SK122890A3

SK122890A3 - Dna fragment, recombinant dna and process for producing l-lysine

Info

Publication number: SK122890A3
Application number: SK1228-90A
Authority: SK
Inventors: Bern Bachman; Georg Thierbach; Jorn Kalinowski; Alfred Puhler
Original assignee: Degussa
Priority date: 1989-03-14
Filing date: 1990-03-14
Publication date: 1999-02-11
Also published as: SK279719B6; DE59006167D1; JPH03219885A; EP0387527A1; ES2056263T3; JP3000087B2; DE3908201A1; EP0387527B1; ATE107699T1

Description

Fragment DNA, rekombinantná DNA a spôsob výroby L-lyzínu

Oblasť techniky

Vynález sa týka fragmentu DNA, ktorý sa nachádza v plazmide, rekombinantnej DNA odvodenej od tohto plazmidu a spôsobu výroby L-lyzínu za použitia mikroorganizmu obsahujúceho vyššie uvedený plazmid alebo z neho odvodenú rekombinantnú DNA.

Doterajší stav techniky

Corynebacterium glutamicum a príbuzné rody, ako sú napríklad Brevibacterium lactofermentum a Brevibacterium fl.avum, sú známe ako mikroorganizmy tvoriace aminokyseliny.

Aby sa produktivita zvýšila, uskutočňujú sa umelé mutácie .

Príkladmi takto pripravených umelých mutantov sú napríklad lyzín produkujúce kmene Corynebacterium glutamicum, ktoré okrem rezistencie AEC (AEC = S-2-aminoetylcysteín), preukazujú s ňou spojenú homoserínovú a leucínovú auxotrofiu (US patentový spis č. 3 708 395) alebo sú citlivé voči metionínu (US patentový spis č. 3 871 960).

Okrem týchto klasických metód boli objavené vektorové systémy, ktoré umožňujú transformáciu mikroorganizmov rodov Corynebacterium a Brevibacterium (DE-OS č. 37 37 719, DE-OS č. 38 41 453, Thierbach G., Schwarzer A., Puhler A., Appl. Microbiol. Biotechnol. 29 (1988) 356-362).

V EP-A-0219 027 sa popisuje spôsob výroby rôznych aminokyselín, pri ktorom sa rekombinantnou DNA transformujú rody Corynebacterium a Brevibacterium, a tak sa zvyšujú produkované množstvá aminokyselín.

Rekombinantná DNA obsahuje pritom fragment DNA, kódujúci syntézu aspartátsemialdehyddehydrogenázy alebo aspartátaminotransferázy.

Z US patentového spisu č. 4 346 170 je známe klonovanie genetickej informácie riadiacej, tvorbu lyzínu v Escherichia coli, ktorá pochádza z kmeňa toho istého rodu s rezistenciou voči analógom L-lyzínu, ako je napríklad AEC.

Predmet US patentového spisu č. 4 560 654 sa týka tej istej oblasti. V tomto prípade sa však v lyzín-auxotrofnom kmeni Corynebacterium.glutamicum klonuje genetická informácia z AEC-rezistentného kmeňa toho istého rodu z toho dôvodu, aby sa vylučoval lyzín.

Identita klonovaného fragmentu DNA nie je zrejmá.

Tiež z EP č. 88 166 je možné iba vyrozumieť, že kmeň Corynebacterium glutamicum vylučuje lyzín, keď transformáciou získal fenotyp AEC rezistencie.

Rekombinantný plazmid pAec5 použitý na tento účel obsahuje 3,9 kb fragment chromozómovej DNA, vsadený na štiepne miesto Bglll vektora pCG 11.

Úlohou predloženého vynálezu je zmeniť regulovatelnosť dôležitého enzýmu biosyntézy lýzínu v mikroorganizme rodu

Corynebacterium alebo Brevibacterium tak, aby sa získal producent lyzínu alebo aby sa zvýšila schopnosť produkcie lyzínu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je fragment DNA, ktorý sa skladá z nukleotidovej sekvencie s dĺžkou 2,1 kb, ohraničený Pst 1 a Xho 1 miestami štiepenia, ktorého podstata spočíva v tom, že aminokyselinová sekvencia uvedená na obr. 5 kóduje produkciu proteínov, vedúcich k aktivite aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy (asd) a k deregulácii aspartátkinázy (lysC), je obsiahnutý v plazmide pCS2, ktorého delečná mapa je uvedená na obr. 3, uloženom v Corynebacterium qlutamicum pod číslom DSM 5086.

Predmetom vynálezu je ďalej aj rekombinantná DNA odvodená z plazmidu pCS2, charakterizovaná delečnou mapou zodpovedajúcou označeniu pCS26, uvedenou na obr. 3.

Predmetom vynálezu je ďalej aj rekombinantná DNA odvodená z plazmidu pCS2, charakterizovaná delečnými mapami zodpovedajúcimi označeniam pCS23 alebo pCS233 na obr. 3.

Predmetom vynálezu je ďalej aj spôsob výroby L-lyzínu fermentáciou mikroorganizmov rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium produkujúcich túto aminokyselinu, ktorého podstata spočíva v tom, že mikroorganizmy obsahujú plazmid uvedený vyššie alebo niektorú z rekombinantných DNA uvedených vyššie.

Pri výhodnom uskutočnení vyššie popísaného spôsobu sa *

používa mikroorganizmus Corynebacterium DMS 5086.

Vynález sa teda okrem iného týka spôsobu výroby L-lyzínu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa rekombinantná DNA, ktorá pochádza z fragmentu DNA, ktorý má kódovanú genetickú sekvenciu pre produkciu proteínov, ktoré vedú k aspartyl-βsemialdehyddehydrogenázovej (asd) aktivite a/alebo k deregulácii aspartátkinázy, a skladá sa z vektora DNA, inzeruje do mikroorganizmu rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium produkujúceho lyzín, takto získané transformanty sa kultivujú vo vhodnom o sebe známom médiu a vytvorený lyzín sa známymi metódami izoluje.

Ako donorové kmene môžu slúžiť všetky kmene, výhodne baktérie rodu Brevibacterium a Corynebacterium produkujúce lyzín, ktoré obsahujú príslušné sekvencie DNA, najmä však Corynebacterium glutamicum DM 58-1, ktorý bol vyvinutý mutagenézou Corynebacterium ATCC 13032 etylmetánsulfátom a preukazuje AEC-rezistenciu.

Tento kmeň je uložený pod číslom DSM 4697, pričom slúži ako hostiteľská baktéria pre plazmid pDM6. Tento môže odborník známymi spôsobmi oddeliť a tak získať kmeň DM58-1 (FEMS Microbiology Review 32 (1986) 149-157).

Chromozómová DNA sa z donora extrahuje známym spôsobom a spracuje sa reštrikčnou endonukleázou.

Po konštrukcii rekombinantnej DNA zavedením chromozómového fragmentu DNA do vektora prebieha transformácia mikroorganizmu s takto získaným plazmidom, podľa predloženého vy nálezu napríklad pCS2, ktorého resktrikčná schéma je znázornená na obr. 2 a ktorý je v kmeni Corynebacterium glutamicum DM2-l/pCS2 uložený podlá Budapeštianskej zmluvy pod číslom DSM 5086 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových štruktúr.

Výhodný vektorový systém predstavuje pZl (uložený v Corynebacterium glutamicum DM 274-2 pod číslom DSM 4241) alebo i pCV34, pCVX4, pCVXlO, pCVX15, pZ9 a pZ8-l (DE-OS 38 41 454.6) alebo pCV35, pECM3 a pECMl (DE-OS 38 41 453.8).

Použiteľné sú však aj zložené plazmidy, známe z EP-A-93 611, ak samy replikujú v rodoch Corynebacterium alebo Brevibacterium, najmä pAJ 655, pAJ 611, pAJ 440, pAJ 1844 a pAJ 3148 alebo tiež pCG 11, pCE 54 (viď EP-A 0 233 581), a taktiež pUL330 (Santamaria, R. I. a kol., J. Bacteriology 162, (1985) 463-467).

Predmetom prihlášky sú aj mikroorganizmy rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium obsahujúce rekombinantnú DNA a ich použitie na výrobu L-lyzínu fermentáciou.

Klonovaný fragment DNA (viď obr. 2) obsahuje len časť génu aspartátkinázy (LysC), ako aj úplný gén aspartyl-βsemialdehyddehydrogenázy (asd), čo je možné zistiť sekvenčnou analýzou.

Časť tohto génu aspartátkinázy má homologickú sekvenciu DNA k β-podjednotke aspartátkinázy II z Bacillus substilis.

Všetky transformanty, ktorých plazmid má túto sekvenciu (pCS2, pCS22, pCS23, pCS24, pCS26 a pCS233) , obsahujú v po6 rovnaní s chromozómovo kódovaným enzýmom z ATCC 13032 vo vzťahu k feed-back inhibítorom L-lyzínu a L-treonínu značne desenzibilizovanú aspartátkinázu a vykazujú AEC-rezistenciu.

Závery odvodzované z porovnaní homológie, podľa ktorých fragment génu Pst I - Xhol z DM58-1 obsahuje len časť génu LysC (AK), ale úplný gén asd, môžu byť jednoznačne potvrdené pomocou enzýmových meraní.

Žiadny kmeň Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, transformovaný derivátom pCS2 alebo pCS2 neobsahuje prekvapivo zvýšenú aktivitu aspartátkinázy v porovnaní s pôvodným kmeňom (tabuľka 4, stĺpec 3) .

Naproti tomu vo všetkých transfprmantoch, ktorých plazmidy obsahujú štruktúrny gén asd, sa dá zistiť silná superexpresia aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) , (tabuľka 4, stĺpec 2, obr. 3 a 4). Plazmidy pCS23 a deriváty pCS23 nevedú podľa očakávania k superexpresii ASA-DH.

Silná superexpresia ASA-DH, nastávajúca pri klonovaní podľa vynálezu fragmentu DNA pomocou pCS2 a z neho odvodených derivátov, zaručuje účinnú reakciu produktu aspartátkinázovej reakcie, β-aspartylfosfátu, čím dochádza k urýchleniu už neinhibovanej aspartátkinázovej reakcie.

Na základe vysokej lability ASA-DH kolísajú faktory superexpresie, kalkulovateľné zo špecifických aktivít v rozmedzí 31 až 65.

V porovnaní so súčasným stavom techniky dochádza k podstatnému zjednodušeniu tým, že sa po prvé musí izolovať len časť génu LysC, ktorý vedie k deregulácii aspartátkinázy, aby sa dosiahlo alebo zlepšilo vylučovanie lyzínu, a po druhé na základe organizácie LysC a asd v jednom operóne sa môže izolovať gén asd bez dodatočných experimentálnych nákladov spojených s AEC-rezistenciou, nastávajúcou s mutáciou génu LysC, spoločne s génom LysC. Naopak sa môže pomocou mutantov asd izolovať fragment DNA obsahujúci LysC + asd, a to nezávisle od toho, či je LysC mutovaný alebo nie.

1. Charakteristika donora génu DM58-1 a príjemcu génu ATCC 13032

1.1 Získanie a fenotyp kmeňa DM58-1

Kmeň DM58-1 sa získal mutagenézou kmeňa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 bežnou koncentráciou etylmetánsulfonátu.

Selekcia prebiehala kultiváciou takto získanej zmesi mutantov na minimálnom agare so zložením:

glukóza	20 g
síran amónny	10 g
močovina	2,5 g
dihydrogenfosforečnan draselný	i g
heptahydrát síranu horečnatého	0,4 g
heptahydrát síranu železnatého	2 mg
monohydrát síranu mangánatého	1,5 mg
biotín	300 pg
tiamín	900 pg
agar	20 g
destilovaná voda	1 liter (pH 7,0),

ktorý obsahoval vhodnú koncentráciu S-aminoetyl-D,L-cysteinu (AEC<) . Kloň izolovaný z tohto selekčného média a schopný delenia na tomto médiu, neskôr označený ako DM58-1, nenesie okrem svojej AEC-rezistencie žiadne ďalšie genetické znaky.

1.2 Enzvmatické obsahy aspartátkinázv a aspartyl-B-semialdep hvddehydrogenázy v ATCC 13Q32 a DM 58-1

Kmene ATCC 13032 a DM58-1 sa kultivujú za priamo porovnatelných podmienok v Standard I Bouillon (Merck Art. Nr.

7882) s prídavkom 4 g/l glukózy a 1 mM chloridu horečnatého pri 30 °C a 150 otáčok za minútu až do dosiahnutia včasné stacionárnej fázy a centrifugáciou sa od kultivačného média oddelia. Premyjú sa trikrát 100 mM Tris/HCl (pH 7,5); 1 mM DTT a vlhká bunková masa sa suspenduje v jednom objemovom dieli rovnakého tlmivého roztoku.

Takto suspendované bunky sa dezintegrujú v guľovom mlyne (B. Braun Melsungen - MSK-Homogenisator, IMA-Disintegrator S) rozmiešaním s vhodným množstvom sklených guľôčok. Bunkový homogenizát sa oddelí od sklených guľôčok na sklenom filtri a centrifuguje sa 30 minút pri 30000 x g do vyčírenia.

Po 15-hodinovej dialýze v tlmivom roztoku stabilizujúcom enzým sa určila enzýmová aktivita v nasledujúcich testovacích zmesiach:

Test aspartátkinázy:

Tris/HCl (pH 7,5)	100 mM
DTT	1 mM
síran amónny	400 mM
chlorid horečnatý	20 mM
NH₂OH.HC1	400 mM

L-aspartát 300 mM

ATP 40 mM a rôzne množstvá enzýmových preparátov.

Prídavkom 150 μΐ roztoku z 10 % hexahydrátu chloridu železitého; 3,3 % TCA; 0,7 N HCI na 500 μΐ testovanej enzýmovej zmesi sa enzýmová reakcia po tridsaťminútovej inkubácii pri teplote 37 °C zastaví. Z koncentrácie aspartyl-β10 hydroxamátu, zistenej fotometrický (ΔΕ₅₄₀ nm) pomocou kalibračnej krivky, sa kalkuluje enzymatická aktivita v μιηοΐ/mg.min (U/mg) . Príslušné koncentrácie proteínov sa určovali podľa metódy Lowryho a kolektívu (Lowry a kol. J. Biol. Chem. 193, 265 (1951) alebo Bradforda (Bradford Anál. Biochem. 72, 248 (1976) ) .

Test aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy:

dietanolamín (pH 9,0) 120 mM

NaAsO₄ 40 mM

NADP⁺ 1 mM

L-treonín 5 mM aspartyl-0-semialdehyd 1,3 mM a rôzne množstvá enzýmových preparátov v celkovom objeme 1 ml.

Aktivita udávaná v μπιοΐ/mg.min (U/mg) sa počíta cez fotometrický stanovenú (ΔΕ_{540 nm}) rýchlosť syntézy NADPH.

Tabuľka 1 obsahuje špecifické enzýmové aktivity obidvoch enzýmov v surových extraktoch identicky pestovaných a zpracovaných buniek Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 a DM58-1. Okrem porovnateľných obsahov aspartátkinázy u obidvoch kmeňov obsahuje AEC-rezistentný mutant DM58-1 v porovnaní s divým typom približne päťnásobne zvýšenú aktivitu aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy.

1.3 Inhibícia aspartátkinázy z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 a DM58-1 in vitro

Tabuľka 1 ukazuje, že už K. Nakayamom a kol. (K. Nakayama a kol., Agr. Biol. Chem. 30, 611 (1966)) naznačená a S. N. Kara-Murzom a kol. (S. N. Kara-Murza Prikladnaya Biokhimiya; Mikrobiológia 14, 345 (1978)) presnejšie preskúmaná inhibícia enzýmov divého typu Corynebacterium glutamicum je schopná reprodukcie. V porovnaní s tým je značne rozdielny charakter enzýmu AEC-rezistentných mutantov DM58-1, ktorých aspartátkináza už nie je koncentrovane inhibovateľná L-lyzínom + L-treonínom. Látkou S-aminoetyl-D,L-cysteínom, pôsobiacim na enzým z ATCC 13032 ako analóg lyzínu, je enzým mutantov taktiež len nepatrne ovplyvňovaný.

Tabuľka 1

Obsah enzýmov a vlastnosti aspartátkinázy (AK) a aspartyl-βsemialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 a DM58-1

'·' Kmeň	ATCC13032	DM58-1
AK (U/mq)	0,016	0,011
ASA-DH	0,06	0,33

tu/mq)

Kombinácie	Inhibícia
inhibítorov	AK (%)
1 0 mM	L-Lys	89	1 2
1 mM
10 mM	L-Lys	95	2
1 0 mM	L-Thr
10 0 mM	L-Lys	99	21
1 0 mM	L-Thr
1 0 mM	AEC	1 2	0
1 mM	L-Thr
1 0. mM	AEC	t, 1	0
1 0 mM	L-Thr
100 mM	AEC	95	7
1 0 mM	L-Thr

AEC: S-(aminoetyl)-D,L-cysteín

2. Klonovanie fragmentu DNA kmeňa Corynebacterium glutamicum DM58-1, ktorý kóduje pre feed-back rezistentnú aspartátkinázu

2.1 Klonovanie

Izoluje sa celková DNA z kmeňa Corynebacterium glutamicum DM58-1 spôsobom popísaným Charterom a kol. (Charter a kol. Curr. Topics Microb. Immunol. 96, 69 (1982)) a parciálne sa naštiepi reštrikčným enzýmom Pstl. Vektor pZl (obr.

1), ktorý je popísaný v nemeckej patentovej prihláške č. 37 37 729.9, sa linearizuje pomocou Pstl a spracovaním alkalickou fosfatázou sa defosforyluje. Vektor DNA a DM58-1 DNA sa zmiešajú a spracujú sa T4 DNA-ligázou, ako sa popisuje Maniatisoma kol. (Maniatis, T. a kol., Molecular Cloning,

A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982).

Transformácia Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ligačnou zmesou sa uskutočňuje spôsobom popísaným Thierbachom a kol. (Thierbach, G. a kol., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356 (1988)).

Na obr. 1 je znázornená reštrikčná schéma plazmidu pZl. Hrubá čiara znázorňuje podiel pHM1519 a tenká čiara znázorňuje podiel pACYC177. Označenie Ap^R = gén ampicilínovej rezistencie a Km³ = gén kanamycínovej rezistencie.

Transformačná zmes sa zaočkuje na agarové platne s RCG/E agarom s 300 μg/ml· kanamycínu a tieto platne sa inkubujú jeden týždeň pri teplote 30 ’C. Potom sa tieto agarové platne prepečiatkujú na agarové platne s agarom MM (Katasumata, R. a kol., J. Bact. 159, 306 (1984)) s 50 mM AEC a 50 mM L-treonínu a tieto sa kultivujú jeden deň pri teplote 30 ’C. Kolónie, ktoré na tomto agare mohli rásť, sa preočkujú na agar MM, ktorý dodatočne obsahuje AEC, L-treonín a 10 gg/ml kanamycínu, aby sa získali jednobunkové kolónie. Plazmid DNA sa izoluje z takéhoto klonu, označeného ako pCS2, a použije sa na transformáciu Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. 59 zo 62 preskúšaných transformantov rezistentných na kanamycín sa javilo rezistentných voči inhibícii 50 mM AEC a 50 mM L-treonínu. Plazmid pCS2 sa ďalej charakterizoval pomocou reštrikčnej analýzy. Obsahuje asi 9,9 kb dlhú inzerciu v štiepnom mieste PstI vektora pZl, ktorý má dĺžku 6,9 kb.

Na obr. 2 je znázornená reštrikčná schéma plazmidu pCS2 v linearizovanej forme.

V hornej časti obr. 2 sú uvedené pozície rôznych reštrikčných štiepnych miest. V dolnej časti obrázka sú znázornené rôzne oblasti plazmidu pCS2. Inzercia DM58-1 DNA je znázornená ako prázdny pás. Gén ampicilínovej rezistencie pZl je znázornený ako čierne pole, gén kanamycínovej rezistencie je znázornený ako bodkované pole. Ostatné podiely pZl plazmidu pCS2 sú vyšrafované. Použité skratky sú nasledovné: BamHI - B; Bell - C; Sali - S; Sca - A; Smal - M; Xhol - X.

2.2 Charakteristika aktivity aspartátkinázv

Aspartátkinázová aktivita sa merala u kmeňa ATCC 13032/pCS2, ako pozitívna kontrola u kmeňa DM58-1 a ako negatívna kontrola u kmeňa ATCC 13032. Kmene sa kultivovali na Standard I Bouillon, pričom táto pôda bola doplnená 4 g/1 glukózy, 10 hg/ml kanamycínu a 1 mM chloridu horečnatého. Kultivačné podmienky, izolácia buniek, rozloženie buniek a stanovenie aspartátkinázy sú popísané a uskutočňujú sa podľa odstavca 1.2. Efektory L-lyzín, L-treonín a AEC sa vždy pridávajú ako základné roztoky v 100 mM Tris/HCl tlmivom roztoku s hodnotou pH 7,5.

Obsah aspartátkinázy a inhibovateľnosť enzýmu z ATCC 13032/pCS2 sú uvedené v tabuľke 4. Aj keď kmeň nepreukazuje žiadne zvýšenie špecifickej aktivity, mohla byť zistená zreteľná desenzibilizácia voči uvedeným inhibičným látkam, ktorých miera stupňa deregulácie enzýmu z poskytovateľa génu DM58-1 však nebola dosiahnutá (parciálna deregulácia).

2.3 Stanovenie vylučovania L-lyzínu

Schopnosť vylučovania lyzínu sa stanovila u kmeňa ATCC 13032/pCS2 a ako negatívna kontrola u kmeňa ATCC 13032/pZl. Po prídavku 10 ug/ml kanamycínu sa kultivácia uskutočňovala spôsobom popísaným nižšie a získané výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2.

Tabuľka2

Vylučovanie L-lyzínu rôznymi kmeňmi Corynebacterium glutamicum

Kmeň C. glutamicum Koncentrácia vylúčeného

L-lyzín.HCI (g/1)

ATCC 13032/pZl

ATCC 13032/pCS2 (= DM 2-l/pCS2)

0, 0 7,1

Erlenmeyerova banka s objemom 100 ml sa naplní 10 ml kultivačného média s nasledovným zložením:

síran amónny	12	g/i
melasa	240	g/i
sójový hydrolyzát	60	ml/l
uhličitan vápenatý	10	g/1.

Po zaočkovaní sa kultúra inkubuje 72 hodín pri teplote 30 °C a 300 otáčkach za minútu. Stanovenie lyzínu sa uskutočňuje v kvapaline po centrifugácii pomocou analyzátora aminokyselín.

3. Prehľad odštiepovania fragmentu DNA pCS2, ktorý kóduje pre feed-back rezistentnú aspartátkinázu

Úplným alebo parciálnym štiepením pCS2 rôznymi reštrikčnými enzýmami a nasledujúcim spracovaním T4 DNA-ligázou pri nízkych koncentráciách DNA sa konštruujú rôzne odštiepne deriváty. Výroba rôznych odštiepnych derivátov je zhrnutá v nasledujúcej tabuľke 3 a pozícia odštiepenia v rôznych derivátoch je znázornená na obr. 3. Na obr. 3 je taktiež nanesená schopnosť rezistencie kmeňov odvodených od Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 voči AEC. Týmto spôsobom mohla byť ohraničená oblasť DNA, sprostredkujúca AEC-rezistenciu, na fragment DNA dlhý približne 1,5 kb, ktorá je obmedzená v plazmide pCS233 klonovacím štiepnym miestom PstI a štiepnym miestom EcoRI.

Aktivita aspartátkinázy a inhibovateľnosť enzýmovej aktivity zmesami lyzínu, prípadne AEC a treonínu, sa stanovovala v konštruovaných klonoch. Pestovanie, izolácia a stano17 venie aktivity sa uskutočňovali spôsobom vyššie popísaným. Okrem toho sa skúmala schopnosť rôznych klonov vylučovať Llyzín. Na to sa používal difúzny test na agarových platniach s L-lyzín-auxotrofným indikačným kmeňom Corynebacterium glutamicum. Z tabuľky 4 je zrejmé, že všetky AEC-rezistentné kmene majú parciálne deregulovanú aktivitu aspartátkinázy a že sú schopné vylučovať L-lyzín.

Tabuľka 3

Výroba a AEC^R/s-f enotyp rôznych štiepnych derivátov plazmidu pCS2

Plazmid	Konštrukcia	AEC^R/S-fenotyp
pCS21	vyrobený štiepením pCS2 pomocou BamHI	R
pCS22	vyrobený štiepením pCS2 pomocou BamHI a Bell	R
pCS23	vyrobený parciálnym štiepením pCS2 pomocou Sali	R
pCS24	vyrobený parciálnym štiepením pCS2 pomocou Xhol	R
pCS2 6	vyrobený štiepením pCS2 pomocou Seal	R
pCS231	vyrobený parciálnym štiepením pCS23 pomocou PstI	S
pCS232	vyrobený parciálnym štiepením pCS23 pomocou Dral	S
pCS233	vyrobený parciálnym štiepením pCS23 pomocou EcoRI	R

Í9

Vysvetlivky: R - rezistencia S = citlivosť

Na obr. 3 je znázornená schéma štiepenia plazmidu pCS2 V hornej časti obrázka sú znázornené deriváty odvodené od pCS2 a v dolnej časti obrázka deriváty odovodené od pCS23. Hranice ampicilínovej rezistencie pZl sú znázornené čierno; hranice kanamycínovej rezistencie sú znázornené bodkované a ostatné časti pZl plazmidu pCS2 sú vyšrafované. Inzercie DM58-1 DNA sú znázornené ako voľné pásy. Štiepenia sú označené čiarou. Vysvetlenie použitých skratiek:

B - BamHI, G - Bell, D - Dral, E - EcoRI, S - Sali, A Seal, M - Smal, X - Xhol.

Tabuľka 4: Mikrobiologické a biochemické charakteristiky rekombinantných kmeňov Corynebacterium glutamicum

Kmeň	ASA-DH (U/ mg)	AK (U/ mg )	Reaktivita AK v prítomnosti 1OmM 1OmM 100mM	(Z ) 1 OOmM AEC 1 OmM Thr	aec^r	Vylučovanie lyzínu
Lys 1mM Thr	Lys 1 OmM Thr	Lys 1 OmM Thr
ATCC13032 (pZ1 )	0,06	0,016	9	5	3	7	-	-
ATCC13032 (pCS2)	3,9	0.013	55	55	28	56	+	+
ATCC13032 (pCS21)	n.	0,016	4 6	50	24	n. ...	♦	4-
ATCC13032 pCS22	n .	0,015	40	4 1	2 2	n .	4-	4-
ATCC13032 (pCS23)	0.03	0,014	5 1	57	30	56		4·
ATCC13032 (pCS24)	2.07	0.011	65	65	40	62	♦	+
ATCC13032 (pCS26)	1 .88	0,015	64	63	39	60	4·	4-
ATCC13032 (pCS231)	0.060	0,013	1 1	1 4	4	1 0	-	-
ATCC13032 (pCS232)	n.	n .	n.	n .	n .	n .	-	n.
ATCC13032 (pCS233)	n.	0,011	56	62	36	57	4-	n ·
DM58-1	0,330	0,009	83	100	79	93	4·	«4

(pZ1 )

Použité skratky: ASA-DH: aspartyl-p-semialdehyddehydrogenáza

AK: aspartátkináza n.: nezistené.

4. Sekvensovanie fragmentu DNA plazmidu pCS24, ktorý sprostredkuje fenotyp AEC-rezistencie

4.1 Metóda sekvengovania

Sekvencia nukleotidov 2,1Kb Pstl-Xhol-fragmentu DNA sa zisťovala metódou Maxama a Gilberta (Maxam, A. M. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)) s modifikáciou podľa Arnolda a Pílhlera (Arnold, W. a kol., Gene, 70, 171 ff (1988)). Subklonovanie k sekven^ovaniu pritom vychádzalo z plazmidu pCS24 (viď obr. 4). Tento sa transformuje' podľa Escherichia coli MM 294 (Merelson, M. a kol., Náture 217, 1110-1114 (1968)) a príslušné fragmenty sa klonujú do sekvenčných vektorov pSVB21, 25 a 26 (Arnold, W. a kol., Gene, 70, 171 ff (1988)). V kmeni Escherichia coli JM83 (Messing, J., Recombinant DNA Technical Bulletin NIH Publication No. 79-99, 2, 43-48 (1979)) je možné dokázať aktiváciu inzercie pomocou testu Xgal (5-bróm-4-chlórindolyl-p-D-galaktopyranozid).

Stratégia sekven^ovania je znázornená na obr. 4. Sekvencia nukleotidov sa zisťovala na obidvoch vetvách DNA s prekrývajúcimi sa klonmi.

Na obr. 4 je znázornená odštiepovacia analýza a stratégia sekventíovania chromozómového fragmentu plazmidu pCS2. Odštiepovacia analýza: Plazmidy pCS23 a pCS24 zprostredkovávajú taktiež ako kloň pCS2 AEC-rezistenciu a produkciu lyzínu. Šrafované pásy predstavujú podiel vektora v plazmide.

Stratégia sekven^ovania: 2,1 kb Pstl-Xhol-fragment plazmidu pCS24 sa subklonoval so znázornenými.reštrikčnými štiepnymi miestami. Šípky vždy udávajú sekvenčný rozsah a smer čítania. Označené sú reštrikčné štiepne miesta enzýmov Dral (D), EcoRI (E), BglII (G), HindlII (H), Nael (N), PstI (P), Sali (S) a Xhol (X). Dolu sú znázornené dva čítacie rastre, ktoré kódujú pre podjednotky aspartátkinázy a pre aspartát-0-semialdehyddehydrogenázu (viď text).

4.2. Sekvencia DNA 2,1 kb Pst I - Xho J-fragmentu_DNA

Sekven^ovaný úsek DNA je dlhý 2112 bp. Nesie reštrikčné štiepne miesta pre enzýmy BglII, Dral, EcoRI, HindlI, Nael, PstI, Sali a Xhol, s ktorými boli vyrobené aj subklony.

Sekvencia nukleotidov sa spracovala sekvenčnou analýzou podía programového zväzku ANALYSEQ (Staden, R. a kol., Nucl. Acids Res. M, 217-232 (1986)).

Na sekven^ovanom úseku DNA sa nachádzajú dva otvorené čítacie rastre (ORF). Obidva sú usporiadané od štiepneho miesta PstI smerom k štiepnemu miestu Xhol. Madzi obidvomi sa nachádza len malá oblasť 26 bp. Pred 2. ORF sa nachádza miesto väzby ribozómov (RBS) (806-809 AGGA nasleduje štartkodón ATG). Vnútri 1. ORF bola lokalizovaná aj jedna RBS (AGGA, 268-271 so štartovacím kodónom GTG).

ORF 1 má dĺžku 264 aminokyselín (AS), počítajúc od PstI miesta a 172 aminokyselín (zodpovedá 18,6 k Dals) od internej RBS. ORF 2 má dĺžku 342 aminokyselín (36,1 k Dals).

Priamo za ORF 2 sa nachádza možná transkripčná terminačná štruktúra, takzvaná vlasová ihlová slučka prebiehajúca od viacerých tymínových zvyškov (1864 - 1900). Toto usporiadanie je charakteristické pre p-nezávislé terminančné signály v Escherichia coli a iných bakteriálnych druhoch (Ahyda a kol., Ann. Rev. Biochem. 47, 967-996 (1978)). Tu predložený terminátor má stabilitu viac ako -40 kcal/mol pri 30 ’C.

Možný promótor pre ORF 2 sa zistil vnútri ORF 1 (409437), (TTGACA-17 bp-TATTCT). Oblasť -35 a vzdialenosť k oblasti -10 zodpovedajú presne E. coli-Consensus-Promotor (Hawley, D. K. a kol., Nucl. Acids Res. 11, 2237-2255 (1983)), oblasť -10 je veľmi podobná E. coli-Consensusregion (TATAAT).

Ďalej je uvedená sekvencia DNA a odvodená sekvencia aminokyselín 2,1 kb Pstl-Xhol-fragmentu.

24
J> o	o	>	o	O	< o	f	O O	o	H -4	O
v o	cr>	P	H	oo	3 o	f	O <	vO		d
d H		4)	b	r—1	fp <	·£	P u	d	-c C3
n		VI	c		o o		fP o		<J C3
bO U		bO U		u o		M O		Q. U
P u		P	o		4) H		>»		VI ·<
< o		•3	u		s: <		l4 -4		-4 O
o o		3	c»		P H		p. H		3 «4
P u			H		4) O		V) <		rP <
fu o		►4	o		v) H		<4 O		O C3
<xu	O	r“4	o	o	>.u		P o	O	»P <	O
M <	QO		H	r*	rP O	H	4i υ	d	cd H
š u		P>	O	t—I	o o	4)	V) f-t	d	> (J
<3 (p		P	U		el U	<d	4) M		P H
<P U		0)	fp		rP O	%	rP P		4) U
*4 O		►4	fp		«4 C3		M «4		v) H
P u		4)	Jp		O P		H		p P
ŕ ^υ		r-t	(p		rP P		rP O		S. <4
P <		CP	-4		M -4		O 13		H H
P H		M	O		P o		3 O		rP O
>Λ<	O		<	o	4) P	O	cl H	O	cd H	O
H H	r»	►4		VO	P P	m	►4 U		> O	d
rP O		P	u	»—I	p P	CM	rP H	d	3 U
cd h		<U	o		ŕ ^υ		(d P		M <2
> U		V)	H		P -4		> C3
				hu		P O		P U	M
rP O		rH	O		r-P (.3		ŕ ^υ			P
(J O		o	O		U U		P		U u	0
CL U		r-i	H		o o		r-1 <J		3 O	Pv.
n <		«d	P		P o		«d H		41 H
-ť o	o	>	O	o	íp a	o	> b	O	P U	O
•p P	VO	(d	H	m	P- A	<r	M ·< ►4	d	,P f-C	CM
cd f-t		rP	U	rP	V) <	CM	d	cd P	<í
> O			O		<4 O			> U
CL O		d	H		P H		id O		u CJ
vi -4		i—I	O		V) «4 <2		d ° <2 o		41 H
<4 o		<	O				X <
P o		3	H		P H		3 «4		CL U
a O		4)	P		v b		»-H *4		VI -4
vi H		>-)	U		VI <		O O		«4 o
P O	O	P	<	O	P H	O	P O	O	4) H	O
X «4	m	tP	*4	<r		d	4) O	CM	d P	fp
H H		O	o	r-1	H P	CM	to H	d	1P -4	<t
« H		P	o		P P		vi o		P u
fp P		41	H		4) b		H -4		VI -4
M -4			U		VI h		-> <2		«4 «4
□ U		U	O		P O		CPU		4) U
•P -4		<u	H		4i u		vi «4		rP H
O O		S	«4		V) (-C		<4 O		M «4
VI H		3	<c		M O		P O		3 -4
ÍSO	o	rP	<2	O	p e>	O	fi U	O	P *4	o
U H	«4	U	O	n	-4 o	CM	P	i—1	U U	o
•P (J		P	<	<P	rP <:	CM	cd <	d	cd -4	<t
H		rH	*4		cd H		rP U		rP U
> O		o	O		> O		<4 O		*4 O
CL H		41	O		bfl O		r~1 U		(X H
M «4		44	H		P O		<d H		vi <
*5 P		CM	P		<2 u		> u		«í O
«3 H		P	b		3 p				d H
fp U		<u	o		41 p		rP U		rP U
	o	V)	-c	O	>4 a	O	U O	O	<: u	o
c u	n	P	u	CM	o -4	rP	P o	O	3 o	<h
q		4)	P	rP	P u	CM	44 U	d	4J fp	d
5 < □ u		P	b		cm u		P «4		P P
	M	O		rP o		3 H		cd b
<i P		ϊ>	<4		d p		<u (-«		rP u
P Γ		P	<4		> b		P u		«4 O ώ H
cd {-»		3	«c		P H		rP U
fp U		r—1			V) «4		«d H		P U
< u		o	O		<2 -4		> U		< U
d H	o	P	O	O	4) U	O	cd «4	o	41 a	O
H U	CM		rp	x p	O	rP Ô	Ch	j: P	CO
S P		rp	rp P	CM	< U	CM	Pc p	d
d <		V)	o		d -4		3 <4		»P (*C
rP U					rP O		rP «4		cd P
		P	<4		< o W1H		U u		> u
3 o		P	(P			3 <4		VI U
« fp		r“l	-4		P o		r-l «4		·$
»4 P		o	u		<2 o		o u		P *4
cd O		cd	•4		d í-i		rP U	Λ	cd U
fP O	o	rP	o	O	<p b	O	<d H	1	rP U	o
S P	rP	<	o	O	«4 U	σι	r> u	1	<4 U	r-
H P		P	P	fp	p a	H	o H		d H	d
«J p		vi	«4		P*4		P O		rP U
> O		*4	<4		H P		fU O		< U
«1 «4	•P	o	{-4		3 «4		4) f-c		3 u
rP O	U	P	U		rP -4		rP P		rP «4
< u	M	CM	U		o o		M -4		U (.3
H	CM		p		p		H		U
b			P		P			*	U

ThrAspIleThrPheThrCysProAr gSer.AspGlyArgArgAlaMecGluIleLeuLysLysLeuGlnValGlnGlyAsnTrpThrA CCACCGACATCACCTTCACCiGCCCxCGTTCCÚACGÓCCGCCGCGCGATGGAGATCTTGaÁgA-AGCTŤCAGGTTCAGGGCAACxGGACCA 460 470 480 490 500 BglII 510 HindlII 530 540

<

O

o

<

o

b

r-4

c

o

r-4

-ť

o

m

»3

H

CM

-ť

4<

b

o

P

tJ

Ov

r~4

-2

VO

r-J

b

r-

b

-L

P

u

<n

P

H

cr>

o

b

«2

o

i

41

o

b

M

b

P.

H

4<

to

P

a)

H

vi

-ť

«r

m

4)

P

OJ

H

s:

O

<d

r-4

P

r-4

P

4)

u

3

u

H

P

4-4

«<

x:

H

4)

H

P

O

«d

<c

p.

U

‘B

P

r-j

b

P

r—1

b

<

a

o

O

P-H

o

P

O

<

b

O

<4

b

O

r—1

CM

vi

r-4

o

P

b

Ο»

□

<

00

O

o

VO

u

r·

CO

4)

b

00

r—1

«2

cn

cd

<

p. H

rr

to

<

b

r-4

b

V)

O

*C

vt

b

r-4

C

<:

o

b

o

H

>,

<

<d

H

u

3

to u

r-4

«2

>

b

x:

b

«-j

P

b

O.

b

d

b

P

o

a

P

b

r-4

<

,—1

H

bO H

H

b

<d

P

O

P

b

O

r-4

O

4)

-·

o

4)

u

O

>

b

r—í

-tí

b

o

b

o

cn

XJ

-1

00

r-4

H

VO

4)

u

r*

P

b

r*

CM

-·

00

4-4

tn

H

b

r-4

H

b

0

b

3

«<

O

b

1-4

P

-ť

P

u

r-l

o

<

ď

o

>v U

CM

u

b

P

u

H

r-4

o

rt

<<

P

b

(P

u

►J

O

b

o

r-4

o

JC

b

V)

o

r—4

b

«d

<

o

P

<

•r4

ri

P

r-4

o

M

u

s. u

u

O

>

b

o

SU

o

r-4

b

O

P

O

P

o

σ\

P

H

OO

b

H

Γ-

b

VO

4)

o

VO

4)

u

VO

r~

d

C

ΟΟ

ta

H

cn

to

P

to

P

H

P

b

VI

b

4)

P

r—1

p

r-J

P

<

o

1-4

ín

r—4

P

Cú

í-r

to

b

4)

b

m

r-J

-ť

1-4

c

>

b

P

b

JZ

H

o

u

o

tO (-4

O

<

P-j

P

u

4)

H

P

o

•d

H

3

u

3

W

X

<1

o

>

b

r-4

o

r-l

»2

O

4)

P

O

«d

u

O

<:

b

o

b

o

F^-4

b

cn

r-4

P

«30

r-4

b

P

b

VO

4)

H

vn

u

o

m

4-4

<

vo

<

b

r-

4)

u

CO

r-4

P

<n

•ti

P

d

o

3

to

P

4-4

b

r-4

r—l

*2

bO b

M

b

o

O

o

O

b

P

b

<

P

a

►J

«2

r—1

b

4)

b

(Λ

«3

U

to H

o

b

to

P

<c

o

rH

b

P

b

r—t

o

P

b

□

<

b

<

o

•d

P

o

Í

b

O

r-l

-2

O

o

b

o

O

>

b

oo

P

r-

b

o

vo

P

b

m

r-4

b

d

u

m

P

u

VO

S

o

CM

u

co

b

cn

4)

H

o

r-4

b

•d

<

•d

<

r9

o

to

P

b

υ

r-4

u

r—1

b

P

o

4)

P

SU

b

4)

o

r-4

P

H

b

H

P

u

to

P

M

-ť

b

r-l

b

4*

o

r—t

o

d

u

d

b

10

H

«d

P

<V

P

<w

H

r-l

P

b

>

b

O

H

P

O

d

b

O

td

P

O

x:

b

O

M

r-

d

vo

b

vn

b

<t

P

n

m

rH

«3

to

r-l

r-

r-l

CO

0

b

cn

b o o o «u u

	r-4	H		X3	H		rt
	4-4	-ť		Pi	P		r-4
	a	U		Ή	b
	VI			r-l	-ť		4)
				b	a		r-l
o	r-4	b	o	d	b	o	1-4
v0	<d	P	m	r-4		<í	P
m	t>	b	to	b	b		xl
	fJ	b		0	H		P

•rl »tj ώ u d b g

ä O m H r* M b

35S cn

AlaThrGluGluSerLeuLysAspIleAspValAlaLeuPheSerAlaGlyGlyThrAlaSerLysGlnTyrAlaProLeuPheAlaAl GGCAACCCAGGAGTCCCTCAAGCACATCGACCTTGCGTTGT7CTCCGCTCCAGGCACCGCTTCCAAGCAGTACGCTCCACTC7TCCCTGC Í000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 PscI «Λ

ÍX U

h.

φι

O	rP tO	o	»4 f“¹		»P u	o	V H	O	rP	H	C
r-»	O O	vO	> b		4 °		t-3 U	m	Ι-»	<í
r-l	f4 H	CN	«4 4	M	Mi H		>» H	m	<4		vr
t—1	fP O	rP	rP U	M	P 10	rP	rP O	rP	rP	U	r-
	4 e»			W	4 ^u		O tO		4	o
	d u		<4 f-»	04	P 4		3 O		M	o
	fP o		fP O		rP 4		ω H			<;
	4 to		4 O		o a		►P U		»P
	p. H		d H		3 4		4) H		CL u
	vi 4		«d {p		t) (P		rP H		14	<
O	4 O	O	> O	O	•J H	O	HP 4	O	4	u
VO	M U	m	P O		bO O	n	0 tO	CN	4)	u
»—1	•P <5	CN	rP 4	n	P O	4	>A 4	m	X	H	H
r-l	X P	rP	O u	rP	4 O	rP	f-l -ť	rP	(X	H	Ci
	3 H		w O		P H		wi o		3		C
	4) h		X4		M <		P o		rP	<í	C
	f-l a		u 4		4 4		4 o		O	o	u
	o 4		«d «í		p to		P o		<4	a
	P u		<P u		x o		41 u		fp	o
	Pp u		S o		P 4		CQ H		.Z 4	o
O	M o	O	3 o	o	4) a	O	3 -e	O	M	o	c
LQ	ís <	<t	« f-l	n	x H	CN	rP 4	rP	•P	<	c
r—1	d	CN	►J H	m	fX H	4	o o	m	X	u	v£
rP	p to	fP	P O	fp	VI (P	rP	c u	fp	41	H	r-
	ej H		X u		xo		14 <5		rP	fp

»P

U

(P

a

H

*4

n

-4

f—i

O

3

«r

3

•4

bh

u

P

O

d

H

rP

41

fp

P

u

X

u

>

O

C3

►P

P

<1

o

P

c

o

rP

O

P

u

3

o

3

o

P

d

O

<4

H

O

x

u

o

4)

H

o

H

C

(P

u

m

>

O

CN

P

<

rP

u

o

•P

υ

σ

u

o

CN

>.

H

m

bO O

«4

o

m

P

u

ir

4)

H

rP

O

rP

P

u

r-l

X

•P

&

o

<-

r-Ί ο ο «4 4 ο ν> Η >ιϋ Ο Η Μ) 4 r-l <5 O U d o

VI •r4 x

>

u c

u o

•P 4

fp

o

« {P

p a

rP

4

r—1

O

O O

O

4

o

>p b

O

4 o

o

<J

O

o

(J

c

(X o

ΓΊ

u

o

CN

rd

d O

o

3

4

cn

P

o

oc

0 4

r-l

4)

H

CN

f-l O

m

rP a

4

rP

4

X

u

ir

4 U

rH

X

4

fP

o o

r-l

4 U

rP

e»

u

rP

P

4

f-

p. (J

P

U

M H

CL U

CL H

4)

U

vi 4 Ο νι Ο $2 bOO

Η

Μ U es

Μ Ο CN 4 &;

Η •4

Β ο Η Ο

R

Ο Η Ο tíj

4 μι

4)

V)

Ρ

U (Λ

C

V) >»ιο ^ub 3

Η Ο

C νι

Ο

Ρ <Λ Η r-l Ο Ο U u

Η ο

ο

O	P	u	O	dno	3	<?	o	o	o	c
r—1	41	a	o	rP O Cb	rP		00	P	u	r
CM	W	H	m	4 O m	O	(J	4	Pm	o	ir
r-l	fP	H	r—1	C ϋ tP	41	o	»—1	fp	o	r—

<4 >

<4 tP (d ΐ> <—ι m ϊ> Μ

Ο ο

Η

Ο <4 _ rP Ο

Ο

G <

Ο Ο U cn Ο Ο

Μ 4

Η U Η ο

ť

Η 4 •3Β

Μ 4 Ο λυη --Ι Ud ο to η

V) u

3·$ fp (J <15 ο ο jj G 3 ρ υ ρ 4) υ

4)

	o o	L0 {-·
i	«4 «<	P. H
t i	rP U	0 <
j	«4 U	«4 o
1	H	O

Ο

Η ο

ο ο

rP 4 ο υ >ι4 rP Ο ο ο CL Η

X H P. H P O es >>o

O	rP	C	o	0	4	O	rP O	o
o	O	a	σι	<	O	CO	O O	r^·
CN	P	o	CN	0	H	cl	P. O	4
fp	ΪΆ	«4	rP	•P	4	r~l	0 4	rP
	(P	H		35	O		4 CJ
	P	H		r-l	u		P.H
	4)	b		rí	H		0 4
	M	H		>	O		4 U
	P	u		41	U		rP o

4) U </) r-1 R) > ο

VJ U •p 4 x u o

oo

CN x H s b r-l 4

O O rP -I «d (p * o

«4 (-1 > O bOO P 10

H id H > O w O >,U a H P u es fP o o o P 4 4) U ι/l H i—I u H O

C ‘C ir

C ir v

3	fp	►P	(5 O		>l			0	o
«i	H	•P	0 4		r-M	to		>>	4
P	O	•o	4 4		o	u		U	4
0	O	P	0 <3	o	<4	o	o		d	c
x	«tj	•P	•P 4	vo	f—1	o	m	oj	H	4
f-l	«í	35	X O	m	4	<3	4	»4	u	ir
rP			CLO	rp	a)	O	fp	CL	o	r-
<4	H		0 4		fP	(P		0	4
>	U		4 O		IP	4		4	to
3	fp		H 4		»4	o		o	4
<u	b		tP O		rP	o		P	U
P	u		O O		4	o		CP	o
	H		H			H			o

ThrValAspGlnAlaGlnGluIleLeuGlyAj.aAlaSerGlyValLysLeuValAspValPrpThr?roLeuAlaAlaAlaGlyIleAs CACCGTGGACCAGGCGCAGGAGATCTTGGGTGCCGCTľCAGGCGTCAACCTTGTCGACGTCCCAACCCCACTTGCAGCTGCCGGCATTGA 1630 16AO BglII1650 1660 HindlII Gali 1690 1700 1710

	o		o	υ o	O	o
►4	o	-í	cn	•ύ 00	H	r-
M U	oo		00	O cn	b	o
H o	r—1	(H	f—1	<4 r-l	<*	ČM
•s °		p
d u		u			«c
41 p		C		U	<c
d b		O		o
d o		<		o	o
í 3	O	e	O	o <ť o	o H	O
tx υ	cn	o	00	u r*	b	tO
M <		H	00	(J cn		o
< o	r-l	b	r-l	*4 r-l ·	o	CM

r-l O O M 4) to f—í >

rt > d a 1-1 r-1 >

d

O

G

H •ť

U

S o

u p

o o

o oo r* o

r>

r>.

(J		l··	-ť
O	o	P O	O	o
υ		(J Ό	p	m
H	oo	•ť cn	b	O
U	r-l	r*l	H	CM

£ o o O m < cn

U rl

x)

P b			υ		a	o	c
Í>nP			o		P	rt	•H
r-l O			o		U M	-í	Ä
o o			υ		p crt	o
bo u					P o	u
H o			«c		rt ^υ	a
< ^u	o		<c	o	«ť w	u	O
c o	CO		<c	m	o	o	n
M <	r-		•T	oo	o	u	o
rt <	r-l		P	r—1	P	o	CM
P, H		n	U		o	rt
n <		ín	•rt		rt	p
•rt i3		P			•í	b
p. υ		r-l	p		o	o
w <	l-l	rt	P		p	rt
rt u	r—1	í>	(3		b	o
r-J U	rt	a	O	o	p o	(J	O
rt p	to	41	p	<í	p m	o	CM
> b		p	b	oo	b cn	rt	O
M p		p	o	r—1	O r-l	rt	CM
P U		41	p			u
P <		P	b		U	o
m a		P	o		υ	P

a c n υ o o

4i υ to P p. b n <

r-l -ť

O u tog o u H o

r· <ť o o rt p r-l O

d.

r-l H M < C O r-l u o

4) U H

P

O

O	o	o		o	a	o
m	o	CM	3	r-l	o	o
co	o	cn	P	O	P	r—1
r—I	H	r-l		CM	, rt	CM
	rt		e		a
	υ		rt		o
	a		-ť		H
	o		o		b

C5

O

H	rt	o	M	rt	o	O	o		o	<	o
MU	m	h	u	CM	C	r-l	H	o	H	cn
H	(J	r·		υ	CO	O	cn	rt	o	rt	o
rt	a	r-l	P	rt	r-l	p	r—1	U	CM	o	CM
>rrt		C	υ		P		u		P
r-l	o		q			P		U		P
O	o		rt	«€		O		<;		u
r-l	p		P			H		p		υ
rt	p		41	p		rt		b		u
£	b		r-l	b		-ť		o		o
P	a	O	rt	u	O	p	O	o	O	-ť	O
«í	p	CM	r-l	u	r-l	P	O	o	cn	u	oo
P	b	f'·		u	OO	P	cn	rt	cn	u	o
p	o	r—1	rt	p	r-l	P	r-l	H	•—J	a	CM
41	o		r-l	b		b		rt		C
CO	p		rt	o		13		O		P
P	rt		d	P		O		P		o
r-l	rt		V)	rt		O		υ		P
O	o		rt	•tí		U		o		o
	a			o		o		P		o

Sekvencia aminokyselín ORF 1 (1 až 794) a ORF 2 (821 až 1846) sa udávajú v trojpísmenovom kóde. Číslovanie pod linajkou sa týka sekvencie DNA. Názvy klonovacích štiepnych miest využitých pri sekvencovaní sú tiež uvedené pod linajkou. Miesta väzby ribozómov sú označené hviezdičkou. Štartovací kodón je označený šípkou a štruktúra terminátora plnou čiarou.

4.3 Analýza sekvencie aminokyselín

Sekvencia aminokyselín prenášaná pomocou ORF 1 a ORF 2 sa porovnávala so známymi sekvenciami aspartátkinázy AK I (Cassan, M. a kol., J. Biol. Chem. 261, 1052-1057 (1986)) z Escherichia coli a AK II z Bacillus subtilis (Chen, N. Y. a kol., J. Biol. Chem. 262, 8737-2255 (1987)), prípadne so sekvenciami aminokyselín aspartátsemialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) z Escherichia coli (Haziza, C. a kol., Embo J. 1., 379-384 (1982)) a Streptococcus mutans (Cardineau, G. A. a kol., J. Biol. Chem. 262, 7, 3344-3353 (1987)). Na to sa využili programy MALIGN (Sobel, E. a kol., Nucl. Acids Res. 14, 363-374, (1986)) a DIAGON (Staden R. a kol·., Nucl. Acid

Res. 14, 217-232 (1986)). Ukázala sa signifikantná zhodnosť medzi ORF 1 a sekvenciou AK na jednej strane a medzi ORF 2 a sekvenciou ASA-DH zo Streptococcus mutans na druhej strane. Pre Escherichia coli sa ukázala v prípade ASA-DH len slabá homológia, najmä však v oblasti aktívneho centra (Haziza, C. a kol., Embo J. 1, 379-384 (1982)).

Z počítačovej analýzy vyplýva nasledovné:

- ORF 1 zodpovedá C. Termínu aspartátkinázy, to znamená, že chýba asi 160 aminokyselín N-terminu, ako i kompletná ob29 lasť promotóra.

- ORF 2 zodpovedá aspartátsemialdehyddehydrogenáze.

Homológia ORF 1 s AK II z Bacillus subtilis je odborníkom zrejmá. AK II pozostáva z prekrývajúcich sa podjednotiek (Chen, N.-Y. a kol., J. Biol. Chem. 262, 8787-8798 (1987)). Pritom zodpovedá β-podjednotka C-Terminu a-podjednotky. Vzhľadom na to, že RBS zistená v ORF 1 sa zhoduje vo svojej polohe presne s RBS tejto aspartátkinázy, môže sa analogicky odvodiť, že tu existuje klonovaná β-podjednotka aspartátkinázy Corynebacterium glutamicum.

5. Skúmanie expresie

5.1 Komolementácia asd- a lysC-negatívnych kmeňov Escherich i a rol i

Identitu ORF 2 s génom asd je možné doložiť komplementáciou asd-negatívneho kmeňa Escherichia coli RASA 6 (Richaud, F. a kol., C. R. Acad. Sc. Paris, 293, 507-512 (1981)) pomocou plazmidov pCS2 a pCS24. Plazmid pCS23, u ktorého asi 30 aminokyselín C-Terminu ASA-DH chýba, nekomplementuje. Žiadny z týchto plazmidov nie je schopný komplementovať AKI-III negatívny kmeň Escherichia coli Gif 106 Ml (Boy, E. a kol., Biochémie 61, 1151-1160 (1979)).

5.2 Sta^nvpnie špecifickej aspartátkinázy (AK) a aspartyl-βsemialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) v_transformantoch ATCC 130 32 s rôznymi š t i epnvmi derivátmi pCS2.

Analogické závery odvodené v odstavci 4.3 z porovnania homoiógií, podľa ktorých fragment génu Pstl-Xhol z DM58-1 obsahuje len časť génu lysC (AK), ale úplný gén asd, je mož né jednoznačne potvrdiť enzýmovými meraniami.

Žiadny kmeň Corynebacterium glutamicum transformovaný pomocou pCS2 alebo derivátom pCS2 neobsahuje zvýšenú aspartátkinázovú aktivitu voči rodičovskému kmeňu (tabuľka 4. stĺpec 3).

Naproti tomu vo všetkých prípadoch transformantov, ktorých plazmidy obsahovali asd-štruktúrny gén, bola dokáza teľná silná superexpresia aspartyl-p-semialdehyddehyd-rogenázy (tabulka 4, stĺpec 2, obr. 3 a 4) . Plazmidy pCS23 a deriváty pCS23 nevedú podľa predpokladu k superexpresii aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy. Na základe vysokej lability aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy kolíšu faktory superexpresie, ktoré sa dajú vypočítať zo špecifickej aktivity, medzi hodnotami 31 až 65.

6. Enzvmatické vlastnosti a vylučovanie L-lvzínu

Vylučovanie L-lyzínu v množstve 7,1 g/1 za 72 hodín do kázané pre ATCC 13032 pCS2 (viď tabulka 2) sa dá odvodiť na základe dvoch geneticky realizovaných zmien.

a) Klonovanie regulačnej podjednotky aspartátkinázy z DM58-1 bez zvýšenia bunkového obsahu enzýmu.

b) Klonovanie aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy z DM58-1, ktoré vedie k 31 až 65-násobnému zvýšeniu bunkového obsahu enzýmu.

Claims

1. DNA-fragment, ktorý sa skladá z nukleotidovej sekvencie s dĺžkou 2,1 kb, ohraničený Pst 1- a Xho 1-miestami štiepenia, vyznačujúci sa tým, že í-odujU ň 7. uf am inokyse1 i nová sekvencia, uvedená na obr. 5 yxákcčixcu/e. produkciu proteínov, vedúcich k aktivite aspar ty 1 - f5 - sem i a 1 dehyddehydrogenázy (asd) a k deregulácii aspartát-k inázy (lysC)^u/ je obsiahnutý v plazmide pCS2, ktorého deleôná mapa je uvedená na obr. 3, uloženom v Corynobacterium glutamicum pod číslom DSI1 5086.

2. Rekombinantná DNA, odvodená z plazmidu pCS2 podľa nároku 1, charakterizovane delečnou mapou zodpovedajúcou označeniu pCS26, uvedenou na obr. 3.

3 Rekombinantná DNA, odvodená z plazmidu pCS2 podľa nároku 1, charakter izovana delečnými mapami zodpovedajúcimi označením pCS23 alebo pCS233 na obr. 3.

4. Spôsob výroby L.-lyzínu fermentáciou mikroorganizmov rodu Corynobacteri um alebo Brev i bacter i. um, produkujúcich túto aminokyselinu, vyznačujúci. sa tým, že mikroorganizmy obsahujú plazmi d podľa nároku 1 alebo z nej odvodenú rekombinantnú DNA podľa nárokov 2 a 3.

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý, m, že m i kroorgan i zrnom je Corynobacter i um^DlíS 5086.

qiu.4w.7nni Ui.'nJ