CZ2003505A3

CZ2003505A3 - Protilátky proti humánnímu IL-1 beta, způsob jejich přípravy a jejich použití

Info

Publication number: CZ2003505A3
Application number: CZ2003505A
Authority: CZ
Inventors: Hermann Gram; Padova Franco E. Di
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-08-22
Filing date: 2001-08-20
Publication date: 2003-05-14
Also published as: CN1484652A; NO2017052I1; FR09C0062I2; MY130248A; NL300427I2; US7446175B2; NO332609B1; BE2009C057I2; CY1108779T1; MXPA03001590A; ECSP034490A; AU9549001A; NO20030827D0; NZ534269A; HUP0300806A3; WO2002016436A3; NO20030827L; US20110256151A1; JP2008295456A; US8273350B2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká protilátek proti humánnímu interleukinu I beta (IL-Ιβ) a použití takových protilátek při léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a chorobných stavů.

Dosavadní stav techniky

Interleukin 1 (IL-1) je tkáňový hormon, tvořený buňkami imunitní systému, který působí jak mediátor akutní fáze zánětlivé reakce. Nepatřičná nebo přílišná produkce IL-1, konkrétně IL-Ιβ, je spojena s patologií různých nemocí a chorobných stavů, jako například septikémie, septický nebo endotoxický šok, alergie, astma, ztráta kostní hmoty, ischémie, mrtvice, revmatoidní artritida a další zánětlivé chorobné stavy. Protilátky proti IL-Ιβ již byli navrhovány pro použití k léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a chorobných stavů, viz například WO 95/01997, konkrétně diskuse v úvodu uvedené přihlášky.

Původci předkládaného vynálezu však připravili zlepšené protilátky proti humánnímu IL-Ιβ vhodné pro použití při léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a chorobných stavů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález tedy poskytuje IL-Ιβ vazebnou molekulu, která obsahuje antigenní vazebné místo obsahující alespoň jednu variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (V_H) , která obsahuje sled hypervariabilních úseků CDR1, CDR2 • · · · • · • · · ·

- 2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovou sekvenci Val-Tyr-Gly-MetAsn, CDR2 má aminokyselinovou sekvenci Ile-Ile-Trp-Tyr-AspGly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovou sekvenci Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro, a její přímé ekvivalenty.

Dále předkládaný vynález také poskytuje IL-Ιβ vazebnou molekulu, která obsahuje alespoň jednu variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (V_L), která obsahuje sled hypervariabilních úseků CDR1', CDR2' a CDR3', kde CDR1' má aminokyselinovou sekvenci Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-SerLeu-His, CDR2' má aminokyselinovou sekvenci Ala-Ser-Gln-SerPhe-Ser, a CDR3' má aminokyselinovou sekvenci His-Gln-Ser-SerSer-Leu-Pro, a její přímé ekvivalenty.

V prvním aspektu vynález poskytuje jednodoménovou IL-Ιβ vazebnou molekulu obsahující izolovaný imunoglobulinový těžký řetězec obsahující variabilní doména těžkého řetězce (V_H), jak byla definována výše.

V druhém aspektu vynález také poskytuje IL-Ιβ vazebnou molekula obsahující variabilní domény jak těžkého (V_H) tak lehkého řetězce (V_L), přičemž IL-Ιβ vazebná molekula obsahuje alespoň jednoho antigenní vazebné místo obsahující:

a) variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (V_H) , která obsahuje sled hypervariabilních úseků CDR1, CDR2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovou sekvenci Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 má aminokyselinovou sekvenci Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-AspAsn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovou sekvenci Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro, a

b) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (V_L) , která obsahuje sled hypervariabilních úseků CDR1', CDR2' a CDR3', kde CDR1' má aminokyselinovou sekvenci Arg-Ala-Ser-GlnSer-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His, CDR2' má aminokyselinovou ·

• * • 9 · ·

- 3 sekvenci Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser, a CDR3' má aminokyselinovou sekvenci His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro, a její přímé ekvivalenty.

Není-li uvedeno jinak, kterýkoliv polypeptidový řetězec je v tomto textu popisován tak, že má aminokyselinovou sekvenci začínající N-koncovým úsekem a končící C-koncovým úsekem (ve směru čtení zleva doprava). Když antigenní vazebné místo obsahuje obě V_H a V_L domény, tyto domény mohou být lokalizovány na stejné polypeptidové molekule nebo, výhodně, každá doména může být na různém řetězci, přičemž V_H doména je částí imunoglobulinového těžkého řetězec nebo jeho fragmentu a V_L je částí imunoglobulinového lehkého řetězce nebo jeho fragmentu.

Termín IL-Ιβ vazebná molekula označuje jakoukoliv molekulu schopnou vázat se k IL-Ιβ antigenu buďto samotnému nebo ve spojení s jinými molekulami. Vazebná reakce může být prokázána standardními metodami (kvalitativní testy) včetně například biologických testů pro stanovení inhibice vazby IL-Ιβ k jeho receptoru, nebo kterýkoli z mnoha známých vazebných testů, který se vztahuje k negativnímu kontrolnímu testu, ve kterém se použije protilátka nepříbuzné specificity, ale stejného izotypu, např. protilátka anti-CD25. Výhodně se vazba IL-Ιβ vazebné molekuly podle vynálezu k IL-Ιβ může prokázat v kompetitivním vazebném testu.

Příklady molekul vázajících antigen jsou protilátky tvořené B-lymfocyty nebo hybridomy, chimérické CDR-roubované protilátky (CDR-grafted) nebo jakékoliv jejich fragmenty, např. a také jednořetězcové (single humánní protilátky, nebo fragmenty F(ab')₂ 3 Fab, chain) protilátky nebo jednodoménové (single domain) protilátky.

Jednořetězcová protilátka sestává z variabilní domény « · • ·

- 4 těžkého a lehkého řetězce protilátky kovalentně spojených pomocí peptidové spojky (linker), kterou tvoří obvykle 10 až 30 aminokyselin, výhodně 15 až 25 aminokyselin. Tudíž taková struktura neobsahuje konstantní úseky těžkého a lehkého řetězce a věří se, že malý spojovací peptidový úsek by měl být méně antigenní než celý konstantní úsek protilátky. Termín chimérická protilátka v popisu označuje protilátku, ve které konstantní úseky těžkého nebo lehkého řetězce nebo obou jsou humánního původu, zatímco variabilní domény jak těžkého tak lehkého řetězce jsou jiného než humánního původu (non-humánní), např. myšího, nebo jsou humánního původu, ale pocházejí z odlišné humánní protilátky. Termín CDR-roubovaná protilátka označuje protilátku, ve které hypervariabilní úseky (CDR) pocházejí z donorové (dárcovské) protilátky, jako je například non-humánní (např. myší) protilátka nebo odlišná humánní protilátka, zatímco všechny nebo v podstatě všechny další části imunoglobulinu, např. konstantní úseky a vysoce konzervativní úseky variabilní domény, tj. úseky definující základní strukturu, tzv. rámec protilátky („framework) , pocházejí z akceptorové (příjemcovské) protilátky, např. protilátky humánního původu. CDR-roubovaná protilátka může však obsahovat několik aminokyselin donorové sekvence v úseku rámce, například v úsecích rámce sousedících s hypervariabilními úseky. Termín humánní protilátka označuje protilátku, ve které konstantní a variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce jsou všechny humánního původu, nebo mají sekvence v podstatě identické se sekvencemi humánního původu, nikoliv nutně ze stejné protilátky, a patří sem i protilátky produkované v myších, ve kterých byly geny pro variabilní a konstantní části imunoglobulinu byly nahrazeny jejich humánními protějšky, např. jak bylo popsáno obecně v patentových dokumentech EP 0546073 Bl, US Patent 5545806, ·

- 5 US Patent 5569825, US Patent 5625126, US Patent 5633425, US Patent 5661016, US Patent 5770429, EP 0438474B1 a EP 0463151 Bl.

Zvláště výhodné IL-Ιβ vazebné molekuly podle vynálezu jsou humánní protilátky, obzvláště protilátka ACZ 885, která je dále popsána v příkladech.

Takže ve výhodných chimérických protilátkách jsou variabilní domény jak těžkého tak i lehkého řetězce humánního původu, například takové, jaké jsou v protilátce ACZ 885, a které jsou v seznamu sekvencí uvedeny jako SEKVENCE ID. Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2. Domény konstantního úseku výhodně také obsahují vhodné humánní domény konstantního úseku, například jak byly popsány v publikaci Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E.A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health.

Hypervariabilní úseky mohou být asociovány s jakýmkoliv úseky rámce protilátky, avšak výhodně humánního původu. Vhodné úseky rámce protilátek byly popsány v Kabat E.A. et al. (cit. výše). Výhodný rámec těžkého řetězce je humánní rámec těžkého řetězce, například protilátky ACZ 885, uvedený v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1. Tato sekvence sestává ze úseků FR1, FR2, FR3 a FR4. Podobně SEKVENCE ID. Č. 2 ukazuje výhodný rámec lehkého řetězce protilátky ACZ885, jehož sekvence sestává z úseků FR1' , FR2', FR3' a FR4 ' .

Tudíž vynález také poskytuje IL-Ιβ vazebnou molekulu, která obsahuje alespoň jedno antigenní vazebné místo obsahující buďto první doménu má aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou se sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1 počínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 118, nebo první doménu • · • « · ·

- β popsanou výše a druhou doménu má aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou se sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2, počínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 107.

Monoklonální protilátky namířené proti proteinům přirozeně se vyskytujícím u všech lidí jsou typicky produkovány v nonhumánních systémech, např. v myši. Přímým důsledkem těchto skutečnosti je to, že xenogenní protilátka produkovaná pomocí hybridomu, když je podávána člověku, vyvolává nežádoucí imunitní reakci, která je především zprostředkovaná konstantní částí xenogenního imunoglobulinu. To jasně omezuje použití takových protilátek, jelikož nemohou být podávány po delší období. Tudíž je zvláště výhodné použití jednořetězcových, jednodoménových, chimérických,

CDR-roubovaných nebo zejména humánních protilátek, které po podání člověku s velkou pravděpodobností nevyvolají významnou allogenní reakci.

S ohledem na skutečnosti výše uvedené, výhodnější IL-Ιβ vazebná molekula podle předkládaného vynálezu je molekula vybraná ze skupiny humánních protilátek anti-IL-Ιβ, které obsahují alespoň

a) těžký řetězec imunoglobulinu nebo jeho fragment, který obsahuje (i) variabilní doména obsahující sled hypervariabilních úseků CDR1, CDR2 a CDR3 a (ii) konstantní úsek nebo jeho fragment z humánního těžkého řetězce, kde CDR1 má aminokyselinovou sekvenci Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 má aminokyselinovou sekvenci Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-AspAsn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovou sekvenci Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro, a

b) lehký řetězec imunoglobulinu nebo jeho fragment, který obsahuje (i) variabilní doménu obsahující sled « * • ·

- 7 hypervariabilních úseků a volitelně také hypervariabilní úseky CDR1' , CDR2' a CDR3' a (ii) konstantní úsek nebo jeho fragment z humánního lehkého řetězce, kde CDR1' má aminokyselinovou sekvenci Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-SerSer-Leu-His, CDR2' má aminokyselinovou sekvenci Ala-SerGln-Ser-Phe-Ser, a CDR3' má aminokyselinovou sekvenci HisGln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro, a její přímé ekvivalenty.

Alternativně IL-Ιβ vazebná molekula podle vynálezu je molekula vybraná ze skupiny jednořetězcových vazebných molekul, která obsahuje vazebné místo pro antigen obsahující

a) první doménu obsahující sled hypervariabilních úseků CDR1,

CDR2 a CDR3, přičemž tyto hypervariabilní úseky mají aminokyselinové sekvence uvedené v SEKVENCI ID. Č. 1,

b) druhou doménu obsahující hypervariabilní úseky CDR1', CDR2' a CDR3', přičemž tyto hypervariabilní úseky mají aminokyselinové sekvence uvedené v SEKVENCI ID. Č. 2, a

c) peptidový linker, který je navázán buďto k N-konci první domény a k C-konci druhé domény, nebo k C-konci první

domény k	N-konci druhé domény,
a její přímé	ekvivalenty.
Jak je	odborníkovi dobře	známo,	malé	změny	v
aminokyselinové sekvenci, jako	je	například	delece

(odstranění), adice (přidání) nebo substituce (nahrazení) jedné, několika málo nebo dokonce i několika více aminokyselin, mohou poskytnout alelickou formu původního proteinu, která má v podstatě identické vlastnosti.

Tudíž termín její přímý ekvivalent označuje v předkládaném popisu vynálezu buďto jednodoménovou IL-Ιβ vazebnou molekulu (molekulu X) • · · · • · « ·

- 8 CDR2 a CDR3, vzaty homologní, výhodně i alespoň z 95 % úseky uvedenými (i) ve které hypervariabilní úseky CDR1, jakožto celek, jsou alespoň z 80 % alespoň z 90 % homologní s v SEKVENCI ID. Č, homologní, výhodněj hypervariabilními 1, a (ii) která je schopná inhibovat vazbu IL-Ιβ k jeho receptoru v podstatě ve stejném rozsahu jako referenční molekula, která má úseky protilátkového rámce identické s odpovídajícími úseky molekuly X, avšak má hypervariabilní úseky CDR1, CDR2 a CDR3 identické s odpovídajícími úseky uvedenými v SEKVENCI ID. Č. 1, nebo jakoukoliv IL-Ιβ vazebnou molekulu, která má alespoň dvě domény na každé vazebné místo (molekulu X') (i) ve které hypervariabilní úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' a CDR3', vzaty jakožto celek, jsou alespoň z 80 % homologní, výhodně alespoň z 90 % homologní, výhodněji alespoň z 95 % homologní s hypervariabilními úseky SEKVENCE ID. Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2, a (ii) která je schopná inhibovat vazbu IL-Ιβ k jeho receptoru v podstatě ve stejném rozsahu jako referenční molekula, která má úseky protilátkového rámce a konstantní úseky identické s odpovídajícími úseky molekuly X', ale má hypervariabilní úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' a CDR3' identické s odpovídajícími úseky SEKVENCE ID. Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2.

V kontextu předkládaného popisu vynálezu je aminokyselinová sekvence alespoň z 80 % homologní s druhou sekvencí, jestliže tyto sekvence mají alespoň 80 % identických aminokyselinových zbytků ve stejné poloze, když jsou sekvence optimálně přiřazeny (srovnány), přičemž mezery nebo inzerce v aminokyselinové sekvenci jsou považována za neidentické « ·

- 9 zbytky.

Inhibice vazby IL-Ιβ k jeho receptorů může být snadno testována pomocí různých testů jako jsou např. testy popsané dále v textu. Výrazem ve stejném rozsahu nebo ve stejné míře se rozumí v kontextu předkládaného popisu, že referenční a s ní ekvivalentní molekula vykazují, statisticky vzato, v podstatě identickou křivku (tj . funkční závislost) inhibice IL-Ιβ vazby podle jednoho z testů zmíněných výše. Tak například IL-Ιβ vazebná molekula podle vynálezu má typicky IC50 pro inhibici vazby IL-Ιβ k receptorů v rozmezí +/-x5 hodnoty, výhodně shodnou hodnotu s IC50 odpovídající referenční molekule, když je testována stejně, jak bylo popsáno výše. Použitý test může být např. test kompetitivní inhibice vazby IL-Ιβ rozpustným receptorem IL-1 a IL-Ιβ vazebnými molekulami podle vynálezu.

Nejvýhodněji humánní IL-Ιβ protilátka obsahuje alespoň

a) jeden těžký řetězec, který obsahuje variabilní doménu, která má aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou se SEKVENCÍ ID. Č. 1 počínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 118, a konstantní úsek humánního těžkého řetězce, a

b) jeden lehký řetězec, který obsahuje variabilní doménu, která má aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou s SEKVENCÍ ID. Č. 2 počínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 107, a konstantní úsek humánního lehkého řetězce.

Konstantní úsek humánního těžkého řetězce může být typu

Yi, Y2, Y3 3 y₄, μ, «1, oí₂, δ nebo ε, přičemž výhodně je typu y, a výhodněji typu yi, zatímco konstantní úsek humánního lehkého řetězce může být typu κ nebo λ (který zahrnuje subtypy λ_1ζ λ₂ a λ₃) , avšak výhodně je typu κ. Aminokyselinové sekvence všech • *

- 10 těchto konstantních úseků jsou uvedeny v publikaci Kabat et al. (citované výše).

Všechny IL-Ιβ vazebné molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny metodami rekombinantní DNA. Pro tento účel je třeba zkonstruovat jednu nebo více DNA molekul kódujících vazebnou molekulu a tuto DNA molekulu umístěna pod kontrolu vhodné kontrolní sekvence a přenést do vhodného hostitelského organismu, kde je pak exprimována.

V obecném smyslu tedy předkládaný vynález poskytuje:

(i) DNA molekuly kódující jednodoménovou IL-Ιβ vazebnou molekulu podle vynálezu, jednořetězcovou IL-Ιβ vazebnou molekulu podle vynálezu, těžké nebo lehké řetězce nebo jejich fragmenty IL-Ιβ vazebné molekuly podle vynálezu, a (ii) použití DNA molekuly podle vynálezu k produkci IL-Ιβ vazebné molekuly podle vynález pomocí rekombinantní technologie.

Dosavadní stav techniky je takový, že odborník je schopen snadno syntetizovat DNA molekuly podle předkládaného vynálezu na základě informací uvedených v tomto popisu, tj. aminokyselinových sekvencí hypervariabilních úseků a DNA sekvencí, které je kódují. Způsob konstrukce genu pro variabilní doménu byl například popsán v dokumentu EPA 239 400 a může být stručně shrnut následovně: Klonuje se gen kódující variabilní doménu MAb (monoklonální protilátky) s libovolnou specificitou. DNA segmenty kódující rámec protilátky a hypervariabilní úseky se určí a DNA segmenty kódující hypervariabilní úseky se odstraní, takže DNA segmenty kódující rámcové úseky jsou vzájemně spojeny pomocí vhodných restrikčních míst v místě spojení. Restrikční místa mohou být vytvořena ve vhodných polohách mutagenezí DNA molekul pomocí

- 11 standardních postupů odborníkovi známých. Dvoj řetězcové syntetické CDR kazety jsou připraveny pomocí DNA syntézy podle sekvence uvedené jako SEKVENCE ID. Č. 1 nebo SEKVENCE ID.

Č. 2. Tyto kazety jsou opatřeny lepivými (sticky) konci, takže mohou být spojeny (ligovány) s vhodnými konci rámce.

A navíc, aby bylo možné získat DNA konstrukt kódující IL-Ιβ vazebnou molekulu podle vynálezu, není potřeba, aby byla dostupná mRNA z produkující hybridomové buněčné linie. Tak např. PCT přihláška publikovaná jako WO 90/07861 poskytuje úplné instrukce pro produkci protilátky pomocí techniky rekombinantní DNA, přičemž výchozí informací je pouze nukleotidové sekvence genu. Popsaný způsob zahrnuje syntézu řady oligonukleotidů, jejich amplifikaci pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) a nakonec jejich sestřih a spojení (splicing), čímž vznikne požadovaná DNA sekvence.

Expresní vektory obsahující vhodný promotor nebo geny kódující konstantní úseky těžkého a lehkého řetězce jsou odborné veřejnosti běžně k dispozici. Takže jakmile je jednou DNA molekula podle vynálezu připravena, může být snadno přenesena ve vhodném expresním vektoru. DNA molekuly kódující jednořetězcové protilátky mohou také být připraveny pomocí standardního postupu, například jak byl popsán v mezinárodní patentové přihlášce WO 88/1649.

Vzhledem k výše uvedenému není nutné ukládat ani hybridomy ani buněčné linie, aby byl splněn požadavek dostatečnosti a úplnosti popisu vynálezu.

V konkrétním provedení se předkládaný vynález poskytuje první a druhý DNA konstrukt pro produkci IL-Ιβ vazebné molekuly, jak jsou popsány dále:

První DNA konstrukt kóduje těžký řetězec nebo jeho fragment a obsahuje • · • v

- 12 a) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavě rámec a hypervariabilní úseky, přičemž hypervariabilní úseky jsou sled úseků CDR1, CDR2 a CDR3 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1, a tato první část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a

b) druhou část kódující konstantní úsek těžkého řetězce nebo jeho fragment, který začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části těžkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části nebo jejího fragmentu, po kterém následuje stop kodon.

Výhodně první část kóduje variabilní doménu, která má aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1 začínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 118. Výhodněji první část má nukleotidovou sekvenci jako SEKVENCE ID. Č. 1 začínající nukleotidem v poloze 1 a končící nukleotidem v poloze 354. A také výhodně druhá část kóduje konstantní část humánního těžkého řetězce, výhodněji konstantní část humánního řetězce yl. Tato druhá část může být DNA fragment genomového původu, (tj. obsahující introny) nebo fragment cDNA (tj. bez intronů).

Druhý	DNA	konstrukt kóduje lehký	řetězec	nebo jeho
fragment a	obsahuje
a) první	část,	která kóduje variabilní	doménu	obsahuj ící

střídavě úseky rámce a hypervariabilní úseky, přičemž hypervariabilní úseky jsou CDR3' a volitelně CDR1' a CDR2', jejichž aminokyselinové sekvence jsou v seznamu sekvencí uvedeny jako SEKVENCE ID. Č. 2, přičemž tato první část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a

b) druhou část kódující konstantní část lehkého řetězce nebo její fragment, který začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části lehkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části nebo jejího fragmentu, po kterém následuje stop kodon.

Výhodně tato první část kóduje variabilní doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2 začínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 107. Výhodněji, první část má nukleotidovou sekvenci uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 2 začínající nukleotidem v poloze 1 a končící nukleotidem v poloze 321. Výhodně také druhá část kóduje konstantní část humánního lehkého řetězce, výhodněji konstantní část humánního řetězce k.

Vynález dále zahrnuje IL-Ιβ vazebnou molekulu, ve které je jeden nebo více zbytků v CDRl, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' nebo CDR3' nebo v úsecích rámce, typicky jen několik málo (např. 1 až 4) změněno proti zbytkům v SEKVENCI ID. Č. 1 a SEKVENCI ID. Č. 2, například mutací, např. místně cílenou mutagenezí odpovídající DNA sekvence. Vynález také zahrnuje DNA sekvence kódující takto změněné IL-Ιβ vazebné molekuly. Zejména vynález zahrnuje IL-Ιβ vazebné molekuly, ve kterých jeden nebo více zbytků v CDRl' nebo CDR2' byly změněny proti zbytkům v SEKVENCI ID. Č. 2.

V prvním a druhém DNA konstruktu může být první a druhá část oddělena intronem, a v intronu mezi první a druhou částí může být výhodně lokalizován enhancer (zesilovací element).

• * • · · ·

- 14 Přítomnost takového enhanceru, který je transkribován ale není translatován, může napomoci účinnosti transkripce. Ve zvláštním provedení první a druhý DNA konstrukt obsahují enhancer genu těžkého řetězce, výhodně humánního původu.

Každý z DNA konstruktů je umístěn pod kontrolu vhodných kontrolních sekvencí, zejména pod kontrolu vhodného promotoru. Může být použit jakýkoliv typ promotoru, za předpokladu, že je adaptován pro hostitelský organismus, ve kterém budou DNA konstrukty exprimovány. Avšak pokud má k expresi dojít v savčích buňkách, zvláště výhodné je použití promotoru imunoglobulinového genu.

Požadovaná protilátka může být produkována v buněčné kultuře nebo v transgenním zvířeti. Vhodné transgenní zvíře může být připraveno standardním způsobem, který je odborníkům dobře znám, a který zahrnuje například mikroinjekce prvního a druhého DNA konstruktu s vhodnými kontrolními sekvencemi do vajíčka a pak přenesení takto připraveného vajíčka do vhodné pseudopregnantní samice a nakonec selekci potomstva exprimujícího požadovanou protilátku.

Když jsou řetězce protilátky produkovány v buněčné kultuře, DNA konstrukty musí být nejdříve vloženy buďto do jednoho expresního vektoru nebo do dvou oddělených, ale přitom kompatibilních expresních vektorů, přičemž tato druhá možnost je považována za výhodnější.

Takže předkládaný vynález také poskytuje expresní vektor schopný replikace v prokaryotické nebo eukaryotické buněčné linii, který obsahuje alespoň jeden z DNA konstruktů výše popsaných.

Každý z expresních vektorů obsahujících DNA konstrukt je pak přenesen do vhodného hostitelského organizmu. Když jsou DNA konstrukty odděleně vloženy do dvou expresních vektorů,

- 15 mohou být přeneseny odděleně, tj . jeden typ vektoru do jedné buňky, nebo mohou být přeneseny společně (ko-transfer), což je považováno za výhodnější možnost. Vhodným hostitelským organismem jsou baktérie, kvasinky nebo savčí buněčné linie, přičemž výhodná je tato třetí možnost. Výhodněji, savčí buněčná linie je linie lymfoidního původu, např. myelom, hybridom nebo normální imortalizované B-lymfocyty, které neexprimují endogenně žádné těžké ani lehké řetězce protilátky.

Pro expresi v savčích buňkách je výhodné, když sekvence kódující IL-Ιβ vazebnou molekulu je integrována do DNA hostitelské buňky do lokusu, který umožňuje nebo podporuje vysoký stupeň exprese IL-Ιβ vazebných molekul. Buňky, ve kterých je sekvence kódující IL-Ιβ vazebnou molekulu integrována do takového výhodného lokusu, mohou být identifikovány a selektovány na základě hladiny IL-Ιβ vazebných molekul, kterou exprimuji. Jakýkoliv vhodný selekční markér může být použit pro přípravu hostitelských buněk obsahujících kódující sekvenci pro IL-Ιβ vazebnou molekulu, např. gen dhfr/metotrexat nebo ekvivalentní selekční systém. Výhodné systémy pro expresi IL-Ιβ vazebné molekuly podle vynálezu jsou např. systémy založené na GS-amplifikaci/selekci, popsané v dokumentech EP 0256055 B, EP 0323997 B a evropské patentové přihlášce 89303964.4.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob produkce IL-Ιβ vazebné molekuly, kterýžto způsob zahrnuje kroky (i) kultivace organizmu, který je transformován expresním vektorem definovaným výše, a (ii) izolace IL-Ιβ vazebné molekuly z kultury.

V souladu s předkládaným vynálezem bylo zjištěno, že protilátka ACZ 885 má vazebnou specificitu pro antigenní • · • · · * · · • ·

epitop humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytek Glu64 zralého humánního IL-Ιβ proteinu (tento zbytek Glu64 ve zralém humánním IL-Ιβ odpovídá zbytku 180 prekurzorů humánního IL-Ιβ). Tento epitop je lokalizován vně rozpoznávacího místa receptorů IL-1 a je proto nanejvýš překvapující, že protilátky proti tomuto epitopu, tj . např. protilátka ACZ885, jsou schopné inhibovat vazbu IL-Ιβ k receptorů. Protilátky, zejména chimérické protilátky a CDR-roubované protilátky, a zejména humánní protilátky, které mají vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který obsahuje kličku obsahující zbytek Glu64, a které jsou schopné inhibovat vazbu IL-Ιβ na jeho receptor, a také použití těchto protilátek při léčení nemocí a poruch zprostředkovaných IL-1, jsou proto nové a jsou též zahrnuty v předkládaném vynálezu.

Takže dalším aspektem předkládaného vynálezu je protilátka proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop humánního IL-Ιβ, který obsahuje kličku obsahující zbytek Glu64 zralého humánního IL-Ιβ, a která je schopná inhibovat vazbu IL-Ιβ na jeho receptor.

Ještě další aspekty předkládaného vynálezu se týkají:

i) Použití protilátky proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytek Glu64, a která je schopná inhibice vazby IL-Ιβ k jeho receptorů, při léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí nebo poruch.

ii) Léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a poruch u pacientů, které spočívá v tom, že se pacientovi podává účinné množství protilátky proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého * · • · · ·

humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytek

Glu64, a která je schopná inhibice vazby IL-Ιβ k jeho receptorů.

iii) Farmaceutického přípravku, který obsahuje protilátku proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytek Glu64, a která je schopná inhibice vazby IL-Ιβ k jeho receptorů, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem, a iv) Použití protilátky proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytek Glu64, a která je schopná inhibice vazby IL-Ιβ k jeho receptorů, pro výrobu léku k léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a poruch.

V kontextu předkládaného popisu výraz, že protilátka je schopná inhibovat vazbu IL-Ιβ znamená, že protilátka je schopná inhibovat vazbu IL-Ιβ k jeho receptorů v podstatě ve stejném rozsahu jako protilátka ACZ 885, přičemž výraz ve stejném rozsahu již byl definován výše.

Protilátka ACZ 885 má vazebnou afinitu pro IL-Ιβ vyšší, než jaká byla dříve popsána pro protilátky anti-IL-Ιβ, např. humánní protilátky anti-IL-Ιβ. Protilátka ACZ 885 má rovnovážnou disociační konstantu K_D pro vazbu IL-Ιβ nižší než 50 pM, např. přibližně 35 pM. Díky této vysoké vazebné afinitě je protilátka ACZ mimořádně vhodná pro terapeutické využití.

Takže další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje protilátku proti IL-Ιβ, která má rovnovážnou disociační konstantu K_D pro vazbu IL-Ιβ nižší než 50 pM. Tento aspekt vynálezu se týká také použití, způsobů a přípravků založených • · • · * ·

- 18 na této protilátce s vysokou afinitou, jak je popsáno výše pro protilátky proti IL-Ιβ s vazebnou specificitou pro antigenní determinantu zralého humánního IL-Ιβ, která zahrnuje kličku obsahující Glu64.

V kontextu předkládaného popisu výraz IL-1 zprostředkovaná nemoc zahrnuje všechna onemocnění a zdravotní stavy, ve kterých hraje nějakou roli IL-1, ať již přímo nebo nepřímo při nemoci nebo stavu, včetně příčiny nemoci, rozvoji a progrese nemoci, persistenci nebo patologii nemoci nebo stavu.

V kontextu předkládaného popisu se termíny léčení nebo léčit týkají jak preventivní čili profylaktické péče tak i léčebné čili kurativní péče nebo péče vedoucí k modifikaci onemocnění, včetně péče o pacienty, kteří jsou v riziku získání nemoci nebo mají podezření, že nemoc získali, a také pacienty, kteří nemocí již trpí nebo byly diagnostikováni jako trpící nemocí, a dále se týkají i potlačení klinického relapsu.

Protilátky, které mají vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ zahrnující kličku obsahující zbytek Glu64, a zejména protilátky, které jsou schopné inhibice vazby IL-Ιβ k jeho receptoru, obzvláště pak protilátky, které mají rovnovážnou disociační konstantu K_D pro vazbu IL-Ιβ nižší než 50 pM, jsou dále označovány jako protilátky podle vynálezu.

Výhodné protilátky podle vynálezu jsou IL-Ιβ vazebné molekuly podle prvního a druhého aspektu předkládaného vynálezu. Výhodně jsou protilátky podle vynálezu humánní protilátky, nejvýhodněji je to protilátka ACZ 885 a její přímé ekvivalenty.

Protilátky podle vynálezu blokují účinky IL-Ιβ na jeho

4* 9 4

4 9 9 ·* 9·

- 19 cílové buňky a jsou tedy určeny pro použití při léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a poruch. Tyto a další farmakologické účinky protilátek podle vynálezu mohou být prokázány užitím standardních testovacích metod, např. testu popsaného dále:

1. Neutralizace IL-Ιβ dependentní tvorby PGE₂ a interleukinu-6 v primárních humánních fibroblastech

Tvorba PGF₂ a IL-6 v primárních humánních dermálních fibroblastech je závislá na IL-Ιβ. Samotný TNF-α nemůže sám účinně indukovat mediátory zánětu, ale působí synergicky s IL-1. Primární dermální fibroblasty se užívají jako náhradní model pro IL-l-indukovanou buněčnou aktivaci.

Primární humánní fibroblasty se stimulují rekombinantním IL-Ιβ nebo kondicionovaným médiem získaným z LPS-stimulovaných humánních PBMC v přítomnosti různých koncentrací protilátky podle vynálezu nebo IL-1RA v rozsahu 6 až 18000 pM. Chimérická protilátka anti-CD25 Simulect® (basiliximab) se užívá jako kontrola se shodným izotypem. Supernatant se odebírá po 16 hodinách stimulace a testuje se na přítomnost IL-6 ELISA testem nebo na přítomnost PGE2 RIA testem. Protilátky podle vynálezu mají při testování v těchto testech typicky hodnotu IC₅₀s pro inhibici produkce IL-6 přibližně 1 nM nebo nižší (např. 0,1 až 1 nM).

Jak bylo ukázáno ve výše popsaném testu, protilátky podle vynálezu silně blokují účinek IL-Ιβ. Tudíž jsou protilátky podle vynálezu farmaceuticky využitelné, a sice následujícími způsoby:

Protilátky podle vynálezu jsou užitečné k profylaxi a léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a stavů, jako je např. zánět, alergie a alergický stav, hypersensitivní reakce, ·· < 9 *» ···· ·· »··· ♦ S · • · · •••a >· autoimunitní choroby, silné infekce a rejekce orgánového nebo tkáňového transplantátu.

Tak například protilátky podle vynálezu mohou být užity při léčení příjemců transplantátů srdce, plic, bloku srdce-plíce, ledvin, slinivky, kůže nebo rohovky, a také při prevenci reakce příjemce (graft-versus-host disease) proti transplantátu dárce např. po transplantaci kostní dřeně, a arteriosklerózy spojené s orgánovým transplantátem.

Protilátky podle vynálezu jsou konkrétně použitelné např. při léčení, prevenci nebo zmírnění autoimunitních onemocnění a zánětlivých onemocnění, zejména zánětlivých stavů s etiologií zahrnující autoimunitní složku, jako je například artritida (např. revmatoidní artritida, chronická progredující artritida a deformující artritida), a revmatických onemocnění, včetně zánětlivých stavů a revmatických onemocnění zahrnujících ztrátu kostní hmoty, bolestivé záněty, a hypersenzitivity (včetně hypersenzitivity dýchacích cest i kožní hypersenzitivity) a alergií. Ke specifickým autoimunitních chorobám, pro které mohou být protilátky podle vynálezu použity, patří autoimunitní poruchy (včetně idiopatická autoimunitní hematologické např. hemolytické anemie, aplastické anemie, anemie červených krvinek a idiopatické trombocytopenie) , systémový lupus erythematosus, polychondritida, skleroderma, Wegenerova granulomatóza, dermatomyositida, chronická aktivní hepatitida, myasthenia gravis, psoriáza, Steven-Johnsonův syndrom, porucha vstřebávánní v tenkém střevu (sprue), zánětlivé onemocnění střev (včetně např.

ulcerativní kolitidy, Crohnovy nemoci a syndromu dráždivého tračníku), endokrinní oftalmopatie, Gravesova nemoc, sarkoidóza, roztroušená skleróza mozkomíšní, primární biliární cirhóza, juvenilní diabetes (diabetes mellitus typu I),

- 21 ··«· · · ·· ···· ·· ·· uveitida (anterior a posterior), keratoconjunctivitis sicca a vernální keratokonjunktivitida, fibróza plicního interstitia, psoriatická artritida a glomerulonefritida (jak bez tak i s nefrotickým syndromem, např. včetně idiopatického nefrotického syndromu nebo nefropatie s minimálními změnami).

Protilátky podle vynálezu jsou také užitečné při léčení, prevenci nebo zmírnění nemocí jako je astma, bronchitida, pneumokonióza, emfyzém plic, a další obstruktivní nebo zánětlivá onemocnění dýchacích cest.

Protilátky podle vynálezu jsou použitelné také při léčení nežádoucí akutní a hyperakutní zánětlivé reakce, která je zprostředkovaná IL-1 nebo zahrnuje tvorbu IL-1, zejména pak IL-Ιβ, nebo podporuje uvolňování TNF pomocí IL-1, jako je např. akutní infekce, např. septický šok (např. endotoxický šok a respirační distresový syndrom dospělých), meningitida, pneumonie, těžké popáleniny, a dále při léčení kachexie nebo úbyťového syndromu spojeného s patologickým uvolňováním TNF v důsledku infekcí, karcinomu nebo orgánových dysfunkcí, obzvláště s AIDS související kachexie, např. asociované nebo následující po infekci HIV.

Protilátky podle vynálezu jsou dále užitečné zejména při léčení onemocnění metabolismu kostí, jako je např. osteoartritida, osteoporóza a další zánětlivé artritidy a ztráty kostní hmoty obecně, včetně ztráty kostní hmoty související se stárnutím, a při specifických onemocněních periodontu.

Pro výše uvedené indikace je vhodná dávka, samozřejmě, různá, v závislosti například na konkrétní použité protilátce podle vynálezu, příjemci, způsobu podávání, a povaze a závažnosti onemocnění, které se má léčit. Avšak při profylaktickém použití lze obecně uspokojivých výsledků

- 22 • · · · ·· ·· · · · 4 · · · * dosáhnout s denními dávkami přibližně 0,05 mg až přibližně 10 mg na 1 kilogram tělesné hmotnosti, obvykle 0,1 mg až 5 mg na 1 kilogram tělesné hmotnosti. Při profylaktickém léčení se typicky podává lék jedenkrát týdně až jedenkrát za 3 měsíce, obvykle jedenkrát za 2 týdny až jedenkrát za 10 týdnů, např. jedenkrát za 4 až 8 týdnů. Protilátka podle vynálezu se obvykle podává parenterálně, intravenózně, např. do antekubitální nebo jiné periferní žíly, intramuskulárně, nebo subkutánně. Profylaktické podávání typicky spočívá v podávání protilátky podle vynálezu jedenkrát za měsíc až jedenkrát za 2 až 3 měsíce, nebo dokonce ještě s menší frekvencí.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu jsou vyráběny obvyklými způsoby, které jsou odborníkům dobře známy. Přípravek podle vynálezu je výhodně poskytnut v lyofilizované formě. Pro podání se rozpustí ve vhodném vodném nosiči, jako je například sterilní voda pro injekce nebo sterilní pufrovaný fyziologický roztok. Pokud je vhodné připravit větší objem takového roztoku pro podávání infúzí namísto bolusové injekce, je výhodné během formulace přípravku do fyziologického roztoku přidat humánní sérový albumin nebo přímo pacientovu vlastní heparinizovanou krev. Přítomnost nadbytku fyziologicky inertního proteinu zabraňuje ztrátě protilátky v důsledku adsorpce na stěnách kontejneru a hadiček, které se užívají pro infúzní roztok. Pokud se užije albumin, pak vhodná koncentrace je 0,5 až 4,5 % (hmot.) vzhledem k hmotnosti fyziologickému roztoku.

Předkládaný vynález je dále popsán a vysvětlen pomocí příkladů, jejichž funkce je ilustrativní, a doplněn výkresem, který ukazuje křivku závislosti reakce na dávce pro inhibici vazby IL-Ιβ rozpustnými receptory IL-1 typu I a II.

• ♦

- 23 Popis obrázku

Obrázek 1 je graf ukazující kompetitivní inhibici vazby ACZ885 k IL-Ιβ rozpustnými receptory IL-1 typu I a typu II.

Příklady provedení vynálezu

Pro přípravu protilátek proti humánnímu IL-Ιβ byly použity transgenní myši exprimující humánní IgG/κ repertoár místo vlastního imunoglobulinového repertoáru (Fishwild et al., 1996, Nátuře Biotechnol., 14, 845-851). B lymfocyty z těchto myši byly imortalizovány užitím standardní hybridomové technologie a byly tak získány myší hybridomové buňky, které secernují humánní IgGl/κ protilátku označenou

ACZ !5.

Příklad 1

Příprava hybridomu a purifikace protilátky

Geneticky modifikovaná myš 18077 (Medarex lne. Annadale, NJ) byla imunizována rekombinantním humánním IL-Ιβ navázaným na KLH (50 pg) v adjuvans subkutánně (s.c.) v několika místech. Imunitní reakce myši byla dále zesílena pěti dalšími injekcemi, poslední injekce tři dni před fúzí. V den fúze byla myš 18077 utracena inhalací CO₂ a pak byly buňky ze sleziny (4,1 x 10⁷) fúzovány rutinním způsobem užitím PEG4000 se stejným počtem buněk PAI-0 myší myelomové buněčné linie. Fúzované buňky byly přeneseny do 624 jamek (1 ml/jamka)

C• · · · ·· ·· ·«·· ·· · ·

- 24 obsahujících podpůrnou vrstvu (feeder) myších peritoneálních buněk (Balb C myši) , v médiu RPMI 1640 doplněném HAT, 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem a 5 x 10’⁵ M β-merkaptoethanolem. Supernatanty byly odebírány a testovány pomocí ELISA testu a byl prováděn screening na IL-Ιβ reaktivní monoklonální protilátky. Pět monoklonálních protilátek podtřídy IgG/κ bylo identifikováno. Klonování bylo provedeno pomocí 4 x 96jamkové mikrotitrační destičky, do každé jamky bylo přeneseno 0,5 buněk. Po dvou týdnech byly jamky kontrolovány inverzním mikroskopem. Supernatanty byly odebrány z jamek s pozitivním růstem a produkce monoklonální protilátky anti-IL-Ιβ byla vyhodnocována pomocí ELISA. Byly připraveny 1 až 2 litry kondicionovaného supernatantu ze čtyřech subklonů původně identifikovaného hybridomu #657 a protilátky byly purifikovány pomocí afinitní chromatografie na koloně s proteinem A.

Čistota a částečná aminokyselinová sekvence těžkého a lehkého řetězce

Aminokyselinové sekvencování

Lehké a těžké řetězce purifikované protilátky ACZ 885 byly odděleny pomocí SDS-PAGE a amino-koncové aminokyseliny byly stanoveny pomocí Edmanovy degradace. Čistota protilátky použité v této studii pomocí sekvencování byla á 90%. cDNA sekvence kódující variabilní domény těžkého a lehkého řetězce byly získány pomocí PCR amplifikace z cDNA připravené z mRNA z klonovaných hybridomových buněk a byly plně sekvencovány. Aminokoncové sekvence variabilních domén těžkého a lehkého řetězce a odpovídající DNA sekvence jsou dále uvedeny jako SEKVENCE ID. Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2, kde úseky CDR jsou vyznačeny tučně.

« · • · « ·

- 25 Variabilní úsek těžkého řetězce ACZ885 (SEKV. ID. Č. 1)

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAG -19 MEFGLSWVFLVALLRGVQCQ -1

GTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCC VQLVESGGGVVQPGRSLRLS -21

TGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTGTTTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCA CAASGFTFSVYGMNWVRQAP -41

GGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTGGTATGATGGAGATAATCAATACTATGCA GKGLEWVAIIWYDGDNQYYA -61

GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG DSVKGRFTISRDNSKNTLYL -81

CAAATGAACGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAGAGATCTTAGG QMNGLRAEDTAVYYCARDLR - 101

ACTGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC TGPFDYWGQGTLVT, V S S -118

Variabilní úsek lehkého řetězce ACZ885 (SEKV. ID. Č. 2)

ATGTTGCCATCACAACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGGGTTCCAGCCTCCAGGGGTGAA -19 AřLFSQLXGFLLLWVPASRGE -1

ATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGAAAGTCACCATC IVLTQSPDFQSVTPKEKVTI -21

ACCTGCCGGGCCAGTCAGAGCATTGGTAGTAGCTTACACTGGTACCAGCAGAAACCAGAT TCRASQSIGSSLHWYQQKPD -41

CAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCTTCTCAGGGGTCCCCTCGAGG QSPKLLIKYASQSFSGVPSR -61

TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAATAGCCTGGAAGCTGAA FSGSGSGTDFTLTINSLEAE -81

GATGCTGCAGCGTATTACTGTCATCAGAGTAGTAGTTTACCATTCACTTTCGGCCCTGGG DAAAYYCHQSSSLPFTFGPG -101

ACCAAAGTGGATATCAAA - 107

T K V D I K

Kurzívou je vyznačena vedoucí („leader) sekvence (není u zralé protilátky) a tučně úseky CDR.

• · « ·

- 26 Konstrukce expresních vektorů pro těžký a lehký řetězec

Byl použit amplifikační/selekční systém založený na GS, jaký byl například popsán v dokumentech EP 0256055 B, EP 0323997 B nebo evropské patentové přihlášce 89303964.4, kde byla jako selekční markér použita GS kódující sekvence.

Příklad 2

Biochemická a biologická data

Bylo zjištěno, že monoklonální protilátka ACZ885 neutralizuje in vitro aktivitu interleukinu-ΐβ. Monoklonální protilátka byla dále charakterizována prostřednictvím vazby protilátky k rekombinantnímu humánnímu ILl-β analyzované systémem BIAcore. Neutralizace byla hodnocena kompetitivni vazebnou studií s rozpustnými IL-1 receptory. Biologická aktivita protilátky ACZ 885 vůči rekombinantně připravenému a přirozeně tvořenému IL-Ιβ byla stanovena na primárních humánních buňkách (viz příklad 3), reagujících na stimulaci IL-Ιβ.

Stanovení rovnovážné disociační konstanty

Konstanty rychlosti asociace a disociace vazby rekombinantního humánního IL-Ιβ a ACZ 885 byly stanoveny analýzou BIAcore. ACZ 885 byla imobilizována a vazba rekombinantního IL-Ιβ v rozmezí koncentrací 1 až 4 nM byla měřena pomocí povrchové plazmonové rezonance. Vybraný formát analýzy umožnil zacházet s vazebnou událostí IL-Ιβ k ACZ 885 podle 1:1 stechiometrie. Analýza dat byla provedena pomocí

- 27 softwaru „BIAevaluation.

	kon [10⁵/ms]	k_Of f [10'⁵/s]	K_D [pM]
Humánní IL-Ιβ	11,0 ± 0,23	3,3 ± 0,27	30,5 ± 2,6	N = 22

Závěr: ACZ 885 se váže k rekombinantnímu humánnímu IL-Ιβ s vysokou afinitou.

Studie kompetitivní inhibice vazby s rozpustnými IL-1 receptory typu I a II

Studium kompetice vazby pomocí rozpustných receptor IL-1 typu I a II

Kompetice mezi ACZ885 a rozpustným humánním receptorem IL-1 typu I a typu II byla měřena pomocí systému BIAcore. ACZ885 byla imobilizována na povrchu čipu a rekombinantní humánní IL-Ιβ (1 nM) byl injikován, aby se navázal na ACZ885 za absence nebo přítomnosti zvyšující se koncentrace rekombinantního humánního rozpustného receptoru I nebo receptoru II (0 až 12 nM, vždy 4 nezávislé cykly) . Získané výsledky jsou ukázány na obrázku 1. Vazba NVP-ACZ885 na humánní IL-Ιβ byla stanovena v přítomnosti rekombinantního rozpustného receptoru IL-1 typu I nebo typu II. Hodnoty polovičního maxima účinku IC50 byly stanoveny pomocí programu Origin 6.0, uvedena je průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

Závěr: Vazba ACZ885 na IL-Ιβ je kompetitivní jak • · · 9

- 28 s receptorem IL-Ιβ typu I tak s receptorem typu II.

Profil reaktivity s humánním IL-Ια, humánním IL-IRA a IL-Ιβ z jiných biologických druhů

Profily reaktivity ACZ885 s humánním IL-Ια, IL-IRA a IL-Ιβ z makaka „cynomolgus, králíka, myši a laboratorního potkana, byly analyzovány opět pomocí zařízení Biacore. ACZ885 byla imobilizována a zkoumané cytokiny byly užity v koncentraci 8 nM (6 nezávislých cyklů).

Tabulka 3: Zkřížená reaktivita NVP-ACZ885 s IL-Ιβ, IL-la a IL-IRA

	% vazby (průměr ± stř. chyba)
Rek. humánní IL-Ιβ (n=6)	100
Rek. IL-Ιβ cynomolg. makaka (n=ll)	7,8 ± 1,0
Rek. králičí IL-Ιβ (n=6)	-0,5 ± 0,2
Rek. myší IL-Ιβ (n=6)	-2,6 ± 0,6
Rek. IL-Ιβ lab. potkana (n=6)	-6,2 ± 1,0
Rek. humánní IL-lcx (n=6)	8,4 ± 2,4
Rek. humánní IL-IRa (n=6)	-3,7 ± 1,7

Jednotky resonance byly odečítány v čase 1000 s po zahájení injikování, hodnota pro injikování samotného pufru byla odečtena ze všech sensorgramů a základní linie po imobilizaci anti-Fcy byla nastavena na nulu. Vazba je vyjádřena jako procenta akumulované resonanční jednotky pro humánní IL-Ιβ.

• ·

- 29 Závěr: Protilátka ACZ 885 zkříženě významně nereaguje s humánním IL-Ιβ, humánním IL-IRa, nebo IL-Ιβ z myši, laboratorního potkana nebo králíka. Reaktivita vůči IL-Ιβ z makaka je v podstatě shodná s humánním cytokinem.

Příklad 3

Neutralizace uvolňování interleukinu-6 v humánních dermálních fibroblastech působením ACZ885

Pro vyhodnocení biologické aktivity ACZ885 v neutralizaci působení humánního IL-Ιβ byl použit následující postup:

1. Příprava kondicionovaného média obsahujícío IL-Ιβ

Příprava kondicionovaná média z humánních mononukleárních buněk periferní krve byla provedena následovně: mononukleární buňky periferní krve byly připraveny oddělením buněk od periferní krve opic s použitím hustotního gradientu ficoll-hypaque podle způsobu, který publikoval Hansel [Hansel,T.T. et.al. (1991). Improved immunomagnetic proceduře for the isolation of highly purified human blood eosinophils. J.Imm. Methods .145: 105-110], a pak byly použity v koncentraci 10⁵ buněk/jamka v RPMI/10% FCS. ΙΕΝβ (100 U/ml) a LPS (5 pg/ml) byly přidány a buňky byly následně inkubovány po dobu 6 hodin. Inkubace byla ukončena centrifugací při 1200 RPM po dobu 10 minut. IL-Ιβ přítomný v supernatantu byl kvantifikován užitím ELISA testu.

• ·

- 30 2. Neutralizační test

Humánní dermální fibroblasty z předkožky byly získány od firmy Clonetics (CC-2509) a byly pěstovány v médiu FBM (Clonetics, CC-3131) obsahujícím bFGF (1 ng/ml, CC-4065), inzulín (5 pg/ml, CC-4021) a 2% FCS (CC-4101).

Pro indukci IL-6 byly buňky nasazeny v hustotě 10⁴buněk/jamka na 48jamkové tkáňové misky. Následující den buňky byly ponechány hladovět po dobu 6-7 h v FBM obsahujícím 2% FCS pře tím, než byl přidán cytokin. Pro stimulaci bylo kultivační médium nahrazeno FBM + 2% FCS obsahujícím vhodné množství kondicionovaného média s přibližně 50pg/ml IL-Ιβ. Alternativně byl použit rekombinantní humánní IL-Ιβ v konečné koncentraci 50 pg/ml.

Neutralizující anti-IL^ protilátka byla titrována do naředěného kondicionovaného média před přidáním k buňkám. Rekombinantní IL-IRa (R&D Systems, # 280-RA-010) byla použita jako pozitivní kontrola.

Buněčný supernatant byl odebrán 16 až 17 h po stimulaci a množství uvolněného IL-6 bylo stanoveno sendvičovým testem ELISA.

3. IL-6 ELISA

Mikrotitrační destičky pro ELISA byly potaženy myší anti-humánní IL-6 monoklonální protilátkou (Mab) 314-14 (Novartis Pharma, šarže EN23,961, 5,5 mg/ml, 100 pl, 3 pg/ml) v PBS s 0,02% NaN₃ a inkubovaly se přes noc v +4 °C, následující den byly mikrotitrační destičky promyty 4krát PBS/0,05% Tween/0,02% NaN₃ a blokovány užitím 300 pl PBS/3% bovinní sérum albumin (BSA)/0,02% NaN₃ po dobu 3 hodin. Destičky byly pak promyty znovu (4krát) a 100 pl supernatantu • ·

- 31 (konečné ředění 1:20) nebo standardu rekombinantního humánního IL-6 ((Novartis Pharma, #91902), titrační křivka v rozmezí od 1 do 0,0156 ng/ml v krocích s dvojnásobným ředěním) bylo přidáno ve dvojím opakování. Po inkubaci přes noc při teplotě místnosti (RT) byly destičky promyty (4 krát) a různé koncentrace myší ant-humánní IL-6 MAb (110-14, Novartis Pharma, 6,3 mg/ml, 100 μΐ, 1 pg/ml, 3 h při teplotě místnosti) byly přidány. Po dalších 4 promytích bylo přidáno biotinem značené kozí anti-myší IgG2b antisérum (Southern Biotechnology, #1090-08) v konečném ředění z 1/10000 (100 μΐ/jamka, 3 h při teplotě místnosti) . Po inkubaci byly destičky promyty 4krát a streptavidin kondenzovaný s alkalickou fosfatázou (Jackson ImmunoResearch, #016-050-084) byl přidán v konečném ředění 1/3000 (100 μΐ/jamka, 30 minut při teplotě místnosti). Po promytí (4krát) byl přidán na dobu 30 minut substrát (p-nitrofenylfosfát v diethanolaminovém pufru, 100 μΐ). Reakce byla zastavena přidáním 5 M NaOH v množství 50 μΐ/jamka. Destičky byly odečítány v mikrotitrační čtecím přístroji (Bio-Rad) s použitím filtru pro 405 a 490 nm.

Hladiny IL-6 v supernatantech z kultur byly vypočítány užitím standardní kalibrační křivky získané proložením kvadratické funkce. Statistické vyhodnocení a stanovení IC₅₀bylo provedeno pomocí proložení sigmoidní křivky.

Výsledky:

Tabulka: Inhibice IL-Ιβ indukované sekrece IL-6

Hodnoty IC50 pro inhibici IL-^-indukované sekrece IL-6 humánních kožních fibroblastů. Fibroblasty byly stimulovány rekombinantním humánním IL-Ιβ nebo kondicionovaným médiem obsahujícím 50 až 100 pg/ml IL-Ιβ.

• ♦ « ·

	NVP-ACZ885, šarže 1 IC₅₀ [pM] + SEM	NVP-ACZ88, šarže 2 IC₅₀ [pM] + SEM	IL-1RA IC₅₀ [PM] + SEM
sekrece IL-6 kond. médium	54 + 6,1 (9,1+1,0 ng/ml) (n=6)	44,6 + 3,6 (7,4+0,6 ng/ml) (n=6)	30 + 3,1 (0,51+0,05 ng/ml) (n=5)
sekrece IL-6 rek. humánní IL-Ιβ	42 + 3,4 (7,1+0,56 ng/ml) (n=4)	63 + 2,8 (10,5+0,5) (n=6)	Neměřeno

Příklad 4

Definice epitopu pro ACZ885

ACZ885 se váže k humánnímu IL-Ιβ s vysokou afinitou, ale selhává v rozpoznání vysoce homologních IL-Ιβ pocházejících z makaka „rhesus. Jeden z nejvýraznějších rozdílů v aminokyselinové sekvence mezi IL-Ιβ makaka „rhesus a humánním IL-Ιβ je v poloha 64 zralého IL-Ιβ. Humánní IL-Ιβ má v této poloze glutamovou kyselinu, zatímco makak „rhesus alanin. Mutantní humánní IL-Ιβ s příslušnou záměnou Glu64Ala ztrácí schopnost vázat se k ACZ885 s měřitelnou afinitou. Původci vynálezu na základě toho došli k závěru, že Glu64 v humánním IL-Ιβ je nezbytný pro rozpoznávání protilátkou ACZ885. Glu64 je lokalizovaný v kličce IL-Ιβ, která není částí vazebného povrchu pro receptor IL-Ιβ typu I, ani není v jeho bezprostřední blízkosti. Proto protilátky namířené proti vazebnému epitopu obsahujícímu Glu64 mají schopnost neutralizovat biologickou aktivitu humánního IL-Ιβ.

• ·

- 33 Seznam sekvencí

SEKVENCE ID. C. 1

DNA a aminokyselinová sekvence variabilního úseku těžkého řetězce protilátky ACZ885

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAG -19 MFFGLSWVFLVALLRGVQCQ -1

ACTGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC

TGPFDYWGQGTLVT. VSS -118

SEKVENCE ID. Č. 2

DNA a aminokyselinová sekvence variabilního úseku lehkého řetězce protilátky ACZ885

ATGTTGCCATCACAACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGGGTTCCAGCCTCCAGGGGTGAA -19 MLPSQL1GFLLLWVPASRGE -1

GATGCTGCAGCGTATTACTGTCATCAGAGTAGTAGTTTACCATTCACTTTCGGCCCTGGG DAAAYYCHQSSSLPFTFGPG - 101

ACCAAAGTGGATATCAAA T K V D I K

107 • ·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. IL-Ιβ vazebná molekula, která obsahuje antigenní vazebné místo obsahující alespoň jednu variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (V_H) , která obsahuje sled hypervariabilních úseků CDR1, CDR2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovou sekvenci Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 má aminokyselinovou sekvenci Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-AsnGln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovou sekvenci Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro, a její přímé ekvivalenty.
2. IL-Ιβ vazebná molekula, která obsahuje alespoň jednu variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (V_L) , která obsahuje sled hypervariabilních úseků úseků CDRl', CDR2' a CDR3', kde CDRl' má aminokyselinovou sekvenci ArgAla-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His, CDR2' má aminokyselinovou sekvenci Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser, a CDR3' má aminokyselinovou sekvenci His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro, a její přímé ekvivalenty.
3. IL-Ιβ vazebná molekula, která obsahuje variabilní domény jak těžkého (V_H) tak i lehkého řetězce (V_L) , přičemž IL-Ιβ vazebná molekula obsahuje alespoň jedno antigenní vazebné místo obsahující: a) variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (V_H) , která obsahuje sled hypervariabilních úseků CDRl, CDR2 a CDR3, kde CDRl má aminokyselinovou sekvenci Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 má aminokyselinovou sekvenci Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-AlaAsp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovou sekvenci • · • 9

- 35 Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro, a b) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (V_L) , která obsahuje sled hypervariabilních úseků úseků CDRl', CDR2 ' a CDR3', kde CDRl' má aminokyselinovou sekvenci Arg-Ala-Ser-Gln-SerIle-Gly-Ser-Ser-Leu-His, CDR2' má aminokyselinovou sekvenci Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser, a CDR3' má aminokyselinovou sekvenci Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro, a její přímé ekvivalenty.
4. IL-Ιβ vazebná molekula podle nároku 1, 2 nebo 3, která je humánní protilátka.

IL-Ιβ vazebná molekula, která obsahuje alespoň jedno antigenní vazebné místo obsahující buďto první doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou se sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1, začínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 118, nebo první doménu, jak byla popsána výše, a druhou doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou se sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2, začínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 107.
6. První konstrukt DNA kódující těžký řetězec nebo jeho fragment, který obsahuje

a) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavě úseky rámce a hypervariabilní úseky, kde hypervariabilní úseky jsou sled CDRl, CDR2 a CDR3, jejichž aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v SEKVENCI • · ·· • · 9' *· • · · · · · · • · <· · ·· ·· ···· ·· ··

- 36 ID. Č. 1, přičemž tato první část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a

b) druhou část kódující konstantní úsek těžkého řetězce nebo jeho fragment, která začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části těžkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části nebo jejího fragmentu, po kterém následuje stop kodon.
7. Druhý konstrukt DNA kódující lehký řetězec nebo jeho fragment, který obsahuje

a) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavě úseky rámce a hypervariabilní úseky, kde hypervariabilní úseky jsou CDR1' a CDR3', jejichž aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v SEKVENCI ID. Č. 2, přičemž tato první část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a

b) druhou část kódující konstantní úsek lehkého řetězce nebo jeho fragment, která začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části lehkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části nebo jejího fragmentu, po kterém následuje stop kodon.
8. Expresní vektor replikující se v prokaryotické nebo eukaryotické buněčné linii, který obsahuje alespoň jeden z konstruktů DNA podle nároku 6 nebo 7.

- 37 «· »» ·· t** »# **·>

• · » · » r · · » * « ·» · · » r · · · ♦ • · » ··· · « · * ··«· ·» ·· ···· ·· ··
9. Způsob přípravy IL-Ιβ vazebné molekuly vyznačující se tím, že zahrnuje kroky (i) kultivace organizmu, který je transformován expresním vektorem podle nároku 8 a (ii) izolaci IL-Ιβ vazebné molekuly z buněčné kultury.
10. Protilátka proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který obsahuje zbytek Glu64, a která inhibuje vazbu IL-Ιβ na jeho receptor.
11. i) Použití protilátky proti IL-Ιβ podle nároku 10 při léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí nebo poruch.

ii) Způsob léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a poruch u pacientů vyznačující se tím, že se pacientovi podává účinné množství protilátky podle nároku 10.

iii) Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje protilátku proti IL-Ιβ podle nároku 10 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem.

iv) Použití protilátky proti IL-Ιβ podle nároku 10 pro výrobu léku k léčení nemocí a poruch zprostředkovaných IL-1.