve směsi formamidu (155 ml), N,N-dimethylformamidu (52 ml) a kyseliny mravenčí (20,2 ml) a směs se zahřívá pod atmosférou dusíku na vnitřní teplotu 166 °C 4 hodiny. Směs se ochladí a vlije se do vody (3,5 litru) a poté extrahuje ethylacetatem (3 x 1500 ml). Spojené ethylacetatové

- 184- • · ·· ··*··· · · · ···· ··· · · · · • · ····· ·· · • · · · · ···· · • · ·· ···· ···· ···· ·· ··· ·· ··· extrakty se promyjí vodou, vysuší, zfiltrují a odpaří k získání tuhé látky, která se trituruje etherem a zfiltruje k získání tuhé látky, která se rekrystaluje z průmyslově methylovaného lihu k získání 7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylaminu, teplota tání 178 až 179 °C.

e) Produkt z části d) (3,7 g) se míchá v suchém dimethylformamidu (120 ml) pod atmosférou dusíku, zatímco N-bromsukcinimid (1,8 g) se po částech přidává pod atmosférou dusíku ve tmě. Směs se míchá 18 hodin ve tmě, poté se zpracuje k získání 6-brom-7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylaminu, teplota tání 161,5 až 162,5 °C.

f) Směs produktu z části e) (449 mg), kyanid zinečnatý (75 mg) a N-methylpyrrolidon (10 ml) se vystaví působení tri (2-furyl)fosfinu (63 mg), poté se důkladně deoxygenuje pod atmosférou dusíku a přidá se tris(dibenzylidenaceton)palladium(O) (45 mg). Směs se zahřeje na teplotu 90 °C a udržuje se při této teplotě 20 hodin. Přidá se ethylace-tat (20 ml), následuje vodný roztok amoniaku (20 ml 2M roztoku) . Směs se míchá a poté se ethylacetatová vrstva oddělí a vodná vrstva se dále extrahuje ethylacetatem. Spojená ethylacetatová vrstva a výplachy se vysuší, zfiltrují a odpaří k získání odparku, který se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití ethylacetatu jako mobilní fáze k získání 4-amino-7-cyklopentyl-5-(4fenoxy-fenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-ylkarbonitrilu, teplota tání 117,5 až 118,5 °C.

Příklad 165

- 185·· ·· ·♦ ···· ·· t>

···· ··· *··· • · ·«··· · · * • · ♦ · · « · · · « • · · · ···· ···· ···· ·· ··· ·· ···

6- Aminomethyl-7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

Produkt z předchozího příkladu (0,881 g) se rozpustí v teplém ethanolu (20 ml) a this roztok se přidá k ethanolu nasycenému amoniakem (200 ml). Přidá se nikl Raney⁰ (2 x 1 ml) a směs se 6 hodin protřepává pod atmosférou vodíku. Vyvinutý kladný tlak a periodicky se vyvíjející plyn se z přístroje vypouštějí. Po 2 hodinách se nádoba několikrát vyprázdní a naplní vodíkem. Po dalších 2 hodinách se tento postup zopakuje. Nakonec se směs protřepává další 1,5 hodiny a poté zfiltruje. Filtrát se odpaří k získání tuhé látky, která se trituruje etherem a shromáždí filtrací k získání surové tuhé látky, která se rozpustí v ethylacetatu. Po částech se přidává kyselina maleinová (0,2 g) v ethylacetatu až nedochzí k dalšímu srážení. Výsledná směs se ohřeje a trituruje a pot-é se nechá ochladit během 16 hodin. Tuhá látka se shromáždí filtrací k získání 6-aminomethyl-7-cyklopentyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylaminu, teplota tání 196,5 až 197,5 °C.

Příklad 166:

7- terc.-Butyl-5-(N-formyl-4-fenylaminofenyl)pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin

Směs 7-terč.-butyl-5-(4-jodfenyl)pyrrolo[2,3-d] pyrimidin-4-ylamin (1,0 g), formanilid (1,0 g), bezvodý uhličitan draselný (1,0 g), jodid měďný (100 mg), prášková měď (80 mg) a N-methylpyrrolidin (5 ml) se zahřívají na teplotu 107 °C za míchání pod atmosférou dusíku 22 hodin. Směs se ochladí a přidá se voda. Směs se extrahuje • ·

- 186-

• · # · *· ·· • «<

• ·· » · • ·· · • *· ethylacetatem k získáni odparku, který se vyčistí preparativní HPLC s reversní fází k získání 7-terc.-butyl-5-(N-formyl-4-fenylaminofenyl)pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu, teplota tání 163 až 164 °C.

Příklad 167

3-[4-[4-Amino-7-terc.-butyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]benzylalkohol

Způsobem podobným jako v předchozím příkladu se

7-terc.-butyl-5-(4-j odfenyl)pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin (392 mg) nechá reagovat s 3-hydroxybenzylalkoholem (372 mg) k získání 3-[4-[4-amino-7-terc.-butyl-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-7-yl]benzylalkoholu.

Příklad 168

N-[2-[(4-Amino-7-isopropylpyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy) fenyl]

Směs 5-[4-(2-aminofenoxy)fenyl]-7H-isopropyl pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylaminu (43 mg), kyanatu draselného (11 mg), ledové kyseliny octové (7 ml) a ethanolu (3 ml) se míchá a zahřívá na teplotu 70 °C 2 hodiny. Přidá se další ledová kyselina octová (7 ml) a kyanat draselný (11 mg) a v zahřívání na teplotu 75 °C se pokračuje 6 hodin. Směs se odpaří za sníženého tlaku.

K odparku se přidá a směs se extrahuje dichlormethanem k získání N-[2-[(4-amino-7-isopropylpyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]fenyljmočoviny jako tuhé látky.

- 187• * · · ···· ·· · ···· ··· ···· * · ····· ·· · * · ^ ♦ · ···· * • « · · ···· ········ ·· · · t ·« ···

Přiklad 169

7-(2-Hydroxyethyl)-5-[4-[4-(2-hydroxyethoxy)fenoxy]fenyl]pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin-4-ylamin

7-(2-Hydroxyethyl)—5—[4—[4-(2-hydroxyethoxy)fenoxy] fenyl]pyrrolo [2,3-d] -pyrimidin-4-ylamin, teplota tání 166 až 166,5 °C se připraví reakcí 5—[4— [4-(2-hydroxy) fenoxy] f enyl]-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-ylaminu s ethylenkarbonatem v N,N-dimethylformamidu obsahujícím katalytické množství prášku hydroxidu sodného 1 hodinu při teplotě varu. Produkt se získá po vypracování a vyčištění bleskovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém.

Příklad 170

5- [4 -(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]indan-l-ol

5- [4 -(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]indan-l-ol se připraví redukcí produktu z příkladu 32 podle postupu z příkladů 109 až 137.

Příklad 171

6- Amino-2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy)benzonitril

6- Amino-2-[4-(4-amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]benzonitril se připraví podle postupu z příkladů 35 až 108.

• · · ·

- 188Přiklad 172 • · * · ♦ · · · · • · · · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · ········ ·· · · · . ·

2—[4 —(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-methylbenzonitril

2-[4-(4-Amino-7-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)fenoxy]-5-methylbenzonitril se připraví podle postupu z příkladů 35 až 108.

Příklad 173 .

7-Isopropylsulfonyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin

5-(4-Fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin (1,57 g) se rozpustí v suchém dimethylformamidu (30 ml) a poté se za míchání přidá hydrid sodný (0,22 g 60% disperse v minerálním oleji). Směs se míchá 30 minut a poté se přidá isopropylsulfonylchlorid (0,74 g) a směs se míchá při teplotě místnosti 18 hodin. Ke směsi se přidává voda až nedochází k dalšímu srážení. Tuhá látka se shromáždí filtrací a vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi dichlormethan/methanol (9:1) jako mobilní fáze k získání tuhé látky, která se dále čistí bleskovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití ethylacetatu jako mobilní fáze k získání 7-isopro-pylsulfonyl-5-(4-fenoxyfenyl)-7Hpyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4—ylaminu, teplota tání 162 až 162,5 °C.

Příklad 174

7-[4-Amino-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin• ·

- 189- • · · · ···· ·· · ♦··· ··· ···· • · ♦ · · · · ·· · • · · · · ···· · • · ·· »··· ·*«· ···· · 4 ·«· ·«

-7-yl]bicyklo[3,3,0]oktan-3-ol

a) Borohydrid sodný (547 mg) se po částech přidá k roztoku cis-bicyklo[3,3,0]oktan-3,7-dionu (2,0 g) v methanolu (20 ml) při teplotě 0 °C. Směs se míchá při teplotě 0 °C 1 hodinu a poté se nechá ohřát na teplotu místnosti a poté se nechá stát při teplotě místnosti 18 hodin. Směs se zalije 2M roztokem hydroxidu sodného (5 ml) a poté se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozdělí mezi ethylacetat (50 ml) a vodu (50 ml). Vodná vrstva se oddělí a extrahuje ethylacetatem. Spojené ethylacetatové extrakty a výplachy se vysuší, zfiltrují a odpaří k získání oleje, který během stání krystaluje k získání cis-bicyklo[3,3,0]oktan-3,7-diolu.

b) Směs diolu z části a) (0,8 g), pyridinu (10 ml) a p-toluensulfonylchloridu (1,17 g) se míchá při teplotě 0 °C 2 hodiny a poté se nechá stát při teplotě místnosti 18 hodin. Směs se vlije do 5M kyseliny chlorovodíkové a extrahuje se ethylacetatem. Spojené ethylacetatové extrakty se promyjí 2M kyselinou chlorovodíkovou, poté vysuší, zfiltrují a odpaří k získání oleje obsahujícího převážně cis-7-toluensulfonyloxybicyklo[3,3,0]oktan-3-ol, který se použije přímo v následující části tohoto příkladu.

c) 5-[4-Fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamin (193 mg) se přidá ke směsi hydridu sodného (52 mg, 60% disperse v minerálním oleji) v dimethylformamidu (10 ml) za míchání při teplotě 0 °C pod atmosférou dusíku. Směs se míchá při teplotě místnosti 1 hodinu a poté se produkt z části c) (190 mg) přidá za míchání. Směs se ohřeje na teplotu 90 °C a poté se na tuto teplotu zahřívá 6 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti a rozdělí mezi vodu a

- 190- ·»··· · · · ··«· • · ····· * · · • ··»« ···· · • · · · ···· ethylacetat. Ethylacetatová vrstva se oddělí’a vo<Sná”vrstva se extrahuje ethylacetatem. Spojené ethylacetatové extrakty a výplachy se promyjí vodou, vysuší, zfiltrují a odpaří k získání oleje který se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití ethylacetatu a poté zvyšujícími se množstvími methanolu, až na 10 % methanolu v ethylacetatu jako mobilní fází. Příslušné frakce se shromáždí, spojí a odpaří k získání tuhé látky, která se promyje studeným etherem k získání 7-[4-amino-5-(4fenoxyfenyl)-7H-pyrro-lo[2,3-d]pyrimidin-7yl]bicyklo[3,3,0]oktan-3-olu, teplota tání 193 až 194 °C.

Příklad 175

-[4-Amino-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]cyklohexanol

Borohydrid sodný (500 mg, 13 mmol) se přidá v jedné části k míchanému roztoku 4-[4-amino-5-(4-fenoxyf enyl) -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimin-7-yl]cyklohexan-l-onu (780 mg, 2,0 mmol) v methanolu (500 ml) a směs se míchá pod atmosférou dusíku 1 hodinu, poté se nechá stát přes noc. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a odparek se rozdělí mezi 2M vodný roztok hydroxidu sodného (100 ml) a dichlormethan (100 ml). Organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se dále extrahuje dichlormethanem (2 x 100 ml). Spojené organické extrakty se promyjí vodou (150 ml), vysuší uhličitanem draselným a vyčistí chromatografií s sloupcem Biotage 40S za použití směsi ethylacetat/triethylamin (98:2 až 95:5) a ethylacetat/ethanol (95:5) jako mobilní fáze k získání 4-[4-amino-5-(4-fenoxyfenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]cyklohexanolu jako bílé tuhé látky (750 mg, 1,9 mmol), teplota tání 199 až 200 °C.

• · · · • ·

- 191 • · · · · · • · · · · · « * · ····· · • · · 3 · ·

C.LC/MS: Hypersil BDS cl8 (100 x 2,1 mm) O,1M octan amonný/acetonitril, 10 až 100% acetonitril v 8 min.)MH⁺ 401 minutách, MH⁺ 401 t_r = 4,12 minut.

Příklad 176

Benzyl-[N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7-l pyrrolo[2,3-d]pyrimidin- 5 -yl) -2-methoxyfenyl]karbamat]

a) 5-Brom-2-methoxyanilin (1)

Směs 4-brom-l-methoxy-2-nitrobenzenu (3,0 g, 12,9 mmol) a ledové kyseliny octové (25 ml) se zahřívá na teplotu 100 °C pod atmosférou dusíku. Přidá se práškové železo (2,2 g, 38,8 mmol) a směs se míchá 1 hodinu při teplotě 100 °C. Směs se ochladí na teplotu místnosti, poté se přidá voda (100 ml) a směs se extrahuje ethylacetatem (3 x 25 ml). Spojené organické extrakty se promyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3 x 25 ml) a poté roztokem chloridu sodného. Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku. Vyčištění materiálu bleskovou chromatografii na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (6:4) jako eluentu poskytne 5-brom-2-methoxyanilin (2,0 g) . ^XH NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 6,76 (s, 1H) , 6,71 (d, 1H) , 6,61 (d, 1H) , 4,99 (široký s, 2H) , 3,74 (s, 3H); (TLC (heptan/ethylacetat 1:1) R_f 0,5; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 m, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min ) t_r = 13,33 min.; MS: MH⁺ 443.

b) terc.-Butyl N-(5-brom-2-methoxyfenyl)karbamat (2) ·· · · * · ···· ·· · ···· ··· · · ·« -192- ,· · j · ··· · · · • · v· ···· ········ · · ··· ·· ···

Směs 5-brom-2-methoxyanilinu (1,50 g, 7,43 mmol) a di-terc.-butyldikarbonatu (1,95 g, 8,91 mmol) v THF (20 ml) se při teplotě zpětného toku zahřívá 20 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti a poté se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku. Výsledný olej se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetat/heptan (1:9) jako eluentu k získání terč.-butyl[-N-(5-brom-2-methoxyfenyl)karbamatu (2,19 g) jako bezbarvého oleje. ²H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,05 (s, 1H) , 7,93 (d, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,95 (d, 1H), 3,8 (s, 1H), 1,47 (s, 9H) ; TLC (ethylacetat/heptan 2:8) R_f 0,4; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μτη, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r 21,8 min.

c) terč . -Butyl[-N- [2-methoxy-5- (4,4,5,5-tertamethyl-l, 3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamat] (3)

Směs terc.-butyl N-(5-brom-2-methoxyfenyl)karbamatu (1,10 g, 3,64 mmol), diborpinakolesteru (1,11 g, 4,37 mmol), komplexu [1,1'-bis(difenylfosfino)ferrocen]dichlorpalladia(II) s dichlormethanem (1:1) (0,09 g, 0,11 mol) a octan draselný (1,07 g, 10,9 mol) v N,N-dimethylformamidu (20 ml) se zahřívají na teplotu 80 °C pod atmosférou dusíku 16 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. K odparku se přidá dichlormethan (20 ml) a výsledná tuhá látka se odstraní filtrací přes podložku z rozsivkové zeminy. Filtrát se odpaří k získání žlutého oleje, který se vyčistí bleskovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi ethylacetat/heptan (2:8) jako mobilní fáze k získání terč.-butyl[-N-[2-methoxy-5-(4,4,5,5-tetramethyl• · * ·

- 193 • · ····· ·· · • ···· ···· · • · · · ···· ······· ·· ··· 4 · ···

1,3,2-di-oxaborolan-2yl)fenyl]karbamatu] (0,96 g) . ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,03 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,0 (d, 1H), 3,82 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,28 (s, 12H); TLC (ethylacetat/heptan 2:8) R_f= 0,35; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r 22,8 min.

d) terč.-Butyl-[N- (5-(chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamat] (4)

Směs 4-chlor-7-cyklopentyl-5-j od-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (0,35 g, 1,0 mmol), terč.-butyl-[N-[2-methoxy-5-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl) fenyl]karbamatu] (0,524 g, 1,5 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladia (0,07 g, 0,06 mmol) a uhličitanu sodného (0,265 g, 2,5 mmol) se zahřívá ve směsi dimethyletherethylenglykolu (10 ml) a vody (5 ml) na teplotu 80 °C 18 hodin pod atmosférou dusíku. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozdělí mezi vodu (15 ml) a ethylacetat (25 ml), organická vrstva se oddělí a voná vrstva se dále extrahuje ethylacetatem (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty se promyjí vodou (3 x 20 ml), poté vysuší síranem hořečnatým, zfiltrují a filtrát se odpaří za sníženého tlaku na olejový odparek. Materiál se vyčistí bleskovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi heptan/ethylacetat (5:1) jako eluentu k získání terč.-bu-tyl-[N-(5-(chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-

d]pyrimidin-5-yl) -2-methoxyfenyl) karbamatu] (0,325 g) . ^ΧΗ NMR (DMSO-d₆,

400 MHz) δ 8,64 (s, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,87 (m, 2H), 7,17 • ·

- 194• · · · ······· • · ·»··· ··· • * · W · ·»··· • · · · · · ·· (d, 1H) , 7,06 (d, 1H) , 5,21 (m, 1H) , 3,86*’ (s’,’ 3H)*,' l’,*65-

1.25 (m, 8H), 1,45 (s, 9H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C 18, 5 μιη, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r

24.25 min. MS: MH⁺ 443.

e) 5-(3-Amino-4-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H -pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-4-amin

Roztok terč. -butyl-[N- (5- (chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamatu] (0,325 g, 0,735 mmol) v dichlormethanu (14 ml) se ochladí na teplotu 0 °C, poté se zpracuje kyselinou trifluoroctovou (1,4 ml). Roztok se míchá při teplotě 0 °C 5 minut, poté se ohřeje na teplotu místnosti a míchá se dalších 16 hodin. Rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku, poté se odparek rozdělí mezi dichlormethan (30 ml) a nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Organický roztok se vysuší síranem horečnatým, zfiltruje a filtrát odpaří za sníženého tlaku na pěnu. Materiál se poté rozpustí v dioxanu (4 ml) a koncentrovaném (28 až 30%) hydroxidu amonném (4 ml) a výsledný roztok se zahřívá na teplotu 120 °C 20 hodin v uzavřené tlakové zkumavce. Rozpouštědla se odpaří a odparek se vyčistí preparativní C 18 RP-HPLC k získání, po lyofilizaci, 5-(3-amino-4-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (85 mg).

^XH NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 8,10 (s, 1H) , 7,21 (s, 1H) , 6,87 (d, 1H), 6,74 (s, 1H), 6,58 (d, 1H), 5,06 (1H, m), 4,87 (široký s, 2H), 3,8 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 8H);

RP-HPLC(Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r 11,87 min.; MS: MH⁺ 324.

- 195 *··« · · · ··· • · ····· ·· « · ·· · · · · ······· ·· · · · 9 · · · ·

f) Benzyl-[N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]karbamat]

Roztok 5-(3-amino-4-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (40 mg, 0,124 mmol) v dichlormethanu (1 ml) a pyridinu (1 ml) se ochladí na teplotu 0 °C a poté se zpracuje benzylchloroformiatem (32 mg, 0,186 mmol), zatímco se teplota udržuje nižší než 5 °C. Roztok se míchá další 1 hodinu při teplotě 0 °C, poté se rozpouštědla odpaří za sníženého tlaku. Vyčištění preparativní C-18 RP-HPLC, poté lyofilizace, poskytne benzyl-[N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)karbamat] (25 mg) jako bílý prášek. *H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8,75 (s, 1H), 8,11 (s, 1H) , 7,75 (s, 1H) , 7,1-7,4 (m, 8H), 6,2 (široký s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,07 (m, 1H), 3,8 (s 3H), 1,6-2,2 (m, 8H), RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μιη, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r 18,63 min.; MS: MH⁺ 458.

Příklad 177

Benzyl-[N-[5-(4-amino-7-cyklopentyl-7H pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamat]

a) terč. -Butyl-[N- ( 5-brom-2-pyridyl) karbamat]

Sloučenina se připraví z 5-brom-2-pyridinaminu způsobem popsaným pro sloučeninu (2). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,96 (s, 1H) , 8,49 (d, 1H), 7,93 (dd, 1H) , 7,78 (d, 1H) , 1,47 (s, 9H); TLC (ethylacetat/heptan 5:95) R_f 0,28;

- 196• · · · 4 4 4 4 «4 » ··♦ 4 4» 4 44 4 • · 4 4 4 4 4 * ·« • · · 4 · 4 · 4·

4 ··*···

444···· 44 444 44444

RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μπι, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r= 18,50 min.

b) terč.-Butyl-[N- [5-(1,1,1-trimethylstannyl)-2-pyridyl)karbamat]

Směs terč. -butyl-[N- (5-brom-2-pyridyl) karbamatu] (1,67 g, 6,12 mmol); hexamethylditinu (2,0 g, 6,12 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)palladia (0,424 g, 0,367 mmol) v dimethyletherethylenglykolu (30 ml) se zahřívá na teplotu 80 °C pod atmosférou dusíku 15 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti a poté se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku. Výsledný materiál se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (95:5) jako eluentu k získání terč .-butyl-[N-[ 5-(1,1,1-trimethylstannyl}-2-pyridyl)karbamatu] (1,11 g) . ²H NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 9,98 (s, 1H) , 8,2 (t, 1H) , 7,74 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 0,30 (t, 9H); TLC (heptan/ethylacetat 95:5) R_r 0,2; MS: MH⁺ 359.

c) terč.-Butyl-[N- [5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo- [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamat]

Směs 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (0,25 g, 0,72 mmol), terc.-butyl N-[5-(1,1,1-trimethylstannyl)-2-pyridyl)karbamatu (0,386 g, 1,08 mmol), tetrakis(dibenzylidenaceton)dipalladia(0 ) (0,033 g, 0,076 mmol) a trifenylarsinu (0,055 g, 0,18 mmol) v N,N-dimethylformamidu (8 ml) se zahřívá na teplotu 65 °C pod atmosférou dusíku 18 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti a poté se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku.

• · • ·

- 197• * · ♦ · ·» · ··· ♦ · · 9 · · · «· · • · · · · ·«·· • · 9 9 «··· ········ 9 9 ··· « · ···

Výsledný materiál se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (75:25) jako eluentu k získání terč.-butyl-[N-[5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamatu] (0,13 g) . ^XH NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,83 (s, 1H) , 8,68 (s, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,85-7,93 (m, 2H), 5,21 (m, 1H), 1,65-2,25 (m, 8H), 1,49 (s, 9H); TLC (heptan/ethylacetat 8:2) R_f 0,18; RP-HPLC(Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μιη, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 21,68 min.

d) 5-(4-Chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinamin

Roztok terč.-butyl-[N-[5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamatu] (0,13 g, 0,315 mmol) v dichlormethanu (5,5 ml) se ochladí na teplotu 0 °C, poté se zpracuje kyselinou trifluoroctovou (0,6 ml). Roztok se míchá při teplotě 0 °C 5 minut, poté se ohřeje na teplotu místnosti a míchá se dalších 18 hodin. Rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku, poté se odparek rozdělí mezi dichlormethan (30 ml) a nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a filtrát odpaří za sníženého tlaku k získání 5-(4-chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinaminu (92 mg). RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μπι, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r= 10,73 min; MS: MH⁺ 314.

« *

- 198• · · · ···· ········ ·· ··· ·· ···

e) 5-(6-Amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-4-amin

5-(4-Chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridinamin (92 mg, 0,291 mmol) se rozpustí v dioxanu (2 ml) a koncentrovaném (28 až 30%) hydroxidu amonném (2 ml) a výsledný roztok se zahřívá na teplotu 120 °C 24 hodiny v uzavřené tlakové zkumavce. Rozpouštědla se odpaří k získání 5-(6-amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-4-aminu (105 mg). RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r 6,33 min.; MS: MH⁺ 295.

f) N-[5-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyl]karbamat

Roztok 5-(6-amino-3-pyridyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (105 mg, 0,29 mmol) v dichlormethanu (1,5 ml) a pyridinu (1,5 ml) se ochladí na teplotu 0 °C a poté se zpracuje benzylchloroformiatem (75 mg, 0,44 mmol), zatímco se teplota udržuje nižší než 5 °C. Roztok se ohřeje na teplotu místnosti, poté se míchá 3 hodiny. Přidá se benzylchloroformiat (75 mg, 0,44 mmol) a směs se míchá 18 hodin, přidá se další benzylchloroformiat (75 mg, 0,44 mmol) a směs se míchá další 24 hodiny. Přidá se benzylchloroformiat (150 mg, 0,88 mmol) a pyridin (1 ml) a směs se míchá další 24 hodiny. Rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku, poté se odparek rozdělí mezi ethylacetat (25 ml) a vodu (10 ml). Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku. Vyčištění preparativní C-18 RPHPLC, poté triturace diethyletherem poskytne N-[5-(4-amino- 199• · · · · · ♦ · ·· · • · ····· ··· • · · · · ····· • · · · · · ·· ········ · · ··· · ···

-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-pyridyljkarbamat (21 mg) jako bílý prášek. ¹H NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 10,33 (s, 1H), 8,36 (d, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,91 (d, IH) , 7,84 (d, 1H), 7,33-7,47 (m, 6H), 6,11 (široký s, 2H) ,

5,2 (s, 2H), 5,06 (m, 1H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min ) t_r= 16,22 min; MS: MH⁺ 429.

Příklad 178

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3methoxyfenyl]karbamat]

a) 4-Brom-3-methoxyanilin

Směs l-brom-2-methoxy-4-nitrobenzenu (3,0 g, 12,9 mmol) a ledové kyseliny octové (25 ml) se zahřívá na teplotu 100 °C pod atmosférou dusíku. Přidá se práškové železo (2,2 g, 38,8 mmol) a směs se míchá 1 hodinu při teplotě 100 °C. Směs se ochladí na teplotu místnosti, přidá se voda (100 ml) a směs se poté extrahuje ethylacetatem (3 x 25 ml). Spojené organické extrakty se promyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3 x 25 ml) a poté roztokem chloridu sodného. Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku. Vyčištění materiálu bleskovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan/ethylacetat (6:4) jako eluentu poskytne 4-brom-3-methoxyanilin (1,22 g) . ¹H NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 7,1 (d,

1H) , 6,31 (s, 1H), 6,1 (d, 1H), 5,27 (široký s, 2H), 3,72 (s, 3H); TLC (heptan/ethylacetat 1:1) Rf 0,33; RP-HPLC

-200- .* . : : ·’·. .:: :

• · ·· ···· ········ · · ··· ·· · · · (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 11,05 min.

b) terč.-Butyl-[N- (4-brom-3-methoxyf enyl) karbamat]

Sloučenina se připraví z 4-brom-3-methoxyanilinu způsobem popsaným pro sloučeninu (2): ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 8 9,46 (s, 1H), 7,4 (d, 1H), 7,35 (s, 1H), 6,95 (d, 1H) , 3,78 (s, 3H), 1,48 (s, 9H); TLC (heptan/ethylacetat 8:2) Rf 0,37; RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r= 18,60 min.

c) terč.-Butyl-[N-[3-methoxy-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamat]

Sloučenina se připraví z terč.-butyl-[N-(4-brom-3-methoxyfenyl)karbamatu] způsobem popsaným pro sloučeninu (3). ^ςΗ NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,44 (s, 1H) , 7,41 (d, 1H) , 7,17 (s, 1H), 7,01 (d, 1H), 3,68 (s, 3H), 1,48 (s, 9H), 1,24 (s, 12 H) ; TLC (heptan/ethylacetat 8:2) R_f 0,28; RPHPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t = 18,83 min.

d) terč.-Butyl-[N- [4-(4-(chloro-7-cyklopentyl-7H-pyrro- lo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)methoxyfenyl)karbamat]

Sloučenina se připraví z terč. -butyl-[N- [3-me-201 ·· · · ·· · · · · · · · *·*· · · ···*· • · ····· ··· • ···· · « · ♦· • · ♦ · ♦ · ·· ········ · · · ·· ·· · · · thoxy-4-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)fenyl]karbamatu] a 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidinu způsobem popsaným pro sloučeninu (4). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,41 (s, 1H) , 8,59 (s, 1H) , 7,72 (s, 1H) , 7,33 (s, 1H), 7,15 (d, 1H), 7,04 (d, 1H) , 5,17 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 3H), 1,49 (s, 9H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 μπι, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r = 21,22 min; MS: MH⁺+ 443.

e) Benzyl-[N- [4- (4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d] pyrimidin-5-yl)-3-methoxyfenyl]karbamat]

Sloučenina se připraví z terč.-butyl-[N- [4-(4-(chlor-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-3-methoxyfenyl)karbamatu] způsobem popsaným pro konversi sloučeniny (4) na sloučeninu (6). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9,87 (s, 1H), 8,08 (s, 1H), 7,34-7,45 (m, 6H), 7,09-7,18 (m, 3H), 5,79 (široký s, 2H), 5,18 (s, 2H), 5,04 (m, 1H), 3,7 (s, 3H), 1,6-2,2 (m, 8H); RP-HPLC (Hypersil HyPurity Elitě C18, 5 pm, 200 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 min, 1 ml/min) t_r 16,87 min; MS: MH⁺ 458.

Příklad 179

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl]karbamat]

a) 4-[[[7-cyklopentyl-5-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]-amino]-(2,4-dimethoxyfenyl)methyl]fenoxypryskyřice • ·

-202Z umělé amidové pryskyřice [4-(2',4'-dimethoxyfenyl-Fmoc-aminomethyl)fenoxypryskyřice s náloží 0,66 mmol/g] (6,55 g, 4,32 mmol) se odstraní chránící skupiny v N,N -dimethylformamidu (2x2 min), 20% piperidinu v dimethylformamidu (1x5 min, 1 x 15 min), N,N-dimethylformamidu (5x2 min), dichlormethanu (3x2 min) a poté methanolu (3x2 min). Pryskyřice se suší při teplotě 40 °C za sníženého tlaku. Prysykřice bez chránících skupin, 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin (1,80 g, 5,19 mmol), dimethylsulfoxid (100 ml) a N,Ndiisopropylethylamin (4,5 ml) se 3 dny zahřívají na teplotu 100 °C, ochladí na teplotu místnosti a poté se pryskyřice shromáždí filtrací a promyje se N,N-dimethylformamidem.

Pryskyřice se poté míchá 30 minut s kyselinou octovou (0,13 g, 2,16 mmol), O-benzothiazol-l-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorboratem (0,69 g, 2,16 mmol), N,N-diisopropylethylaminem (0,56 g, 4,32 mmol) a N,N-dimethylformamidem (30 ml). Pryskyřice se shromáždí filtrací a promyje se N,N-dimethylformamidem, dichlormethanem a methanolem. Pryskyřice se suší do konstantní hmotnosti (6,25 g) za sníženého tlaku. Pryskyřice, diborpinakolester (1,11 g, 4,37 mmol), octan draselný (0,822 g, 8,39 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin)palladium (0,24 g, 0,21 mmol) v dimethylsulfoxidu (125 ml) se zahřívají na teplotu 85 °C pod atmosférou dusíku 17 hodin. Pryskyřice se shromáždí filtrací, poté se promyje N,N-dimethylformamidem, dichlormethanem a ethylacetatem, poté etherem. Pryskyřice se suší za sníženého tlaku do hmotnosti 5,49 g.

b) Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl]karbamat] • · · · ·· ···· ·· · • · · · ··· ···· “ 203 - * · ····· ··· • · ·· ···· ········ ·· · · · ·· ···

Směs 4-[[[7-cyklopentyl-5-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]mino]- (2,4-dimethoxyfenyl) methyl]fenoxypryskyřice (0,5 g, 0,254 mmol), 4-brom-2-fluoranilinu (0,484 g, 2,54 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladia (0,044 g,0,038 mmol), 2M vodného fosforečnanu draselného (1,27 ml, 2,54 mmol) a dimethylsulfoxidu (10 ml) se zahřívá na teplotu 85 °C 18 hodin. Směs se ochladí a pryskyřice se shromáždí filtrací, poté se proymje N,N-dimethylformamidem a dichlormethanem. Pryskyřice se poté vystaví kondenzačním podmínkám popsaným výše podruhé. Pryskyřice se suspenduje v dichlormethanu (2 ml) a pyridinu (2 ml), poté se směs ochladí na teplotu 0 °C a vystaví se působení benzylchloroformiatu (0,44 g, 2,6 mmol). Po míchání při teplotě 0 °C 1 hodinu se směs nechá ohřát na teplotu místnosti na dobu 18 hodin. Pryskyřice se shromáždí filtrací, poté se ošetřuje 5% kyselinou trifluoroctovou v dichlormethanu (10 ml) 30 minut. Odstranění pryskyřice filtrací poskytne filtrát, který se odpaří za sníženého tlaku k získání odparku, který se vyčistí preparativní C-18 RP-HPLC k získání benzyl-[N- [4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl]karbamatu] (přibližně 10 mg). RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 μπι, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r 11,47 min;

MS: MH⁺ 446.

Příklad 180

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimídín-5-yl)-2-(trifluormethyl)fenyl]karbamat]

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem,

-204♦ · · · ······· • · ····· · ·· • · · fc · · · · ·· • · ·· · · ·· ········ · · · ·· ·· ··· jaký je popsán pro PH 454098: RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 μτη, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min ) t_r=12,07 min; MS: MH⁺ 496.

Příklad 181

Benzyl-[N- [4- (4-amino-7-cyklopentyl-7H pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl) - 2-kyanfenyl]karbamat]

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jaký je popsán pro PH 454098: RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 μη?., 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r= 10,93 min; MS: MH⁺ 453.

Příklad 182

Methyl-[5- ( 4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-[[(benzyloxy)karbonyl]amino]benzoat

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jaký je popsán pro PH 454098: RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 μη, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r 13,28 min; MS:MH⁺ 486.

Příklad 183

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methylfenyl]karbamat]

-205 • ♦ · · ··· · ·· · • · · · · · « « ·· · • · ·»··· · e· • ···· v···· • · ·· · · ·· ········ · · · · · «· ···

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jaký je popsán pro PH 454098: RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 gm, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min) t_r =11,25 min; MS:MH⁺ 442 .

Příklad 184

Benzyl-[N-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) fenyl]karbamat]

Tato sloučenina se připraví stejným způsobem, jaký je popsán pro PH 454098: RP-HPLC (Hypersil HS C18, 5 μιη, 100 A, 250 x 4,6 mm; 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 10 min, 1 ml/min ) t_r= 11,27 min; MS:MH⁺ 428 .

Příklad 185

N-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]fenylmethansulfonamid

5-(4-Amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-4-amin (27 mg, 0,083 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (0,8 ml). Přidá se pyridin (0,8 ml), následuje fenylmethansulfonylchlorid (19 mg, 0,145 mmol). Po celonočním míchání se přidá dalších 19 mg fenylmethansulfonylchloridu a reakční směs se míchá přes noc. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se vyčistí preparativní chromatografií na tenké vrstvě, přičemž se eluuje směsí dichlormethan/methanol (95:5) k získání N-[4-(4-amino-7-206-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxy fenyl]fenylmethansulfonamidu (9 mg, 0,0188 mmol). ^ΧΗ NMR (DMSO-d₆) v 1,89 (m, 6H), 2,28 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 4,38 (s, 2H), 5,23 (m, 3H), 6,08 (široký s, 1H), 6,99 (m, 2H), 7,27, (m, 2H), 7,33 (m, 3H), 7,58 (d, J = 8,17 Hz, 1H), 8,34 (s, 1H). LC/MS MH⁺ = 478.

Příklad 186

NI-[4-(4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyf enyl]-2-f enylacet amid

5-(4 -Amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin (28mg, 0,086 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (1 ml). Přidá se pyridin (1 ml), následuje 2-fenylethanoylchlorid (14 μΐ, 0,105 mmol). Po celoročním míchání se přidá dalších 14 μΐ fenylethanolylchloridu a reakční směs se míchá přes noc. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se vyčistí preparativní chromatografií na tenké vrstvě, přičemž se eluuje směsí dichlormethan/methanol (95:5) k získání NI-[4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-2-fenylacetamidu (7 mg, 0,0158 mmol). ^XH NMR (DMSO-d₆) 1,89 (m, 6H) , 2,25 (m, 2H) , 3,77 (s, 3H) , 3,79 (s,2H), 5,21 (m, 1H) , 5,56 (široký s, 2H), 6,89 (s, 1H), 6,99 (s, 1H), 7,05(d, J = 8,22, 1H), 7,36 (m, 5H), 7,81 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,43 (d, J = 8,23 Hz, 1H) . LC/MS MH⁺ = 442.

Příklad 187

NI - [ 4 - (4-Amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl]-2-(2-thienyl)acetamid

9

-2075-(4-Amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amin (31 mg, 0,095 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (1 ml). Přidá se pyridin (1 ml), následuje 2-(2-thienyl)ethanoylchlorid (14 μΐ, 0,113 mmol). Po celonočním míchání se přidá dalších 14 μΐ 2-(2-thienyl)ethanoylchloridu a reakční směs se míchá přes noc. Rozpouštědlo -se odpaří a odparek se vyčistí preparativní chromatografií na tenké vrstvě, přičemž se eluuje směsí dichlormethan/methanol (95:5) k získání NI-[4-(4-amino-7-

-cyklopentyl-7H-
		NH
rV		ry-cH,
NH2	O-CHj	py
w		n\-X w
ó		č
Příklad	18 2	Příklad 183

Příklad 186

-208Obecný způsob » · 4 i ····»··· • ♦ · * · < ··· • · · · · · * · · * · · · 9 9 99

9 · · 9 99

99999999 99 99999 přípravy pyrrolopyrimidinarylsulfonamidů

K 0,225M roztoku 5-(4-amino-3-fluorfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-4-aminu v pyridinu se přidá 1 ekvivalent substituovaného arylsulfonylchloridu. Tato směs se zahřívá za míchání na teplotu 45 °C 24 hodiny. Produkt se z reakční směsi vyčistí preparativní RP-HPLC (Hypersil BDS C18, (5pm balení; 100 x 21,2mm) za použití gradientu 0,05M, pH 4,5, směsi vodného roztoku octanu amonného/acetonitrilu (0 až 100% během 12,5 min, při rychlosti toku 25 ml/min).

Příklady 188 až 249 připraví podle obecného postupu popsaného výše. Molekulová hmotnost, jak se stanoví hmotovou spektometrií (MH⁺) a HPLC retenční časy (RT) v minutách jsou u každého příkladu uvedeny.

o

Příklad 188

Příklad 189

Příklad 190

MH+ 485.89

RT 3,12

Příklad 191

MH+ 465_f9

RT 3,11 • · • · · ·

Přiklad 192

MH+ 501_f97

RT 3_ť22

Příklad 193

MH+ 519_f88

RT3.15 f

Příklad 194

MH+ 519_f84

RT 3_f19

Příklad 195

MH+ 561 73

RT 3_ξ2 ·· «· · · · · · · · · « · · 9 · · · · · ···

- 210 - · · ····· ·· · • ···· ···* · * · ·· ···· ········ · · · · « 9 · · · ·

Příklad 196

ΜΗ+ 555.77

RT 3.45 ι

Příklad 197

MH+ 476,89

RT 2.85 ¹ <

Příklad 198

MH+ 469_?9

RT 2.92

Příklad 199

MH+ 496,93

RT 3_f65 '

í.

• ·

Příklad 200

MH+ 496_f94

RT 3.66

Příklad 201

MH+ 485₁87

RT 3,79

MH+ 496.9

RT 3.65

příklad 203

MH+ 487_r9

RT 3_f55 • · · · • 99 « ♦

212;·

z-o

Cl

Přiklad 204

ΜΗ+ 535_f9

RT 3₍82

Příklad 205

MH+ 530,92

RT 3.43 '

I

Příklad 206

MH+ 541.95

RT 3.35 *

Příklad 207

MH+ 465.89 RT 3,45 ^? • · • ·

Přiklad 208

MH+ 602,99

RT 3_f56

Příklad 209

MH+ 503.85

RT 3_?48

Příklad 210

MH+ 503.88

RT 3_f53 ^?

Příklad 211

MH+ 483,9

RT 3,47

Příklad 212

MH+ 567.74

RT 3_?53

Příklad 213

MH+ 577,88

RT 3,65 í

Příklad 214

MH+ 603.05

RT 3,4

I

Příklad 215

MH+ 501_{93

RT 3_f16 • · • · • ·

215.·»’

Příklad 217

Přiklad 216

MH+ 564_f96

RT 3_f34

MH+ 577 88

RT 3_f5

Příklad 219

MH+ 545_ř04

RT 3_f58

Příklad 218

MH+ 545_ř01

RT 3_f5

Příklad 220

MH+ 487.9

RT 333

Příklad 221

MH+ 499.92

RT 3^46

Příklad 222

MH+ 505_f93

RT 3,46

MH+ 510_?88

RT 3,41

-217

Přiklad 224

MH+ 553_ř96

RT 3_ř55

Přiklad 225

MH+ 587,97

RT 3,6

Přiklad 226

MH+ 553^9

RT 3,88

Příklad 227

MH+ 487_{9

RT 3_f6 • 4

Přiklad 228

MH+ 587 9

RT 3,9

Příklad 229

MH+ 545_f8 RT 3,93

Příklad 230

MH+ 615,8

RT 4,02

Příklad 232

MH+ 487,9

RT 3,6 • · · · • · · · ·· • · ··

219.-· .· · ::

«······· · · • ·· • · · ·· • · ·· • ·· • · · · ·

Přiklad 231

MH+ 549,8

RT 3,82

Přiklad 233

MH+ 533.8

RT 3_f89

Příklad 234

MH+ 519,9

RT 3_f74

Příklad 235

MH+ 555,8

RT 3_f93

- 220 , • ·· · · ···· ·· • · * ··· ··· • · ····· ·· • · · · · · · ··· · · ··· ·· · · ·

Příklad 236

MH+ 496

RT 3^49 příklad 237

MH+ 514

RT 3.92

Příklad 239

MH+ 528

RT 3.84

Příklad 238

MH+ 519.9

RT 3_f78

Příklad 240

MH+ 502

RT 3_t66

Příklad 241

MH+ 532

RT 3_{85

Příklad 242

MH+ 4_ř16

RT 4.16 !

Příklad 243

MH+ 3,97

RT 3.97

I

Příklad 244

MH+ 547j9

RT 2.72 i

Příklad 245

MH+ 503

RT 3,64

• · « ·

příklad 246

Příklad 247

Příklad 248

Příklad 249

• · · · · · · • · · · · · ·

- - · · · · · · · · · ········ ·· ···

Obecné syntézy pro příklady 250 až 269

K 0,225M roztoku 5-(4-amino-3-methoxyfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-4-aminu (nebo 5-(4-amino-3-fluorfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu nebo 5-(4-amino-3-chlorfenyl)-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu) v pyridinu se přidá 1 ekvivalent substituovaného arylsulfonylchloridu. Tato směs se zahřívá za míchání při teplotě 45 °C 24 hodin. Produkt se z reakční směsi vyčistí preparativni C18 RP-HPLC. Analytické hodnoty RP-HPLC RT uvedené v tabulce se získají na sloupci Hypersil HyPurity Elitě C18((5 um, 200 A) 250 x 4,6 mm) za použití a lineárního gradientu 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 minut při rychlosti toku 1 ml/min.

Je třeba si povšimnout, že při zavádění reaktivních substituentů může být vyžadována manipulace s chránícími skupinami.

Sloučeniny 250 až 269 se připraví podle obecného postupu popsaného výše. Molekulová hmotnost, jak se stanoví hmotovou spektometrií (MH⁺) a HPLC retenční časy (RT) v minutách jsou u každého příkladu uvedeny.

”=9

Příklad 250

MH+ 478₍1

RT 13_{9

Příklad 251

MH+ 494,1

RT 15.68 f

·· • ·

Přiklad 252

MH+ 498,0

RT15J2

Příklad 253

MH+ 514 0

RT 17 7

Příklad 154 MH+ 464.1 RT 10.4 t

Příklad 255^ MH+ 480fl RT 11/2 Připraví se ze sloučeniny z příkladu 251 působením BBí3 v methylenchloridu

·· ·»

- » * »

-226- .* • · ··*· »··· ·· ··· · t v · · *

Přiklad 256

MH+ 4S2_sl

RT 15_ř65

Příklad 257

MH+ 542,1, 544_ř0

RT 17,45

Příklad 258

MH+ 509.2

RT 15,8

Příklad 259

MH+ 557,2

RT 19,55 • · > · ·· a · · · ·· · • · · · · · · · · a a

22^ * * · · · · · · · · a · a · a · · · aaaaaaaa ·· a · · ·· a·a

Přiklad 260

MH+ 477,1

RT 11,6

Připraví se hydrogenací sloučeniny z příkladu 258 palladiem na uhlí

Příklad 261

MH+ 512,0

RT 17,62

Příklad 262

MH+ 506_f0

RT 9_f93

Příklad 263

MH+ 502,0

RT 18,23 • ·

-228-

Přiklad 2β4

MH+ 502,0

RT 18,02

Přiklad 265

MH+ 502,0

RT 17 6

Přiklad 266

MH+ 507,1

RT 12,2

Připraví se působením

EDC, HOAt, ME₂NHvDMFna sloučeninu z příkladu 262

Přiklad 267

MH+ 486_řl

RT 15,68

-229-

Příklad 268

MH+ 486.1

RT 16,35* přiklad 269/

MH+ 486,1 RT 16,7

Sloučeniny 270 až 282 se syntetizují za použití následujících způsobů.

Cesta 1

a) Směs příslušného bromarylsulfonamidu (0,735 mmol), bispinakolatodiboranu (0,225 g, 0,88 mmol), komplexu [1,1'-bis(difenylfosfino)ferrocen]dichlorpalladia(II) s dichlormethanem (1:1) (2 mg, 0,002 mol) a octanu draselného (0,216 g, 2,205 mol) v N,N-dimethylformamidu (5 ml) se zahřívá na teplotu 100° C pod atmosférou dusíku 16 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. K odparku se přidá dichlormethan (20 ml) a výsledná tuhá látka se odstraní filtrací přes podložku z rozsivkové zeminy. Filtrát se odpaří k získání žlutého oleje, který se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu k získání sulfonamidoarylboratu.

b) Směs 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H pyrrolo[2,3-d]pyri-

-230- * · · · ·· ···· 9« · • · · · ·»· ···· • · «···· «« · • «··· ««·· · • * · * · · 9 e ········ ·· ··· ♦· · · · midinu (0,35 g, 1,0 mmol), sulfonamidoarylboratu (1,5 mmol, z 1 (a) výše), tetrakis(trifenylfosfin)palladia (0,07 g, 0,06 mmol) a uhličitanu sodného (0,265 g, 2,5 mmol) se zahřívá ve směsi dimethyletherethylenglykolu (10 ml) a vody (5 ml) na teplotu 80 °C 18 hodin pod atmosférou dusíku. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozdělí mezi vodu (15 ml) a ethylacetat (25 ml), organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se dále extrahuje ethylacetatem (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty se promyjí vodou (3 x 20 ml), poté se vysuší síranem hořečnatým a zfiltrují. Filtrát se odpaří za sníženého tlaku na olejový odparek, který se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu k získání odpovídaj ícího sulfonamidoaryl-4-chlorpyrrolo[2,3-d]pyrimidinu.

c) Směs 4-chlorpyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (obvykle 10 až 20 mmmol; z 1(b) výše), se smísí s dioaxanem (100 ml) a koncentrovaným hydroxidem amonným (100 ml) v tlakové nádobě. Směs se přes noc zahřívá na teplotu 120 °C. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se vyčistí RP-HPLC k získání požadovaného konečného 4-aminopyrrolo[2,3-d]pyrimidinového produktu.

Cesta 2

a) Směs příslušného bromanilinu (2,4 mmol), bispinakolatodiboranu (0,735 g, 2,88 mmol), komplexu [l,l’-bis(difenylfosfino)ferrocen]dichlorpalladia(II) s dichlormethanem (1:1) (59 mg, 0,072 mol) a octanu draselného (0,707 g, 7,205 mol) v N,N-dimethylformamidu (15 ml) se zahřívá na teplotu 100° C pod atmosférou dusíku 16 hodin. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědlo ·· ·· · · · · ·· « • ··· ···· • ····· ·· · ···· « · · · · • · · · · ♦ · ··· ·· ··· ·· ··· se odpaří za sníženého tlaku. K odparku se přidá toluen (20 ml) a směs se promyje vodou (2 x 15 ml). Organické fáze e vysuší síranem hořečnatým (pevným), odpaří ve vakuu a vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu k získání anilino-boratu.

b) Směs anilinoboratu 4-chlor-7-cyklopentyl-5-jod-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (0,24 g, 0,67 mmol), tetrakis(trifenylfosfin)palladia (0,04 g, 0,033 mmol) a uhličitanu sodného (0,215 g, 2,03 mmol) se zahřívá ve směsi dimethyletherethylenglykolu (10 ml) a vody (5 ml) na teplotu 80 °C 18 hodin pod atmosférou dusíku. Směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a rozpouštědla se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozdělí mezi vodu (15 ml) a ethylacetat (25 ml), organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se dále extrahuje ethylacetatem (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty se promyjí vodou (3 x 20 ml), poté se vysuší síranem hořečnatým a zfiltrují. Filtrát se odpaří za sníženého tlaku na olejový odparek, který se vyčistí bleskovou chromatografií na silikagelu k získání požadovaného 4-chlor-7cyklopentyl-5-(4-aminofenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu.

c) Směs 4-chlor-7-cyklopentyl-5-(4-aminofenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (0,201 mmol; z 2(b) výše), arylsulfonylchloridu (0,402 mmol) a pyridinu (1,005 mmol) v methylenchloridu se míchá při teplotě místnosti 16 hodin. Rozpouštědla se odstraní filtrací a sulfonamido-4-chlor-pyrrolopyrimidinový produkt se vyčistí RP-HPLC.

d) Sulfonamido-4-chlorpyrrolo[2,3-d]pyrimidin (obvykle 10 až 20 mmol; z 2(c) výše) se smísí s dioxanem (100 ml) a koncentrovaným hydroxidem amonným (100 ml) v tlakové • · · 9

-232- .* • ·

9 · 9 · · • ·9 • · · · · • · ·

9t

99 9 9 teplotu vyčistí

9 9

9 9 9 9

120 °C.

nádobě. Směs se přes noc zahřívá na Rozpouštědlo se odpaří a odparek se získání požadovaného konečného sulfonamido-4-aminopyr—

RP-HPLC k rolo[2,3-d]pyrimidinového produktu.

Analytické hodnoty RP-HPLC RT vedené v tabulce se získají na sloupci Hypersil HyPurity Elitě C18 ((5 μτη, 200 A) 250 x 4,6 mm) za použití lineárního gradientu 25 až 100% acetonitril - 0,1 M octan amonný během 25 minut při rychlosti toku 1 ml/min.

Je třeba si povšimnout, že při zavádění reaktivních substituentů může být vyžadována manipulace s chránícími skupinami.

Claims (43)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina představovaná následujícím strukturním vzorcem a její farmaceuticky přijatelné soli, kde kruh A je šestičlenný aromatický kruh nebo 5- nebo 6-členný heteroaromatický kruh, který je případně substituován jedním nebo více substituenty zvolenými ze substituované nebo nesubstituované alifatické skupiny, atomu halogenu, substituované nebo nesubstituované aromatické skupiny, substituované nebo nesubstituované heteroaromatické skupiny, substituovaného nebo nesubstituovaného cykloalkylu, substituovaného nebo nesubstituovaného heterocykloalkylu, substituovaného nebo nesubstituovaného aralkylu, substituovaného nebo nesubstituovaného heteroaralkylu, kyanoskupiny, nitroskupiny, -NR₄R₅, -C(O)2H, -OH, substituovaného nebo nesubstituovaného alkoxykarbonylu, -C (0)₂-halogenalkylu, substituovaného nebo nesubstituovaného alkylthioetheru, substituovaného nebo nesubstituovaného alkylsulfoxidu, substituovaného nebo nesubstituovaného alkylsulfonu, substituovaného nebo nesubstituovaného arylthioetheru, substituovaného nebo nesubstituovaného arylsulfoxidu, substituovaného nebo nesubstituovaného arylsulfonu, substituovaného nebo • · nesubstituovaného alkylkarbonylu, -C(0)-halogenalkylu, substituovaného nebo nesubstituovaného alifatického etheru, substituovaného nebo nesubstituovaného aromatického etheru, substituované nebo nesubstituované karboxamidoskupiny, tetrazolylu, trifluormethylsulfonamidoskupiny, trifluormethylkarbonylaminoskupiny, substituovaného nebo nesubstituovaného alkinylu, substituované nebo nesubstituované alkylamidoskupiny nebo alkylkarboxamidoskupiny, substituované nebo nesubstituované arylamidoskupiny nebo arylkarboxamidoskupiny, substituovaného nebo nesubstituovaného styrylu a substituované nebo nesubstituované aralkylamidoskupiny, aralkylkarboxamidoskupiny

   L je -0-; -S-; -S(0)-; -S(0)₂-; -N(R)-; N(C(O)OR)-; -N(C(O)R)-; -N(SO₂R)-; -CH₂O-; -CH₂S-; -CH₂N(R)-; -CH(NR)-; CH₂N(C(O)R) )-; -CH₂N (C(0)OR)-; -CH₂N (SO₂R)-; -CH(NHR)-; CH(NHC(0)R)-; CH(NHSO₂R)-; -CH(NHC(0)OR)-; -CH(OC(0)R)-; CH(OC(0)NHR)-; -CH=CH~; C(=NOR)-; -C(0)-; -CH(OR)-; C (0) N (R)-; -N (R) C (0)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)₂-; OC(O)N(R)-;

   -N (R) C (0) N (R)-NRC(O)O-; -S(O)N(R)-; -S(O)₂N(R)-;

   N (C (0) R) S (0)-; N (C (0) R) S (0) 2-; -N(R)S(O)N(R)-;

   -N (R) S (0) ₂N (R) -; C (0) N (R) C (0)-; -S(O)N(R)C(O)-;

   -S (0)₂N (R)C(O)-; -OS(O)N(R)-; -OS (0) ₂N (R) -; -N(R)S(O)O-;

   -N (R) S (0) ₂0-; -N (R) S (0) C (0)-; -N (R) S (0) ₂C (0)-;

   -SON (C (0) R)-; SO₂N (C (0) R) -; -N (R) SON (R)-; -N (R) SO₂N (R) -; -C(0)0-; -N(R)P(OR')O-; -N (R) P (OR' ) -; -N(R)P(O)(OR')O-; -N(R)P(O) (OR')-; -N(C(0)R)P(OR')0-; N(C(O)R)P(OR')-;

   -N(C(0)R)P(0)(0R')0- nebo -N(C(0)R)P(OR')-, kde R a R' jsou každý nezávisle, atom vodíku, acylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituovaná cykloalkylová skupina, nebo

   -249• · · · · « · • · ····· ·

   L je -R_bN (R) S (O) ₂, -, -R_bN(R)P(O)- nebo -R_bN (R) P (0) 0-, kde R_b je alkylenová skupina, která když se pojme spolu se sulfonamidovou, fosfinamidovou nebo fosfonamidovou skupinou, na kterou je navázána, tvoří 5- nebo 6-členný kruh kondenzovaný na kruh A, nebo

   L je představován jedním z následujících strukturních vzorců:

   nebo kde R85 pojatý dohromady se fosfinamidem nebo fosfonamidem je 5-, 6- nebo 7-členný aromatický, heteroaromatický nebo heterocykloalkylový kruhový systém,

   -250• · ·· ·· ···· ·· · • · · · · · · · · « · • · ····· · · · • · · · · · · · · · • · ·· ···· ········ · » ··· ·· ···

   R_x je atom vodíku, 2-fenyl-l,3-dioxan-5-yl, alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, cykloalkylová skupina se 3 až 8 atomy uhlíku, cykloalkenylová skupina s 5 až 7 atomy uhlíku nebo případně substituovaná fenyalkylskupina s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, kde alkylová, cykloalkylová a cykloalkenylová skupina, může být případně substituována jednou nebo více skupinami obecného vzorce -OR^a, za předpokladu, že -OR^a není umístěn na atomu uhlíku připojeném na atomu dusíku,

   R^a je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku nebo cykloalkylová skupina se 3 až 6 atomy uhlíku,

   R₂ je atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, atom halogenu, -OH, kyanoskupina, substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaralkyl, -NR4R5 nebo -C(O)NR₄R₅,

   R3 je substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina nebo substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, nebo L je NRSO₂-, NRC(O)-, NRC(O)O-, -S(O)₂NR-, -C(O)NRnebo -OC(O)NR- a R3 je substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkenyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aralkyl,

   -251 • · · · ···· · « • · · ··· ·· • · · · · · · ·· • · · · ···· • · · · · · za předpokladu,

   -NRC(O)- a R₃ je že j je 0, když L je -CH₂NR-, -C(O)NR- nebo azacykloalkyl nebo azaheteroaryl a za předpokladu, že j je 0 když L je

   -O- a R₃ je fenyl

   R₄, R₅ a atom dusíku dohromady tvoří a 3-, 4-, 5-, 6- nebo 7-členný, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl nebo substituovanou nebo nesubstituovanou heteroaromatickou skupinu nebo

   R₄ a R₅ jsou každý nezávisle atom vodíku, azabicykloalkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina nebo Y-Z,

   Y je zvolen z -C(O)-, -(CH₂)_p-, -S(O)₂, -C(0)0-, -SO₂NH-, -CONH-, -(CH₂)_pO-, -(CH₂)_pNH-, -(CH₂)_PS-, - (CH₂)_PS (O) - nebo -(CH₂)pS(O)2-, p je celé číslo od 0 do 6,

   Z je substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná aminoskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl nebo substituovaná nebo nesubstituovaná heterocykloalkylová skupina a j je celé číslo od 0 do 6.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde R₃ je zvolen ze skupiny sestávající ze substituovaného nebo nesubstituovaného fenylu, substituovaného nebo nesubstituovaného naftylu, substituovaného nebo nesubstituovaného pyridylu,

   -252-

   substituovaného nebo nesubstituovaného thienylu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzotriazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného tetrahydropyranylu substituovaného nebo nesubstituovaného tetrahydrofuranylu substituovaného nebo nesubstituovaného dioxanu, substituovaného nebo nesubstituovaného dioxolanu, substituovaného nebo nesubstituovaného chinolinu, substituovaného nebo nesubstituovaného thiazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného isoxazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného cyklopentanylu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzofuranu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzothiofenu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzisoxazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzisothiazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzothiazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného bezoxazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzoxazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného bezimidazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzoxadiazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzothiadiazolu, substituovaného nebo nesubstituovaného isochinolinu, substituovaného nebo nesubstituovaného chinoxalinu, substituovaného nebo nesubstituovaného indolu nebo substituovaného nebo nesubstituovaného pyrazolu.
3. 3. Sloučenina podle nároku 2, ve které R₃ je substituován jedním nebo více substituenty zvolenými ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, CH₃, N0₂, OCF₃, OCH₃, CN, CO₂CH₃, CF₃, terč.-butylu, pyridylu, substituovaného nebo nesubstituovaného oxazolylu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzylu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzensulfonylu, substituované nebo • · • · • · · · · · • · · · · · *φ • · · ···· ·

   - 253 - · ······· •t·—' φ _e φ ········ · · ··· nesubstituovaná fenoxyskupiny, substituovaného nebo nesubstituovaného fenylu, substituované nebo nesubstituované áminoskupiny, karboxylu, substituovaného nebo nesubstituovaného tetrazolylu, styrylu, -S-(substituovaného nebo nesubstituovaného arylu), -S(substituovaného nebo nesubstituovaného heteroarylu), substituovaného nebo nesubstituovaného heteroarylu, substituovaného nebo nesubstituovaného heterocykloalkylu, alkinylu, skupiny -C(O)NRfR_g, R_c a skupiny CH2OR_c,

   R_f, R_g a atom dusíku dohromady tvoří 3-, 4-, 5-, 6- nebo 7členný substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterobicykloalkyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaromatický kruh,

   R_f a R_g jsou každý nezávisle atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina a

   R_c je atom vodíku nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl,

   -W- (CH₂) _t-NR_dR_e, -W-(CH₂) t-O-alkyl, -W- (CH₂) _t-S-alkyl, -W(CH₂)_t-OH, t je celé číslo od 0 do asi 6,

   W je vazba nebo -0-, -S-, -S(O)-, -S(0)₂- nebo -NR_k,

   R_k je atom vodíku nebo alkyl a

   R_d, R_e a atom dusíku, na nějž jsou připojeny dohromady tvoří 3-, 4-, 5-, 6- nebo 7-členný substituovaný nebo

   -254 - nesubstituovaný heterocykloalkyl nebo substituovanou nebo nesubstituovanou heterobicyklickou skupinu, nebo

   R_d a R_e jsou každý nezávisle atom vodíku, alkyl, alkanoyl nebo -K-D,

   K je -S(0)₂-, -C(0)-, -C(O)NH~, -C(0)₂~ nebo přímá vazba,

   D je substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroaromatická skupina, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaralkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaná nebo nesubstituovaná aminoskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný aminoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aminocykloalkyl, COORi nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, a

   Ri je substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituovaná aromatická skupina.

   3. Sloučenina podle nároku 3, kde R3 je substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl, threnyl, benzoxadiazolyl nebo benzothiadiazolyl.
4. 4. Sloučenina podle nároku 1, kde kruh A je zvolen ze skupiny sestávající ze substituovaného nebo nesubstituovaného fenylu, substituovaného nebo nesubstituovaného naftylu, substituovaného nebo nesubstituovaného pyridylu a substituovaného nebo nesubstituovaného indolu.
5. 5. Sloučenina podle nároku 5, kde kruh A je substituován ·· ♦· ·· · · · · · · · ···· ··· ···· • · ····· ·· « - 255 - · ···· ····· · · ·· ···· ········ ·· ··· ·· ·«· jedním nebo více substituentů zvolených ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, CH₃, N0₂, OCF₃, OCH₃, CN, CO₂CH₃, CF₃, terč.-butylu, pyridylu, substituovaného nebo nesubstituovaného oxazolylu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzylu, substituovaného nebo nesubstituovaného benzensulfonylu, substituované nebo nesubstituované fenoxyskupiny, substituovaného nebo nesubstituovaného fenylu, substituované nebo nesubstituované aminoskupiny, karboxylu, substituovaného nebo nesubstituovaného tetrazolylu, styrylu, -S-(substituovaného nebo nesubstituovaného arylu), -S-(substituovaného nebo nesubstituovaného heteroarylu), substituovaného nebo nesubstituovaného heteroarylu, substituovaného nebo nesubstituovaného heterocykloalkylu, alkinylu, skupiny C(O)NRfR_g, R_c a skupiny CH₂OR_c,

   R_f, R_g a atom dusíku dohromady tvoří 3-, 4-, 5-, 6- nebo 7členný substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovanou nebo nesubstituovanou heterobicyklickou skupinu nebo substituovanou nebo nesubstituovanou heteroaromatickou skupinu, nebo

   R_f a R_g jsou každý nezávisle atom vodíku substituovaná nebo nesubstituované alifatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituované aromatická skupina,

   R_c je atom vodíku nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, -W(CH₂) _t-NR_dR_e, -W- (CH₂) _t-O-alkyl, -W- (CH₂) _t-S-alkyl,

   -W (CH₂) _t-0H, t je celé číslo od 0 do 6,

   -256 ·· ♦· ··*··* ·· · ···· ♦·· ···· • · ·«··· ·· · • ···· ···· · • · ·· ···· ···· ···· ·· ··· ·· ···

   W je vazba nebo -0-, -S-, -S(0)-, -S(0)₂- nebo -NR_k,

   R_k je atom vodíku nebo alkyl, a

   R_d, R_e a atom dusíku, na nějž jsou připojeny dohromady tvoří 3-, 4-, 5-, 6- nebo 7-členný substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl nebo substituovanou nebo nesubstituovanou heterobicyklickou skupinu nebo substituovanou nebo nesubstituovanou heteroaromatickou skupinu, nebo

   R_d a R_e jsou každý nezávisle atom vodíku, alkyl, alkanoyl nebo -K-D,

   K je -S(0)₂ ^—, -C(0)-, -C(O)NH-, ~C(0)₂~ nebo přímá vazba,

   D je substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný aralkyl, substituovaná nebo nesubstituované heteroaromatická skupina, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaralkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyl, substituovaná nebo nesubstituované aminoskupina, substituovaný nebo nesubstituovaný aminoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aminocykloalky1, COORj nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl,

   Ri je substituovaná nebo nesubstituované alifatická skupina nebo substituovaná nebo nesubstituované aromatická skupina.
6. 6. Sloučenina podle nároku 6, kde kruh A je substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl.

   ·· ·· *··· ·· · • · · · « * i *··· • · · · t · · ·· ·

   -257- : : ·: : :

   ········ ·· ·«· · · ···
7. 7. Sloučenina podle nároku 1, kde R¹ je cyklopentylová skupina, hydroxycyklopentyl nebo isopropyl.
8. 9. Sloučenina zvolená ze skupiny zahrnující

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-(trifluormethoxy)-1-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-2-chlor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-2-fluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-chlor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-3-fluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-1-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-nitrofenyl)-1-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-3-(trifluormethyl)-1-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-chlorfenyl)-4-chlor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-258·· ·· ·· ·«·· ·· · • · · * < ♦ ř<··· • « · · · · «♦ · « • · 4«·<·« »··· »·*♦ *>· «*· ·» »'·

   -yl)-2-chlorfenyl)-2-kyan-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-nitro-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,6-difluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-methoxyfenyl)1-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,3,4-trifluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) -2-fluorfenyl)-4-brom-2-fluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl}-2,5-difluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)3,4-difluor-l-benzensulfonamid,

   Nl-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-brom-l-benzensulfonamid,

   Nl-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)2,6-dichlor-l-benzensulfonamid,

   Nl-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,4,6-trichlor-l-benzensulfonamid,

   Nl-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5• · • ·

   9« ······

   4 · · · ····· • » ····♦ · · --Q .··»··»♦·

   - 259 - *······ ········ * · · · ·· ·

   -yl)-2-fluorfenyl)2,4-dichlor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-5-yl) -2-fluorfenyl)-2-chlor-4-fluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)2,4-difluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopeníy1-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-jod-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)2,3-dichlor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopeníy1-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-4-brom-2,5-difluor-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopeníy1-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-chlor-4-kyan-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopeníy1-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2-chlor-6-meíhyl-l-benzensulfonamid,

   NI-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-3-chlor-2-meíhyl-l-benzensulfonamid,

   N2-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-4,5-dibrom-2-íhiofensulfonamid,

   N2-(4-(4-amino-7-cyklopeníy1-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-5-brom-2-íhiofensulfonamid,

   N2-(4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5• · • · ···· · · • · * · · · < » · · · ♦ ·

   - 260 - . .* í í · * · · ········ ·· · *· · · *

   -yl)-2-fluorfenyl)-3-brom-5-chlor-2-thiofensulfonamid,

   N3-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,5-dichlor-3-thiofensulfonamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,1,3-benzothiadiazol-4-sulfonamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,1,3-benzoxadiazol-4-sulfonamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-7-chlor-2,1,3-benzoxadiazol-4-sulfonamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-7-methyl-2,1,3-benzothiadiazol-4-sulfonamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-5-methyl-2,1,3-benzothiadiazol-4-sulfonamid,

   N4-(4-(4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-5-chlor-2,1,3-benzothiadiazol-4-sulfonamid,

   N- (4-(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-(2-nitrofenyl)methansulfonamid,

   NI-(4 -(4-amino-7-cyklopeníyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)-2-fluorfenyl)-2,5-dibrom-3,6-difluor-l-benzensulfon amid a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

   • ·

   -261 -
9. 10. Sloučenina podle nároku 1, kde R₂ je atom vodíku.
10. 11. Sloučenina podle nároku 1, kde L je -0-, -NHSO2R-, -NHC(O)O- nebo -NHC(O)R-.
11. 12. Způsob inhibice aktivity proteinkinasy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 nebo její fyziologicky přijatelné soli, jejího prekurzoru léčiva nebo jejích biologicky aktivních metabolitů.
12. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedená proteinkinasa je zvolena ze skupiny sestávající z KDR, FGFR-1, PDGFRP, PDGFRa, IGF-1R, c-Met, Flt-1, TIE-2, Lek, Src, fyn, Lyn, Blk a yes.
13. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že aktivita uvedené proteinkinasy ovlivňuje hyperproliferativní poruchy.
14. 15. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že aktivita uvedené proteinkinasy ovlivňuje angiogenesi, vaskulární permaebilitu, imunitní odpovědi nebo zánět.
15. 16. Způsob léčby pacienta, který je postižen stavem, který je zprostředkován aktivitou proteinové kinasy, vyznačující se tím, že zahrnuje krok podávání pacientovi terapeutického množství sloučeniny obecného vzorce I, podle nároku 1 nebo její fyziologicky přijatelné soli, jejího prekurzoru léčiva nebo jejího biologicky aktivního metabolitů.

    • · · ·

    -262• · · · ·· • · · ·· • · ·· ··· ·· ···
16. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedená proteinkinasa je zvolena ze skupiny sestávající z KDR, Flt-1, PDGFRP, PDGFRa, IGF-1R, c-Met, TIE-2, Lek, Src, fyn, Lyn, Blk a yes.
17. 18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinkinasy je hyperproliferativní porucha.
18. 19. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že aktivita uvedené proteinkinasy ovlivňuje angiogenesi, vaskulární permaebilitu, imunitní odpovědi nebo zánět.
19. 20. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že aktivita uvedené proteinkinasy ovlivňuje angiogenesi nebo vaskulární permaebilitu.
20. 21. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že proteinkinasou je proteinová serin-/threoninkinasa nebo proteinová tyrosinkinasa.
21. 22. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinkinasy je jeden nebo více vředů.
22. 23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že vřed nebo vředy jsou způsobeny bakteriální nebo houbovou infekcí, nebo vřed nebo vředy jsou Moorenovými vředy nebo vřed nebo vředy jsou symptomy uleerativní kolitidy.

    ·· ·· ·· · · · · ···· · · ·· · · • · · · · · ···

    -263 - : ::

    ········ ·· · · ··· ·
23. 24. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je Lymeská choroba, sepse nebo infekce Herpes simplex, Herpes Zoster, virem lidské imunodeficience, parapoxvirem, protozoem nebo toxoplasmatem.
24. 25. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je Hippel Lindauova choroba, pemfigoid, psoriasa, Pagetova choroba nebo polycystická choroba ledvin.
25. 26. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je fibrosa, sarkoidosa, cirhosa, thyroiditida, syndrom hyperviskosity, Osler-Weber-Rendiova choroba, chronická obstrukční plicní choroba, astma, exsudáty, ascites, pleurální výpotky, perikardiální výpotky, plicní edém, cerebrální edém nebo edém po popáleninách, traumatu, ozáření, mrtvici, hypoxii nebo ischemii.
26. 27. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je syndrom ovariální hyperstimulace, preeklampsie, menometrorhagie nebo endometriosa.
27. 28. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je chronický zánět, systémový lupus, glomerulonefritida, synovitida, choroba zánětlivého střeva, Crohnova choroba, glomerulonefritida, revmatoidní artritida a osteoartritida, roztroušená sklerosa nebo odmítnutí štěpu.
28. 29. Způsob podle nároku 16, vyznačující se

    -264• · ·· ·· ···· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ······· · · ··· tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je srpkovitá anémie.
29. 30. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je stav oka.
30. 31. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že stavem oka je oční nebo makulární edém, okulární neovaskulární choroba, skleritida, radiální keratotomie, uveitida, vitritida, myopie, důlky na oku po neštovicích, chronické odchlipování retiny, komplikace po ošetření laserem, konjunktivitida, Stagardtova choroba a Ealesova choroba, retinopatie nebo makulární degenerace.
31. 32. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je stav kardiovaskulární.
32. 33. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je atherosklerosa, restenosa, poškození při ischemii/reperfusi, vaskulární okluse, venosní malformace nebo obstrukční choroba karotidy.
33. 34. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je rakovina.
34. 35. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že rakovinou je solidní tumor, sarkom, fibrosarkom, osteom, melanom, retinoblastom, rhabdomyosarkom,

    -265 44 44 444444 • 444 4444

    4 4 4 4 4 4 44

    4 4 4 4 44

    44444444 44444 glioblastom, neuroblastom, teratokarcinom, hemetopoietická malignita nebo maligní ascites.
35. 36. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že rakovinou je Kaposiho sarkom, Hodgkinova choroba, lymfom, myelom nebo leukemie.
36. 37. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným aktivitou proteinové kinasy je Crow-Fukasův syndrom (POEMS) nebo diabetický stav.
37. 38. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že diabetickým stavem je glaukom při diabetů mellitus závislém na inzulínu, diabetická retinopatie nebo mikroangiopatie.
38. 39. Způsob snížení plodnosti pacienta vyznačuj ίο i se t í m, že zahrnuje krok podávání pacientovi terapeutického množství sloučeniny obecného vzorce I, podle nároku 1 nebo její fyziologicky přijatelné soli, jejího prekurzoru léčiva nebo jejího biologicky aktivního metabolitu.
39. 40. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelná sůl, její prekurzor léčiva nebo její biologicky aktivní metabolit se podávají v množství účinném k usnadnění angiogenese nebo vaskulogenese.
40. 41. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že proteinkinasou je Tie-2.

    •« •· •· •· •· •· •· •·

    -266-

    I nebo její tím, že sloučenina obecného vzorce fyziologicky přijatelná sůl, její prekurzor léčiva nebo její biologicky aktivní metabolit se podávají v kombinaci se proangiogenním růstovým faktorem.
41. 43. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že proangiogenní faktor je zvolen ze skupiny zahrnující VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, HGF, FGF1, FGF-2, jejich deriváty a antijodotypické protilátky.
42. 44. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že stavem zprostředkovaným protienkinasou je anemie, ischemie, infarkt, odmítnutí transplantátu, poranění, gangréna nebo nekrosa.
43. 45. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že aktivita proteinkinasy zahrnuje aktivaci T-buněk, aktivaci B-buněk, degranulaci mastocytů, aktivaci monocytů, potenciaci zánětlivé odpovědi nebo jejich kombinaci.