PL212480B1

PL212480B1 - Czasteczka wiazaca IL-1β, sposób jej wytwarzania, wektor ekspresyjny, zastosowanie czasteczki wiazacej IL-1β oraz kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL212480B1
Application number: PL360358A
Authority: PL
Inventors: Hermann Gram; Padova Franco E. Di
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-08-22
Filing date: 2001-08-20
Publication date: 2012-10-31
Also published as: PT1313769E; LU91624I2; HUS1300015I1; SI1313769T1; PE20020319A1; JP2008295456A; HUP0300806A3; WO2002016436A2; CA2420231A1; DE60134148D1; WO2002016436A3; US8273350B2; CZ304470B6; ES2305110T5; HUP0300806A2; CY2009019I1; AR035581A1; EP1313769B1; NZ524199A; KR20080056316A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka wiążąca IL-Ιβ, sposób jej wydarzania, wektor ekspresyjny zastosowań cząsteczki wiążącej IL-^ oraz kompozycja farmaceutyczna obejmująca cząsteczkę wiążącą IL-^.

Interleukina 1 (IL-1) jest wydzielana przez komórki układu odpornościowego, która działa, jako czynnik pośredniczący fazy ostrej odpowiedzi zapalnej. Nieodpowiednie lub nadmierne wytwarzanie IL-1, w szczególności IL-1 β, jest związane z patologią różnych chorób i zaburzeń, takich jak posocznica, wstrząs endotoksynowy lub septyczny, alergie, astma, ubytek masy kostnej, niedokrwienie, udar, reumatoidalne zapalenie stawów i inne choroby zapalne. Sugerowano, że cząsteczki wiążące, IL-1 β mogą być stosowane w leczeniu chorób lub zaburzeń, w których pośredniczy IL-1 (patrz na przykład WO 95/01997 i dyskusja we wprowadzeniu tego opisu).

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka wiążąca IL-^, która obejmuje zmienne domeny zarówno ciężkiego łańcucha (V_H), jak i lekkiego łańcucha (V_L), gdzie cząsteczka wiążąca IL-^ zawiera przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu obejmujące:

a) zmienną domenę (VH) immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, która obejmuje w sekwencji hiperzmienne regiony CDR1, CDR2 , CDR3, przy czym CDR1, ma sekwencję aminokwasową ValTyr-Gly-Met-Asn, CDR2 ma sekwencję aminokwasową Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-TyrAIa-Asp-Ser-VaI-Lys-GIy, a CDR3 ma sekwencję aminokwasową Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro oraz

b) zmienną domenę (VL) immunoglobulinowego lekkiego łańcucha, która obejmuje w sekwencji hiperzmienne regiony CDR1'. CDR2' i CDR3'. przy czym CDR1' ma sekwencję aminokwasową Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His, CDR2' ma sekwencję aminokwasową Ala-Ser-Gln-Ser-PheScr, a CDRV, ma sekwencję aminokwasową His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro i ich bezpośrednie ekwiwalenty, w których hiperzmienne regiony CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' i CDR3' rozpatrywane, jako całość są przynajmniej w 95% homologiczne względem regionów hiperprzmiennych przedstawionych w a) i b), która specyficznie wiąże epitop antygenowy ludzkiej IL1β, który obejmuje pętlę zawierającą resztę GIu64 dojrzałej IL-^, oraz która wykazuje właściwości hamowania wiązania IL-^, do jej receptora oraz posiada stałą równowagi dysocjacji KD dla wiązania z IL-^, wynoszącą 50 pM lub mniej.

Cząsteczka wiążąca IL-^, według wynalazku jest korzystnie ludzkim przeciwciałem.

Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka wiążąca IL-^, która obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu, obejmujące zarówno pierwszą domenę o sekwencji aminokwasowej identycznej z przedstawioną, jako SEQ. ID. NO. 1, rozpoczynającej się od aminokwasu w pozycji 1 i zakończonej aminokwasem w pozycji 118 i drugą domenę o sekwencji aminokwasowej identycznej z przedstawioną, jako SEQ. ID. NO. 2, rozpoczynającej się od aminokwasu w pozycji 1 i zakończonej aminokwasem w pozycji 107.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny, zawierający pojedynczy wektor ekspresyjny lub zestaw dwóch kompatybilnych wektorów ekspresyjnych, zawierający:

1) pierwszy konstrukt DNA, kodujący ciężki łańcuch lub jego fragment, który zawiera:

a) pierwszą część, która koduje zmienną domenę obejmującą, naprzemiennie regiony zrębowe i regiony hiperzmienne, przy czym regiony hiperzmienne są w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3, których sekwencje aminokwasowe zostały przedstawione, jako SEQ. ID. NO. 1, gdzie pierwsza część rozpoczyna się od kodonu, kodującego pierwszy aminokwas domeny zmiennej i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas domeny o zmiennej oraz

b) drugą część kodującą, niezmienną część ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu, który rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas niezmiennej części ciężkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas niezmiennej części lub jej fragmentu, po której występuje kodon stop.

2) drugi konstrukt DNA, kodujący lekki łańcuch lub jego fragment, który zawiera:

a) pierwszą część, która koduje zmienną domenę obejmującą, naprzemiennie regiony zrębowe i regiony hiperzmienne, przy czym regionami hiperzmiennymi są CDR1' i CDR3', których sekwencje aminokwasowe zostały przedstawione, jako SEQ. ID. NO. 2, gdzie pierwsza część rozpoczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas domeny zmiennej i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas domeny zmiennej oraz

b) drugą część kodującą lekki łańcuch niezmiennej części lub jej fragmentu, który rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas niezmiennej części lekkiego łańcucha i kończy się

PL 212 480 B1 kodonem kodującym ostatni aminokwas niezmiennej części lub jej fragmentu, po którym występuje kodon stop.

Wektor ekspresyjny, według wynalazku jest zdolny do replikacji w prokariotycznej lub eukariotycznej linii komórkowej.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cząsteczki wiążącej IL-Ιβ, który obejmuje (i) hodowlę organizmu transformowanego wektorem ekspresyjnym określonym powyżej i (ii) uzyskiwanie cząsteczki wiążącej IL-^ z hodowli.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cząsteczki wiążącej IL-^, która jest ludzkim przeciwciałem, do wytwarzania leku do leczenia choroby lub zaburzenia, w którym pośredniczy IL-1 β.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, obejmująca cząsteczkę wiążącą IL-^, która jest ludzkim przeciwciałem, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.

Jeśli nie wskazano inaczej, dowolny polipeptydowy łańcuch jest opisany tutaj, jako mający sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się od zakończenia końca N i kończącą się na zakończeniu końca C. Miejsce wiązania antygenu obejmuje domeny zarówno VH jak i VL, które mogą być zlokalizowane na tej samej cząsteczce polipeptydu lub, korzystnie, każda domena może być na różnym łańcuchu, tj. domena VH, będąca częścią immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu i VL, będąca częścią immunoglobulinowego lekkiego łańcucha lub jego fragmentu.

Termin „cząsteczka wiążąca ^-1β” oznacza cząsteczkę zdolną do wiązania się z antygenem IL-1 β, zarówno samym jak i w połączeniu z innymi cząsteczkami. Reakcja wiązania może być przedstawiona standardowymi sposobami (testy jakościowe) włączając na przykład, test biologiczny do określania hamowania wiązania IL-^ z jego receptorem lub dowolnego rodzaju testy wiązania, w odniesieniu do testów kontroli negatywnej, w których stosowane jest przeciwciało o niepokrewnej specyficzności, lecz o takim samym izotypie, np. przeciwciało anty-CD25. Korzystnie, wiązanie cząsteczek wiążących IL-^, według wynalazku z IL-^ może być przedstawione w kompetycyjnych testach wiązania.

Przykłady cząsteczek wiążących antygen obejmują przeciwciała, takie jakie są wytwarzane przez limfocyty B, hybrydomy i chimeryczne, CDR-szczepione lub ludzkie przeciwciała lub dowolny ich fragment, np. F(ab')2 i fragmenty Fab, jak i przeciwciała o pojedynczym łańcuchu lub pojedynczej domenie.

Jednołańcuchowe przeciwciało zawiera zmienne domeny ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała, kowalencyjnie związane linkerem peptydowym, zwykle zawierającym od 10 do 30 aminokwasów, korzystnie od 15 do 25 aminokwasów. Dlatego taka struktura nie obejmuje domeny stałej ciężkiego i lekkiego łańcucha i uważa się, że mała część peptydowa rozdzielająca powinna być mniej antygenowa niż cała domena stała. Termin „chimeryczne przeciwciało” oznacza przeciwciało, w którym domeny stałe ciężkiego lub lekkiego łańcucha lub obu są pochodzenia ludzkiego, podczas gdy zmienne domeny zarówno ciężkiego jak i lekkiego łańcucha nie są pochodzenia ludzkiego (np. pochodzenia mysiego) lub są pochodzenia ludzkiego lecz pochodzą od różnych ludzkich przeciwciał. Termin „szczepione CDR przeciwciało” oznacza przeciwciało, w którym regiony hiperzmienne (CDRy) pochodzą z donorowego przeciwciała, innego niż ludzkiego przeciwciała (np. pochodzenia mysiego) lub odmiennego ludzkiego przeciwciała, podczas gdy wszystkie lub zasadniczo wszystkie inne części immunoglobuliny np. domeny stałe i wysoce konserwatywne części domen zmiennych, to jest regiony zrębowe, pochodzą z akceptorowego przeciwciała, np. przeciwciała pochodzenia ludzkiego. Szczepione CDR przeciwciało może jednakże zawierać kilka aminokwasów sekwencji donorowej w regionach zrębowych, na przykład w częściach regionów zrębowych przylegających do regionów hiperzmiennych. Termin „ludzkie przeciwciało” oznacza przeciwciało, w którym stałe i zmienne domeny ciężkiego jak i lekkiego łańcucha są wszystkie pochodzenia ludzkiego, lub zasadniczo identyczne z sekwencjami pochodzenia ludzkiego, niekoniecznie z tego samego przeciwciała i obejmują przeciwciała wytwarzane przez myszy, w których mysie immunoglobulinowe domeny zmienne i stałe genów zostały zastąpione przez ich ludzkie odpowiedniki, np. jak opisano w ogólnych określeniach w opisach patentowych EP 0546073 B1, USP 5545806, USP 5 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, EP 0438474 B1 i EP 0463151 B1.

Szczególnie korzystne cząsteczki wiążące IL-^ według wynalazku stanowią ludzkie przeciwciała zwłaszcza przeciwciało ACZ 885 jak poniżej o pisano w przykładach.

W korzystnych chimerycznych przeciwciałach zmienne domeny zarówno ciężkiego jak i lekkiego łańcucha są pochodzenia ludzkiego, na przykład przeciwciała ACZ 885, które zostały przedstawione

PL 212 480 B1 jako Seq. Id. No. 1 i Seq. Id. No. 2. Domeny regionów stałych korzystnie obejmują odpowiednie ludzkie domeny regionu stałego, na przykład jak opisano w „Sequences of Protein of Immunological Interest”, Kabat E.A. i wsp., US Department of Health i Human Services, Public Health Service, National Institute of Health.

Regiony hiperzmienne mogą być w połączeniu z dowolnym rodzajem regionów zrębowych, lecz korzystnie są pochodzenia ludzkiego. Odpowiednie regiony zrębowe w opisano w Kabat E.A. i wsp., ibid. Korzystny zrąb ciężkiego łańcucha stanowi ludzki zrąb ciężkiego łańcucha, na przykład przeciwciała ACZ 885, które przedstawiono jako Seq. Id. No. 1. Zawiera ono w sekwencji regiony FR1, FR2, FR3 i FR4. W podobny sposób Seq. Id. No. 2, wskazuje korzystny zrąb lekkiego łańcucha ACZ 885, który zawiera w sekwencji regiony FR1', FR2', FR3' i FR4'.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka wiążąca IL-1 β, która obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu obejmujące jedną domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako Seq. Id. No. 1, rozpoczynającą się aminokwasem w pozycji 1 i kończącą się aminokwasem w pozycji 118 lub pierwszą domenę, jak opisano powyżej i drugą domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako Seq. Id. No. 2, rozpoczynającą się aminokwasem w pozycji 1 i kończącą się aminokwasem w pozycji 107.

Monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko białku naturalnie występującemu u wszystkich ludzi są typowo opracowywane w układach nie pochodzenia ludzkiego np. u myszy, i jako takie typowo nie są białkami pochodzenia ludzkiego. Jako bezpośrednia konsekwencja powyższego, przeciwciało pochodzenia obcego, jakie jest wytwarzane przez hybrydomy, po podaniu ludziom, wywołuje niepożądaną odpowiedź odpornościową, w której przeważająco pośredniczą domeny stałe immunoglobuliny pochodzenia obcego. To wyraźnie ogranicza zastosowanie takich przeciwciał, gdyż nie mogą one być podawane przez dłuższy okres czasu. Dlatego szczególnie korzystne jest zastosowanie pojedyńczego łańcucha, pojedyńczej domeny, chimery, szczepionego CDR, lub zwłaszcza ludzkiego przeciwciała, które jest mało prawdopodobne, żeby wywoływało zasadniczą reakcję allogeniczną, gdy jest podawane ludziom.

Alternatywnie, cząsteczka wiążąca IL-^ według wynalazku może być wybrana z jednołańcuchowej cząsteczki wiążącej, która obejmuje miejsce wiązania antygenu obejmujące:

a) pierwszą domenę, obejmującą w sekwencji regiony hiperzmienne CDR1, CDR2 i CDR3, te regiony hiperzmienne mają sekwencje aminokwasowe przedstawione jako Seq. Id. No. 1;

b) drugą domenę, obejmującą regiony hiperzmienne CDR1', CDR2' i CDR3' te regiony hiperzmienne mają sekwencje aminokwasowe przedstawione, jako Seq. Id. No. 2 oraz;

c) łącznik (Iinker) peptydowy, który jest związany bądź z zakończeniem końca N pierwszej domeny i z zakończeniem końca C drugiej domeny bądź z zakończeniem końca C pierwszej domeny i z zakończeniem końca N drugiej domeny;

i ich bezpośrednie ekwiwalenty zdefiniowane powyżej.

Zgodnie z ogólną wiedzą, mniejsze zmiany w sekwencji aminokwasowej takie jak delecja. dodanie lub podstawienie jednego, kilku lub więcej aminokwasów może prowadzić do formy allelicznej wyjściowego białka, która ma zasadniczo identyczne właściwości.

Zatem, określenie „ich bezpośrednie ekwiwalenty” oznacza dowolną cząsteczkę wiążącą IL-^, mającą na jedno miejsce wiążące przynajmniej dwie domeny zmienne: immunoglobulinowego cieżkiego łańcucha i lekkiego łańcucha.

Hamowanie wiązania IL-^ z jej receptorem może być dogodnie badane różnymi testami obejmującymi takie oznaczenia jak opisano poniżej w tekście.

Określenie „w tym samym zakresie” oznacza, że odnośnik i równoważne cząsteczki wykazują, na podstawie obliczeń statystycznych, zasadniczo identyczne krzywe hamowania wiązania z ILw jednym z testów określonych powyżej. Na przykład, cząsteczka wiążąca IL-^, według wynalazku typowo ma wartości IC₅₀ hamowania wiązania Χ-1β z jej receptorem, które są w zakresie +/- x 5 tych wartości, korzystnie zasadniczo takich samych, jak wartości IC50 odpowiadającej wzorcowej cząsteczki, gdy jest testowana, jak opisano powyżej.

Na przykład, zastosowane oznaczenie może być testem kompetycyjnego hamowania wiązania IL-^ przez rozpuszczalne receptory IL-1 i cząsteczki wiążące Χ-1β według wynalazku.

Najkorzystniej, ludzkie przeciwciało wobec IL-^ obejmuje przynajmniej:

a) jeden ciężki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę, mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako Seq. Id. No. 1, rozpoczynającą się aminokwasem w pozycji 1 i kończącą się aminokwasem w pozycji 118 i domeny stałej ludzkiego ciężkiego łańcucha oraz

PL 212 480 B1

b) jeden lekki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako Seq. Id. No. 2, rozpoczynającą się aminokwasem w pozycji 1 i kończącą się aminokwasem w pozycji 107 i domenę stałą ludzkiego lekkiego łańcucha.

Domena stała ludzkiego ciężkiego łańcucha może być typu γ₁, γ₂, γ₃, γ₄, μ, α₁, α₂, δ lub ε. korzystnie typu γ, korzystniej typu γ₁,. podczas gdy domena stała ludzkiego lekkiego łańcucha, może być typu κ lub λ (który obejmuje podtypy λ1,. λ2 i λ3), lecz jest korzystnie typu κ. Sekwencje aminokwasowe wszystkich tych domen stałych są podane w Kabat i inni.

Cząsteczka wiążąca Χ-1β według wynalazku może być wytwarzana technikami rekombinacji DNA. Biorąc pod uwagę powyższe, jedna lub więcej cząsteczek DNA kodujących cząsteczkę wiążącą muszą być utworzone, umieszczając je pod odpowiednimi kontrolnymi sekwencjami, a następnie muszą być przeniesione do odpowiedniego organizmu gospodarza w celu ekspresji.

W bardzo ogólny sposób, przedstawiono odpowiednio zastosowanie cząsteczki DNA według wynalazku do wytwarzania cząsteczki wiążącej Χ-1β według wynalazku, metodami rekombinacyjnymi.

Obecny stan techniki jest na takim poziomie, że wykształcony pracownik jest w stanie zsyntetyzować cząsteczkę DNA według wynalazku na podstawie informacji zawartej w przedmiotowym opisie, to jest sekwencji aminokwasowych kodujących regiony hiperzmienne i sekwencje DNA kodujące te cząsteczki.

Sposób konstruowania genu kodującego zmienną domenę opisano na przykład w opisie patentowym EPA 239 400 i może być krótko podsumowany w następujący sposób: sklonowano gen kodujący zmienną domenę MAb o dowolnej specyficzności. Segmenty DNA kodujące regiony zrębowe i regiony hiperzmienne zostały wyznaczone i segmenty DNA kodujące regiony hiperzmienne są usunięte, tak że segmenty DNA kodujące regiony zrębowe poddano fuzji razem, stosując do połączeń odpowiednie miejsca restrykcyjne. Miejsca restrykcyjne mogą być wytworzone w odpowiednich pozycjach stosując mutagenezę cząsteczki DNA standardowymi procedurami. Dwuniciowe syntetyczne kasety CDR przygotowano do syntezy DNA zgodnie z sekwencjami podanymi, jako Seq. Id. No. 1 lub 2. Kasety te wyposażono w lepkie końce tak, że mogą być ligowane w połączeniach regionu zrębowego.

Ponadto, nie jest konieczne w celu otrzymania konstruktu DNA kodującego cząsteczkę wiążącą Χ-1β według wynalazku, posiadanie dostępu do mRNA z produkującej linii komórkowej hybrydomy.

Zatem, opis w zgłoszeniu patentowym PCT WO 90/07861 przedstawia pełną instrukcję wytwarzania przeciwciała technikami rekombinacji DNA, gdzie dana jest jedynie zapisana informacja dotycząca sekwencji nukleotydowej genu. Aby otrzymać żądaną sekwencję DNA, sposób obejmuje syntezę wielu oligonukleotydów, ich amplifikację metodą PCR i ich splicing.

Wektory ekspresyjne obejmujące odpowiedni promotor lub geny kodujące domeny stałe ciężkiego jak i lekkiego łańcucha są ogólnie dostępne. Zatem, gdy cząsteczka DNA według wynalazku jest przygotowana, może ona być dogodnie przeniesiona do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Cząsteczki DNA kodujące pojedyńczy łańcuch przeciwciała mogą również być przygotowane standardowymi sposobami, na przykład, jak opisano w opisie patentowym WO 88/1649.

Biorąc pod uwagę powyższe nie są konieczne żadne depozyty hybrydomy lub linii komórkowej, aby spełniać kryteria całkowitego opisu środków technicznych.

Wynalazek obejmuje wektor ekspresyjny obejmujący pierwszy i drugi konstrukt DNA do wytwarzania cząsteczki wiążącej Χ-1β, jak opisano poniżej:

1) pierwszy konstrukt DNA koduje ciężki łańcuch lub jego fragment i obejmuje:

a) pierwszą część, która koduje zmienną domenę obejmującą alternatywnie region zrębowy i regiony hiperzmienne, te regiony hiperzmienne są w sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3, których sekwencje aminokwasowe zostały przedstawione, jako Seq. Id. No. 1; ta pierwsza część rozpoczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas zmiennej domeny i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny oraz;

b) drugą część kodującą domenę stałą ciężkiego łańcucha lub jej fragment, która rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas domeny stałej ciężkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas domeny stałej lub jego fragmentu, po której występuje kodon stop.

Pierwsza część koduje zmienną domenę, mającą sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową przedstawioną, jako Seq. Id. No. 1, rozpoczynającą się aminokwasem w pozycji 1 i kończącą się aminokwasem w pozycji 118.

Korzystniej pierwsza część ma sekwencję nukleotydową przedstawioną, jako Seq. Id. No. 1 rozpoczynającą się od nukleotydu w pozycji 1 i kończącą się nukleotydem w pozycji 354. Również korzystnie, druga część koduje domenę stałą ludzkiego ciężkiego łańcucha, korzystniej domenę stałą

PL 212 480 B1 ludzkiego łańcucha. Ta druga część może być fragmentem DNA pochodzenia genomowego (obejmującego introny) lub fragmentem cDNA (bez intronów).

2) drugi konstrukt DNA koduje lekki łańcuch lub jego fragment i obejmuje:

a) pierwszą część, która koduje zmienną domenę obejmującą alternatywnie region zrębowy i regiony hiperzmienne; te regiony hiperzmienne są CDR3' i ewentualnie CDR1' i CDR2', których sekwencje aminokwasowe zostały przedstawione jako Seq. Id. No. 2; pierwsza część rozpoczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas zmiennej domeny i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny oraz

b) druga część kodująca lekki łańcuch domeny stałej lub jej fragment, która rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas domeny stałej lekkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas domeny stałej lub jego fragmentu po której występuje kodon stop.

Pierwsza część koduje zmienną domenę, mającą sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową przedstawioną, jako Seq. Id. No. 2, rozpoczynającą się aminokwasem w pozycji 1 i kończącą się aminokwasem w pozycji 107.

Korzystniej, pierwsza część ma sekwencję nukleotydową przedstawioną, jako Seq. Id. No. 2, rozpoczynającą się od nukleotydu w pozycji 1 i kończącą się nukleotydem w pozycji 321. Również korzystnie druga część koduje domenę stałą ludzkiego lekkiego łańcucha, korzystniej domenę stałą ludzkiego łańcucha κ.

W pierwszym i drugim konstrukcje DNA, pierwsza i druga część mogą być rozdzielone przez intron, a wzmacniacz (ang. enhancer) może być dogodnie zlokalizowany w intronie pomiędzy pierwszą a drugą częścią. Obecność takiego wzmacniacza, który ulega transkrypcji ale nie ulega translacji, może towarzyszyć wydajnej transkrypcji. W szczególnych rozwiązaniach pierwszy i drugi konstrukt

DNA obejmują wzmacniacz genu kodującego ciężki łańcuch korzystnie pochodzenia ludzkiego.

Każdy z konstruktów DNA jest umieszczony pod kontrolą odpowiedniej kontrolnej sekwencji, w szczególności pod kontrolą odpowiedniego promotora. Może być użyty dowolny rodzaj promotora, pod warunkiem, że jest on dostosowany do organizmu gospodarza, w którym konstrukty DNA będą przenoszone w celu ekspresji. Jednakże, jeśli ekspresja ma mieć miejsce w komórce ssaka, szczególnie korzystne jest zastosowanie promotora genu kodującego immunoglobulinę.

Pożądane przeciwciało może być wytwarzane w hodowli komórkowej lub przez zwierzę transgeniczne. Odpowiednie transgeniczne zwierzę może być otrzymane zgodnie ze standardowymi sposobami, które obejmują mikroiniekcję do jaj pierwszego i drugiego konstruktu DNA umieszczonego pod kontrolą odpowiednich kontrolnych sekwencji, przenosząc tak przygotowane jaja do odpowiednich pseudo-ciężarnych samic i wybranie potomka, u którego zachodzi ekspresja pożądanego przeciwciała.

Gdy łańcuchy przeciwciała są wytwarzane w hodowli komórkowej, konstrukty DNA muszą najpierw być wstawione bądź do pojedynczego wektora ekspresyjnego bądź do dwóch oddzielnych, lecz kompatybilnych wektorów ekspresyjnych, ta druga możliwość jest korzystna.

Odpowiednio, przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny zdolny do replikacji w prokariotycznej lub eukariotycznej linii komórkowej, która zawiera przynajmniej jeden z konstruktów DNA powyżej opisanych.

Każdy wektor ekspresyjny, zawierający konstrukt DNA jest następnie przenoszony do odpowiedniego organizmu gospodarza. Gdy konstrukty DNA są wstawione oddzielnie do dwóch wektorów ekspresyjnych, mogą one być przeniesione oddzielnie, to jest jeden typ wektora na komórkę, lub współ-przeniesione, ta druga możliwość jest korzystna. Odpowiedni organizm gospodarza może być bakterią, drożdżem, linią komórkową komórek ssaka, ta druga możliwość jest korzystna.

Korzystniej, ssacza linia komórkowa jest pochodzenia limfoidalnego, np. linia komórkowa szpiczaka, hybrydomy lub normalna unieśmiertelniona linia limfocytytów B, która dogodnie nie prowadzi ekspresji żadnego ciężkiego lub lekkiego łańcucha endogennego przeciwciała.

W celu ekspresji w komórkach ssaczych, korzystnie jest, aby sekwencja kodująca cząsteczki wiążącej IL-Ιβ była zintegrowana z komórkowym DNA gospodarza w locus, co umożliwia lub sprzyja wysokiemu poziomowi ekspresji cząsteczki wiążącej IL-^. Komórki, w których sekwencja kodująca cząsteczki wiążącej IL-^ jest zintegrowana w takim sprzyjającym loci może być zidentyfikowana i wybrana na podstawie poziomów ekspresji cząsteczki wiążącej IL-^. Każdy odpowiedni selekcyjny marker może być użyty do otrzymania komórki gospodarza, zawierającej sekwencję kodującą cząsteczki wiążącej IL-^; na przykład, gen dhfr/metotreksan lub równoważne układy selekcji mogą być użyte. Alternatywne układy do ekspresji cząsteczki wiążącej IL-^ według wynalazku obejmują

PL 212 480 B1 oparte na GS układy amplifikacji/selekcji, takie jak te opisane w opisach patentowych EP 0256055 B, EP 0323997 B i europejskim zgłoszeniu patentowym 89303964.4.

W kolejnym aspekcie wynalazek obejmuje sposób wytwarzania cząsteczki wiążącej IL-Ιβ, który obejmuje (i) hodowlę organizmu transformowanego wektorem ekspresyjnym, jak zdefiniowano powyżej i (ii) uzyskiwanie cząsteczki wiążącej ^-1β z hodowli.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem stwierdzono, że przeciwciało ACZ 885 wydaje się mieć specyficzność wiązania względem epitopu antygenowego ludzkiej IL-^, który obejmuje pętlę, zawierającą resztę Glu64 dojrzałej ludzkiej IL-^. (Reszta Glu64 dojrzalej ludzkiej IL-^ odpowiada reszcie 180 prekursora ludzkiej IL-^). Epitop ten wydaje się być poza miejscem rozpoznawania receptora IL-1 i dlatego jest niezwykle zaskakujące, że przeciwciała tego epitopu. np. przeciwciało ACZ 885. są zdolne do hamowania wiązania IL-^ z jej receptorem. Przeciwciała, w szczególności chimeryczne i szczepione CDR przeciwciała a zwłaszcza ludzkie przeciwciała, które specyficznie wiążą się z epitopem antygenowym dojrzałej ludzkiej IL-^, które obejmują pętlę zawierającą resztę Glu64 i które są zdolne do hamowania wiązania IL-^ z jej receptorem i zastosowanie takich przeciwciał do leczenia chorób lub zaburzeń, w których pośredniczy IL-1 są nowe i są objęte zakresem obecnego wynalazku.

W jeszcze innych aspektach wynalazek obejmuje:

i) zastosowanie cząsteczki wiążącej IL-^ według wynalazku, która ma specyficzność wiązania antygenu względem epitopu antygenowego dojrzalej ludzkiej IL-^, które obejmuje pętlę obejmującą Glu 64 i które jest zdolne do hamowania wiązania IL-^ z jej receptorem, do leczenia choroby lub zaburzenia, w który m pośredniczy IL-1;

ii) kompozycję farmaceutyczną zawierającą cząsteczkę wiążącą IL-Ιβ, która ma specyficzność wiązania antygenu względem epitopu antygenowego dojrzałej ludzkiej IL-Ιβ, który obejmuje pętlę obejmująca Glu 64, i która jest zdolna do hamowania wiązania IL-^ z jej receptorem, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką. rozcieńczalnikiem lub nośnikiem:

iii) zastosowanie cząsteczki wiążącej IL-^, które ma specyficzność wiązania antygenu względem epitopu antygenowego dojrzalej ludzkiej IL-^, który obejmuje pętlę obejmującą Glu64, i która jest zdolna do hamowania wiązania IL-^ z jej receptorem, do wytwarzania leku do leczenia choroby lub zaburzenia, w których pośredniczy IL-1, zgodnie z opisem obecnego wynalazku przeciwciało jest zdolne do hamowania wiązania ^-1β” jeśli przeciwciało jest zdolne do hamowania wiązania ILz jej receptorem zasadniczo w tym samym zakresie jak przeciwciało ACZ885, gdzie „w tym samym zakresie” oznacza, jak zdefiniowano powyżej.

Przeciwciało ACZ885 ma stałą równowagi dysocjacji KD, dla wiązania z IL-^ poniżej około 50 pM. np. około 35 pM. Tak wysokie powinowactwo wiązania powoduje, że przeciwciało ACZ jest szczególnie odpowiednie do zastosowań terapeutycznych.

Ujawnione jest przeciwciało, specyficzne wobec IL-^, które ma wartość KD wiązania z ILokoło 50 pM lub mniej. Ujawnienie obejmuje również sposoby zastosowania i kompozycje takich przeciwciał o dużym powinowactwie, jak opisano powyżej dla przeciwciała skierowanego przeciwko ^-1β, które ma specyficzność wiązania dla antygenowej determinanty dojrzałej ludzkiej IL-^, która obejmuje pętlę obejmującą Glu 64.

W obecnym opisie wyrażenie „choroba w której pośredniczy IL-1” obejmuje wszystkie choroby i stany medyczne w których IL-1 odgrywa rolę bezpośrednią bądź pośrednią, w chorobie lub stanach medycznych obejmujących przyczynę, rozwój, postępowanie, przetrwanie lub patologię choroby lub stanu.

W obecnym opisie określenia „leczenie” lub „traktowanie” dotyczą zarówno leczenia profilaktycznego, jak i zapobiegania oraz terapii leczniczej lub modyfikującej chorobę, obejmujące leczenie pacjenta, u którego występuje ryzyko kontaktowania się z chorobą lub pacjentów, których podejrzewa się, że mieli kontakt z chorobą jak i pacjentów, którzy są chorzy lub u których zdiagnozowano występowanie choroby lub stanu klinicznego i obejmuje zapobieganie klinicznemu nawrotowi choroby.

Korzystnie, przeciwciała według wynalazku są ludzkimi przeciwciałami, najkorzystniej przeciwciałem ACZ885 lub bezpośrednim ekwiwalentem.

Przeciwciała, według wynalazku blokują wpływ IL-^ na komórki docelowe, a zatem są wskazane do stosowania w leczeniu chorób lub zaburzeń, w których pośredniczy IL-^. Te i inne działania farmakologiczne przeciwciała według wynalazku, mogą być wykazane w standardowych metodach oznaczania, na przykład jak opisano poniżej:

Znoszenie wytwarzania PGE₂ i interleukiny-6 zależnej od IL-^ przez pierwotne primary, ludzkie fibroblasty.

PL 212 480 B1

Wytwarzanie PGE₂ i IL-6 w pierwotnych ludzkich skórnych fibroblastach zależy od IL-^. Sam TNF-α nie może skutecznie indukować tych czynników pośredniczących w infekcji, lecz stanowi składnik synergistyczny z IL-1. Pierwotne skórne fibroblasty są użyte, jako model zastępczy dla aktywacji komórkowej indukowanej IL-1. Pierwotne ludzkie fibroblasty stymulowano rekombinacyjną IL-^ lub pożywką immunologiczną otrzymaną z ludzkich komórek PBMC stymulowanych LPS w obecności różnych stężeń przeciwciała według wynalazku lub IL-1RA w zakresie od 6 do 18 000 pM. Chimeryczne przeciwciało anty-CD25 Simulect® (bazyliksymab) jest stosowane, jako odpowiadająca izotypowi kontrola. Supernatant jest zbierany po 16 godzinach stymulacji i testowany pod kątem IL-6 oznaczeniem ELISA. Cząsteczki wiążące IL-^ według wynalazku typowo mają wartości IC₅₀hamowania wytwarzania IL-6 około 1 nM lub mniej (np. od około 0,1 do około 1 nM) w wyniku badania, jak opisano powyżej.

Jak wskazano w powyższym teście cząsteczki wiążące IL-^, według wynalazku silnie blokują wpływ IL-^. Odpowiednio, cząsteczki wiążące IL-^, według wynalazku mają następujące zastosowanie farmaceutyczne:

Cząsteczki wiążące IL-^ według wynalazku są stosowane w profilaktyce i leczeniu chorób lub stanów medycznych, w których pośredniczy IL-1 np. stany zapalne, alergie i stany alergiczne, reakcje nadwrażliwościowe, choroby autoimmunizacyjne, ciężkie infekcje i odrzucenia przeszczepu organu lub tkanki.

Na przykład, cząsteczki wiążące IL-^, według wynalazku mogą być zastosowane do leczenia odrzucenia przeszczepu (np. przy przeszczepach obejmujących serce, płuca, łączone płuco-serce, wątrobę, nerki, trzustkę, skórę, lub przeszczep rogówki) obejmujące odrzucenia aloprzeszczepu lub odrzucenia ksenoprzeszczepu lub reakcję przeszczepu przeciw biorcy i przeszczep organów związany ze stwardnieniem tętnic.

Cząsteczki wiążące IL-^, według wynalazku są szczególnie użyteczne do leczenia, zapobiegania, lub poprawiania stanu zdrowia przy chorobach autoimmunologicznych i stanach zapalnych, w szczególności stanach zapalnych o etiologii obejmującej autoimmunologiczny składnik, taki jak zapalenie stawów (na przykład reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekłe zapalenie stawów progredientne i zniekształcające zapalenie stawów) i choroby gośćcowe, obejmujące stany zapalne i choroby gośćcowe obejmujące zmniejszenie masy kostnej, ból zapalny, nadwrażliwość (obejmujące zarówno nadwrażliwość dróg oddechowych i skórną nadwrażliwość) i alergie. Specyficzne autoimmunizacyjne choroby, w których mogą być stosowane cząsteczki wiążące IL-1 β, według wynalazku obejmują autoimmunologiczne hematologiczne zaburzenia (obejmujące np. niedokrwistość hemolityczną. niedokrwistość aplastyczną. niedokrwistość czystoczerwonokrwinkową i idiopatyczną malopłytkowość, ogólnoustrojowy liszaj rumieniowaty, wielozapalenie chrząstki, sklerotomę, ziarniakowatość Wegenera, zapalenie skórno-mięśniowe, przewlekłe czynne zapalenie wątroby, osłabienie mięśni górnej części ciała, łuszczycę, zespół Stevena-Johnsona. idiopatyczną celiakię, autoimmunologiczną zapalną chorobę jelita (obejmujące np. wrzodziejące zapalenie okrężnicy, chorobę Crohna i zespół nadwrażliwego jelita), oftalmopatię wewnątrzwydzielniczą, chorobę Gravesa, sarkoidozę, stwardnienie rozsiane, marskość wątroby żółciową pierwotną, młodzieńczą cukrzycę (cukrzyca typu 1), zapalenie błony naczyniowej oka (przedniej i tylnej), zapalenie rogówki suche i wiosenne zapalenie rogówki, śródmiąższowe zwłóknienie płuc, łuszczycowe zapalenie stawów i zapalenie kłębuszków nerkowych (z i bez zespołem nerczycowym, np. obejmujące idiopatyczny zespół nerczycowy lub nefropatię z minimalnymi zmianami).

Cząsteczki wiążące IL-1 β, według wynalazku są również użyteczne do leczenia, zapobiegania, lub poprawiania stanu zdrowia w przypadku astmy, zapalenia oskrzeli, pylicy płuc, samoistnej rozedmy płuc i innych czopujących lub zapalnych chorób dróg oddechowych.

Cząsteczki wiążące IL-1 β, według wynalazku są użyteczne do leczenia niepożądanych ostrych i nadostrych reakcji zapalnych, w których pośredniczy IL-1 lub w których uczestniczy wytwarzanie IL-1, zwłaszcza IL-^ lub wzmacnianie wydzielania TNL przez IL-1, np. ostre infekcje, na przykład wstrząs septyczny (np. wstrząs endotoksyczny i zespół zaburzeń oddechowych dorosłych), zapalenie opon, zapalenie płuc i ciężkie oparzenia: i do leczenia charłactwa lub wyniszczenia związanego z patologicznym wydzielaniem TNF, w wyniku infekcji, nowotworu lub zaburzeniu czynności organu, zwłaszcza wyniszczeniu związanemu z AIDS. np. w połączeniu z/lub w wyniku infekcji HIV.

Cząsteczki wiążące IL-1 β, według wynalazku są szczególnie użyteczne do leczenia chorób metabolizmu kości obejmujących zapalenia kości i stawów, osteoporozę i inne zapalenia stawów,

PL 212 480 B1 ogólną utratą masy kostnej, obejmującą związaną z wiekiem utratę masy kostnej, w szczególności chorobę ozębnej.

Przy powyższych wskazaniach, odpowiednia dawka będzie oczywiście różna w zależności od, na przykład, konkretnej cząsteczki wiążącej IL-1 β według wynalazku, która ma być zastosowana u pacjenta, sposobu podawania, charakteru i ciężkości stanu, który jest leczony. Jednakże w zastosowaniu profilaktycznym satysfakcjonujące wyniki uzyskano przy dawkach od około 0,05 mg do około 10 mg na kilogram masy ciała, zwykle od około 0,1 mg do około 5 mg na kilogram masy ciała. Częstość dawkowania przy profilaktycznym zastosowaniu będzie normalnie w zakresie od około raz na tydzień do około raz na 3 miesiące, zwykle w zakresie od około raz na 2 tygodnie do około raz na 10 tygodni, np. raz na 4 lub 8 tygodni. Lek zawierający cząsteczki wiążące IL-1 β według wynalazku jest dogodnie podawany pozajelitowo, dożylnie, np. do żyły zgięcia łokciowego lub innej żyły obwodowej, domięśniowo, lub podskórnie. Na przykład, stosowanie profilaktyczne typowo obejmuje podawanie przeciwciała, według wynalazku raz na miesiąc do raz na 2 do 3 miesięcy, lub rzadziej.

Farmaceutyczne kompozycje, według wynalazku mogą być wytwarzane w tradycyjny sposób.

Kompozycja, według wynalazku jest korzystnie przechowywana w postaci zliofilizowanej. Przy podawaniu natychmiastowym, jest ona rozpuszczona w odpowiednim nośniku wodnym, na przykład sterylnej wodzie do iniekcji lub sterylnym zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej. Jeśli uważa się, że jest pożądane przygotowanie roztworu o większej objętości do podawania przez wlew, niż jako jedna iniekcja uderzeniowa, korzystnie jest wprowadzić ludzką albuminę z surowicy lub własną heparynizowaną krew pacjenta do roztworu soli w momencie wytwarzania roztworu. Obecność nadmiaru takiego fizjologicznie obojętnego białka zapobiega utracie przeciwciała przez absorpcję na ściankach zbiornika lub przewodu stosowanego przy roztworze do wlewu. Jeśli stosowana jest albumina, odpowiednie stężenie wynosi od 0,5 do 4,5% wagowych roztworu soli.

Wynalazek jest zobrazowany w przykładach, które odnoszą się do rysunku przedstawiającego zależność dawki od krzywych hamowania wiązania IL-^ przez rozpuszczalne receptory IL-1 typu I i II.

P r z y k ł a d y

Transgeniczne myszy zaprojektowane do prowadzenia ekspresji ludzkiego zestawu IgG/κ zamiast mysiego zestawu immunoglobulin (Fisshwild i wsp., 1996. Nat Biotechnol., 14. 845-851) użyto do wytworzenia przeciwciała specyficznego wobec ludzkiej IL-1 β. Limfocyty B z tych myszy immortalizowano standardową technologią hybrydomy i otrzymano mysie komórki hybrydomy, które wydzielają ludzkie przeciwciało IgG1/K przeciwko ACZ 885.

P r z y k ł a d I Wytworzenie hybrydomy i oczyszczanie przeciwciała

Genetycznie zmodyfikowaną mysz 18077 (Medarex Inc. Annadale. NJ) immunizowano w adiuwancie rekombinacyjną ludzką IL-1 β sprzężoną z KLH (50 ąg) podskórnie w kilku miejscach. Dawki wspomagające podawano myszy pięć dodatkowych razy, przy czym ostatnia iniekcja była na trzy dni przed fuzją. W dniu fuzji mysz 18077 została zabita przez wdychanie CO2, a komórki śledziony (4,1 x 10⁷) poddano fuzji tradycyjną metodą stosując PEG 4000 z równą liczbą komórek PAI-O), to jest mysią linią komórkową szpiczaka. Komórki po fuzji wysiano do 624 studzienek (1ml/studzienkę), zawierających warstwę odżywiającą mysie komórki otrzewnowe (myszy Balb C), w HAT uzupełnionej

RPMI 1640, 10% inaktywowaną temperaturą, cielęcą surowicą płodową. 5 x 10^- M β-merkaptoetanolem. Supernatanty zebrano i badano oznaczeniem ELISA i badano przesiewowo pod kątem reaktywnych monoklonalnych przeciwciał IL-^. Zidentyfikowano pięć monoklonalnych przeciwciał podklasy IgG/κ. Klonowanie przeprowadzono stosując 4 x 96 studzienkowe mikrotitracyjne szalki, na których wysiano 0,5 komórek na studzienkę. Po dwóch tygodniach studzienki badano przy pomocy mikroskopu inwersyjnego. Supernatant zebrano ze studzienek pozytywnych pod kątem wzrostu i wytwarzania monoklonalnego przeciwciała anty-IL-1 β określono oznaczeniem ELISA. 1-2 1 immunogennego supernatantu z czterech subklonów z wstępnie zidentyfikowanej hybrydomy # 657 przygotowano i przeciwciała oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa, stosując kolumnę z białkiem A.

1. Czystość i częściowe sekwencje aminokwasowe ciężkiego i lekkiego łańcucha

Sekwencjonowanie aminokwasowe

Lekkie i ciężkie łańcuchy oczyszczonego przeciwciała ACZ885 rozdzielono w żelu SDS-PAGE i aminokwasy końca aminowego określono metodą degradacji Edmana. Czystość przeciwciała użytego w tych badaniach wynosiła > 90% przez sekwencjonowanie. Sekwencje cDNA kodujące zmienne domeny ciężkiego jak i lekkiego łańcucha otrzymano metodą amplifikacji PCR cDNA otrzymanego z mRNA ze sklonowanych komórek hybrydomy i w pełni zsekwencjonowano.

PL 212 480 B1

Sekwencje końca aminowego zmiennych domen ciężkiego, jak i lekkiego łańcucha, i odpowiadające sekwencje DNA są podane jako Seq. Id No. 1 i Seq Id No. 2 poniżej, w których CDRy zostały przedstawione wytłuszczoną czcionką.

T a b e l a 1

ACZ885 Ciężki łańcuch zmiennego regionu sekwencji Seq. Id. No. 1

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAG

-19 MEFGI,SNVFLVALLRGVQCQ -1

GTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCC

VQLVESGGGVVQPGRSLRLS -21

TGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTGTTTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCA

CAASGFTFSVYGM»WVRQAP -41

GGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTGGTATGATGGAGATAATCAATACTATGCA

GKGLEWVAI1WYDGDNQYYA -61 gactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattcCaagaacacgctgtatctg

DSVKGRFTISRDNSKNTLYL -81

CAAATGAACGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAGAGATCTTAGG

QMNGLRAEDTAVYYCARDLR - 101

ACTGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC

TGPFDYWGQGTLVTVSS - 118

ACZ885 Lekki łańcuch zmiennego regionu sekwencji Seq. Id. No 2

ATGTTGCCATCACAACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGGGTTCCAGCCTCCAGGGGTGAA

-19 MLPSQLIGFLL LWVPASRGE - 1

ATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGAAAGTCACCATC

IVLTQSPDFQSVTPKEKVTI -21

ACCTGCCGGGCCAGTCAGAGCATTGGTAGTAGCTTACACTGGTACCAGCAGAAACCAGAT

TCRASQSIGSSLHWYQQKPD -41

CAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCTTCTCAGGGGTCCCCTCGAGG

QSPKLLIKYASQSFSGVPSR -61

TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAATAGCCTGGAAGCTGAA

FSGSGSGTDFTLTINSLEAE -81

GATGCTGCAGCGTATTACTGTCATCAGAGTAGTAGTTTACCATTCACTTTCGGCCCTGGG

DAAAYYCHQSSSLPFTFGPG - 101

ACCAAAGTGGATATCAAA - 107

T K V D I K

Czcionką pochyłą: sekwencja liderowa (nie w dojrzałym przeciwciele)

Czcionką wytłuszczoną: CDRy

PL 212 480 B1

2. Konstrukcja wektorów ekspresyjnych ciężkiego i lekkiego łańcucha

Stosowano układy do amplifikacji/selekcji takie jak te opisane w opisach patentowych EP 0256055 B, EP 0323997 B, Iub zgłoszeniu patentowym 89303964.4, w których jako selekcyjny marker użyto sekwencji kodującej GS.

P r z y k ł a d II Dane biochemiczne i biologiczne

Stwierdzono, że monoklonalne przeciwciało ACZ885 neutralizuje aktywność inter^u^nyin vitro. Monoklonalne przeciwciało jest również charakteryzowane przez jego wiązanie z rekombinacyjną ludzką IL-1 β w analizie BIAcore. Sposób neutralizacji jest wyznaczany przez badanie wiązania kompetycyjnego z rozpuszczalnymi receptorami IL-1 Biologiczna aktywność przeciwciała ACZ885 względem zrekombinowanej i wytwarzanej naturalnie IL-1 β jest wyznaczana w pierwotnych komórkach ludzkich (Przykład 3), reagujących na stymulację Χ-1β.

3. Określenie stałej równowagi dysocjacji

Stałe szybkości asocjacji i dysocjacji dla wiązania rekombinacyjnej ludzkiej IL-1 β z ACZ885 zostały oznaczone analizą BIAcore. ACZ885 unieruchomiono i wiązanie rekombinacyjnej IL-1 β w zakresie stężeń od 1 do 4 nM zmierzono powierzchniowym rezonansem plazmonowym. Wybrany format przedstawia jednowartościowe oddziaływanie, a zatem umożliwia traktowanie zdarzenia wiązania IL-1 β z ACZ885 zgodnie ze stechiometrią 1:1. Analizę danych wykonano, stosując oprogramowanie BIAevaluation.

T a b e l a 2

	kon [10⁵/Ms]	^koff [10^-5/s]	Kd [PM]
Ludzka IL-1 β	11,0 +/- 0,23	3,3 +/- 0,27	30,5 +/- 2,6	n = 22

Wniosek: ACZ885 wiąże się z rekombinacyjną ludzką IL-1beta z bardzo dużym powinowactwem.

4. Kompetycyjne badania wiązania z rozpuszczalnymi receptorami typu I i II IL-1

Współzawodnictwo pomiędzy ACZ885 i rozpuszczalnymi receptorami typu I i II IL-1 jest mierzone poprzez BIAcore. ACZ885 unieruchomiono na powierzchni chipowej i rekombinacyjne ludzkie IL-beta (1 nM) wstrzyknięto w celu związania z ACZ885 przy braku lub w obecności zwiększającego się stężenia rekombinacyjnego ludzkiego rozpuszczalnego receptora I lub receptora II (0-12 nM; każde po 4 niezależne przebiegi). Otrzymane wyniki podano na załączonym rysunku.

Wiązanie NVP-ACZ885 z ludzką IL-1 β określano w obecności rekombinacyjnych ludzkich rozpuszczalnych receptorów IL-1, typu I lub typu II. Wartości połowy maksymalnego stężenia (IC50) określono graficznie stosując oprogramowanie Origin 6.0, podawana jest średnia ± SEM (n = 4).

Wniosek: Wiązanie ACZ885 z IL-1beta jest kompetycyjne względem receptora IL-1 typu I, jak i typu II.

5. Krzywa reaktywności ludzkiej IL-1alfa, ludzkiej IL-1RA, i IL-1beta z innych gatunków

Krzywa reaktywności ACZ885 z ludzką IL-1alfa, IL-1RA i IL-1 beta pochodzącego od M. cynomolgus, królika, myszy i szczura jest wyznaczana analizą BIAcore. ACZ885 unieruchomiono i badane cytokiny stosowano w stężeniu 8 nM (6 niezależnych przebiegów).

T a b e l a 3

Reaktywność krzyżowa NVP-ACZ885 z IL-1 β, Χ-1α, i IL-1Ra

	% Wiązania (średnia ± SEM)
Rek Ludzka ^-1β (n = 6)	100
Rek IL -β z M. cynomolgus (n = 11)	7,8 ± 1,0
Rek Rabbit IL-1β (n = 6)	-0,5 ± 0,2
Rek Mysz IL-1β (n = 6)	-2,6 ±- 0,6
Rek Szczurza Χ-1β (n = 6)	-6,2 ± 1,0
Rek Ludzka IL-1a (n = 6)	8,4 ± 2,4
Rek Ludzka IL-1Ra (n = 6)	-3,7 ± 1,7

PL 212 480 B1

Jednostki rezonansowe odczytywano przy 1000 s po rozpoczęciu wstrzykiwania: wstrzykiwanie buforu do przebiegu odejmowano od wszystkich sensorogramów i linie podstawowe po unieruchomieniu anty-Fcy ustawiono na zero. Wiązanie wyrażono, jako procent zakumulowanych jednostek rezonansowych dla ludzkiej IL-1 β.

Wniosek: ACZ885 nie reaguje krzyżowo znacząco z ludzką IL-1alfa, ludzką IL-1RA lub IL-1beta pochodzącego z M. cynomolgous królika, myszy lub szczura.

P r z y k ł a d III Neutralizacja uwalniania IL-6 z ludzkich skórnych fibroblastów przez ACZ885

Poniższa metoda była stosowana, aby wyznaczyć biologiczną aktywność ACZ885 pod względem działania neutralizującego ludzkie IL-1 β:

1. Przygotowanie pożywki immunologicznej zawierającej IL-W

Przygotowanie pożywki immunologicznej z ludzkich komórek jednojądrowych krwi obwodowej przeprowadzono następująco: jednojądrowe komórki przygotowano z obwodowej krwi małpy stosując rozdział gęstościowy fikol-kontrastowy zgodnie ze sposobem opisanym przez Hansela [Hansel.T.T.

i wsp. (1991). An improved immunomagnetic proceduro for the isolation of highly purified human blood ₅ eosinophils. J. Imm. Methods. 145: 105-110]: zostały one użyte w stężeniu 10⁵ komórek/studzienkę w RPMI/10% FCS. Dodano ΙFΝβ (100 U/ml) i LPS (5 ąg/ml), a następnie komórki inkubowano przez 6 godzin. Inkubację zakończono przez wirowanie przy 1200 RPM przez 10 min. IL-1 β w supernatancie określono ilościowo oznaczeniem ELISA.

2. Test neutralizacji

Ludzkie skórne fibroblasty z napletka otrzymano z Klontics (CC-2509) i hodowano w FBM (Klontic, CC-3131) obejmującej bFGF (1 ng/ml, CC-4065), insulinę (5 ąg/ml, CC-4021) i 2% FCS (CC-4101).

W celu indukcji IL-6, komórki wysiewano przy gęstości 10⁴ komórek na studzienkę w 48 studzienkowe gniazda tkankowe. Następnego dnia, komórki głodzono przez 6-7 godzin w FBM zawierającej 2% FCS przed dodaniem cytokiny. W celu stymulacji, pożywkę hodowlaną zastąpiono FBM + 2% FCS, zawierającą odpowiednią ilość pożywki immunologicznej przez około 50 ąg/ml IL-1 β. Alternatywnie była stosowana rekombinacyjna ludzka IL-1 β o stężeniu końcowym 50 pg/ml.

Neutralizowane anty-IL-^ przeciwciała miareczkowano do rozcieńczonej pożywki immunologicznej przed dodaniem do komórek. Rekombinacyjna IL-1Ra (R&D Systems # 280-RA-010) była stosowana, jako kontrola pozytywna.

Supernatant komórkowy zbierano 16-17 godzin po stymulacji i ilość uwolnionej IL-6 określano w teście „kanapkowym” ELISA.

3. ELISA IL-6

Szalki mikrotitracyjne ELISA powlekano mysią anty-ludzką IL-6 MAb (314-14 (Novartis Pharma: seria EN23.961. 5,5 mg/ml): 100 μl przy stęż. 3 μg/ml) w PBS 0,02% NaN₃ i inkubowano przez noc w temp. +4°C. Następnego dnia, szalki mikrotitracyjne przemywano 4 razy PBS/0,05% Tween/0,02%) NaN₃ i blokowano 300 μl PBS/3% albumina z surowicy bydlęcej (BSA)/0,02% NaN₃ przez 3 godziny. Szalki przemyto ponownie (4 razy) i 100 μl supernatantu (końcowe rozcieńczenie 1:20) lub standardu rekombinacyjnej ludzkiej IL-6 ((Novartis Pharma #91902), krzywa miareczkowania w zakresie od 1 do 0,0156 ng/ml w 2 krotnym rozcieńczeniu) dodawano w dwóch powtórzeniach. Po nocnej inkubacji w temp. pokojowej szalki przemyto (4 razy) i dodano inną mysią anty-ludzką IL-6 MAb (110-14. Novartis Pharma; 6,3 mg/ml); 100 μl w stęż. 1 μg/ml; 3 godz. w temperaturze pokojowej). Po dodatkowych 4 przemyciach, dodano znakowaną biotyną kozią anty-mysią IgG2b surowicę odpornościową (Southern Biotechnology; #1090-08) przy rozcieńczeniu końcowym 1/10000 (100 μl/studzienkę; 3 godz. w temperaturze pokojowej). Po inkubacji szalki przemyto 4 razy i dodano streptawidynę sprzężoną z alkaliczną fosfatazą (Jackson Immunoresearch, #016-050-084) przy rozcieńczeniu końcowym 1/3000 (100 μΙ/studzienkę; 30 min w temperaturze pokojowej). Po przemyciu (4 razy) substrat (p-nitrofenylofosforan w buforze dietanoloaminowym: 100 μβ dodawano przez 30 min. Reakcję blokowano dodając 50 μl/studzienkę 1,5 M NaOH. Szalki sczytywano w czytniku mikrotitracyjnym (Bio-Rad) stosując filtry 405 i 490 nm.

Poziomy IL-6 w supernatantach hodowli obliczano w odniesieniu do krzywych wzorcowych, stosując sześcienne dopasowanie krzywych. Wyznaczanie statystyki i oznaczenie IC50 wykonywano w oparciu o dopasowanie krzywych sigmoidalnych.

4. Wyniki:

PL 212 480 B1

T a b e l a 4

Hamowanie wydzielania IL-6 indukowane przez IL-1 β

	NVP-ACZ885 Seria 1 IC50 [pM ] ± SEM	NVP-ACZ885 Seria 2 IC50 [pM] ± SEM	IL-1ra IC50 [pM] ± SEM
IL-6 wydzielanie pożywka immunol.	54 ± 6,1 (9,1 ± 1,0 ng/ml) (n = 6)	44,6 ± 3,6 (7,4 ± 0,6 ng/ml) (n = 6)	30 ±3,1 (0,51 ± 0,05 ng/ml) (n = 5)
IL-6 wydzielanie rek. ludzka IL-1 β	42 ± 3,4 (7,1 ± 0,56 ng/ml) (n = 4)	63 ± 2.8 (10.5 ± 0.5) (n = 6)	nd

Wartości IC₅₀ hamowania indukowanego przez ^-1β wydzielania IL-6 z ludzkich skórnych fibroblastów. Fibroblasty stymulowano rekombinacyjną ludzką ^-1β pożywką immunologiczną, zawierającą pomiędzy 50 a 100 pg/ml IL- 1β.

P r z y k ł a d IV Określanie epitopu ACZ885

ACZ885 wiąże się z ludzką ^-1β z dużym powinowactwem, ale nie może rozpoznawać wysoce homologicznej ^-1β, pochodzącej od makaków rezusów. Jedna z najbardziej znaczących różnic w sekwencji aminokwasowej pomiędzy pochodzącą od rezusów, a ludzką ^-1β jest w pozycji 64 dojrzałej cząsteczki ^-1β. Ludzka ^-1β ma kwas glutaminowy, a pochodząca od makaków rezusów, alaninę w tej pozycji. Zmutowana ludzka ^-1β z odpowiednim zastąpieniem Glu64 traci swoją zdolność do wiązania z ACZ885 z mierzalnym powinowactwem. Stwierdziliśmy, że Glu64 w ludzkiej ^-1β ma kluczowy wpływ na rozpoznawanie przez przeciwciało ACZ885. Glu64 jest zlokalizowana na pętli ^-1β, która nie jest częścią powierzchni wiązania z typem I receptora ^-1β, lub w jej bliskości. Zatem przeciwciała skierowane przeciwko wiązaniu epitopu, obejmującego Glu64 mogą znosić biologiczną aktywność ludzkiej ^-1β.

Claims

1. Cząsteczka wiążąca ^-1β, która obejmuje zmienne domeny zarówno ciężkiego łańcucha (V_H), jak i lekkiego łańcucha (V_L), gdzie cząsteczka wiążąca ^-1β zawiera przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu obejmujące:

a) zmienną domenę (VH) immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, która obejmuje w sekwencji hiperzmienne regiony CDR1, CDR2 i CDR3, przy czym CDR1 ma sekwencję aminokwasową Val-Tyr-Gly-Met-Asn, CDR2 ma sekwencję aminokwasową Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-TyrAla-Asp-Scr-Val-Lys-Gly, a CDR3 ma sekwencję aminokwasową Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro oraz

b) zmienną domenę (VL) immunoglobulinowego lekkiego łańcucha, która obejmuje w sekwencji hiperzmienne regiony CDR1', CDR2' i CDR3', przy czym CDR1' ma sekwencję aminokwasową ArgAla-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His. CDR2' ma sekwencję aminokwasową Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser, a CDR3' ma sekwencję aminokwasową His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro i ich bezpośrednie ekwiwalenty, w których hiperzmienne regiony CDR1, CDR2. CDR3, CDR1', CDR2' i CDR3' rozpatrywane, jako całość są przynajmniej w 95% homologiczne, względem regionów hiperzmiennych przedstawionych w a) i b), która specyficznie wiąże epitop antygenowy ludzkiej ^-1β, który obejmuje pętlę, zawierającą resztę Glu64 dojrzałej ^-1β, oraz która wykazuje właściwości hamowania wiązania IL-1 β do jej receptora oraz posiada stałą równowagi dysocjacji KD dla wiązania z ^-1β, wynoszącą 50 pM lub mniej.

2. Cząsteczka wiążąca ^-1β według zastrz. 1, znamienna tym, że jest ludzkim przeciwciałem.

3. Cząsteczka wiążąca ^-1β, która obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu obejmujące zarówno pierwszą domenę o sekwencji aminokwasowej identycznej z przedstawioną jako SEQ. ID. NO. 1, rozpoczynającej się od aminokwasu w pozycji 1 i zakończonej aminokwasem w pozycji 118 i drugą domenę o sekwencji aminokwasowej identycznej z przedstawioną, jako SEQ. ID. NO. 2, rozpoczynającej się od aminokwasu w pozycji 1 i zakończonej aminokwasem w pozycji 107.

4. Wektor ekspresyjny, zawierający pojedynczy wektor ekspresyjny lub zestaw dwóch kompatybilnych wektorów ekspresyjnych, zawierający:

PL 212 480 B1

a) pierwszą część, która koduje zmienną domenę obejmującą naprzemiennie regiony zrębowe i regiony hiperzmienne, przy czym regiony hiperzmienne są w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3, których sekwencje aminokwasowe zostały przedstawione, jako SEQ. ID. NO. 1, gdzie pierwsza część rozpoczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas domeny zmiennej i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas domeny zmiennej oraz

b) drugą część kodującą niezmienną część ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu, która rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas niezmiennej części ciężkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas niezmiennej części lub jej fragmentu, po której występuje kodon stop;

a) pierwszą część, która koduje zmienną domenę obejmującą naprzemiennie regiony zrębowe i regiony hiperzmienne, przy czym regionami hiperzmiennymi są CDR1' i CDR3', których sekwencje aminokwasowe zostały przedstawione, jako SEQ. ID. NO. 2, gdzie pierwsza część rozpoczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas domeny zmiennej i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas domeny zmiennej oraz

b) drugą część kodującą lekki łańcuch niezmiennej części lub jej fragmentu, który rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas niezmiennej części lekkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas niezmiennej części lub jej fragmentu, po którym występuje kodon stop.

5. Wektor ekspresyjny według zastrz. 4, zdolny do replikacji w prokariotycznej lub eukariotycznej linii komórkowej.

6. Sposób wytwarzania cząsteczki wiążącej IL-^, który obejmuje (i) hodowlę organizmu transformowanego wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 5 i (ii) uzyskiwanie cząsteczki wiążącej IL-^ z hodowli.

7. Zastosowanie cząsteczki wiążącej IL-^ określonej w zastrz. 2, do wytwarzania leku do leczenia choroby lub zaburzenia, w którym pośredniczy IL-^.

8. Kompozycja farmaceutyczna, obejmująca cząsteczkę wiążącą IL-^ określoną w zastrz. 2, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.