ME00530B - Farmaceutske kompozicije tizoksanida i nitazoksanida - Google Patents

Abstract

Farmaceutska kompozicija koja kao aktivno sredstvo sadrži najmanje jedno jedinjenje koje je odabrano od grupa koje sadrže formule (I) ili (II). Aktivno sredstvo je po mogućstvu u obliku čestica koje imaju veličinu manju od 200 μm i srednju vrednost veličine čestice veću od 10 μm. Farmaceutske kompozicije su naročito korisne u lečenju oportunističkih infekcija kod osoba sa komprimovanim ili supresivnim imunim sistemima, i u u lečenju infekcija trematoda.

Description

Oblast pronalaska

Dati pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže kao aktivno sredstvo barem jedno jedinjenje koje je izabrano od grupa koje se sastoje od formule (I)

i formule (II)

i koji dalje obuhvata barem jednu farmaceutski prihvatljivu kiselinu.

Aktivno sredstvo je po mogućstvu u obliku čestica koje imaju veličinu manju od 200 µm, gde je srednja veličina čestice veća od 10 µm. Pronalazak se posebno odnosi i na farmaceutske kompozicije koje su stabilizovane sa barem jednom farmaceutski prihvatljivom kiselinom. Farmaceutske kompozicije su naročito korisne u lečenju oportunističkih infekcija (koje su prouzrokovane od strane nekog mikroorganizma) koje nastaju kod osoba sa ugroženim ili supresivnim imunim sistemima, i u lečenju infekcija izazvanih trematodama (pljosnatim glistama) .

Opis stanja tehnike

Postoji hitna potreba za razvojem postupaka lečenja brojnih parazitskih i bakterijskih infekcija kod ljudi sa ugroženim imunim

sistemima (AIDS, oboleli od raka, stariji ljudi, pacijenti kojima su transplantirani organi i koji su na lekovima koji utiču na slabljenje imunog sistema). Druga oblast od značaja predstavljaju infekcije izazvane trematodama, naročito u tropskim klimatskim uslovima. Tako postoji potreba za farmaceutskom kompozicijom koju mogu da podnesu čak i ljudi sa oslabljenim imunim sistemom, i čije je čuvanje stabilno čak i u uslovima tropske klime. Još odredjenije, Toxoplasma gondii je protozoa i ona je medju najmoćnijim uzročnicima latentnih infekcija centralnog nervnog sistema po celom svetu. Mnogi zdravi ljudi su zaraženi sa parazitima,., ali obično imuni sistem drži organizam pod kontrolom.T. gondii je najobičniji patogen (prouzrokovan od strane drugog mikroorganizma) i u mozgu pacijenata koji boluju od AIDS-a. Sada toksoplazmoza postaje sve veći problem ne samo zbog AIDS-a, već i zbog širokog spektra korišćenja imunosupresivnih lekova (na primer, kod davanja pacijentima sa presadjenim organima). Toksoplazmoza se obično Ieči u kombinaciji pirimetaminom i sulfadiazinom. Dok su lekovi efikasni, oni ne ubijaju ciste parazita, tako da lečenje mora biti nastavljeno da bi se održala efikasnost doze. Toksičnost često ubrzava prestanak dejstva leka, naročito kod imunosupresivnih lekova, i vraća rezultat delovanja na početak. Statistike nisu dobre, sa izveštajima o stopama smrtnosti od oko 70 procenata kod pacijenata sa imunodeficijencijom i prosečnim vremenom preživljavanja od četiri meseca. Kriptosporidioza je uzrokovana parazitskom protozoom Cryptosporidium parvum koja je vidljiva pod mikroskopom. Kod osoba sa normalnom funkcijom imunog sistema, diareja izazvana od strane C.parvum, može da se intezivira i prolongira ali je samoograničavajuća. Kod pacijenata obolelih od AIDS-a, kriptosporidialna diareja često ugrožava život. Utvrdjeno je da 15-20 procenata obolelih od AIDS-a pati od ovih stanja. Do danas,nije bilo konzistentne i efikasne terapije za kriptosporidiozu.

Najčešće identifikovani patogen kod pacijenata obolelih od AIDS-a je Enterocytozoon bieneusi, mikrosporodijalni parazit, koji se može pronaći kod približno jedne četvrtine pacijenata. Izgleda da ovaj sićušni parazit može da bude uzročnik u velikom broju neobjašnjenih slučajeva smanjene absorpcije (nedovoljna absorpcija hranjivih materijala u crevima), diareje i slabljenja koja se javljaju kod pacijenata bolesnih od HlV-a. Još uvek ne postoji efikasan način lečenja za ovo oboljenje. Nekoliko drugih vrsta mikrosporidija mogu da inficiraju HlV-pozitivne pacijente, uključujući Encephalitozoon hellem i cuniculi, i nove vrste označene kao Septata intestinalis. U skorijem izveštaju sugeriše se da je rasprostiranje infekcija mikrosporidija u značajnijem porastu. Infekcije sa parazitom Isospora belli je klinički nemoguće razlikovati od kriptosporidioze. Još rasprostranjenija u tropskim klimatskim uslovima, I.belli je bila prijavljena kod manje od 1% pacijenata u Sjedinjenim Državama, mada je stvarni opseg nalaženja verovatno viši. Pneumocystis carinii je uopšteno klasifikovan kao protozooski parazit (protozoa); neke studije ukazuju da su to možda gljive, sa kojima dele izvesne genetičke sekvence. P.carinii obično inficiraju pluća (Pneumocystis Carnii Pneumonia (POP)). Objavljeno je da je terapija uspešna kod 40-60 % pacijenata, sa problemima koji uključuju

toksičnost leka naročito kod pacijenata sa ugroženim imunim sistemom. Medju mnogim ozbiljnim manifestacijama infekcije virusom humane imunodeficijencije (HIV) kod dece, PCP odudara zbog njegovog visokog opsega nalaženja, ravnomerne raspodele po godištima, i učestanoj smrtnosti. PCP je najrasprostranjenija ozbiljna infekcija kod dece zaražene virusom HlV-a; opseg nalaženja PCP-a medju decom zaraženom HlV-om koje ne prihvataju profilaksu se procenjuje na barem 12 % u prvoj godini života. Mnoga deca umiru kratko nakon pogoršanja razvoja PCP. Mycobacterium Avium kompleks (MAC) upućuje na infekcije familije vrlo sličnih mikobakterijskih organizama, Mycobacteruim avium i M. intracellulare. Kada se MAC javlja kod ljudi koji nemaju ugrožen imuni sistem, to je obično u obliku infekcije respiratornog trakta. Kod pacijenata koji boluju od AIDS-a, MAC je veoma rasprostranjen (rasprostranjeni MAC ili DMAC) i skoro bilo koji sistem organa može biti obuhvaćen. U skorijoj studiji, bakterijski MAC j e nadjen kod 43% pacijenata koji su preživeli 2 godine nakon postavljanja dijagnoze za AIDS. Nije ustanovljena standardna terapija za rasprostranjeni MAC. Obično se prepisuje kombinacija lekova, i ukoliko je tretman bio uspešan, potrebno je da se lečenje nastavi do kraja života. Hitno je potreban još efikasniji tretman. Zaraženi HlV-om su naročito osetljivi na infekcije Mycobacterium tuberculosis, i tok bolesti je ubrzan. Dok ekstrapulmonalna tuberkuloza nije običajena kod pacijenata koji nisu zaraženi virusom HlV-a, ona se učestano javlja kod HlV-pozitivnih ljudi. CDCpokazuje smernice budućeg toka lečenja TB-a koji pokazuje rastuću raširenost TB koji je otporan na veliki broj lekova (MDR-TB). Smrtnost medju pacijentima koji boluju od AIDS-a sa MDR-TB je veoma visoka (približno 80%) i širenje bolesti je ekstremno brzo. Prema tome, postoji hitna potreba za razvojem postupka za lečenje ovih tako rasprostranjenih infekcija kod ljudi i životinja. Takodje postoji potreba za dobijanjem leka koji ima široki spektar dejstva kojim bi se pojednostavilo lečenje infekcija tremadama. Danas je neophodno utvrditi dijagnozu za specifični patogen (u ovom slučaju trematodu), i onda prepisati terapiju sa lekom koji je specifičan za datu trematodu. Mnogi manje razvijene zemlje nisu opremljene za postavljanje dijagnoze za specifičnu trematodu. Razvoj širokog spektra lekova koji deluju eliminisaće potrebu za postavljanjem dijagnoze. Schistosoma mansoni, krvni parazit (trematoda iz roda Schistosoma), je uzročnik šistozomiaze, druge najznačajnije tropske parazitske bolesti kod ljudi (posle malarije), i najznačajnije infekcije koje izazivaju trematode kod čoveka. Schistosoma haematobium je još jedna značajna vrsta koja inficira čoveka. Preko 200 miliona individua pati od šistosomiazije širom sveta, uključujući nekoliko stotina hiljada ljudi u Sjedinjenim Državama. Fasciola hepatica, uobičajeni parazit jetre, prvenstveno izaziva oboljenje kod ovaca, ali su ljudi slučajni domaćini. Paraziti se prilagodavaju da bi opstali u prisustvu snažnog imunog odgovora domaćina. Bitionol je predložen za lečenje, ali nije odobrena njegova upotreba u Sjedinjenim Američkim Državama.

Tako postoji potreba za farmaceutskom kompozicijom čije je skladištenje stabilno čak i u tropskim sredinama, i koja ima širok spektar dejstva prema trematodama.

Suština Pronalaska

U okviru studija o životinjama kao i u humanim kliničkim studijama pokazano je daje efikasnost lečenja, zavisi od veličine čestice aktivne supstance u leku kao i od stabilnosti jedinjenja, korišćenjem jedinjenja sa formulama (I) i (II). Opisani farmaceutski sastavi su pogodni za lečenje infekcija izazvanih Schistosoma trematodama kod ljudi i životinja, kao što su Schistosoma mansoni,Schistosoma haematobium, Schistosomamekongi,Schistosomajaponicum, Schistosoma intercalatum,Fasciola kao sto je Fasciola gigantica, Fasciolopsis biski\ i Dicrocoelium dentriticum, Heterophyes heterophyes, i Metagonimus yokogawa. Farmaceutske kompozicije su takodje efikasne za lečenje imunokompromisnih i oportunističkih infekcija izazvanih od strane Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Enterocytzoon bieneusi, Encephalittozoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intacellulare, Pneumocystis carinii i Toxoplasma gon d i i.

Farmaceutska kompozicija može biti u obliku pogodnom za oralnu primenu, u čvrstom doznom obliku, u vidu tečnih suspenzija ili u obliku

paste.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Za potpunije razumevanje prirode i predmeta zaštite datog pronalaska , postoji referenca u okviru detaljnog opisa zajedno sa pratećim crtežima gde :

Sl. 1 pokazuje inhibiciju u procentima i sposobnost rastenja ćelije domaćina od nitazoksamida prema E.intestinalis.

Sl. 2 pokazuje inhibiciju u procentima i sposobnost rasta ćelije domaćina za nitazoksanid prema V. corneae.

SI. 3 pokazuje inhibiciju u procentima i sposobnost rasta ćelije domaćina albendazola prema E. intestinalis.

Sli. 4 pokazuje procenat inhibicije i sposobnost za život ćelije domaćina albendazola naspram V.corneae.

SI. 5 pokazuje mapu vrednosti za OD dobijenu za svaku posudu sa kulturom T. gondii, naspram koncentracije leka u kulturi.

SI. 7 je tabela koja se zasniva na ogledu za efikasnost nitazoksanida naspram mikobakterija koje rastu u tečnoj sredini koja sadrži odgovarajuće hranjive sastojke za uzgajanje mikroorganizama.

SI. 8 pokazuje procenat aktivnih čestica koje imaju veličinu manju od Ø μm

Detaljan opis pronalaska

Pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje kao aktivno sredstvo sadrže barem jedno jedinjenje koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od:

jedinjenja formule (I)

jedinjenja formule (II)

i koje dalje sadrže stabilnu količinu farmaceutski prihvatljive kiseline.

Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja kao aktivno sredstvo sadrži jedinjenje formule II

i farmaceutski prihvatljivu kiselinu u količini koja je dovoljna za održavanje pH pomenute farmaceutske kompozicije izmedju 2 i 6 kada rečena farmaceutska kompozicija dolazi u kontakt sa vodom, gde j e pomenuto aktivno sredstvo u obliku čvrstih čestica, i gde je odnos težine farmaceutski prihvatljive kiseline u odnosu na težinu pomenutih čestica izmedju 0.01 i 0.5.

Primeri takvih kiselina su : limunska kiselina, glutaminska kiselina, ćilibarna kiselina, etansulfonska kiselina, sirćetna kiselina, vinska kiselina, askorbinska kiselina, metansulfonska kiselina, fumarna kiselina, adipinska kiselina, jabučna kiselina kao i njihove smeše. Limunska kiselina je veoma pogodna za primenu. Prisustvo pomenute kiseline poboljšava stabilnost aktivnog sredstva ili sredstava.

Odnos težine farmaceutski prihvatljive kiseline u odnosu na težine pomenutih aktivnih čvrstih čestica je obično izmedju 0.03 i 0.2. Obično je količina kiseline dovoljna za regulisanje pH suspenzije izmedju 2 i 6, po mogućstvu izmedju 3 i 5, najpoželjnije izmedju 3.5 i 4.5.

Tehnike dobijanja kao i poželjni primeri, čvrsti i tečni oblik farmaceutske kompozicije opisani su u WO/ 95/ 28393, gde je otkriće u potpunosti obuhvaćeno referencom. Kompozicije koje sadrže sredstvo za kvašenje i ako je moguće derivat škroba kao što je onaj opisan u US Patent 5,578,621, čiji sadržaj je ovde u potpunosti obuhvaćen referencom, za otkrivanje mogućih sredstava za kvašenje i derivata škroba. Kao što je 0pis3.no u US 5,578,621, sredstvo za kvašenje služi kao disperziono sredstvo.

Takve farmaceutske kompozicije, ili davanjem u dozama u čvrstom ili u tečnom stanju ili u obliku pasti ili masti, mogu po slobodnom izboru da sadrže dodatna aktivna sredstva kao sto su antibiotici, anti-virusna sredstva ili inhibitore protonskih pumpi. Kada to nije pogodno, takodje je moguće i da takve farmaceutske formulacije sadrže aktivne čvrste čestice jedinjenja sa formulom (I) i / ili jedinjenje sa formulom (II) koje su veće od 200|im.

Kompozicije mogu da sadrže ekscipijente koji su kao takvi poznati za potrebe dobijanja oblika pogodnih za oralnu primenu.

Da bi imali dobru efikasnost protiv širokog spektra parazita, bakterija i virusa, korisno je da je faktor raspodele za pomenute aktivne čestice bude izmedju 0.8 i 2, po mogućstvu izmedju 1.1 i 1.9, a najpoželjnije je da bude veći od 1.5, gde je pomenuti faktor raspodele izračunat pomoću sledeće formule, :

u kojoj je F90% faktor raspodele pri 90% ;

u kojoj je F90% faktor raspodele pri 90% ;

Ø90 je maksimalna veličina čestica frakcije koja odgovara 90% od pomenutih aktivnih čvrstih čestica, i Ø10 je maksimalna veličina čestica od frakcija čestica koje odgovaraju 10% od pomenutih aktivnih čvrstih supstanci. Prema specifičnom izvodjenju pronalaska, čestice jedinjenja sa formulom (I) i / ili (II) se dobijaju pomoću postupaka koji su ovde ranije opisani i koje se nakon toga samelju tako da j e manje od 10 % aktivnih čestica veće od 100 µm, manje od 50% od rečenih čestica je veće od 50pm i manje od 10 %od pomenutih aktivnih čestica je manje od 5μm u veličini, gde je srednja vrecfnost veličine čestica izmedju 20 i 50-μm. Pomenute aktivne čestice se onda granulišu korišćenjem smeše koja sadrži aktivne čvrste čestice i barem jedno sredstvo za granulaciju. Primeri sredstava za granulaciju su polivinilpirolidon, voda, alkohol, saharoza hidroksil celuloza i njihova smeša. Korisno je da se barem jedna farmaceutski prihvatljiva kiselina dodaje za vreme procesa granulacije.

Pronalazak se odnosi na davanje doza u čvrstom stanju koje obuhvata kompoziciju pronalaska kao što su tablete, disperzibilne tablete, tabete sa prevlakom, matriksi itd. Dozni oblik prema pronalasku sadrži, na primer .

Aktivne čestice u čvrstom stanju sa veličinom čestice manjom od 200μm, gde manje od 10% pomenutih čestica ima veličinu manju od 100 pm, gde manje od 50 % od pomenutih čestica ima veličinu manju od 50 pm i gde manje od 10% pomenutih čestica ima veličinu manju od 5 µm, gde je srednja veličina čestice izmedju 20 i 50 µm. barem jedno sredstvo za granulaciju;

barem jedno sredstvo za kvašenje; i barem jedan derivat škroba, i barem jednu farmaceutski prihvatljivu kiselinu koja se po mogućstvu dobija za vreme procesa granulacije.

Davanje doza u tečnom obliku kao što su vodene suspenzije iz pronalaska obuhvata, na primer :

kao aktivno sredstvo, čvrste čestice koje sadrže u sebi jedinjenje sa formulom (I) i / ili jedinjenja sa formulom (II) imaju veličinu čestica manju od 200μm, manje od 10 % od pomenutih čestica ima veličinu veću od 100 µm, manje od 50 %pomenutih čestica ima veličinu veću od 50 µm i manje od 10% pomenutih čestica ima veličinu manju od 5 µm, i barem jedno sredstvo za, granulaciju; barem jedno sredstvo za kvašenje ; i barem jednu farmaceutski prihvatljivu so, pH suspenzije treba daje izmedju 2 i 6, po mogućstvu izmedju 3 i 5, najpoželjnije izmedju 3.5 i 4.5; barem jedno sredstvo za zgušnjavanje, na primer, ksantan guma, agar guma, kristalna celuloza, karuba guma, karboksimetilceluloza i I i njihove smeše.

Pasta ili mast iz pronalaska koji su pogodni za oralnu primenu sadrže, na primer :

kao aktivno sredstvo, čvrste čestice koje sadrže u sebi jedinjenje sa formulom (I) i / ili jedinjenje sa fomulom (II) imaju veličinu čestica manju od 200 µm, gde manje od 10 %od pomenutih čestica ima veličinu veću od 100 µm, gde manje od 50% od pomenutih čestica imaju veličinu veću od 50 µm i manje od 10% od pomenutih čestica imaju veličinu manju od 5 µm, i barem jedno sredstvo za kvašenje; barem jednu farmaceutski prihvatljivu so, pH suspenzije treba daje izmedju 2 i 6, po mogućstvu izmedju 3 i 5, najpoželjnije izmedju 3.5 i 4.5; barem jedno sredstvo za zgušnjavanje, na primer ksantan guma, aguar guma, kristalna celuloza, karuba guma, karboksimetilceluloza ili njihove smeše.

Pasta i mast za lokalnu ili intravaginalnu primenu sadrže, na primer : kao aktivno sredstvo, čvrste čestice koje sadrže jedinjenje sa formulom (I) i / ili jedinjenje sa fomulom (II) koje imaju veličinu čestica koja je manja od 200 µm, gde manje od 10 % od pomenutih čestica ima veličinu veću od 100 µm, gde manje od 50% od pomenutih čestica ima veličinu veću od 50 µm i gde manje od 10% od pomenutih čestica ima veličinu manju od 5 µm, i

barem jedno sredstvo za kvašenje; barem jednu farmaceutski

prihvatljivu so, gde pH suspenzije treba da je izmedju 2 i 6, po

mogućstvu izmedju 3 i 5, najpoželjnije izmedju 3.5 i 4.5;

cetil alkohol i/ili derivate glicerida i/ili propilenglikola;

barem jedno sredstvo za zgušnjavanje, na primer ksantan guma, aguar

guma, kristalnu celulozu, karuba guma, karboksimetilceluloza ili

njihove smeše.

Postupak za tretman infekcija obuhvata primenu farmaceutske kompozicije koja kao aktivno sredstvo obuhvata najmanje jedno jedinjenje koje je odabrano iz grupe koja se sastoji od dezacetil-nitoksanida formule (I):

Nitazoksanid (NTZ), jedinjenje koje ima formulu (II), je generičko ime za 2-(acetiloksi)-N-(5-nitro 2-tiazoli) benzamid, jedinjenje koje je prvi put sintetizovano odstrane Rossignol i Cavier-a 1975 godine. 2 mg nitazoksanida se može rastvoriti u 1 ml DMSO. Nitazoksanid se lako absorbuje oralnim putem. Sve do sada nije bilo dokaza da jedinjenja sa formulama (I) i/ili (II) mogu u širokom spektru da budu efikasna u lečenju infekcija izazivanih trematodama, ili da mogu da budu dovoljno netoksična da bi mogla da budu prihvaćena čak i od ljudi sa ugroženim imunim sistemom. Dovijanje i odredjena upotreba nitazoksanida je opisana u Američkom patentu 3,950,351, kao i u publikacijama datog pronalazača. Dezacetil-nitazoksanid, jedinjenje sa formulom (I), se ponekad odnosi na tizoksanid ili d-NTZ, i metabolit je nitazoksanida. U WO95/28393, dati pronalazač opisuje postupak za proizvodnju čistog jedinjenja sa formulom (II), kao i upotrebu jedinjenja koje sadrži smesu jedinjenja (I) i (II). Uočeno je da čvrste čestice jedinjenja sa formulom (I), jedinjenja sa formulom (II) ili njihove smeše imaju čestice veličine izmedju 170 i 520 µm (prosečna vrednost veličine čestice = 352 µm) i veoma ograničenu efikasnost kada se primenjuju u oralnom obliku na životinje i ljude. Efikasnost takvih čestica je manja od postojećih farmaceutskih proizvoda i stoga je neprihvatljiva za regulisanje ili za komercijalne svrhe. Takodje je uočeno kod pasa da oralna primena jedinične doze od 50 mg po kilogramu čvrstih čestica jedinjenja sa formulom (I) i jedinjenja sa formulom (II) sa veličinom čestice koja je manja od 5μm, prouzrokuje snažnu reakciju kod životinja.

Sada je otkriveno da u cilju efikasnog i sigurnog tečenja infekcija uzrokovanih parazitima, bakterijama, gljivama i virusima kod ljudi i životinja, farmaceutska kompozicija, ili u čvrstom obliku ili u obliku vodene suspenzije, mora da sadrži efikasnu dozu aktivnog sredstva u obliku čestica u čvrstom stanju, koje imaju veličinu manju od 200pm i jedinjenje formule (I) i / ili jedinjenje formule (II), srednja veličina aktivnih čvrstih čestica je veća od 10 µm. Prisustvo velikog broja čestica aktivnog sredstva koje imaju veličinu veću od 200pm u pogledu sadržaja čestica koje imaju veličinu izmedju 5 i 200 µm značajno smanjuje hemoterapeutsku aktivnost jedinjenja. Po mogućstvu, farmaceutski sastavi iz pronalaska ne obuhvataju više od 5% težine aktivnih čestica u čvrstom stanju koje imaju veličinu veću od 200 µm. Najpoželjnije 'je da farmaceutski sastavi iz pronalaska ne sadrže aktivne čvrste čestice u čvrstom stanju koje imaju veličinu veću od 200 µm. Prisustvo visokog sadržaja čestica sa aktivnim sredstvom koje imaju veličinu manju od 5pm u pogledu sadržaja čestica koje imaju veličinu izmedju 5 i 200pm, može da proizvede suprotan efekat kod životinja ili ljudi. Osim toga, uočeno je da se čestice koje imaju veličinu manju od 5μm brze apsorbuju iz gastro-intestinalnog trakta u krvotok, i da stoga nisu tako efikasne protiv parazita, bakterija, gljiva i virusa koji obično žive unutar gastro-intestinalnog trakta životinja ili ljudi.

Upućeni naučnik ne može predvideti da veličina čestice jedinjenja sa formulom (I) i jedinjenja sa formulom (II) može imati tako značajan efekat na njegovu mikrobiološku aktivnost kod životinja i ljudi. Na primer, u studijama koje su sprovedene od strane pronalazača, antiparazitska jedinjenja takva kao što su albendazol, mebendazol, niklozamid, prazikvantel i metronidazol ne pokazuju tako primetnu razliku u antiparazitskoj aktivnosti kod životinja i ljudi što je zavisno od njihove veličine čestice. Pored toga, upućeni naučnik ne može da predvidi da veličina čestice od jedinjenja sa formulom (I) i jedinjenja sa formulom (II) može da ima tako suprotan efekat na sposobnost životinja ili ljudi da podnesu primenu pomenutog aktivnog sredstva. Jedinjenje (a) sa formulama (I) i (II) mogu se primeniti davanjem leka u dozama (u čvrstom obliku) ili u vidu vodene suspenzije, i poželjno je da farmaceutski sastav sadrži efikasnu dozu aktivnog sredstva u obliku čestica u čvrstom stanju sa formulom (I) i / ili (II) sa veličinom čestice manjom od 200 μm, srednja vrednost veličine čestice za pomenute aktivne čestice u čvrstom stanju je veća od 10 μm kao što je odredjeno od strane Coulter Counter LS100. Ova oprema koristi lasersko svetio na 750 μm za čestice veličine od 0.4 do 900 μm u prečniku, pomoću difrakcije svetlosti. Uzorci su mereni u vodi sa malim količinama Triton X-100 da bi se povećala kvašljivost i deflokulacija (smanjenjem stanja flokulencije dispergovanjem flokulovanih čestica) praha. Od koristi je daje srednja vrednost veličine čestice za pomenute aktivne čestice u čvrstom stanju izmedju 10 i 100 μm. po rnogućstvu izmedju 20 i 50 μm. Primeri poželjnih kompozicija su: kompozicija za koju manje od 10% od težine pomenutih čvrstih čestica ima veličinu veću od 100 μm ; kompozicija gde najmanje 50 % težine od pomenute aktivne čvrste supstance ima veličinu čestica manju od 50 μm. Od koristi je da je srednja vrednost veličine čestica za pomenute aktivne čestice (u čvrstom stanju) izmedju 10 i 100 μm, po mogućstvu izmedju 20 i 50 μm. Prema poželjnom izvodjenju za kompoziciju, manje od 10 % pomenutih aktivnih čestica u čvrstom stanju ima veličinu manju od 5 μm. Aktivno sredstvo ili sredstva koja su korišćena prilikom davanja leka u čvrstom doznom obliku ili u vidu suspenzija je pogodna smeša čestica u čvrstom stanju od jedinjenja sa formulom (I) i formulom (II) sa veličinom čestice koja je manja od 200μm, težinski sadržaj jedinjenja sa formulom (I) u pogledu težine jedinjenja sa formulom (I) i sa formulom (II) od pomenute smeše je obuhvaćeno izmedju 0.5 i 20% po

mogućstvu izmedju 0.5 i 10 %.

Opis dobijanja farmaceutskih kompozicija

Osušeno prečišćeno jedinjenje sa formulom (I) i osušeno prečišćeno jedinjenje sa formulom (II) podvrgnuta su mlevenju i razvrstana su prema veličini mrežastog rešeta.

Posle mlevenja, čestice jedinjenja sa formulom (I), ili formulom (II) i njihove smeše imaju raspodelu veličine čestice kao sto je dato na si. 8. Slika 8 pokazuje procenat čestica koje imaju veličinu manju od 0 μm.

Sa pomenute slike, se vidi da :

manje od 10% od ukupne težine čestica ima veličinu manju od približno 5 μm;

manje od 10 % od težine čestica ima veličinu veću od približno 70 μm; gde srednja veličina čestice iznosi približno 40 μm ; gde faktor raspodele za čestice iznosi oko 1.73, dok je pomenuti faktor raspodele ukalkulisan u sledeću formulu :

u kojoj je

F90% faktor raspodele na 90% ;

Ø90%je maksimalna veličina čestica frakcija za čestice koja odgovara 90% od pomenutih aktivnih čvrstih čestica, i

Ø10% je maksimalna veličina čestica za frakcije čestica koje odgovaraju 10 % od pomenutih aktivnih čvrstih čestica.

Specifični primeri za takve kompozicije su predstavljeni usledećim tabelama.

u kojoj je

F90% faktor raspodele na 90% ;

Ø90%je maksimalna veličina čestica frakcija za čestice koja odgovara 90% od pomenutih aktivnih čvrstih čestica, i

Ø10% je maksimalna veličina čestica za frakcije čestica koje odgovaraju 10 % od pomenutih aktivnih čvrstih čestica.

Specifični primeri za takve kompozicije su predstavljeni usledećim tabelama.

Tabela 1. Primer kompozicije za disperzibilne tablete za oralnu primenu koja kao aktivna sredstva sadrži jedinjenje sa formulom (II) i jedinjenje sa formulom (II).

Tabela 2. Primeri kompozicije tableta sa prevlakom za oralnu primenu koja kao aktivna sredstva sadrži jedinjenje sa formulom (II) i jedinjenje sa formulom (II).

Omotači:

Topli šećerni rastvor ili sloj prevlake raspršava se preko površine tableta ili granula koje sadrže 500 mg aktivnog sredstva.

Tabela 3. Primer vodene suspenzije za oralnu primenu koja kao aktivno sredstvo sadrži jedinjenje sa formulom (II) i jedinjenje sa formulom (II). pH suspenzije je oko 4.1.

Tabela 4. Primer paste za oralnu upotrebu koja u vidu

aktivnog sredstva sadrži jedinjenje sa formulom (II) i

Tabela 5. Primer za pastu li formulaciju masti za intavenoznu ili lokalnu primenu, gde pomenuta pasta ili mast kao aktivno sredstvo sadrži jedinjenje sa formulom (II) i jedinjenje sa formulom (I).

Farmaceutske kompozicije u pronalasku su kompozicije sa širokim spektrom dejstava na parazite, bakterije, gljive i viruse, naročito kada se daju oralnim putem. Efikasnost i sigurnost farmaceutskih kompozicija koje su opisane ranije u ovom tekstu je izvanredna kod životinja i ljudi. U humanim kliničkim studijama, naročito je uočeno da je efikasnost ovde opisanih farmacetskih kompozicija značajno veća u lečenju parazitskih infekcija nego što je to slučaj sa istim formulacijama koje koriste aktivna jedinjenja koja imaju veličinu čestica izmedju 170 i 520 μm (srednja vrednost veličine=352μm), čak i kada se čestice većih dimenzija daju pacijentima u dozama koje su do tri puta veće i za duži period vremena. Dobijeni primeri izlečenja su pokazani u tabeli 6.

Tabela 6. Poredjenje rezultata humanih kliničkih studija korišćenjem jedinjenja formule (I) i formule (II) sa veličinom čestica koja je u opsegu od 170 μm do 520 μm (srednja vrednost =352 μm)koji su dobijeni korišćenjem jedinjenja formule (I) i formule (II) koje imaju veličinu čestice u opsegu od 5 μm do 200 μm (srednja vrednost =34 μm)-Jedinjenje sa formulom (I) (98 %) + jedinjenje sa formulom (II) (2%)

Za svaki od parazita koji su navedeni u tabeli 6, proporcionalna stopa

izlečenja je značajno bolja za pacijente koji su lečeni sa aktivnim

česticama koje imaju veličinu izmedju 5 i 200 μm, nego za one koje su lečeni sa aktivnim česticama čija je veličina u opsegu od 170 μm do 520 μm, gde je statistički značaj u svakom od slučajeva bio manji od 0.02, p<0.02 ( korišćenjem standardnog testa). Ovo je slučaj čak i kada su doze koje sadrže veće čestice aktivnog sredstva obično više i kada je trajanje lečenja često duže nego kada su pacijentima davane farmaceutske kompozicije gde je veličina čestica kod aktivnih sredstava manja od 200 μm. Nije objavljeno da postoje ozbiljniji štetni efekti kod bilo koje grupe pacijenata. Kod testiranja na životinjama, takodje su posmatrani rezultati koji su slični onima koji su opisani ranije u humanim studijama. Osim toga, štetne reakcije koje se javljaju kod pasa nakon oralne primene jedinične doze od 50 miligrama po kilogramu jedinjenja formule (I) i jedinjenja formule (II) nisu posmatrane na ekstenzivnim studijama kod životinja korišćenjem jedinjenja formule (I) i jedinjenja formule (II) gde je veličina čestica izmedju 5 i 200 μm (srednja vrednost veličine čestice > 10 μm)., čak i kada se ista ili povećana doza jedinjenja primenjuje dnevno u periodu od 90 dana ili duže. Osim toga, pomenute kompozicije su stabilne (čak i kada su podvrgunte temperaturama od 40 °C i relativnoj vlažnosti vazduha od 65% u periodu od šest meseci ili u slučaju tečnih suspenzija, kada se rastvore u vodi pod ovim uslovima u periodu od 3 meseca) pokazujući na taj način da su aktivna sredstva ne razgradjuju i da kompozicije zadržavaju svoju efikasnost za period vremena nakon njihovog dobijanja koje je pogodno za medicinske i komercijalne svrhe. U onome sto sledi, biće predstavljena efikasnost farmaceutskih kompozicija.

PRIMER I

CRYPTOSPORIDIUM PARVUM

U preliminarnom kliničkom ispitivanju, 30 pacijenata obolelih od AIDS-a sa hroničnom kriptosporodijalnom dijarejom lečeno je oralnim putem sa nitazoksanidom u dozama od 500 do 2000 mg dnevno. Ukoliko se dijareja nastavlja, pacijenti primaju dodatne četiri nedelje nitazoksanid, u dozama do 2000 mg na dan. Dvadeset osmoro ljudi prima terapiju u trajanju od dve ili više nedelja i kod šesnaestoro od njih je procenjivan terapeutski odgovor nakon osme nedelje tretmana. U ovoj kasnijoj grupi, 12 osoba ima dnevno smanjenje frekvencije pomeranja creva u procentu od 50 %ili vise i 10 pojedinaca ima znatno smanjenje ili iskorenjenje parazita u izmetu, dok se kod četiri pacijenta prisustvo parazita ne može da detektuje. Kod šestoro pacijenata je dostignut kriterijum i za klinički i za parazitološki odgovor koji dovodi do poboljšanja. Više je verovatno da ce pacijenti koji dobijaju više dnevne doze leka za duže periode vremena, pozitivno da reaguju na lek.Otvorena studija o nitazoksanidu za kriptosporidialnu diareju u vezi sa AIDS-om, dokumentuje podatke o smanjenju crevnih pokreta kod pacijenata koji uzimaju dnevno 500, 1000, 1500 ili 2000 mg leka. Učesnici u ogledu imaju srednju vrednost rezultata CD4+ brojanja za 42 ćelije / mm 3 ( opseg 0-303 ćelije / mm 3), prosečno 6.7 pokreta creva dnevno u prosečnom vremenskom intervalu od 1 5 meseci, imaju jaja cisti Cryptosporidium parvum u stolici, bez prisustva ostalih patogena iz trbuha. Skoro svi učesnici su imali pogrešnu terapiju sa azitromicinom ili paromomicinom. Posle 23 nedelje, 9 od 13 ima kompletan klinički odgovor (preovladjujuće jedan do tri pokreta creva dnevno) i 4 od 13 ima delimični klinički odgovor (najmanje 50 procentno smanjenje kod dnevnih pokreta creva i I i promena u sastavu stolice tako da se dobija barem 75 procenata). Sa završetkom studije, kod 8 od 11 pacijenata, parazit je kompletno iskorenjen i ostala tri imaju značajno smanjenje u broju jaja cisti. Postoji trend sa dozama od 100 mg dnevno ili više i sa dužom terapijom koji dovodi do boljeg odgovora. Dva učesnika ogleda su dobila osip po koži, više od 90 procenata se pridržavalo režima studije u periodu dužem od četiri nedelje

PRIMER II

CRYPTOSPORIDIUM PARVUM

In Vitro Informacija o davanju leka

Nitazoksanid se rastvara u sterilnom dimetilsulfoksidu (DMSO) i testira se prema netretiranim ocistama C.parvum koje su inficirale ćelijske monoslojeve pri koncentracijama od 100 µg/mL, 10 µg/mL i 0 1 µg/mL. Druga proba (test) je izvedena sa testiranim nitazoksanidom u dodatnim koncentracijama od 20/2, 0.2 i 0.02 mg/l. Ove koncentracije se postižu serijskim rastvaranjem sa kompletnim DMEM medijumom da bi se dobila krajnja koncentracija DMSO-a od 0.5%. Kontrolni medijum takodje dolazi u dodir sa 0.5% DMSO-a Eksperiment u kojem se koristi ćelijska kultura MDBKF5D2 ćelija koje su uzgajane u komori od 7 mm, i kao Cryptosporidium parvum; GCH1 očiste (umehureno zigotno stanje u

životu nekih sporozoa), 5 x 10 4 po bunarčiću, i praćeno da bi se uporedilo dejstvo paromomicina (pozitivna kontrola) prema nitazoksanidu (eksperimentalni lek). Materijali obuhvataju serum kunića (0.1%) koji je imunizovan sa Sporozoitima Cryptosporidium parvuum (jedan od sićušnih tela u kojima se dele spore od izvesnih protozoa, od kojih se svaka razvija u odraslu individuu) i kozijim anti-kunić antitelom (1%) koje je obeleženo fluorosceinom .

Ogled provere toksičnosti

200 pl medijuma koji sadrži nitazoksanid u koncentracijama od 100, 10, 1 ili 0.1 µg/mL i odgovarajuće kontrole, dodaju se u dva “ bunarčića “ na mikrotitracionoj ploči sa 96 bunarčića, koji sadrže konfluentni ćelijski monosloj MDBKF5D2 i dva bunarčića bez monoslojeva. Lek se

inkubira na monoslojevima ćelija na 37°C i pri 8%CO2. Na 24 h (proba 1) i 48 h (proba 2), MTS (Ovensov rastvor), PMS se dodaje u svaki

bunarčić u Koncentracijama od 333 µg/mL i 25 µM. Ploča se vraća u inkubator da bi se razvijala u mraku dva sata. Nakon dva sata, 100 µl od svakog supernatanta se prenosi u novu posudu za mikrotitraciju i očitava se na ELISA čitaču na 490 nm. Rezultati su snimljeni i analizirani. Procenat toksičnosti se izračunava oduzimanjem srednje vrednosti optičke gustine (OD) supernatanta iz kontrolnog medijuma (bez leka), deljenjem sa OD kontrolnog medijuma i množenjem sa 100. OD mediiuma - OD leka x 100

OD medijuma

Ogled sa netaknutim C parvuum ocistama

5x 10 4 C. parvuum ocista po “ bunarčiću “ se inkubira u nitazoksanidu

(100, 20, 10 , 2, 0.1 i 0.02 mg/ml) na 37°C(8% CO2) na konfluentnim ćelijskim monoslojevima MDKBKF5D2 Nivo infekcije za svaku ćeliju j e odredjen i analiziran imunofluoroscentnim ogledom na 24 do 48h. Procenat inhibicije je izračunat oduzimanjem srednje vrednosti broja parazita/10 polja u posudama za testiranje leka od srednje vrednosti broja parazita/10 polja u kontrolnom medijumu (bez leka), đeljenjem broja za kontrolni medijum i zatim množenjem sa 100. broj za kontrolni medijum - broj za test sa lekom x 100

Uticaj nitazoksanida na netretirane ociste C.parvum U probi 1, nitazoksanid pri koncentracijama od 10, 1 ili 0.1 za svakog posebno dovodi do nivoa inhibiranja parazita od 94.4, 77.2 i 51.8 %, i do nivoa ćelijske toksičnosti od 65.1, 8.3 i 19.3 %.Mada se gotovo kompletna inhibicija parazitskih infekcija javlja u 10 µg/mL,visoka toksičnost je očigledna.Pri koncentraciji od 1 µg/mL nitazoksanida, parazitska inhibicija i ćelijska toksičnost se uporedjuje sa paramomicinom pri koncentraciji od 2 mg/ ml (77.2% parazitske inhibicije i 8.3% toksičnosti nitazoksanida pri koncentraciji od 1 µg/mL poredi se sa procentom parazitske inhibicije od 51% i 23.8% ćelijske toksičnosti za paromomicin za 2 mg/ml). U ogledu 2, lek se modifikuje da bi se dobila bolja raspodela doza sa minimalnom toksičnošću. Stoga,kulture su vidljive 48 h umesto 24 sata kao u ogledu 1.Inkubacija u vremenu od 48h jasno dovodi do više relativne vrednosti ćelijske toksičnosti što je očigledno iz oba ogleda sa ispitivanjem paromomicina.Koncentracija nitazoksanida od 20 µg/mL je još uvek dosta toksična nakon 48h inkubacije mada ćelijski monosloj ostaje netaknut.Moguće je da visoka toksičnost koja deluje na ćelijsku funkciju takodje zaustavlja razvoj/infekciju parazita.Pri koncentraciji od 2 µg/mL nitazoksanida, postoji značajnija inhibicija infekcije izazvane parazitima sa relativno niskom ćelijskom toksičnošću.Dalja razblaživanja takodje dovode do značajnije inhibicije i manje toksičnosti. Pri koncentraciji leka od 2 µg/ml ublažena ćelijska toksičnost i procenat inhibitorske aktivnosti od 94.90% pokazuju daje pri koncentraciji od 2 µg/ml nitazoksanid bolji od paramomicina za infekciju C.parvum izazvanu in vitro na 2 mg/ml (npr. 1000 puta veća koncentracija).

PRIMER III CRYPTOSPORIDIUM PARVUM

Davanje doze in vitro i podaci o čuvanju Zalihe nitazoksanida i dezacetil-nitazoksanida (NTZ i NTZ-idi) testirane su prema netretiranim ocistama C.parvum i ćelijskim monoslojevima inficiranim sporozoitima pri koncentracijma od 10,1,0.1 i 0.01µg/ml.Svako jedinjenje se rastvara u 100%-tnom DMSO-u i razblažuje do željenih koncetracija sa sterilnim DMEM-om. Svaka koncentracija nitazoksanida i kontrolnih medijuma sadrži 0.025% DMSO-a kao konstantu. Eksperiment u kojem se koristi ćelijska kultura MDBKF5D2 ćelija koje su uzgajane u komori od 7mm, i kao Cryptosporidium parvum: GCH1 očiste, 4x104 po bunarčiću i praćeno da bi se uporedilo dejstvo paramomicina (pozitivni kontrola) u odnosu na nitazoksanid (eksperimentalni lek). Materijali obuhvataju serum kunića koji je sa imunizovan sa Sporozoitima Cryptosporidium parvum (0.1%) i kozijim anti-kunić antitelom koje je obeleženo fluorosceinom (1%).

Ogled provere toksičnosti

200 µl medijuma koji sadrži rastvor nitazoksanida u predhodno pomenutim koncentracijama i odgovarajuće kontrolne rastvore, dodaje se u dva bunarčića na mikrotitracionoj ploči sa 96 bunarčića koji sadrže konfluentni monosloj MDBKFD2 ćelija i dva bunarčića bez tih

monoslojeva. Lek se inkubira na monoslojevima na37°Ci 8%-tnom CO2 Nakon 48h, MTS (Ovenov rastvor) i PMS se dodaju u svaki bunarčić u koncentracijama od 333 µg/ml i 25 μM. Ploča se vraća u inkubator da bi se razvijala u mraku 2 sata. Nakon 2h, 100ml svakog supernatanta se prenosi na novu mikrotitracionu ploču i očitava se na ELISA čitaču na 490 nm. Rezultati se snimaju i analiziraju. Procenat toksičnosti se izračunava oduzimanjem srednje vrednosti optičke gustine (OD) iz supernatanta koji sadrži lek od srednje vrednosti optičke gustine za supernatant iz kontrolnog medijuma (bez leka),deljenjem sa vrednosti za OD kontrolnog medijuma i množenjem sa 100.

ODmedijum - OD lek x 100 OD medijum

Rezultati za citotoksjčnost označeni su na sledeći način: 0.5% toksičnost = 0,6-25%toksičnosti = 1 ,26-50 %toksičnosti = 2,51 - 75 toksičost=3 i 76-100% toksičnost=-4. Kao standard,0 ili 1 kao rezultati za citotoksičnost,smatraju se prihvatljivim nivoima toksičnosti. Toksičnost izražena vrednostima 2,3 ili 4 predstavlja visok nivo toksičnosti ćelijskog monosloja.

Ogled sa netaknutim ocistama C. parvum

5x104ocista C.parvum po bunarči ću inkubira se na predhodno pomenutih koncentracijama nitazoksanida na 37°C (8%CO2) na konfluentnom MDBKF5D2 monosloju ćelija. Odredjuju se nivoi infekcije u svakom bunarčiću i analiziraju kompjuterom pomoću imunofluorescentnog ogleda u vremenu od 48h. Procenat inhibicije se izračunava oduzimanjem srednje vrednosti broja parazita/po polju u bunarčićima sa lekom od srednje vrednosti broja parazita/po bunarčiću u kontrolnog medijumu (bez leka), deljenjem sa srednjom vrednošću broja kontrolnog medijuma i množenjem sa 100. broj za kontrolni medjurn - broj za ogled sa lekom x 100 srednja vrednost za kontrolni medijum

Rezultati: Ogled sa ocistama C. parvum (48h)

Konc.-μg/ml;Parazit/Srednjibr.parazita/po polju (analizirano 12 polja);

% Inhibicije-procenat inhibicije parazitskih infekcija;% Toks-Procenat toksičnosti za ćelije upotrebom leka. Iz gornje tabele se može videti da je inhibitorska aktivnost NTZida ista kao i za NTZ u primeru II. I nitazoksanid i dezacetil nitazoksanid su podjednako efikasni in vitro naspram Cryptosporidium parvum kada se paralelno testiraju za procenat inhibicije od 98 i 94 % koji se dobija za 10 i 1 i±g/ml za svako jedinjenje posebno. Za nitazoksanid, 1μg/ml je najniža koncentracija kojom se postiže više od 90 % inhibicije, dok se 50% inhibicija može dobiti sa nižim koncentracijama nitazoksanida kao što su 0.2,0.1 i 0.02 lig/ml.Pri istim eksperimentalnim uslovima paromomicin koji se koristi kao kontrolno jedinjenje je 2,000 puta manje efikasan u koncentracijama unutar opsega od 51% do 83% koje izazivaju inhibiciju, pri koncentraciji od 2,000 μg/ml.

PRIMER IV

E.INTESTINALIS i V.CORNEA

2RK-13 ćelije (ćelijske linije bubrega kunića) dodaju se na ploče sa kulturama sa 24 bunarčića u koncentracijama od 2.6x105 ćelija po posudi (1.0ml medijuma;RPMI 1640 sa 2mM L-glutamina i 5%seruma

fetusa govečeta koji se inaktivira toplotom).Sudovi se inkubiraju na 37°C u CO2 inkubatoru preko noći za koje vreme se bunarčići prelivaju jedan u drugi (sa jednim udvostručavanjem, 5 x 105 ćelija po

bunarčiću). Septata intestinalis (kultura izvedena iz tkiva) organizmi se dodaju u ćelije domaćina u odnosu 3 :1 i porede se sa procenjenim ćelijama domaćina ili sa 15 x 106 organizama po bunarčiću. Ovaj odnos javlja se kod približno 50 % zaraženih ćelija domaćina).Lekovi se rastvaraju u DMSO-u, vodi i metanolu (u zavisnosti od rastvorljivosti) da bi stvorili stokovi od 1.0 mg/ ml Stokovi se čuvaju na -70oC. Razblaženja u eksperimentima su u potpunosti napravljena u medijumu za uzgajanje kulture tkiva i sva su testirana u triplikatima. Medijum se zamenjuje svaka tri do četiri dana (sadrži sveže rastvorene lekove).šestoga dana (posle dodavanja parazita i lekova), ćelije su ispitivane na toksičnost. Kontrolnim ćelijama se daju lekovi ali se ne ispituje konfluentnost parazita, morfologija ćelije i prisustvo mrtvih ili plutajućih ćelija Samo su ćelije koje su inkubirane sa parazitima ispitivane da bi se potvrdilo da su paraziti zarazni (tj. prisustvo parazitofosfornih vakuola). Samo se ispituju ćelije inkubirane sa parazitima i praćeno je delovanje tekova u odnosu na toksičnost ćelija domaćina i relativan broj parazitofosfornih vakuola (tj.viši,srednji ili niži). Desetog dana,100 p.l 10% SDS-a (0.5 % krajnja koncentracija) dodaje se u bunarčiće sa kulturama da bi se razorile membrane ćelija domaćina uz oslobadjanje mikrosporidija Ukupan broj parazita koji su prisutni u svakom bunarčiću je određjen brojanjem alikvota na hemacitometru. Rezultati su izraženi kao procenat inhibicije (koji se odnosi na inficirane ćelije koje ne daju lek). Rezultati su pokazani na crtežima 1-4.

PRIMER V

TOXOPLASMA GONDII

Nitazoksanid i dezacetil nitazoksanid su testirani protiv parazita, i još odredjenije, RH sojevi Toxoplasma gondii,održavani su pomoću serijskog pasažiranja kod miševa. Ćelijske kulture MRC5 fibroplasta (Bio-Merieux, France) koje su uzgajane na mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića su nakalemljene sa T gondii. 200 sveže uzgajenih tahizoita dodaje se u svaki od bunarčića sa kulturom,izuzev u 8 kontrolnih bunarčića ( negativni kontrolori).Posle 4 sata inkubacije, razblaženi lekovi se dodaju u kulture Nitazoksanid (NTZ) i dezacetil nitazoksanid (dNTZ) su probani u koncentracijama u opsegu izmedju 8.10-4 i 40 mg /L.Lekovi na početku rastvoreni u DMSO, u koncentraciji od 2 mg/ mL, zatim su razblaženi rastvori po redu pripremani u medijumu za uzgajanje kulture.

Nije dobijen precipitiat. Razblaženi lekovi su dodavani kulturama (8 bunarčića za svako razblaženje), zatim su ploče sa kulturama inkubirane 72h. Kulture su onda fiksirane sa hladnim metanolom. Procena rasta za T.gondii je izvršena pomoću ELISA korišćenjem peroksidaze koja obeležava anti tela T.gondii kod kunića. Vrednosti optičke gustine su zabeležene za svaki bunarčić. Rezultati su predstavljeni pomoću dobijenih ODvrednosti koje su podeljene za svaki bunarčić sa kulturom, u odnosu na koncentraciju leka u kulturi. Statističke analize koje su sadržane u regresionoj analizi sa 95% intervala sastoje se od regresione analize sa intervalom pouzdanosti od 95% i odredjivanja kriva za raspodelu doza, od ODvrednosti koje su dobijene za svaki lek. Jedna posuda se boji sa Giemsa da bi se ispitao citopatički efekat u kulturama.Izvode se tri odvojena eksperimenta. U svakom eksperimentu, dve posude sa kulturom se koriste za svako jedinjenje; u svakoj posudi sa kulturom 8 replikata koristi se za svaku koncentraciju feka.

Rezultati: Slični rezultati dobijaju se u tri niza eksperimenata.Grafički prikaz rezultata za jedan eksperiment za svaki lek pokazani su na slikama 5 a,b,c, i 6 a,b,c,.

Nitazoksanid (slike 5 a. b. c):

Nije uočen inhibitorski efekat za koncentracije u opsegu izmedju 10-4

prema Mycobacteria za 2 µg/ml i tiazoksanid ima mg/l i 0.3 mg/l. Značajan efekat je uočen za koncentracije >0.6 mg/ml,sa kompletnom inhibicijom rasta za Toxoplasmu za koncentracije >2.5 mg/L. Medjutim,uočena je znatna toksičnost ćelijskog monosloja za koncentracije >2.5 mg/L. Mikroskopsko ispitivanje monosloja pokazuje da NTZ, u koncentraciji od 1.25 mg/L izaziva citopatički efekat na ćelijama koje sadrže parazite, sa povećanjem parazitofosforne vakuole i smanjenjem broja intracelularnih parazita. Iz regresione analize, procenjeno je da pri 1.2 mg/L dolazi do 50% inhibiranja koncentracije. Deacetil nitazoksanid (Slike 7 a. b, c):

Slični rezultati su dobijeni sa deacetil nitazoksanidom: nema efekata za koncentracije u opsegu izmedju 10-4 mg/L i 0.3 mg/L, inhibicije koncentracije >0.6 mg/L i označena toksičnost za koncentracije> 2.5 mg/L.Procenjeno je da pri 1.2 mg/L dolazi do 50% inhibiranja koncentracije.Dobijeni rezultati su reproducibilni tokom tri odvojena ekseprimenta,sa procenom inhibitorskog efekta leka za ponovljene kulture za svaku koncentraciju leka. I za NTZ i za deacetil NTZ, obeležena inhibicija rasta Toxoplasme, posmatra se na koncentracijama od približno 1.2 mg/L, sa promenom parazitofosforne vakuole ali bez označene promene samog parazita. Ovi rezultati pokazuju da ovi lekovi imaju dobro dejstvo prema T.gondii i da se može očekivati terapeutski efekat in vivo na osnovu dobijanja koncentracije od približno 1 mg/L u serumu ili tkivima.

PRIMER VI

MYCOBACTERIA

Nadjeno je da nitazoksanid ima antibakterijsko dejstvo prema TB organizmima.Sledeća tabela pokazuje ogled za MIC nitazoksanid i tizoksanid prema Mycobacterium intracellular pomoću tehniike rastvaranja u agaru.Ovi rezultati zasnovani su na nekoliko eksperimenata,gde svaki postupak rastvaranja u tzv. Middlebrook agraru traje oko 3 nedelje.Dobijeni rezultati pokazuju da nitazoksanid ima MIC MIC od 4 μg/ml upotrebom standardnog soja standardnog Mycobacterium intracellular iz ATCC.korišćenjem standardnog ogleda rastvaranja u agaru.

MIC za nitazoksanid i tizoksanid za Mycobacteria intracellulare

MIC su odredjeni standardnim raz blaživanjem u agaru upotrebom Middlebrok 7H11 agara u vremenu od 3 nedelje. Za ovaj eksperiment je korišćen standardni soj M. intracellular ATCC 13950.SI. 7 je grafikon zasnovan na ogledu za procenu efikasnosti nitazoksanida u odnosu na rast mycobacterije u “ bujonu “. Koriste se MTS kolorimetrijski ogled koji dozvoljava da se odredi rast u vremenu od 4h pre nego u vremenu od 3 nedelje kao i za postupak razblaživanja agarom. Kao što se može videti iz rezultata predstavljenih u tabeli 7, kada se 72 h nakon što je kultura formirana dodaje nitazoksanid, odmah se javlja efekat vezano za kontinulani rast u poredjenju sa rastom u jedinstvenom kontrolnom medijumu. Doza od 3μg/ml nitazoksanida zaustavlja rast u naredna 2 4 h,nakon toga se u naredna 2 dana ponovo javlja usporeni rast. Doza od 5 0 μg/ml je u potpunosti bakteriostatska za kulturu u vremenu od 144 h.

PRIMER VII

CRYPTOSPORIDIUM PARVUM

Efekat nitazoksanida testira se prema Cryptosporidium parvum, kod eksperimentalno zaraženog miša. Nitazoksanid je dostupan od strane Romark Laboratories, L.C. sa sedištem u Tampi na Floridi. Ukupna doza za čoveka (1 g/dan za period od 7 dana, tj. ukupno 7g) promenjena je za upotrebu na miševima prema Paget-u i Burnsu. Humana doza se množi sa 0.0026 za primenu kod miševa (težine pribl ižno 20 g) da bi se dobila ukupna količina leka potrebna za svakog domaćina tokom svakog jutra i večeri u narednih 7 dana. Svaki miš prima 2.6 mg/dan (7000 mg x 0.0026/7). Doze su davane kroz usta upotrebom plastične brizgalice sa okrugim vrhom. Dvadesetoro (20) odojčadi miševa starih 2 dana zaraženi su oralnim putem davanjem 100.000 ocista Cryptosporidium parvum koji su dobijeni od zaraženog govečeta. Pre primene na m iševe, očiste se koncentruju korišćenjem šećernog rastvora prema tehnikama opisanim od strane Fayer & Ellis. Uzimani su analni brisevi svakog od miševa i ispitivani su dnevno korišćenjem modifikovane tehnike bojenja po Niehl-Nilsenu koja je opisana odstrane Graczyk i dr. Košuljice od ocista se javljaju u izmetu 2 dana nakon što su životinje zaražene. Trećeg dana nakon infekcije životinja, tokom jutra i večeri u narednih 7 dana, 10 miševa je primilo 1.3 mg nitazoksanida, dok su preostalih 10 miševa čuvani, kao nelečeni kontrolni uzorci. Analni brisevi se dobijaju na dnevnoj bazi tokom 7 dana do kraja tretmana. Očiste su suspenduju u ulju da bi se izvršilo njihovo prebrojavanje na 100 polja pod mikroskopom.

Rezultati:

Rezultati pokazani u sledećoj tabeli jasno pokazuju da je nitazoksanid koji je davan u vidu dnevne doze od 2.6 mg/dan tokom 7 uzastopnih dana efikasan prema Cryptosporidium parvum u smanjenju broja ocista u izmetu inficiranog miša kada se uporedi sa kontrolnim životinjama. Primenom probnog leka snižava se broj košuljica ocista u 6 od 10 miševa, koji su podvrgnuti tretmanu na kraju trećeg dana lečenja. Sedmog dana na kraju tretmana, javlja se potpuno smanjenje broja košuljica ocista, sve tretirane životinje imaju negativno prisustvo ocista u stolici kada se porede sa kontrolnim miševima koji nisu bili podvrgnuti tretmanu. Ovaj efekat traje najmanje 7 dana po tretmanu kao što je pokazano ispitivanjima koja nisu pokazala prisustvo ocista 3 i 7 dana nakon završetka tretmana.

PRIMER VIII

MYCOBACTERIUM

Nitazoksanid se poredi sa izoniazidnim antibioticima. U protokolu se kao soj mikobakterija koriste BCG (Bacille de Calmette et Guerin). Osetljivost ovog sloja je ista kao i za M tuberculosis, ali je ovaj soj manje štetan i stoga nije potreban viši nivo odbrane upotrebom sredstva za tuberkulozu. Davana je količina od 4mg/na dan u 0.2 ml suncokretovog ulja po mišu. Rezultati kod miševa tretiranih mtazoksanidom mogu da se porede sa grupom primljenih izoniazida.

PRIMER IX

FASCIOLA HEPATICA

Efikasnost in vitro za nitazoksanid i dezacetil-nitazoksanid testirana je prema Fasciola Hepatica. Odrasla F. hepatica dobijena je iz žučnih kanala jetre tri govečeta koja su proglašena bolesnim na osnovu fasciolosis-a (genoma trematode koja živi u jetri) u laboratoriji za medicinsku dijagnostiku u veterini, u Lujzijani kod Hardy’s Meat Packers, Bunkie, LA. Trematode su ispirane u sterilnom sonom rastvoru 1h i prenesene u sterilan rastvor RPMI (pH 7.4) dodatna 3 h. Trematode su čuvane u sterilnom ,RPMI-serumu kunića (50 :50 v/v) ili sterilnom RPMI (pH 7.4) preko noći na 37 °C sa 5 % CO2. Na osnovu izmenjenog postupka od Ibarra i Dženkinsa (Z. Parasitenkd. 70 :655-661,1984) dobijena je kultura in vitro (37 °C CO2). Korišćenjem tehnike u sterilnim uslovima, trematode su ispirane dva puta u vremenu od 2-3 minuta u Henksovom uravnoteženom rastvoru soli (pH 7.2) i nanošene su pojedinačno na Linbro ploče (za kulturu) sa 6 bunarčića koja sadrži 10 ml alikvota označenih razblaženih rastvora lekova na podlozi za gajenje kulture. Potonji se sastoji od sterilnog RPMI-seruma kunića (50 : 50 v/v) sa 2% serumom kunića plus 100 ppm penicilina i 100 ppm streptomicina. Korišćene su samo one trematode koje su imale normalnu aktivnost i morfologiju. Zalihe rastvora NTZ ili njegovog D-NTZ metabolita nabavljene od strane Romark, rastvorene su u DMSO(2000 μg/ ml) i razblažene na podlozi za gajenje kulture, korišćenjem volumetrijskih balona od 100 ml, da bi se dobile specifične koncentracije leka ( 100, 50, 25, 10, 5, 3, 1 μg/ml). Dve uzorka trematoda koje su služila za kontrolu, bila su uključene u svaki replikat, jedan na podlozi za gajenje kulture sa RBC koja nije bila natopljena lekovima i jedna na podlozi za gajenje kulture sa RBC koja nije bila natopljena lekovima. Ispitivano je delovanje leka na trematode.

Efekat lečenja je procenjivan sa jedne strane na osnovu smrtnosti, ograničene pokretljivosti i sa druge strane na osnovu morfoloških promena u poredjenju sa kontrolnim trematodama, korišćenjem panela osvetljenog sa pozadinskim svetlom i osvetljenog sočiva sa trostrukim uvećanjem.

Rezultati :

Eksperiment 1 :

Za D-NTZ, trematode u tretmanima od 50 i 100 μg su na umoru ili su mrtve tokom jednog sata. 4 od 7 parazita iz roda trematoda sa tretmanom od 25 (ig su-.pa umoru, dva su aktivna, i jedan tromi parazit ostaje živ posle četiri sata. Na 10 μg, uočena je smanjena aktivnost na 1,3 ili 4 časa i svi su na umoru ili mrtvi za 7 h. Smanjena aktivnost kod nekih individua se vidi za 24 h u grupama od 5 mg i 3 μg sa nešto sporijim početkom na 3 μg ; za 50h sve su mrtve u posudama za tretman od 3 μg i 5^g, izuzev jednog usporenog parazita u svakoj grupi. Uočeno je neko usporavanje aktivnosti u grupi od 1mg na 42-74 h i samo 3 aktivna i jedan parazit koji je na umoru ostaju živi za 91 h; za 115 sati preostaje samo jedan usporeni parazit u grupi od 1 / g. Posmatrana j e smrtnost u kontroli sa RBC grupom za 66 h ( jedan parazit), 91 h ( jedan parazit) i 115 h (četiri parazita). Kod kontrole bez RBC grupe, svi su živi za 91 h i jedan je umro posle 115 h.

Eksperiment 2:

Za NTZ, uočena je nešto veća aktivnost za ranije efekte u odnosu na ukupan rezultat pokretljivosti i smrtnosti u osam replikata u poredjenju sa rezultatima za D-NTZ. U grupama od 100, 50 i 25 μg svi paraziti su mrtvi ili skoro mrtvi u vremenu od 1 h, izuzev jednog parazita iz grupe od 25 μg koji je uginuo za tri sata. Smanjenje pokretljivosti koje je izazvano davanjem leka u dozama, može se videti u svakoj od ostalih grupa koje su lečene lekovima nakon sat vremena. U 10 μg, samo je jedan parazit opstao 16 h. U grupi od 5 μg, samo su tri parazita aktivna posle šest sati i nijedan nije ostao aktivan nakon 16 h. Po isteku 23 h, samo 2 usporena parazita u grupi od 3 μg ostaju živa, oni umiru po isteku 41 h. Za grupu od 1 mg/ I, jedan parazit umire posle 16 h, tri posle 41 h i pet posle 74 h ; 3 parazita ostaju aktivna posle 91 h i jedan parazit ima aktivnost posle 115 h. Smrt parazita u grupama sa visokim dozama (25, 50, 100 mg) je bila brza i udružena sa kontrakcijom i “uvijanjem trbuha". Pri nižim nivoima davanja leka, većina parazita je usporena za neko vreme i mnogo su opuštenije kada su mrtve ili skoro mrtve. Kontaminacija postaje ograničena eksperimentalnim rezultatima kod nekih replikata počev od 91. Za D-NTZ eksperiment, glavni bakterijski i fungicidalni prekomerni rast i koji prati smrtnost u dva tanjira za replikaciju se javlja posle 115 h. Za NTZ eksperiment, prekomerni rast i smrtnost parazita u nepomešanim tanjirima za replikaciju se javlja posle 91 ( dva replikata) i 115 h (5 replikati). 139 sati posmatranja se ne smatraju validnim zbog

generalne kontaminacije najvećeg broja tanjira.

Zaključci :

Snažna efikasnost nitazoksanida kod parazita je utvrdjena eksperimentima sa obadva testirana leka. Nešto veća aktivnost u uništavanju parazita je posmatrana protiv F. hepatica, za nitazoksanid a zatim za dezacetil-nitazoksanid, glavni metabolit, koji treba da je aktivan na nivou jetre. Brza smrt parazita se javlja za 1h u in vitro D-NTZ opsegu davanja leka >50 μg, za 4 sata na 25 mg i 6-7 sata na 10 mg. Deset μg.može da bude opseg isporuke proleka kroz odgovarajući jednokratni tretman ukoliko farmakokinetički rezultat pokazuje da je nivo tkiva održavan > 6-8 sati po pojedinačnom tretmanu.Snažna aktivnost usmrćivanja parazita od 74 h ( tri dana ) je posmatrana za oba jedinjenja u opsegu davanja leka u dozama od 3 i 5 μg.

Produženi opstanak, koji nije jednak za kontrolne parazite koji nisu lečeni lekovima, posmatran je na nivou davanja leka u dozama od 1 μg; isporuka ovih nivoa leka parazitima u tkivima jetre u vremenu od 3 do 4 dana može zato imati neodgovarajući terapeutski efekat na parazite.

PRIMER X

FASCIOLA GIGANTICA

Nitazoksanid je testiran protiv nesazrelih i odraslih Fasciola gigantica u kunićima koji su zaraženi u eksperimentu. Učaurene larve Fasciola gigantica (EMC) su sakupljane na listu celofana 28-35 dana posle infekcije puža L. callmji od strane larve Fasciola gigantica koja se izležu iz jaja parazita korišćenjem tehnike opisane od Abdel-Gani kada su puževi dnevno bili izloženi veštačkom svetlu, 30 min u čistoj dehlorinizovanoj vodi iz česme. Rezultujuće učaurene larve (EMC)čuvane

su na 4°C u frižideru 5 do 8 dana ispod površine vode sve dok su korišćene za inficiranje eksperimentalnih životinja, četrdeset (40) Boscat kunića, od koji svaki ima težinu od 1.5 do 2 kg, uključeni su u studiju i dodeljeni su dvema tretiranim grupama od 20 životinja, životinje iz grupe 1 zaražene su oralno sa 35-40 učaurenih larvi zavijenih u list salate i nakon toga su gurnute na vrh jezika životinja Usta životinja su držana zatvorenim pomoću ruke sve dok one nisu sažvakale učaurene larve. Ova grupa životinja obeleležena kao 1 koristi se za testiranje efikasnosti mtazoksanida prema nezrelim larvama (starih 4-5 nedelja) Fasciola gigantica.životinje iz grupe 2 su oralno inficirane kako je ranije naznačeno sa 10-15 učaurenih larvi i korišćene su za testiranje efikasnosti nitazoksanida prema parazitima (> 10 nedelja starosti). Deset životinja iz grupe 1 koje su tokom jutra i večeri, primale 35 mg nitazoksanida, tokom 7 uzastopnih dana, četiri nedelje nakon njihove infekcije u nezrelom stadijumu ciklusa parazita. Deset preostalih životinja u grupi 1 su sačuvane kao kontrolne, tj. nisu podvrgnute tretmanu. Deset životinja iz grupe 2 koje su tokom jutra i večeri, primale 35 mg nitazoksanida, tokom 7 uzastopnih dana, četiri nedelje nakon njihove infekcije u odraslom stadijumu parazita. Deset preostalih životinja u grupi 2 su sačuvane kao kontrolne, tj. nisu podvrgnute tretmanu. Sve životinje su hranjene suvim obrocima sve do kraja eksperimenta. Sedam dana po davanju zadnje doze nitazoksanida, svi zečevi iz svake grupe su bili žrtvovani. Ispitivana je površina jetre na prisustvo nekrotičnih migrirajućih brazdi naročito onih u nezreloj fazi ciklusa parazita. Ove nekrotične oblasti su ispitivane korišćenjem dve hirurške igle da bi,.se izvukli premešteni juvenilni paraziti prema tehnici opisanoj od strane EI-Bahy-a. Jetre su isečene u male komade naročito oko migrirajućih brazdi i potopljene su pod mikroskopom da bi se izvukli postojeći paraziti. Abdominalna šupljina i crevne površine su ispirane sa toplom vodom. Voda se onda sakuplja, prosejava i ispituje radi identifikacije juvenilnih parazita. Svi sakupljeni paraziti kao i njihovi delovi brojani su i kod tretiranih i netretiranih životinja u obe grupe 1 i 2. živi paraziti se pojavljuju kao obojene glave čiode, jasno pokazujući netaknute delove opne, koji se lako izvlače iz tkiva jetre korišćenjem tople vode, dok mrtvi paraziti gube sivu boju i pokazuju napuklu nekrotičnu površinu. Efikasnost nitazoksanida se izračunava korišćenjem formule koja je pokazana dole:

% efikasnosti a-b x 100 a

gde je: a= broj parazita dobijenih iz izmeta kontrolnih životinja b= broj parazita dobijenih iz izmeta tretiranih životinja Rezultati

Kao što je naznačeno u tabeli 7, rezultati studije pokazuju značajno smanjenje u broju nezrelih larvi parazita dobijenih iz jetre kunića u tretiranoj grupi u odnosu na kontrolnu grupu. Prosečni procenat smanjenja izračunat je na 46.77% (opseg: 40-60%).

Tabela 7: Efikasnost nitazoksanida prema nezrelim larvama (starosti 4 nedelje) F. gigantica u eksperimentalno zaraženim kunićima

Na samom početku razvijenog stadijuma infekcije, nitazoksanid pokazuje kompletan efekat (100 %smanjenje) i ne mogu se videti crv nakon ispitivanja jetre tretiranih kunića u poređjenju sa kontrolnim životinjama koje nisu lečene, kao što je pokazano u tabeli 8.

Tabela 8. Efikasnost nitazoksanida prema (starosti 10 nedelja) F.

gigantica u ranom stadijumu kod eksperimentalno zaraženih kunića

Nitazoksanid koji je davan u dozama od 70 mg/ na dan za 7 uzastopnih dana, umereno je efikasan u odnosu na nezrele larve Fasciola g jantica i u potpunosti je efikasan prema larvama parazita u ranom stadijumu.

PRIMER XIII SCHISTOSOMA

Nitazoksanid je testiran prema Schistosoma mansoni i Schistosoma hematobium na eksperimentalno zaraženom mišu. četrdeset (40) belih miševa, teških od 30 do 50 g, smešteni su u dve grupe odredjene za tretman sa po 20 životinja po grupi. Prva grupa je zaražena sa 300-500 larvi Schistosoma mansoni koje su suspendovane u 0.25 ml destilovane vode i koje su davane interperitonealnim ubrizgavanjem svakom mišu. Druga grupa je zaražena na isti način ali sa larvama Schistosoma hemotobium. Ove dve grupe su nakon toga čuvane ukupno 70 dana u laboratoriji.

Sedamdeset dana nakon infekcije životinja, deset m iševa iz svake grupe se tretira sa dozom od 1,3 mg nitazoksanida koja se daje oralno, tokom jutra i večeri u narednih 7 dana. Sedam dana nakon završetka tretmana, veliki miševi su žrtvovani i gliste su polivanjem izvadjene iz jetre svake od životinja korišćenjem mlake vode (37°). Izbrojane su izolovane šistozome za sve tretirane i kontrolne životinje. Efikasnost nitazoksanida se izračunava korišćenjem formule koja je pokazana dole:

gde je: a= broj šistozoma dobijenih iz izmeta kontrolnih životinja b= broj šistozoma dobijenih iz izmeta tretiranih životinja

Rezultati

Rezultati prikazani u tabelama 9 i 10, jasno pokazuju daje nitazoksanid koji se daje u dnevnim dozama od 2.6 mg/ na dan tokom 7 uzastopnih dana efikasniji prema Schistosoma hematobium gde je posmatrano smanjenje broja glista od 82 85% u poredjenju sa kontrolnim životinjama dok prema Schistosoma mansoni smanjenje broja glista dostiže samo 59.91% u odnosu na kontrolne miševe. Ovi rezultati su saglasni sa izveštajem Abaza i dr., kod pacijenata gde nitazoksanid nije bio efikasan prema S. mansoni kako je pokazano proračunom za broj jaja posle tretmana nitazok,sanidom.

Claims (20)

1. Farmaceutska kompozicija koja kao aktivno sredstvo sadrži barem jedno jedinjenje koje je odabrano iz grupe koju čine: jedinjenje formule (I) i jedinjenje formule (II) i koja dalje sadrži stabilnu količinu farmaceutski prihvatljive kiseline.

2.    Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je farmaceutski prihvatljiva kiselina odabrana iz grupe koju crne limunska kiselina, glutaminska kiselina, ćilibarna kiselina, etansulfonska kiselina, sirćetna kiselina, vinska kiselina, askorbinska kiselina, metansulfonska kiselina, fumarna kiselina, adipinska kiselina, jabučna kiselina kao i njihove smeše.

3.    Kompozicija prema patentnom zahtevu 2, naznačena time, što je pomenuta farmaceutski prihvatljiva kiselina, limunska kiselina.

4.    Kompozicija prema patentnom zahtevu 2, naznačena time, što je pomenuta farmaceutski prihvatljiva kiselina, askorbinska kiselina.

5.    Farmaceutska kompozicija koja kao aktivno sredstvo sadrži jedinjenje formule II i farmaceutski prihvatljivu kiselinu u količini koja je dovoljna da bi se održao pH pomenute farmaceutske kompozicije izmedju 2 i 6, gde j e pomenuta farmaceutska kompozicija dovedena u kontakt sa vodom, gde je aktivno sredstvo u obliku čvrstih čestica, i gde je odnos težine farmaceutski prihvatljive kiseline prema težini pomenutih čvrstih čestica izmedju 0.01 i 0.5.

6.    Kompozicija prema patentnom zahtevu 5, naznačena time, što je odnos težine farmaceutski prihvatljive kiseline prema težini pomenutih aktivnih čestica izmedju 0.03 i 0.2.

7. Kompozicija prema patentnom zahtevu 2, naznačena time, što se pomenuta kompozicija nalazi u čvrstom doznom obliku, i gde su pomenute aktivne čestice granulisane u prisustvu najmanje jednog aktivnog sredstva da bi se formirale granulisane aktivne čestice u čvrstom stanju.

8. Kompozicija prema patentnom zahtevu 5, naznačena time, što se pomenute aktivne čestice pre granulisanja imaju veličinu manju od 200 μg i gde je srednja vrednost čestice veća od 10 μg.

9.    Kompozicija prema patentnom zahtevu 8, naznačena time, što je srednja vrednost veličine čestice kod pomenutih aktivnih čestica izmedju 10 μg i 100 μg.

10.    Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time, što je sredstvo za granulaciju odabrano iz grupe koju čine polivinilpirolidon, voda, alkohol, saharoza,. hidroksil celuloza i njihova smeša.

11.    Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time, što je kod pomenutih granulisanih aktivnih čvrstih čestica, odnos težine farmaceutski prihvatljive kiseline u odnosu na težinu aktivnog sredstva izmedju 0.01 i 0.5.

12.    Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time, što je farmaceutski prihvatljiva kiselina odabrana iz grupe koju čine limunska kiselina, glutaminska kiselina, ćilibarna kiselina, etansulfonska kiselina, sirćetna kiselina, vinska kiselina, askorbinska kiselina, metansulfonska kiselina, fumarna kiselina, adipinska kiselina, jabučna kiselina kao i njihove smeše.

13. Kompozicija prema patentnom zahtevu 2, naznačena time, što je pomenuta kompozicija u obliku suspenzija čvrstih čestica od barem jednog jedinjenja formule I i formule II u tečnom stanju.

14. Kompozicija prema patentnom zahtevu 13, naznačena time, što su pomenute aktivne čestice pre formiranja pomenute suspenzije bile granulisarte u prisustvu najmanje jednog sredstva za granulisanje da bi se formirale granulisane aktivne čestice u čvrstom stanju.

15. Kompozicija prema patentnom zahtevu 13, naznačena time, što je pomenuta tečnost voda.

16. Kompozicija prema patentnom zahtevu 13, naznačena time, što je pH pomenute suspenzije izmeđju 2 i 6.

17. Kompozicija prema patentnom zahtevu 13, naznačena time, što je pH pomenute suspenzije izmediu 3 i 5.

18. Kompozicija prema patentnom zahtevu 2, naznačena time, što je pomenuta kompozicija u obliku paste koja obuhvata aktivne čestice barem jednog jedinjenje formule I i formule II, sredstvo za kvašenje i sredstvo za zgušnjavanje.

19.    Kompozicija prema patentnom zahtevu 18, naznačena time, što je pomenuta farmaceutski prihvatljiva kiselina odabrana iz grupe koju čine limunska kiselina, glutaminska kiselina, ćilibarna kiselina, etansulfonska kiselina, sirćetna kiselina, vinska kiselina, askorbinska kiselina, metansulfonska kiselina, fumarna kiselina, adipinska kiselina, jabučna kiselina kao i njihove smeše.

20. Kompozicija prema patentnom zahtevu 18, naznačena time. što pomenute aktivne čestice imaju veličinu koja je manja od 200 µm, gde manje od 10% težine pomenutih čestica imaju veličinu koja je veća od 100 µm, gde manje od 50% od pomenutih čestica ima veličinu manju od 50 µm i gde manje od 10% pomenutih čestica ima manju veličinu od 5 µm