JP3000087B2 - Ｌ―リジンの製法、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物、及びｄｎａ―フラグメント - Google Patents
Ｌ―リジンの製法、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物、及びｄｎａ―フラグメントInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は発酵によるＬ−リジンの製法に関する。
従来技術 コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacteriu
m glutamicum）及び類縁の属、例えばブルビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンツム（Brevibacterium Lactoferm
entum）及びブレビバクテリウム・フラブム（Brevibact
erium flavum）はアミノ酸形成微生物として公知であ
る。
m glutamicum）及び類縁の属、例えばブルビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンツム（Brevibacterium Lactoferm
entum）及びブレビバクテリウム・フラブム（Brevibact
erium flavum）はアミノ酸形成微生物として公知であ
る。
生産性を上昇させるためには、人為的突然変異を実施
する。
する。
このようにして生じた人為的突然変異体の例は、例え
ばコリネバクテリウム・グルタミクムのリジン生産菌株
であり、この菌株はAEC耐性 の他にこれと関連するホモセリン−及びロイシン−要求
性（米国特許第3708395号明細書）を示すか、又はメチ
オニンに対して敏感である（米国特許第3871960号明細
書）。
ばコリネバクテリウム・グルタミクムのリジン生産菌株
であり、この菌株はAEC耐性 の他にこれと関連するホモセリン−及びロイシン−要求
性（米国特許第3708395号明細書）を示すか、又はメチ
オニンに対して敏感である（米国特許第3871960号明細
書）。
これら古典的な方法の他に、コリネバクテリウム（Co
rynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibact
erium）属の形質転換を可能とするベクターシステムも
開発された（西独特許公開第3737719号及び同第3841453
号公報、Thierbach G.、Schwarzer A.、Ｐhler A.
著、Appl.Microbiol.Biotechnol.、第29巻、1988年、第
356〜362頁）。
rynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibact
erium）属の形質転換を可能とするベクターシステムも
開発された（西独特許公開第3737719号及び同第3841453
号公報、Thierbach G.、Schwarzer A.、Ｐhler A.
著、Appl.Microbiol.Biotechnol.、第29巻、1988年、第
356〜362頁）。
ヨーロツパ特許公開第0219027号公報には種々のアミ
ノ酸の製法が記載されており、ここでは組換えDNAでコ
リネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属の微生物
を形質転換し、こうしてアミノ酸の分泌量を上昇させ
る。
ノ酸の製法が記載されており、ここでは組換えDNAでコ
リネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属の微生物
を形質転換し、こうしてアミノ酸の分泌量を上昇させ
る。
この際、組換えDNAはアスパルテートセミアルデヒド
−デヒドロゲナーゼ又はアスパルテート−アミノトラン
スフエラーゼの合成に関してコードするDNA−フラグメ
ントを含有する。
−デヒドロゲナーゼ又はアスパルテート−アミノトラン
スフエラーゼの合成に関してコードするDNA−フラグメ
ントを含有する。
米国特許第4346170号明細書から、リジン形成を調節
する遺伝情報の大腸菌中でのクローン化が公知であり、
この遺伝情報はＬ−リジン−類似化合物、例えばAECに
対する耐性を有する同じ属の菌株からのものである。
する遺伝情報の大腸菌中でのクローン化が公知であり、
この遺伝情報はＬ−リジン−類似化合物、例えばAECに
対する耐性を有する同じ属の菌株からのものである。
米国特許第4560654号明細書の課題は同じ分野であ
る。しかしながら、ここではコリネバクテリウム・グル
タミクムのリジン要求性菌株中で同属のAEC−耐性菌株
からの遺伝情報をクローン化し、その結果としてリジン
が分泌される。
る。しかしながら、ここではコリネバクテリウム・グル
タミクムのリジン要求性菌株中で同属のAEC−耐性菌株
からの遺伝情報をクローン化し、その結果としてリジン
が分泌される。
クローン化DNA−フラグメントの同定は明らかにされ
ていない。
ていない。
ヨーロツパ特許公開第88166号公報からは、AEC−耐性
の表現型の形質転換により得られたコリネバクテリウム
・グルタミクムの菌株がリジンを分泌するということだ
けがわかる。
の表現型の形質転換により得られたコリネバクテリウム
・グルタミクムの菌株がリジンを分泌するということだ
けがわかる。
この目的のために使用した組換えプラスミドpAec5は
染色体DNAの3.9kbフラグメントをベクターpCG11のBgl I
I−切断位に挿入して含有する。
染色体DNAの3.9kbフラグメントをベクターpCG11のBgl I
I−切断位に挿入して含有する。
発明が解決しようとする課題 本発明の課題はコリネバクテリウム属又はブレビバク
テリウム属の微生物中のリジン生合成の重要な酵素の調
節性をリジン分泌体が生じるか、又はリジン分泌速度を
高めるように変化させることである。
テリウム属の微生物中のリジン生合成の重要な酵素の調
節性をリジン分泌体が生じるか、又はリジン分泌速度を
高めるように変化させることである。
課題を解決するための手段 本発明はＬ−リジンの製法に関し、この製法は、コリ
ネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物か
ら由来するアスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒド
ロゲナーゼ（asd）活性に導びき、かつ／又はアスパル
テート−キナーゼ（LysC）の調節解除に導びく蛋白質の
生産をコードする遺伝配列を示すDNAフラグメントか
ら、及びベクターDNAからなる組換えDNAをコリネバクテ
リウム属又はブレビバクテリウム属の、リジン生産性で
あつてよい微生物中に挿入し、このようにして得られた
形質転換体を好適な、自体公知の培地中で培養し、生じ
たＬ−リジンを公知法で分離することを特徴とする。
ネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物か
ら由来するアスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒド
ロゲナーゼ（asd）活性に導びき、かつ／又はアスパル
テート−キナーゼ（LysC）の調節解除に導びく蛋白質の
生産をコードする遺伝配列を示すDNAフラグメントか
ら、及びベクターDNAからなる組換えDNAをコリネバクテ
リウム属又はブレビバクテリウム属の、リジン生産性で
あつてよい微生物中に挿入し、このようにして得られた
形質転換体を好適な、自体公知の培地中で培養し、生じ
たＬ−リジンを公知法で分離することを特徴とする。
供与菌としては、すべての、有利にはＬ−リジン生産
性のブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属
の、相応するDNA−配列を有する菌を使用することがで
きるが、特にコリネバクテリウムATCC13032をエチルメ
タンスルホネートを用いて突然変異誘発することにより
生じ、かつAEC−耐性を示すコリネバクテリウム・グル
タミクムDM58−１を使用することができる。この菌株は
プラスミドpDM6に関する宿主菌として用いられる、番号
DSM4697として寄託されている。これは専門家に公知の
方法で分離され、菌株DM58−１が得られる。（FEMS Mic
robiology Review、第32巻、1986年、第149〜157頁）。
性のブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属
の、相応するDNA−配列を有する菌を使用することがで
きるが、特にコリネバクテリウムATCC13032をエチルメ
タンスルホネートを用いて突然変異誘発することにより
生じ、かつAEC−耐性を示すコリネバクテリウム・グル
タミクムDM58−１を使用することができる。この菌株は
プラスミドpDM6に関する宿主菌として用いられる、番号
DSM4697として寄託されている。これは専門家に公知の
方法で分離され、菌株DM58−１が得られる。（FEMS Mic
robiology Review、第32巻、1986年、第149〜157頁）。
染色体DNAを公知法で供与体から抽出し、制限エンド
ヌクレアーゼで処理する。
ヌクレアーゼで処理する。
ベクター中への染色体DNA−フラグメントの導入によ
る組換えDNAの製造の後、このようにして得られたプラ
スミド、本発明による例においてはその制限地図が第２
図中に示されているpCS2で微生物の形質転換を行ない、
かつコリネバクテリウム・グルタミクム中でプラスミド
DM2−1/pCS2はドイル微生物保存機関にDSM5086という番
号で寄託された。
る組換えDNAの製造の後、このようにして得られたプラ
スミド、本発明による例においてはその制限地図が第２
図中に示されているpCS2で微生物の形質転換を行ない、
かつコリネバクテリウム・グルタミクム中でプラスミド
DM2−1/pCS2はドイル微生物保存機関にDSM5086という番
号で寄託された。
有利なベクターシステムはpZ1（コリネバクテリウム
・グルタミクムDM274−２中で番号DSM4241として寄託）
であるか、又はpCV34、pCV36、pCVX4、pCVX10、pCVX1
5、pZ9、pZ8−１（西独特許公開第3841454.6号公報）又
はpCV35、pEM3、pECM1（西独特許公開第3841453.8号公
報）である。ヨーロツパ特許公開第93611号公報から公
知の集められたプラスミドも、コリネバクテリウム又は
ブレビバクテリウム中で自体複製するかぎり使用可能で
ある。特にpAJ655、pAJ611、pAJ440、pAJ1844及びpAJ31
48並びにPCG11、pCE54（ヨーロツパ特許公開第233581号
公報参照）、同様にpUL330（Santamaria、R.I.等著、J.
Bacteriology、第162号、1985年、第463〜467頁）も使
用可能である。
・グルタミクムDM274−２中で番号DSM4241として寄託）
であるか、又はpCV34、pCV36、pCVX4、pCVX10、pCVX1
5、pZ9、pZ8−１（西独特許公開第3841454.6号公報）又
はpCV35、pEM3、pECM1（西独特許公開第3841453.8号公
報）である。ヨーロツパ特許公開第93611号公報から公
知の集められたプラスミドも、コリネバクテリウム又は
ブレビバクテリウム中で自体複製するかぎり使用可能で
ある。特にpAJ655、pAJ611、pAJ440、pAJ1844及びpAJ31
48並びにPCG11、pCE54（ヨーロツパ特許公開第233581号
公報参照）、同様にpUL330（Santamaria、R.I.等著、J.
Bacteriology、第162号、1985年、第463〜467頁）も使
用可能である。
同様に本願の課題はこの組換えDNAを含有するコリネ
バクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物並び
に該微生物を使用した発酵によるＬ−リジンの製法に関
する。
バクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物並び
に該微生物を使用した発酵によるＬ−リジンの製法に関
する。
クローン化したDNA−フラグメント（第２図参照）は
配列分析から認識されるようにアスパルテート−キナー
ゼ遺伝子（LysC）の断片並びにアルパルチル−β−セミ
アルデヒド−デヒドロゲナーゼ（asd）の完全遺伝子を
含有する。
配列分析から認識されるようにアスパルテート−キナー
ゼ遺伝子（LysC）の断片並びにアルパルチル−β−セミ
アルデヒド−デヒドロゲナーゼ（asd）の完全遺伝子を
含有する。
このアスパルテート−キナーゼ遺伝子の断片はブレビ
バクテリウム・ズブチリス（B.Subtilis）からのアスパ
ルテート−キナーゼIIのβ−サブユニツトに相同のDNA
−配列を有する。
バクテリウム・ズブチリス（B.Subtilis）からのアスパ
ルテート−キナーゼIIのβ−サブユニツトに相同のDNA
−配列を有する。
そのプラスミドが該配列を有するすべての形質転換体
（pCS2、pCS21、pCS22、pCS23、pCS24、pCS26、pCS23
3）は、フイード・バツク抑制物質Ｌ−リジン及びＬ−
スレオニンに関して、ATCC13032からの染色体によりコ
ードされた酵素と比較して明らかに感度の低下したアス
パルテートキナーゼを含有し、AEC−耐性を示す。
（pCS2、pCS21、pCS22、pCS23、pCS24、pCS26、pCS23
3）は、フイード・バツク抑制物質Ｌ−リジン及びＬ−
スレオニンに関して、ATCC13032からの染色体によりコ
ードされた酵素と比較して明らかに感度の低下したアス
パルテートキナーゼを含有し、AEC−耐性を示す。
DM58−１からのPst I〜Xho I遺伝子フラグメントはLy
sC遺伝子（AK）の１部のみを、しかし完全asd−遺伝子
を包含するという、相同比較から出された推論は酵素測
定により明らかに確認することができた。
sC遺伝子（AK）の１部のみを、しかし完全asd−遺伝子
を包含するという、相同比較から出された推論は酵素測
定により明らかに確認することができた。
pCS2又はpCS2−誘導体で形質転換されたコリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC13032菌株のいずれも、意外
にも受容菌に対して高められたアスパルテート−キナー
ゼ活性を有さない（第４表、第３欄）。
リウム・グルタミクムATCC13032菌株のいずれも、意外
にも受容菌に対して高められたアスパルテート−キナー
ゼ活性を有さない（第４表、第３欄）。
これに対して、プラスミドがasd−構造遺伝子を有す
るすべての形質転換体においてはアスパルチル−β−セ
ミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ASA−DH）の強い過
剰表現が検出可能である（第４表、第２欄、第３及び第
４図）。プラスミドpCS23及びpCS23−誘導体は予期した
ようにASA−DHの過剰表現に導びかない。
るすべての形質転換体においてはアスパルチル−β−セ
ミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ASA−DH）の強い過
剰表現が検出可能である（第４表、第２欄、第３及び第
４図）。プラスミドpCS23及びpCS23−誘導体は予期した
ようにASA−DHの過剰表現に導びかない。
pCS2及びこれから誘導された誘導体を用いて本発明に
よるDNA−フラグメントをクローン化する際に生じるASA
−DHの著しい過剰発現はアスパルテート−キナーゼ反応
の生成物のβ−アスパルチルホスフエートへの十分な交
換を保証し、これによりもはや抑制不可能なアスパルテ
ート−キナーゼ反応の促進が生じる。
よるDNA−フラグメントをクローン化する際に生じるASA
−DHの著しい過剰発現はアスパルテート−キナーゼ反応
の生成物のβ−アスパルチルホスフエートへの十分な交
換を保証し、これによりもはや抑制不可能なアスパルテ
ート−キナーゼ反応の促進が生じる。
ASH−DHの高い崩壊性のために特異的活性から予期可
能な31〜65の過剰発現のフアクターは変動する。
能な31〜65の過剰発現のフアクターは変動する。
公知技術に対する著しい単純化が得られたが、このこ
とは第１に、リジン分泌に作用するか、又は分泌を改良
するためにアスパルテート−キナーゼの調節解除に導び
くLysC遺伝子の断片のみを単離すればよいということか
ら、第２にオペロン中でのLysCとasdの構成のために、
突然変異Lys−遺伝子と共に生じるAEC−耐性によりasd
−遺伝子を付加的な実験なしにLysC−遺伝子と共に単離
することができるということから得られた。反対にasd
−突然変異体を用いて、LysC＋asdを含有するDNA−フラ
グメントを単離することもできる；すなわちLysCが突然
変異したかしないかということとは独立して単離するこ
ともできる。
とは第１に、リジン分泌に作用するか、又は分泌を改良
するためにアスパルテート−キナーゼの調節解除に導び
くLysC遺伝子の断片のみを単離すればよいということか
ら、第２にオペロン中でのLysCとasdの構成のために、
突然変異Lys−遺伝子と共に生じるAEC−耐性によりasd
−遺伝子を付加的な実験なしにLysC−遺伝子と共に単離
することができるということから得られた。反対にasd
−突然変異体を用いて、LysC＋asdを含有するDNA−フラ
グメントを単離することもできる；すなわちLysCが突然
変異したかしないかということとは独立して単離するこ
ともできる。
１ 遺伝子供与菌DM58−１及び遺伝子受容菌ATCC13032
の特徴付け 1.1 菌株DM58−１の発生及び表現型 コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ATCC13032を
通常濃度のエチルメタンスルホネートで突然変異誘発を
行なうことにより菌株DM58−１が生じた。
の特徴付け 1.1 菌株DM58−１の発生及び表現型 コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ATCC13032を
通常濃度のエチルメタンスルホネートで突然変異誘発を
行なうことにより菌株DM58−１が生じた。
選択はこのように得られた突然変異体の混合物を最少
培地上に塗布することにより行なつた。この最少培地の
組成は蒸留水（pH7.0）１あたりグルコース20g、（NH
4）2SO410g、尿素2.5g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O0.4g、F
eSO4・7H2O2mg、MnSO4・H2O1.5mg、ビオチン300μｇ、
チアミン900μｇ及び寒天20gであり、これは好適な濃度
のＳ−アミノエチル−D,L−システイン（AEC）を含有す
る。このような培地上で分裂能力を有する、選択培地か
ら単離されたクローンはAEC−耐性の他に全く他の遺伝
的特徴を有さない。これをDM58−１と名命する。
培地上に塗布することにより行なつた。この最少培地の
組成は蒸留水（pH7.0）１あたりグルコース20g、（NH
4）2SO410g、尿素2.5g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O0.4g、F
eSO4・7H2O2mg、MnSO4・H2O1.5mg、ビオチン300μｇ、
チアミン900μｇ及び寒天20gであり、これは好適な濃度
のＳ−アミノエチル−D,L−システイン（AEC）を含有す
る。このような培地上で分裂能力を有する、選択培地か
ら単離されたクローンはAEC−耐性の他に全く他の遺伝
的特徴を有さない。これをDM58−１と名命する。
1.2 ATCC13032及びDM58−１中のアスパルテート−キナ
ーゼ及びアスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロ
ゲナーゼに関する酵素含量 菌株ATCC13032とDM58−１をスタンダードＩブイヨン
（Merk社、種類番号7882）中、付加的にグルコース4g/
及び1mMMgCl2と共に、30℃及び150r.p.mで直接比較可
能な条件下に早期定常期に達するまで培養し、培地の遠
心分離により分離する。100mMトリス/HC（pH7.5）;1m
M DTTで３回洗浄し、湿潤細胞塊を同じ緩衝液の容積中
に懸濁させる。
ーゼ及びアスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロ
ゲナーゼに関する酵素含量 菌株ATCC13032とDM58−１をスタンダードＩブイヨン
（Merk社、種類番号7882）中、付加的にグルコース4g/
及び1mMMgCl2と共に、30℃及び150r.p.mで直接比較可
能な条件下に早期定常期に達するまで培養し、培地の遠
心分離により分離する。100mMトリス/HC（pH7.5）;1m
M DTTで３回洗浄し、湿潤細胞塊を同じ緩衝液の容積中
に懸濁させる。
このように懸濁した細胞をボールミル（B.Braun Mels
ungen−MSK−Homogenisator、IMA−Disintegrator参
照）中で適量のガラス球と攪拌することにより破砕す
る。この細胞均質物をガラスフイルター吸引濾過器を用
いてガラス球から分離し、30000×ｇで30分間遠心分離
して澄明にする。
ungen−MSK−Homogenisator、IMA−Disintegrator参
照）中で適量のガラス球と攪拌することにより破砕す
る。この細胞均質物をガラスフイルター吸引濾過器を用
いてガラス球から分離し、30000×ｇで30分間遠心分離
して澄明にする。
酵素を安定化する緩衝液中で15時間の透析の後、次の
テスト混合物中で酵素活性が測定された： アスパルテート−キナーゼテスト:100mMトリス/HC
（pH7.5）、1mM DDT、400mM（NH4）2SO4、20mM MgCl2、
400mMNH2OH・HC、300mM L−アスパルテート、40mM AT
P及び種々の量の酵素調剤 酵素反応を37℃で30分間恒温保持した後、酵素テスト
混合物500μに10％FeCl3・6H2O;3.3％TCA;0.7NHCか
らなる溶液750μを添加することにより酵素反応を中
断する。検量線法により測光法（△E540nm）で測定した
アスパルチル−β−ヒドロキサメート濃度から、μMol/
mg・分（U/mg）で表わす酵素活性を計算する。所属の蛋
白質濃度はローリイ（Lowry）等の方法（ローリイ等、
J.Biol.Chem.、第193巻、第265頁、1951年）又はブラツ
ドフオード（Bradford;Anal.Biochem.第72巻、第248
頁、1976年）の方法により実施した。アスパルチル−β
−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼテストは120mMジ
エタノールアミン（pH9.0）;40mM NaAsO4;1mM NADP+;5m
M L−スレオニン;1.3mMアスパルチル−β−セミアルデ
ヒド及び種々の量の酵素調剤を全容量1ml中に含有す
る。μMol/mg・分（U/mg）で示した活性を測光法（△E5
40nm）により測定したNADPH合成速度を介して計算す
る。
テスト混合物中で酵素活性が測定された： アスパルテート−キナーゼテスト:100mMトリス/HC
（pH7.5）、1mM DDT、400mM（NH4）2SO4、20mM MgCl2、
400mMNH2OH・HC、300mM L−アスパルテート、40mM AT
P及び種々の量の酵素調剤 酵素反応を37℃で30分間恒温保持した後、酵素テスト
混合物500μに10％FeCl3・6H2O;3.3％TCA;0.7NHCか
らなる溶液750μを添加することにより酵素反応を中
断する。検量線法により測光法（△E540nm）で測定した
アスパルチル−β−ヒドロキサメート濃度から、μMol/
mg・分（U/mg）で表わす酵素活性を計算する。所属の蛋
白質濃度はローリイ（Lowry）等の方法（ローリイ等、
J.Biol.Chem.、第193巻、第265頁、1951年）又はブラツ
ドフオード（Bradford;Anal.Biochem.第72巻、第248
頁、1976年）の方法により実施した。アスパルチル−β
−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼテストは120mMジ
エタノールアミン（pH9.0）;40mM NaAsO4;1mM NADP+;5m
M L−スレオニン;1.3mMアスパルチル−β−セミアルデ
ヒド及び種々の量の酵素調剤を全容量1ml中に含有す
る。μMol/mg・分（U/mg）で示した活性を測光法（△E5
40nm）により測定したNADPH合成速度を介して計算す
る。
第１表はC.グルタミクムATCC13032及びDM58−１の同
じに培養し、かつ処理した細胞を粗抽出物中の両方の酵
素の特異的酵素活性を示す。両方の菌株のアスパルテー
ト−キナーゼに関する比較可能な含量の他に、AEC耐性
突然変異体DM58−１は野生型に比較して約５倍高められ
たアスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナー
ゼ活性を有する。
じに培養し、かつ処理した細胞を粗抽出物中の両方の酵
素の特異的酵素活性を示す。両方の菌株のアスパルテー
ト−キナーゼに関する比較可能な含量の他に、AEC耐性
突然変異体DM58−１は野生型に比較して約５倍高められ
たアスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナー
ゼ活性を有する。
1.3 C.グルタミクムATCC13032及びDM58−１からのアス
パルテート−キナーゼの試験管内抑制性 第１表は、すでにK.ナカヤマ等（K.ナカヤマ等、Agr.
Biol.Chem.、第30巻、第611頁、1966年）により示唆さ
れ、かつS.N.カラームルザ等（S.N.Kara−Murza、Prikl
adnaya Biokhimiya;Mikrobiologia、第14巻、第345頁、
1978年）により更に正確に実験されたC.グルタミクム野
生型酵素の抑制性が我々により再現されることができた
ことを示す。これに対して、アスパルテート−キナーゼ
がもはや協調してＬ−リジン＋Ｌ−スレオニンにより抑
制可能でないAEC耐性突然変異細胞DM58−１の酵素の明
らかに異なる性質を示す。ATCC13032からの酵素にリジ
ン−類似に作用する物質Ｓ−アミノエチル−D,L−シス
テイン（AEC）により、突然変異体の酵素は同様に僅か
に影響をうけるにすぎない。
パルテート−キナーゼの試験管内抑制性 第１表は、すでにK.ナカヤマ等（K.ナカヤマ等、Agr.
Biol.Chem.、第30巻、第611頁、1966年）により示唆さ
れ、かつS.N.カラームルザ等（S.N.Kara−Murza、Prikl
adnaya Biokhimiya;Mikrobiologia、第14巻、第345頁、
1978年）により更に正確に実験されたC.グルタミクム野
生型酵素の抑制性が我々により再現されることができた
ことを示す。これに対して、アスパルテート−キナーゼ
がもはや協調してＬ−リジン＋Ｌ−スレオニンにより抑
制可能でないAEC耐性突然変異細胞DM58−１の酵素の明
らかに異なる性質を示す。ATCC13032からの酵素にリジ
ン−類似に作用する物質Ｓ−アミノエチル−D,L−シス
テイン（AEC）により、突然変異体の酵素は同様に僅か
に影響をうけるにすぎない。
2. フイードバツク耐性アスパルテート−キナーゼに関
してコードするC.グルタミクム菌株DM58−１のDNA−フ
ラグメントのクローン化 2.1 クローン化 全DNAをチヤター（Chater）等により記載されている
ように（Chater等、Curr.Topics Microb.Immunol.、第9
6巻、第69頁、1982年）単離し、部分的に制限酵素Pst I
で消化する。ドイツ特許出願第3737729.9号明細書中に
記載されているベクターpZ1（第１図）をPst Iで直線と
し、アルカル性ホスフアターゼで処理することにより脱
ホスホリル化する。ベクターDNAとDM58−1DNAを混合
し、マニアテイス（Maniatis）等により記載されている
ように（Maniatis、T.等著、Molecular Cloning、A Lab
oratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、19
82年）T4DNA−リガーゼで処理した。C.グルタミクムATC
C13032の連結混合物を用いる形質転換はテイーヤバツハ
（Thierbach）等により記載されているように（Thwierb
ach、G.等著、Applied Microbiology and Biotechnolog
y、第29巻、第356頁、1988年）実施した。
してコードするC.グルタミクム菌株DM58−１のDNA−フ
ラグメントのクローン化 2.1 クローン化 全DNAをチヤター（Chater）等により記載されている
ように（Chater等、Curr.Topics Microb.Immunol.、第9
6巻、第69頁、1982年）単離し、部分的に制限酵素Pst I
で消化する。ドイツ特許出願第3737729.9号明細書中に
記載されているベクターpZ1（第１図）をPst Iで直線と
し、アルカル性ホスフアターゼで処理することにより脱
ホスホリル化する。ベクターDNAとDM58−1DNAを混合
し、マニアテイス（Maniatis）等により記載されている
ように（Maniatis、T.等著、Molecular Cloning、A Lab
oratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、19
82年）T4DNA−リガーゼで処理した。C.グルタミクムATC
C13032の連結混合物を用いる形質転換はテイーヤバツハ
（Thierbach）等により記載されているように（Thwierb
ach、G.等著、Applied Microbiology and Biotechnolog
y、第29巻、第356頁、1988年）実施した。
第１図はプラスミドpZ1の制限地図である。太い線はp
HM1519部分を示し、細い線はpZ1のpACYC177部分を示
す。ApR:アンピシリン耐性遺伝子;KmR:カナマイシン耐
性遺伝子。
HM1519部分を示し、細い線はpZ1のpACYC177部分を示
す。ApR:アンピシリン耐性遺伝子;KmR:カナマイシン耐
性遺伝子。
形質転換混合物をカナマイシン300μg/mlを有するRCG
/E−寒天培地錠に塗り、この寒天培地を１週間30℃で恒
温保持した。引き続きこの寒天培地を50mM AEC及び50mM
L−スレオニンを含有するMM−寒天培地（カツマタ、R.
等、J.Bact、第159巻、第306頁、1984年）上にスタンプ
を押すように移し、１日間30℃で培養した。この寒天上
で成長することのできたコロニーを付加的にAEC、Ｌ−
スレオニン及びカナマイシン10μg/mlを含有するMM−寒
天上に塗布し、個別のコロニーを得る。プラスミドDNA
をこの種のクローンから単離し、pCS2と成づけ、C.グル
タミクムATCC13032の形質転換のために使用する。審査
したカナマイシン耐性突然変異体62のうち59は50mM AEC
及び50mML−スレオニンによる抑制に対して耐性である
ことが判明した。このプラスミドpCS2を更に制限地図に
書くことにより特徴付けした。これは長さ6.9kbを有す
るベクターpZ1のPst I−切断位中に長さ約9.9kbの挿入
体を有する。pCS2の制限地図を第２図中に示す。
/E−寒天培地錠に塗り、この寒天培地を１週間30℃で恒
温保持した。引き続きこの寒天培地を50mM AEC及び50mM
L−スレオニンを含有するMM−寒天培地（カツマタ、R.
等、J.Bact、第159巻、第306頁、1984年）上にスタンプ
を押すように移し、１日間30℃で培養した。この寒天上
で成長することのできたコロニーを付加的にAEC、Ｌ−
スレオニン及びカナマイシン10μg/mlを含有するMM−寒
天上に塗布し、個別のコロニーを得る。プラスミドDNA
をこの種のクローンから単離し、pCS2と成づけ、C.グル
タミクムATCC13032の形質転換のために使用する。審査
したカナマイシン耐性突然変異体62のうち59は50mM AEC
及び50mML−スレオニンによる抑制に対して耐性である
ことが判明した。このプラスミドpCS2を更に制限地図に
書くことにより特徴付けした。これは長さ6.9kbを有す
るベクターpZ1のPst I−切断位中に長さ約9.9kbの挿入
体を有する。pCS2の制限地図を第２図中に示す。
第２図はプラスミドpCS2の直線形での制限地図であ
る。図面の上部は種々の制限切断位の位置を再たび示
す。図面の下部中にはプラスミドpCS2の種々の領域が示
されている。DM58−1DNAの挿入は白地の部分として示さ
れている。pZ1のアンピシリン耐性遺伝子は黒く目だた
せてあり、カナマイシン耐性遺伝子は点で示した。pCS2
のその他のpZ1−部分は斜線で示した。略語:BamH I、B;
Bcl I、C;Sal I、S;Sca、A;Sma I、M;Xho I、Ｘ。
る。図面の上部は種々の制限切断位の位置を再たび示
す。図面の下部中にはプラスミドpCS2の種々の領域が示
されている。DM58−1DNAの挿入は白地の部分として示さ
れている。pZ1のアンピシリン耐性遺伝子は黒く目だた
せてあり、カナマイシン耐性遺伝子は点で示した。pCS2
のその他のpZ1−部分は斜線で示した。略語:BamH I、B;
Bcl I、C;Sal I、S;Sca、A;Sma I、M;Xho I、Ｘ。
2.2 アスパルテート−キナーゼ−活性の特徴付け アスパルテート−キナーゼ−活性を菌株ATCC13032/pC
S2中で測定したが、この際プラスの対照として菌株DM58
−１中で、かつマイナスの対照として菌株ATCC13032中
でこの活性を測定した。この菌株をグルコース4g/、
カナマイシン10μg/ml及びMgCl21mMを追加した標準Ｉブ
イヨン中で培養した。培養条件、細胞収穫、細胞破砕及
びアスパルテート−キナーゼの測定は1.2に記載したよ
うに実施した。有効物質Ｌ−Lys、Ｌ−Thr及びAECはそ
れぞれpH7.5の100mMトリス/HC緩衝液中の原液として
使用する。
S2中で測定したが、この際プラスの対照として菌株DM58
−１中で、かつマイナスの対照として菌株ATCC13032中
でこの活性を測定した。この菌株をグルコース4g/、
カナマイシン10μg/ml及びMgCl21mMを追加した標準Ｉブ
イヨン中で培養した。培養条件、細胞収穫、細胞破砕及
びアスパルテート−キナーゼの測定は1.2に記載したよ
うに実施した。有効物質Ｌ−Lys、Ｌ−Thr及びAECはそ
れぞれpH7.5の100mMトリス/HC緩衝液中の原液として
使用する。
ATCC13032/pCS2からの酵素のアスパルテート−キナー
ゼ含量及び抑制性を第４表に示す。この菌株が全く高め
られた特異的活性を示さないにもかかわらず、前記抑制
物質に対する明らかな脱敏感性を照明することができ
た。ただしその程度は遺伝子供給体DM58−１からの酵素
の抑制解除の度合には達しない（部分的抑制解除）。
ゼ含量及び抑制性を第４表に示す。この菌株が全く高め
られた特異的活性を示さないにもかかわらず、前記抑制
物質に対する明らかな脱敏感性を照明することができ
た。ただしその程度は遺伝子供給体DM58−１からの酵素
の抑制解除の度合には達しない（部分的抑制解除）。
2.3 Ｌ−リジン−分泌の測定 リジンを分泌する能力を菌株ATCC13032/pCS2において
測定し、かつ菌株ATCC13032/pZ1中でマイナス対照とし
て測定した。カナマイシン10μg/mlの添加後、該内容を
下記のように実施した。実験の結果を第２表中にまとめ
る。
測定し、かつ菌株ATCC13032/pZ1中でマイナス対照とし
て測定した。カナマイシン10μg/mlの添加後、該内容を
下記のように実施した。実験の結果を第２表中にまとめ
る。
隔壁を備える100ml三角フラスコをこの際次の培地100
mlで満たす：硫酸アンモニウム12g/、糖密240g/、
大豆粉加水分解物60ml/及びCaCO310g/。
mlで満たす：硫酸アンモニウム12g/、糖密240g/、
大豆粉加水分解物60ml/及びCaCO310g/。
接種した後、この培養体を30℃、300r.p.mで72時間高温
保持する。リジン測定は遠心分離上澄液中でアミノ酸分
析装置を用いて行なつた。
保持する。リジン測定は遠心分離上澄液中でアミノ酸分
析装置を用いて行なつた。
3. フイード・バツク耐性アスパルテート−キナーゼに
関してコードするpCS2のDNA−フラグメントの欠失地図
化 低いDNA濃度において、pCS2を種々の制限酵素で完全
に、又は部分的に消化し、引き続きT4DNA−リガーゼで
処理することにより種々の欠失誘導体を製造した。種々
の欠失誘導体の製造は第３表中にまとめられており、種
々の誘導体中の欠失の位置を第３図中に示す。第３図中
にはC.グルタミクムATCC13032から誘導された菌株のAEC
に対する耐性挙動が示されている。このようにしてAEC
−耐性を示すDNA−域はプラスミドpCS233中のPst IPク
ローン化切断位とEcoR I−切断位により限定される長さ
約1.5kbのフラグメント上に限定される。
関してコードするpCS2のDNA−フラグメントの欠失地図
化 低いDNA濃度において、pCS2を種々の制限酵素で完全
に、又は部分的に消化し、引き続きT4DNA−リガーゼで
処理することにより種々の欠失誘導体を製造した。種々
の欠失誘導体の製造は第３表中にまとめられており、種
々の誘導体中の欠失の位置を第３図中に示す。第３図中
にはC.グルタミクムATCC13032から誘導された菌株のAEC
に対する耐性挙動が示されている。このようにしてAEC
−耐性を示すDNA−域はプラスミドpCS233中のPst IPク
ローン化切断位とEcoR I−切断位により限定される長さ
約1.5kbのフラグメント上に限定される。
リジンもしくはAEC及びスレオニンの混合物により、
アスパルテート−キナーゼ−活性及び酵素活性の抑制性
は構成されたクローン中で測定された。培養、破砕及び
活性測定を前記のように実施した。更に、Ｌ−リジンを
分泌する能力を種々のクローンについて調べた。このた
めにはC.グルタミクムのＬ−リジン要求性指示菌株を用
いる寒天プレート拡散テストを使用した。第４表から
は、すべてのAEC耐性菌株が部分的に抑制解除されたア
スパルテート−キナーゼ−活性を有し、かつＬ−リジン
を分泌することができることがわかる。
アスパルテート−キナーゼ−活性及び酵素活性の抑制性
は構成されたクローン中で測定された。培養、破砕及び
活性測定を前記のように実施した。更に、Ｌ−リジンを
分泌する能力を種々のクローンについて調べた。このた
めにはC.グルタミクムのＬ−リジン要求性指示菌株を用
いる寒天プレート拡散テストを使用した。第４表から
は、すべてのAEC耐性菌株が部分的に抑制解除されたア
スパルテート−キナーゼ−活性を有し、かつＬ−リジン
を分泌することができることがわかる。
第３図はプラスミドpCS2の欠失地図である。図面の上
方はpCS2から誘導された誘導体を示し、下方はpCS23か
ら誘導された誘導体を示す。pZ1のアンピシリン耐性遺
伝子は黒く示されており、カナマイシン耐性遺伝子は点
で示されている;pCS2の他のpZ1部分は斜線により示され
ている。DM58−1DNAの挿入は白地の帯状に示されてい
る。欠失は線として示した。略語:BamH I、B;Bcl I、C:
Dra I、D;EcoR I、E;Sal I、S;Sca I、A;Sma I、M;Xho
I、Ｘ。
方はpCS2から誘導された誘導体を示し、下方はpCS23か
ら誘導された誘導体を示す。pZ1のアンピシリン耐性遺
伝子は黒く示されており、カナマイシン耐性遺伝子は点
で示されている;pCS2の他のpZ1部分は斜線により示され
ている。DM58−1DNAの挿入は白地の帯状に示されてい
る。欠失は線として示した。略語:BamH I、B;Bcl I、C:
Dra I、D;EcoR I、E;Sal I、S;Sca I、A;Sma I、M;Xho
I、Ｘ。
4. 表現型AEC−耐性を示す、プラスミドpCS24のDNA−
フラグメントの配列決定 4.1 配列決定法 21kbのPst I−Xho I−DNA−フラグメントのヌクレオ
チド配列をマクサム及びギルバートの方法（Maxam、A.
M.等著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第74巻、560〜564頁、
1977年）によりアーノルド（arnold）及びピユーター
（Ｐhler）の変法（Arnold.W.等、Gene、第70巻、第1
71頁以降、1988年）で測定した。配列決定のためのサブ
クローン化はこの際プラスミドpCS24（第４図）から出
発した。これらは大腸菌MM294（Merelson M.等著、Natu
re第217頁、第1110〜1114頁、1968年）により形質転換
され、相応するフラグメントを配列決定ベクターpSVB2
1、25及び26（Arnold、W.等、Gene、第70巻、第171頁以
降、1988年）中でクローン化した。大腸菌株JM83（Mess
ing J.Recombinaut DNA Technical Bulletin NIH Publi
cation No.79〜99、第２巻、第43〜48頁、1979年）中で
XGal−テスト（５−ブロモ−４−クロル−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド）により挿入不活化を証明
することができた。
フラグメントの配列決定 4.1 配列決定法 21kbのPst I−Xho I−DNA−フラグメントのヌクレオ
チド配列をマクサム及びギルバートの方法（Maxam、A.
M.等著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第74巻、560〜564頁、
1977年）によりアーノルド（arnold）及びピユーター
（Ｐhler）の変法（Arnold.W.等、Gene、第70巻、第1
71頁以降、1988年）で測定した。配列決定のためのサブ
クローン化はこの際プラスミドpCS24（第４図）から出
発した。これらは大腸菌MM294（Merelson M.等著、Natu
re第217頁、第1110〜1114頁、1968年）により形質転換
され、相応するフラグメントを配列決定ベクターpSVB2
1、25及び26（Arnold、W.等、Gene、第70巻、第171頁以
降、1988年）中でクローン化した。大腸菌株JM83（Mess
ing J.Recombinaut DNA Technical Bulletin NIH Publi
cation No.79〜99、第２巻、第43〜48頁、1979年）中で
XGal−テスト（５−ブロモ−４−クロル−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド）により挿入不活化を証明
することができた。
配列決定計画を第４図に示す。ヌクレオチド配列を重
なりあるクローンを有する両方のDNA−鎖により調べ
た。
なりあるクローンを有する両方のDNA−鎖により調べ
た。
第４図はプラスミドpCS2の染色体フラグメントの欠失
分析及び配列決定計画を示す図である。
分析及び配列決定計画を示す図である。
欠失分析：プラスミドpCS23及びpCS24はクローンpCS2
と同様にAEC−耐性とリジン生産を示す。斜線の帯はプ
ラスミドのベクター部を示す。
と同様にAEC−耐性とリジン生産を示す。斜線の帯はプ
ラスミドのベクター部を示す。
配列決定計画：プラスミドpCS24の2.1kb Pst I−Xho
I−フラグメントを、示した制限切断位でサブクローン
化した。矢印は配列決定した領域と読み取り方向を示
す。酵素Dra I（Ｄ）、EcoR I（Ｅ）、Bgl II（Ｇ）、H
ind III（Ｈ）、Nae I（Ｎ）、Pst I（Ｐ）、Sal I
（Ｓ）及びXho I（Ｘ）の制限切断位を書き入れた。そ
の下には２つの開放読み取り枠が示されており、これら
はアスパルテート−キナーゼのサブユニツト及びアスパ
ルテート−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼに関
してコードする。
I−フラグメントを、示した制限切断位でサブクローン
化した。矢印は配列決定した領域と読み取り方向を示
す。酵素Dra I（Ｄ）、EcoR I（Ｅ）、Bgl II（Ｇ）、H
ind III（Ｈ）、Nae I（Ｎ）、Pst I（Ｐ）、Sal I
（Ｓ）及びXho I（Ｘ）の制限切断位を書き入れた。そ
の下には２つの開放読み取り枠が示されており、これら
はアスパルテート−キナーゼのサブユニツト及びアスパ
ルテート−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼに関
してコードする。
4.2 2.1kbのPst I−Xho I−DNAフラグメントのDNA配列 配列決定されるDNA−片は長さ2112bpである。これは
酵素Bgl II、Dra I、EcoR I、Hind III、Nae I、Pst
I、Sal I及びXho Iに関する制限切断位を有し、これら
を用いてサブクローンを製造した（第５図）。ヌクレオ
チド配列を配列分析−プログラムパツクANALYSEQ（Stad
en、R.等著、Nucl.Acids Res.第14巻、第217〜232頁、1
986年）で処理した。
酵素Bgl II、Dra I、EcoR I、Hind III、Nae I、Pst
I、Sal I及びXho Iに関する制限切断位を有し、これら
を用いてサブクローンを製造した（第５図）。ヌクレオ
チド配列を配列分析−プログラムパツクANALYSEQ（Stad
en、R.等著、Nucl.Acids Res.第14巻、第217〜232頁、1
986年）で処理した。
配列決定DNA−片上には２本の長い開放読み取り枠（O
RF）が存在する。両方ともPst I−切断位からXho I−切
断位の間に配置されている。両方の間には26bpの小さい
領域のみが存在する。リボソーム結合位（RBS）が第2OR
Fの前に存在する。同様に第17ORFの中にRBSが局在する
（開始コドンGTGを有するAGGA、268〜271）。ORF1はPst
I−切断位から計算してアミノ酸（AS）264の長さを有
し、内部RBSから172AS（18.6kDalに相応する）の長さを
有する。ORF2は342AS（36.1kDal）の長さである。
RF）が存在する。両方ともPst I−切断位からXho I−切
断位の間に配置されている。両方の間には26bpの小さい
領域のみが存在する。リボソーム結合位（RBS）が第2OR
Fの前に存在する。同様に第17ORFの中にRBSが局在する
（開始コドンGTGを有するAGGA、268〜271）。ORF1はPst
I−切断位から計算してアミノ酸（AS）264の長さを有
し、内部RBSから172AS（18.6kDalに相応する）の長さを
有する。ORF2は342AS（36.1kDal）の長さである。
ORF2のすぐ後方には可能応な転写終結構造、いわゆる
ヘヤピンループが存在し、多くのチミン基が続く（1864
〜1900）。この配置は大腸菌及び他の菌種中のρ−独立
終結シグナルに特徴的である（Ahyda等著、Ann.Rev.Bic
hem.第47巻、第967頁−996頁、1978年）。ここに存在す
るターミネーターは30℃で−40kcal/molより大きい安定
性を有する。
ヘヤピンループが存在し、多くのチミン基が続く（1864
〜1900）。この配置は大腸菌及び他の菌種中のρ−独立
終結シグナルに特徴的である（Ahyda等著、Ann.Rev.Bic
hem.第47巻、第967頁−996頁、1978年）。ここに存在す
るターミネーターは30℃で−40kcal/molより大きい安定
性を有する。
ORF2に可能なプロモーターはORF1の中に見い出される
（409〜437、TTGACA−17bp−TATTCT）。−35−領域及び
−10−領域への間隔はまさに大腸菌共通プロモーターに
相応し（Hawley、D.K.等著、Nucl.Acids Res.第11巻、
第2237〜2255頁、1983年）、この−10−領域は大腸菌共
通域（TATAAT）に非常に似ている。
（409〜437、TTGACA−17bp−TATTCT）。−35−領域及び
−10−領域への間隔はまさに大腸菌共通プロモーターに
相応し（Hawley、D.K.等著、Nucl.Acids Res.第11巻、
第2237〜2255頁、1983年）、この−10−領域は大腸菌共
通域（TATAAT）に非常に似ている。
第５図は2.1kbのPst I−Xho I−フラグメントのDNA配
列及び誘導されたアミノ酸配列の図である。ORF1（１〜
794）及びORF2（821〜1846）のアミノ酸配列に関しては
３文字コードを記載した。DNA鎖の下の数字はDNA−配列
に関して示す。配列決定のために使用したクローン化切
断位は同様に下に記載した。リボソーム結合位は星印
で、開始コドンは矢印（）で、かつターミネーター構
造は線（−）により記載した。
列及び誘導されたアミノ酸配列の図である。ORF1（１〜
794）及びORF2（821〜1846）のアミノ酸配列に関しては
３文字コードを記載した。DNA鎖の下の数字はDNA−配列
に関して示す。配列決定のために使用したクローン化切
断位は同様に下に記載した。リボソーム結合位は星印
で、開始コドンは矢印（）で、かつターミネーター構
造は線（−）により記載した。
4.3 アミノ酸配列の分析 ORF1及びORF2から翻訳されたアミノ酸配列を大腸菌か
らのアスパルテート−キナーゼ（AK）Ｉの公知配列（Ca
ssan、M.等著、J.Biol.Chem.、第261巻、第1052〜1057
頁、1986年）及びB.ズブチリス（Subtilis）からのAK I
Iの公知配列（Chem、N.−Y.等著、J.Biol.Chem、第262
巻、第8737〜2255頁、1987年）もしくは大腸菌のアスパ
ルテートセミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ASA−D
H）のAS−配列（Haziza、C.等著、Embo J.第１巻、第37
9〜384頁、1982年）及びストレプトコツカス・ムタン
（Streptococcus mutan;Cardineau、G.A.等著、J.Biol.
Chem,第262巻、第７号、第3344〜3353頁、1987年）と比
較する。このためにはプログラムMALIGN（Sobel、E.等
著、Nucl.Acids Res.第14巻、第363〜374頁、1986年）
及びDIAGON（Staden、R.等著、Nucl.Acids Res.、第14
巻、第217〜232頁、1986年）を使用した。１方ではORF1
とAK−配列との間の、及び他方ではORF2とS.ムタンのAS
A−DH−配列との間の明らかな一致が示された。大腸菌A
SA−DHに対しては弱い相同性のみを示した、じつさいと
くに活性中心の領域中で示した（Haziza、C.等著、Embo
J.、第１巻、第379〜384頁、1982年）。
らのアスパルテート−キナーゼ（AK）Ｉの公知配列（Ca
ssan、M.等著、J.Biol.Chem.、第261巻、第1052〜1057
頁、1986年）及びB.ズブチリス（Subtilis）からのAK I
Iの公知配列（Chem、N.−Y.等著、J.Biol.Chem、第262
巻、第8737〜2255頁、1987年）もしくは大腸菌のアスパ
ルテートセミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ASA−D
H）のAS−配列（Haziza、C.等著、Embo J.第１巻、第37
9〜384頁、1982年）及びストレプトコツカス・ムタン
（Streptococcus mutan;Cardineau、G.A.等著、J.Biol.
Chem,第262巻、第７号、第3344〜3353頁、1987年）と比
較する。このためにはプログラムMALIGN（Sobel、E.等
著、Nucl.Acids Res.第14巻、第363〜374頁、1986年）
及びDIAGON（Staden、R.等著、Nucl.Acids Res.、第14
巻、第217〜232頁、1986年）を使用した。１方ではORF1
とAK−配列との間の、及び他方ではORF2とS.ムタンのAS
A−DH−配列との間の明らかな一致が示された。大腸菌A
SA−DHに対しては弱い相同性のみを示した、じつさいと
くに活性中心の領域中で示した（Haziza、C.等著、Embo
J.、第１巻、第379〜384頁、1982年）。
コンピユーター分析から次のことが明らかになる： −ORF1はアスパルテート−キナーゼのＣ末端に相当す
る、すなわちＮ−末端の約160AS並びに完全プロモータ
ー領域が欠失する。
る、すなわちＮ−末端の約160AS並びに完全プロモータ
ー領域が欠失する。
−ORF2はアスパルテートセミアルデヒド−デヒドロゲナ
ーゼに相応する。
ーゼに相応する。
ORF1とB.ズブチリス−AK IIとの相同は専門家にとつ
て目につくことである。AK IIは重なり合うサブユニツ
トからなる（Chen、N.Y.等著、J.Biol.Chem、第262巻、
第8787〜8798頁、1987年）。この際、β−サブユニツト
はα−サブユニツトのＣ−末端に相応する。ORF1中で見
い出されるRBSはその位置で正確にこのAKのRBSと同一で
あるので、その結果C.グルタミクム（glutamicum）のAK
のクローン化β−サブユニツトが存在するということが
推論される。
て目につくことである。AK IIは重なり合うサブユニツ
トからなる（Chen、N.Y.等著、J.Biol.Chem、第262巻、
第8787〜8798頁、1987年）。この際、β−サブユニツト
はα−サブユニツトのＣ−末端に相応する。ORF1中で見
い出されるRBSはその位置で正確にこのAKのRBSと同一で
あるので、その結果C.グルタミクム（glutamicum）のAK
のクローン化β−サブユニツトが存在するということが
推論される。
5. 発現実験 5.1 大腸菌のasd−及びlysC−マイナス菌株の相補性 ORF2とasd−遺伝子との同一性はプラスミドpCS2とpCS
24によるasd−マイナス大腸菌株RASA6（Richaud、F.
等、C.R.Acad.Sc.Paris、第293巻、第507〜512頁、1981
年）の相補性により証明されることができた。ASA−DH
のＣ−末端の約50個のアミノ酸が欠けているのでpCS23
は相補性ではない。これらのプラスミドのいずれもがAK
I〜IIIマイナス大腸菌Gif106M1（Boy、E.等著、Bioche
mie、第61巻、第1151〜1160頁、1979年）を相補するこ
とができる立場ではなかつた。
24によるasd−マイナス大腸菌株RASA6（Richaud、F.
等、C.R.Acad.Sc.Paris、第293巻、第507〜512頁、1981
年）の相補性により証明されることができた。ASA−DH
のＣ−末端の約50個のアミノ酸が欠けているのでpCS23
は相補性ではない。これらのプラスミドのいずれもがAK
I〜IIIマイナス大腸菌Gif106M1（Boy、E.等著、Bioche
mie、第61巻、第1151〜1160頁、1979年）を相補するこ
とができる立場ではなかつた。
5.2 種々のpCS2欠失誘導体を有するATCC13032の形質転
換体中の特異的アスパルテート−キナーゼ（AK）及びア
スパルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ
（ASA−DH）の測定 DM58−１からのPst I−Xho I遺伝子フラグメントがly
sC遺伝子（AK）の１部のみ、しかし完全なasd−遺伝子
を有するという、4.3における相同体比較からひき出さ
れた推論が酵素測定により明らかに保証された。
換体中の特異的アスパルテート−キナーゼ（AK）及びア
スパルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ
（ASA−DH）の測定 DM58−１からのPst I−Xho I遺伝子フラグメントがly
sC遺伝子（AK）の１部のみ、しかし完全なasd−遺伝子
を有するという、4.3における相同体比較からひき出さ
れた推論が酵素測定により明らかに保証された。
pCS2又はpCS2誘導体で形質転換したC.グルタミクムAT
CC13032菌株は受容菌株に対して高められたアスパルテ
ート−キナーゼ活性を有する（第４表第３欄）。
CC13032菌株は受容菌株に対して高められたアスパルテ
ート−キナーゼ活性を有する（第４表第３欄）。
これに対して、プラスミドがasd−構造遺伝子を有す
るすべての形質転換体中ではASA−DHの大過剰発現が検
出可能であつた（第４表、第２欄、第３及び第４図）。
プラスミドpCS23とpCS23−誘導体とは予期されていたよ
うにASA−DHの過剰発現に導びかない。ASA−DHの高い崩
壊性のために、特異的活性から計算可能な過剰発現のフ
アクターは31〜65で揺れる。
るすべての形質転換体中ではASA−DHの大過剰発現が検
出可能であつた（第４表、第２欄、第３及び第４図）。
プラスミドpCS23とpCS23−誘導体とは予期されていたよ
うにASA−DHの過剰発現に導びかない。ASA−DHの高い崩
壊性のために、特異的活性から計算可能な過剰発現のフ
アクターは31〜65で揺れる。
6. 酵素特性及びＬ−リジン分泌 こうして、ATCC13032pC32に関して検出されるＬ−リ
ジン分泌7.1g/（72時間、第２表）は２つの遺伝工学
的に実施した変換に起因する。
ジン分泌7.1g/（72時間、第２表）は２つの遺伝工学
的に実施した変換に起因する。
ａ）細胞性酵素含量の上昇なしに、DM58−１からのアス
パルテート・キナーゼの調節サブユニツトのクローン化 ｂ）細胞性酵素含量の31〜65倍上昇に導びく、DM58−１
からのアスパルチル−５−β−セミアルデヒド−デヒド
ロゲナーゼのクローン化
パルテート・キナーゼの調節サブユニツトのクローン化 ｂ）細胞性酵素含量の31〜65倍上昇に導びく、DM58−１
からのアスパルチル−５−β−セミアルデヒド−デヒド
ロゲナーゼのクローン化
第１図はプラスミドpZ1の制限地図を示す図である。A
pR:アンピシリン耐性遺伝子;KmR:カナマイシン耐性遺伝
子。 第２図はプラスミドpCS2の直線形での制限地図を示す図
である。略語:BamH I、B;Bcl I、C;Sal I、S;Sca、A;Sm
a I、M;Xho I、Ｘ。 第３図はプラスミドpCS2の欠失地図を示す図である。略
語:BamH I、B;Bcl I、C;Dra I、D;EcoR I、E;Sal I、S;
Sca I、A;Sma I、M;Xho I、Ｘ。 第４図はプラスミドpCS2の染色体フラグメントの欠失分
析及び配列決定計画を示す図である。 第５図は2.1kbのPst I−Xho I−フラグメントのDNA配列
及び誘導されたアミノ酸配列の図である。
pR:アンピシリン耐性遺伝子;KmR:カナマイシン耐性遺伝
子。 第２図はプラスミドpCS2の直線形での制限地図を示す図
である。略語:BamH I、B;Bcl I、C;Sal I、S;Sca、A;Sm
a I、M;Xho I、Ｘ。 第３図はプラスミドpCS2の欠失地図を示す図である。略
語:BamH I、B;Bcl I、C;Dra I、D;EcoR I、E;Sal I、S;
Sca I、A;Sma I、M;Xho I、Ｘ。 第４図はプラスミドpCS2の染色体フラグメントの欠失分
析及び配列決定計画を示す図である。 第５図は2.1kbのPst I−Xho I−フラグメントのDNA配列
及び誘導されたアミノ酸配列の図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 イエルン・カリノヴスキ ドイツ連邦共和国ビーレフエルト１・ド レーゲシユトラーセ 25 (72)発明者 アルフレート・ピユーラー ドイツ連邦共和国ビーレフエルト15・ア ム・ヴアルトシ ユレスシエン ２ (56)参考文献 特開 昭62−79788（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/21 C12P 13/08 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＤａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ
Claims (9)
- 【請求項１】コリネバクテリウム属又はブレビバクテリ
ウム属の微生物から由来する、アスパルチル−β−セミ
アルデヒド−デヒドロゲナーゼ（asd）活性に導き、か
つアスパルテート−キナーゼ（LysC）の調節解除に導び
く蛋白質の生産をコードする、長さ2.1kbの、第５図に
示されたアミノ酸配列をコードするDNA−フラグメント
又はその欠失誘導体。 - 【請求項２】アスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒ
ドロゲナーゼ（asd）活性に導き、かつアスパルテート
−キナーゼ（LysC）の調節解除に導びく蛋白質をコリネ
バクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物中で
生産することに関してコードする、請求項１に記載され
たDNA−フラグメント又はその欠失誘導体を含有する、
長さ9.9kbの第２図に示したDNA−フラグメント又はその
欠失誘導体。 - 【請求項３】アスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒ
ドロゲナーゼ（asd）活性に導き、かつアスパルテート
−キナーゼ（LysC）の調節解除に導びく蛋白質をコリネ
バクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物中で
生産することに関してコードする、請求項２に記載され
たDNA−フラグメント又はその欠失誘導体とベクターDNA
とからなる組換えDNA又はその欠失誘導体。 - 【請求項４】ベクターがコリネバクテリウム属又はブレ
ビバクテリウム属の微生物中で複製可能であり、pZ1、p
CV34、pCV36、pCVX4、pCVX10、pCVX15、pZ9、pZ8−１、
pCV35、pECM1、pECM3の群から選択される請求項３記載
の組換えDNA又はその欠失誘導体。 - 【請求項５】コリネバクテリウム・グルタミクムDSM508
6中に含有されているプラスミドpCS2である請求項３又
は４記載の組換えDNA又はその欠失誘導体。 - 【請求項６】プラスミドpCS2から誘導された誘導体pCS2
1、pCS22、pCS24又はpCS26である請求項５記載の組換え
DNA又はその欠失誘導体。 - 【請求項７】プラスミドpCS2から誘導された誘導体pCS2
3である請求項５記載の組換えDNA又はその欠失誘導体。 - 【請求項８】請求項３記載の組換えDNA又はその欠失誘
導体を含有するコリネバクテリウム属又はブレビバクテ
リウム属の微生物。 - 【請求項９】アスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒ
ドロゲナーゼ（asd）活性に導き、かつアスパルテート
−キナーゼ（LysC）の調節解除に導びく蛋白質をコリネ
バクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物中で
生産することに関してコードする、請求項２に記載され
たDNA−フラグメント又はその欠失誘導体とベクターDNA
とからなる組換えDNA又はその欠失誘導体をコリネバク
テリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物中に挿入
し、このようにして得られた形質転換体を好適な培地中
で培養し、生じたＬ−リジンを分離することを特徴とす
るＬ−リジンの製法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3908201.6 | 1989-03-14 | ||
| DE3908201A DE3908201A1 (de) | 1989-03-14 | 1989-03-14 | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03219885A JPH03219885A (ja) | 1991-09-27 |
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ID=6376268
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|---|---|---|---|
| JP2061308A Expired - Fee Related JP3000087B2 (ja) | 1989-03-14 | 1990-03-14 | Ｌ―リジンの製法、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物、及びｄｎａ―フラグメント |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3000087B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017122369A (ja) * | 2016-01-08 | 2017-07-13 | 新日鐵住金株式会社 | 横架材、横架材を用いた面材の取り付け構造、及び横架材を用いた面材と枠材との取り付け構造 |
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|---|---|---|---|---|
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| JPH07108228B2 (ja) * | 1990-10-15 | 1995-11-22 | 味の素株式会社 | 温度感受性プラスミド |
| JP3473042B2 (ja) * | 1992-04-28 | 2003-12-02 | 味の素株式会社 | 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子 |
| JP3783065B2 (ja) * | 1994-03-04 | 2006-06-07 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
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| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
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| AU2001287630A1 (en) * | 2000-08-02 | 2002-02-13 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences which code for the mete gene |
| US6958228B2 (en) | 2000-08-02 | 2005-10-25 | Degussa Ag | Nucleotide sequence which code for the metH gene |
| AU2001287631A1 (en) * | 2000-08-02 | 2002-02-13 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences which code for the metf gene |
| DE10109690A1 (de) * | 2000-09-02 | 2002-03-14 | Degussa | Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| US6812016B2 (en) | 2000-09-02 | 2004-11-02 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the metY gene |
| WO2002020573A2 (en) * | 2000-09-09 | 2002-03-14 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the gpmb gene |
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| AU2001287682A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-26 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences coding for the ftsx gene |
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| US7026158B2 (en) | 2000-09-27 | 2006-04-11 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the mikE17 gene |
| DE10047864A1 (de) * | 2000-09-27 | 2002-04-11 | Degussa | Neue für das truB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| WO2002034775A2 (en) * | 2000-10-28 | 2002-05-02 | Degussa Ag | Nucleotide sequences encoding the hemd and hemb genes |
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| DE10155505A1 (de) | 2001-11-13 | 2003-05-22 | Basf Ag | Gene die für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Proteine codieren |
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| EP2940143B1 (de) | 2014-04-30 | 2020-02-05 | Evonik Operations GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
| EP3467099A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-10 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
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| WO2023222515A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
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-
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| JP2017122369A (ja) * | 2016-01-08 | 2017-07-13 | 新日鐵住金株式会社 | 横架材、横架材を用いた面材の取り付け構造、及び横架材を用いた面材と枠材との取り付け構造 |
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