ES2895848T3 - Anticuerpos contra IL-1 beta - Google Patents

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Titus Kretzschmar
Simone Schmitt
Abdijapar Shamshiev
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Abstract

Un scFv humanizado contra IL-1 beta que comprende una secuencia de cadena ligera variable como se expone en la SEQ ID No: 8 y una secuencia de cadena pesada variable como se expone en la SEQ ID No: 12, donde la secuencia de cadena ligera variable, VL, y la secuencia de cadena pesada variable, VH, están conectadas por un enlazador con una orientación de extremo N-VL-enlazador-VH-extremo C y donde el enlazador comprende de 10 a 25 aminoácidos que comprenden de dos a cinco repeticiones (GGGGS).

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra IL-1 beta
Campo de la invención
La invención se refiere a anticuerpos anti IL-1 beta humanizados, en particular fragmentos de anticuerpos anti IL-1 beta monovalentes, muy potentes y estables aplicables para usos terapéuticos. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, vectores, huéspedes que contienen dichas secuencias, composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que comprenden los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos o ácidos nucleicos, y usos de los mismos.
Antecedentes de la invención
La interleucina 1 beta (IL-1 beta) es una citocina proinflamatoria que se expresa como un precursor llamado pro-IL-1 beta por macrófagos activados, monocitos y células dendríticas. El precursor se escinde por caspasa-1 para formar la forma biológicamente activa y secretada de IL-1 beta. La unión de IL-1 beta a su receptor, el receptor de IL-1 tipo I (IL-1R1), permite el reclutamiento de una segunda subunidad del receptor, la proteína accesoria IL-1R (IL-1 RAP). El complejo formado es competente para la transducción de señales. Al ser un mediador clave en la respuesta inflamatoria, la citocina afecta a una serie de actividades celulares tales como la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. Por lo tanto, la IL-1 beta se considera un objetivo importante para una diversidad de fármacos.
Se han informado previamente varios anticuerpos contra IL-1 beta. R&D Systems, Inc. produce y vende el anticuerpo murino anti IL-1 beta/IL-1F2 humana MAB201 (R&D Systems, Inc., cat. n.° MAB201), una inmunoglobulina IgG1 de longitud completa, que se produce en cultivo de hibridoma.
MAB201, que muestra un intervalo de potencia neutralizante medio máximo de 6,6 a 20 pM según el proveedor, se ha humanizado injertando sus CDR en la secuencia de la línea germinal de la cadena kappa humana y las secuencias aceptoras de VH-2 de la cadena gamma (documento US20030026806, AMGEN, Inc.) para producir una inmunoglobulina de longitud completa.
XOMA052, también conocido como AB7 o gevokizumab, es una IgG2 humanizada, es decir, una inmunoglobulina de longitud completa (OWYANG, A., et al. XOMA 052, a potent, high-affinity monoclonal antibody for the treatment of IL-1 beta-mediated diseases. mAbs 2011, vol. 3, pág. 49-60; documento EP 1899378 B también publicado como WO2007/002261 A2, XOMA TECHNOLOGY, Ltd.). Sus dominios variables se humanizaron para coincidir con una cadena ligera kappa 1 humana y una cadena pesada VH2 humana. Sus CDR son idénticas a MAB201 con la excepción de una mutación puntual conservadora en CDR-H2. El documento WO2011/140522 desvela métodos y materiales para tratar o prevenir la uveítis usando un anticuerpo anti IL-1 p o un fragmento de unión del mismo. El documento WO2004/067568 desvela anticuerpos aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a IL-1 beta humana madura y pueden usarse para tratar diversas enfermedades tales como artritis reumatoide, osteoartritis o neuroinflamación.
Típicamente, después del injerto de CDR, por ejemplo, con fines de humanización, un anticuerpo que ha acomodado nuevas CDR de un anticuerpo donante de CDR experimenta una caída en la potencia en comparación con el anticuerpo donante de CDR. Por lo tanto, es un verdadero desafío, si es que tiene éxito, manipular adicionalmente el anticuerpo aceptor de CDR generado de manera que la potencia sea cercana o igual a la del anticuerpo donante de CDR.
Además, para su uso en tratamientos médicos es obligatorio, además de proporcionar una buena potencia biológica del anticuerpo, generar anticuerpos con propiedades de tipo fármaco mejoradas, por ejemplo, alta estabilidad y suficiente solubilidad.
Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos anticuerpos y, en particular, fragmentos de anticuerpos, que superen las desventajas de los anticuerpos existentes en la técnica. La invención proporciona dichos compuestos, así como métodos para prepararlos y usarlos.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, se proporciona un anticuerpo humanizado contra IL-1 beta.
En una realización, dicho anticuerpo humanizado comprende una secuencia de cadena ligera variable como se expone en la SEQ ID No: 8; y una secuencia de cadena pesada variable como se expone en la SEQ ID No: 12.
Preferentemente, dicho fragmento de anticuerpo tiene un dominio VH del subtipo humano VH3 o VH1b.
Los anticuerpos proporcionados en el presente documento son muy estables, es decir, permanecen monoméricos durante periodos de tiempo prolongados. Esto se aplica en particular a los fragmentos de anticuerpos y más particularmente a los scFv desvelados en el presente documento. Los parámetros de estabilidad son factores cruciales para proporcionar un fármaco viable. Cuanto más estable sea un fármaco, mayor será la semivida en almacenamiento. Los anticuerpos inestables tienden a dimerizarse u oligomerizarse e incluso precipitar, disminuyendo así la semivida y finalmente volviéndose menos adecuados para aplicaciones farmacéuticas debido, por ejemplo, a una mayor inmunogenicidad.
Para determinadas indicaciones terapéuticas, los fragmentos de anticuerpos pequeños tienen ventajas sobre las inmunoglobulinas de longitud completa debido a su tamaño más pequeño y a la falta de la región constante Fc de las inmunoglobulinas. Por ejemplo, los scFv son capaces de penetrar los tejidos de manera más eficiente debido a su pequeño tamaño. Además, muestran una retención disminuida en la circulación sistémica, ya que son incapaces de unirse a receptores Fc tales como FcRn, lo que eventualmente conduce a tasas de aclaramiento renal más altas. Estas características de buena penetración tisular con posterior distribución uniforme en el tejido y la rápida eliminación de fragmentos de anticuerpos pequeños tales como scFv de la circulación sistémica son particularmente ventajosas para enfermedades tanto locales/tópicas crónicas como sistémicas agudas. Sin embargo, esta utilidad práctica se ha visto gravemente limitada en el pasado por la baja estabilidad y la baja potencia biológica del scFv humanizado recombinante.
Los anticuerpos proporcionados en el presente documento ejercen potencias inhibidoras muy elevadas con respecto a la IL-1 beta humana. Los fragmentos de anticuerpos monovalentes que tienen valores de potencia en el intervalo pM son particulares y no se obtienen de forma rutinaria. Además, y típicamente, un anticuerpo pierde afinidad por su diana tras la humanización cuando se compara con el anticuerpo no humano precursor. Por lo tanto, es un desafío humanizar un anticuerpo de manera que los parámetros de afinidad sean cercanos o iguales a los del anticuerpo precursor. Esto es particularmente cierto para los fragmentos de anticuerpos monovalentes que comprenden solo una cadena ligera y pesada variable y, por lo tanto, se unen a la diana con menos fuerza que los anticuerpos bivalentes que presentan dos cadenas ligeras y pesadas.
Un anticuerpo biológicamente muy potente es particularmente útil ya que permite, por ejemplo, la administración de pequeñas cantidades de fármaco al paciente, disminuyendo así los costes generales del tratamiento. Además, se hace factible una neutralización más completa de la diana molecular de la enfermedad.
Además, se pueden prever diferentes vías de aplicación novedosas en modelos animales, así como en terapia humana, cuando se aplican anticuerpos de mayor potencia. Por ejemplo, en cuanto a los fármacos aplicados por vía tópica, aunque la eficacia de suministro puede estar limitada debido a la función de barrera del estrato córneo de la piel y/u otras estructuras biológicas, la eficacia del tratamiento se restablece por la alta potencia de la cantidad de otro modo limitada de moléculas de fármaco que atraviesa tales barreras fisiológicas.
Con frecuencia, la gran cantidad de un fármaco menos potente que debe administrarse para lograr efectos farmacodinámicos similares a los de un fármaco más potente se traduce en volúmenes de aplicación intravenosa o subcutánea mucho mayores. Dichos volúmenes de aplicación más altos son una desventaja para su uso en animales y seres humanos por dos razones: en primer lugar, la impracticabilidad de tratar a los pacientes con un gran volumen de fármaco y, en segundo lugar, los anticuerpos son caros por unidad de masa.
Las menores cantidades de anticuerpos necesarios para el tratamiento se traducen en menores costes de producción del fármaco. En particular, los fragmentos de anticuerpos son susceptibles de bajos costes de producción ya que el uso de, por ejemplo, sistemas de cultivo de bacterias o levaduras conduce a costes más bajos que con los sistemas de expresión de mamíferos usados típicamente para la producción de inmunoglobulinas de longitud completa. La combinación de cantidades más pequeñas de fármaco a administrar y procesos de fabricación más baratos abre la posibilidad de medicamentos más rentables por paciente. Por lo tanto, un mayor número de pacientes puede beneficiarse de dicho fármaco.
Los parámetros de estabilidad son otros factores cruciales para proporcionar un medicamento viable. Cuanto más estable sea un fármaco de anticuerpos, mayor será la semivida en almacenamiento. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento son muy estables, es decir, permanecen monoméricos durante periodos de tiempo prolongados y también a altas concentraciones, lo que tiene la ventaja de volúmenes de administración más pequeños.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica los anticuerpos anteriores, un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico y/o células huésped que comprenden dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector.
También se proporciona una composición que comprende el anticuerpo anterior, el ácido nucleico anterior, el vector anterior o la célula huésped anterior; y además un portador, diluyente o excipiente adecuado.
Se proporciona además un método para tratar una enfermedad mediada por IL-1 beta que comprende administrar a un sujeto que lo necesite dicha composición farmacéutica.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse, por ejemplo,
(i) como medicamento, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad mediada por IL-1 beta;
(ii) en diagnósticos; y/o
(iii) con fines de detección.
Se proporciona además un método para producir los anticuerpos desvelados en el presente documento que comprende las etapas de
(i) cultivar la célula huésped anterior para que se exprese el anticuerpo;
(ii) recuperar el anticuerpo; y
(iii) purificar opcionalmente el anticuerpo.
Opcionalmente, dicho método puede comprender además al menos una etapa de síntesis química.
Se proporciona además un método para producir los anticuerpos desvelados en el presente documento que comprende las etapas de
(a) proporcionar un sistema acelular,
(b) proporcionar un molde de producto de ácido nucleico,
(c) permitir la transcripción y traducción de dicho molde de producto de ácido nucleico, expresando así el anticuerpo;
(d) recuperar el anticuerpo; y
(e) purificar opcionalmente el anticuerpo.
Dicho método puede comprender opcionalmente al menos una etapa de síntesis química.
También se proporciona un método in vivo o in vitro para detectar la presencia de IL-1 beta en una muestra biológica que comprende las etapas de
(i) poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo desvelado en el presente documento en condiciones permisivas para la unión a IL-1 beta, y
(ii) detectar si se forma un complejo con IL-1 beta.
Se proporciona además un kit que comprende el anticuerpo anterior junto con una combinación empaquetada de reactivos con instrucciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra alineaciones de secuencias de dominios variables de anticuerpos. La figura 1A representa alineaciones de secuencias de cadena ligera (VL) de scFv anti IL-1 beta DLX2260, DLX2289, DLX2332, DLX2295 y DLX2296 correspondientes a las SEQ ID Nos. 17, 16, 20, 19 y 18, respectivamente. La figura 1B muestra alineaciones de las correspondientes secuencias de cadena pesada (VH). Los aminoácidos que difieren en la misma posición están marcados en negrita, las secuencias CDR están subrayadas.
La figura 2A muestra los resultados de un ELISA para determinar la unión de DLX2260 y DLX2289 a rhIL-1 beta biotinilada a diversas concentraciones. Las diferencias de absorbancia a una longitud de onda de 450 nm se representan en función de la concentración de IL-1 beta biotinilada dada en ng/ml. Cuadrados: DLX2260; círculos: DLX2289.
La figura 2B muestra la inhibición de la proliferación de células D10.G4.1 inducida por IL-1 beta por tres anticuerpos anti IL-1 beta diferentes. Las diferencias de absorbancia a una longitud de onda de 450 nm se representan en función de la concentración de scFv dada en ng/ml. Cuadrados: DLX2260; círculos: DLX2289; triángulos: MAB201.
La figura 3A muestra la unión de DLX2295 y DLX2296 a rhIL-1 beta en un ELISA. Las diferencias de absorbancia a una longitud de onda de 450 nm se representan en función de la concentración de scFv dada en ng/ml. Cuadrados: scFv de control; círculos: DLX2296; triángulos: DLX2295. El resultado del mismo experimento realizado con DLX2332 se muestra en la figura 3B. Las diferencias de absorbancia a una longitud de onda de 450 nm se representan en función de la concentración de scFv dada en ng/ml. Círculos: scFv de control; triángulos: DLX2332.
La figura 4 muestra la inhibición de la actividad biológica de rhIL-1 beta en un ensayo de fibroblastos humanos. Se compara la potencia de los scFv DLX2260 y DLX2296, así como del anticuerpo de control MAB201. El eje y indica la cantidad de IL-6 liberada de fibroblastos humanos en pg/ml; el eje x indica la concentración de anticuerpos aplicados en pM. Cuadrados: MAB201; círculos: DLX2260; triángulos: DLX2296.
La figura 5 muestra la inhibición de la actividad biológica de rhIL-1 beta por DLX2295 en un ensayo de fibroblastos humanos. En el mismo experimento, se analizaron los anticuerpos de control positivo MAB201 y llaris®. El eje y indica la cantidad de IL-6 liberada de fibroblastos humanos en pg/ml; el eje x indica la concentración de anticuerpos aplicados en pM. Cuadrados: MAB201; triángulos: DLX2295; círculos: llaris®.
La figura 6 muestra la capacidad de neutralización de IL-1 beta de DLX2332 en comparación con DLX2295 en un ensayo de fibroblastos humanos. El eje y indica la cantidad de IL-6 liberada de fibroblastos humanos en pg/ml; el eje x indica la concentración de anticuerpos aplicados en pM. Cuadrados: DLX2295; círculos: DLX2332.
La figura 7 muestra la definición de la región CDR-H1 como se usa en el presente documento y en el esquema de numeración de Kabat. Las flechas indican los residuos de CDR-H1 de acuerdo con la definición de Kabat (arriba) o como se usa en el presente (abajo).
Descripción detallada
Para que la invención pueda entenderse más fácilmente, primero se definirán determinados términos. A menos que se defina lo contrario en la memoria descriptiva, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen su significado reconocido en la técnica. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados.
Dentro del alcance de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas de longitud completa, así como a fragmentos de las mismas. Dichas inmunoglobulinas de longitud completa pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados, remodelados o humanos.
Dicho anticuerpo puede ser monovalente o multivalente, es decir, que tiene uno o más sitios de unión a antígeno. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos monovalentes incluyen scFv, fragmentos Fab, dAb, VHH y nanocuerpos. Un anticuerpo multivalente puede tener dos, tres, cuatro o más sitios de unión a antígeno por lo que se pueden reconocer uno o más antígenos diferentes. Las inmunoglobulinas de longitud completa, los fragmentos F(ab')2, el bis-scFv y los diacuerpos son ejemplos no limitantes de anticuerpos multivalentes; en dichos anticuerpos multivalentes de ejemplo, están presentes dos sitios de unión, es decir, el anticuerpo es bivalente.
En una realización, el anticuerpo multivalente es biespecífico, es decir, el anticuerpo se dirige contra dos dianas diferentes o dos sitios diana diferentes en una molécula diana. Los anticuerpos biespecíficos se revisan, por ejemplo, en MÜLLER, D. y Kontermann, R.E. Bispecific antibodies. Editado por DÜBEL, S. Weinheim: Wiley-VCH, 20 2007. ISBN 3527314539. pág. 345-378. En otra realización, el anticuerpo multivalente comprende más de dos, por ejemplo, tres o cuatro sitios de unión diferentes para tres o cuatro, respectivamente, antígenos diferentes. Dicho anticuerpo es multivalente y multiespecífico, en particular, triespecífico o tetraespecífico, respectivamente.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden porciones de una inmunoglobulina de longitud completa que conservan esencialmente la especificidad antigénica de dicha inmunoglobulina. Muchos, pero no todos, los fragmentos de anticuerpos carecen, al menos parcialmente, de la región constante (región Fc) de la inmunoglobulina de longitud completa. En algunas realizaciones, los fragmentos de anticuerpos se producen mediante digestión proteolítica de la inmunoglobulina de longitud completa. Un fragmento de anticuerpo también puede ser una construcción sintética o recombinante que comprende partes de la inmunoglobulina o cadenas de inmunoglobulina (véanse, por ejemplo, HOLLIGER, P. y Hudson, J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology 2005, vol. 23, n.° 9, pág. 1126-1136). Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos, sin limitación, incluyen scFv, Fab, Fv, Fab', fragmentos F(ab')2, dAb, VHH, nanocuerpos, V(NAR) o unidades de reconocimiento mínimo.
Los "fragmentos variables monocatenarios" o los "anticuerpos monocatenarios" o "scFv" son un tipo de fragmentos de anticuerpo. Los scFv son proteínas de fusión que comprenden la VH y la VL de inmunoglobulinas conectadas por un enlazador. Por lo tanto, carecen de la región Fc constante presente en las inmunoglobulinas de longitud completa, pero conservan la especificidad antigénica de la inmunoglobulina original.
La "CI 50" o "concentración inhibidora semimáxima" es una medida de la potencia del fármaco antagonista y describe cuantitativamente la eficacia de un compuesto para inhibir una función biológica o bioquímica. Esta medida indica qué cantidad de dicho compuesto se necesita para inhibir en un 50 % un determinado proceso biológico o bioquímico. Si se observa actividad residual, el valor de CI50 es la concentración del compuesto en el punto de inflexión de la curva de inhibición medida. Aunque no es un indicador directo de afinidad, ambos valores se correlacionan mediante la ecuación de Cheng-Prusoff (CHENG Y. y Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochemical Pharmacology 1973, vol. 22, pág. 3099-3108; RAMMES, G., et al. Identification of a domain which affects kinetics and antagonistic potency of clozapine at 5-HT3 receptors. PLOS one 2009, vol. 4, pág. 1-14; ZHEN, J., et al. Concentration of receptor and ligand revisited in a modified receptor binding protocol for high-affinity radioligands: [3H] spiperone binding to D2 and D3 dopamine receptors. Journal of Neuroscience Methods 2010, vol. 188, pág. 32-38).
La expresión "unión específica a IL-1 beta", como se usa en el presente documento, describe que un anticuerpo se une a IL-1 beta con mayor afinidad que a un antígeno estructuralmente diferente que no comprende el epítopo de IL-1 beta al que tal anticuerpo anti IL-1 beta se une. La unión específica se refleja mediante una constante de equilibrio de disociación (Kd) inferior a 1 micromolar. Esta constante se puede determinar, por ejemplo, usando la microbalanza de cristal de cuarzo (Quartz Crystal Microbalance, QCM) en un instrumento Attana, o la tecnología de resonancia de plasmón superficial (Surface Plasmon Resonance, SPR) en un instrumento BIACORE.
Como se usa en el presente documento, "IL-1 beta" se refiere a la molécula como se describe, por ejemplo, en Dinarello C.A., A clinical perspective of IL-1 beta as the gatekeeper of inflammation. Eur. J. Immunol. 2011, vol. 41, pág. 1203­ 1217. "hIL-1 beta", como se usa en el presente documento, se refiere a IL-1 beta humana. "rIL-1 beta" se refiere a IL-1 beta recombinante. La IL-1 beta recombinante puede tener o no un residuo de metionina en el extremo amino, dependiendo del método mediante el cual se prepara. "rhIL-1" beta se refiere a IL-1 beta humana recombinante. rhIL-1 beta puede obtenerse, por ejemplo, en Peprotech, EE.UU., cat. n.° 200-01B. La IL-1 beta también se puede obtener mediante aislamiento de muestras biológicas de origen humano o no humano.
Anticuerpo "humanizado" se refiere a una inmunoglobulina de longitud completa o un fragmento de la misma que comprende una o más, típicamente las seis regiones CDR de un anticuerpo precursor no humano o una variante del mismo, y en el que la región marco puede ser, por ejemplo, (i) una región marco humana, que comprende potencialmente uno o más residuos de la región marco del anticuerpo precursor no humano, o (ii) una región marco de un anticuerpo no humano modificado para aumentar la similitud con las regiones marco humanas producidas de forma natural. Se conocen en la técnica métodos de humanización de anticuerpos, véase, por ejemplo, LEGER, O. y Saldanha, J. Antibody Drug Discovery, Editado por WOOD, C. London: Imperial College Press, 2011. ISBN 1848166281, pág. 1-23, mientras que la funcionalidad sigue siendo impredecible.
"Región marco" (Framework, FR) se refiere al armazón del dominio de anticuerpo variable, ya sea la cadena ligera variable (VL) o la cadena pesada variable (VH), que incrusta las CDR respectivas. Una región marco VL y/o VH comprende típicamente cuatro secciones de la región marco, FR1, FR2, FR3 y FR4, que flanquean las regiones CDR. Por lo tanto, como se conoce en la técnica, una VL tiene la estructura general: (FR-L1) -(CDR-L1) -(FR-L2) -(CDR-L2) -(FR-L3) -(CDR-L3) -(FR-L4), mientras que una VH tiene la estructura general: (FR-H1) -(CDR-H1) -(FR-H2) -(CDR-H2) -(FR-H3) -(CDR-H3) -(FR-H4).
"Región determinante de complementariedad" (Complementarity Determining Region, CDR) se refiere a las regiones hipervariables del anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión al antígeno. Típicamente, un sitio de unión a antígeno comprende seis CDR incrustadas en una región marco. En el presente documento, las CDR de VL se denominan c Dr -L1, CDR-L2 y CDR-L3, mientras que las CDR de VH se denominan CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3. Estas pueden identificarse como se describe en KABAT, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest.
5a edición. Editado por U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. NIH Publications, 1991. pág. 91­ 3242. Sin embargo, CDR-H1, como se usa en el presente documento, difiere de la definición de Kabat en que comienza con la posición 27 y termina antes de la posición 36 (véase la figura 7 con fines ilustrativos).
Como se usa en el presente documento, el sistema de numeración para identificar las posiciones de los residuos de aminoácidos en la VH y la VL del anticuerpo corresponde al sistema "AHo" descrito por HONEGGER, A. y Pluckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: An automatic modelling and analysis tool. Journal of Molecular Biology 2001, vol. 309, pág. 657-670. La publicación proporciona además tablas de conversión entre el AHo y el sistema de Kabat (KABAT, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5a edición. Editado por U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. NIH Publications, 1991. pág. 91-3242).
Un anticuerpo o ácido nucleico "aislado" es uno que se identifica y se separa de al menos un componente de su entorno natural.
El término "identidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la coincidencia de secuencias entre dos proteínas o ácidos nucleicos. Las secuencias de proteínas o ácidos nucleicos que se van a comparar se alinean para proporcionar la máxima identidad, por ejemplo, usando herramientas bioinformáticas tales como EMBOSS Needle (alineación por pares; disponible en www.ebi.ac.uk). Cuando la misma posición en las secuencias a comparar está ocupada por la misma nucleobase o residuo de aminoácido, entonces las moléculas respectivas son idénticas en esa misma posición. Por consiguiente, el "porcentaje de identidad" va en función del número de posiciones coincidentes dividido por el número de posiciones comparadas y multiplicado por el 100 %. Por ejemplo, si 6 de cada 10 posiciones de secuencia son idénticas, entonces la identidad es del 60 %. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de proteínas se puede determinar, por ejemplo, usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (NEEDLEMAN, S.B. y Wunsch, C.D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins.
Journal of Molecular Biology 1970, vol. 48, pág. 443-453) que se ha incorporado en EMBOSS Needle, usando una matriz BLOSUM62, una "penalización por apertura de hueco" de 10, una "penalización por extensión de hueco" de 0,5, una falsa "penalización por hueco final", una "penalización por apertura de hueco final" de 10 y una "penalización por extensión de hueco final" de 0,5. El % de identidad o similitud se determina típicamente en toda la longitud de la secuencia de consulta en la que se realiza el análisis. Dos moléculas que tienen la misma secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos primarios son idénticas independientemente de cualquier modificación química y/o biológica. Por ejemplo, dos anticuerpos que tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria pero diferentes patrones de glucosilación son idénticos según esta definición. En el caso de los ácidos nucleicos, por ejemplo, dos moléculas que tienen la misma secuencia pero diferentes componentes de unión, tal como tiofosfato en lugar de fosfato, son idénticas según esta definición.
Las secuencias de proteínas "similares" son aquellas que, cuando se alinean, comparten residuos de aminoácidos similares y, más a menudo, pero no obligatoriamente, residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones de las secuencias que se van a comparar. Los residuos de aminoácidos similares se agrupan en familias según las características químicas de las cadenas laterales. Dichas familias se describen a continuación para "sustituciones de aminoácidos conservadoras". El "porcentaje de similitud" entre secuencias es el número de posiciones que contienen residuos idénticos o similares en las mismas posiciones de secuencia de las secuencias a comparar dividido por el número total de posiciones comparadas y multiplicado por el 100 %. Por ejemplo, si 6 de 10 posiciones de secuencia tienen residuos de aminoácidos idénticos y 2 de 10 posiciones contienen residuos similares, entonces las secuencias tienen un 80 % de similitud. La similitud entre dos secuencias se puede determinar, por ejemplo, usando EMBOSS Needle.
Una "variante" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos que difiere de la secuencia parental en virtud de la adición (incluidas las inserciones), la deleción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos o nucleobases conservando al menos una actividad deseada de la secuencia parental desvelada en el presente documento. En el caso de anticuerpos, dicha actividad deseada puede incluir la unión a antígenos específicos. En cuanto a una secuencia de ácido nucleico variante, el anticuerpo codificado conserva al menos una actividad deseada del anticuerpo precursor como se ha descrito anteriormente. Las variantes pueden ser de origen natural, tales como variantes alélicas o de corte y empalme, o pueden construirse artificialmente.
Como se usa en el presente documento, la expresión "modificaciones conservadoras" se refiere a modificaciones que son física, biológica, química o funcionalmente similares a la referencia correspondiente, por ejemplo, propiedades de tamaño, forma, carga eléctrica, químicas similares, incluida la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Dichas modificaciones conservadoras incluyen, pero sin limitación, una o más sustituciones de nucleobase y aminoácidos.
Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Los restos de aminoácidos que no son esenciales con respecto a la unión a un antígeno pueden, por ejemplo, reemplazarse por otro residuo de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales, por ejemplo, la treonina puede ser sustituida por serina. Los residuos de aminoácidos normalmente se dividen en familias en función de propiedades comunes similares de la cadena lateral, tales como:
1. cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina),
2. cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, prolina, cisteína, triptófano),
3. cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina, prolina),
4. cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico),
5. cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y
6. cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Una sustitución conservadora también puede implicar el uso de un aminoácido no natural.
Las "sustituciones no conservadoras", es decir, el intercambio de miembros de una familia por miembros de otra familia, pueden conducir a cambios sustanciales, por ejemplo, con respecto a la carga, momento dipolar, tamaño, hidrofilia, hidrofobicidad o conformación del anticuerpo, lo que puede conducir a una caída significativa en la actividad de unión, en particular si se ven afectados los aminoácidos que son esenciales para la unión a la molécula diana. Una sustitución no conservadora también puede implicar el uso de un aminoácido no natural.
Se pueden introducir modificaciones conservadoras y no conservadoras en los anticuerpos precursores mediante una diversidad de técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como química combinatoria, mutagénesis de ADN dirigida, mutagénesis de casete y/o mediada por PCR, síntesis química de péptidos/proteínas, reacciones químicas que modifican específicamente el anticuerpo precursor. Las variantes pueden ensayarse mediante métodos de rutina para determinar sus propiedades químicas, biológicas, biofísicas y/o bioquímicas.
Las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos se pueden realizar en condiciones de diferente rigurosidad. Las "condiciones rigurosas" son ampliamente conocidas y publicadas en la técnica. Típicamente, durante la reacción de hibridación se puede usar un tampón basado en SSC en el que SSC es NaCl 0,15 M y tampón de citrato 15 mM que tiene un pH de 7,0. El aumento de las concentraciones de tampón y la presencia de un agente desnaturalizante aumentan la rigurosidad de la etapa de hibridación. Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad pueden implicar el uso de (i) formamida al 50 % (vol/vol), 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sometido a sonicación (50 pg/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C con lavados a 42 °C en 0,2 x SSC y SDS al 0,1 %; (ii) formamida al 50 % (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0,1 %/Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1 %/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C o (iii) sulfato de dextrano al 10 %, 2 x SSC y formamida al 50 % a 55 °C, seguido de un lavado muy riguroso que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C. Adicionalmente, o como alternativa, se pueden incluir una, dos o más etapas de lavado usando soluciones de lavado de baja fuerza iónica y alta temperatura en el protocolo de hibridación usando, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 °C.
Se describen diversos aspectos de la invención con más detalle en las siguientes subsecciones. Se entiende que las diversas realizaciones, preferencias e intervalos pueden combinarse a voluntad. Además, dependiendo de la realización específica, es posible que no se apliquen definiciones, realizaciones o intervalos seleccionados.
En un primer aspecto, la invención proporciona anticuerpos humanizados que se unen a IL-1 beta.
En una realización, dicho anticuerpo humanizado comprende una secuencia de cadena ligera variable que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID No: 8; y una secuencia de cadena pesada variable que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID No: 12.
El anticuerpo desvelado en el presente documento puede ser una inmunoglobulina de longitud completa o un fragmento de anticuerpo tal como, pero sin limitación, un Fab, un Fab', a F(ab)'2 , un scFv o un fragmento Fv.
En una realización, el anticuerpo es monovalente, tal como un scFv o un fragmento Fab. En otra realización, el anticuerpo es multivalente. Dicha molécula multivalente puede ser bivalente (tal como una inmunoglobulina de longitud completa o un fragmento F(ab')2) o comprende al menos tres sitios de unión a diana. El anticuerpo multivalente puede ser un anticuerpo biespecífico tal como un diacuerpo, un diacuerpo monocatenario o un scFv en tándem (véase, por ejemplo, KONTERMa Nn , R.E. Methods in Molecular Biology. Editado por LO, B. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004. ISBN 1588290921. pág. 227-242). Dichos anticuerpos biespecíficos pueden usar enlazadores más cortos que la SEQ ID NO: 14, es decir, que tengan solo de una a tres repeticiones del motivo básico de la SEQ ID NO: 14 (véase, por ejemplo, HOLLIGER, P., et al. Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments. PNAS 1993, vol. 90, n.° 14, pág. 6444-6448). En otra realización, el anticuerpo multivalente es un triacuerpo, minicuerpo o tetracuerpo.
En una realización preferida, el anticuerpo y, en particular, el fragmento de anticuerpo monovalente anterior es un scFv. Los dominios VH y VL se pueden conectar en cualquier orientación, VL-enlazador-VH o VH-enlazador-VL, mediante un enlazador flexible. En una realización preferida, la orientación es VL-enlazador-VH, es decir, con la región variable de cadena ligera en el extremo N y la región variable de cadena pesada en el extremo C del polipéptido.
Dicho anticuerpo, y en particular el fragmento de anticuerpo monovalente tal como el scFv, es estable. Como se usa en el presente documento, el término "estable" se refiere a la propiedad biofísica del anticuerpo de permanecer esencialmente monomérico en solución después de una incubación prolongada y/o una incubación a temperatura elevada.
Por ejemplo, los anticuerpos proporcionados en el presente documento y, en particular, el fragmento de anticuerpo monovalente anterior, más particularmente el scFv, permanecen monoméricos al menos al 70 %, preferentemente al menos al 75 %, y mucho más preferentemente al 80 % después de incubarse durante 1 mes a 37 °C a una concentración de 1 mg/ml en PBS a pH 7,2. Adicionalmente, o como alternativa, el anticuerpo permanece monomérico al menos al 80 %, preferentemente al menos al 85 %, más preferentemente al 90 %, después de 1 mes a temperatura ambiente a una concentración de 1 mg/ml en PBS a pH 7,2.
El porcentaje de monómeros se puede determinar, por ejemplo, mediante SEC-HPLC (cromatografía de exclusión por tamaño-cromatografía líquida de alto rendimiento). Una fase móvil adecuada para tales pruebas es, por ejemplo, PBS a pH 7,2. El contenido de monómero se puede cuantificar mediante la integración máxima de la señal UV 280 nm registrada durante la cromatografía de proteínas. Un sistema de HPLC adecuado es, por ejemplo, una HPLC Dionex Summit controlada por el software Chromeleon® 6.5 que también permite el análisis posterior del cromatograma y la cuantificación de picos.
En una realización preferida, los anticuerpos proporcionados en el presente documento, y en particular el fragmento de anticuerpo anterior, comprenden un dominio VH del subtipo humano VH3 o VH1b, preferentemente del subtipo VH3. Como se conoce en la técnica, los dominios VH de otros subtipos humanos, es decir, VH2, VH4 y VH6, normalmente son inestables en el formato scFv que se refleja, por ejemplo, por una menor cooperatividad en el despliegue de equilibrio que VH3 o VH1b (véase, por ejemplo, EWERT, S. et al. Structure-based improvement of the biophysical properties of immunoglobulin VH domains with a generalizable approach. Biochemistry 2003, vol. 42, pág.
1517-1528). En efecto, una biblioteca de scFv derivada de inmunoglobulinas humanas de longitud completa de origen natural que se seleccionó por su estabilidad y solubilidad dentro de las células de levadura mostró una preferencia por VH3 (67 %) y VH1b (19 %), mientras que solo se encontraron el 9 % de VH1a y el 5 % de VH4; VH2, VH5 y VH6 no estaban representados en absoluto (documento WO03/097697, ESBATech AG).
Los anticuerpos desvelados en el presente documento son preferentemente reactivos cruzados con IL-1 beta de ratón, macaco de la India y/o cangrejero.
Los anticuerpos proporcionados en el presente documento comprenden una secuencia VL como se expone en la SEQ ID No. 8. Adicionalmente, o como alternativa, el anticuerpo comprende un VH como se expone en la SEQ ID No. 12. El anticuerpo, en particular en el caso de un scFv, comprende una secuencia enlazadora. Tal secuencia enlazadora tiene de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. Normalmente, dicho péptido enlazador es rico en glicinas, que confieren flexibilidad, así como serinas y/o treoninas para mejorar la solubilidad. En una realización preferida, se usa un enlazador (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 14) o una variante del mismo. También se pueden usar variaciones de dicho motivo que tienen de tres a cinco repeticiones. Otros enlazadores adecuados se describen, por ejemplo, en ALFTHAN, K. Properties of a single-chain antibody containing different linker peptides. Protein Engineering 1995, vol. 8, n.° 7, pág.
725-731.
En una realización muy preferida, el anticuerpo comprende la secuencia como se expone en la SEQ ID No.: 19. En determinadas realizaciones, se contemplan variantes de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la unión a antígenos, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity, ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity, CDC) para aumentar la estabilidad o la solubilidad, disminuir la inmunogenicidad y/o alterar otras propiedades biológicas, bioquímicas o biofísicas del anticuerpo. En algunas realizaciones, la variante no muestra ninguna mejora con respecto al anticuerpo precursor.
Las variantes de los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden prepararse mediante ingeniería de proteínas y/o química, introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis de proteínas/péptidos. Son de particular interés las sustituciones, preferentemente las sustituciones conservadoras como se ha descrito anteriormente. Las sustituciones conservadoras preferidas incluyen:
1. Sustitución de alanina (A) por valina (V);
2. Sustitución de arginina (R) por lisina (K);
3. Sustitución de asparagina (N) por glutamina (Q);
4. Sustitución del ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E);
5. Sustitución de cisteína (C) por serina (S);
6. Sustitución de glicina (G) por alanina (A);
7. Sustitución de histidina (H) por arginina (R) o lisina (K);
8. Sustitución de isoleucina (I) por leucina (L);
9. Sustitución de metionina (M) por leucina (L);
10. Sustitución de fenilalanina (F) por tirosina (Y);
11. Sustitución de prolina (P) por alanina (A);
12 Sustitución de serina (S) por treonina (T);
13. Sustitución de triptófano (W) por tirosina (Y);
14. Sustitución de fenilalanina (F) por triptófano (W); y/o
15. Sustitución de valina (V) por leucina (L)
y viceversa.
El anticuerpo descrito en el presente documento puede comprender una o más, tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de dichas sustituciones conservadoras.
Las sustituciones no conservadoras pueden conducir a cambios más sustanciales, por ejemplo, con respecto a la carga, momento dipolar, tamaño, hidrofilia, hidrofobicidad o conformación del polipéptido. En una realización, el anticuerpo comprende una o más, tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de tales sustituciones no conservadoras.
La VH del anticuerpo comprende mutaciones puntuales potenciadoras de la solubilidad. El documento WO2009/155725 (ESBATech, Alcon Biomedical Research Unit l Lc ) describe un motivo que ha demostrado aumentar la solubilidad general del anticuerpo. Los residuos se colocan en posiciones ubicadas en la interfaz del dominio variable y el dominio constante de un anticuerpo y estabilizan los fragmentos de anticuerpos, en particular scFv, que carecen del dominio constante. En particular, están presentes al menos uno, preferentemente los tres residuos siguientes:
(i) serina (S) en la posición 12 del aminoácido de cadena pesada (según la numeración AHo);
(ii) serina (S) o treonina (T) en la posición 103 del aminoácido de cadena pesada (según la numeración AHo);
y/o
(iii) serina (S) o treonina (T) en la posición 144 del aminoácido de cadena pesada (según la numeración AHo).
El anticuerpo tiene una serina en la posición 12 de VH; una serina en la posición 103 de VH; y una treonina en la posición 144 de VH (todas las numeraciones AHo).
Los anticuerpos desvelados en el presente documento tienen altas potencias para neutralizar IL-1 beta. Dichos anticuerpos tienen potencias inhibidoras muy altas contra IL-1 beta humana con una CI50 inferior a 10 nM, más preferentemente inferior a aproximadamente 1 nM, 500 pM, 250 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM y mucho más preferentemente aproximadamente 5 pM.
La CI 50 puede determinarse, por ejemplo, usando un ensayo de potencia basado en células. En una realización, el valor de CI50 anterior se determina inhibiendo la liberación de IL-6 inducida por IL-1 beta de fibroblastos humanos. Dicho ensayo se basa en la observación de que los fibroblastos estimulados con IL-1 beta liberan IL-6. En presencia de anticuerpos inhibidores de IL-1 beta, se reduce la concentración de IL-6 liberada. En una realización preferida, se usan células de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF-Neo, por ejemplo, de Lonza Walkersville USA, cat. n.° CC-2509). Tras la incubación con una mezcla de hIL-1 beta y el anticuerpo de interés, los sobrenadantes se recogen y se examinan mediante un ELISA de IL-6 tal como el kit ELISA de IL-6 humana DuoSet de R&D Systems (R&D Systems, cat. n.° DY206). En una realización, el ensayo es el ensayo de neutralización de IL-1 beta como se describe en el ejemplo 2. En una realización preferida, el ensayo es el ensayo de neutralización de IL-1 beta como se describe en el ejemplo 4. El valor de CI50 es el valor medio obtenido de tres repeticiones independientes de tal ensayo.
En una realización muy preferida, el anticuerpo tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 69 °C determinada por fluorimetría diferencial de barrido (Differential Scanning Fluorimetry, DSF), preferentemente 70 °C, 71 °C, 72 °C, 73 °C, 74 °C, 75 °C, 76 °C, 77 °C, 78 °C, 79 °C y mucho más preferentemente 80 °C. Este método se basa en que las propiedades de determinados colorantes sean fluorescentes solo en un ambiente hidrófobo. Por ejemplo, el despliegue de proteínas se puede detectar como un aumento en la fluorescencia tras la unión del colorante SYPRO® Orange a una proteína desnaturalizada por calor (NIESEN F.H. et al. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nature Protocols 2007, vol. 2, pág. 2212-2221). Por lo tanto, la estabilidad de una proteína puede analizarse mediante desnaturalización térmica.
En algunas realizaciones, IL-1 beta muestra actividad residual cuando se pone en contacto con los anticuerpos desvelados en el presente documento en un entorno in vivo y/o in vitro, es decir, el anticuerpo no inhibe completamente la acción de IL-1 beta pero permite una señal de actividad residual provocada por IL-1 beta. Esto puede tener la ventaja de mantener respuestas inmunitarias eficientes. En una realización, el anticuerpo permite una actividad de IL-1 beta residual de aproximadamente el 10 %, preferentemente de aproximadamente el 5 % de la señal del ensayo, según se determina mediante la inhibición de la liberación de IL-6 de fibroblastos humanos por 10pg/ml de IL-1 beta, preferentemente el ensayo descrito en el ejemplo 2, en presencia de 60 ng/ml del anticuerpo descrito en el presente documento cuando se compara con anticuerpos de especificidad no relevante o un vehículo de control a la misma concentración.
También se proporcionan biosimilares de los anticuerpos descritos en el presente documento, es decir, compuestos que no muestran diferencias significativas en términos de seguridad, pureza y potencia de los anticuerpos anteriores.
Ácidos nucleicos, vectores, células huésped y método de producción
Cada anticuerpo descrito en el presente documento está codificado por un solo ácido nucleico o por dos o más ácidos nucleicos, por ejemplo, cada uno de los cuales codifica al menos una región variable. Conociendo la secuencia del anticuerpo o de sus partes, los ADNc que codifican la secuencia polipeptídica pueden generarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante síntesis génica. Estos ADNc se pueden clonar mediante técnicas estándar de clonación y mutagénesis en un vector adecuado, tal como un vector de expresión o un vector de clonación. Opcionalmente, la cadena ligera variable está codificada por un ácido nucleico separado de la cadena pesada variable del anticuerpo. Además, secuencias adicionales tales como etiquetas (por ejemplo, una etiqueta His), dominios constantes para la producción de un Fab o una inmunoglobulina de longitud completa, enlazadores, secuencias codificantes de una segunda especificidad de unión u otro polipéptido funcional tal como una enzima para generar una construcción de fusión o una molécula biespecífica se pueden incluir en la construcción genética.
Basándose en la estrategia de clonación, las construcciones genéticas elegidas pueden generar un anticuerpo que tenga uno o más residuos adicionales en el extremo N o C. Por ejemplo, una metionina del extremo N derivada del codón de inicio o una alanina adicional puede estar presente en un polipéptido expresado, a menos que se haya recortado postraduccionalmente. Por lo tanto, debe entenderse que los anticuerpos desvelados en el presente documento comprenden las secuencias desveladas en lugar de consistir en ellas.
En una realización, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos 300 nucleobases, más preferentemente al menos 350, 400, 450 o 500 nucleobases y que tiene al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID No. 15. En una realización muy preferida, la secuencia de ácido nucleico es la SEQ ID No. 15.
Los protocolos básicos de técnicas de clonación estándar, mutagénesis y biología molecular se describen en, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (GREEN, M. y Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual.
4a edición. Cold Spring Harbor Laboratory, 2012. ISBN 1936113422.).
Las células huésped apropiadas para la expresión de las construcciones genéticas pueden ser procariotas o eucariotas. Las células huésped procariotas adecuadas son gramnegativas o grampositivas e incluyen especies de las familias Escherichia, Erwinina, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas o Bacillus. Es muy preferida Escherichia coli, en particular las cepas de E. coli BL21 (DE3) (Life Technologies™, cat. n.° C6000-03) y Origami™ 2 (DE3) (Novagen, cat. n.° 71345).
Si se desean modificaciones postraduccionales tales como glucosilación o fosforilación, son preferibles las células huésped eucariotas. Por ejemplo, los microbios eucariotas tales como las cepas comúnmente usadas de Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris pueden servir como células huésped. Las células huésped también pueden incluir células vegetales o animales, en particular células de insecto o mamífero. Las células de mamífero adecuadas incluyen, sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionarias humanas (HEK), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) o células de mieloma NS0.
El anticuerpo se puede producir mediante expresión en una célula huésped adecuada. Por ejemplo, los vectores de expresión descritos anteriormente se introducen en una célula huésped mediante técnicas estándar tales como electroporación o transformación química. A continuación, las células transformadas se cultivan en condiciones adecuadas para la expresión de proteínas recombinantes, típicamente en medios nutricionales apropiados, opcionalmente modificados para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar secuencias codificantes de interés. La proteína del anticuerpo se recupera del cultivo y opcionalmente se purifica usando técnicas estándar en la técnica. El rendimiento de la proteína recombinante se puede mejorar optimizando los medios y las condiciones de cultivo, tales como el pH, la temperatura o el suministro de oxígeno. En procariotas, el anticuerpo puede producirse en el periplasma, intracelularmente como cuerpos de inclusión o secretarse al medio. Tras la recogida, la proteína puede purificarse usando métodos bien conocidos en la técnica tales como cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, interacción hidrófoba, cromatografía de modo mixto y/o cromatografía de afinidad.
En una realización, el anticuerpo se produce en un sistema acelular. Típicamente, esto implica la transcripción in vitro seguida de la traducción in vitro de moldes de productos de ácido nucleico que codifican las proteínas descritas en el presente documento, por ejemplo, moldes de productos de ADN plasmídico o PCR. Por ejemplo, los lisados en bruto de células en crecimiento se usan como base para sistemas de expresión acelulares, proporcionando las enzimas necesarias, así como la maquinaria de síntesis de proteínas celulares. Los componentes básicos necesarios, tales como los aminoácidos o las nucleobases, así como las moléculas que suministran energía y otros, pueden suministrarse de forma exógena. Los sistemas de expresión acelulares pueden, por ejemplo, basarse en reticulocitos de conejo lisados (por ejemplo, sistema de lisado de reticulocitos de conejo, Promega, Promega, cat. n.° L4540), células HeLa (por ejemplo, kit de traducción in vitro humana de 1 paso, Thermo Scientific, cat. n.° 88881), células de insecto (por ejemplo, EasyXpress Insect Kit II, Qiagen, cat. n.° 32561), gérmenes de trigo (por ejemplo, extracto de germen de trigo, Promega, cat. n.° L4380) o células de E. coli (por ejemplo, kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress®, NEB, cat. n.° E6800S). Además, se pueden usar para la producción sistemas optimizados de expresión de anticuerpos acelulares para la generación mejorada de enlaces disulfuro. Los kits disponibles comercialmente incluyen lisados de células de insecto (por ejemplo, EasyXpress Disulfide Insect Kit, Qiagen, cat. n.° 32582) o lisados de células de E. coli (por ejemplo, EasyXpress Disulfide E. coli Kit, Qiagen, cat. n.° 32572). La síntesis de proteínas acelular tiene, por ejemplo, la ventaja de ser rápida, lograr altos rendimientos de producto, permitir una fácil modificación de las condiciones de reacción, formar un bajo grado o incluso ningún subproducto. La síntesis de proteínas acelular puede implicar etapas biológicas y/o químicas que no pueden realizarse en sistemas de producción puramente biológicos o químicos. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales o modificados químicamente se pueden incorporar a la proteína en las posiciones deseadas. Las proteínas de fusión scFv-toxina se han producido con éxito en sistemas acelulares (NICHOLLS, P. J., et al. Characterization of single-chain antibody (sFv)-toxin fusion proteins produced in vitro in rabbit reticulocyte lysate. Journal of Biological Chemistry 1993, vol. 268, págs. 5302-5308.) Por lo tanto, en una realización, se proporciona un método para producir el anticuerpo descrito en el presente documento que comprende las etapas de
(a) proporcionar un sistema acelular,
(b) proporcionar un molde de ácido nucleico que codifica el anticuerpo descrito en el presente documento,
(c) permitir la transcripción y traducción de dicho molde de producto de ácido nucleico, mediante el que se expresa el anticuerpo;
(d) recuperar el anticuerpo; y opcionalmente
(e) purificar dicho anticuerpo.
Adicionalmente, o como alternativa, un método para producir el anticuerpo descrito en el presente documento comprende al menos una etapa de síntesis química. Por ejemplo, el método puede ser completamente químico. En otra realización, los sistemas de producción basados en células o acelulares descritos anteriormente comprenden al menos una etapa de síntesis química.
En una realización preferida, los anticuerpos descritos en el presente documento se producen en un sistema basado en células usando un vector de expresión para la expresión intracelular en E. coli. Tras la expresión, el polipéptido se genera como cuerpos de inclusión dentro de las células que posteriormente se separan de otras partículas celulares seguido de solubilización en un agente desnaturalizante tal como clorhidrato de guanidina (GndHCl) y se repliegan mediante procedimientos de renaturalización bien conocidos por el experto.
Modificaciones químicas y/o biológicas
En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención se modifica química y/o biológicamente. Dicha modificación puede comprender, pero sin limitación, glucosilación, PEGilación, HESilación, tecnología de fusión de albúmina, PASilación, marcaje con colorantes y/o radioisótopos, conjugación con enzimas y/o toxinas, fosforilación, hidroxilación y/o sulfatación. Análogamente, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped descrita anteriormente se pueden modificar en consecuencia.
Se pueden realizar modificaciones químicas y/o biológicas, por ejemplo, para optimizar la farmacocinética, la farmacodinámica, la solubilidad en agua de la proteína y/o para reducir sus efectos secundarios. Por ejemplo, se pueden aplicar PEGilación, PASilación y/o HESilación para ralentizar el aclaramiento renal y aumentar así la semivida plasmática del anticuerpo. Adicionalmente, o como alternativa, una modificación puede añadir una funcionalidad diferente a la proteína, por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con una toxina para combatir de manera más eficiente las células cancerosas, o puede añadirse una molécula de detección con fines de diagnóstico.
La glucosilación se refiere a un proceso que une los carbohidratos a las proteínas. En los sistemas biológicos, este proceso se realiza enzimáticamente dentro de la célula como una forma de modificación cotraduccional y/o postraduccional. Una proteína, en este caso el anticuerpo, también se puede glucosilar químicamente. Típicamente, pero sin limitación, la glucosilación está (i) unida en N a un nitrógeno de cadenas laterales de asparagina o arginina; (ii) unida en O al hidroxioxígeno de las cadenas laterales de serina, treonina, tirosina, hidroxilisina o hidroxiprolina; (iii) implica la unión de xilosa, fucosa, manosa y/o N-acetilglucosamina a una fosfo-serina; o (iv) está en forma de C-manosilación, donde se añade un azúcar manosa a un residuo de triptófano que se encuentra en una secuencia de reconocimiento específica. Los patrones de glucosilación pueden controlarse, por ejemplo, eligiendo líneas celulares apropiadas, medios de cultivo, modos de fabricación de ingeniería de proteínas y/o estrategias de proceso (HOSSLER, P. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology 2009, vol. 19, n.° 9, pág. 936­ 949.).
La ingeniería de proteínas para controlar o alterar el patrón de glucosilación puede implicar la deleción y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación. La creación de sitios de glucosilación puede realizarse convenientemente introduciendo la secuencia de reconocimiento enzimático correspondiente en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o añadiendo o sustituyendo uno o más de los residuos de aminoácidos enumerados anteriormente.
Puede ser deseable PEGilar el anticuerpo. La PEGilación puede alterar las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas de una proteína. El polietilenglicol (PEG) de un peso molecular apropiado se une covalentemente al esqueleto de la proteína (véase, por ejemplo, PASUT, G. y Veronese, F. State of the art in PEGylation: the great versatility achieved after forty years of research. Journal of Controlled Release 2012, vol. 161, n.° 2, pág. 461-472). La PEGilación puede reducir adicionalmente la inmunogenicidad protegiendo la proteína PEGilada del sistema inmunitario y/o alterar su farmacocinética, por ejemplo, aumentando la estabilidad in vivo del anticuerpo, protegiéndolo de la degradación proteolítica, alargando su semivida y/o alterando su biodistribución.
Pueden conseguirse efectos similares mediante miméticos de PEG, por ejemplo, HESilando o PASilando el anticuerpo. La HESilación utiliza derivados de hidroxietil almidón ("HES"), mientras que durante la PASilación el anticuerpo se une a secuencias polipeptídicas con alteraciones conformacionales compuestas por los aminoácidos prolina, alanina y serina. Dichos miméticos de PEG y compuestos relacionados se describen, por ejemplo, en BINDER, U. y Skerra, A. Half-Life Extension of Therapeutic Proteins via Genetic Fusion to Recombinant PEG Mimetics, en Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives. Editado por KONTERMANN, R., Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2012. ISBN: 9783527328499. pág. 63-81.
El anticuerpo puede incluir un epítopo de unión al receptor de rescate. Tal epítopo de unión al receptor de rescate se refiere típicamente a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) y tiene el efecto de aumentar la semivida in vivo de la molécula.
Adicionalmente, o como alternativa, el anticuerpo se marca o se conjuga con un segundo resto que atribuye funciones auxiliares después de la unión a la diana. Dicho segundo resto puede, por ejemplo, tener una función efectora inmunológica adicional, ser eficaz en el direccionamiento de fármacos o útil para la detección. El segundo resto puede, por ejemplo, unirse químicamente o fusionarse genéticamente al anticuerpo usando métodos conocidos en la técnica.
Las moléculas que pueden servir como segundo resto incluyen, sin limitación, radionúclidos, también llamados radioisótopos (por ejemplo, 35S 32P, 14C, 18F, 1251); apoenzimas; enzimas (tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa o angiogenina); cofactores; péptidos (por ejemplo, etiquetas HIS); proteínas (lectinas en pulgadas, dominios de unión a metales); carbohidratos (etiqueta manosa-6-fosfato en pulgadas); fluoróforos (incluyendo isotiocianato de fluoresceína (FITC); ficoeritrina; verde/azul/rojo y otras proteínas fluorescentes; aloficocianina (APC)); cromóforos; vitaminas (incluyendo biotina); quelantes; antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato), liposomas; toxinas que incluyen fármacos citotóxicos tales como taxol, gramicidina D o colchicina; o una radiotoxina.
Un anticuerpo marcado es particularmente útil para fines de diagnóstico o detección in vitro e in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo marcado con un radioisótopo, enzima, fluoróforo y/o cromóforo adecuados puede detectarse mediante radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o análisis de células individuales basado en citometría de flujo (por ejemplo, análisis FACS). De manera similar, los ácidos nucleicos y/o vectores desvelados en el presente documento pueden usarse con fines de detección o diagnóstico, por ejemplo, usando fragmentos marcados de los mismos como sondas en ensayos de hibridación. Pueden encontrarse protocolos de etiquetado, por ejemplo, en JOHNSON, I. y Spence, M. T.Z. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Life Technologies, 2010. ISBN: 0982927916.
Composiciones
El anticuerpo de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico o el vector desvelado en el presente documento se pueden proporcionar en una composición que además comprende un portador, excipiente o diluyente adecuado. Se prefiere mucho una composición que comprende un anticuerpo descrito en el presente documento.
Tal composición puede ser, por ejemplo, una composición de diagnóstico o farmacéutica. Para fines terapéuticos, dicha composición es una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de anticuerpo descrito en el presente documento y además un portador, excipiente o diluyente farmacéutico, es decir, un portador, excipiente o diluyente que no es tóxico a las dosis y concentración empleadas.
Los "portadores", "excipientes" o "diluyentes" adecuados incluyen, sin limitación: (i) tampones tales como fosfato o ácidos orgánicos tales como citrato; (ii) antioxidantes tales como ácido ascórbico y tocoferol; (iii) conservantes tales como 3-pentanol, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, alcohol bencílico, alquil parabeno, catecol o ciclohexanol; (iv) aminoácidos, tales como, por ejemplo, histidina, arginina; (v) péptidos, preferentemente hasta 10 residuos tales como polilisina; (vi) proteínas, tales como albúmina de suero bovino o humano; (vii) polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; (viii) monosacáridos, disacáridos, polisacáridos y/u otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, sacarosa, manitol, trehalosa, sorbitol, aminodextrano o poliamidoaminas; (ix) agentes quelantes, por ejemplo, EDTA o EGTA; (x) iones formadores de sal tales como sodio o potasio; (xi) complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o (xii) tensioactivos iónicos y no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICs ™ o polietilenglicol (PEG).
Muchos de dichos compuestos de ejemplo tienen funciones diferentes y/o a veces dobles o múltiples y pueden, por ejemplo, actuar como portador y diluyente. También debe entenderse que la composición puede comprender más de uno de cada portador, diluyente o excipiente.
El anticuerpo, las secuencias de ácido nucleico o el vector se pueden proporcionar sobre materiales de soporte sólidos tales como perlas y micropartículas. Típicamente, las moléculas se unen a dicho portador mediante un enlace covalente (que implica opcionalmente un enlazador), pero también pueden adherirse de forma no covalente a dicho portador o mezcla. Dichas perlas y micropartículas pueden comprender, por ejemplo, almidón, celulosa, poliacrilato, poliglicolato de poliacetato, poli(lactida-co-glicólido), látex o dextrano.
Aplicaciones terapéuticas
Las moléculas descritas en el presente documento, en particular el anticuerpo, miembro de unión, ácido nucleico o vector, son útiles como medicamento. Típicamente, dicho medicamento comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de las moléculas proporcionadas en el presente documento. Por consiguiente, dichas moléculas pueden usarse para la producción de un medicamento útil en el tratamiento de trastornos relacionados con IL-1 beta.
En un aspecto, se proporciona un método para tratar un trastorno relacionado con IL-1 beta que comprende las etapas de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de las moléculas descritas en el presente documento, en particular el anticuerpo, a un sujeto que lo necesite. En una realización, la composición farmacéutica anterior que comprende tal cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo se administra a dicho sujeto.
El término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo, ácido nucleico, vector o célula huésped de la presente invención, a un sujeto que lo necesite para prevenir, curar, retrasar la aparición y/o progresión, reducir la gravedad de, estabilizar, modular, curar o mejorar uno o más signos y/o síntomas de un trastorno relacionado con IL-1 beta. Típicamente, el anticuerpo, ácido nucleico, vector o célula huésped se proporciona en una composición farmacéutica que incluye las descritas anteriormente en el presente documento.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad a la que el régimen de dosificación aplicado produce el efecto terapéutico deseado, es decir, para alcanzar los objetivos del tratamiento como se ha definido anteriormente. La dosis dependerá de diversos factores, incluidos factores clínicos y del paciente (por ejemplo, la edad, el peso, el sexo, el historial clínico del paciente, la gravedad del trastorno y/o la respuesta al tratamiento), la naturaleza del trastorno que se está tratando, la composición particular a administrar, la vía de administración y otros factores.
El sujeto que necesita tal tratamiento puede ser un ser humano o un animal no humano, por ejemplo, un ratón, rata, conejo, mono, perro, caballo, vaca, pollo, cobaya o cerdo. Típicamente, al sujeto se le diagnostica un trastorno relacionado con IL-1 beta o puede adquirir tal trastorno.
Ejemplos de trastornos relacionados con IL-1 beta, en los que los antagonistas de IL-1 beta han mostrado efectos terapéuticos incluyen, sin limitación, retinopatía diabética proliferativa, artritis gotosa, síndrome de Schnitzler, artritis idiopática juvenil sistémica, artritis reumatoide, artritis gotosa aguda, artritis gotosa crónica, urticaria, vasculitis, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, espondilitis anquilosante, osteomielitis multifocal recurrente, policondritis recidivante, síndrome periódico asociado a ciropirina (Cyropyrin-Associated Periodic Syndrome, CAPS), enfermedad de Behget, fiebre mediterránea familiar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, polimialgia reumática, mutaciones NALP3, pioderma gangrenoso, urticaria idiopática crónica, artrosis, degeneración macular húmeda relacionada con la edad, síndrome del ojo seco, psoriasis pustulosa, síndrome de sinovitis-acné-pustulosis-hiperostosis-osteítis, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de fiebre periódica-adenitis-faringitis-úlcera aftosa, enfermedad de Still del adulto, deficiencia de mevalonato cinasa, aterosclerosis, síndrome periódico asociado al receptor de TNF (TNF-Receptor Associated Periodic Syndrome, TRAPS), acné vulgar y/o acné inverso.
El término "CAPS" o síndrome periódico asociado a criopirina debe entenderse que incluye el síndrome autoinflamatorio familiar por frío (Familial Cold Autoinflammatory Syndrome, FCAS), el síndrome de Muckle-Wells (Muckle-Wells Syndrome, MWS) y la enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición neonatal, también conocida como síndrome neurológico, cutáneo y articular crónico infantil (Chronic Infantile Neurological Cutaneous and Articular, CINCA).
La composición farmacéutica se puede aplicar por diferentes vías de administración. La administración puede realizarse, por ejemplo, pero sin limitación, por vía parenteral, por ejemplo, intramuscular, subcutánea, epicutánea, intravenosa como un bolo o por infusión continua, intraarticular, intrasinovial, intracerebral, intracerebrospinal, intratecal, epidural o intraperitoneal; oral; rectal; urogenital; tópica, por ejemplo, a la piel o al ojo; intravítrea; intraocular; ótica; intranasal; por inhalación; por vía dérmica tal como por vía intradérmica o transdérmica; sublingual; bucal, por ejemplo. Se prefieren las vías de administración tópica, rectal, intranasal, intravenosa y/o intradérmica.
El anticuerpo de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico, el vector o la célula huésped pueden combinarse con uno o más compuestos terapéuticamente eficaces adicionales. Dicho compuesto puede ser capaz de interrumpir la señalización a través del receptor de IL-1 o, como alternativa, inhibir una o más dianas diferentes tales como, por ejemplo, otros mediadores de respuestas inflamatorias. Dicho compuesto o compuestos se pueden administrar simultánea o secuencialmente.
Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo también puede marcarse radiactivamente o unirse a una toxina o unirse a otra función efectora como se ha descrito anteriormente.
Aplicaciones de diagnóstico y/o fines de detección
El anticuerpo de la presente invención puede usarse con fines de detección o diagnóstico in vivo y/o in vitro. Por ejemplo, el experto conoce una amplia gama de inmunoensayos que implican anticuerpos para detectar la expresión en células o tejidos específicos. Análogamente, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped descrita previamente se pueden usar en consecuencia como se detalla en esta sección. En una realización, el método no se pone en práctica en el cuerpo humano o animal.
Para tales aplicaciones, el anticuerpo, la secuencia de ácido nucleico, el vector o la célula huésped que se desvelan en el presente documento pueden estar marcados o sin marcar. Por ejemplo, un anticuerpo no marcado puede usarse y detectarse mediante un anticuerpo secundario que reconoce un epítopo en el anticuerpo descrito en el presente documento.
En otra realización, el anticuerpo, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped se conjugan con una o más sustancias que pueden reconocerse por una o más sustancias detectoras, por ejemplo, estando el anticuerpo conjugado con biotina que puede detectarse por estreptavidina. Análogamente, los ácidos nucleicos y/o vectores desvelados en el presente documento pueden usarse con fines de detección o diagnóstico, por ejemplo, usando fragmentos marcados de los mismos como sondas en ensayos de hibridación.
En determinadas realizaciones, cualquiera de las moléculas proporcionadas en el presente documento, en particular el anticuerpo, es útil para detectar la presencia de IL-1 beta, incluyendo preferentemente IL-1 beta de longitud completa, fragmentos de la misma y/o precursores de la misma, en una muestra, preferentemente una muestra biológica. El término "detectar" abarca la detección cuantitativa y/o cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido de pacientes humanos. Los ejemplos no limitantes de muestras biológicas incluyen sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, biopsia, linfa y/o tejidos no sanguíneos.
En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti IL-1 beta como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo a IL-1 beta y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo y la IL-1 beta. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se usa un anticuerpo anti IL-1 beta para seleccionar sujetos aptos para la terapia con el anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, donde IL-1 beta es un biomarcador para la selección de pacientes.
En un aspecto adicional, se proporciona un kit que comprende el anticuerpo, una combinación empaquetada de reactivos con instrucciones para realizar el ensayo de detección o diagnóstico. Los reactivos se proporcionan típicamente en cantidades predeterminadas de polvos secos, normalmente liofilizados, incluyendo excipientes que después de la disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada. También pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores y/o tampones. Si el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá normalmente los sustratos y cofactores correspondientes. Análogamente, cualquier miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped descrita previamente se pueden usar en consecuencia como se detalla en esta sección.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Diseño de anticuerpos anti IL-1 beta humana
Las cadenas pesadas y ligeras variables de AB7 se unieron mediante el enlazador peptídico de SEQ ID No.: 14 para producir un scFv que resultó ser inestable.
Se identificaron las CDR del anticuerpo anti IL-1 beta humana que comprendían la SEQ ID No.: 22 y la SEQ ID No.: 23 y se injertaron en dos regiones marco de scFv humanas estables, consistiendo cada una en una región variable de cadena ligera humana del extremo N, una secuencia enlazadora y una región variable de cadena pesada humana del extremo C. Ambas regiones marco de scFv difieren entre sí en cinco posiciones de aminoácidos en la cadena pesada. Los dos scFv resultantes se denominaron DLX2260 y DLX2289 (véase la figura 1).
La región marco DLX2289 se obtiene a partir de una inmunoglobulina humana descrita en el documento WO 03/097697 A (ESBATech AG), mientras que la región marco DLX2260 se deriva de la misma; la secuencia de la región marco VH de esta última se ha modificado para la humanización y estabilización de anticuerpos de conejo, véase, por ejemplo, el documento WO 2009/155726 A (ESBATech, AN ALCON BIOMEDICAL RESEARCH UNIT LLC; BORRAS, L. et al. Generic approach for the generation of stable humanized single-chain Fv fragments from rabbit monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry 2010, vol. 285, n.° 12, pág. 9054-9066).
Los scFv se expresaron como cuerpos de inclusión en E. coli (BL21 (DE3); Novagen, cat. n.° 69450-3). Después de recoger las células, los cuerpos de inclusión se aislaron y se purificaron. Las proteínas se replegaron mediante métodos estándar y los scFv monoméricos se purificaron usando cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones de los picos monoméricos se recogieron y se caracterizaron por la unión a antígeno y la potencia de neutralización de lL-1 beta en un ensayo basado en células.
Ejemplo 2 - Unión a IL-1 beta y neutralización por DLX2260 y DLX2289
En un ELISA, se confirmó el reconocimiento de IL-1 beta humana recombinante (rh) por DLX2260 y DLX2289. Los scFv se recubrieron sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos a una concentración de 10 mcg/ml durante una noche a 4 °C en glicina 50 mM, NaCl 50 mM, pH 10,0. Después del bloqueo con leche desnatada en polvo al 5 %, se añadió rhIL-1 beta biotinilada (R&D systems, cat. n.° NFLB0) a concentraciones que variaban de 5 a 20 ng/ml. La IL-1 beta unida se detectó mediante estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, cat. n.° 554060). El ELISA se desarrolló con sustrato BM Blue POD (Roche Applied Science) y se midió la absorbancia a 450 nm. Los resultados (véase la figura 2A) muestran que ambos scFv se unen igualmente bien a rhIL-1 beta.
La potencia de DLX2260 y DLX2289 para neutralizar la función biológica de la IL-1 beta humana se analizó en un ensayo de proliferación celular usando linfocitos T auxiliares de ratón D10.G4.1 (DSMZ, cat. n.° ACC45). Se sembraron células D10.G4.1 en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 4000 células por pocillo en RPMI 1640 sin rojo de fenol (Gibco, Life Technologies, cat. n.° 32404014) complementado con FBS al 10 % (Gibco, Life Technologies, cat. n.° 10270106), glutamina 2 mM (Gibco, Life Technologies, cat. n.° 25030024), PenStrep al 1% (Gibco, Life Technologies, cat. n.° 15070063) y 10 ng/ml de rhIL-2 (Peprotech, cat. n.° 200-02) y se cultivaron durante 4-6 horas. Los scFv y el anticuerpo de control (R&D systems, cat. n.° MAB201) se preincubaron con rhIL-1 beta (Peprotech, cat. n.°200-01B) en medio de cultivo celular durante 2 horas a 37 °C. Las mezclas se añadieron a las células a una concentración final de 10 pg/ml de rhIL-1 beta. El control de proliferación positivo contenía 10 pg/ml de rhIL-1 beta solamente. Las células se cultivaron durante 48 horas más. La proliferación inducida por IL-1 beta se cuantificó mediante la adición de XTT (Sigma-Aldrich, cat. n.° X4251-100MG) a una concentración de 1 mg/ml en RPMI sin rojo de fenol con 25 mcM de metosulfato de fenazina (Sigma-Aldrich, P9625-1G). Las células se incubaron con solución XTT durante 4 horas a 37 °C. La absorbancia se determinó a 450 nm y a la longitud de onda de referencia de 620 nm. Tanto DLX2260 como DLX2289 inhibieron la proliferación celular inducida por IL-1 beta (véase la figura 2B) con una eficacia similar. En comparación con la inmunoglobulina de longitud completa de control MAB201 (R&D systems, cat. n.°MAB201), la proliferación celular no se inhibe por completo, aproximadamente el 5% de las células continuó creciendo incluso a las concentraciones más altas de scFv.
Ejemplo 3 - Manipulación de DLX2260
Se eligió DLX2260 como punto de partida para mutaciones de la región marco para mejorar su capacidad de neutralización de IL-1 beta humana. Se introdujeron varias mutaciones en la cadena ligera, así como en las regiones marco de cadena pesada. También se mutó una posición en CDR-H2. Además, tres posiciones de aminoácidos en la región marco de cadena pesada que se sabía que mejoraban la solubilidad de scFv (véase el documento WO2009/155725, ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC) se sustituyeron por aminoácidos con cadenas laterales más hidrófilas. En total, se diseñaron tres scFv diferentes (véase la figura 1). DLX2332 es un 97 % idéntico a DLX2260, mientras que DLX2296 es un 93 % idéntico a DLX2260. DLX2295 contiene las mismas mutaciones que DLX2296 pero incluye además las tres sustituciones de solubilidad descritas anteriormente. DLX2295 es un 92 % idéntico a DLX2260.
Las secuencias de ADN que codifican los tres scFv se clonaron en un vector de expresión bacteriano, las proteínas se expresaron y se purificaron como se ha descrito anteriormente. Los scFv monoméricos se caracterizaron por sus características de unión a IL-1 beta, neutralización y estabilidad.
Ejemplo 4 - Unión a IL-1 beta y neutralización por DLX2295, DLX2296 y DLX2332
El reconocimiento de rhIL-1 beta por DLX2295, DLX2296 y DLX2332 se confirmó por ELISA (figuras 3A y 3B). Se usó como control un scFv de especificidad irrelevante. Se revistieron con rhIL-1 beta (Peprotech, cat. n.°200-01B) inmunoplacas Maxisorp de 96 pocillos NUNC. Después del bloqueo, los scFv se valoraron de 10 a 3000 ng/ml. Los scFv unidos se detectaron mediante la proteína L-HRP (Sigma-Aldrich, cat. n.° P3226), y el ELISA se desarrolló usando sustrato BM Blue POD (Roche Applied Science, cat. n.° 11484281001). Para fines de cuantificación, la absorción se midió a 450 nm usando un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices).
Se realizó un ensayo de fibroblastos para determinar la potencia de un compuesto para neutralizar la actividad de IL-1 beta. Los fibroblastos dérmicos humanos (NHDF-Neo, cat. n.° CC-2509, Lonza Walkersville, EE.UU.), tras la activación por IL-1 beta, liberan específicamente IL-6 que es cuantificable mediante ELISA. La neutralización de IL-1 beta disminuye la cantidad de IL-6 liberada de tales fibroblastos. La potencia inhibidora de los anticuerpos anti IL-1 beta generalmente se cuantifica midiendo la reducción semimáxima (CI50) de la liberación de IL-6 inducida por IL-1 beta. Se sembraron fibroblastos dérmicos humanos en microplacas de 96 pocillos a 5000 células/pocillo aproximadamente 16-20 horas antes de la adición de muestras que contenían el estímulo IL-1 beta. Los fibroblastos se cultivaron en medio basal de fibroblastos (FBM; Lonza, cat. n.°CC-3131) con complementos (hFGF-B, insulina, FBS, GA-1000) como describe el proveedor de células (Lonza Walkersville, EE.UU.: Clonetics™ Dermal Fibroblast Cell Systems).
Antes de la siembra, se eliminó el FBM y las células se lavaron con medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco, Life Technologies, cat. n.° 11880) para eliminar los factores de crecimiento. A continuación, las células se cultivaron durante 7 horas en medio DMEM complementado con FBS al 2 %. Los anticuerpos se preincubaron en medio DMEM complementado con FBS al 2 % con rhIL-1 beta durante 1 hora a 37 °C. La mezcla se añadió a las células a una concentración final de 10 pg/ml de IL-1 beta. Como control, se añadieron 10 pg/ml de rhIL-1 beta a las células sin ningún anticuerpo anti IL-1 beta. Las células se incubaron con la mezcla de anticuerpos IL-1 beta/anti IL-1 beta durante 18-24 horas, y los sobrenadantes del cultivo celular se analizaron para determinar la liberación de IL-6 usando el kit ELISA de IL-6 humana DuoSet según las instrucciones del fabricante. (R&D Systems, EE.UU., cat. n.° DY206).
Se evaluó la capacidad de neutralización de IL-1 beta de DLX2260, DLX2295, DLX2296 y DLX2332 en el ensayo de fibroblastos dérmicos humanos (NHDF-Neo, cat. n.° CC-2509, Lonza Walkersville, EE.UU.) como se ha descrito anteriormente. Como controles adicionales, se usaron inmunoglobulinas de longitud completa anti IL-1 beta tales como MAB201 (R&D systems, EE.UU., cat. n.°MAB201) y Canakinumab (Novartis, llaris®). En un experimento, se compararon MAB201, DLX2296 y DLX2260 (figura 4). En otra serie experimental, se ensayaron en paralelo MAB201, DLX2295 y Canakinumab (figura 5). Finalmente, se comparó la eficacia neutralizante de DLX2295 y DLX2332 (véase la figura 6). MAB201 y DLX2295 mostraron la CI50 más baja ambos con aproximadamente 2-5 pM, mientras que DLX2296 mostró una CI50 (considerando un 20 % de actividad residual) de aproximadamente 8 pM y 2260 una CI50 considerando un 20 % de actividad residual) de aproximadamente 100 pM. Los valores de CI50 son valores medios de tres experimentos independientes. Por lo tanto, el scFv monovalente DLX2295 es tan potente como la IgG MAB201 bivalente. Para todos los scFv (DLX2295, DLX2296, DLX2260 y DLX2332) ensayados en el ensayo de fibroblastos se observó actividad residual, es decir, la actividad de IL-1 beta no se inhibió completamente. Esta observación concuerda con los resultados obtenidos en el ensayo de proliferación D10.G4.1.
Ejemplo 5 - Estabilidad
Se evaluó la estabilidad de la proteína DLX2295 a diferentes temperaturas. Con este fin, se desarrolló cromatografía de exclusión por tamaño HPLC (Dionex, sistema Summit) (Tosoh, TSKgel G2000SWxl, cat. n.° 08540) para determinar el porcentaje de proteína scFv monomérica no degradada después de un mes a TA en PBS a pH 7,2. El porcentaje de monómero se midió en el punto de partida del estudio (T0) y después de un mes para 0,6 mg/ml de DLX2295. Los resultados del estudio de estabilidad se enumeran en la tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000017_0001
La estabilidad térmica de DLX2260, DLX2289, DLX2295, DLX2296 y DLX2332 se analizó mediante fluorimetría de barrido diferencial (DSF). Para esta medición, se usó un dispositivo de PCR en tiempo real (Corbett, Rotor-Gene) para calentar los scFv en un gradiente de temperatura mientras se medía simultáneamente la fluorescencia. Las muestras contenían 0,5 mg/ml de scFv y 20x SYpRO® Orange (Sigma-Aldrich, cat. n.° S5692, 5000x) en PBS a pH 7,2. El gradiente de temperatura se fijó de 30 °C a 95 °C (con aumento en pasos de 1 °C, tiempo de retención de 5 segundos por paso). La fluorescencia se excitó a 470 nm, la emisión se detectó a 555 nm. Las temperaturas de fusión del punto medio (Tm) se calcularon utilizando el software 1.7 de Rotor-Gene 6000 Series. La Tm de los 5 scFv se resume en la tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000017_0002
Ejemplo 6 - Reactividad cruzada de DLX2295
La reactividad cruzada de DLX2295 con homólogos de IL-1 beta de otras especies distintas de los seres humanos se evaluó en ELISA. Se investigó la unión a las proteínas IL-1 beta expresadas de manera recombinante de las siguientes especies: macaco cangrejero (Sino Biological Inc., EE.UU., cat. n.° 90010-CNAE), macaco de la India (R&D Systems, EE.UU., cat. n.° 1318-Rl/c F) e IL-1 beta de ratón (BioLegend, cat. n.° 575102). La unión de DLX2295 se comparó con anticuerpos de control positivos para ELISA (R&D Systems, EE.UU., IgG policlonal anti IL-1 beta humana de cabra, cat. n.° AB-201-NA; BioLegend, Inc., EE.UU., anticuerpo de biotina anti ratón/IL-1 beta de rata, cat. n.° 503505). Brevemente, se recubrieron proteínas a una concentración de 2 mcg/ml durante una noche a 4 °C en microplacas Maxisorp de 96 pocillos en p Bs a pH 7,2. Después del bloqueo con leche desnatada en polvo al 5 %, se añadieron a los pocillos concentraciones crecientes (0,1 mcg/ml, 0,3 mcg/ml y 1,0 mcg/ml) de DLX2295. El recubrimiento exitoso de cada proteína se confirmó por separado aprovechando los anticuerpos de control específicos de IL-1 beta. Mientras que DLX2295 se detectó mediante la proteína L-HRP (Sigma-Aldrich, EE.UU., cat. n.° P3226), los anticuerpos de control se detectaron mediante IgG-HRP anti cabra de conejo (Southern Biotech, cat. n.° 6160-05) o por estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, EE.UU., cat. n.° 554060). Los ELISA se desarrollaron con sustrato BM Blue Po D (Roche Applied Science) y se midió la absorbancia a 450 nm. DLX2295 reconoció igualmente bien IL-1 beta humana, de macaco cangrejero y macaco de la India, mientras que el reconocimiento de IL-1 beta de ratón fue más débil.
Listado de secuencias
Las secuencias desveladas en el presente documento son:
SEQ ID NO: 1 - VL CDR1
RASQDISNYLS
SEQ ID NO: 2 - VL CDR2
YTSKLHS
SEQ ID NO: 3 - VL CDR3
LQGKMLPWT
SEQ ID NO: 4 - VH CDR1
FSLSTSGMGVG
SEQ ID NO: 5-VH CDR2
HIWWDGDESYNPSLKS
SEQ ID NO: 6 - VH CDR3
NRYDPPWFVD
SEQ ID NO: 7 - VL de DLX2260 y DLX2289
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLIYYTSKLHSGV
PSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCLQGKMLPWTFGQGTKLTVLG
SEQ ID NO: 8 - VL de DLX2295 y DLX2296
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLIYYTSKLHSG
VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYFCLQGKMLPWTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO: 9 - VH de DLX2289 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGMGVGWVRQAPGKGLEWVSHIW WDGDESYNPSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRYDPPWFVD WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 10 - VH de DLX2260 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSTSGMGVGWVRQAPGKGLEWVGHIW WDGDESYNPSLKSRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNRYDPPWFVD WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 11 - VH de DLX2296 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAFSGFSLSTSGMGVGWIRQAPGKGLEWVSHIW WDGDESYNPSLKGRFTISKDTSRNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARNRYDPPWFVD WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 12 - VH de DLX2295 EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAFSGFSLSTSGMGVGWIRQAPGKGLEWVSHIW WDGDESYNPSLKGRFTISKDTSRNTVYLQMNSLRAEDTASYFCARNRYDPPWFVD WGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 13 - VH de DLX2332 EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGMGVGWVRQAPGKGLEWVGHIW WDGDESYNPSLKSRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTASYFCARNRYDPPWFVD WGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 14 - enlazador
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 15 - secuencia de ácido nucleico de DLX2295
G AC ATT C AG AT G ACG C AGTCT CCGTCTACCCTGTCCG CAAGT GTGGGTGATCGC GTGACAATCACCTGTCGTGCCTCACAGGACATTTCCAACTACCTGTCCTGGTATC AACAGAAACCGGGGAAAGCACCGAAACT CTT GAT CTACT ATACGAGCAAACTGC ATAGTGGAGTACCTAGCCGCTTTTCAGGCTCTGGCAGTGGTGCGGAATTTACGC T G ACCATTT CAAGCCT G CAACCCG AAG ATTT CG CG ACTTACTT CT GCTT AC AG G G GAAGATGCTTCCGTGGACCTTTGGCCAGGGGACTAAACTGGAGATCAAGCGTG GAGGTGGTGGATCCGGCGGTGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGTTCGGGCGGCG GTGGCAGCGAAGTCCAGCTGGTCGAATCAGGCGGTGGTTCGGTTCAACCAGGC GGCTCTTTACGCCTCTCGTGTGCCTTTTCCGGGTTCAGTCTGAGCACGTCGGGA ATGGGTGTTGGGTGGATTCGCCAAGCTCCGGGTAAAGGCTTGGAATGGGTGAG CCACATTTGGTGGGATGGAGATGAGAGCTATAACCCGTCCCTTAAAGGGCGGTT TACCATCTCGAAAGACACCAGCCGCAATACCGTGTATCTGCAGATGAACAGTCT GCGTGCTGAAGATACAGCCTCGTACTTTTGCGCGCGTAATCGCTATGATCCGCC TTGGTTCGTAGACTGGGGTCAAGGCACTACGGTCACCGTTAGCTCT SEQ ID NO: 16 - DLX2289 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLIYYTSKLHSGV PSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCLQGKMLPWTFGQGTKLTVLGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGMGVGW VRQAPGKGLEWVSHIWWDGDESYNPSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAKNRYDPPWFVDWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 17-DLX2260
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLIYYTSKLHSGV PSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCLQGKMLPWTFGQGTKLTVLGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSTSGMGVGW VRQAPGKGLEWVGHIWWDGDESYNPSLKSRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTA VYYCARNRYDPPWFVDWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 18 - DLX2296 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLIYYTSKLHSG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYFCLQGKMLPWTFGQGTKLEIKRGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAFSGFSLSTSGMGVGWI RQAPGKGLEWVSHIWWDGDESYNPSLKGRFTISKDTSRNTVYLQMNSLRAEDTAV YFCARNRYDPPWFVDWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 19 - DLX2295 DiQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLlYYTSKLHSG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYFCLQGKMLPWTFGQGTKLEIKRGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAFSGFSLSTSGMGVGW IRQAPGKGLEWVSHIWWDGDESYNPSLKGRFTISKDTSRNTVYLQMNSLRAEDTAS YFCARNRYDPPWFVDWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 20 - DLX2332 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLIYYTSKLHSGV PSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYFCLQGKMLPWTFGQGTKLTVLGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGMGVGWV RQAPGKGLEWVGHIWWDGDESYNPSLKSRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAS YFCARNRYDPPWFVDWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 21 - VH CDR2 de DLX2295

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un scFv humanizado contra IL-1 beta que comprende una secuencia de cadena ligera variable como se expone en la SEQ ID No: 8 y una secuencia de cadena pesada variable como se expone en la SEQ ID No: 12,
donde la secuencia de cadena ligera variable, VL, y la secuencia de cadena pesada variable, VH, están conectadas por un enlazador con una orientación de extremo N-VL-enlazador-VH-extremo C y
donde el enlazador comprende de 10 a 25 aminoácidos que comprenden de dos a cinco repeticiones (GGGGS).
2. El scFv de la reivindicación 1, que comprende la secuencia enlazadora como se expone en la SEQ ID No: 14.
3. El scFv de la reivindicación 1 o 2, que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID No.: 19.
4. Un anticuerpo que comprende las secuencias VL y VH del scFv según las reivindicaciones 1 a 3.
5. El scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el anticuerpo de la reivindicación 4, que está modificado químicamente.
6. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el anticuerpo de la reivindicación 4.
7. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6.
8. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de la reivindicación 7.
9. Una composición que comprende el scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, el anticuerpo de la reivindicación 4 o 5, el ácido nucleico de la reivindicación 6, el vector de la reivindicación 7 o la célula huésped de la reivindicación 8; y además un portador, diluyente o excipiente adecuado.
10. El scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, el anticuerpo de la reivindicación 4 o 5, el ácido nucleico de la reivindicación 6, el vector de la reivindicación 7 o la célula huésped de la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento, prevención o retraso en la progresión de una enfermedad mediada por IL-1 beta.
11. El scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 o el anticuerpo de la reivindicación 4 o 5 para su uso como medicamento o para su uso en diagnósticos in vivo.
12. Uso del scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 o del anticuerpo de la reivindicación 4 o 5 para fines de detección in vitro.
13. Un método para producir el scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, comprendiendo el anticuerpo de la reivindicación 4 o 5
las etapas de (A)
(i) cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 para que se exprese el fragmento de anticuerpo o el anticuerpo;
(ii) recuperar el scFv o el anticuerpo; y
(iii) purificar opcionalmente el scFv o el anticuerpo;
o (B)
(a) proporcionar un sistema acelular;
(b) proporcionar un molde de producto de ácido nucleico;
(c) permitir la transcripción y traducción de dicho molde de producto de ácido nucleico;
(d) recuperar el scFv o el anticuerpo; y
(e) purificar opcionalmente el scFv o el anticuerpo.
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