SI20149A - Farmacevtski sestavki tizoksanida in nitazoksanida - Google Patents

Abstract

Farmacevtski sestavek, ki vsebuje kot učinkovino najmanj eno spojino, izbrano iz skupine, ki obstaja iz spojine s formulo (I) in iz spojine s formulo (II). Učinkovina je prednostno v obliki delcev z velikostjo delcev pod 200 mikro metrov in srednjo velikostjo delcev nad 10 mikro metrov. Farmacevtski sestavki so prednostno stabilizirani z najmanj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino. Farmacevtski sestavki so posebno koristni za zdravljenje oportunističnih okužb pri ljudeh s prizadetim ali zatrtim imunskim sistemom in za zdravljenje okužb s trematodami.ŕ

Description

FARMACEVTSKI SESTAVKI TIZOKSANIDA IN NITAZOKSANIDA

OZADJE IZUMA

Področje izuma

Predmetni izum se nanaša na farmacevtski sestavek, ko vsebuje kot učinkovino najmanj eno spojino, izbrano iz skupine, ki obsega formulo (I)

in formulo (II)

Učinkovina (učinkoviti agens) je prednostno v obliki delcev, ki imajo velikost delcev manjšo od 200 pm ter povprečno velikost delcev večjo od 10 pm.

Izum se nanaša tudi na farmacevtske sestavke, ki so stabilizirani z najmanj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino.

Farmacevtski sestavki so posebno koristni za zdravljenje oportunističnih infekcij pri osebah s prizadetimi ali suprimiranimi (zatrtimi) imunskimi sistemi, in za zdravljenje infekcij s trematodami.

Opis sorodnega stanja tehnike

Obstaja nujna potreba po razvoju metod za zdravljenje številnih parazitskih in bakterijskih infekcij pri ljudeh s prizadetimi imunskimi sistemi (AIDS, rakavi pacienti, stare ali starejše osebe, pacienti s presajenimi organi, ki dobivajo imunosupresivna zdravila). Nadaljnje ciljno področje so infekcije s trematodami, zlasti v tropskih podnebjih. Torej obstaja potreba po farmacevtskem sestavku, ki ga lahko prenašajo celo imunsko prizadeti ljudje, in ki je stabilen pri skladiščenju celo v tropskih okoljih.

Bolj specifično je Toxoplasma gondii protozojska ter je med prevladujočimi vzroki latentne infekcije centralnega živčnega sistema po celem svetu. Mnoge zdrave osebe so inficirane s parazitom, vendar imunski sistem običajno vzdržuje organizem pod kontrolo. T. gondii je najobičajnejši oportunistični patogen v možganih pacientov z AIDSom. V sedanjem času postaja toksoplazmoza vedno večji problem, ne samo zaradi AIDSa, ampak tudi zaradi bolj razširjene uporabe imunosupresivnih zdravil (npr. pri dajanju pacientom s transplantacijo organov). Toksoplazmozo običajno zdravijo s kombinacijo pirimetamina in sulfadiazina. Čeprav so zdravila učinkovita, pa ne uničijo parazitskih cist, zaradi česar je treba z zdravljenjem nadaljevati pri vzdrževalni dozi. Toksičnost pogosto izsili prekinitev dajanja zdravila, zlasti pri imunosuprimiranih, kar vodi do ponovitve bolezni. Statistike niso dobre, saj poročajo o smrtnosti okoli 70 odstotkov pri imunodeficientnih pacientih ter o srednjem preživetju štirih mesecev. Kriptosporidiozo povzroča mikroskopski protozojski parazit Cryptosporidium parvum. Pri osebah z normalnimi imunskimi funkcijami je diareja, ki jo povzroča C. Parvum, morebiti intenzivna in dolgotrajna, vendar se ustavi sama od sebe. Pri pacientih z AIDSom pa je kriptosporodialna diareja pogosto življensko nevarna. Ocenjujejo, da 15-20 odstotkov pacientov z AIDSom trpi zaradi tega stanja. Doslej še ne obstaja konsistentno učinkovita ali odobrena terapija za kriptosporidiozo.

Najpogosteje identificirani patogen pri pacientih z AIDSom je Enterocytozoon bieneusi, mikrosporidialen parazit, ki ga najdemo v skoraj eni četrtini pacientov. Sedaj se zdi, da se bo ta neznatni parazit izkazal kot vzrok za velik del mnogih nepojasnjenih primerov slabe absorpcije, diareje in hiranja, ki jih vidimo pri pacientih okuženih s HIV. Doslej še ni bilo znanega učinkovitega zdravljenja.

Številne druge vrste mikrosporidij inficirajo HlV-pozitivne paciente, vključno Encephalitozoon hellem in cuniculi, ter nova vrsta označena s Septata intestinalis. Nedavno poročilo nakazuje, da razsejane infekcije z mikrosporidijami pridobivajo na pomenu.

Infekcija s parazitom Isospora belli je klinično nerazpoznavna od kriptosporidioze. Za /. belli, ki je običajnejša v tropskih podnebjih, so poročali o manj kot 1 % pacientov v ZDA, čeprav je dejanska pogostnost verjetno višja.

Pneumocystis carinil so na splošno klasificirali kot protozojski parazit; nekatere študije označujejo, da je to lahko gliva, s katerimi si deli določena genska zaporedja. P. carinil' običajno inficira pljuča (Pneumocystis Carinii Pneumonia (PCP)). Poročajo, da je terapija uspešna pri okoli 40-60 % pacientov, problemi pa vključujejo toksičnost zdravila, zlasti za imunsko prizadete paciente. Med mnogimi resnimi pojavi infekcije z virusom humane imunske deficience (HIV) pri otrocih, izstopa PCP zaradi visoke pogostnosti, edinstvene starostne porazdelitve in pogoste smrtnosti. PCP je najpogostejša resna oportunistična infekcija pri otrocih okuženih s HIV. Pogostnost PCP med s HIV okuženimi malčki, ki niso deležni profilakse, je ocenjeno na vsaj 12 % v prvem letu življenja. Mnogi otroci umrejo kmalu po razvoju PCP.

Mycobacterium Avium Complex (MAC) se nanaša na infekcije z družino zelo podobnih mikobakterijskih organizmov, Mycobacterium avium in M. Intracellulare. Če se MAC pojavi pri imunsko neprizadetih ljudeh, je to običajno v obliki infekcije v respiratornem traktu. Pri pacientih z AIDSom, je MAC pogosto razsejan (razsejan MAC ali DMAC), prizadet pa je lahko skoraj vsak sistem organov. V nedavni študiji so MAC bakterije našli v 43 % pacientov, ki so preživeli dve leti po diagnozi AIDSa. Za razsejani MAC doslej še ni bilo predpisane standardne terapije. Običajno predpisujejo kombinacijo zdravil in če so uspešne, je treba s takim zdravljenjem nadaljevati doživljensko. Nujno je potrebna učinkovitejša terapija.

S HIV okuženi so posebno občutljivi na infekcijo z Mycobacterium tuberculosis in potek bolezni je pospešen. Kakor je ekstrapulmonarna tuberkuloza neobičajna pri pacientih, ki niso okuženi s HIV, pa se pogosto pojavlja pri HlV-pozitivnih ljudeh. CDC je izdal smernice za zdravljenje tuberkuloze, ki je usmerjen na naraščajočo prevladujočo obliko tuberkuloze odporne na številna zdravila (MDR-TB). Umrljivost med pacienti z AIDSom, ki imajo MDR-TB, je zelo visoka (približno 80 %) in napredovanje bolezni je izredno hitro.

Torej obstaja nujna potreba po razvoju metode za zdravljenje teh infekcij, ki so tako razširjene in ogrožajo ljudi in živali.

Obstaja tudi potreba po zdravilu širokega spektra za poenostavljenje zdravljenja infekcij s trematodami. Najprej je potrebno diagnosticirati specifični trematodni patogen in nato predpisati terapijo z zdravilom, ki je specifična za to trematodo. Mnoge manj razvite države niso usposobljene za diagnozo specifične trematode. Razvoj zdravila širokega spektra bi odpravil potrebo po diagnozi.

Schistosoma mansoni, krvni parazit, je povzročitelj shistosomiaze, za malarijo druge najpomembnejše tropske parazitske bolezni pri človeku in najpomembnejša trematodna infekcija pri človeku. Schistosoma haematobium je nadaljnja pomembna vrsta, ki inficira človeka. Preko 200 milijonov posameznikov trpi zaradi shistosomiaze po celem svetu, vključno več sto tisoč ljudi v ZDA.

Fasciola hepatica, običajni jetrni parazit, povzroča predvsem bolezen ovac, vendar so včasih tudi ljudje gostitelji. Parazitu se posreči preživetje v prisotnosti močnega imunskega odziva gostitelja. Za terapijo so predlagali bitionol, vendar ni odobren za uporabo v ZDA.

Zato obstaja potreba po farmacevtskem sestavku, ki je stabilen pri skladiščenju celo v tropskih okoljih in ima širok spekter učinka proti trematodam.

Povzetek izuma

Sedaj smo opazili na živalih in kliničnih študijah na ljudeh, da je učinkovitost terapije oz. zdravljenja z uporabo spojin s formulo (I) in (II) odvisna od velikosti delcev učinkovitih snovi ter od stabilnosti teh snovi.

Opisani farmacevtski sestavki so primerni za zdravljenje trematodnih infekcij na ljudeh in živalih, ki jih povzročajo shistosome, kot so Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma mekongi, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalaturrr, Fasciola, kot je Fasciola hepatica in Fasciola gigantica, Fasciolopsis biskr, in Dicrocoelium dendriticum, Heterophyes heterophyes in Metagonimus yokogawa.

Farmacevtski sestavki so učinkoviti tudi za zdravljenje oportunističnih infekcij pri imunsko prizadetih, ki jih povzročajo Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Enterocytzoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii in Toxoplasma gondii.

Farmacevtski sestavek je lahko v obliki, ki je primerna za oralno dajanje, kot je trdna dozirna oblika, tekoča suspenzija, ali pasta.

KRATEK OPIS SKIC

Za popolnejše razumevanje narave in namenov predmetnega izuma se sklicujemo na naslednji podrobni opis, skupaj s spremljajočimi skicami, kjer:

Skica 1 kaže odstotno inhibicijo in viabilnost celice gostitelja pri uporabi nitazoksanida proti E. intestinalis.

Skica 2 kaže odstotno inhibicijo in viabilnost celice gostitelja pri uporabi nitazoksanida proti V.corneae.

Skica 3 kaže odstotno inhibicijo in viabilnost celice gostitelja pri uporabi albendazola proti E. intestinalis.

Skica 4 kaže odstotno inhibicijo in viabilnost celice gostitelja pri uporabi albendazola proti V. corneae.

Skici 5 in 6 kažeta diagram OD vrednosti, dobljenih za vsako luknjo s kulturo T. gondii, z ozirom na koncentracijo zdravila v kulturi.

Skica 7 je diagram, osnovan na preizkusu učinkovitosti nitazoksanida proti mikobakterijam, ki rastejo v tekoči juhi.

Skica 8 kaže odstotek učinkovitih delcev z velikostjo pod Φ μιτι.

Podroben opis izuma

Metoda za zdravljenje infekcij po predmetnem izumu obsega dajanje farmacevtskega sestavka, ki obsega kot učinkovino najmanj eno spojino, izbrano iz skupine, ki obstaja iz desacetil-nitazoksanida s formulo (I):

Nitazoksanid (NTZ), spojina s formulo (II), je generično ime za 2-(acetoliloksi)-N(5-nitro 2-tiazolil) benzamid, to je spojino, ki stajo najprej sintetizirala Rossignol in Cavier v letu 1975. 2 mg nitazoksanida se da raztopiti v 1 ml DMSO. Nitazoksanid se da zlahka absorbirati oralno.

Doslej še ni bilo dokazov, da bi imeli spojini s formulo (I) in/ali (II) širok spekter učinka proti trematodnim infekcijam, ali da bi bili dovolj netoksični, da bi ju lahko prenesli celo imunsko prizadeti ljudje.

Priprava in določene uporabe nitazoksanida so opisane v US patentu št. 3,950,351, kot tudi v objavah avtorja predmetnega izuma. Desacetilnitazoksanid, spojina s formulo (I), je včasih imenovana tizoksanid ali d-NTZ, in je metabolit nitazoksanida.

V W0 95/28393 je avtor predmetnega izuma razkril postopek za pripravo čiste spojine s formulo (II), kot tudi uporabo sestavka, ki vsebuje zmes spojin s formulo (I) in (II).

Sedaj smo opazili, da imajo trdni delci spojine s formulo (I), spojine s formulo (II), ali njihove zmesi, velikost delcev med 170 in 520 pm (srednja velikost delcev = 352 pm) zelo omejeno učinkovitost pri oralnem dajanju živalim ali ljudem. Učinkovitost takih delcev je slabša od učinkovitosti obstoječih farmacevtskih proizvodov in zato nesprejemljiva za registracijo ali tržišče.

Na psih smo tudi opazili, da je oralno dajanje ene same doze 50 miligramov na kilogram trdnih delcev spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II) z velikostjo delcev pod 5 pm, povzročalo hude negativne reakcije na živalih.

Sedaj pa smo ugotovili, da mora za doseganje učinkovitega in varnega zdravljenja infekcij, ki jih povzročajo paraziti, bakterije, glive in virusi na ljudeh in živalih, farmacevtski sestavek vsebovati, bodisi v trdni dozirni obliki ali kot vodna suspenzija, učinkovito dozo učinkovine v obliki trdnih delcev z velikostjo delcev pod 200 pm in vsebujočih%spojino s formulo (I) in/ali spojino s formulo (II), pri čemer je srednja velikost delcev trdne učinkovine večja od 10 pm.

Prisotnost visoke vsebnosti delcev učinkovine z velikostjo nad 200 pm z ozirom na vsebnost delcev z velikostjo med 5 in 200 pm signifikantno zmanjša kemoterapevtsko učinkovitost spojin. Prednostno ne vsebujejo farmacevtski sestavki po predmetnem izumu več kot 5 mas. % delcev trdne snovi z velikostjo nad 200 pm. Najbolj prednostno pa farmacevtski sestavki po predmetnem izumu praktično ne vsebujejo trdnih delcev z velikostjo nad 200 pm.

Prisotnost visoke vsebnosti delcev učinkovine z velikostjo pod 5 pm z ozirom na vsebnost delcev z velikostjo med 5 in 200 pm lahko povzroči negativne učinke na živalih ali ljudeh. Nadalje smo ugotovili, da so delci z velikostjo pod 5 pm hitreje absorbirani iz gastro-intestinalnega trakta v krvni obtok in da zato niso tako učinkoviti proti parazitom, bakterijam, glivam in virusom, ki običajno žive v gastrointestinalnem traktu živali in ljudi.

Znanstvenik iz predmetne stroke ne bi mogel predvideti, da bo imela velikost delcev spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II) tako signifikanten vpliv na njihovo antimikrobno učinkovitost pri živalih in ljudeh. Tako npr. v študijah, ki jih je vodil avtor predmetnega izuma, antiparazitske spojine, kot so albendazol, mebendazol, niklozamid, praziquantel in metronidazol, niso pokazale tako izrazito različne antiparazitske učinkovitosti na živalih ali ljudeh, ki bi bila odvisna od njihove velikosti delcev. Poleg tega znanstvenik s predmetnega področja ni mogel predvideti, da bo imela velikost delcev spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II) tako negativen vpliv na sposobnost živali ali ljudi za prenašanje (toleranco) apliciranih navedenih učinkovin.

Spojino oz. spojine s formulo (I) in (II) lahko dajemo bodisi v trdni dozirni obliki ali v vodni suspenziji, prednostno pa je, da farmacevtski sestavek vsebuje učinkovito dozo učinkovine v obliki trdnih delcev s formulo (I) in/ali (II) z velikostjo delcev pod 200 pm, pri čemer je srednja velikost delcev navedenih trdnih delcev učinkovine večja od 10 pm, kot je ugotovljeno z Coulter® Counter LS 100. Ta oprema uporablja lasersko svetlobo pri 750 nm za merjenje dimenzij delcev od 0.4 do 900 pm premera z difrakcijo svetlobe. Vzorce smo merili v vodi z majhno množino Triton Χ-100, da smo povečali omočljivost in razkosmičili prašek.

Prikladno je srednja velikost delcev navedenih trdnih delcev učinkovine med 10 in 100 pm, prednostno med 20 in 50 pm. Primeri za prednostne sestavke so:

• sestavek, v katerem ima manj kot 10 mas.% navedenih trdnih delcev učinkovine velikost delcev nad 100 pm;

• sestavek, v katerem ima manj kot 50 mas.% navedenih trdnih delcev učinkovine velikost delcev pod 50 pm.

Prikladno je srednja velikost delcev navedenih delcev trdne učinkovine med 10 in 100 pm, prednostno med 20 in 50 pm. V skladu s prednostno izvedbo sestavka ima manj kot 10 % navedenih delcev trdne učinkovine velikost delcev pod 5 pm. Učinkovina ali učinkovine, uporabljene v trdni dozirni obliki ali kot suspenzija, so prikladno zmes trdnih delcev spojin s formulo (I) in s formulo (II) z velikostjo delcev pod 200 pm, pri čemer je masna vsebnost spojine s formulo (I) z ozirom na maso spojin s formulo (I) in s formulo (II) navedene zmesi v območju od 0.5 do 20 %, prednostno med 0.5 in 10 %.

Izum se nanaša tudi na zgoraj opisane farmacevtske sestavke, ki prikladno vsebujejo najmanj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino. Primeri za take kisline so: citronska, glutaminska, jantarna, etansulfonska, ocetna, vinska, askorbinska, metansulfonska, fumarna, adipinska, jabolčna kislina ter njihove zmesi. Zelo primerna je citronska kislina. Prisotnost navedene kisline izboljša stabilnost ene učinkovine ali učinkovin.

Razmerje med maso farmacevtsko sprejemljive kisline proti masi navedenih delcev trdne učinkovine je prikladno med 0.01 in 0.5, prednostno med 0.03 in 0.2. Prikladno zadošča množina kisline za nastavitev pH suspenzije med 2 in 6, prednostno med 3 in 5, najbolj prednostno med 3.5 in 4.5.

Tehnike priprave in prednostni primeri za trdne in tekoče dozirne oblike farmacevtskega sestavka so opisane v WO 95/28393, katerega opis tukaj vključujemo kot referenco. Sestavki vsebujejo prikladno omakalo in morebiti škrobni derivat, kot so npr. opisani v US patentu št. 5,578,621, katerega vsebino vključujemo tukaj kot referenco za opis možnih omakal in škrobnih derivatov. Omakalo, opisano v US patentu št. 5,578,621, rabi kot dispergator.

Taki farmacevtski sestavki, bodisi kot trdne ali tekoče dozirne oblike, ali kot paste ali mazila lahko opcijsko vsebujejo dodatne učinkovine kot so antibiotiki, antivirusna sredstva ali inhibitorji protonske črpalke (»proton pump inhibitors«). Čeprav ni prikladno, pa je tudi možno, da taki farmacevtski pripravki vsebujejo delce trdne učinkovite spojine s formulo (I) in/ali spojine s formulo (II), ki so večji od 200 pm. Sestavki lahko vsebujejo polnila (ekscipiente ), ki so kot taki znani za namen priprave oblik, primernih za oralno dajanje.

Prikladno je za doseganje odlične učinkovitosti proti širokemu spektru parazitov, bakterij, gliv in virusov, porazdelitveni faktor navedenih delcev trdne učinkovine med 0.8 in 2, prednostno med 1.1 in 1.9, najbolj prednostno nad 1.5, pri čemer je navedeni porazdelitveni faktor izračunan z naslednjo formulo:

Fgo% - ($90% - Φιο%)/((Φ9Ο% ⁺ Φιο%)/2) v kateri • Fgo% je porazdelitveni faktor pri 90%;

• Φ90% je maksimalna velikost delcev frakcije delcev, ki ustreza 90% navedenih delcev trdne učinkovine, in • Φ·ιο% J^e maksimalna velikost delcev frakcije delcev, ki ustreza 10% navedenih delcev trdne učinkovine.

V skladu s specifično izvedbo izuma pripravimo delce spojine s formulo (I) in/ali (II) po zgoraj opisanih metodah in jih nato zmeljemo tako, da je manj kot 10% navedenih delcev učinkovine večjih od 100 pm, manj kot 50% navedenih delcev je večjih od 50 pm, manj kot 10% navedenih delcev učinkovine pa je manjših od 5 pm, pri čemer je srednja velikost delcev med 20 in 50 pm. Navedene delce učinkovine nato granuliramo z uporabo zmesi, ki vsebuje delce trdne učinkovine in najmanj eno granulirno sredstvo. Primeri za granulirno sredstvo so: polivinilpirolidon, voda, alkohol, saharoza, hidroksil celuloza ter njihove zmesi. Prikladno dodamo vsaj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino med potekom granulacije.

Izum se nanaša na trdne dozirne oblike, ki vsebujejo sestavek po predmetnem izumu, kot so tablete, disperzne tablete, obložene tablete, matrike itd. Dozirna oblika po predmetnem izumu vsebuje na primer:

• delce trdne učinkovine z velikostjo delcev pod 200 pm, pri čemer ima manj kot 10% navedenih delcev velikost nad 100 pm, manj kot 50% navedenih delcev ima velikost nad 50 pm ter manj kot 10% navedenih delcev ima velikost pod 5 pm, srednja velikost delcev pa je med 20 in 50 pm;

• najmanj eno granulirno sredstvo;

• najmanj eno omakalo;

• najmanj en derivat škroba, in • najmanj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino, ki jo dodamo prednostno med postopkom granuliranja.

Tekoče dozirne oblike, kot so vodne suspenzije, po predmetnem izumu vsebujejo na primer:

• kot učinkovino trdne delce, ki vsebujejo spojino s formulo (I) in/ali spojino s formulo (II) z velikostjo delcev pod 200 pm pri čemer ima manj kot 10 % navedenih delcev velikost nad 100 pm, manj kot 50% navedenih delcev ima velikost nad 50 pm in manj kot 10% navedenih delcev ima velikost pod 5 pm, in • najmanj eno granulirno sredstvo;

• najmanj eno omakalo;

• najmanj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino, pri čemer je pH suspenzije med 2 in 6, prednostno med 3 in 5, najbolj prednostno med 3.5 in 4.5;

• najmanj eno zgoščevalo, npr. ksantanski gumi, aguarski gumi, kristalno celulozo, karuba gumi, karboksimetil celulozo ali njihove zmesi.

Pastozne ali mazalne oblike po predmetnem izumu, ki so primerne za oralno dajanje, vsebujejo na primer:

• kot učinkovino trdne delce, ki vsebujejo spojino s formulo (I) in/ali spojino s formulo (II) z velikostjo delcev pod 200 pm, pri čemer ima manj kot 10 % navedenih delcev velikost nad 100 pm, manj kot 50% navedenih delcev ima velikost nad 50 pm in manj kot 10% navedenih delcev ima velikost pod 5 pm, in • najmanj eno omakalo;

• najmanj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino, pri čemer je pH suspenziije med 2 in 6, prednostno med 3 in 5, najbolj prednostno med 3.5 in 4.5;

• najmanj eno zgoščevalo, npr. ksantanski gumi, aguarski gumi, kristalno celulozo, karuba gumi, karboksimetil celulozo ali njihove zmesi.

Pastozne ali mazalne oblike za zunanjo ali intravaginalno uporabo vsebujejo na primer:

• kot učinkovino trdne delce, ki vsebujejo spojino s formulo (I) in/ali spojino s formulo (II) z velikostjo delcev pod 200 pm, pri čemer ima manj kot 10 % navedenih delcev velikost nad 100 pm, manj kot 50% navedenih delcev ima velikost nad 50 pm in manj kot 10% navedenih delcev ima velikost pod 5 pm, in • najmanj eno omakalo;

• najmanj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino, pri čemer je pH suspenziije med 2 in 6, prednostno med 3 in 5, najbolj prednostno med 3.5 in 4.5;

• derivate cetil alkohola in/ali glicerida in/ali propilenglikol;

• najmanj eno zgoščevalo, npr. ksantanski gumi, aguarski gumi, kristalno celulozo, karuba gumi, karboksimetil celulozo ali njihove zmesi.

Opis priprave farmacevtskih sestavkov

Suho Čisto spojino s formulo (I) in suho čisto spojino s formulo (II) smo zmleli in sortirali s pomočjo sita. Po mletju so imeli delci spojine s formulo (I), s formulo (II) in njihove zmesi porazdelitev velikosti delcev, kot je navedena na Skici 8. Skica 8 kaže odstotke delcev z velikostjo pod Φ pm.

Iz navedene Skice je videti, da :

• ima manj kot 10 mas.% delcev velikost delcev pod približno 5 pm;

• ima manj kot 10 mas.% delcev velikost delcev večjo od približno 70 pm;

• srednja velikost delcev je približno 40 pm;

• porazdelitveni faktor delcev je okoli 1.73, pri čemer je navedeni porazdelitveni faktor izračunan z naslednjo formulo;

F90% - (Φθο% - Φιο%)/((Φθο% + Φ·ιο%)/2) v kateri • F9θο/_ο j_e porazdelitveni faktor pri 90%;

• ¢90% je maksimalna velikost delcev frakcije delcev, ki ustreza 90% navedenih delcev trdne učinkovine, in • Φ·ιο% je maksimalna velikost delcev frakcije delcev, ki ustreza 10% navedenih delcev trdne učinkovine.

Specifični primeri za take sestavke so prikazani v naslednjih Tabelah.

Tabela 1. Primer sestavka dispergirnih tablet za oralno dajanje, ki vsebuje spojino s formulo (II) in spojino s formulo (I) kot učinkovini.

Nitazoksanid (99%)+desacetil-nitazoksanid(1%) 200 mg

Mikrokristalna celuloza

Avicel pH 102, prodaja FMC-USA 116 mg

Crospovidone 25 mg

Magnezijev stearat 3 mg

Koloidni silicijev dioksid 5 mg

Citronska kislina 10 mg

Jagodna aroma št. 877720, prodaja Robertet 10 mg

Natrijev saharinat 2 mg

Tabela 2. Primer sestavka obloženih tablet za oralno dajanje, ki vsebujejo spojino s formulo (II) in spojino s formulo (I) kot učinkovini.

Nitazoksanid 500 mg

Koruzni škrob 60 mg

Pre-želatiniziran koruzni škrob 70 mg

Hidroksipropil metilceluloza 5 mg

Saharoza 20 mg

Natrijev škrobni glikolat 30 mg

Citronska kislina 25 mg

Smukec 8 mg

Magnezijev stearat 7 mg

Obloge:

Na tablete ali granule, ki so vsebovale 500 mg učinkovine, nabrizgamo oblogo z vročo raztopino sladkorja ali filma.

Tabela 3. Primer za vodno suspenzijo za oralno dajanje, ki vsebuje spojino s formulo (II) in spojino s formulo (I) kot učinkovini. pH suspenzije je okoli 4.1.

Nitazoksanid (98%)+desacetil-nitazoksanid(2%) 2 g

Destilirana voda 100 ml

Natrijev benzoat 0.2 g

Saharoza 30.5 g

Ksantanski gumi 0.2 g

Mikrokristalnaceluloza in natrijeva karboksimetilceluloza

Avicel RC-591, prodaja FMC-USA 0.8 g

Citronska kislina 0.2 g

Dihidratni natrijev citrat 50 mg

Jagodna aroma št. 877720, prodaja Robertet 125 mg

Rdeče barvilo št. 33 D in C 1 mg

Tabela 4. Primer paste za oralno dajanje, ki vsebuje spojino s formulo (II) in spojino s formulo (I) kot učinkovini.

Nitazoksanid (98%)+desacetil-nitazoksanid(2%) 500 mg

Mineralno olje 10 g

Rjavi sladkor 1 g

Mikrokristalnaceluloza in natrijeva karboksimetilceluloza

Avicel RC-591, prodaja FMC 0.8 g

Citronska kislina 0.2 g

Tabela 5. Primer za formulacijo paste ali mazila za intravaginalno ali zunanjo uporabo, pri čemer navedena pasta ali mazilo vsebuje spojino s formulo (II) in spojino s formulo (I) kot učinkovini.

Nitazoksanid (98%)+desacetil-nitazoksanid(2%)

Cremaphor A6

Cremaphor A25

Mineralno olje

Luvitol EHO

Glicerol monoester

Cetilni alkohol

Simeticone

Germaben II

Propilenglikol

Destilirana voda

8g

2g

1.5 g 7g 7g 4g 3g

0.5 g 1 g

3.5 g

62.5 g

Farmacevtski sestavki po predmetnem izumu so sestavki s širokim spektrom učinka na parazite, bakterije, glivice in viruse, zlasti pri oralnem dajanju.

Učinkovitost in varnost zgoraj opisanih farmacevtskih sestavkov sta bili odlični pri živalih in ljudeh. Specifično smo pri humanih kliničnih študijah ugotovili, da je učinkovitost zgoraj opisanih farmacevtskih sestavkov signifikantno boljša pri zdravljenju parazitskih infekcij, kot pri enakih formulacijah, ki uporabljajo učinkovino z velikostjo delcev med 170 in 520 pm (srednja velikost delcev = 352 pm), celo pri dajanju delcev z večjo velikostjo pacientom in sicer v dozah do trikrat višjih in v daljšem časovnem razdobju. Primeri za stopnje ozdravljenja so spodaj prikazani v Tabeli 6.

Tabela 6. Primerjava rezultatov za humane klinične študije z uporabo spojin s formulo (I) in formulo (II) z velikostjo delcev v območju od 170 pm do 520 pm (srednja = 352 pm) z rezultati, dobljenimi z uporabo spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II), z velikostjo delcev v območju od 5 pm do 200 pm (srednji = 34 pm).

Spojina s formulo (I) (98%) + spojina s formulo (II) (2%)

Velikost delcev 170 do 520 pm	Velikost delcev 5 do 200 pm
Doza = 15 do 50 mg/kg/dan za 3	Doza = 15 mg/kg/dan za 3
do 7 dni		dni
Št. ozdravelih/Celota = %	Št. ozdravelih/Celota = %
ozdravljenja		ozdravljenja
Parazit
Blastocystis hominis	12/27=44%	10/10=100%
Entamoeba histolytica	29/47=62%	106/133=80%
Giardia lamblia	11/37=30%	50/73=68%
Ascaris lumbricoides	3/69=4%	144/179=80%
Trichuris trichiura	7/48=15%	58/79=73%

Za vsakega izmed parazitov, naštetih v Tabeli 6, so proporcionalne stopnje ozdravljenja signifikantno boljše za paciente, zdravljene z učinkovitimi delci med 5 in 200 pm, kot pa za tiste, ki so zdravljeni z učinkovitimi delci v območju 170 pm do 520 pm, pri čemer je statistična signifikanca v vsakem primeru p<0.02 (ob uporabi standardnega X testa). To je veljalo celo takrat, kadar so bile doze učinkovine z večjimi delci običajno višje in je bilo trajanje zdravljenja pogosto daljše, kot pri dajanju pacientom, ki so dobivali farmacevtske sestavke učinkovine z velikostjo delcev pod 200 pm. Za nobeno skupino pacientov niso poročali o resnih negativnih pojavih.

Pri testiranju na živalih smo opazili podobne rezultate, kot smo jih zgoraj opisali za človeške študije.

Poleg tega nismo opazili negativnih reakcij, ki so bile sicer opazovane na psih po dajanju ene same oralne doze 50 miligramov na kilogram spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II), na obsežnih študijah na živalih z uporabo spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II) z velikostjo delcev med 5 in 200 pm (srednji >10 pm), celo pri vsakodnevnem dajanju enake ali višje doze spojin v teku 90 dni ali dlje. Vrhu tega so bile navedeni sestavki stabilni (celo pri izpostavljanju temperaturam 40 °C in 65% relativni vlažnosti v obdobju šest mesecev, ali v primeru tekoče suspenzije, pri suspendiranju v vodi pod temi pogoji v času 3 mesecev), kar zagotavlja, da se učinkovite sestavine ne razgradijo in da sestavki obdržijo svojo učinkovitost tako dolgo po pripravi, kot je primerno za medicinske in komercialne namene.

V nadaljevanju bomo dokazali učinkovitost farmacevtskih sestavkov.

PRIMER I

CRYPTOSPORIDIUM PARVUM

Pri predhodnem kliničnem poskusu smo zdravili 30 pacientov z AIDSom, ki so imeli kronično kriptosporidialno diarejo, z oralnim nitazoksanidom od 500 do 2000 mg dnevno. Če se je diareja nadaljevala, so pacienti prejemali dodatne štiri tedne nitazoksanid, do 2000 mg dnevno.

Osemindvajset ljudi je dokončalo dva ali več tednov terapije in 16 od teh se je dalo oceniti glede terapevtskega odziva osmi teden zdravljenja. V tej zadnji skupini je imelo 12 oseb za 50 odstotkov ali več zmanjšane dnevne frekvence praznjenja črevesja, 10 oseb pa je pokazalo izrazito zmanjšanje ali odstranitev parazitov iz stolice, pri čemer se parazitov pri štirih ljudeh ni več dalo odkriti. Šest pacientov je izpolnjevalo tako klinične kot tudi parazitološke kriterije glede izboljšanja stanja.

Pri pacientih, ki so dobivali višje dnevne doze zdravila v daljših časovnih obdobjih, je bilo bolj verjetno, da bodo imeli pozitiven odziv.

Odprta študija nitazoksanida na kriptosporidialni diareji, povezani z AIDSom, je dokumentirala pogostejše praznjenje črevesja pri osebah, ki so jemale 500, 1000, 1500 ali 2000 mg zdravila dnevno. Udeleženci preizkusa so imeli srednje CD4+ štetje 42 celic/mm³ (območje 0-303 celic/mm³), s srednjo vrednostjo 6.7 praznjenj črevesja dnevno za povprečno 15 mesecev, Cryptosporidium parvum oociste v stolici, in nobenih drugih opaznih enteričnih parazitov. Pri skoraj vseh pacientih je odpovedala terapija z azitromicinom ali paromomicinom.

Po 23 tednih je 9 od 13 imelo popoln kliničen odziv (eden do trije so pretežno imeli vsakodnevna praznjenja črevesja), in 4 od 13 je imelo delen kliničen odziv (vsaj 50 odstotno zmanjšanje dnevnega praznjenja črevesja ali sprememba konsistence stolice, tako, da se je oblikovalo vsaj 75%). Na koncu študije je 8 od 11 popolnoma odpravilo parazit in ostali trije so imeli znatno zmanjšane koncentracije oocist. Pri dozah po 1000 mg dnevno ali več ter pri dolgotrajnejši terapiji so odzivi kazali težnjo k izboljšanju. Dva udeleženca poskusa sta imela urtikaričen kožni izpuščaj: več kot 90 odstotkov se je držalo protokola za več kot štiri tedne.

PRIMER II

CRYPTOSPORIDIUM PARVUM

Informacija o in vitro dozi

Nitazoksanid smo raztopili v sterilnem dimetilsulfoksid u (DMSO) in testirali proti intaktnim celičnim monoslojem, okuženim z oocistami C. parvum s koncentracijami 100 pg/ml, 10 pg/ml, 1 gg/ml in 0.1 pg/ml. Drugi poskus smo napravili za testiranje nitazoksanida pri dodatnih koncentracijah 20, 2, 0.2 in 0.02 gg/ml. Te koncentracije smo dosegli s serijskimi razredčenji s popolnim DMEM medijem, da smo dobili končno koncentracijo DMSO 0.5%. Kontrola medija je tudi pokazala 0.5% DMSO.

Pri poskusu smo uporabili celično kulturo MDBKF5D2 celic, gojeno v 7 mm komori, in kot Cryptosporidium parvurrr. GCH1 oociste, 5 X 10⁴ na luknjo, in smo ga vršili za primerjavo paromomicina (pozitivna kontrola) proti nitazoksanidu (poskusno zdravilo). Materiali so vključevali imunski anti- Cryptosporidium parvum sporozoitni kunčji serum (0.1%) in fluorescein-konjugirano kozje anti-kunčje protitelo (1%).

Preizkusni test na toksičnost:

200 μΙ medija, ki vsebuje nitazoksanid s koncentracijami 100, 10, 1 in 0.1 pg/ml in primerne kontrole, smo uvedli v dve luknji na plošči s 96 luknjami, ki je vsebovala zlivajoče se MDBKF5D2 celične monosloje in dve luknji brez monoslojev. Zdravilo smo inkubirali na monoslojih pri 37 °C in 8% CO2. Po 24 urah (preizkus 1) in 48 urah (preizkus 2), smo dodali MTS (Ovvensova raztopina) PMS v vsako luknjo s koncentracijami 333 μg/ml oziroma 25 μΜ. Ploščo smo vrnili v inkubator v temo za dveurno razvijanje. Po dveh urah smo 100 μΙ vsakega vrhnjega sloja (supernatanta) prenesli na novo mikrotitrirno ploščo in odčitali na ELISA čitalniku pri 490 nm. Rezultate smo beležili in analizirali. Odstotno toksičnost smo izračunali z odštetjem srednje optične gostote (OD) vrhnjih slojev (supernatantov) zdravila od srednje optične gostote (OD) vrhnjih slojev (supernatantov) kontrolnih medijev (brez zdravila), in delili z OD kontrolnega medija ter pomnožili s 100.

OD medija - OD zdravila x 100

OD medija

Poskus z intaktnimi oocistami C, parvum x 10⁴ oocist C. parvum na luknjo smo inkubirali v nitazoksanidu (100, 20, 10, 2, 1, 0.2, 0.1 in 0.02 pg/mL) pri 37 °C (8% CO2) na zlivajočih se MDBKF5D2 celičnih monoslojih. Nivo okužbe v vsaki luknji smo določili in analizirali z imunofluorescenčnim poskusom pri 24 do 48 urah. Odstotno inhibicijo smo izračunali z odštetjem srednje vrednosti preštetih parazitov/10 polje v luknjah s testiranim zdravilom od srednje vrednosti preštetih parazitov/10 polje v kontrolnem mediju (brez zdravila), delitvijo s številom preštetih v kontrolnem mediju, zatem pa s pomnožitvijo s 100.

Št. preštetih v kontrolnem mediju - Št. preštetih pri testiranju zdravila x100 Št. preštetih v kontrolnem mediju

Rezultati:

Preizkus 1: 24 ur.

Spojina	Konc.	Srednji(+SD)*	Odstotek toksičnosti	Odstotek inhibicije
Okuženi	0	983.5(+128.2)	0	0
mediji
Paromomicin	2 mg/ml	482(+47.1)	23.8	51
NTZ	100pg/ml	izgubljen	88.1	NA**
	10pg/ml	55.5(+13.5)	65,1	94.4
	1pg/ml	224.5(+28.5)	8.3	77.2
	0.1pg/ml	474.5(+29.5)	19.3	51.8

Št. preštetih parazitov/10 polj ** Zaradi toksičnosti ni na voljo

Preizkus 2: 48 ur.

Spojina	Konc.	Srednji(+SD)*	Odstotek toksičnosti	Odstotek inhibicije
Okuženi	0	2231.25(+90.03)	0	0
mediji
Paromomicin	2 mg/ml	580(+33.42)	40.8	74.01
NTZ	20pg/ml	68.75(+13.77)	92.87	96.92
	2pg/ml	113.75(+21.36)	24.93	94.90
	0.2pg/ml	1020(+158.48)	16.56	54.29
	0.02pg/ml	1041(+191.46)	21.23	53.33

* St.preštetih parazitov/10 polj

Vpliv nitazoksanida na intaktne oociste C. parvunr.

Pri preizkusu 1 smo z nitazoksanidom s koncentracijami 10, 1 in 0.1 dosegli stopnje inhibiranja parazita 94.4, 77.2 in 51.8%, in stopnje toksičnosti za celice 65.1, 8.3 in 19.3%. Čeprav seje pojavila skoraj popolna inhibicija parazita pri 10 pg/ml, je bila očitna visoka stopnja toksičnosti. Pri 1 pg/ml nitazoksanida sta bili inhibicija parazita in toksičnost za celice ugodni v primerjavi s paromomicinom pri koncentraciji 2 mg/ml (77,2% inhibicije parazita in 8.3% toksičnost za nitazoksanid pri 1 pg/ml, v primerjavi z 51% inhibicijo parazita in 23.8% toksičnost za celice pri 2 mg/ml paromomicina).

Pri preizkusu 2 je bilo zdravilo modificirano, da smo dosegli boljšo porazdelitev doz ob minimalni toksičnosti. Kot posledica tega so kulture ostale viabilne 48 ur namesto 24 ur, kot pri preizkusu 1. Jasno je, da 48 urna inkubacija povzroči višjo relativno toksičnost za celice, kot je razvidno iz preizkušanja paromomicina pri obeh preizkusih. Koncentracija 20 pg/ml nitazoksanida je bila še vedno preveč toksična pri 48 urni inkubaciji, čeprav je videti celični monosloj še vedno nedotaknjen. Možno je, da visoka toksičnost, ki mora prizadeti delovanje celic, vpliva tudi na razvoj okužbe s parazitom. Pri 2 pg/ml nitazoksanida je bila znatna inhibicija okužbe s parazitom sorazmerna majhni toksičnosti za celice. Nadaljnja razredčenja so tudi povzročila signifikantno inhibicijo in majhno toksičnost. Pri koncentraciji zdravila 2 μο/ιτιΙ nakazujeta zmerna toksičnost za celice in inhibitorska aktivnost 94.90%, da je 2 μ9/ηηΙ nitazoksanida boljše od 2 mg/ml (to je 1000 krat večja koncentracija) paromomicina za in vitro okužbo s C. parvum.

PRIMER III

CRYPTOSPORIDIUI\/I PARVUM

Informacija o in vitro dozi in hrambi:

Osnovne raztopine nitazoksanida in desacetil-nitazoksanida (NTZ in NTZdes) smo testirali proti oocistam C. parvum in ekscistnimi sporozoitnimi okuženimi celičnimi monosloji pri koncentracijah 10, 1, 0.1 in 0.01 μ9/ιηΙ. Vsako spojino smo raztopili v 100% dimetilsulfoksida (DMSO) in razredčili na želene koncentracije s sterilno DMEM. Vsaka koncentracija nitazoksanida in kontrolni mediji so vsebovali 0.025% DMSO kot konstanto.

Pri poskusu smo uporabili celično kulturo MDBKF5D2 celic, gojenih v 7 mm komorah, in kot Cryptosporidium parvum: GCH1 oociste, 5 X 10⁴ na luknjo, ter ga izvajali za primerjavo paromomicina (pozitivna kontrola) proti nitazoksanidu (poskusno zdravilo). Materiali so vključevali imunski anti-Cryptosporidium parvum sporozoitni kunčji serum (0.1%) in fluorescein-konjugirano kozje anti-kunčje protitelo (1%).

Testni preizkus na toksičnost:

200 μΙ medija, ki je vseboval raztopino nitazoksanida s predhodno omenjenimi koncentracijami, in primerne kontrole smo vnesli v dve luknji na plošči s 96 luknjami, ki je vsebovala zlivajoče se MDBKFD2 celične monosloje in dve luknji brez monoslojev. Zdravilo smo inkubirali na monoslojih pri 37 °C in 8% CO2. Po 48 urah smo dodali MTS (Owenovo raztopino) in PMS k vsaki luknji pri koncentracijah 333 pg/ml oziroma 25 μΜ. Ploščo smo vrnili v inkubator v temo in razvijali 2 uri. Po 2 urah smo 100 μΙ vsakega vrhnjega sloja (supernatanta) prenesli v novo mikrotitrirno ploščo in odčitali na ELISA čitalniku pri 490 nm. Rezultate smo zabeležili in analizirali. Odstotek toksičnosti smo izračunali z odštetjem srednje optične gostote (OD) vrhnjih slojev (supernatantov) zdravila od srednje OD vrhnjih slojev (supernatantov) kontrolnega medija (brez zdravila), nato pa delili z OD kontrolnega medija in pomnožili s 100.

OD medija - OD zdravila x 100

OD medija

Rezultate za citotoksičnost smo izrazili kot sledi:

0.5% toksičnost = 0, 6-25% toksičnost = 1, 26-50% toksičnost = 2,

51-75% toksičnost = 3 in 76-100% toksičnost = 4.

Kot standard smatramo rezultate za citotoksičnost 0 ali 1 kot sprejemljive nivoje toksičnosti. Rezultate za toksičnost 2, 3, ali 4 smatramo kot visok nivo toksičnosti za celični monosloj.

Poskus na intaktnih oocistah C. parvum χ 10⁴ oocist C. parvum na luknjo smo inkubirali v predhodno omenjenih koncentracijah nitazoksanida pri 37°C (8% CO2) na zlivajočih se celičnih monoslojih MDBKF5D2. Določili smo nivo okužbe v vsaki luknji ter računalniško analizirali z imunofluorescenčnim preizkusom v 48 urah. Odstotno inhibicijo smo izračunali z odštetjem srednjega števila preštetih parazitov/polje v luknjah za testiranje zdravila od srednjega števila preštetih parazitov/polje v kontrolnem mediju (brez zdravila), nato pa delili s številom preštetih v kontrolnem mediju in pomnožili s 100.

Št. preštetih v kontrolnem mediju - Št. preštetih pri testiranem zdravilu x100 Št. preštetih v kontrolnem mediju

Rezultati:

Preizkus z oocistami C.parvum (48 ur).

Zdravila Vodni mediji Paromo micin	Konc	Parazit	+SD	Toks/OD	+SD	%lnhib	%Toks	Rezultat
0	681.58	+271.02	2.024	±0-18	0	0	0
2000	115.75	+44.65	1.219	+.009	83.02	39.79

0.025%	0	628.50	+171.94	1.799	+1.45	0	0	0
DMSO mediji
NTZ	10	11.75	+7.33	.413	±0.13	98.13	77.07	4
	1	39.67	+13.13	1.618	+.326	93.69	10.09	1
	0.1	643.42	+229.73	1.878	+.154	±0	±0	0
	0.01	714.33	+194.79	1.617	+.072		10.12	1
Novi NTZdes	10	13.75	+6.66	.337	+.005	97.81	81.27	4
	1	39.92	+13.49	1.710	+.033	93.65	4.97	0
	0.1	649.86	+152.19	1.506	+.119	<0	16.29	1
	0.01	749.33	+139.49	1.721	+.144	±0	4.36	0

Konc. - pg/ml; parazit - srednje št. preštetih parazitov/polje (analizirano 12 polj);

% Inhib - odstotna inhibicija okužbe s parazitom;

% Toks - odstotna toksičnost zdravila za celice.

Iz zgornjega je razvidno, da je bila inhibitorska učinkovitost NTZdes enaka, kot pri NTZ iz Primera II.

Tako nitazoksanid kot tudi desacetil nitazoksanid sta bila enako učinkovita in vitro proti Cryptosporidium parvum, kadar smo jih testirali v paralelkah z 98 in 94% inhibicijami, dobljenimi z 10 in 1 pg/ml vsake spojine. Za nitazoksanid je bil 1 pg/ml najnižja koncentracija, ki je dala nad 90% inhibicijo, medtem ko smo lahko dosegli 50% inhibicijo z nižjimi koncentracijami nitazoksanida, kot so 0.2, 0.1 in 0.02 pg/ml. Pri istih poskusnih pogojih smo uporabili paromomicin kot pozitivno kontrolo in je bil 2000 krat manj učinkovit; inhibitorske koncentracije pa so bile v območju 51 do 83% pri koncentraciji 2000 pg/ml.

PRIMER IV

E.INTESTINALIS in V.CORNEA

2RK-13 celice (kunčja jetrna celična linija) smo vnesli na gojilne plošče s 24 luknjami pri koncentraciji 2.6 χ 10⁵ celic na luknjo (1.0 mL medij; RPMI 1640 z 2mM L-glutamina in 55 termično dezaktiviranega fetalnega govejega seruma).

Posodice smo inkubirali pri 37 °C v CO2 inkubatorju preko noči, tedaj pa so se luknje zlile (z eno ponovitvijo; ocenili bi 5 x 10 celic na luknjo).

Organizme Septata intestinalis (izvira iz tkivne kulture) smo dodali k celicam gostiteljicam v razmerju 3 : 1 v primerjavi z ocenjenimi celicami gostitelicami ali 15 o

x 10 organizmi na luknjo. (To razmerje je povzročilo okužbo približno 50% celic gostitelja.)

Zdravila smo raztopili v DMSO, vodi ali metanolu (v odvisnosti od topnosti), da smo ustvarili osnovne raztopine z 1.0 mg/mL. Osnovne raztopine smo shranili pri -70 °C. Razredčine, uporabljene pri poskusih, smo napravili v popolnem tkivnem gojilnem mediju. Vse razredčine smo testirali v treh luknjah.

Medij smo nadomeščali vsake tri do štiri dni (vseboval je sveže razredčena zdravila).

6. dne (po dodatku parazitov in zdravil), smo celice preiskali na toksičnost. Kontrolne celice, ki so bile dobile zdravila, parazitov pa ne, smo preiskali na zlitje, celično morfologijo in prisotnost mrtvih ali lebdečih celic. Celice, inkubirane samo s paraziti, smo preiskali za potrditev, da so paraziti nalezljivi (to je prisotnost parazite vsebujočih vakuol). Celice, inkubirane s paraziti in zdravili, smo ovrednotili na toksičnost za celice gostitelja in relativno število parazite vsebujočih vakuol (to je visoko, srednje ali nizko).

10. dne smo v gojilne luknje vnesli 100 μΙ 10% SDS (0.5% končna koncentracija), da smo pretrgali celične membrane gostitelja in povzročili sproščanje mikrosporidij. Celotno število parazitov, prisotnih v vsaki luknji, smo določili s preštetjem alikvota v hemacitometru. Rezultati so izraženi kot odstotna inhibicija (z ozirom na okužene celice, ki niso dobile zdravila).

Rezultati so prikazani na Skicah 1-4.

PRIMER V

TOXOPLASMA GONDII

Nitazoksanid in desacetil nitazoksanid smo testirali proti parazitom, bolj specifično proti RH sevu Toxoplasma gondii, vzdrževanega z zaporednimi pasažami na miših. Celične kulture MRC5 fibroblastov (Bio-Merieux, Francija), gojene v mikroploščah s 96 luknjami, smo inokulirali s T. gondii. 200 sveže pobranih tahizoit smo vnesli v vse gojilne luknje, z izjemo 8 kontrolnih lukenj (negativne kontrole). Po 4 urah inkubacije smo kulturam dodali razredčine zdravila. Nitazoksanid (NTZ) in desacetil nitazoksanid (dNTZ) smo testirali v koncentracijah med 8.10’⁴ in 40 mg/L. Zdravila smo prvotno raztopili v DMSO pri koncentraciji 2 mg/mL, nato pa smo pripravili serijske razredčine v gojilnem mediju. Nismo opazili oborine.

Razredčine zdravila smo dodali kulturi (8 lukenj za vsako razredčino), nato pa smo gojilne plošče inkubirali za 72 ur. Nato smo gojilni material fiksirali z mrzlim metanolom. Določitev rasti T. gondii smo izvedli z ELISA ob uporabi s peroksidazo markiranega kunčjega anti T. gondii protitelesa. Za vsako luknjo smo zabeležili vrednosti za optično gostoto.

Rezultate smo predstavili z narisanjem krivulje OD vrednosti, dobljenih za vsako gojilno luknjo, proti koncentraciji zdravila v kulturi. Statistična analiza je obstajala iz regresijske analize s 95% odstotnim intervalom zanesljivosti in določitvijo krivulj odziva na zdravilo, od OD vrednosti ustvarjenih za vsako zdravilo.

Eno ploščo smo obsevali z Giemsa, da smo preizkusili citopatogeni učinek na kulture.

Realizirali smo tri različne poskuse. Pri vsakem poskusu smo uporabili dve gojilni plošči za vsako spojino; v vsaki plošči smo uporabili 8 ponovitev lukenj za vsako koncentracijo zdravila.

Rezultati:

Podobne rezultate smo dobili za tri serije poskusov. Grafične predstavitve za rezultate po enega reprezentativnega poskusa za vsako zdravilo so prikazane na Skicah 5 a, b, c in 6 a, b, c.

Nitazoksanid (Skice 5 a, b, c);

Nismo opazili inhibitorskega učinka za koncentracije v območju med 10^-4 mg/L in 0.3 mg/L. Signifikanten učinek smo opazili pri koncentracijah >0.6 mg/L, s popolno inhibicijo rasti Toxoplasma pri koncentracijah >2.5 mg/L. Vendar pa smo opazili izrazito toksičnost pri celičnem monosloju za koncentracije >2.5 mg/L. Mikroskopske preiskave monosloja so pokazale, da NTZ pri koncentraciji 1.25 mg/L izzove citopatogen učinek na parazitizirane celice, s povečanjem parazite vsebujoče vakuole in zmanjšanjem števila intraceličnih parazitov. Iz regresijske analize se je dalo oceniti 50% inhibitorsko koncentracijo na 1.2 mg/L.

Desacetil nitazoksanid (Skice 7 a, b, c):

Podobne rezultate smo dobili z desacetil nitazoksanidom: nobenega učinka za koncentracije v območju med 10^-4 mg/L in 0.3 mg/L, inhibicija za koncentracije >0.6 mg/L, in izrazita toksičnost za koncentracijo >2.5 mg/L. 50% inhibitorsko koncentracijo se je dalo oceniti na 1.2 mg/L.

Dobljene rezultate se je dalo ponoviti pri treh ločenih poskusih, z ugotavljanjem inhibitorskega učinka zdravila na ponavljajoče kulture za vsako koncentracijo zdravila.

Tako za NTZ kot tudi za desacetil NTZ je bilo mogoče opaziti izrazito inhibicijo rasti Toxoplasma pri koncentracijah približno 1.2 mg/l, s spremembo parazite vsebujoče vakuole, vendar brez izrazite spremembe samega parazita.

Ti rezultati označujejo, da imajo ta zdravila dobro učinkovitost proti T. gondii, in da je mogoče pričakovati terapevtski učinek in vivo na osnovi dobljenih koncentracij približno 1 mg/L v serumu ali tkivih.

PRIMER VI

MYCOBACTERIA

Ugotovili smo, da ima nitazoksanid antimikrobno učinkovitost proti TB organizmom. Naslednja Tabela kaže poskus za MIC nitazoksanida in tizoksanida proti Mycobacterium intracellular z agarsko razredčilno tehniko. Ti rezultati so na osnovi številnih poskusov, od katerih je vsak trajal okoli 3 tedne za agarsko razredčilno metodo z Middlebrook agarjem. Dobljeni podatki označujejo, da ima nitazoksanid MIC proti Mycobacteria 2 pg/ml, tizoksanid pa ima MIC 4 pg/ml, pri uporabi standardnega seva Mycobacterium intracellular iz ATCC, z uporabo standardnega agarskega razredčilnega testa.

MIC za nitazoksanid in tizoksanid pri Mycobacteria intracellulare

MIC

Nitazoksanid 2 pg/ml

Tizoksanid 4 pg/ml *MIC smo določili s standardnim agarskim razredčenjem ob uporabi Middlebrook 7H11 agarja v teku 3 tednov.

Za ta poskus smo uporabili standarden sev M.intracellular ATTC 13950.

Skica 7 je diagram na osnovi testiranja učinkovitosti nitazoksanida proti mikobakterijam, ki rastejo v tekoči gojilni juhi. Uporabili smo MTS kolorimetrični test, ki dopušča določitev rasti v 4 urah namesto v 3 tednih, kot traja metoda s štetjem in uporabo agarja. Kot je razvidno iz podatkov na Skici 7, je pri dodatku nitazoksanida 72. uro po pričetku gojenja, takojšen učinek na kontinuirno rast v primerjavi z rastjo v kontrolnem mediju samem. 3 pg/ml doza nitazoksanida ustavi rast za naslednjih 24 ur in nato je počasna rast v naslednjih 2 dneh. 50 pg/ml doza je bila popolnoma bakteriostatična vseh 144 ur gojenja.

PRIMER VII

CRYPTOSPORIDIUM PARVUM

Učinek nitazoksanida smo testirali proti Cryptosporidium parvum pri poskusno okuženih miših. Nitazoksanid je dobavil Romark Laboratories, L.C. iz Tampe, Florida.

Celotno humano dozo (1 g/dan v teku 7 dni, torej 7 gramov) smo modificirali za uporabo na miših, po navodilih Pageta in Barnesa. Humano dozo smo pomnožili z 0.0026 za posamezno miš (z maso približno 20 gramov), da smo dobili celotno množino zdravila, potrebnega za vsakega gostitelja, zjutraj in zvečer, 7 dni zapored. Vsaka miš je dobila 2.6 mg/dan (7000 mg x 0.0026/7). Doze smo aplicirali oralno s pomočjo plastične brizgalke, opremljene z iglo z zaokroženo konico.

Dvajset (20) 2 dni stare miške smo okužili z oralnim dajanjem 100,000 oocist Cryptosporidium parvum, dobljenih iz okuženih telet. Pred aplikacijo mišim smo oociste koncentrirali z uporabo sladkorne raztopine, po tehniki, ki sta jo opisala

Fayer & Ellis. Od vsake miši smo dnevno jemali rektalne brise in jih preiskovali z uporabo modificirane Niehl-Neelsen obarvalne tehnike, ki so jo opisali Grazyk et al. Dva (2) dni po oralni okužbi živali so se v blatu pojavile izločene oociste. Na 3.dan po okužbi živali je 10 miši dobilo 1.3 mg nitazoksanida, zjutraj in zvečer, v teku 7 dni zapored, medtem ko smo 10 preostalih miši vzdrževali kot neobdelane kontrole. Rektalne brise smo jemali dnevno za vsakega izmed 7 dni obdelave in za vsakega izmed 7 dni po končani obdelavi. Oociste smo suspendirali v olju in prešteli pod mikroskopom v 100 poljih.

Rezultati:

Rezultati, prikazani v naslednji Tabeli, jasno označujejo, da je bil nitazoksanid, ki smo ga dajali v dnevni dozi 2.6 mg/dan 7 dni zapored, učinkovit proti Cr/ptosporidium parvum za zmanjšanje števila oocist v blatu okuženih miši, v primerjavi s kontrolnimi živalmi. Testno zdravilo je zmanjšalo izločanje oocist pri 6 izmed 10 obdelanih miši na koncu tretjega dne obdelave. Na koncu obdelave 7.dne je bilo popolno zmanjšanje izločanja oocist, vse obdelane živali so imele negativne izvide pri preiskavi blata, v primerjavi z neobdelanimi kontrolnimi mišmi. Ta učinek se je ohranil vsaj 7 dni po obdelavi, kar kažejo negativni rezultati preiskav, opazovani na 3. in 7. dan po končani obdelavi.

	ŠT. (	OOCIST, UGOTOVLJENIH V POLJU,	POTOPLJENEM V OLJE
3. dan obdelave	zadnji dan obdelave 3.	dan po obdelavi	7. dan po obdelavi
Miši	Kontrol.	Obdelana	Kontrol. Obdelana	Kontrol.	Obdelana	Kontrol.	Obdelana
št.	skupina	skupina	Skupina skupina	Skupina	skupina	Skupina	skupina
1	3.0	0.0	5.0 0.0	4.0	0.0	2.0	0.0
2	4.0	0,0	4.0 0.0	3.0	0.0	1.0	0.0
3	6.0	0.0	5.0 0.0	4.0	0.0	0.5	0.0
4	3.0	2.0	3.0 0.0	2.0	0.0	1.0	0.0
5	5.0	2.0	3.0 0.0	3.0	0.0	0.5	0.0
6	3.0	0.0	4.0 0.0	5.0	0.0	2.0	0.0
7	3.0	0.0	5.0 0.0	4.0	0.0	1.0	0.0

8	5.0	1.0	5.0	0.0	1.0	0.0	0.5	0.0
9	3.0	3.0	3.0	0.0	2.0	0.0	1.0	0.0
10		0.0	5.0	0.0	2.0	0.0	0.5	0.0
Vse	35	8.0	4.2	0.0	30	0.0	10	0.0
Sre= dnje	3.5	0.8	4.2	0.0	3.0	0.0	1.0	0.0
Učin kovi tost		60%		100%		100%		100%

PRIMER VIII

MYCOBACTERIUM

Nitazoksanid smo primerjali z izoniazidnim antibiotikom. Pri protokolu je bil uporabljen BCG (Bacille de Calmette et Guerin) kot mikobakterijski sev. Občutljivost tega seva je enaka, kot pri M. tuberculosis, vendar je ta sev manj nevaren, zato ni terjal visokih vsebnosti sredstva proti tuberkulozi.

Mišim smo aplicirali 4 mg/miš dnevno v 0.2 mL sončničnega olja. Pri miših, ki so dobile nitazoksanid, so bili rezultati primerljivi s skupino, ki je dobila izoniazid.

Tabela prikazuje CFU za Mycobacterium tuberculosis na vranici, jetrih in pljučih 4 misši, inokuliranih z 10⁷ CFU in 4 miši inokuliranih z 10⁵ CFU po obdelavi z nitazoksanidom, izotiazidom (aktivna kontrola) in PBS. Miši smo obdelali v dneh 14 -19 po inokulaciji ter prešteli bakterijske CFU v tkivih na dan 23 po inokulaciji. (CFU pomeni Colony Forming Units).

	107 CFU	105 ČFU
	Vranica	Jetra	Pljuča	Vranica	Jetra	Pljuča
Nitazo	1 575 000	1 575 000	57 500	68 250	70 000	50
	800 000	1 550 000	122 500	65 000	87 500	75
	875 000	1 550 000	30 000	75 000	35 000	150
	950 000	750 000	75 000	60 000	60 000	50
INH	475 000	1 050 000	11 000	20 000	21 250	50
	255 000	750 000	5 750	15 250	27 500	125
	200 000	975 000	4 000	60 000	52 500	50
				20 000	37 500	50
PBS	1 500 000	2125 000	92 500	102 500	195 000	750
	1 525 000	1 800 000	98 000	140 000	175 000	800
	1 925 000	1 750 000	177 500	98 000	150 000	500
|	| 1 675 000	1 800 000	117 500	105 000	150 000	750

PRIMER IX

FASCIOLA HEPATICA

In vitro učinkovitost nitazoksanida in desacetil nitazoksanida smo testirali proti Fasciola hepatica.

Razvite (adulte) F.hepatica smo pridobili iz žolčevodov treh telet, žrtvovanih zaradi fascioloze na Louisiana Veterinary Medical Diagnostic Laboratory v Hardy’s Meat Packers, Bunkie, LA. Metljaje smo izpirali v sterilni slanici 1 uro in prenesli v sterilno slanico ali RPMI (pH 7.4) za nadaljnje 3 ure. Metljaje smo nato vzdrževali v sterilnem RPMI-kunčjem serumu (50:50 v/v) ali sterilnem RPMI (pH 7.4) čez noč pri 37 °C s 5% CO2.

In vitro kulturo (37 °C, 5% CO2) smo napravili po modifikaciji metode Ibarra in Jenkinsa (Z. Parasitenkd. 70:655-661, 1984). Z uporabo sterilne tehnike smo metljaje dvakrat izprali v teku 2-3 minut v Hankovi uravnoteženi solni raztopini (pH 7.2) in položili posamič v luknje Linbro gojilnih plošč s šestimi luknjami, ki so vsebovale 10 mL alikvote navedenih razredčin zdravila v gojilnem mediju. Slednji je obstajal iz sterilnega 50:50 v/v RPMI-kunčjega seruma, z 2% kunčje krvi plus 100 ppm penicilina in 100 ppm streptomicina. Uporabili smo samo metljaje z normalno aktivnostjo in morfologijo.

Osnovne raztopine NTZ ali njegovega metabolita D-NTZ dobavitelja Romark, smo raztopili v DMSO (2000 μg/mL) in razredčili v gojilnem mediju, ob uporabi 100 mL volumetričnih bučk, da smo dobili specifične koncentracije zdravila (100, 50, 25, 10, 5, 3, 1 pg/mL). Dva kontrolna metljaja smo vključili v vsako ponovitev, enega v gojilni medij z RBC brez dodatka, drugega pa v gojilni medij z RBC brez zdravila. Metljaje smo preiskali na učinke obdelave z zdravilom, razvidne iz smrtnosti, motnje v gibanju, ali morfoloških sprememb, v primerjavi z neobdelanimi kontrolnimi metljaji, z uporabo panoja z osvetlitvijo v ozadju in osvetljenih leč s trikratno povečavo.

Rezultati:

Poskusi: Pri D-NTZ so bili metljaji pri obdelavi s 50 in 100 pg umirajoči ali mrtvi v teku ene ure. Štirje od 7 metljajev pri obdelavi s 25 pg so bili umirajoči, dva sta bila aktivna, eden pa je bil oslabljen v teku prve ure; v teku treh ur so bili vsi mrtvi razen dveh oslabljenih metljajev, po štirih urah pa je preživel samo še en oslabljen metljaj. Pri 10 pg smo opazili zmanjšano aktivnost po 1, 3 in 4 urah, vsi pa so bili umirajoči ali mrtvi po 7 urah. Zmanjšano aktivnost nekaterih osebkov smo videli po 24 urah pri 5 pg in 3 pg skupinah z nekoliko počasnejšim pričetkom pri 3 pg; vsi so bili mrtvi pri luknjah z obdelavo s 3 in 5 pg po 50 urah, razen enega oslabljenega metljaja v vsaki skupini. Nekoliko upočasnjeno aktivnost smo opazili pri 1 pg skupini po 42-74 urah in samo 3 aktivni in en umirajoč metljaj so preživeli po 91 urah; po 115 urah je ostal en sam oslabljen metljaj v 1 pg skupini. Mortaliteto pri kontroli z RBC skupino smo opazili po 66 urah (en metljaj), 91 urah (en metljaj) in 115 urah (štirje metljaji). Pri kontroli brez RBC skupine so bili vsi živi po 91 urah in en sam je bil mrtev po 115 urah.

Poskus 2: Za NTZ smo opazili nekoliko večjo učinkovitost iz zgodnejših pojavov vpliva na motiliteto in mortaliteto pri 8 ponovitvah, v primerjavi z rezultati za DNTZ. Pri skupinah s po 100, 50 in 25 pg so bili vsi metljaji mrtvi ali umirajoči, razen enega metljaja po 1 uri pri 25 pg skupini, ki je bil mrtev po 3 urah. Zmanjšanje motilitete v odvisnosti od doze smo videli za vsako izmed drugih skupin, ki so dobivale zdravilo, od prve ure dalje. Pri 10 pg je en sam metljaj preživel 16 ur. Pri 5 pg skupini so bili samo 3 metljaji aktivni po 6 urah in noben ni bil več aktiven po 16 urah. Po 23 urah sta preživela samo dva oslabljena metljaja v 3 pg skupini; po 41 urah sta bila mrtva. Pri 1 pg skupini je en metljaj mrtev po 16 urah, trije po 41 urah in pet po 74 urah; trije metljaji so ostali aktivni po 91 urah in en metljaj je bil aktiven po 115 urah. Pri kontroli z RBC skupino je bilo sedem od osem metljajev živih po 74 urah, trije so bili živi po 91 urah in dva sta preživela 115 ur. Pri kontroli brez RBC skupine je bilo šest od osem metljajev aktivnih po 74 urah, štirje so bili aktivni po 91 urah in dva sta ostala aktivna po 115 urah.

Pri skupinah z visokimi dozami (25, 50, 100 pg) je bila umrljivost metljajev hitra in povezana s kontrakcijami in trebušnim »zvitjem«. Pri nižjih koncentracijah zdravila se je pri večini metljajev gibanje upočasnilo, bili so bolj sproščeni in »sploščeni« med umiranjem ali po smrti. Kontaminacija je postala omejevalna pri poskusnih rezultatih pri nekaterih ponovitvah, s pričetkom po 91 urah. Pri poskusu z D-NTZ se je pojavilo glavno bakterijsko ali glivično preraščanje in s tem povezana mortaliteta metljajev pri ploščah z dvema ponovitvama po 115 urah. Za NTZ poskus sta se preraščanje in mortaliteta metljajev pojavila v celotnih ploščah po 91 urah (dve ponovitvi) in 115 urah (5 ponovitev). Po 139 urah pa opazovanj nismo mogli več upoštevati, saj so bile pretežno vse plošče v glavnem kontaminirane.

Zaključki:

Poskusi z obema testiranima zdraviloma nakazujejo močno anti-metljajsko učinkovitost nitazoksanida. Nekoliko večjo anti-metljajsko učinkovitost proti F. hepatica smo opazili za nitazoksanid kot pa za desacetil-nitazoksanid, glavni metabolit, za katerega mislimo, da je učinkovit na jetrnem nivoju.

Hitra umrljivost metljajev se pojavi po 1 uri pri in vitro množinah zdravila D-NTZ >50 gg, po 4 urah pri 25 gg in po 6-7 urah pri 10 gg. Deset gg je lahko primerna enkratna doza za aplikacijo ciljnega zdravila, če farmakokinetični podatki kažejo, da ostajajo nivoji v tkivih >6-9 ur po posamezni obdelavi.

Močno anti-metljajsko aktivnost po 74 urah (treh dneh) smo opazili za obe spojini pri dozah 3 in 5 gg. Dolgotrajno preživetje, ki se je približevalo, vendar ni bilo enako kontrolnim metljajem, ki niso prejeli zdravila, smo opazili pri dozirnem nivoju 1 gg; na tem nivoju ima zato aplikacija zdravila metljajem lahko nezadostne terapevtske učinke na parazite.

PRIMER X

FASCIOLA GIGANTICA

Nitazoksanid smo testirali proti nerazvitim in razvitim (adultim) Fasciola gigantica na poskusno okuženih kuncih.

Metacerkarije Fasciola gigantica v obliki cist (EMC) smo zbrali na celofanski poli 28-35 dni po okužbi L. calludi polžev z miracidijem Fasciola gigantica ob uporabi tehnike, ki jo je opisal Abdel-Ghany, kjer so bili polži izpostavljeni vsak dan umetni svetlobi, v teku 30 minut, v čisti dekiorirani vodovodni vodi. Nastale metacerkarije v cistah (MEC) smo shranili pri 4 °C v hladilniku za 5 do 8 dni pod vodno površino, dokler jih nismo uporabili za okužbo poskusnih živali.

Štirideset (40) Boscat kuncev z maso po 1.5 do 2 kg, smo vključili v študijo in jih razdelili na dve obdelovani skupini po 20 živali.

Živali iz Skupine 1 smo oralno okužili s 35-40 metacerkarijami v cistah, ki smo jih bili ovili v solatne liste in jih potisnili živalim na koren jezika. Živalim smo zatiskali usta z roko, dokler niso pogoltnile metacerkarij v cistah. Te živali iz Skupine 1 smo uporabili za testiranje učinkovitosti nitazoksanida proti nerazvitim stopnjam (4-5 tednov starih) Fasciola gigantica.

Živali iz Skupine 2 smo oralno okužili tako, kot smo zgoraj navedli, z 10-15 metacerkarij v cistah in jih uporabili za testiranje učinkovitosti nitazoksanida proti zgodnje razvitim (adultim) metljajem (starim >10 tednov).

Deset živali iz Skupine 1 je dobilo 35 mg nitazoksanida, zjutraj in zvečer, v teku 7 dni zapored 4 tedne po njihovi okužbi pri nerazviti stopnji njihovega parazitskega cikla. Deset preostalih živali v Skupini 1 smo vzdrževali kot neobdelane kontrole. Deset živali iz Skupine 2 je prejelo 35 mg nitazoksanida, zjutraj in zvečer, v teku 7 dni zapored 10 tednov po njihovi okužbi pri razviti (adulti) stopnji njihovega parazitskega cikla. Deset preostalih živali v Skupini 2 smo vzdrževali kot neobdelane kontrole.

Vse živali smo krmili s suhim obrokom do konca poskusa.

Sedem dni po dajanju zadnje doze nitazoksanida smo žrtvovali vse kunce iz obeh skupin. Površino jeter smo preiskali na prisotnost nekrotičnih migracijskih brazd, zlasti v nerazviti stopnji parazitskega cikla. Ta nekrotična področja smo preiskali z uporabo dveh kirurških igel, da smo izvlekli juvenilne migracijske metljaje po tehniki, ki jo je opisal El-Bahy. Jetra smo narezali na majhne koščke, zlasti okoli migracijskih brazd, ter macerirali pod mikroskopom, da smo iz njih pridobili prisotne metljaje. Trebušno votlino in visceralno površino smo izprali s toplo vodo. To vodo smo nato zbrali, filtrirali in preiskali za identifikacijo juvenilnih metljajev. Vse zbrane parazite kot tudi njihove dele, smo prešteli tako na obdelanih kot tudi neobdelanih živalih v obeh Skupinah 1 in 2. Živi metljaji so se pojavili v rožnati barvi, prosojni, in z nedotaknjenimi tegmenti, ki se jih je dalo zlahka potegniti iz jetrnega tkiva z uporabo tople vode, medtem ko so bili mrtvi metljaji sivkaste barve, niso bili fiksirani in so kazali razpokano, nekrotično površino. Učinkovitost nitazoksanida smo izračunali z uporabo spodaj navedene formule:

% učinkovitosti a - b x100 a

kjer pomenita:

a = število metljajev, pridobljenih iz blata kontrolnih živali b = število metljajev, pridobljenih iz blata obdelanih živali.

Rezultati

Rezultati študije, kot je navedeno v Tabeli 7, kažejo izrazito zmanjšanje števila nerazvitih metljajev, pridobljenih iz jeter kuncev v obdelani skupini, v primerjavi s kontrolno skupino. Srednji odstotki zmanjšanja so izračunani kot 46.77% (območje: 40-60%).

Tabela 7: Učinkovitost nitazoksanida proti nerazvitim (4 tedne starim) F.gigantica pri poskusno okuženih kuncih

Št. metljajev odvzetih iz jeter:
Kunca št	Neobdelane kontrole	Obdelanih kuncev	Učinkovitost %
1	7	4	42%
2	7	4	42%
3	6	3	50%
4	8	4	50%
5	5	3	40%
6	5	2	60%
7	6	3	40%
8	8	3	50%
9	5	4	50%
10	6.2	3	40%
Srednji		3.3	46.77%

Pri zgodnji stopnji zrelosti infekcije je nitazoksanid pokazal popolen učinek (100% zmanjšanje) in ni bilo videti glist po pregledu jeter obdelanih kuncev, v primerjavi z neobdelanimi živalmi, kot je prikazano v Tabeli 8.

Tabela 8: Učinkovitost nitazoksanida proti zgodnje razvitim (10 tednov starim) F.gigantica pri poskusno okuženih kuncih

Št. metijajev odvzetih iz jeter:
Kunca št	Neobdelane kontrole	Obdelanih kuncev	Učinkovitost %
1	4	0.0	100%
2	4	0.0	100%
3	3	0.0	100%
4	3	0.0	100%
5	2	0.0	100%
6	2	0.0	100%
7	2	0.0	100%
8	3	0.0	100%
9	3	0.0	100%
10	3	0.0	100%
Srednji	2.9	0.0	100%

Nitazoksanid je pri dajanju doze po 70 mg/dan 7 dni zapored zmerno učinkovit proti nerazvitemu stadiju Fasciola gigantica in popolnoma učinkovit proti zgodnji razviti stopnji parazita.

PRIMER XIII

SCHISTOSOMA

Nitaksozanid smo testirali proti Schistosoma mansoni in Schistosoma hematobium na poskusno okuženih miših.

Štirideset (40) belih miši, z maso po 30 do 50 gramov, smo razdelili na dve obdelovani skupini po 20 živali na skupino. Prvo skupino smo okužili s 300-500 aktivnimi cerkarijami brez Schistosoma mansoni, suspendiranih v 0.25 mL destilirane vode in jih aplicirali vsaki miši z intraperitonealno injekcijo. Prvo skupino smo okužili na enak način, vendar z uporabo cerkarij s Schistosoma mansoni. Obe skupini smo nato pustili skupno 70 dni v laboratoriju.

Sedemdeset dni po okužbi živali smo deset miši od vsake skupine obdelali z nitazoksanidom, v obliki 1.3 mg oralne doze, aplicirane zjutraj in zvečer 7 dni zapored. Sedem dni po končani obdelavi smo vse miši žrtvovali in iz jeter vsake živali odvzeli gliste s perfuzijo z mlačno vodo (37 °C). Odvzete shistosome smo prešteli pri vseh obdelanih in kontrolnih živalih. Učinkovitost nitazoksanida smo izračunali z uporabo spodaj navedene formule:

% učinkovitost a - b x100 a

kjer sta:

a= število shistosom, odvzetih iz blata kontrolnih živali.

b = število shistosom, odvzetih iz blata obdelanih živali.

Rezultati

Rezultati, prikazani v Tabelah 9 in 10, jasno kažejo, da je bil nitazoksanid, apliciran v dnevni dozi 2.6 mg/dan 7 dni zapored, učinkovitejši proti Schistosoma hematobium, kjer smo opazili zmanjšanje števila glist za 82.85%, v primerjavi s kontrolnimi živalmi, medtem ko je pri Schistosoma mansoni znašalo zmanjšanje števila glist samo 59.91% v primerjavi s kontrolnimi mišmi. Ti rezultati se ujemajo s poročilom Abaza et al. za paciente, kjer nitazoksanid ni bil učinkovit proti S. mansoni, kar kažejo pozitivni rezultati pri štetju jajčec po obdelavi z nitazoksanidom.

Tabela 9: Učinkovitost nitazoksanida proti razvitim (13 tednov starim) Schistosoma mansoni pri miših

Št. metljajev odvzetih iz jeter:
Miši št.	Neobdelane kontrole	Obdelanih miši
1	21	10
2	29	9
3	32	10
4	26	11
5	24	13
6	19	10
7	20	9
8	24	12
9	22	8
10	30	7
Vse	247	99
Srednje/Miš	24.7	9.9
Učinkovitost		59.91

Tabela 10: Učinkovitost nitazoksanida proti razvitim (13 tednov starim) Schistosoma hematobium pri miših

Št. metijajev odvzetih iz jeter:
Miši št.	Neobdelane kontrole	Obdelanih miši
1	18	3
2	16	3
3	14	2
4	19	2
5	12	4
6	10	4
7	13	2
8	12	2
9	17	0.0

10	9	2
Vse	140	24
Srednje/Miš	14	2.4
Učinkovitost		82.85

r?

Claims (44)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Farmacevtski sestavek za oralno dajanje, značilen po tem, da vsebuje kot učinkovino najmanj eno spojino, izbrano iz skupine, ki obstaja iz:

   spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II) (II).
2. 2. Sestavek po zahtevku 1, značilen po tem, da je navedena spojina v obliki delcev učinkovine z velikostjo delcev pod 200 pm in srednjo velikostjo delcev nad 10 pm.
3. 3. Sestavek po zahtevku 2, značilen po tem, da je srednja velikost navedenih delcev učinkovine med 10 in 100 pm.
4. 4. Sestavek po zahtevku 2, značilen po tem, da je srednja velikost navedenih delcev učinkovine med 20 in 50 pm.
5. 5. Sestavek po zahtevku 2, značilen po tem, da ima pod 10 mas.% navedenih delcev učinkovine velikost delcev nad 100 pm.
6. 6. Sestavek po zahtevku 2, značilen po tem, da ima vsaj 50 mas.% navedenih delcev učinkovine velikost delcev pod 50 pm.
7. 7. Sestavek po zahtevku 2, značilen po tem, da ima pod 10 mas.% navedenih delcev učinkovine velikost delcev pod 5 pm.
8. 8. Sestavek po zahtevku 2, značilen po tem, da obsega navedeni sestavek zmes delcev učinkovine s formulo (I) in s formulo (II), pri čemer je masna vsebnost spojine s formulo (I) z ozirom na maso spojin s formulo (I) in s formulo (II) navedene zmesi v območju 0.5 do 20%.
9. 9. Sestavek po zahtevku 1, značilen po tem, da obsega navedeni sestavek nadalje vsaj še eno farmacevtsko sprejemljivo kislino.
10. 10. Sestavek po zahtevku 9, značilen po tem, da je navedena farmacevtsko sprejemljiva kislina izbrana iz skupine, ki obsega citronsko, glutaminsko, jantarno, etansulfonsko, ocetno, vinsko, askorbinsko, metansulfonsko, fumarno, adipinsko, jabolčno kislino ter njihove zmesi.
11. 11. Sestavek po zahtevku 9, značilen po tem, da je navedena učinkovina v obliki trdnih delcev z velikostjo delcev pod 200 pm in srednjo velikost delcev nad 10 pm, in da je razmerje med maso farmacevtsko sprejemljive kisline/maso navedenih trdnih delcev med 0.01 in 0.5.
12. 12. Sestavek po zahtevku 11, značilen po tem, da je razmerje med maso farmacevtsko sprejemljive kisline/maso navedenih trdnih delcev učinkovine med 0.03 in 0.2.
13. 13. Uporaba farmacevtskega sestavka, ki vsebuje kot učinkovino najmanj eno spojino, izbrano iz skupine, ki obstaja iz spojine s formulo (I)

    OH (I) in spojine s formulo (II)

    O -CO - CH (II) za pripravo zdravila za zdravljenje imunsko prizadetega sesalca okuženega z mikroorganizmom, izbranim iz skupine, ki obstaja iz Cryptosporidium parvum, Isospora belil, Enterocytzoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinil in Toxoplasma gondii.
14. 14. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 13, značilna po tem, da je navedena učinkovina v obliki delcev s srednjo velikostjo delcev med 10 in 200 pm.
15. 15. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 13, značilna po tem, da navedena učinkovina v obliki delcev s srednjo velikostjo delcev med 20 in 50 pm.
16. 16. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 13, značilna po tem, da obsega navedeni farmacevtski sestavek nadalje vsaj še eno farmacevtsko sprejemljivo kislino.
17. 17. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 16, značilna po tem, da je navedena farmacevtsko sprejemljiva kislina izbrana iz skupine, ki obsega citronsko, glutaminsko, jantarno, etansulfonsko, ocetno, vinsko, askorbinsko, metansulfonsko, fumarno, adipinsko, jabolčno kislino ter njihove zmesi.
18. 18. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 13 navedena učinkovina spojina s formulo (I).
19. 19. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 13 navedena učinkovina spojina s formulo (II).

    značilna po tem da je značilna po tem da je
20. 20. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 13, značilna po tem, da je navedeni sesalec človek in je navedena učinkovina aplicirana v množini od 500 do 2000 mg dnevno.
21. 21. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 20, značilna po tem, da je navedena učinkovina aplicirana v množini od 1000 do 1500 mg dnevno.
22. 22. Uporaba farmacevtskega sestavka, ki vsebuje kot učinkovino najmanj eno spojino, izbrano iz skupine, ki obstaja iz spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II)

    NH—CO

    O - CO - CH v 3 (in za pripravo zdravila za zdravljenje parazitske okužbe s trematodo, izbrano iz skupine, ki obstaja iz Schistosoma, Fasciola, Fasciolopsis, Dicrocoelium, Heterophyes in Metagonimus.
23. 23. Uporaba farmacevtskega sestavka, ki vsebuje kot učinkovino najmanj eno spojino, izbrano iz skupine, ki obstaja iz spojine s formulo (I) (I) in spojine s formulo (II) za pripravo zdravila za zdravljenje parazitske okužbe s trematodo, izbrano iz skupine, ki obstaja iz Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma mekongi, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum; Fasciola hepatica, Fasciola gigantica, Fasciolopsis biski, Dicrocoelium dendriticum, Heterophyes heterophyes in Metagonimus yokogawa.
24. 24. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 23, značilna po tem, da je navedena učinkovina v obliki delcev s srednjo velikostjo delcev med 10 in 200 pm.
25. 25. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 24, značilna po tem, da je navedena učinkovina v obliki delcev s srednjo velikostjo delcev med 20 in 50 pm.
26. 26. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 23, značilna po tem, da obsega navedeni farmacevtski sestavek nadalje vsaj še eno farmacevtsko sprejemljivo kislino.
27. 27. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 26, značilna po tem, da je navedena farmacevtsko sprejemljiva kislina izbrana iz skupine, ki obsega citronsko, glutaminsko, jantarno, etansulfonsko, ocetno, vinsko, askorbinsko, metansulfonsko, fumarno, adipinsko, jabolčno kislino ter njihove zmesi.
28. 28. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 26, značilna po tem, da je razmerje med maso farmacevtsko sprejemljive kisline/maso navedenih delcev učinkovine med 0.01 in 0.5.
29. 29. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 23, značilna po tem, da je navedena učinkovina spojina s formulo (I).
30. 30. Uporaba farmacevtskega sestavka po zahtevku 23, značilna po tem, da je navedena učinkovina spojina s formulo (II).
31. 31. Farmacevtska pasta za zunanjo aplikacijo, značilna po tem, da navedena pasta obsega:

    kot učinkovino trdne delce vsaj ene spojine, izbrane iz skupine, ki obstaja iz: spojine s formulo (I) in spojine s formulo (II)

    Ο - CO - CH

    NO (II) pri čemer imajo navedeni delci velikost pod 200 gm in srednjo velikost delcev nad 10 gm ;

    najmanj eno zgoščevalo;

    najmanj eno omakalo; in najmanj eno farmacevtsko sprejemljivo kislino, pri čemer je pH paste med 2 in 6.
32. 32. Farmacevtska pasta po zahtevku 31, značilna po tem, da navedena pasta nadalje obsega najmanj en dodatek iz skupine, ki obstaja iz cetil alkohola, giiceridnih derivatov, propilen glikola in njihovih zmesi.
33. 33. Farmacevtski sestavek za oralno aplikacijo, značilen po tem, da vsebuje učinkovino, granulirano v prisotnosti granulimega sredstva, v katerem:

    je učinkovina v obliki trdnih delcev vsaj ene spojine, izbrane iz skupine, ki obstaja iz:

    spojine s formulo (I)

    OH

    NO (I) spojine s formulo (II) in kjer imajo navedeni delci učinkovine velikost pod 200 μιτι in srednjo velikost delcev nad 10 μιτι.
34. 34. Sestavek po zahtevku 33, značilen po tem, da je navedeno granulirno sredstvo izbrano iz skupine, ki obstaja iz polivinilpirolidona, vode, alkohola, saharoze, hidroksil celuloze, in njihovih zmesi.
35. 35. Sestavek po zahtevku 33, značilen po tem, da obsegajo navedeni granulirani delci trdne učinkovine vsaj še eno farmacevtsko sprejemljivo kislino.
36. 36. Sestavek po zahtevku 35, značilen po tem, da je navedena farmacevtsko sprejemljiva kislina izbrana iz skupine, ki obsega citronsko, glutaminsko, jantarno, etansulfonsko, ocetno, vinsko, askorbinsko, metansulfonsko, fumarno, adipinsko, jabolčno kislino ter njihove zmesi.
37. 37. Sestavek po zahtevku 35, značilen po tem, da je razmerje med maso farmacevtsko sprejemljive kisline/maso navedene učinkovine med 0.01 in 0.5.
38. 38. Farmacevtski sestavek za oralno aplikacijo, značilen po tem, da vsebuje učinkovino, omakalo in škrobni derivat, v katerem:

    je navedena učinkovina v obliki trdnih delcev vsaj ene spojine, izbrane iz skupine, ki obstaja iz: spojine s formulo (I) spojine s formulo (II) in kjer imajo navedeni delci učinkovine velikost pod 200 pm in srednjo velikost delcev nad 10 pm.
39. 39. Farmacevtski sestavek po zahtevku 38, značilen po tem, da nadalje obsega vsaj še eno farmacevtsko sprejemljivo kislino.
40. 40. Farmacevtski sestavek po zahtevku 38, značilen po tem, da so navedeni delci učinkovine granulirani v prisotnosti granulirnega sredstva, ki vsebuje od 2 do 99.97 mas.% navedene učinkovine in od 0.03 do 10 mas.% granulirnega sredstva.
41. 41. Farmacevtski sestavek po zahtevku 40, značilen po tem, da je navedeno granulirno sredstvo izbrano iz skupine, ki obstaja iz polivinilpirolidona, vode, alkohola, saharoze, hidroksil celuloze, in njihovih zmesi.
42. 42. Tekoča suspenzija za oralno aplikacijo, značilna po tem, da vsebuje;

    • kot učinkovino trdne delce vsaj ene spojine, izbrane iz skupine, ki obstaja iz:

    spojine s formulo (I)

    OH

    NO (I) spojine s formulo (II) o - co - CH

    NO

    CII) in kjer imajo navedeni delci velikost pod 200 pm in srednjo velikost delcev nad 10 pm; in • najmanj ene farmacevtsko sprejemljive kisline, pri čemer je pH suspenzije med 2 in 6.
43. 43. Suspenzija po zahtevku 42, značilna po tem, da je pH suspenzije med 3 in 5.
44. 44. Suspenzija po zahtevku 42, značilna po tem, da nadalje obsega granulirno sredstvo.