SK288089B6

SK288089B6 - IL-1 Beta binding molecule, expression vector, process for production of IL-1 beta binding molecule, use of antibody and pharmaceutical composition

Info

Publication number: SK288089B6
Application number: SK213-2003A
Authority: SK
Inventors: Hermann Gram; Padova Franco E. Di
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-08-22
Filing date: 2001-08-20
Publication date: 2013-06-03
Also published as: LU91624I2; PL212480B1; NO2012018I2; US20090081732A1; HUS1300015I1; CY2009019I1; US20110256151A1; JP2004506448A; KR100910789B1; NO20030827D0; CZ2003505A3; CA2420231C; WO2002016436A2; PE20020319A1; WO2002016436A3; IL154465A; BRPI0113420B1; EP1313769B2; RU2286351C2; CZ304470B6

Abstract

Described is an IL-1 beta binding molecule, in particular an antibody to human IL-1 beta , especially a human antibody to human IL-1 beta is provided, wherein the CDRs of the heavy and light chains having amino acid sequences as defined, for use in the treatment of an IL-1 mediated disease or disorder, e.g. osteoarthritis, osteoporosis and other inflammatory arthritides.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka protilátok proti ľudskému interleukínu I beta (IL-Ιβ) a využitia týchto protilátok pri liečení IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch.

Doterajší stav techniky

Interleukín 1 (IL-1) je tkanivový hormón, tvorený bunkami imunitného systému, ktorý pôsobí ako mediátor akútnej fázy zápalovej reakcie. Nedostatočná alebo nadbytočná produkcia IL 1, konkrétne IL-1 β, je spojená s patológiou rôznych ochorení, porúch a stavov, ako napr. septikémia, septický alebo endotoxický šok, alergia, astma, strata kostnej hmoty, ischémia, mŕtvica, reumatoidná artritída a ďalšie zápalové chorobné stavy. Protilátky proti IL-1 β už boli navrhované kvôli využitiu pri liečbe IL-1 sprostredkovaných chorôb a chorobných stavov, pozri napríklad WO 95/01997, konkrétne diskusiu v úvode uvedenej prihlášky.

Autori predkladaného vynálezu však pripravili vylepšené protilátky proti ľudskému IL-Ιβ vhodné na využitie pri liečbe IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález teda poskytuje IL-Ιβ väzbovú molekulu, ktorá obsahuje väzbové miesto pre antigén, obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H), ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro, a ich priame ekvivalenty.

Predkladaný vynález tiež poskytuje IL-Ιβ väzbovú molekulu, ktorá obsahuje aspoň jednu variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulínu (Vl), ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDRľ, CDR2' a CDR3', kde CDRľ má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His, CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser a CDR3' má aminokyselinovú sekvenciu His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro a ich priame ekvivalenty.

V prvom aspekte vynález poskytuje jednodoménovú IL-Ιβ väzbovú molekulu, ktorá obsahuje izolovaný ťažký reťazec imunoglobulínu obsahujúci variabilnú doménu ťažkého reťazca (V_H), tak ako už je definovaná. V druhom aspekte vynález taktiež poskytuje IL-Ιβ väzbovú molekulu, ktorá obsahuje variabilné domény ťažkého (V_H) ako aj ľahkého reťazca (V_L), pričom IL-Ιβ väzbová molekula obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén, ktoré obsahuje:

(a) variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H), ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro, a (b) variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulínu (V_L), ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDRľ, CDR2' a CDR3', kde CDRľ má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His, CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser a CDR3' má aminokyselinovú sekvenciu His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro a ich priame ekvivalenty.

Ak nie je uvedené inak, ktorýkoľvek polypeptidový reťazec je v tomto texte opisovaný tak, že jeho aminokyselinová sekvencia začína N-koncovým úsekom a končí C-koncovým úsekom (v smere čítania zľava doprava). Ak väzbové miesto pre antigén obsahuje obe V_H a V_L domény, tieto domény môžu byť lokalizované v tej istej polypeptidovej molekule alebo výhodne každá doména môže byť na inom reťazci, pričom V_Hdoména je časťou ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jeho fragmentu a V_L je časťou ľahkého reťazca imunoglobulínu alebo jeho fragmentu.

Termín „IL-Ιβ väzbová molekula“ označuje ktorúkoľvek molekulu schopnú viazať sa na IL-Ιβ antigén buď samotný, alebo v spojení s inými molekulami. Väzbová reakcia sa môže dokázať štandardnými metódami (kvalitatívne testy) vrátane napr. biologických testov na stanovenie inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, alebo ktorýmkoľvek z množstva známych väzbových testov, ktorý sa vzťahuje k negatívnemu kontrolnému testu, v ktorom sa použije protilátka nepríbuznej špecificity ale rovnakého izotypu, napr. protilátka anti-CD25. Väzba IL-Ιβ väzbovej molekuly na IL-Ιβ sa podľa vynálezu môže výhodne dokázať pomocou kompetitívneho väzbového testu.

Príklady molekúl viažucich antigén zahŕňajú protilátky produkované B-lymfocytmi alebo hybridómami a chimérické protilátky, protilátky so „vštepenými“ CDR („CDR-grafted“) alebo ľudské protilátky, alebo akékoľvek ich fragmenty, napr. fragmenty F(ab')₂ a Fab, ako aj jednoreťazcové („single chain“) protilátky alebo jednodoménové („single domain“) protilátky.

SK 288089 Β6

Jednoreťazcová protilátka pozostáva z variabilných domén ťažkého a ľahkého reťazca protilátky kovalentne spojených pomocou peptidovej spojky („linker“), ktorú tvorí obvykle 10 až 30 aminokyselín, výhodne od 15 do 25 aminokyselín. Takže takáto štruktúra neobsahuje konštantné úseky ťažkého a ľahkého reťazca a verí sa, že malý spojovací peptidový úsek by mal byť menej antigénny ako celý konštantný úsek protilátky. Termín „chimérická protilátka“ v opise označuje protilátku, v ktorej konštantné úseky ťažkého alebo ľahkého reťazca, prípadne oboch, sú ľudského pôvodu, kým variabilné domény ťažkého ako aj ľahkého reťazca sú iného ako ľudského pôvodu (non-human), napr. z myši, alebo sú ľudského pôvodu, ale pochádzajú z odlišnej ľudskej protilátky. Termín „protilátka so „vštepenými“ CDR“ označuje protilátku, v ktorej hypervariabilné úseky (CDR) pochádzajú z donorovej protilátky, ako je napr. iná ako ľudská (napr. myšia) protilátka alebo odlišná ľudská protilátka, kým všetky ostatné alebo takmer všetky ostatné časti imunoglobulínu, napr. konštantné úseky a vysoko konzervatívne úseky variabilných domén, t. j. rámcové úseky (ktoré definujú základnú štruktúru, tzv. rámec protilátky „fŕamework“), pochádzajú z akceptorovej protilátky, napr. protilátky ľudského pôvodu. Protilátka so „vštepenými“ CDR však môže obsahovať niekoľko aminokyselín donorovej sekvencie v úsekoch rámca, napr. v častiach rámcových úsekoch susediacich s hypervariabilnými úsekmi. Termín „ľudská protilátka“ označuje protilátku, v ktorej konštantné a variabilné úseky ťažkého a ľahkého reťazca sú všetky ľudského pôvodu, alebo majú sekvencie v podstate identické so sekvenciami ľudského pôvodu, pričom nemusia byť nevyhnutne z tej istej protilátky, a patria sem aj protilátky produkované v myšiach, v ktorých myšie imunoglobulínové gény pre variabilné a konštantné časti sú nahradené ich ľudskými náprotivkami (couterparts), napr. ako je opísané všeobecne v patentových dokumentoch EP 0546073, US Patent 5545806, US Patent 5569825, US Patent 5625126, US Patent 5633425, US Patent 5661016, US Patent 5770429, EP 0438474B1 a EP 0463151B1.

Obzvlášť výhodnými IL-1 β väzbovými molekulami sú podľa vynálezu ľudské protilátky, najmä protilátka ACZ 885, ktorá je ďalej opísaná v príkladoch.

Takže vo výhodných chimérických protilátkach sú variabilné domény ťažkého ako aj ľahkého reťazca ľudského pôvodu, napríklad také, aké sú v protilátke ACZ 885, a ktoré sú v zozname sekvencií uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a sekvencia SEQ ID NO: 2. Domény konštantného úseku taktiež výhodne obsahujú vhodné ľudské domény konštantného úseku, tak ako to je opísané napr. v publikácii „Sequences of Proteins of Imunological Interest“, Kabat E.A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Inštitúte of Health.

Hypervariabilné úseky môžu byť spojené s úsekmi rámca protilátky akéhokoľvek druhu, ale výhodne sú ľudského pôvodu. Vhodné úseky rámca protilátky sú opísané v Kabat E.A. et al. (cit. už uvedená). Výhodný rámec (fŕamework) ťažkého reťazca je ľudský rámec ťažkého reťazca, napr. protilátky ACZ 885, ktorý je uvedený v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1. Táto sekvencia pozostáva z úsekov FR1, FR2, FR3 a FR4. Podobne sekvencia SEQ ID NO: 2 ukazuje výhodný rámec ľahkého reťazca protilátky ACZ 885, ktorý pozostáva z úsekov FRľ, FR2', FR3' a FR4 '.

Takže vynález taktiež poskytuje IL-1 β väzbovú molekulu, ktorá obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén, obsahujúce buď prvú doménu s aminokyselinovou sekvenciou takmer identickou so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 118, alebo prvú doménu, ako je už opísaná a druhú doménu s aminokyselinovou sekvenciou v podstate identickou so sekvenciou, ktorá je uvedená v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 2, začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 107.

Monoklonálne protilátky proti proteínom, ktoré sa prirodzene vyskytujú u všetkých ľudí, sú typicky produkované v iných ako ľudských (non-human) systémoch, napr. v myši. Priamym dôsledkom tejto skutočnosti je fakt, že ak sa xenogénna protilátka, ktorá je produkovaná pomocou hybridómu, podáva človeku, vyvoláva nežiaducu imunitnú reakciu, ktorá je predovšetkým sprostredkovaná prostredníctvom konštantnej časti xenogénneho imunoglobulínu. To samozrejme obmedzuje použitie takýchto protilátok, pretože sa nemôžu podávať počas dlhšieho obdobia. Z tohto dôvodu je obzvlášť výhodné použitie jednoreťazcových, jednodoménových, a chimérických protilátok, protilátok so „vštepenými“ CDR alebo ľudských protilátok, ktoré po podaní človeku s veľkou pravdepodobnosťou nevyvolajú významnú alogénnu reakciu.

S ohľadom na skutočnosti, ktoré sú už uvedené, výhodnejšou IL-Ιβ väzbovou molekulou je podľa predkladaného vynálezu molekula vybratá zo skupiny ľudských anti-IL-Ιβ protilátok, ktoré obsahujú aspoň (a) ťažký reťazec imunoglobulínu alebo jeho fragment, ktorý obsahuje (i) variabilnú doménu obsahujúcu sled hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, (ii) konštantný úsek alebo jeho fragment z ľudského ťažkého reťazca, kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro a (b) ľahký reťazec imunoglobulínu alebo jeho fragment, ktorý obsahuje (i) variabilnú doménu obsahujúcu sled hypervariabilných úsekov a ľubovoľne taktiež hypervariabilné úseky CDRľ, CDR2' a CDR3', (ii) konštantný úsek alebo jeho fragment z ľudského ľahkého reťazca, kde CDRľ má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His, CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Ala-Ser-Gln-Ser-Phe3

SK 288089 Β6

-Ser a CDR3' má aminokyselinovú sekvenciu His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro a ich priame ekvivalenty.

Alternatívne, IL-Ιβ väzbovou molekulou je podľa vynálezu molekula vybratá zo skupiny jednoreťazcových väzbových molekúl, ktorá obsahuje väzbové miesto pre antigén obsahujúce (a) prvú doménu, ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, pričom tieto hypervariabilné úseky majú aminokyselinové sekvencie uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 1, (b) druhú doménu, ktorá obsahuje hypervariabilné úseky CDRľ, CDR2' a CDR3', pričom tieto hypervariabilné úseky majú aminokyselinové sekvencie uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 2, (c) peptidový linker, ktorý je naviazaný buď na N-koniec prvej domény a C-koniec druhej domény, alebo je naviazaný na C-koniec prvej domény a N-koniec druhej domény a ich priame ekvivalenty.

Ako je odborníkom dobre známe, malé zmeny v aminokyselinovej sekvencii, ako napríklad delécia (odstránenie), adícia (pridanie) alebo substitúcia (nahradenie) jednej, niekoľkých alebo dokonca viacerých aminokyselín môže umožniť vznik alelickej formy pôvodného proteínu, ktorá má v podstate identické vlastnosti.

Z tohto dôvodu termín Jej priamy ekvivalent“ označuje v predkladanom opise vynálezu buď jednodoménovú IL-Ιβ väzbovú molekulu (molekulu X), (i) v ktorej hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, zobrané ako celok, sú aspoň na 80 % homologické, výhodne aspoň na 90 % homologické, výhodnejšie aspoň na 95 % homologické s hypervariabilnými úsekmi uvedenými v sekvencii SEQ ID NO: 1, a (ii) ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jej receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako referenčná molekula, ktorá má úseky protilátkového rámca identické so zodpovedajúcimi úsekmi molekuly X, ale má hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 identické so zodpovedajúcimi úsekmi, ktoré sú uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 1, alebo ktorúkoľvek IL-Ιβ väzbovú molekulu, ktorá má aspoň dve domény na každé väzbové miesto (molekulu X'), (i) v ktorej hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDRľ, CDR2' a CDR3', zobraté ako celok, sú aspoň na 80 % homologické, výhodne aspoň na 90 % homologické, najvýhodnejšie aspoň na 95 % homologické s hypervariabilnými úsekmi uvedenými v sekvencii SEQ ID NO: 1 a v sekvencii SEQ ID NO: 2, a (ii) ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jej receptor v podstate v tom istom rozsahu ako referenčná molekula, ktorá má úseky protilátkového rámca a konštantné úseky identické so zodpovedajúcimi úsekmi molekuly X, pričom hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDRľ, CDR2' a CDR3' sú identické so zodpovedajúcimi úsekmi, ktoré sú uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 1 a sekvencii SEQ ID NO: 2.

V kontexte predkladaného opisu vynálezu sú aminokyselinové sekvencie aspoň na 80 % homologické s druhou sekvenciou v prípade, že tieto sekvencie majú aspoň 80 % identických aminokyselinových zvyškov v rovnakej polohe, keď sa tieto sekvencie vzájomne porovnávajú, pričom medzery alebo inzercie v aminokyselinovej sekvencii nie sú považované za identické zvyšky.

Inhibícia väzby IL-Ιβ na jej receptor sa môže jednoducho otestovať pomocou rôznych testov, ako sú napr. testy opísané ďalej v texte. Výraz „v tom istom rozsahu“ alebo „v rovnakej miere“ znamená v kontexte predkladaného opisu, že referenčná a s ňou ekvivalentná molekula štatisticky majú v podstate identickú krivku (t. j. funkčnú vzdialenosť) inhibície väzby IL-Ιβ podľa jedného z testov, ktoré sú už spomenuté. Napríklad IL-Ιβ väzbové molekuly podľa vynálezu typicky majú IC₅₀s pre inhibíciu väzby IL-Ιβ na jeho receptor v rozmedzí +/-x5 hodnoty, výhodne v podstate zhodnú s hodnotou IC₅₀ zodpovedajúcou referenčnej molekule, ak sa testuje rovnakým spôsobom, ako už je opísané.

Napríklad sa môže použiť test kompetitívnej inhibície väzby IL-Ιβ rozpustným receptorom IL-1 a IL-Ιβ väzbovými molekulami podľa vynálezu.

Najvýhodnejšia ľudská IL-Ιβ protilátka obsahuje aspoň (a) jeden ťažký reťazec, ktorý obsahuje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou SEQ ID NO: 1 začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 118a konštantný úsek ťažkého reťazca a (b) jeden ľahký reťazec, ktorý obsahuje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou SEQ ID NO: 2 začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 107 a konštantný úsek ľudského ľahkého reťazca.

Konštantný úsek ľudského ťažkého reťazca môže byť typu y_b γ₂, γ₃ a γ₄, μ, a_b α₂, δ alebo ε, výhodne typu γ, výhodnejšie typu y_b kým konštantný úsek ľudského ľahkého reťazca môže byť typu κ alebo λ (ktorý zahŕňa subtypy λ], λ₂ a λ₃), ale výhodne je to typ k. Aminokyselinové sekvencie všetkých týchto konštantných úsekov sú uvedené v publikácii Kabat et al. (už citované).

Podľa predkladaného vynálezu sa všetky IL-Ιβ väzbové molekuly môžu pripraviť metódami rekombinantných DNA. Na tento účel je potrebné pripraviť jednu alebo viac molekúl DNA kódujúcich väzbovú molekulu a túto DNA molekulu umiestniť pod kontrolu vhodnej riadiacej sekvencie a preniesť do vhodného hostiteľského organizmu, kde je potom exprimovaná.

Vo všeobecnom význame teda predkladaný vynález poskytuje:

(i) DNA molekuly, ktoré kódujú jednodoménovú IL-Ιβ väzbovú molekulu podľa vynálezu, jednoreťaz4

SK 288089 Β6 covú IL-Ιβ väzbovú molekulu podľa vynálezu, ťažké alebo ľahké reťazce alebo ich fragmenty IL-Ιβ väzbovej molekuly podľa vynálezu a (ii) použitie DNA molekuly podľa vynálezu na produkciu IL-Ιβ väzbovej molekuly podľa vynálezu pomocou rekombinantnej technológie.

Súčasný stav techniky je taký, že odborník je schopný jednoducho syntetizovať DNA molekuly podľa predkladaného vynálezu na základe informácií, ktoré sú uvedené v tomto opise, t. j. aminokyselinových sekvencií hypervariabilných úsekov a DNA sekvencii, ktorými sú kódované. Spôsob konštrukcie génu pre variabilnú doménu je napr. opísaný v dokumente EPA 239 400 a môže byť stručne zhrnutý nasledovne: klonuje sa gén, ktorý kóduje variabilnú doménu mAb (monoklonálnej protilátky) s ľubovoľnou špecificitou. Určia sa DNA segmenty, ktoré kódujú rámcové a hypervariabilné úseky, a DNA segmenty kódujúce hypervariabilné úseky sa odstránia, takže DNA segmenty kódujúce rámcové úseky sú navzájom spojené pomocou vhodných reštrikčných miest v mieste spojenia. Reštrikčné miesta sa môžu vytvoriť vo vhodných polohách mutagenézou DNA molekúl pomocou štandardných postupov, ktoré sú odborníkom známe. Dvojreťazcové syntetické CDR kazety sa pripravia pomocou DNA syntézy podľa sekvencie, ktorá je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 1 alebo sekvencia SEQ ID NO: 2. Tieto kazety sú vybavené „lepivými“ („sticky“) koncami, takže sa môžu spojiť (ligovať) s vhodnými koncami rámca.

Okrem toho, aby bolo možné získať DNA konštrukt, ktorý kóduje IL-Ιβ väzbovú molekulu podľa vynálezu, nie je potrebné, aby bola dostupná mRNA z produkujúcej hybridómovej bunkovej línie. Tak napr. PCT prihláška publikovaná ako WO 90/07861 poskytuje kompletné inštrukcie na produkciu protilátky pomocou techniky rekombinantnej DNA, pričom východiskovou informáciou je len nukleotidová sekvencia génu. Tento spôsob zahŕňa syntézu množstva oligonukleotidov, ich amplifikáciu pomocou PCR (polymerázovej reťazovej reakcie) a nakoniec ich zostrih a spojenie („splicing“), čím vznikne požadovaná DNA sekvencia.

Expresné vektory, ktoré obsahujú vhodný promótor alebo gény kódujúce konštantné úseky ťažkého a ľahkého reťazca, sú odbornej verejnosti bežne k dispozícii. Takže len čo je raz DNA molekula podľa vynálezu pripravená, dá sa ľahko preniesť do vhodného expresného vektora. DNA molekuly, ktoré kódujú jednoreťazcové protilátky, môžu byť taktiež pripravené pomocou štandardného postupu, napríklad tak, ako je opísané v medzinárodnej patentovej prihláške WO 88/1649.

Vzhľadom na skôr uvedené nie je nutné uchovávať hybridómy ani bunkové línie, aby bola splnená požiadavka dostatočnosti a úplnosti opisu vynálezu.

V konkrétnom uskutočnení predkladaný vynález poskytuje prvý a druhý DNA konštrukt na produkciu ILΙβ väzbovej molekuly, tak ako sú opísané neskôr.

Prvý DNA konštrukt kóduje ťažký reťazec alebo jeho fragment a obsahuje (a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo rámcové a variabilné úseky, pričom variabilné úseky sú sledom úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1, a táto prvá časť začína kodónom, ktorý kóduje prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom, ktorý kóduje poslednú aminokyselinu variabilnej domény a (b) druhú časť kódujúcu konštantný úsek ťažkého reťazca alebo jeho fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ťažkého reťazca a končí kodónom, ktorý kóduje poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.

Výhodne, prvá časť kóduje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je uvedená v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1, začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 118. Výhodnejšie má prvá časť nukleotidovú sekvenciu, ktorá je uvedená v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúcu nukleotidom v polohe 1 a končiacu nukleotidom v polohe 354. Tiež výhodne druhá časť kóduje konštantnú časť ľudského ťažkého reťazca, výhodnejšie konštantnú časť ľudského ťažkého reťazca γΐ. Táto druhá časť môže byť DNA fragment genómového pôvodu, (obsahujúci intróny) alebo fragment cDNA (bez intrónov).

Druhý DNA fragment kóduje ľahký reťazec alebo jeho fragment a obsahuje (a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu, ktorá obsahuje striedavo rámcové a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú CDR3' a voliteľne CDRľ a CDR2', s aminokyselinovými sekvenciami uvedenými v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 2, pričom táto prvá časť začína kodónom, ktorý kóduje prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom, ktorý kóduje poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a (b) druhú časť, ktorá kóduje konštantnú časť ľahkého reťazca alebo jej fragment, ktorý začína kodónom, ktorý kóduje prvú aminokyselinu konštantnej časti ľahkého reťazca a končí kodónom, ktorý kóduje poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.

Výhodne táto prvá časť kóduje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je v zozname sekvencii uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 2, začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 107. Výhodnejšie má prvá časť nukleotidovú sekvenciu, ktorá je v zozname sekvencii uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 2, začínajúcu nukleotidom v polohe 1 a končiacu nukleotidom v polohe 321. Tiež výhodne druhá časť kóduje konštant5 nú časť ľudského ľahkého reťazca, výhodnejšie konštantnú časť ľudského reťazca k.

Vynález tiež zahŕňa IL-Ιβ väzbové molekuly, v ktorých je jeden alebo viac zvyškov z CDR1, CDR2, CDR3, CDRľ, CDR2' alebo CDR3', alebo rámcových úsekov, typicky len niekoľko (napr. 1 až 4) zmenených v porovnaní so sekvenciou SEQ ID NO: 1 a sekvenciou SEQ ID NO: 2, napr. mutáciou napr. pomocou miestne-špecifickej, cielenej mutagenézy zodpovedajúcich DNA sekvencii. Vynález zahŕňa DNA sekvencie kódujúce takto zmenené IL-Ιβ väzbové molekuly. Obzvlášť vynález zahŕňa IL-Ιβ väzbové molekuly, v ktorých 1 alebo viac zvyškov v CDRľ alebo CDR2'je zmenených oproti zvyškom zo sekvencie SEQ ID NO: 2.

V prvom a druhom DNA konštrukte môže byť prvá a druhá časť oddelená intrónom, pričom je výhodné, ak je v takomto intróne lokalizovaný enhancer (zosilňovací element). Prítomnosť takéhoto enhancera, ktorý je transkribovaný, ale nie je translatovaný, môže napomôcť účinnosti transkripcie. V špecifických uskutočneniach prvý a druhý DNA konštrukt obsahuje enhancer génu pre ťažký reťazec výhodne ľudského pôvodu.

Každý z DNA konštruktov je umiestnený pod kontrolu vhodných riadiacich sekvencii, najmä pod kontrolu vhodného promótora. Môže sa použiť akýkoľvek typ promótora s podmienkou, že je adaptovaný pre hostiteľský organizmus, do ktorého sa budú DNA konštrukty prenášať na expresiu. Ale ak má dôjsť k expresii v cicavčej bunke, je obzvlášť výhodné použiť promótor imunoglobulínového génu.

Požadovaná protilátka sa môže produkovať v bunkovej kultúre alebo v transgénnom zvierati. Vhodné transgénne zviera sa môže použiť štandardným spôsobom, ktorý je odborníkom dobre známy, a ktorý zahŕňa napr. mikroinjekcie prvého a druhého DNA konštruktu s vhodnými riadiacimi sekvenciami do vajíčka, a potom prenos takto pripraveného vajíčka do vhodnej pseudopregnantnej samice a nakoniec selekciu potomstva, ktoré exprimuje požadovanú protilátku.

Ak sú reťazce protilátky produkované v bunkovej kultúre, DNA konštrukty musia byť najprv vložené buď do jedného expresného vektora, alebo do dvoch rozdielnych, ale pritom kompatibilných expresných vektorov, pričom táto druhá možnosť je považovaná za výhodnejšiu.

Predkladaný vynález teda tiež poskytuje expresný vektor schopný replikácie v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunkovej línii, ktorý obsahuje aspoň jeden z DNA konštruktov, už opísaných.

Každý expresný vektor obsahujúci DNA konštrukt je potom prenesený do vhodného hostiteľského organizmu. Ak sú DNA konštrukty oddelene vložené do dvoch expresných vektorov, môžu byť prenesené oddelene, t. j. jeden typ vektora do jednej bunky, alebo môžu byť prenesené súčasne (kotransfer), táto druhá možnosť je považovaná za výhodnejšiu. Vhodným hostiteľským organizmom môžu byť baktérie, kvasinky alebo cicavčie bunkové línie, pričom výhodnejšia je tretia možnosť. Je výhodné, ak táto cicavčia bunková línia je líniou lymfoidného pôvodu, napr. myelóm, hybridom alebo normálne imortalizované B-lymfocyty, ktoré endogénne neexprimujú žiadne ťažké ani ľahké reťazce protilátky.

Pre expresiu v cicavčích bunkách je výhodné, ak je sekvencia, ktorá kóduje IL-Ιβ väzbovú molekulu, integrovaná do DNA hostiteľskej bunky do lokusu, ktorý umožňuje vysoký stupeň expresie IL-Ιβ väzbových molekúl. Bunky, v ktorých je sekvencia kódujúca IL-Ιβ väzbovú molekulu integrovaná do takéhoto výhodného lokusu, sa môžu identifikovať a selektovať na základe hladiny IL-Ιβ väzbovej molekuly, ktorú exprimujú. Na prípravu hostiteľských buniek obsahujúcich kódujúcu sekvenciu pre IL-Ιβ väzbovú molekulu sa môže použiť akýkoľvek vhodný selekčný marker, napr. gén dhfr/metotrexát, alebo sa môže použiť ekvivalentný selekčný systém. Výhodné systémy na expresiu IL-Ιβ väzbovej molekuly sú podľa vynálezu napr. systémy založené na GS-amplifikácii/selekcii, opísané v dokumentoch EP 0256055 B, EP 0323997 Bav európskej patentovej prihláške 89303964.4.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob produkcie IL-Ιβ väzbovej molekuly, ktorý zahŕňa kroky (i) kultiváciu organizmu, ktorý je transformovaný expresným vektorom už definovaným a (ii) izoláciu IL-Ιβ väzbovej molekuly z kultúry.

V súlade s predkladaným vynálezom sa zistilo, že protilátka ACZ 885 má väzbovú špecificitu pre antigénny epitop ľudského IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu aminokyselinový zvyšok Glu64, zrelého ľudského IL-Ιβ proteínu (tento zvyšok Glu64 v zrelom ľudskom IL-Ιβ zodpovedá zvyšku 180 v prekurzore ľudského IL-Ιβ). Tento epitop je lokalizovaný na vonkajšej strane rozpoznávacieho miesta receptora IL-1, a je preto veľmi prekvapujúce, že protilátky proti tomuto epitopu, napr. protilátka ACZ 885, sú schopné inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor.

Protilátky, obzvlášť chimérické protilátky a protilátky so „vštepenými“ CDR, a najmä ľudské protilátky, ktoré majú väzbovú špecificitu pre antigénny epitop zrelého ľudského IL-Ιβ, ktorý obsahuje slučku obsahujúcu aminokyselinový zvyšok Glu64, a ktoré sú schopné inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor, a použitie týchto protilátok pri liečbe ochorení a porúch sprostredkovaných IL-1, sú preto nové a sú zahrnuté v rozsahu predkladaného vynálezu.

Takže ďalším aspektom predkladaného vynálezu je protilátka proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu pre antigénny epitop ľudského IL-Ιβ, ktorý obsahuje slučku obsahujúcu zvyšok Glu64 zrelého ľudského IL-1 β, a ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-1 β na jeho receptor.

Ďalšie aspekty predkladaného vynálezu zahŕňajú:

(i) použitie protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu pre antigénny epitop zrelého

SK 288089 Β6 ľudského IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšok Glu64, a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, na liečbu IL-1 sprostredkovaných ochorení alebo porúch, (ii) liečbu IL-1 sprostredkovaných ochorení alebo porúch u pacienta, ktorá spočíva v tom, že sa pacientovi podáva účinné množstvo protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecifickú pre antigénny epitop zrelého ľudského IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšok Glu64, a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, (iii) farmaceutickú kompozíciu, ktorá obsahuje protilátku proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecifickú pre antigénny epitop zrelého ľudského IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšok Glu64, a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, v kombinácii s farmaceutický prijateľným vehikulom, riedidlom alebo nosičom, a (iv) použitie protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecifickú pre antigénny epitop zrelého ľudského IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšok Glu64, a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, na výrobu liečiva na liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch.

V kontexte predkladaného opisu výraz, že protilátka je „schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ, znamená, že protilátka je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako protilátka ACZ 885, pričom výraz „v rovnakom rozsahu“ už je definovaný.

Protilátka ACZ 885 má väzbovú afinitu pre IL-Ιβ vyššiu ako tá, ktorá je už opísaná pri protilátkach anti-IL-Ιβ, napr. ľudskej protilátke anti-IL-Ιβ. Protilátka ACZ 885 má rovnovážnu disociačnú konštantu K_D pre väzbu IL-Ιβ nižšiu ako 50 pM, napr. približne 35 pM. Vďaka tejto vysokej väzbovej afinite je protilátka ACZ mimoriadne vhodná na terapeutické využitie.

Takže ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje protilátku proti IL- 1B, ktorá má rovnovážnu disociačnú konštantu K_D pre väzbu IL-ΙΒ nižšiu ako 50 pM. Tento aspekt vynálezu tiež zahŕňa použitia, spôsoby a kompozície založené na takýchto protilátkach s vysokou afinitou, ako je už skôr opísané pre protilátky proti IL-ΙΒ s väzbovou špecificitou pre antigénny determinat zrelého ľudského IL-ΙΒ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšok Glu64.

V kontexte predkladaného opisu výraz „IL-1 sprostredkované ochorenie“ zahŕňa všetky ochorenia a zdravotné stavy, v ktorých má nejakú úlohu IL-1, či už priamo alebo nepriamo pri chorobe alebo stave, vrátane príčiny choroby, rozvoji a progrese choroby, perzistencii alebo patológii ochorenia alebo stavu.

V kontexte predkladaného opisu sa termíny „liečba“ alebo „liečiť“ týkajú tak profylaktického alebo preventívneho liečenia, ako aj kuratívneho ošetrenia alebo ošetrenia vedúceho k modifikácii ochorenia, vrátane ošetrenia pacientov, u ktorých je riziko získania choroby alebo je podozrenie, že chorobu získali a tiež pacientov, ktorí chorobou už trpia alebo ich diagnostikovali ako trpiacich chorobou alebo stavom, a tiež sa týkajú potlačenia klinického relapsu.

Protilátky, ktoré majú väzbovú špecifickú pre antigénny epitop zrelého ľudského IL-1 B, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšok Glu64 a hlavne protilátky, ktoré sú schopné inhibície väzby IL-ΙΒ na jeho receptor, obzvlášť potom protilátky, ktoré majú rovnovážnu disociačnú konštantu K_D pre väzbu IL-1 B nižšiu ako 50 pM, sú ďalej označované ako „protilátky podľa vynálezu“.

Výhodnými protilátkami podľa vynálezu sú IL-1 B väzbové molekuly podľa prvého a druhého aspektu predkladaného vynálezu. Výhodne sú protilátkami podľa vynálezu ľudské protilátky, najvýhodnejšie je to protilátka ACZ 885 a jej priame ekvivalenty.

Protilátky podľa vynálezu blokujú účinky IL- 1B na jeho cieľové bunky a sú teda určené na použitie pri liečbe IL-1 sprostredkovaných chorôb a porúch. Tieto a ďalšie farmakologické účinky protilátok podľa vynálezu sa môžu preukázať použitím štandardných testovacích metód, napr. testu opísaného ďalej:

Neutralizácia IL-Ιβ závislej tvorby PGE₂ a interleukínu-6 v primárnych ľudských fibroblastoch

Tvorba PGE₂ a IL-6 v primárnych ľudských dermálnych fibroblastoch je závislá od IL-Ιβ. Samotný TNFα nemôže sám účinne indukovať tieto mediátory zápalu, ale pôsobí synergicky s IL-1. Primáme dermálne fibroblasty sa používajú ako náhradný model na IL-1-indukovanú bunkovú aktiváciu.

Primáme ľudské fibroblasty sa stimulujú rekombinantným IL-Ιβ alebo kondicionovaným médiom, ktorý sa získa z LPS-stimulovaných ľudských PBMC v prítomnosti rôznych koncentrácií protilátky podľa vynálezu alebo IL-IRA v rozsahu od 6 do 18 000 pM. Chimerická protilátka anti-CD25 Simulect® (basiliximab) sa použije ako kontrola s rovnakým izotypom. Supematant sa odoberie po 16 hodinách stimulácie a testuje sa na prítomnosť IL-6 ELISA testom alebo na prítomnosť PGE₂ RIA testom. Protilátky podľa vynálezu majú pri testovaní v týchto testoch typicky hodnotu IC₅₀s pre inhibíciu produkcie IL-6 približne 1 nM alebo nižšiu (napr. od asi 0,1 do asi 1 nM), pri testovaní ako je uvedené skôr.

Ako sa ukázalo už v opísanom teste, protilátky podľa vynálezu silno blokujú účinky IL-Ιβ. Teda protilátky podľa vynálezu sú farmaceutický využiteľné, a nasledujúcimi spôsobmi:

Protilátky podľa vynálezu sú užitočné na profylaxiu a liečbu IL-1 sprostredkovaných chorôb a stavov, ako je napr. zápal, alergia a alergický stav, hypersenzitívna reakcia, autoimunitné choroby, silné infekcie a

SK 288089 Β6 rejekcie orgánového alebo tkanivového transplantátu.

Tak napríklad protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť pri liečbe príjemcov transplantátov srdca, pľúc, bloku srdce-pľúca, obličiek, pankreasu, kože alebo rohovky, vrátane rejekcie aloštepu alebo xenoštepu (xenograft) a pri prevencii reakcie štepu proti hostiteľovi („graft versus host disease“), napr. po transplantácii kostnej drene, a artériosklerózy spojenej s orgánovou transplantáciou.

Protilátky podľa vynálezu sú konkrétne použiteľné napr. na liečbu, prevenciu alebo zmiernenie autoimunitných ochorení a zápalových ochorení, hlavne zápalových stavov s etiológiou zahŕňajúcou autoimunitnú zložku, ako je napr. artritída (napr. reumatoidná artritída, chronická progredujúca artritída a deformujúca artritída), a reumatických ochorení, vrátane zápalových stavov a reumatických ochorení zahŕňajúcich stratu kostnej hmoty, bolestivé zápaly, a hypersenzitivity (vrátane hypersenzitivity dýchacích ciest aj kožnej hypersenzitivity) a alergií. Ku špecifickým autoimunitným chorobám, pri ktorých sa môžu protilátky podľa vynálezu použiť, patria autoimunitné hematologické poruchy (vrátane napr. hemolytickej anémie, aplastickej anémie, anémie červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie), systémový lupus erythematosus, polychondritída, skleroderma, Wegenerova granulomatóza, dermatomyozitída, chronická aktívna hepatitída, myasthenia gravis, psoriáza, Steven-Johnsonov syndróm, idiopatická porucha vstrebávania v tenkom čreve (sprue), autoimunitné zápalové ochorenie čriev (vrátane napr. ulceratívnej kolitídy, Crohnovej choroby a syndrómu dráždivého čreva), endokrinná oftalmopatia, Gravesova choroba, sarkoidóza, skleróza multiplex, primárna biliáma cirhóza, juvenilný diabetes (diabetes mellitus typu I), uveitída (anterior a posterior), keratoconjunctivitis sicca a vemálna keratokonjunktivitída, fibróza pľúcneho interstícia, psoriatická artritída a glomerulonefritída (tak bez ako aj s nefrotickým syndrómom, napr. vrátane idiopatického nefrotického syndrómu alebo nefropatie s minimálnymi zmenami).

Protilátky podľa vynálezu sú tiež užitočné pri liečbe, prevencii alebo zmiernení ochorení, ako je astma, bronchitída, pneumokonióza, pľúcny emfyzém a ďalšie obštrukčné alebo zápalové ochorenia dýchacích ciest. Protilátky podľa vynálezu sú použiteľné taktiež pri liečbe nežiaducej akútnej a hyperakútnej zápalovej reakcie, ktorá je sprostredkovaná IL-1 alebo zahŕňa tvorbu IL-1, hlavne IL-Ιβ, alebo podporuje uvoľňovanie TNF pomocou IL-1, ako je napr. akútna infekcia, napr. septický šok (napr. endotoxický šok a syndróm respiračných ťažkostí dospelých), meningitída, pneumónia, ťažké popáleniny a ďalej pri liečbe kachexie alebo „wasting“ syndrómu spojeného s patologickým uvoľňovaním TNF v dôsledku infekcie, karcinómu alebo orgánovej dysfunkcie, obzvlášť s AIDS súvisiacou kachexiou, napr. asociovanou alebo nasledujúcou po infekcii HIV.

Protilátky podľa vynálezu sú ďalej užitočné hlavne pri liečbe ochorení metabolizmu kostí, ako je napr. osteoartritída, osteoporóza a ďalšie zápalové artritídy a straty kostnej hmoty všeobecne, vrátane straty kostnej hmoty súvisiacej so starnutím a pri špecifických ochoreniach periodontu.

Na uvedené indikácie vhodná dávka bude samozrejme rôzna, v závislosti napr. od konkrétnej použitej protilátky podľa vynálezu, príjemcu, spôsobu podávania a povahy a závažnosti ochorenia, ktoré sa má liečiť. Ale pri profylaktickom použití sa môžu všeobecne uspokojivé výsledky dosiahnuť s dennými dávkami približne 0,05 mg až približne 10 mg na 1 kilogram telesnej hmotnosti, zvyčajne 0,1 mg až 5 mg na 1 kilogram telesnej hmotnosti. Pri profylaktickej liečbe sa typicky podáva liek jedenkrát za týždeň až jedenkrát za 3 mesiace, zvyčajne jedenkrát za 2 týždne až jedenkrát za 10 týždňov, napr. jedenkrát za 4 až 8 týždňov. Protilátka podľa vynálezu sa zvyčajne podáva parenterálne, intravenózne, napr. do antekubitálnej alebo inej periférnej žily, intramuskuláme alebo subkutánne. Profylaktické podávanie typicky spočíva v podávaní protilátky podľa vynálezu jedenkrát za mesiac až jedenkrát za 2 až 3 mesiace alebo dokonca ešte s menšou frekvenciou.

Farmaceutické kompozície podľa predkladaného vynálezu sa môžu vyrábať konvenčnými spôsobmi. Kompozícia podľa vynálezu je výhodne poskytnutá v lyofilizovanej forme. Na bezprostredné podanie sa rozpustí vo vhodnom vodnom nosiči, ako je napr. sterilná voda do injekcií alebo sterilný pufrovaný fyziologický roztok. Pokiaľ je žiaduce pripraviť roztok s väčším objemom na podávanie infúziou skôr než bolusovou injekciou, je výhodné v priebehu formulácie inkorporovať do fyziologického roztoku ľudský sérový albumín alebo priamo pacientovu vlastnú heparinizovanú krv. Prítomnosť nadbytku fyziologicky inertného proteínu zabraňuje strate protilátky v dôsledku adsorpcie na stenách kontajnera a hadičiek, ktoré sa používajú s infuznym roztokom. Pokiaľ sa použije albumín, potom vhodná koncentrácia je 0,5 až 4,5 % (hmotn.) vzhľadom na hmotnosť fyziologického roztoku.

Predkladaný vynález je ďalej opísaný a vysvetlený pomocou príkladov, ktorých funkcia je ilustratívna, a doplnený výkresom, ktorý ukazuje krivky závislosti reakcie od dávky na inhibíciu väzby IL- IB rozpustnými receptormi IL-1 typu I a II.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok je graf ukazujúci kompetitívnu inhibíciu väzby ACZ 885 na IL-ΙΒ rozpustnými receptormi IL-1 typu I a typu II.

SK 288089 Β6

Príklady uskutočnenia vynálezu

Na prípravu protilátok proti ľudskému IL- 1B sa použili transgénne myši exprimujúce ľudský IgG/κ repertoár namiesto myšieho imunoglobulínového repertoáru (Fishwild et al., 1996, Náture Biotechnol., 14, 845-851). B lymfocyty z týchto myší sa imortalizovali použitím štandardnej hybridómovej technológie a získali sa tak myšie hybridómové bunky, ktoré sekretujú ľudskú IgGl/x protilátku označenú ACZ 885.

Príklad 1

Príprava hybridómu a purifikácia protilátky

Geneticky modifikovaná myš 18077 (Medarex Inc. Annadale, NJ) sa imunizovala rekombinantným ľudským IL-Ιβ naviazaným na KLH (50 pg) v adjuvans subkutánne (s.c.) v niekoľkých miestach. Imunitná reakcia myši sa ďalej zosilnila piatimi ďalšími injekciami, posledná injekcia tri dni pred fúziou. V deň fúzie sa myš 18 077 utratila inhaláciou CO₂, a potom sa bunky zo sleziny (4,1 x 10⁷) fúzovali rutinným spôsobom použitím PEG 4000 s rovnakým počtom buniek PAI-0 myší myelómovej bunkovej línie. Fuzované bunky sa preniesli do 624 jamiek (1 ml/jamka) obsahujúcich podpornú vrstvu („feeder“) myších peritoneálnych buniek (Balb C myši), v médiu RPMI 1640 doplnenom HAT, 10 % tepelne inaktivovaným fetálnym teľacím sérom a 5 x 10'⁵ M β-merkaptoetanolom. Supematanty sa odoberali a testovali pomocou ELISA testu a uskutočnil sa skríning na IL-Ιβ reaktívne monoklonálne protilátky. Identifikovalo sa päť monoklonálnych protilátok podtriedy IgG/κ. Klonovanie sa uskutočnilo pomocou 4 x 96 jamkovej mikrotitračnej doštičky, do každej jamky sa prenieslo 0,5 buniek. Po dvoch týždňoch sa jamky kontrolovali inverzným mikroskopom. Supematanty sa odobrali z jamiek s pozitívnym rastom a produkcia monoklonálnej protilátky anti-IL-Ιβ sa vyhodnocovala pomocou ELISA. Pripravili sa 1 až 2 litre kondicionovaného supematantu zo štyroch subklonov pôvodne identifikovaného hybridómu #657 a protilátky sa purifikovali pomocou afinitnej chromatografie na kolóne s proteínom A.

Čistota a čiastočné aminokyselinové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca

Sekvenovanie aminokyselín

Ľahké a ťažké reťazce purifikovanej protilátky ACZ 885 sa oddelili pomocou SDS-PAGE a aminokoncové aminokyseliny sa stanovili pomocou Edmanovej degradácie. Čistota protilátky použitej v týchto štúdiách je > 90 % pomocou sekvenovania. cDNA sekvencie kódujúce variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca sa získali PCR amplifikáciou cDNA pripravenej z mRNA z klonovaných hybridómových buniek a úplne sa sekvenovali. Aminokoncové sekvencie variabilných domén ťažkého a ľahkého reťazca a zodpovedajúce DNA sekvencie sú ďalej uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a sekvencia SEQ ID NO: 2, kde úseky CDR sú vyznačené tučné.

Variabilný úsek ťažkého reťazca ACZ 885 (sekvencia SEQ ID NO: 1)

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAG -19 MEFGLSHVFLVALLRGVQCQ -1

GTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCC VQLVESGGGVVQPGRSLRLS -21

TGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTGTTTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCA CAASGFTFSVYGMNWVRQAP -41

GGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTGGTATGATGGAGATAATCAATACTATGCA GKGLEWVAIIWYDGDNQYYA -61

GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG DSVKGRFTISRDNSKNTLYL -81

CAAATGAACGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAGAGATCTTAGG QMNGLRAEDTAVYYCARDLR - 101

ACTGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC TGPFDYWGQGTLVTVSS - 118

Variabilný úsek ľahkého reťazca ACZ 885 (sekvencia SEQ ID NO: 2)

ATGTTGCCATCACAACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGGGTTCCAGCCTCCAGGGGTGAA

-19 MLPSQLIGFLLLWVPASRGE, -1

ATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGAAAGTCACCATC IVLTQSPDFQSVTPKEKVTI -21

ACCTGCCGGGCCAGTCAGAGCATTGGTAGTAGCTTACACTGGTACCAGCAGAAACCAGAT TCRASQSIGSSLHWYQQKPD -41

CAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCTTCTCAGGGGTCCCCTCGAGG QSPKLLIKYASQSFSGVPSR -61

TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAATAGCCTGGAAGCTGAA FSGSGSGTDFTLTINSLEAE -81

GATGCTGCAGCGTATTACTGTCATCAGAGTAGTAGTTTACCATTCACTTTCGGCCCTGGG DAAAYYCHQSSSLPFTFGPG -101

ACCAAAGTGGATATCAAA - 107

T K V D I K

Kurzívou je vyznačená vedúca („leader“) sekvencia (nie je pri zrelej protilátke) a tučné úseky CDR.

Konštrukcia expresných vektorov pre ťažký a ľahký reťazec

Použil sa amplifikačný/selekčný systém založený na GS, aký je napríklad opísaný v dokumentoch EP

0256055 B, EP 0323997 B alebo európskej patentovej prihláške 89303964.4, kde bola ako selekčný marker použitá GS kódujúca sekvencia.

Príklad 2

Biochemické a biologické dáta

Zistilo sa, že monoklonálna protilátka ACZ 885 neutralizuje in vitro aktivitu interleukínu-1 β. Monoklonálna protilátka sa ďalej charakterizovala prostredníctvom väzby protilátky na rekombinantný ľudský IL-1-β analyzovanej systémom BIAcore. Neutralizácia sa hodnotila kompetitívnou väzbovou štúdiou s rozpustnými IL-1 receptormi. Biologická aktivita protilátky ACZ 885 proti rekombinantnému a prirodzene tvorenému IL-1β sa stanovila v primárnych ľudských bunkách (pozri príklad 3), reagujúcich na stimuláciu IL-Ιβ. Stanovenie rovnovážnej disociačnej konštanty

Konštanty rýchlosti asociácie a disociácie väzby rekombinantného ľudského IL-Ιβ a ACZ 885 sa stanovili analýzou BIAcore. ACZ 885 sa imobilizovala a väzba rekombinantného IL-Ιβ v rozmedzí koncentrácií 1 až 4 nM sa merala pomocou povrchovej plazmónovej rezonancie. Vybratý formát predstavuje monovalentnú interakciu, a teda umožňuje zachádzať s väzbovou udalosťou IL-Ιβ na ACZ 885 podľa 1 : 1 stechiometrie. Analýza dát sa uskutočnila pomocou softvéru „BIAevaluation“.

	[10⁵/ms]	^off [10⁵/s]	K_D [pM]
Ľudský IL-Ιβ	11,0 ±0,23	3,3 ± 0,27	30,5 ± 2,6	n = 22

Záver: ACZ 885 sa viaže na rekombinantný ľudský IL-Ιβ s vysokou afinitou.

Štúdium kompetitívnej inhibície väzby s rozpustnými IL-1 receptormi typu I a II

Štúdium väzbovej kompetície pomocou rozpustných receptorov IL-1 typu I a II

Kompetícia medzi ACZ 885 a rozpustným ľudským receptorom IL-1 typu I a typu II sa merala pomocou systému BIAcore. ACZ 885 sa imobilizovala na povrchu čipu a rekombinantný ľudský IL-Ιβ (1 nM) sa injikoval, aby sa naviazal na ACZ 885 v neprítomnosti alebo prítomnosti zvyšujúcej sa koncentrácie rekombinantného ľudského rozpustného receptora I alebo receptora II (0 až 12 nM, vždy 4 nezávislé cykly). Získané výsledky sú ukázané na obrázku L Väzba NVP-ACZ 885 na ľudský IL-Ιβ sa stanovila v prítomnosti rekombinantného ľudského rozpustného receptora IL-1 typu I alebo typu II. Hodnoty polovičného maxima účinku (IC₅₀) sa stanovili graficky pomocou softvéru Origin 6.0. Uvedená je priemerná hodnota ± stredná chyba priemeru (SEM) (n=4).

Záver: Väzba ACZ 885 na IL-Ιβ je kompetitívna tak s receptorom IL-Ιβ typu I, ako aj s receptorom typu

II.

Profil reaktivity s ľudským IL-1 a, ľudským IL-1RA a IL-Ιβ z iných biologických druhov

Profily reaktivity ACZ 885 s ľudským IL-1 a, IL-1RA a IL-Ιβ z makaka „cynomolgous“, králika, myši a laboratórneho potkana sa analyzovali opäť pomocou zariadenia Biacore. ACZ 885 sa imobilizovala a skúmané cytokíny sa použili v koncentrácii 8 nM (6 nezávislých cyklov).

Tabuľka 3: Skrížená reaktivita NVP-ACZ885 s IL-Ιβ, IL-Ία a IL-1RA

	% väzby (priemer ± stredná chyba)
Rek. ľudský IL-Ιβ (n=6)	100
Rek. IL-Ιβ cynomolg. makaka (n=l 1)	7,8 ± 1,0
Rek. králičí IL-Ιβ (n=6)	-0,5 ± 0,2
Rek. myší IL-Ιβ (n=6)	-2,6 ± 0,6
Rek. IL-Ιβ lab. potkana (n=6)	-6,2 ± 1,0
Rek. ľudský IL-Ία (n=6)	8,4 ± 2,4
Rek. ľudský IL-IRa (n=6)	-3,7 ±1,7

Jednotky rezonancie sa odčítali v čase 1000 s po začiatku injikovania, hodnota na injikovanie „running“ pufra sa odpočítala zo všetkých senzorgramov a základná línia po imobilizácii anti-Fcy sa nastavila na nulu. Väzba je vyjadrená ako percento akumulovaných jednotiek rezonancie pre ľudský IL-Ιβ.

Záver: Protilátka ACZ 885 skrížené významne nereaguje s ľudským IL-Ιβ, ľudským IL-IRa alebo IL-Ιβ z myši, laboratórneho potkana alebo králika. Reaktivita proti IL-Ιβ z makaka je v podstate zhodná s ľudským cytokínom.

Príklad 3

Neutralizácia uvoľňovania interleukínu-6 v ľudských dermálnych fibroblastoch pôsobením ACZ 885

Na vyhodnotenie biologickej aktivity ACZ 885 v neutralizácii pôsobenia ľudského IL-Ιβ sa použil nasledujúci postup:

1. Príprava kondicionovaného média obsahujúceho IL-Ιβ

Príprava kondicionovaného média z ľudským mononukleámych buniek periférnej krvi sa uskutočnila nasledovne: mononukleáme bunky periférnej krvi sa pripravili oddelením buniek od periférnej krvi opíc s použitím hustotného gradientu ficoll-hypaque podľa spôsobu, ktorý publikoval Hansel (Hansel, T.T. et. al. (1991), Improved immunomagnetic procedúre for the isolation of highly purified human blood eosinophils, J. Imm. Methods, 145: 105-110), a potom sa použili v koncentrácii 10⁵ buniek/jamka v RPMI/10 % FCS. Pridali sa ΙΡΝβ (100 U/ml) a LPS (5 pg/ml) a bunky sa následne inkubovali počas 6 hodín. Inkubácia sa ukončila centrifúgáciou pri 1200 rpm počas 10 minút. IL-Ιβ prítomný v supematante sa kvantifíkoval použitím ELISA testu.

2. Neutralizačný test

Ľudské dermálne fibroblasty z predkožky sa získali od firmy Clonetics (CC-2509) a pestovali sa v médiu FBM (Clonetics, CC-3131) obsahujúcom bFGF (1 ng/ml, CC-4065), inzulín (5 pg/ml, CC-4021) a 2 % FCS (CC-4101).

Na indukciu IL-6 sa bunky nasadili v hustote 10^{3 4} buniek/jamku na 48-jamkový tkanivový klaster (tissue cluster). Nasledujúci deň sa bunky nechali hladovať počas 6-7 hodín vo FBM obsahujúcom 2 % FCS pred pridaním cytokínu. Na stimuláciu sa kultivačné médium nahradilo FBM + 2 % FCS obsahujúcim vhodné množstvo kondicionovaného média s približne 50 pg/ml IL-Ιβ. Alternatívne sa použil rekombinantný ľudský IL-Ιβ vo výslednej koncentrácii 50 pg/ml.

Neutralizujúca anti-lL^ protilátka sa titrovala do nariedeného kondicionovaného média pred pridaním k bunkám. Rekombinantný IL-IRa (R&D Systems, # 280-RA-010) sa použil ako pozitívna kontrola.

Bunkový supernatant sa odobral 16 až 17 h po stimulácii a množstvo uvoľneného IL-6 sa stanovilo sendvičovým testom ELISA.

3. IL-6 ELISA

Mikrotitračné doštičky na ELISA sa potiahli myšou anti-ľudskou IL-6 monoklonálnou protilátkou (mAb) 314-14 (Novartis Pharma, šarža EN23,961, 5,5 mg/ml, 100 pl, 3 pg/ml) v PBS s 0,02 % NaN₃ a inkubovali sa cez noc pri +4 °C, nasledujúci deň sa mikrotitračné doštičky premyli 4-krát PBS/0,05 % Tween/0,02 % NaN₃ a blokovali použitím 300 pl PBS/3 % bovinný sérový albumín (BSA)/0,02 % NaN₃ počas 3 hodín. Doštičky sa potom premyli opäť (4-krát) a 100 pl supematantu (výsledné riedenie 1 : 20) alebo štandardu re11

SK 288089 Β6 kombinantného ľudského IL-6 ((Novartis Pharma, #91902, titračná krivka v rozmedzí od 1 do 0,0156 ng/ml v krokoch s dvojnásobným riedením) sa pridalo v dvojitom opakovaní. Po inkubácii cez noc pri teplote miestnosti (RT) sa doštičky premyli (4-krát) a pridali sa rôzne koncentrácie myšej anti-ľudskej IL-6 mAb (110-14, Novartis Pharma, 6,3 mg/ml, 100 pl, 1 pg/ml, 3 h pri teplote miestnosti). Po ďalších 4 premytiach sa pridalo kozie anti-myšie IgG2b antisérum značené biotínom (Southern Biotechnology, #1090-08) v konečnom riedení z 1/10000 (100 pl/jamka, 3 h pri teplote miestnosti). Po inkubácii sa doštičky premyli 4-krát a pridal sa streptavidín kondenzovaný s alkalickou fosfatázou (Jackson ImmunoResearch, #016-050-084) v konečnom riedení 1/3000 (100 pl/jamka, 30 minút pri teplote miestnosti). Po premytí (4-krát) sa pridal substrát (p-nitrofenylfosfát v dietanolamínovom pufri, 100 pl) na 30 minút. Reakcia sa zastavila pridaním 5 M NaOH v množstve 50 pl/jamka. Doštičky sa odpočítali v mikrotitračnom čítacom prístroji (Bio-Rad) s použitím filtra pre 405 a 490 nm.

Hladiny IL-6 v supematantoch z kultúr sa vypočítali použitím štandardnej kalibračnej krivky získanej preložením kvadratickej funkcie. Štatistické vyhodnotenie a stanovenie IC₅₀ sa uskutočnilo pomocou preloženia sigmoidnej krivky.

Výsledky:

Tabuľka: Inhibícia IL-Ιβ indukovanej sekrécie IL-6

Hodnoty IC₅₀ pre inhibíciu ΙΕ-Ιβ-indukovanej sekrécie IL-6 ľudských kožných fibroblastov. Fibroblasty sa stimulovali rekombinantným ľudským IL-Ιβ alebo kondicionovaným médiom obsahujúcim 50 až 100 pg/ml IL-1 β.

	NVP-ACZ885, šarža 1 IC₅₀ [pM] ± SEM	NVP-ACZ88, šarža 2 IC₅o [pM] ± SEM	IL-1RA IC₅o [pM] ± SEM
sekrécia IL-6 kond. médium	54 ±6,1 (9,l±l,0 ng/ml) (n=6)	44,6 ± 3,6 (7,4±0,6 ng/ml) (n=6)	30 ±3,1 (0,51±0,05 ng/ml) (n=5)
sekrécia IL-6 rek. ľudský IL-Ιβ	42± 3,4 (7,1 ±0,56 ng/ml) (n=4)	63 ± 2,8 (10,5±0,5 ng/ml) (n=6)	Nemerané

Príklad 4

Definícia epitopu pre ACZ 885

ACZ 885 sa viaže na ľudský IL-Ιβ s vysokou afinitou, ale zlyháva v rozpoznaní vysoko homologických IL-Ιβ, ktoré pochádzajú z makaka „rhesus“. Jedným z najvýraznejších rozdielov v aminokyselinovej sekvencii medzi IL-Ιβ makaka „rhesus“ a ľudským IL-Ιβ je v polohe 64 zrelého IL-Ιβ. Ľudský IL-Ιβ má v tejto polohe kyselinu glutámovú, zatiaľ čo makak „rhesus“ alanín. Mutantný ľudský IL-Ιβ s príslušnou zámenou Glu64Ala stráca schopnosť viazať sa na ACZ 885 s merateľnou afinitou. Pôvodcovia vynálezu na základe toho prišli k záveru, že Glu64 v ľudskom IL-Ιβ je nevyhnutný na rozpoznanie protilátkou ACZ 885. Glu64 je lokalizovaný v slučke IL-Ιβ, ktorá nie je časťou väzbového povrchu pre receptor IL-Ιβ typu I, ani nie je v jeho bezprostrednej blízkosti. Preto protilátky namierené proti väzbovému epitopu obsahujúcemu Glu64 majú schopnosť neutralizovať biologickú aktivitu ľudského IL-Ιβ.

Zoznam sekvencií

Sekvencia SEQ ID NO: 1

DNA a aminokyselinová sekvencia variabilného úseku ťažkého reťazca protilátky ACZ 885

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAG -19 MEFGLSWVFLVALLRGVQCQ -1

GGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTGGTATGATGGAGATAATCAATACTATGCA GKGLEWVAII WYDGDNQYYA -61

SK 288089 Β6

GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA'rTCCAAGAACACGCTGTATCTG DSVKGRFTISRDNSKNTLYL -81

CAAATGAACGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAGAGATCTTAGG QMNGLRAEDTAVYYCARDLR -101

ACTGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAÄCCCTGGTCACCGTCTCCTC

TGPFDYWGQGTLVTVSS - 118

Sekvencia SEQ ID NO: 2

DNA a aminokyselinová sekvencia variabilného úseku ľahkého reťazca protilátky ACZ 885

ATGTTGCCATCACAACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGGGTTCCAGCCTCCAGGGGTGAA -19 M LPSQLIGFLLLWVPASR G E -1

ACCAAAGTGGATATCAAA - 107

T K V D I K

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. IL-Ιβ väzbová molekula, ktorá obsahuje variabilné domény tak ťažkého (V_H) ako aj ľahkého reťazca (V_L), pričom IL-Ιβ väzbová molekula obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén, ktoré obsahuje:

(a) variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H), ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro, a (b) variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulínu (V_L), ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDRľ, CDR2' a CDR3', kde CDRľ má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-GIy-Ser-Ser-Leu-His, CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser a CDR3' má aminokyselinovú sekvenciu His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro, a ich priame ekvivalenty, v ktorých hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDRľ, CDR2' a CDR3' zobrané ako celok, sú aspoň na 95 % homologické s hypervariabilnými úsekmi podľa a) a b) a majú väzbovú špecificitu pre antigénny epitop ľudského IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšok Glu64 zrelého ľudského IL-Ιβ proteínu, pričom sú schopné inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor a majú K_D pre väzbu IL-Ιβ 50 pM alebo menej.
2. IL-Ιβ väzbová molekula podľa nároku 1, ktorá je ľudskou protilátkou.
3. IL-Ιβ väzbová molekula, ktorá obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahujúce buď prvú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu identickú so sekvenciou uvedenou v SEQ ID NO: 1 začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 118, a druhú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu identickú so sekvenciou uvedenou v SEQ ID NO: 2, začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 107.
4. Expresný vektor obsahujúci buď jediný expresný vektor, alebo set dvoch kompatibilných expresných vektorov, obsahujúci

SK 288089 Β6 (1) prvý DNA konštrukt, ktorý kóduje ťažký reťazec alebo jeho fragment, ktorý obsahuje (a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu, ktorá obsahuje striedavo rámcové a hypervariabilné úseky, kde hypervariabilné úseky sú sledom CDR1, CDR2 a CDR3, ktorých aminokyselinové sekvencie sú uvedené v SEQ ID NO: 1, pričom táto prvá časť začína kodónom, ktorý kóduje prvú aminokyselinu variabilnej domé5 ny a končí kodónom, ktorý kóduje poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a (b) druhú časť kódujúcu konštantnú časť ťažkého reťazca alebo jej fragment, ktorá začína kodónom, ktorý kóduje prvú aminokyselinu konštantnej časti ťažkého reťazca a končí kodónom, ktorý kóduje poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón, a (2) druhý DNA konštrukt, ktorý kóduje ľahký reťazec alebo jeho fragment, ktorý obsahuje

10 (a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo rámcové a hypervariabilné úseky, kde hypervariabilné úseky sú sledom CDRľ a CDR3', ktorých aminokyselinové sekvencie sú uvedené v SEQ ID NO: 2, pričom táto prvá časť začína kodónom, ktorý kóduje prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom, ktorý kóduje poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a (b) druhú časť kódujúcu konštantný úsek ľahkého reťazca alebo jeho fragment, ktorá začína kodónom, ktorý

15 kóduje prvú aminokyselinu konštantnej časti ľahkého reťazca a končí kodónom, ktorý kóduje poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.
5. Expresný vektor podľa nároku 4, ktorý je schopný sa replikovať v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunkovej línii.
6. Spôsob prípravy IL-Ιβ väzbovej molekuly, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa (i) kultivá20 ciu organizmu, ktorý je transformovaný expresným vektorom podľa nároku 5 a (ii) izoláciu IL-Ιβ väzbovej molekuly z kultúry.
7. Použitie protilátky proti IL-Ιβ podľa nároku 2 na prípravu liečiva na liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení alebo porúch.
8. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje protilátku proti IL-Ιβ

25 podľa nároku 2, v kombinácii s farmaceutický prijateľným excipientom, riedidlom alebo nosičom.