SK279719B6

SK279719B6 - Fragment dna, rekombinantná dna a spôsob výroby l-

Info

Publication number: SK279719B6
Application number: SK1228-90A
Authority: SK
Inventors: Bern Bachman; Georg Thierbach; Jrn Kalinowski; Alfred Phler
Original assignee: Degussa Ag
Priority date: 1989-03-14
Filing date: 1990-03-14
Publication date: 1999-02-11
Also published as: SK122890A3; DE59006167D1; JPH03219885A; EP0387527A1; ES2056263T3; JP3000087B2; DE3908201A1; EP0387527B1; ATE107699T1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka fragmentu DNA, ktorý sa nachádza v plazmide, rekombinantnej DNA odvodenej od tohto plazmidu a spôsobu výroby L-lyzínu s použitím mikroorganizmu obsahujúceho uvedený plazmid alebo z neho odvodenú rekombinantnú DNA.

Doterajší stav techniky

Corynobacterium glutamicum a príbuzné rody, ako sú napríklad Brevibacterium lactofermentum a Brevibacterium flavum, sú známe ako mikroorganizmy tvoriace aminokyseliny.

Aby sa produktivita zvýšila, uskutočňujú sa umelé mutácie.

Príkladmi takto pripravených umelých mutantov sú napríklad lyzín produkujúce kmene Corynobacterium ghitamicum, ktoré okrem rezistencie AEC (AEC = S-2-aminoetylcysteín) preukazujú s ňou spojenú homoserínovú a leucínovú auxotrofiu (US patentový spis č. 3 708 395) alebo sú citlivé na metionín (US patentový spis č. 3 871 960).

Okrem týchto klasických metód boli objavené vektorové systémy, ktoré umožňujú transformáciu mikroorganizmov rodov Corynobacterium a Brevibacterium (DE-OS č. 37 37 719, DE-OS č. 38 41 453, Thierbach G., Schwarzer A., Piihlcr A., Appl. Microbiol. Biotechnol. 29 (1988) 356-362).

VEP-A-0219 027 sa opisuje spôsob výroby rôznych aminokyselín, pri ktorom sa rekombinantnou DNA transformujú rody Corynobacterium a Brevibacterium, a tak sa zvyšujú produkované množstvá aminokyselín.

Rekombinantná DNA obsahuje pritom fragment DNA, kódujúci syntézu aspartátsemialdehyddehydrogenázy alebo aspartátaminotransferázy.

Z US patentového spisu č. 4 346 170 je známe klonovanie genetickej informácie riadiacej tvorbu lyzínu v Escherichia coli, ktorá pochádza z kmeňa toho istého rodu s rezistenciou proti analógom L-lyzínu, ako je napríklad AEC.

Predmet US patentového spisu č 4 560 654 sa týka tej istej oblasti. V tomto prípade sa však v lyzín-auxotrofnom kmeni Corynobacterium glutamicum klonuje genetická informácia z AEC-rezistentného kmeňa toho istého rodu z toho dôvodu, aby sa vylučoval lyzín.

Identita klonovaného fragmentu DNA nie je zrejmá.

Tiež zEP č. 88 166 je možné iba vyrozumieť, že kmeň Corynobacterium glutamicum vylučuje lyzín, keď transformáciou získal fenotyp AEC rezistencie.

Rekombinantný plazmid pAec5 použitý na tento účel obsahuje 3,9 kb fragment chromozómovej DNA, vsadený na štiepne miesto BglII vektora pCG 11.

Úlohou predloženého vynálezu je zmeniť regulovateľnosť dôležitého enzýmu biosyntézy lyzínu v mikroorganizme rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium tak, aby sa získal producent lyzínu alebo aby sa zvýšila schopnosť produkcie lyzínu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je fragment DNA, ktorý sa skladá z nukleotidovej sekvencie s dĺžkou 2,1 kb, ohraničený PstI a Xhol miestami štiepenia, ktorého podstata spočíva v tom, že aminokyselinová sekvencia uvedená na obr. 5 kóduje produkciu proteínov, vedúcich k aktivite aspartyl-P-semial dehyddehydrogenázy (asd) a k deregulácii aspartátkinázy (lysC), je obsiahnutý v plazmide pCS2, ktorého delečná mapa je uvedená na obr. 3, uloženom v Corynobacterium glutamicum pod číslom DSM 5086.

Predmetom vynálezu je ďalej aj rekombinantná DNA odvodená z plazmidu pCS2, charakterizovaná delečnou mapou zodpovedajúcou označeniu pCS26, uvedenou na obr. 3.

Predmetom vynálezu je ďalej aj rekombinatná DNA odvodená z plazmidu pCS2, charakterizovaná delečnými mapami zodpovedajúcimi označeniam pCS23 alebo pCS233 na obr. 3.

Predmetom vynálezu je ďalej aj spôsob výroby L-lyzínu fcrmcntáciou mikroorganizmov rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium produkujúcich túto aminokyselinu, ktorého podstata spočíva v tom, že mikroorganizmy obsahujú uvedený plazmid alebo niektorú z uvedených rekombinantných DNA.

Pri výhodnom uskutočnení opísaného spôsobu sa používa mikroorganizmus Corynobacterium DMS 5086.

Vynález sa teda okrem iného týka spôsobu výroby L-lyzínu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa rekombinantná DNA, ktorá pochádza z fragmentu DNA, ktorý má kódovanú genetickú sekvenciu na produkciu proteínov, ktoré vedú k aspartyl-P-semialdehyddehydrogenázovej (asd) aktivita a/alebo k deregulácii aspartátkinázy a skladá sa z vektora DNA, inzeruje do mikroorganizmu rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium produkujúceho lyzín, takto získané transformanty sa kultivujú vo vhodnom osebe známom médiu a vytvorený lyzín sa známymi metódami izoluje.

Ako donorové kmene môžu slúžiť všetky kmene, výhodne baktérie rodu Brevibacterium a Corynobacterium produkujúce lyzín, ktoré obsahujú príslušné sekvencie DNA, najmä však Corynobacterium glutamicum DM 58-1, ktorý bol vyvinutý mutagenézou Corynobacterium ATCC 13032 etylmetánsulfátom a preukazuje AEC-rezistenciu.

Tento kmeň je uložený pod číslom DSM 4697, pričom slúži ako hostiteľská baktéria pre plazmid pDM6. Tento môže odborník známymi spôsobmi oddeliť a tak získať kmeň DM58-1 (FEMS Microbiology Review 32 (1986) 149-157)

Chromozómová DNA sa z donoru extrahuje známym spôsobom a spracuje sa restikčnou endonukleázou.

Po konštrukcii rekombinantnej DNA zavedením chromozómového fragmentu DNA do vektora prebieha transformácia mikroorganizmu s takto získaným plazmidom, podľa predloženého vynálezu napríklad pCS2, ktorého reštrikčná schéma je znázornená na obr. 2 a ktorý je v kmeni Corynobacterium glutamicum DM2-l/pCS2 uložený podľa Budapeštianskej zmluvy pod číslom DSM 5086 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových štruktúr.

Výhodný vektorový systém predstavuje pZl (uložený v Corynobacterium glutamicum DM 274-2 pod číslom DSM 4241) alebo i pCV34, pCVX4, pCVXlO, pCVX15, pZ9 a pZ8-l (DE-OS 38 41 454.6) alebo pCV35, pECM3 a pECMl (DE-OS 38 41 453.8).

Použiteľné sú však aj zložené plazmidy, známe z EP-A-93 611, ak samy replikujú v rodoch Corynobacterium alebo Brevibacterium, najmä pAJ 655, pAJ 611, p AJ 440, p AJ 1844 a pAJ 3148 alebo tiež pCG 11, pCE 54 (pozri EP-A 0 233 581), a taktiež pUL33O (Santamaria, R. I. a kol., J. Bacteriology 162, (1958) 463-467).

Predmetom prihlášky sú aj mikroorganizmy rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium obsahujúce rekombinantnú DNA a ich použitie na výrobu L-lyzínu fermentáciou.

Klonovaný fragment DNA (pozri obr. 2) obsahuje len časť génu aspartátkinázy (LysC), ako aj úplný gén aspartyl-β-semialdehyddehydrogenázy (asd), čo je možné zistiť sekvenčnou analýzou.

Časť tohto génu aspartátkinázy má homologickú sekvenciu DNA k β-podjednotke aspartátkinázy II z Bacillus substilis.

Všetky transformanty, ktorých plazmid má túto sekvenciu (pCS2, pCS22, pCS23, pCS24, pCS26 a pCS233), obsahujú v porovnaní s chromozómovo kódovaným enzýmom z ATCC 13032 vo vzťahu k feed-back inhibitorom L-lyzínu a L-treonínu značne desenzibilizovanú aspartátkinázu a majú AEC-rezistenciu.

Závery odvodzované z porovnaní homológie, podľa ktorých fragment génu PstI - Xhol z DM58-1 obsahuje len časť génu LysC (AK), ale úplný gén asd, môžu byť jednoznačne potvrdené pomocou enzýmových meraní.

Žiadny kmeň Corynobacterium glutamicum ATCC 13032, transformovaný derivátom pCS2 alebo pCS2 neobsahuje prekvapivo zvýšenú aktivitu aspartátkinázy v porovnaní s pôvodným kmeňom (tabuľka 4. stĺpec 3).

Naproti tomu vo všetkých transformantoch, ktorých plazmidy obsahujú štruktúrny gén asd, sa dá zistiť silná superexpresia aspartyl^-semialdehyddehydrogenázy (ASA-DH), (tabuľka 4, stĺpec 2, obr. 3 a 4). Plazmidy pCS23 a deriváty pCS23 nevedú podľa očakávania k superexpresii ASA-DH.

Silná superexpresia ASA-DH, nastávajúca pri klonovaní podľa vynálezu fragmentu DNA pomocou pCS2 a z neho odvodených derivátov, zaručuje účinnú reakciu produktu aspartátkinázovej reakcie, β-aspartylfosfátu, čím dochádza k urýchleniu už neinhibovanej aspartátkinázovej reakcie.

Na základe vysokej lability ASA-DH kolísajú faktory superexpresie, kalkulovateľné zo špecifických aktivít v rozmedzí 31 až 65.

V porovnaní so súčasným stavom techniky dochádza k podstatnému zjednodušeniu tým, že sa po prvé musí izolovať len časť génu LysC, ktorý vedie k deregulácii aspartátkinázy, aby sa dosiahlo alebo zlepšilo vylučovanie lyzínu, apo druhé na základe organizácie LysC a asd v jednom operóne sa môže izolovať gén asd bez dodatočných experimentálnych nákladov spojených s AEC-rezistenciou, nastávajúcou s mutáciou génu LysC, spoločne s génom LysC. Naopak sa môže pomocou mutantov asd izolovať fragment DNA obsahujúci LysC + asd, a to nezávisle od toho, či je LysC mutovaný alebo nie.

1. Charakteristika donora génu DM58-1 a príjemcu génu ATCC 13032

1.1 Získanie a fenotyp kmeňa DM58-1

Kmeň DM58-1 sa získal mutagenézou kmeňa Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 bežnou koncentráciou etylmetánsulfonátu.

Selekcia prebieha kultiváciou takto získanej zmesi mutantov na minimálnom agare so zložením:

glukóza	20 g
síran amónny	10g
močovina	2,5 g
dihydrogenfosforečnan draselný	1 g
heptahydrát síranu horečnatého	0,4 g
heptahydrát síranu železnatého	2 mg
monohydrát síranu mangánatého	1,5 mg
biotín	300 pg
tiamín	900 pg
agar	20 g

destilovaná voda 1 liter (ph 7,0), ktorý obsahoval vhodnú koncentráciu S-aminoetyl-D,L-cysteínu (AEC). Kloň izolovaný z tohto selekčného média a schopný delenia na tomto médiu, neskôr označený ako DM58-1, nenesie okrem svojej AEC-rezistencie žiadne ďalšie genetické znaky.

1.2 Enzymatické obsahy aspartátkinázy a aspartyl-β-semialdehyddehydrogenázy v ATCC 13032 aDM58-l

Kmene ATCC 13032 a DM58-1 sa kultivujú za priamo porovnateľných podmienok v Štandard I Bouillon (Merck Art. Nr. 7882) s prídavkom 4 g/1 glukózy a 1 mM chloridu horečnatého pri 30 °C a 150 otáčok za minútu až do dosiahnutia včasné stacionárnej fázy a centrifugáciou sa od kultivačného média oddelia. Premyjú sa trikrát 100 mM Tris/HCl (pH 7,5); 1 mM DTT a vlhká bunková masa sa suspenduje v jednom objemovom diele rovnakého tlmivého roztoku.

Takto suspendované bunky sa dezintegrujú v guľovom mlyne (B. Braun Melsungen - MSK-Homogenisator, IMA-Disintegrator S) rozmiešaním s vhodným množstvom sklených guľôčok na sklenom filtri a centrifuguje sa 30 minút pri 30 000 x g do vyčírenia.

Po 15-hodinovej dialýze v tlmivom roztoku stabilizujúcom enzým sa určila enzýmová aktivita v nasledujúcich testovacích zmesiach:

Test aspartátkinázy:

Tris/HCl (pH 7,5)	100 mM
DTT	1 mM
síran amónny	400 mM
chlorid horečnatý	20 mM
NH₂OH.HC1	400 mM
L-aspartát	300 mM
ATP	40 mM a
rôzne množstvá enzýmových preparátov.

Prídavkom 150 μΐ roztoku z 10 % hexahydrátu chloridu železitého; 3,3 % TCA; 0,7 N HCI na 500 μΐ testovanej enzýmovej zmesi sa enzýmová reakcia po tridsaťminútovej inkubácii pri teplote 37 °C zastaví. Z koncentrácie aspartyl-β-hydroxamátu, zistenej fotometrický (ΔΕ₅₄ο J pomocou kalibračnej krivky, sa kalkuluje enzymatická aktivita v pmol/mg.min (U/mg). Príslušné koncentrácie proteinov sa určovali podľa metódy Lowryho a kolektívu (Lowry a kol. J. Biol. Chem. 193, 265 (1951) alebo Bradforda (Bradford Anál. Biochem. 72, 248 (1976)).

Test aspartyl- β-semialdehyddehydrogenázy:

dietanolamín (ph 9,0)	120 mM
NaAsO4	40 mM
NADP+	1 mM
L-treonín	5 mM
aspartyl-O-semialdehyd	1,3 mM a

rôzne množstvá enzýmových preparátov v celkovom objeme 1 ml.

Aktivita udávaná v pmol/ mg.min (U/mg) sa počíta cez fotometrický stanovenú (AE_{540 mn}) rýchlosť syntézy NADPH.

Tabuľka 1 obsahuje špecifické enzýmové aktivity obidvoch enzýmov v surových extraktoch identicky pestovaných a spracovaných buniek Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 a DM58-1. Okrem porovnateľných obsahov aspartátkinázyu obidvoch kmeňov obsahuje AEC-rezistentný mutant DM58-1 v porovnaní s divým typom približne päťnásobne zvýšenú aktivitu asparty!-|j-semialdchyddehydrogenázy.

SK 279719 Β6

1.3 Inhibícia aspartátkinázy z Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 aDM58-l in vitro

Tabuľka 1 ukazuje, že už K. Nakayamom a kol. (K. Nakayama a kol., Agr. Biol. Chem. 30, 611 (1966)) naznačená a S. N. Kara-Murzom a kol. (S. N. Kara-Murza Prikladnaya Biokhimiya; Mikrobiológia 14, 345 (1978)) presnejšie preskúmaná inhibícia enzýmov divého typu Corynobacterium glutamicum je schopná reprodukcie. V porovnaní s tým je značne rozdielny charakter enzýmu AEC-rezistentných mutantov DM58-1, ktorých aspartátkináza už nie je koncentrovane inhibovateľná L-lyzinom + L-treonínom. Látkou S-aminoetyl-D,L-cysteínom, pôsobiacim na enzým z ATCC 13032 ako analóg lyzínu, je enzým mutantov taktiež len nepatrne ovplyvňovaný.

Tabuľka 1

Obsah enzýmov a vlastnosti aspartátkinázy (AK) a aspartyl-P-semialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) z Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 a DM58-1

Kmeň	ATCC13032	DM58-1
AK (U/me)	0.016	0,011
ASA-DH (U/rnoi	0.06	0.33
Kombinácie	Inhibícia
inhibítorov	AK W
10 mM L-Ľy* i mM	99	1 2
10 eiH L-Lys 10 mM L-Thr	95	2
100 mM L-Lys 10 mM L-Thr	99	21
10 mM AEC 1 nifl L-Thr	1 2	0
10 mM AEC 10 mM L-Thr	61	0
100 mM AEC 10 mM L-Thr----	95	T

AEC: S-(aminoetyl)-D,L-cysteín

2. Klonovanie fragmentu DNA kmeňa Corynobacterium glutamicum DM58-1, ktorý kóduje pre feed-back rezistentnú aspartátkinázu

3. Klonovanie

Izoluje sa celková DNA z kmeňa Corynobacterium glutamicum DM58-1 spôsobom opísaným Charterom a kol. (Charter a kol. Curr. Topics Microb. Immunol. 96, 69 (1982)) a parciálne sa naštiepi reštrikčným enzýmom Pstl. Vektor pZl (obr. 1), ktorý je opísaný v nemeckej patentovej prihláške č. 37 37 729.9, sa linearizuje pomocou Pstl a spracovaním alkalickou fosfatázou sa defosforyluje. Vektor DNA a DM58-1 DNA sa zmiešajú a spracujú sa T4 DNA-ligázou, ako sa opisuje Maniatisom a kol. (Maniatis T. a kol., Molecular Cloning A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982).

Transformácia Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 ligačnou zmesou sa uskutočňuje spôsobom opísaným Thierbachom a kol. (Thierbach G. a kol., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356 (1988)).

Na obr. 1 je znázornená reštrikčná schéma plazmidu pZl. Hrubá čiara znázorňuje podiel pHM1519 a tenká čiara znázorňuje podiel pACYC177. Označenie Ap^R = gén ampicilínovej rezistencie a Km³ = gén kanamycínovej rezistencie.

Transformačná zmes sa zaočkuje na agarové platne s RCG/E agarom s 300 pg/ml kanamycínu a tieto platne sa inkubujú jeden týždeň pri teplote 30 °C. Potom sa tieto agarové platne prepečiatkujú na agarové platne s agarom MM (Katasumata, R. a kol., J. Bact. 159, 306 (1984)) s 50 mM AEC a 50 mM L-treonínu a tieto sa kultivujú jeden deň pri teplote 30 °C. Kolónie, ktoré na tomto agare mohli rásť, sa preočkujú na agar MM, ktorý dodatočne obsahuje AEC, L-treonín a 10 pg/ml kanamycínu, aby sa získali jednobunkové kolónie. Plazmid DNA sa izoluje z takéhoto klonu, označeného ako pCS2, a použije sa na transformáciu Corynobacterium glutamicum ATCC 13032. 59 zo 62 preskúšaných transformantov rezistentných na kanamycín sa javilo rezistentných proti inhibícii 50 mM AEC a 50 mM L-treionínu. Plazmid pCS2 sa ďalej charakterizoval pomocou reštrikčnej analýzy. Obsahuje asi 9,9 kb dlhú inzerciu v štiepnom mieste Pstl vektora pZl, ktorý má dĺžku 6,9 kb.

Na obr. 2 je znázornená reštrikčná schéma plazmidu pCS2 v linearizovanej forme.

V hornej časti obr. 2 sú uvedené pozície rôznych reštrikčných štiepnych miest. V dolnej časti obrázka sú znázornené rôzne oblasti plazmidu pCS2. Inzercia DM58-1 DNA je znázornená ako prázdny pás. Gén ampicilínovej rezistencie pZl je znázornený ako čierne pole, gén kanamycínovej rezistencie je znázornený ako bodkované pole. Ostatné podiely pZl plazmidu pCS2 sú vyšrafované. Použité skratky sú nasledovné:

BamHI - B; Beli - C; Sali - S; Sca - A; Smal - M; Xhol - X.

2.2 Charakteristika aktivity aspartátkinázy

Aspartátkinázová aktivita sa merala u kmeňa ATCC 13032/pCS2, ako pozitívna kontrola u kmeňa DM58-1 a ako negatívna kontrola u kmeňa ATCC 13032. Kmene sa kultivovali na Štandard I Boillon, pričom táto pôda bola doplnená 4 g/1 glukózy, 10 μΐ/ml kanamycínu a 1 mM chloridu horečnatého. Kultivačné podmienky, izolácia buniek, rozloženie buniek a stanovenie aspartátkinázy sú opísané a uskutočňujú sa podľa odseku 1.2. Efektory L-lyzín, L-treonín a AEC sa vždy pridávajú ako základné roztoky v 100 mM Tris/HCl tlmivom roztoku s hodnotou pH 7,5.

Obsah aspartátkinázy a inhibovateľnosť enzýmu z ATCC 13032/pCS2 sú uvedené v tabuľke 4. Aj keď kmeň nepreukazuje žiadne zvýšenie špecifickej aktivity, mohla byť zistená zreteľná desenzibilizácia proti uvedeným inhibičným látkam, ktorých miera stupňa deregulácia enzýmu z poskytovateľa génu DM58-1 však nebola dosiahnutá (parciálna deregulácia).

2.3 Stanovenie vylučovania L-lyzínu

Schopnosť vylučovania lyzínu sa stanovila u kmeňa ATCC 13032/pCS2 a ako negatívna kontrola u kmeňa ATCC 13032/pZl. Po prídavku 10 pg/ml kanamycínu sa kultivácia uskutočňovala spôsobom opísaným a získané výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Vylučovanie L-lyzínu rôznymi kmeňmi Corynobacterium glutamicum

Kmeft C. glutamicum Koncentrácia vylúčeného

L-lyzín.HCI (g/1)

ATCC 13032/pZl 0,0

ATCC 13032/pCS2 (= DM 2-l/pCS2) 7,1

Erlenmeyerova banka s objemom 100 ml kultivačného média s nasledovným zložením:

síran amónny 12 g/1 melasa 240 g/1

SK 279719 Β6 sójový hydrolyzát 60 ml/1 uhličitan vápenatý 10 g/1.

Po zaočkovaní sa kultúra inkubuje 72 hodín pri teplote 30 °C a 300 otáčkach za minútu. Stanovenie lyzínu sa uskutočňuje v kvapaline po centrifugácii pomocou analyzátora aminokyselín.

3. Prehľad odštiepovania fragmentu DNA pCS2, ktorý kóduje pre feed-back rezistentnú aspartátkinázu

Úplným alebo parciálnym štiepením pCS2 rôznymi reštrikčnými enzýmami a nasledujúcim spracovaním T4 DNA-ligázou pri nízkych koncentráciách DNA sa konštruujú rôzne odštiepne deriváty. Výroba rôznych odštiepnych derivátov je zhrnutá v nasledujúcej tabuľke 3 a pozícia odštiepenia v rôznych derivátoch je znázornená na obr. 3. Na obr. 3 je taktiež nanesená schopnosť rezistencie kmeňov odvodených od Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 voči AEC. Týmto spôsobom mohla byť ohraničená oblasť DNA, sprostredkujúca AEC-rezistenciu, na fragment DNA dlhý približne 1,5 kb, ktorá je obmedzená v plazmide pCS233 klonovacím štiepnym miestom Pstl a štiepnym miestom EcoRl.

Aktivita aspartátkinázy a inhibovateľnosť enzýmovej aktivity zmesami lyzínu, prípadne AEC a treonínu, sa stanovovala v konštruovaných klonoch. Pestovanie, izolácia a stanovenie aktivity sa uskutočňovali opísaným spôsobom. Okrem toho sa skúmala schopnosť rôznych klonov vylučovať L-lyzín. Na to sa používal difúzny test na agarových platniach s L-lyzín-auxotrofným indikačným kmeňom Corynobacterium glutamicum. Z tabuľky 4 je zrejmé, že všetky AEC-rezistentné kmene majú parciálne deregulovanú aktivitu aspartátkinázy a že sú schopné vylučovať L-lyzín.

Tabuľka 3

Výroba a AEC^-fenotyp rôznych štiepnych derivátov plazmidu pCS2

Plazmid Konštrukcia AEC^k/:i-fenotyp

pCS21	vyrobený štiepením pCS2 pomocou BamHl	R
PCS22	vyrobený štiepením pCS2 pomocou BamHl a Bclľ	R
pCS2 3	vyrobený parciálnym štiepením pCS2 pomocou Sali	R
pCS24	vyrobený parciálnym štiepením. pCS2 pomocou Xhol	R
pCS26	vyrobený štiepením pCS2 pomocou Scal	R
pCS231	vyrobený parciálnym štiepenin pCS23 pomocou Pstl	S
PCS232	vyrobený parciálnym štiepením pCS23 pomocou Dral	s
PCS233	vyrobený parciálnym Štiepením pCS23 pomocou EcoRl	R

Vysvetlivky: R = rezistencia

S = citlivosť

Na obr. 3 je znázornená schéma štiepenia plazmidu pCS2. V hornej časti obrázka sú znázornené deriváty odvodené od pCS2 a v dolnej časti obrázka deriváty odvodené od pCS23. Hranice ampicilínovej rezistencie pZl sú znázornené čierno; hranice kanamycínovej rezistencie sú znázornené bodkované a ostatné časti pZl plazmidu pCS2 sú vyšrafované. Inzercie DM58-1 DNA sú znázornené ako voľné pásy. Štiepenia sú označené čiarou. Vysvetlenia použitých skratiek:

B - BamHl, G - Beli, D - Dral, E - EcoRl, S - Sali,

A - Scal, M - Smal, X - Xhol.

Tabuľka 4

Mikrobiologické a biochemické charakteristiky rekombinantných kmeňov Corynobacterium glutamicum

Kmeň

ASA-DH AK	Reaktivita AK v pritoonosti	(Ϊ) aec^r	Vylučovanie Lyzínu
(11/ (U/	10mH 10mM lOOmM	1 OOmH
mg 1 mg)	Lyi Lys Ly·	AEC
	1mM 10mH 1OmM	10mM
	rnr Thr Thr	Thr

ATCC13032 0 (pZl J	06	0.016	9	S		7	-
ATCC13032 1pCS21	3	9	0.013	55	55	28	56	•	-
ATCC13032 IpCS21)	ⁿ		0.016	46	50	24	·	•	-
ATCC13032 PCS2Z	n		0.015	4 0	41	22	n.	-	-
ATCC13032 (pCS23 í	0	03	0.014	5 1	57	30	56	•	•
ATCC13O3Z <pCS24 >	2	07	0.011	65	55	40	62	•	•
ATCC13O32 (DCSZ6)	1	aa	0,015	64	53	39	60	•	•
ATCC13032 lPCS231)	0	060	0,013	1 1	14		10	-	-
ATCC13032 1pCS232)			n.	n.	n.	·		-	-
ATCC13D32 1PCS233)	n		0.011	56	62	36	57	-
DM5Í-1 IpZI)	0	330	0.009	83	100	79	93	•	•

Použité skratky: ASA-DH: aspartyl-P-semialdehyddehydrogenáza

AK: aspartátkináza

n.: nezistené.

4. Sekvenovanie fragmentu DNA plazmidu pCS24, ktorý sprostredkuje fenotyp AEC-rezistencie

4.1 Metóda sekvenovania

Sekvencia nukleotidov 2,1 kb Pstl-Xhol-fragmetnu DNA sa zisťovala metódou Maxama a Gilberta (Maxam, A. M. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)) s modifikáciou podľa Arnolda a Puhlera (Arnold W. a kol, Gene, 70, 171 ff (1988)). Subklonovanie k sekvenovaniu pritom vychádzalo z plazmidu pCS24 (pozri obr. 4). Tento sa transformuje podľa Escherichia coli MM 294 (Merelson, M. a kol, Náture 217, 1110-1114 (1968)) a príslušné fragmenty sa klonujú do sekvenčných vektorov pSVB21, 25 a 26 (Arnold W. a kol., Gene, 70, 171 ff (1988)). V kmeni Escherichia coli JM83 (Mesing J., Recombinant DNA Technical Bulletin NIH Publication No. 79-99, 2, 43-48 (1979)) je možné dokázať aktiváciu inzercie pomocou testu Xgal (5-bróm-4-chlórindolyl-p-D-galaktipyranozid).

Stratégia sekvenovania je znázornená na obr. 4. Sekvencia nukleotidov sa zisťovala na obidvoch vetvách DNA s prekrývajúcimi sa klonmi.

Na obr. 4 je znázornená odštiepovacia analýza a stratégia sekvenovania chromozómového fragmentu plazmidu pCS2. Odštiepovacia analýza: Plazmidy pCS23 a pCS24 sprostredkovávajú taktiež ako kloň pCS2 AEC-rezistenciu a produkciu lyzínu. Šrafované pásy predstavujú podiel vektora v plazmide.

SK 279719 Β6

Stratégia sekvenovania: 2,1 kb Pstl-Xhol-fragment plazmidu pCS24 sa subklonoval so znázornenými reštrikčným štiepnymi miestami. Šípky vždy udávajú sekvenčný rozsah a smer čítania. Označené sú reštrikčné štiepne miesta enzýmov Dral (D), EcoRI (E), BglII (O), HindlII (H), Nael (A), PstI (P), Sali (S) a Xhol (X). Dolu sú znázornené dva čítacie rastre, ktoré kódujú pre podjednotky aspartátkinázy a pre aspartát-P-semialdehyddehydrogenázu (pozri text).

4.2 Sekvencia DNA 2,1 kb Pstľ-Xhol-fragmetnu DNA

Sekvenovaný úsek DNA je dlhý 2112 bp. Nesie reštrikčné štiepne miesta pre enzýmy BglII, Dral, EcoRI, Hindll, Nael, PstI, Sali a Xhol, s ktorými boli vyrobené aj subklony.

Sekvencia nukleotidov sa spracovala sekvenčnou analýzou podľa programového zväzku ANALYSEQ (Staden, R. a kol., Nucl. Acids Res. 14, 217-323 (1986)).

Na sekvenovanom úseku DNA sa nachádzajú dva otvorené čítacie rastre (ORF). Obidva sú usporiadané od štiepneho miesta PstI smerom k štiepnemu miestu Xhol. Medzi obidvoma sa nachádza len malá oblasť 26 bp. Pred 2. ORF sa nachádza miesto väzby ribozómov (RBS) (806-809 AGGA nasleduje štartkodón ATG). Vnútri 1. ORF bola lokalizovaná aj jedna RBS (AGGA, 268-271 so štartovacím kodónom GTG).

ORF 1 dĺžku 264 aminokyselín (AS), počítajúc od PstI miesta a 172 aminokyselín (zodpovedá 18,6 k Dals) od internej RBS. ORF 2 má dĺžku 342 aminokyselín (36,1 k Dals).

Priamo za ORF 2 sa nachádza možná transkripčná terminančná štruktúra, takzvaná vlasová ihlová slučka prebiehajúca od viacerých tymínových zvyškov (1864-1900). Toto usporiadanie je charakteristické pre p-nezávislé terminančné signály v Escherichia coli a iných bakteriálnych druhoch (Ahyda a kol., Ann. Rev. Biochem. 47, 967-996 (1978)). Tu predložený terminátor má stabilitu viac ako -40 kcal/mol pri 30 °C.

Možný promótor pre ORF 2 sa zistil vnútri ORF 1 (409-437), (TTGACA-17 bp-TATTCT). Oblasť -35 a vzdialenosť k oblasti -10 zodpovedajú presne E. coliConsensus-Promotor (Hawley, D. K. a kol., Nucl. Acids Res. 11, 2237-2255 (1983)), oblasť -10 je veľmi podobná E. coli-Consensusregion (TATAAT).

Ďalej je uvedená sekvencia DNA a odvodená sekvencia aminokyselín 2,1 kb Pstl-Xhol-fragmetnu.

u á S

Str li

Ii^s * o < n u w »

O iľ <3 .Sít

O cn

O co 00 r—t

O r*, co

O XD «Ο r-4

O CM

CO

Sekvencia aminokyselín ORF 1(1 až 794) a ORF 2 (821 až 1846) sa udávajú v trojpísmenovom kóde. Číslovanie pod linajkou sa týka sekvencie DNA. Názvy klonovacích štiepnych miest využitých pri sekvenovaní sú tiež uvedené pod linajkou. Miesta väzby ribozómov sú označené hviezdičkou. Štartovací kodón je označený šípkou a štruktúra terminátora plnou čiarou.

4.3 Analýza sekvencie aminokyselín

Sekvencia aminokyselín prenášaná pomocou ORF 1 a ORF 2 sa porovnávala so známymi sekvenciami aspartátkinázy AK I (Cassan, M. a kol., J. Biol. Chem. 261, 1052-1057 (1986)) z Escherichia coli a AK II z Bacillus subtilis (Chen, N. Y. a kol., J. Biol. Chem. 262, 8737-2255 (1987)), prípadne so sekvenciami aminokyselín aspartátsemialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) z Escherichia coli (Haziza C. a kol., Embo J. 1, 379-384 (1982)) a Streptococcus mutans (Cardineau G. A. a kol., J. Biol. Chem. 262, 7, 3344-3353 (1987)). Na to sa využili programy MALIGN (Sobel E. a kol., Nucl. Acids Res. 14, 363-374, (1986)) a DIAGON (Staden R. a kol., Nucl. Acid Res. 14, 217-232 (1986)). Ukázala sa signifikantná zhodnosť medzi ORF 1 a sekvenciou AK na jednej strane a medzi ORF 2 a sekvenciou ASA-DH zo Streptococcus mutans na druhej strane. Pre Escherichia coli sa ukázala v prípade ASA-DH len slabá homológia, najmä však v oblasti aktívneho centra (Haziza, C. a kol., Embo J. 1, 379-384 (1982)).

Z počítačovej analýzy vyplýva nasledovné:

- ORF 1 zodpovedá C-koncu aspartátkinázy, to znamená, že chýba asi 160 aminokyselín N-konca, ako i kompletná oblasť promótora.

- ORF 2 zodpovedá aspartátsemialdehyddehydrogenáze.

Homológia ORF 1 a AK II z Bacillus subtilis je odborníkom zrejmá. AK II pozostáva z prekrývajúcich sa podjednotiek (Chen, N. Y. a kol., J. Biol. Chem. 262, 8787-8798 (1987)). Pritom zodpovedá β-podjednotka C-konca α-podjednotky. Vzhľadom na to, že RBS zistená v ORF 1 sa zhoduje vo svojej polohe presne s RBS tejto aspartátkinázy, môže sa analogicky odvodiť, že tu existuje klonovaná β-podjednotka aspartátkinázy Corynobacterium glutamicum.

5. Skúmanie expresie

5.1 Komplementácia asd- a lysC-negatívnych kmeňov Escherichia coli

Identitu ORF 2 s génom asd je možné doložiť komplementáciou asd-negatívneho kmeňa Escherichia coli RASA 6 (Richaud, F. a kol., C. R. Acad. Sc. Paríš, 293, 507-512 (1981)) pomocou plazmidov pCS2 a pCS24. Plazmid pCS23, pri ktorom asi 30 aminokyselín C-konca ASA-DH chýba, nekomplementuje. Žiadny z týchto plazmidov nie je schopný komplementovať AKI-III negatívny kmeň Escherichia coli Gif 106 Ml (Boy, E. a kol., Biochémie 61, 1151-1160 (1979)).

5.2 Stanovenie špecifickej aspartátkinázy (AK) a aspartylβ-semialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) v transformantoch ATCC 13032 s rôznymi štiepnymi derivátmi pCS2

Analogické závery odvodené v odseku 4.3 z porovnania homológií, podľa ktorých fragment génu Pstl-Xhol z DM58-1 obsahuje len časť génu lysC (AK), ale úplný gén asd, je možné jednoznačne potvrdiť enzýmovými meraniami.

Žiadny kmeň Corynobacterium glutamicum transformovaný pomocou pCS2 alebo derivátom pCS2 neobsahuje zvýšenú aspartátkinázovú aktivitu proti rodičovskému kmeňu (tabuľka 4, stĺpec 3).

SK 279719 Β6

Naproti tomu vo všetkých prípadoch transformantov, ktorých plazmidy obsahovali asd-štruktúmy gén, bola dokázateľná silná superexpresia aspartyl-p-scmialdchyddehydrogenázy (tabuľka 4, stĺpec 2, obr. 3 a 4). Plazmidy pCS23 a deriváty pCS23 nevedú podľa predpokladu k superexpresii aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy. Na základe vysokej lability aspartyl-P-semialdehyddehydrogenázy kolíšu faktory superexpresie, ktoré sa dajú vypočítať zo špecifickej aktivity, medzi hodnotami 31 až 65.

6. Enzymatické vlastnosti a vylučovanie L-lyzínu

Vylučovanie L-lyzínu v množstve 7,1 g/1 za 72 hodín dokázané pre ATCC 13032 pCS2 (pozri tabuľka 2) sa dá odvodiť na základe dvoch geneticky realizovaných zmien.

a) Klonovanie regulačnej podjednotky aspartátkinázy z DM58-1 bez zvýšenia bunkového obsahu enzýmu.

b) Klonovanie aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy zDM58-l, ktoré vedie k 31 až 65-násobnému zvýšeniu bunkového obsahu enzýmu.

Claims

1. DNA-fragment, ktorý sa skladá z nukleotidovej sekvencie s dĺžkou 2,1 kb, ohraničený PstI- a Xhol- miestami štiepenia, vyznačujúci sa tým, že kóduje aminokysclinovú sekvenciu, uvedenú na obr. 5, a tým zabezpečuje produkciu proteínov vedúcich k aktivite aspartyl-P-semialdehyddehydrogenázy (asd) a kderegulácii aspartátkinázy (lysC) a je obsiahnutý v plazmide pCS2, ktorého delečná mapa je uvedená na obr. 3, uloženom v Corynobacterium glutamicum pod číslom DSM 5086.

2. Rekombinantná DNA odvodená z plazmidu pCS2 podľa nároku 1, charakterizovaná delečnou mapou zodpovedajúcou označeniu pCS26, uvedenou na obr. 3.

3. Rekombinantná DNA, odvodená z plazmidu pCS2 podľa nároku 1, charakterizovaná delečnými mapami zodpovedajúcimi označením pCS23 alebo pCS233 na obr. 3.

4. Spôsob výroby L-lyzínu fermentáciou mikroorganizmov rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium, produkujúcich túto aminokyselinu, vyznačujúci sa t ý m , že mikroorganizmy obsahujú plazmid podľa nároku 1 alebo z nej odvodenú rekombinantnú DNA podľa nárokov 2 a 3.

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že mikroorganizmom je Corynobacterium glutamicum DMS 5086.