SK283946B6

SK283946B6 - Farmaceutické kompozície tizoxanidu a nitazoxanidu

Info

Publication number: SK283946B6
Application number: SK1511-99A
Authority: SK
Inventors: Jean-Fran�Ois Rossignol
Original assignee: Romark Laboratories, L.C.
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2004-05-04
Also published as: KR20040004544A; UA57079C2; AU740022B2; KR100576646B1; NO335781B1; HK1025907A1; DE69809928T2; SK283947B6; EP1005342A4; UA74388C2; GEP20032970B; IL155799A; SI20149B; NO20021832L; AU7289598A; NO20021832D0; BR9808722A; CA2288003A1; CZ298270B6; IL155799A0

Abstract

Farmaceutická kompozícia obsahujúca ako aktívnu zložku najmenej jednu zlúčeninu zvolenú zo skupiny, ktorú tvorí zlúčenina vzorca (I) a zlúčenina vzorca (II). Aktívna zložka je výhodne vo forme častíc s veľkosťou častice menšou ako 200 um a stredná veľkosť častíc je väčšia než 10 um. Farmaceutické kompozície sa výhodne stabilizujú najmenej jednou farmaceuticky prijateľnou kyselinou. Farmaceutické kompozície sú zvlášť použiteľné pri liečbe oportúnnych infekcií osôb s oslabeným alebo suprimovaným imunitným systémom a pri liečbe infekcií motolicou.ŕ

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka farmaceutickej kompozície, zvlášť použiteľnej pri liečbe oportúnnych infekcií osôb s oslabeným alebo suprimovaným imunitným systémom a pri liečbe infekcii motolicami (trematódami).

Doterajší stav techniky

Existuje naliehavá potreba vývoja spôsobov liečby početných parazitámych a bakteriálnych infekcii osôb s oslabeným imunitným systémom (AIDS, karcinóm, staršie osoby, choroby starnutia, príjemcovia imunosupresívnych liečiv po transplantácii orgánov). Inou oblasťou záujmu sú infekcie motolicou, obzvlášť v tropickom podnebí. Preto tu je potreba farmaceutickej kompozície, ktorú by znášali aj imunitné oslabené osoby a ktorá by bola skladovateľná aj v tropickom prostredí.

Špecificky prvok Toxoplasma gondii je medzi prevládajúcimi príčinami latentných infekcií centrálneho nervového systému vo svetovom meradle. Týmto parazitom je infikovaných veľa zdravých ľudí, ale obvykle ich imunitný systém udrží organizmus pod kontrolou. Toxoplasma gondii je najobvyklejším oportúnnym patogénom mozgu pacientov trpiacich AIDS. V dnešnej dobe sa toxoplazmóza stáva stále väčším problémom nielen kvôli AIDS, ale aj vplyvom rastúceho používania imunosupresívnych liečiv (podávaných napríklad pacientom po transplantácii orgánov). Toxoplazmóza sa obvykle lieči kombináciou pyrimethaminu a sulfadiazínu. Sú to účinné lieky, ale nezabíjajú cysty parazita, takže liečba musí pokračovať pri udržiavacích dávkach. Toxicita si často vynúti vysadenie lieku, zvlášť pri ľuďoch imunosuprimovaných (prijímajúcich imunosupresívne lieky) a nasleduje recidíva. Štatistika preto nie je priaznivá pri uvádzanej úmrtnosti asi 70 % pri imunodeficientných pacientov a priemernom prežívaní štyri mesiace.

Kryptosporidióza je spôsobená mikroskopickým parazitným prvokom Cryptosporidium parvum. Pri osobách s normálnou imunitou môže byť hnačka spôsobená týmto prvokom prudká a dlhá, ale dočasná (self-limiting). Pri pacientoch trpiacich AIDS kryptosporidiálna hnačka často ohrozuje ich život. Odhaduje sa, že z pacientov AIDS asi 15-20 % trpí týmto ochorením. Až dosiaľ neexistuje žiadna trvalo účinná alebo osvedčená terapia kryptosporidiózy.

Pri pacientoch trpiacich AIDS bol najčastejšie identifikovaný ako patogén Enterocytozoon bieneusi, parazitná mikrosporídia nájdená pri takmer jednej štvrtine pacientov. Teraz sa zdá, že tento drobný parazit môže byť označený ako príčina značného podielu mnohých nevysvetlených prípadov porúch trávenia, hnačky a telesného chátrania nositeľov HIV. Žiadna účinná liečba dosiaľ neexistuje.

HlV-pozitívne osoby infikuje niekoľko ďalších druhov mikrosporídií vrátane Encephalitozoon heliem a cuniculi a nový druh označený ako Septata intestinalis. Nedávna správa zisťuje, že infekcia diseminovanými mikrosporídiami v súčasnosti nadobúda na význame.

Od kryptosporidiózy je klinicky neodlíšiteľná infekcia parazitom lsospora belli. Je známy skôr v tropickom pásme a v USA bol nájdený pri menej ako 1 % pacientov, aj keď jeho skutočný výskyt je pravdepodobne vyšší.

Pneumocyslis carinii sa všeobecne zaraďuje ako parazitný prvok; niektoré práce však uvádzajú, že by mohol patriť medzi fungi (huby), s ktorými zdieľa určité genetické sekvencie. Pneumocystis carinii obvykle infikuje pľúca (Pneumocystis Carinii Pneumonia (PCP) - zápal pľúc spôsobený P.c.). Uvádza sa, že liečba je úspešná pri 40 - 60 % pacien toch, pričom však sú problémy s toxicitou lieku zvlášť pri imunitne oslabených pacientoch. Medzi mnohými vážnymi prípadmi infekcie deti vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV) zaujíma PCP výnimočné postavenie vplyvom svojho vysokého výskytu, ojedinelého rozloženia podľa veku a častej úmrtnosti. PCP je najbežnejšia vážna oportúnna infekcia detí infikovaných HIV; výskyt PCP medzi malými deťmi infikovanými HIV bez profylaktického ošetrenia je odhadovaný na najmenej 12 % v prvom roku života. Veľa detí umiera krátko po rozvinutí choroby PCP.

Mycobacterium Avium Complex (MAC) patrí k infekciám, ktoré spôsobuje čeľaď veľmi podobných mykobakteriálnych mikroorganizmov Mycobacterium avium a Mycobacterium intracellulare. Pokiaľ sa vyskytuje pri ľuďoch imunitné neoslabených, je obvykle vo forme infekcie dýchacieho ústrojenstva. Pri pacientoch trpiacich AIDS je MAC obvykle diseminovaný (diseminovaný MAC alebo DMAC) a takmer každý orgán môže byť zasiahnutý. V nedávnom výskume sa zistilo, že baktérie MAC boli nájdené pri 43 % pacientoch, ktorí prežili 2 roky po diagnostikovaní AIDS. Pre diseminovaný MAC nebola nájdená žiadna štandardná terapia. Obvykle sa predpisujú kombinácie liekov, a ak sú úspešné, vyžaduje sa ich doživotné podávanie. Naliehavo je potrebný účinnejší spôsob liečby.

Osoby nakazené HIV sú zvlášť náchylné k infekciám Mycobacterium tuberculosis a priebeh choroby sa urýchľuje. Zatiaľ čo pri osobách neinfikovaných HIV je extrapulmonáma tuberkulóza neobvyklá, pri HlV-pozitívnych osobách sa často vyskytuje. CDC zverejnila smernice na liečbu TBC, ktoré zohľadňujú rastúci výskyt tuberkulózy odolnej proti širokému spektru liečiv (MDR-TB). Úmrtnosť medzi pacientami AIDS s MDR-TB je veľmi vysoká (asi 80 %) a postup choroby je extrémne prudký.

Preto existuje naliehavá potreba vývoja nových spôsobov liečby týchto infekcií, ktoré sú pri ľuďoch i zvieratách tak časté a trvalo ich ohrozujú.

Tiež existuje potreba mať k dispozícii širokospektrálne lieky na zjednodušenie liečby infekcií spôsobených motolicou (trematóda). V súčasnej dobe je nutné diagnostikovať špecifickú patogénnu motolicu a predpísať liekovú terapiu špecifickú pre danú motolicu. Veľa menej vyvinutých krajín nie je vybavených prostriedkami na diagnostikovanie špecifickej motolice. Nájdenie lieku so širokou pôsobnosťou by odstránilo potrebu tejto diagnózy.

Schistosoma mansoni, krvná motolica, je pôvodcom schistosomiázy, druhej najvýznamnejšej tropickej parazitámej choroby ľudí po malárii, a najdôležitejšou infekciou motolicou pri ľuďoch. Schistosoma haematobium je iný významný druh infikujúci človeka. Vo svetovom meradle trpí schistosomiázou viac ako 200 miliónov ľudí vrátane niekoľko sto tisíc osôb v USA.

Fasciola hepatica, bežná pečeňová motolica, je predovšetkým chorobou oviec, ale človek býva náhodným hostiteľom. Tento parazit dokáže prežiť aj pri silnej imunitnej odozve hostiteľa. Na liečbu sa ponúka bithionol, ktorý však nie je v Spojených štátoch schválený.

Preto pretrváva potreba farmaceutickej kompozície s dlhou skladovateľnosťou aj v tropických podmienkach a so širokou pôsobnosťou proti motoliciam.

Podstata vynálezu

Hlavným predmetom vynálezu je farmaceutická kompozícia obsahujúca ako aktívnu zložku najmenej jednu zlúčeninu vybranú zo skupiny, ktorú tvorí zlúčenina vzorca (I)

a zlúčenina vzorca (II)

pričom aktívna zložka je v podobe častíc veľkosti pod 200 pm a stredná veľkosť častice je väčšia než 5 pm.

Vynález sa tiež týka farmaceutických kompozícií stabilizovaných najmenej jednou farmaceutický prijateľnou kyselinou.

Teraz bolo pozorované pri výskumoch na zvieratách a pri klinických výskumoch na ľuďoch, že účinnosť liečby s použitím zlúčenín vzorca (I) a (II) závisí od veľkosti častice aktívnej zložky lieku a od stability zlúčeniny.

Opísané farmaceutické kompozície sú vhodné na liečbu nákaz ľudí a zvierat motolicou spôsobených patogénmi Schistosoma ako napríklad Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma mekongi, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum; patogénmi Fasciola ako napríklad Fasciola hepatica a Fasciola gigantica, Fasciolopsis biski; a Dicrocoelium dendriticum, Heterophyes heterophyes a Metagonimus yokogawa.

Farmaceutické kompozície sú tiež účinné pri liečbe imunooslabených pacientov trpiacich oportúnnymi infekciami patogénmi Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Enterocytzoon bineusi, Encephalitozoon intestinalis, Mycobac.terium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii a Toxoplasma gondii.

Farmaceutická kompozícia môže byť vo forme vhodnej na orálne podanie, ako pevná dávkovacia forma, kvapalná suspenzia alebo ako pasta.

Na lepšie porozumenie podstaty a predmetu tohto vynálezu by bolo užitočné odkázať na nasledujúci podrobný opis, ktorý je treba vnímať s pripojenými obrázkami, v ktorých: Obrázok 1: ukazuje percentá inhibície a prežívania buniek hostiteľa pri aplikácii nitazoxanidu proti E. intestinalis. Obrázok 2: ukazuje percentá inhibície a prežívania buniek hostiteľa pri aplikácii nitazoxanidu proti V. corneae. Obrázok 3: ukazuje percentá inhibície a prežívania buniek hostiteľa pri aplikácii albendazolu proti E. intestinalis. Obrázok 4: ukazuje percentá inhibície a prežívania buniek hostiteľa pri aplikácii albendazolu proti V. corneae. Obrázok 5 a 6: ukazuje hodnoty optickej hustoty získané pre každú kultivačnú jamku vynášané proti koncentráciám lieku v kultúre.

Obrázok 7: je graf založený na zisťovaní účinnosti nitazoxanidu proti mykobaktérii pomnoženej v kvapalnom živnom bujóne.

Obrázok 8: ukazuje percento aktívnych častíc s objemom menším než 0 pm.

Spôsob liečby infekcii podľa tohto vynálezu zahrnuje podávanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej ako aktívnu zložku najmenej jednu zlúčeninu vybranú zo skupiny, ktorú tvorí desacetylnitazoxanid vzorca (I)

OH

a nitazoxanid vzorca (II)

Nitazoxanid (NTZ), zlúčenina so vzorcom (II), je genetický názov 2(acetyloxy)-N-(5-nitro-2-tiazolyl)benzamidu, zlúčeniny, ktorú po prvý raz syntetizovali Rossignol a Cavier v r. 1975; 2 mg nitazoxanidu možno rozpustiť v 1 ml DMSO. Nitazoxanid sa ľahko vstrebáva pri orálnom podaní.

Až dosiaľ nebol podaný dôkaz, že zlúčeniny vzorca (I) a/alebo (II) by mohli byť v širokom rozsahu účinné proti infekciám spôsobeným motolicami alebo že by boli dostatočne netoxické, aby ich znášali aj imunooslabené osoby.

Príprava a určité použitia pre nitazoxanid sa opisujú v patente USA 3,950.351 a v prácach publikovaných prihlasovateľom. Desacetylnitazoxanid, zlúčenina vzorca (I), sa niekedy uvádza ako tizoxanid alebo d-NTZ a je metabolitom nitazoxanidu.

V patente WO 95/28393 opísal prihlasovateľ spôsob prípravy čistej zlúčeniny vzorca (II) i použitie kompozície obsahujúcej zmes zlúčenín vzorca (I) a (II).

Teraz bolo pozorované, že pevné častice zlúčeniny vzorca (I), zlúčeniny vzorca (II) alebo ich zmesí s veľkosťou častíc medzi 170 a 520 pm (stredná veľkosť častice = = 352 pm) majú veľmi obmedzenú účinnosť pri orálnom podávaní ľuďom alebo zvieratám. Účinnosť takých častíc je menšia ako účinnosť existujúcich farmaceutických produktov a preto je na komerčné účely neprijateľná.

Na psoch tiež bolo pozorované, že orálne podávanie jednotlivej dávky 50 mg pevných častíc zlúčeniny vzorca (I) a zlúčeniny vzorca (II) s veľkosťou častíc pod 5 pm na kg hmotnosti psa spôsobilo zvieratám závažné nepriaznivé následky.

Teraz sa zistilo, že ak má byť zaistená účinná a bezpečná liečba infekcií spôsobených ľuďom i zvieratám parazitmi, baktériami, hubami a vírusmi, musí farmaceutická kompozícia, či už v pevnej dávkovacej forme, alebo kvapalnej suspenzii obsahovať účinnú dávku aktívnej zložky vo forme pevných častíc obsahujúcich zlúčeninu vzorca (1) a/alebo vzorca (II) s veľkosťou častice menšou než 200 pm, pričom stredná veľkosť častice aktívnych pevných častíc je väčšia než 10 pm.

Prítomnosť vysokého obsahu častíc aktívnej zložky s veľkosťou väčšou než 200 pm vzhľadom na obsah častíc veľkosti medzi 5 a 200 pm významne znižuje chemoterapeutickú aktivitu zlúčenín. Je výhodné, keď farmaceutické kompozície podľa vynálezu neobsahujú viac než 5 % hmotnostných aktívnych pevných častíc veľkosti väčšej než 200 pm. Najvýhodnejšie je, keď farmaceutické kompozície podľa vynálezu neobsahujú prakticky žiadne aktívne pevné častice s veľkosťou väčšou než 200 pm.

Prítomnosť vysokého obsahu častíc aktívnej zložky s rozmerom pod 5 pm vzhľadom naobsah častíc s rozmermi medzi 5 a 200 pm môže vyvolať pri zvieratách alebo pri ľuďoch záporné účinky. Okrem toho sa zistilo, že častice s rozmermi pod 5 pm sú rýchlejšie vstrebávané zo zažívacieho traktu do krvného obehu a preto nie sú dostatočne účinné proti parazitom, baktériám, hubám a vírusom v zažívacom trakte zvierat a ľudí.

Ani skúsení vedci nemohli predvídať, že veľkosť častice zlúčeniny vzorca (I) a zlúčeniny vzorca (II) by mohla mať taký významný dopad na ich antimikrobiálnu aktivitu pri liečbe zvierat a ľudí. Napríklad pri výskumoch uskutočňovaných prihlasovateľom nemali antiparazitické zlúčeniny ako albendazol, mebendazol, niklosamid, praziquantel a metronidazol tak výrazný rozdiel antiparazitickej aktivity pri liečbe zvierat a ľudí v závislosti od ich veľkosti častíc. Okrem toho by ani skúsený vedec nemohol predvídať, že rozmery častíc zlúčeniny vzorca (í) a zlúčeniny vzorca (II) by mali taký nepriaznivý dopad na schopnosť zvierat a ľudí znášať podávanie uvedenej aktívnej zložky.

Zlúčeniny vzorca (I) a (II) môžu byť podávané buď v pevnej dávkovacej forme alebo ako vodné suspenzie, ale uprednostňuje sa, aby farmaceutické kompozície obsahovali účinnú dávku aktívnej zložky vo forme pevnej častice vzorca (I) a/alebo (II) s rozmerom častíc pod 200 pm, pričom je stredná veľkosť uvedenej aktívnej pevnej častice väčšia než 10 pm ako možno zistiť prístrojom Co-ulter® Counter LS 100. Toto zariadenie používa laserové lúče vlnovej dĺžky 750 nm na triedenie častíc v rozmedzí 0,4 pm do 900 pm (priemer) lomom svetla. Vzorky sú merané vo vode s malým prídavkom prípravku Triton X-100 na zvýšenie zmáčavosti a deflokuláciu prášku.

Je výhodné, keď stredná veľkosť častice uvedených aktívnych pevných častíc je medzi 10 a 100 pm, výhodne medzi 20 a 50 pm. Príklady výhodných kompozícií sú:

- kompozície s menej ako 10 % hmotnostnými uvedených aktívnych pevných častíc s veľkosťou častíc nad 100 pm.

- kompozície s najmenej 50 % hmotnostnými uvedených aktívnych pevných častíc s veľkosťou častíc pod 50 pm.

Je výhodné, keď stredná veľkosť častice uvedených aktívnych pevných častíc je medzi 10 a 100 pm, výhodnejšie medzi 20 a 50 pm. Vo výhodnom uskutočnení kompozície má menej ako 10 % uvedených aktívnych pevných častíc veľkosť častice menšiu než 5 pm.

Aktívna zložka alebo zložky použité v pevnej dávkovacej forme alebo suspenzii je výhodne zmes pevných častíc zlúčenín vzorca (I) a vzorca (II) s veľkosťou častíc menšou než 200 pm, pričom je hmotnostný obsah zlúčeniny vzorca (I) vzhľadom na hmotnosť zlúčenín vzorca (1) a (II) v uvedenej zmesi medzi 0,5 % a 20 %, výhodnejšie 0,5 % a 10%.

Vynález sa tiež týka uvedených farmaceutických kompozícií, ktoré výhodne obsahujú najmenej jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu. Príklady takých kyselín predstavujú: kyselina citrónová, kyselina glutámová, kyselina jantárová, kyselina etánsulfónová, kyselina octová, kyselina vínna, kyselina askorbová, kyselina metánsulfónová, kyselina fumarová, kyselina adipová, kyselina jablčná a ich zmesi. Kyselina citrónová je veľmi vhodná. Prítomnosť uvedenej kyseliny zlepšuje stabilitu aktívnej zložky alebo zložiek.

Pomer hmotnosti farmaceutický prijateľnej kyseliny k hmotnosti uvedených aktívnych pevných častíc je výhodne medzi 0,01 a 0,5, ešte radšej medzi 0,03 a 0,2. Je výhodné, keď množstvo kyseliny postačuje na upravenie pH suspenzie medzi 2 a 6, výhodnejšie medzi 3 a 5, najvýhodnejšie medzi 3,5 a 4,5.

Spôsoby prípravy pevných a kvapalných dávkovacích foriem tejto farmaceutickej kompozície sú opísané v patente WO/95/28393 a tieto opisy sú tu zahrnuté vo forme odkazu. Tieto kompozície výhodne obsahujú zvlhčovadlo a prípadne i derivát škrobu ako je opísané v patente USA 5,578.621, ktorého obsah tuje zahrnutý formou odkazu pokiaľ ide o opis prípadného zvlhčovadla a derivátov škrobu. Zvlhčovadlo opísané v patente USA 5,578.621 slúži ako disperzné činidlo.

Tieto farmaceutické kompozície v pevnej dávkovacej forme, v kvapalnej dávkovacej forme, ako pasty alebo masti môžu v prípade potreby obsahovať ďalšie aktívne činidlá ako sú antibiotiká, antivírusové prostriedky alebo in hibítory protónovej pumpy. Aj keď to nie je výhodné, tieto farmaceutické kompozície môžu tiež obsahovať aktívne pevné častice zlúčeniny vzorca (I) a/alebo zlúčeniny vzorca (II) väčšie než 200 pm.

Kompozície môžu obsahovať vehikulá (excipienty) známe ako použiteľné na prípravu foriem vhodných na orálne podávanie.

Je výhodné, keď v záujme vynikajúcej účinnosti proti širokému spektru parazitov, baktérií, húb a vírusov je rozdeľovači súčiniteľ uvedených aktívnych pevných častíc medzi 0,8 a 2, výhodne medzi 1,1 a 1,9, najlepšie vyšší než 1,5, pričom sa uvedený rozdeľovači súčiniteľ vypočíta podľa vzorca:

F<>0% = 0 I l>%)/((0 W% + 0 1(1·';,)/2) , v ktorom

- F_{90 %}je rozdeľovači súčiniteľ pri 90 %;

- 0_{9O %} je maximálna veľkosť častice vo frakcii častíc zodpovedajúcich 90 % uvedených aktívnych pevných častíc a

- 0,o % je maximálna veľkosť častice vo frakcii častíc zodpovedajúcich 10 % uvedených aktívnych pevných častíc.

V špecifickom uskutočnení vynálezu sú častice zlúčeniny vzorca (I) a/alebo (II) pripravené uvedenými spôsobmi a potom sú mleté, takže menej ako 10 % uvedených aktívnych častíc presahuje veľkosť 100 pm, menej ako 50 % uvedených častíc je väčších než 50 pm a menej ako 10 % uvedených aktívnych častíc je menších než 5 pm, pričom je stredná veľkosť častíc medzi 20 a 50 pm. Potom sú uvedené aktívne častice granulované s použitím zmesi obsahujúcej aktívne pevné častice a aspoň jedno granulačné činidlo. Príklady granulačného činidla predstavujú: polyvinylpyrolidón, voda, alkohol, sacharóza, hydroxycelulóza a ich zmesi. Je výhodné, keď sa počas granulačného procesu pridá aspoň jedna farmaceutický prijateľná kyselina.

Vynález sa týka pevných dávkovacích foriem obsahujúcich kompozíciu podľa vynálezu ako sú tablety, dispergovateľné tablety, povlečené tablety, matrice atď. Dávkovacia forma podľa vynálezu obsahuje napríklad:

- pevné aktívne častice s veľkosťou častíc pod 200 pm, pričom menej ako 10 % uvedených častíc má veľkosť nad 100 pm, menej ako 50 % uvedených častíc má veľkosť nad 50 pm a menej ako 10 % uvedených častíc má veľkosť pod 5 pni, pričom je stredná veľkosť častíc medzi 20 a 50 pm;

- najmenej jedno granulačné činidlo;

- najmenej jedno zvlhčovadlo;

- najmenej jeden derivát škrobu a

- najmenej jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu, ktorá sa výhodne pridáva počas granulačného procesu.

Kvapalné dávkovacie formy ako sú vodné suspenzie zlúčeniny podľa vynálezu obsahujú napríklad:

- ako aktívne činidlo pevné aktívne častice obsahujúce zlúčeninu vzorca (I) a/alebo zlúčeninu vzorca (II) s veľkosťou častíc pod 200 pm, pričom menej ako 10 % uvedených častíc má veľkosť nad 100 pm, menej ako 50 % uvedených častíc má veľkosť nad 50 pm a menej ako 10 % uvedených častíc má veľkosť pod 5 pm a

- najmenej jedno granulačné činidlo;

- najmenej jedno zvlhčovadlo;

- najmenej jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu, takže pH suspenzie je medzi 2 a 6, výhodne medzi 3 a 5, najradšej medzi 3,5 a 4,5;

- najmenej jedno zahusťovadlo, napríklad xantánovú, aguarovú alebo carruba živicu, kryštalickú celulózu, karboxymetylcelulózu alebo ich zmesi.

Pastovité alebo masťové formy podľa vynálezu, vhodné na orálne podávanie, obsahujú napríklad:

- ako aktívne činidlo pevné častice obsahujúce zlúčeninu vzorca (I) a/alebo zlúčeninu vzorca (II) s veľkosťou častíc pod 200 pm, pričom menej ako 10 % uvedených častíc má veľkosť nad 100 pm, menej ako 50 % uvedených častíc má veľkosť nad 50 pm a menej ako 10 % uvedených častíc má veľkosť pod 5 pm a

- najmenej jedno zvlhčovadlo;

- najmenej jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu, takže pH suspenzie je medzi 2 a 6, výhodne medzi 3 a 5, najradšej medzi 3,5 a4,5;

Pasty alebo masťové formy na vonkajšie alebo intravaginálne aplikácie obsahujú napríklad:

- najmenej jedno zvlhčovadlo;

- cetylalkohol a/alebo glyceridové deriváty a/alebo propylénglykol;

Suchá a čistá zlúčenina vzorca (I) a suchá a čistá zlúčenina vzorca (II) boli podrobené mletiu a triedeniu sitovou technikou.

Po mletí mali častice zlúčeniny vzorca (I), zlúčeniny vzorca (II) a ich zmesi distribúciu veľkosti častíc podľa obrázka 8. Obrázok 8 ukazuje percentuálny podiel častíc s menším rozmerom než 0 pm.

Z uvedeného vyplýva že:

- menej ako 10 % hmotnostných častíc malo veľkosť častice menšiu než asi 5 pm;

- menej ako 10 % hmotnostných častíc malo veľkosť častice väčšiu než asi 70 pm;

- stredná veľkosť častice je asi 40 pm;

- rozdeľovači súčiniteľ častíc je asi 1,73, pričom sa uvedený rozdeľovači súčiniteľ vypočítal podľa rovnice:

F'>w% ⁼ (0';d% 0|ο%)/((0·ιι>% + 0ιη··;,)/2) ₍ v ktorej

- F';o%J^e rozdeľovači súčiniteľ pri 90 %;

- 0_9O % je maximálna veľkosť častice vo frakcii častíc zodpovedajúcich 90 % uvedených aktívnych pevných častíc a

- 0io% je maximálna veľkosť častice vo frakcii častíc zodpovedajúcich 10 % uvedených aktívnych pevných častíc. Nasledujúce tabuľky ilustrujú príklady takých kompozícií.

Tabuľka 1

Príklad kompozície dispergovateľných tabliet na orálne podávanie obsahujúcich ako aktívne zložky zlúčeninu vzorca (II) a zlúčeninu vzorca (I)

Nitazoxanid (99 %) +desacetylnitazoxanid (1 %) 200 mg

Mikrokryštálická celulóza

Avicel pH 102 od firmy FMC-USA 116 mg

Krospovidon25 mg

Stearát horečnatý3 mg

Koloidný oxid kremičitý5 mg

Kyselina citrónová10 mg

Jahodová príchuť č. 877720 od firmy Robertet 10 mg Sacharinát sodný 2 mg

Tabuľka 2

Príklad kompozície povlečených tabliet na orálne podávanie obsahujúcich ako aktívne zložky zlúčeninu vzorca (II) a zlúčeninu vzorca (I)

Nitazoxanid 500 mg

Kukuričný škrob60 mg

Predgelatinizovaný kukuričný škrob70 mg

Hydroxypropylmetylcelulóza5 mg

Sacharóza20 mg

Sodný glykolát škrobu30 mg

Kyselina citrónová25 mg

Mastenec 8mg

Stearát horečnatý7 mg

Povlaky: na tablety alebo granuly obsahujúce 500 mg aktívnej zložky sa nastrekuje horúci cukrový roztok alebo povlakový film

Tabuľka 3

Príklad vodnej suspenzie, obsahujúcej zlúčeninu vzorca (II) a zlúčeninu vzorca (I) ako aktívne zložky na orálne podávanie; pH suspenzie bolo okolo 4.1

Nitazoxanid (98 %) + desacetylnitazoxanid (2 %) 2 g

Destilovaná voda 100 ml

Benzoát sodný0,2 g

Sacharóza 30,5 g

Xantánová živica0,2 g

Mikrokryštalická celulóza a sodná karboxymetylcelulóza Avicel RC-591 od firmy FMC-USA0,8 g

Kyselina citrónová0,2 g

Dihydrát citrátu sodného50 mg

Jahodová príchuť č. 877720 od firmy Robertet 125 mg Červené farbivo č. 33 D a C1 mg

Tabuľka 4

Príklad pasty na orálne podávanie obsahujúcej zlúčeninu vzorca (II) a zlúčeninu vzorca (I) ako aktívne zložky Nitazoxanid (98 %) + desacetylnitazoxanid (2 %) 500 mg Minerálny olej 10 g

Surový cukor1 g

Kyselina citrónová0,2 g

Tabuľka 5

Príklad pasty alebo masťovej formulácie na intravaginálne alebo vonkajšie podávanie, pričom uvedená pasta alebo masť ohsahuje zlúčeninu vzorca (II) a zlúčeninu vzorca (I) ako aktívne zložky

Nitazoxanid (98 %) + desacetylnitazoxanid (2 %) 8 g

Kremafor A62 g

KremaforA25 1,5g

Minerálny olej 7g

Luvitol EHO 7g

Glycerylmonoester 4g

Cetylalkohol 3g

Simetikon 0,5g

Germaben II 1g

Propylénglykol 3,5g

Destilovaná voda 62,5g

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sú kompozície so širokým spektrom účinkov na parazity, baktérie, huby a vírusy, zvlášť keď sú podávané orálne.

Účinnosť a bezpečnosť opísaných farmaceutických kompozícií pri podávaní zvieratám i ľuďom boli vynikajú ce. Pri klinických výskumoch na ľuďoch bolo špecificky zistené, že účinnosť uvedených farmaceutických kompozícii je pri liečbe parazitámych ochorení výrazne vyššia ako pri tých istých formuláciách s použitím aktívnej zlúčeniny s veľkosťou častice medzi 170 a 520 pm (stredná veľkosť častice = 352 pm), i keď sa väčšie častice podávali pacientom v dávkach až trikrát vyšších a dlhšie. Príklady rýchlostí uzdravení sú uvedené v tabuľke 6.

Tabuľka 6

Porovnanie výsledkov klinických výskumov na ľuďoch s použitím zlúčenín vzorca (1) a vzorca (II) s veľkosťami častíc v rozmedzí 170 pm až 520 pm (priemer = 352 pm) s výsledkami získanými s použitím zlúčenín vzorca (1) a vzorca (II) s veľkosťami častíc v rozmedzí od 5 pm do 200 pm (priemer = 34 pm).

Zlúčenina vzorca (I) [0X zlúčenina vzorca fII] (2 %)

Parazil	Veľkosť častice 170 až 520 (im Dávka 15-50 mg/kg/deii počas 3 až 7 dm Vyliečerí/eetok % vyliečených	Veľkosť častice 5 až 200 um Dávka 1 $ mg/kg/deft počas 3 dni Vyliečent/celok “ % vyliečených
Blastocyslis hominis	12/27 = 44 %	10/10 = 100 %
Fiitatnoeba hislolytica	29/47 - 62 %	106/1 33 - 80 %
Giardia lamblia	11/3? 30 %	50/73 = 68 %
Ascaris lumbricoides	3/69 = 4 %	144/179 - 80 %
Trichuristnchiura	7/48 -15%	58/79 = 73 %

V prípade všetkých parazitov uvedených v tabuľke 6 bol podiel uzdravených výrazne lepší pri pacientoch liečených aktívnymi časticami veľkosti medzi 5 a 200 pm ako pri liečbe aktívnymi časticami v rozmedzí veľkostí 170 až 520 pm, pričom vo všetkých prípadoch bola štatistická významnosť p < 0,02 (s použitím štandardných testov X²). Tak to bolo, aj keď dávky aktívneho činidla s väčšou veľkosťou častíc boli bežne vyššie a čas liečby bol často dlhší než čas podávania farmaceutických kompozícií aktívneho činidla s veľkosťou častíc pod 200 pm. Pri žiadnej skupine pacientov sa nevyskytli nežiaduce účinky.

Výsledky podobné uvedeným údajom z výskumov na ľuďoch boli zistené aj pri testoch na zvieratách.

Okrem toho nežiaduce účinky pozorované na psoch po orálnom podaní jednorazovej dávky 50 mg zlúčeniny vzorca (I) a zlúčeniny vzorca (II) na kg hmotnosti psa neboli pozorované pri extenzívnych výskumoch na zvieratách pri použití zlúčeniny vzorca (I) a zlúčeniny vzorca (II) s veľkosťou častice medzi 5 a 200 pm (priemer >10 pm), aj keď tá istá dávka alebo vyššia dávka týchto zlúčenín bola podávaná denne počas 90 dní alebo dlhšie.

Okrem toho boli uvedené kompozície stále aj v podmienkach 40 °C a 65 % relatívnej vlhkosti počas šiestich mesiacov, alebo v prípade kvapalných suspenzií, keď boli suspendované vo vode za uvedených podmienok, počas 3 mesiacov, čím je zaistené, že aktívne zložky nedegradujú a že kompozície si udržujú svoju účinnosť počas takého času po príprave, ktorý je vhodný na liečebné a komerčné účely.

V ďalšom bude ukázaná účinnosť farmaceutických kompozícií.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Cryptosporidium parvum

V prípravnom klinickom experimente sa 30 osôb trpiacich AIDS s chronickou kryptosporidálnou hnačkou liečilo orálnym podávaním nitazoxanidu pri denných dávkach 500 až 2000 mg. Pokiaľ hnačka neustala, podávanie nitazoxanidu pokračovalo ďalšie 4 týždne s maximálnou dennou dávkou 2000 mg.

Dvadsaťosem osôb dokončilo dva alebo viac týždňov liečby a do ôsmeho týždňa po liečení bolo 16 z nich schopných vyhodnotenia z hľadiska terapeutickej odozvy. V tejto poslednej skupine 12 osôb malo 50 % alebo väčšie obmedzenie dennej frekvencie vylučovania a desať jednotlivcov malo výrazné zníženie alebo úplnú likvidáciu parazitov v stolici, pričom pri štyroch osobách bol tento organizmus nepreukázateľný. Šesť pacientov splnilo kritériá klinickej a parazitologickej odozvy.

Pacienti, ktorým boli podávané vyššie denné dávky lieku dlhšie, mali väčšiu šancu na pozitívnu odozvu.

Pokus s nitazoxanidom pri kryptosporidiálnej hnačke v dôsledku AIDS s použitím značenia fluorescenčnou látkou preukázal pokles frekvencie vylučovania pri osobách, ktorým bolo denne podávané 500, 1000, 1500 alebo 2000 mg lieku. Účastníci pokusu mali počty CD4+ 42 buniek/mm³(v rozsahu 0-303 buniek /mm³), priemerný počet denných stolíc 6,7 počas 15 mesiacov, oocysty Cryptosporidium parvum v stolici a žiadne ďalšie zjavné črevné patogény. Takmer pri všetkých účastníkoch zlyhala terapia s azitromycínom alebo paromycínom.

Po 23 týždňoch malo 9 osôb z 13 kompletnú klinickú odozvu (prevažne tvarovanú stolicu jedenkrát až trikrát denne) a 4 z 13 mali čiastočnú klinickú odozvu (najmenej 50 % pokles dennej frekvencie stolice alebo zmenu konzistencie stolice na najmenej 75 % tvarovanej stolice). Do ukončenia pokusu došlo pri 8 z 11 osôb k úplnému vyhladeniu parazita a ďalšie 3 mali podstatné zníženie koncentrácie oocýst. Bol zistený trend k lepšej odozve pri dávkach 1000 mg denne a vyšších a pri dlhšej liečbe. Traja účastníci pokusu dostali žihľavkovú vyrážku na pokožke; zdravotný režim dodržiavalo viac než 90 % účastníkov viac ako štyri týždne.

Príklad 2

Cryptosporidium parvum

Pokus in vitro, údaje o dávkovaní

Nitazoxanid sa rozpustil v sterilnom dimetylsulfoxide (DMSO) a skúšal sa na jednobunkových vrstvách infikovaných intaktnými oocystami Crypotosporidium parvum pri koncentráciách 100 pg/ml, 10 pg/ml, 1 pg/ml a 0,1 pg/ml. Paralelne sa uskutočnil druhý test pri koncentráciách nitazoxanidu 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml a 0,02 pg/ml. Tieto koncentrácie sa docielili technikou postupného riedenia s použitím kompletnej živnej pôdy DMEM až do dosiahnutia finálnej koncentrácie DMSO 0,5 %. Pri kontrolnom médiu (pôdy) sa dosiahlo to isté zriedenie.

Pri pokuse sa použila bunková kultúra MDBKF5D2 vypestovaná v sedemmilimetrových komôrkach; ako Cyklosporidium parvum oocysty GCH1 v počte 5 x 10⁴ na jamku; išlo o porovnanie paromomycínu (pozitívna kontrola) s nitazoxanidom (experimentálny liek). Obsiahnuté bolo aj imúnne králičie antisérum obsahujúce sporozoity Cryptosporidium parvum (0,1 %) a s fluoresceínom konjugované kozie sérum proti králičej protilátke (1 %).

Test toxicity

200 pl pôdy obsahujúcej nitazoxanid pri koncentráciách 100, 10, 1 a 0,1 pg/ml a príslušné kontrolné pôdy sa umiestnili do dvoch jamiek platne s 96 jamkami obsahujúcich konfluentné jednobunkové vrstvy buniek MDBKF5D2 a do dvoch jamiek bez tejto vrstvy. Liek sa na jednobunkových vrstvách inkuboval pri 37 °C a 8 % CO₂; po 24 hodinách (prvý pokus) a 48 hodinách (druhý pokus) sa do každej jamky pridal MTS (Owenov roztok) a PMS v množstve

333 pg/ml, resp. 25 μΜ. Platňa sa vrátila do inkubátora a potme sa vyvíjala dve hodiny. Potom sa odobralo zvrchu kultúry 100 μΐ supematantu a previedlo na novú platňu s mikrotitrom na zistenie optickej hustoty prístrojom ELISA pri 490 nm. Výsledky sa zaznamenali a analyzovali. Toxicita v percentách sa vypočítala odčítaním strednej optickej hustoty (OD) supematantu z kultúry s liekom od OD supematantu kontrolnej pôdy bez lieku, vydelením strednou optickou hustotou supematantu z kontrolnej pôdy a násobením 100.

OD pôdy - OD lieku _x j q q OD pôdy

Test intaktných oocýst Cryptosporidium parvum

Na konfluentných jednobunkových vrstvách MDBKF5D2 sa pri 37 °C a v prostredí 8 % CO₂ inkubovali v nitazoxanide (100, 20, 10, 2, 1, 0,2, 0,1 a 0,02 pg/ml) oocysty Cryptosporidium parvum v množstve 5 x 10⁴ na jamku. Stupeň infekcie v každej jamke sa stanovil imunofluorescenčnou analýzou po 24 a 48 hodinách. Inhibícia v percentách sa stanovila odčítaním priemerného počtu parazitov na 10 polí v jamkách s testovaným liekom od priemerného počtu parazitov na 10 polí v jamkách s kontrolnou pôdou bez lieku, delením tohto rozdielu priemerným počtom parazitov v kontrolných pôdach a vynásobením sto.

počet v kontr. pôdach - počei v pôdach s liekom _x | o o počet v kontrolných pôdach

Výsledky:

Pokus 1: 24 hodín

Zlúčenina	Koncenlráciu	Stredná (+SD)*	Toxicita %	Inhibícia %
Infikovaná pôda	0	983.5 (±128.2)	0	0
Paromomycín	2 mg/ml	482 (±47,1)	23,8	51
NTZ	100 μ^/ηιΐ	strata	88J	NA ··
	10 pg/ml	55,5(±l3.5)	65,1	94.4
	1 gg/ml	224,5(128.5)	8,3	77.2
	OJ Bg/inl	474,5(129.5)	19,3	51,8

• Počet parazitov/10 poli *· Nie je k dispozícii vplyvom toxicity

Pokus 2: 48 hodín

Zlúčenina	Koncentráciu	Stredná (+SD)·	Toxicita %	Inhibícia %
Infikovaná pôda	0	2231.25 (+90,03)	0	0
Paromomvcin	2 mg/ml	580(+33,42)	40.8	74,01
NTZ	20 utúml	68.75(+ 13,77)	92.87	96.92
	2 pg/ml	1 13.7 5( + 21.36)	24.93	94,90
	0.2 pg/.nl	1020(+158.48)	16.56	54.29
	0.02 pg/iMl	1041(+191.46)	21.23	53,33

Počet parazitov/IOpolí

Účinok nitazoxanidu na intaktné oocysty Cryptospondium parvum

V pokuse 1 mal nitazoxanid pri koncentráciách 10, 1 a 0,1 pm/ml za následok hodnoty inhibície parazitov 94,4, 77,2 a 51,8 % a toxicitu proti bunkám v percentách 65,1, 8,3 a 19,3 %. Hoci pri zriedení 10 pg/ml došlo k takmer úplnej inhibícii infekcie parazitmi, boli zrejmé vysoké stupne toxicity. Pri zriedení 1 pg/ml nitazoxanidu vyšlo priaznivo porovnanie s paromomycínom koncentrácie 2 mg/ml z hľadiska inhibície parazitov i toxicity proti bunkám (77,2% inhibície parazitov a 8,3 % celulámej toxicity v prípade nitazoxanidu pri zriedení 1 pg/ml v porovnaní s 51 % inhibíciou parazitov a 23,8 % toxicity proti bunkám v prípade paromomycínu pri 2 mg/ml).

Pri pokuse 2 sa liek modifikoval s cieľom dosiahnuť lepšiu distribúciu dávok pri minimálnej toxicite. V dôsled ku toho zostali kultúry živé i po 48 hodinách a nielen po 24 hodinách ako v pokuse 1. Inkubácia počas 48 hodín mala samozrejme za následok vyššiu relatívnu toxicitu proti bunkám ako ukazuje porovnanie s paromomycínom v oboch pokusoch. Koncentrácia nitazoxanidu 20 pg/ml bola pri inkubácii počas 48 hodín stále príliš toxická, i keď sa jednobunková vrstva zdala dosiaľ intaktná. Je možné, že vysoká toxicita nutne ovplyvňujúca funkciu buniek má taktiež účinok na vývoj infekcie parazitom. Pri zriedení 2 pg/ml nitazoxanidu bola zábrana infekcie parazitom značná pri relatívne nízkej celulámej toxicite. Ďalšie riedenia taktiež mali za následok značnú inhibíciu a nízku toxicitu proti bunkám. Pri koncentrácii lieku 2 pg/ml mierna toxicita proti bunkám a inhibičná aktivita 94,90 % ukazuje, že nitazoxanid je pri koncentrácii 2 pg/ml vhodnejší ako paromomycín pri infekcii s Cryptosporidium parvum in vitro než paromomycín pri koncentrácii 2 mg/ml (tisíckrát vyššia koncentrácia).

Príklad 3

Cryptosporidium parvum

Informácia: dávkovanie a prechovávanie in vitro

Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid (NTZ a NTZdes) boli testované na jednobunkových vrstvách infikovaných intaktnými oocystami Cryptosporidium parvum a excystovanými sporozoitmi pri koncentráciách 10, 1, 0,1 a 0,01 pg/ml. Každá zlúčenina sa rozpustila v 100 % dimetylsulfoxide (DMSO) a zriedila sterilným médiom DMEM. Každá koncentrácia nitazoxanidu rovnako ako kontrolné médiá obsahovala konštantné množstvo DMSO 0,025 %.

Pri pokuse sa použili bunkové kultúry z buniek MDBKF5D2 vypestované v sedemmilimetrových komôrkach; ako Cyklosporidium parvum použité oocysty GCH1 v počte 5 x 10⁴ na jamku; šlo o porovnanie paromomycínu (pozitívna kontrola) proti nitazoxanidu (experimentálny liek). Obsiahnuté bolo aj imúnne králičie antisérum obsahujúce sporozoity Cryptosporidium parvum (0,1 %) a s fluoresceínom konjugované kozie sérum proti králičej protilátke (1 %).

Test toxicity

200 μΐ pôdy obsahujúcej nitazoxanid pri uvedených koncentráciách a príslušné kontrolné pôdy sa umiestnili do dvoch jamiek platne s 96 jamkami obsahujúcich konfluentnú jednobunkovú vrstvu buniek MDBKF5D2 a do dvoch jamiek bez tejto vrstvy. Liek sa na vrstvách inkuboval pri 37 °C 8 % CO₂ po 48 hodinách sa do každej jamky pridal MTS (Owenov roztok) a PMS v množstve 333 pg/ml, resp. 25 μΜ. Platňa sa vrátila do inkubátora a potme sa vyvíjala dve hodiny. Potom sa odobralo zvrchu kultúry 100 μΐ každého supernatantu a previedlo na novú mikrotitračnú platňu na zistenie optickej hustoty prístrojom ELISA pri 490 nm. Výsledky sa zaznamenali a analyzovali. Toxicita v percentách sa vypočítala odčítaním strednej optickej hustoty (OD) supematantu z lieku od strednej optickej hustoty OD supematantu kontrolnej pôdy bez lieku, vydelením strednou optickou hustotou supematantu z kontrolnej pôdy a násobením 100.

OD pydy - OD li<?ku _{x 100}OD pôdy

Klasifikácia cytotoxicity bola stanovená takto: 0,5 % toxicita = 0,6 % až 25 % toxicita = 1,26 % až 50 % toxicita = 2,51 % až 75 % toxicita = 3 a 76 až 100 % toxicita = 4. Platí, že cytotoxicita 0 až 1 sa má považovať za prijateľnú úroveň toxicity. Toxicity hodnôt 2, 3 a 4 sa považujú ako vysoko toxické pre jednobunkovú vrstvu.

Testovanie intaktných oocýst Cryptosporidium parvum

Na konfluentných jednobunkových vrstvách MDBKF5D2 sa pri 37 °C a v prostredí 8 % CO₂ inkubovali v nitazoxanide pri uvedených koncentráciách oocysty Cryptosporidium parvum v množstve 5 x 10⁴ na jamku. Stupeň infekcie v každej jamke sa stanovil imunofluorescenčnou analýzou po 48 hodinách a analyzoval sa počítačom. Inhibícia v percentách sa stanovila odčítaním priemerného počtu parazitov na pole v medikovaných jamkách od priemerného počtu parazitov na pole v jamke s kontrolnou pôdou bez lieku, delením tohto rozdielu priemerným počtom parazitov v kontrolných pôdach a násobením stom.

počet v kontr pôdach · počet v pôdach s liekom _x íoo počet v kontrolných pôdach

Výsledky:

Pokus s oocystami Cryptosporidiumparvum (48 hod.)

Lieky	Kone.	Parazit	±SD	Tox/O D	+SD	Inhib. %	Τυχ %	Klasifikácia
Vodné médiá	0	681,58	+271,02	2,024	±0.18	0	0	0
Pai omoinycín	2000	115,75	:44,65	1,219	±0 009	83,02	39,79
DMSO médiá	0	628,50	±171,94	1,799	±1,45	0	0	0
0,025
NTZ	10	11.25	±7,33	0,413	±0,13	98,13	77,07	4
	1	39,67	±13,13	1,618	±0,326	93,69	10,09	1
	0.1	643,42	+229,73	1,878	±0,154	<0	<0	0
	0,01	?14,33	±194,79	1,617	±0,072	SO	10,12	1
Nové	10	13,75	±6.66	0,337	±0,005	97,81	81,27	4
NTZdes	1	39,92	±13,49	1,710	±0,033	93,65	4,97	0
	0,1	649,86	+152,19	1,506	±0,119	SO	16,29	1
	0,01	749,33	±139,49	1,721	±0,144	s0	4,36	0

Kone. - pg/ml, Parazit - priemerný počet paruítov/pole (analyzovaných 12 poli), Inhib % - inhibícia infekcie parazitom v %, Tox % · toxicita lieku voči bunkám v %.

Z uvedeného je zrejmé, že inhibičná aktivita NTZdes je rovnaká ako pri NTZ v príklade II. Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid boli rovnako účinné in vitro proti Cryptosporidium parvum pri paralelných testoch, získané výsledky 98 % a 94 % inhibície pri riedeniach 10 a 1 pg/ml pre obe zlúčeniny. V prípade nitazoxanidu bolo zriedenie 1 pg/ml najnižšou koncentráciou dosahujúcou viac než 90 % inhibície, zatiaľ čo 50 % inhibície bolo možné dosiahnuť s nižšou koncentráciou nitazoxanidu napríklad 0,2, 0,1 a 0,02 pg/l. V tých istých experimentálnych podmienkach paromomycín použitý ako pozitívna kontrola bol 2000-krát menej účinný, pretože dosahoval pri koncentrácii 2000 pg/ml inhibičnú účinnosť len 51 až 83 %.

Príklad 4

E. intestinalis a V. cornea

Bunky 2RK-13 (pečeňové bunky králika) sa uložili na kultivačné platne s 24 jamkami v množstve 2,6 x 10⁵ buniek na jamku (1,0 ml média, RPMI 1640 s 2 mM L-glutamínu a 5 % teplom aktivované hovädzie fetálne sérum). Platne sa inkubovali cez noc v inkubátore s atmosférou CO₂ pri teplote 37 °C, počas tohto času sa jamky spojili (jedno zdvojenie, takže množstvo buniek na jamku bolo asi 5 x 10⁵).

K hostiteľským bunkám sa pridali mikroorganizmy Šeptala intestinalis (z tkanivových kultúr) v množstve v pomere asi 3:1, teda asi 15 x 10⁶ mikroorganizmov na jamku. Výsledkom tohto pomeru bolo, že sa infikovalo asi 50 % hostiteľských buniek.

Lieky sa rozpustili v DMSO, vode alebo metanole (v závislosti od rozpustnosti) na roztoky koncentrácie 1,0 mg/ml. Tieto roztoky sa skladovali pri -70 °C. Všetky zriedenia v týchto experimentoch sa uskutočňovali v kompletnom tkanivovom kultivačnom médiu. Všetky zriedenia sa skúšali v troch jamkách.

Médium (obsahujúce čerstvo zriedené lieky) sa nahradzovalo každé tri až štyri dni.

Šiesty deň po pridaní parazitov a liekov sa na bunkách zisťuje toxicita. Kontrolné bunky s liekmi, ale bez parazitov, sú študované z niekoľkých hľadísk: konfluencia, morfológia buniek a či sú prítomné mŕtve alebo plávajúce bunky. Bunky inkubované iba s parazitmi sú kontrolované z hľadiska infekčnosti parazitov (prítomnosť parazitofómych vakuol). Bunky inkubované s parazitmi a liekmi sa hodnotia z hľadiska toxicity pre hostiteľské bunky a množstva prítomných parazitofómych vakuol (či je veľké, stredné, malé).

Na desiaty deň sa do kultivačných jamiek pridá 100 μΐ 10 % SDS (cieľová koncentrácia 0,5 %), aby došlo k prasknutiu membrán hostiteľských buniek a uvoľnili sa mikrosporídie. Celkové množstvo parazitov v každej jamke sa stanoví zisťovaním alikvotného množstva hemacytometrom. Výsledky sa vyjadrujú v percentách inhibície (v pomere k počtu infikovaných buniek bez prídavku lieku). Výsledky ukazujú obrázky 1 až 4.

Príklad 5

Toxoplasma gondii

Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid sa testovali proti parazitom, konkrétne proti Toxoplasma gondii kmeň RH, udržovanému opakovanými pasážami myšami. Bunkové kultúry fibroplastov MRC5 od firmy Bio-Merieux, Francúzsko, boli v kultivačných platniach s 96 jamkami inokulované týmto kmeňom Toxoplasma gondii. Do každej kultivačnej jamky (s výnimkou 8 kontrolných jamiek použitých ako negatívna kontrola) sa pridalo 200 čerstvo odobratých tachyzoitov. Po 4 hodinách inkubácie sa do týchto kultúr pridali zriedené roztoky liekov.

Nitazoxanid (NTZ) a desacetylnitazoxanid (dNTZ) sa skúšali v koncentráciách v rozmedzí medzi 8 x 10⁴ a 40 mg/1. Lieky sa najskôr rozpustili v DMSO pri koncentráciách 2 mg/ml a potom sa postupným riedením v kultivačnej pôde pripravili v potrebných koncentráciách. Nedošlo ku vzniku zrazenín.

Tieto zriedenia liekov sa pridali ku kultúram (na každé zriedenie 8 jamiek) a nasledovala inkubácia kultivačných platní počas 72 hodín. Potom boli kultúry fixované studeným metanolom. Rast Toxoplasma gondii sa zisťoval na prístroji ELISA pomocou králičej protilátky proti Toxoplasma gondii značenej peroxidázou. Pre každú jamku sa zaznamenala hodnota optickej hustoty.

Výsledky sa prezentujú grafom, v ktorom sa vynášajú údaje optickej hustoty proti koncentrácii lieku v kultúre. Štatistický rozbor spočíval v regresnej analýze pri intervale spoľahlivosti 95 % a stanovení kriviek závislosti dávka/odozva z hodnôt optickej hustoty pre každý liek.

Jedna platňa bola kontaminovaná Giemsou na zistenie jej cytopatického účinku na kultúry.

Boli uskutočnené tri oddelené experimenty. V každom experimente sa pre každú zlúčeninu použili dve kultivačné platne; v každej kultivačnej platni sa pre každú koncentráciu lieku použilo 8 replikačných jamiek.

Výsledky

V troch súpravách pokusov boli získané podobné výsledky. Grafické znázornenie výsledkov jedného reprezentatívneho pokusu pre každý liek je ukázané na obrázkoch 5a, b, c a 6a, b, c.

Nitazoxanid (obrázky 5a, b, c)

Pri koncentráciách v rozmedzí 10’⁴ mg/1 a 0,3 mg/1 nebol zaznamenaný žiadny inhibičný účinok. Značný efekt mala koncentrácia >0,6 mg/1 a úplná inhibícia rastu 7oxoplasma sa dosiahla pri koncentráciách >2,5 mg/1. Pri koncentráciách >2,5 mg/1 však bola na jednobunkovej vrstve zaznamenaná výrazná toxicita.

Mikroskopické skúmanie jednobunkovej vrstvy ukázalo, že NTZ pri koncentrácii 1,25 mg/1 vyvolalo na parazitmi infikovaných bunkách cytopatický efekt vo forme zväčšenia parazitofómych vakuol a zníženia počtu intracelulámych parazitov. Na základe regresnej analýzy možno odhadnúť, že 50 % inhibičný účinok má zriedenie 1,2 mg/1. Desacetylnitazoxanid (obrázky 7a, b, c)

S desacetylnitazoxanidom boli dosiahnuté podobné výsledky: žiadny účinok pri koncentráciách v rozmedzí 10 ⁴ mg/1 a 0,3 mg/1, inhibícia pri koncentrácii > 0,6 mg/1 a výrazná toxicita pri koncentrácii > 2,5 mg/1. Možno odhadnúť, že 50 % inhibičný účinok má zriedenie 1,2 mg/1.

Získané výsledky boli reprodukovateľné v troch oddelených pokusoch pri hodnotení inhibičného účinku lieku na opakovaných kultiváciách pre každú koncentráciu lieku.

Pri NTZ i desacetylnitazoxanidu bolo možné pozorovať pri koncentráciách okolo 1,2 mg/1 výraznú inhibíciu rastu Toxoplasma so zmenami na parazitofóme vakuoly, ale bez výrazných zmien na samotnom parazite.

Tieto výsledky ukazujú, že tieto lieky majú dobrú aktivitu proti Toxoplasma gondii a že tento terapeutický účinok možno očakávať in vivo pri koncentráciách okolo 1 mg/1 v šere alebo tkanivách.

Príklad 6

Mycobacteria

Bolo zistené, že nitazoxanid má antimikrobiálnu aktivitu proti mykobaktériám tuberkulózy. Nasledujúca tabuľka ukazuje výsledky zisťovania MIC nitazoxanidu a tizoxanidu (NTZdes) proti Mycobacterium intracellular agarovou dilučnou technikou. Tieto výsledky sú založené na niekoľkých experimentoch s použitím agarovej dilučnej techniky na agare Middlebrook, z ktorých každý trval 3 týždne. Získané údaje preukazujú, že nitazoxanid má MIC proti Mycobacteria 2 pg/ml a tizoxanid má MIC 4 pg/ml pri použití štandardného kmeňa Mycobacterium intracellular od ATCC a štandardnej agarovej dilučnej techniky.

MIC (minimálna inhibičná koncentrácia) nitazoxanidu proti Mycobacteria intracellulare

	MIC’
nitazoxanid	2 μβ/ιηΙ
tižoxanid	4 pg/ml

*M1C sa stanovili štandardnou agarovou dilučnou technikou počas 3 týždňov s použitím agaru Middlebrook 7H1 1 V tomto pokuse bol použitý .V/. iniracei/ular ATCC 13950. štandardný kmeň.

Obrázok 7 je graf založený na štúdiu účinnosti nitazoxanidu proti mykobaktériám vypestovaným v kvapalnom bujóne. Použili sme kolorimetrickú analýzu MTS umožňujúcu stanoviť rast po 4 hodinách v porovnaní s počítaním na agare, ktoré to umožňuje po 3 týždňoch. Ako možno vidieť na údajoch na obrázku 7, pokiaľ sa nitazoxanid pridal 72 hodín po začiatku kultivácie, bolo možné pozorovať bezprostredný účinok na kontinuálny rast v porovnaní s rastom v samotnom kontrolnom médiu. Pri dávke 3 pg/ml nitazoxanidu sa na budúcich 24 hodín rast zastaví a potom ďalšie dva dni pokračuje pomalý rast. Dávka 50 μg/ml pôsobila počas 144 hodín kultivácie dokonale bakteriostaticky.

Príklad 7

Cryptosporidium parvum

Účinok nitazoxanidu proti Cryptosporidium parvum bol skúšaný na experimentálne infikovaných myšiach. Nitazoxanid bol dodaný firmou Romark Laboratories, L. C. Tampa, Florida.

Celková dávka pre človeka (1 g/deň počas 7 dní = 7 g) bola modifikovaná na použitie pri myšiach podľa Pageta a Bamesa. Ľudská dávka bola násobená faktorom 0,0026 pre myši (vážiace približne 20 g) a získalo sa celkové množstvo lieku potrebné pre každého hostiteľa ráno a večer počas 7 dní nasledujúcich po sebe. Každá myš prijala denne 2,6 mg (7000 mg x 0,0026/7). Dávky boli podávané orálne s použitím plastovej injekčnej striekačky so špeciálne upravenou špičkou ihly (around tip needle).

Dvadsať (20) dvojdenných cicajúcich myších mláďat sa infikovalo orálnym podaním 100.000 oocýst Cryptosporidium parvum získaných z infikovaných teliat. Pred podaním myšiam sa oocysty skoncentrovali pomocou cukomého roztoku technikou opísanou Fayerom a Ellisom. Všetkým myšiam boli odoberané rektálne výtery a denne skúmané modifikovanou kontaminačnou technikou Niehl-Neelsenovou opísanou Graczykom a ďalšími. Oocysty sa objavili v truse 2 dni po orálnej infekcii zvierat. Od tretieho dňa po infekcii zvierat bolo desiatim myšiam podávané 1,3 mg nitazoxanidu ráno a večer 7 dní po sebe nasledujúcich, zatiaľ čo 10 zostávajúcich myši sa použilo ako neliečená kontrola. Rektálne výtery boli odoberané denne všetkých sedem dní liečby a každý deň sedem dni nasledujúcich po ukončení liečby. Oocysty boli suspendované v oleji a pod mikroskopom počítané v 100 poliach.

Výsledky

Výsledky ukázané v nasledujúcej tabuľke jasne dokazujú, že nitazoxanid podávaný v dennej dávke 2,6 mg/deň 7 po sebe nasledujúcich dni bol účinný proti Cryptosporidium parvum a redukoval počet oocýst v truse infikovaných myší, ako vyplýva z porovnania s kontrolnými zvieratmi. Skúšaný liek znížil na konci tretieho dňa liečby uvoľňovanie oocýst do stolice pri 6 z 10 liečených myší. Na siedmy deň na konci liečby bola táto produkcia oocýst celkom eliminovaná a všetky liečené zvieratá mali negatívne výsledky pri kontrole trusu na rozdiel od neliečených kontrolných myší. Tento efekt trval po ukončenej liečbe najmenej 7 dni ako vyplýva z negatívneho výsledku kontroly na tretí a siedmy deň po ukončení liečby.

Počet z stenvch oocýst/pole v olejovej itnerzii
	3. deň liečby	posledný deň liečby	3. deň po liečbe	7. deň po liečbe
Myš č	Kon-	Lieče-	Kon-	Lieče-	Kou-	Lieče-	K. on-	Lieče-
	troliiň	na	trolná	n á	trolná	ná	trolná	ná
	sk tip	skúp.	skúp.	skúp.	skúp.	skúp.	skúp.	skúp.
\|	3 0	0,0	5.0	0.0	4.0	0.0	2.0	0,0
2	4.0	0.0	4.0	0.0	3.0	0.0	1.0	0,0
3	6.0	0.0	5.0	0.0	4.0	0.0	0.5	o.o
4	3.0	2.0	3.0	0.0	2.0	0.0	1.0	o.o
	5.0	2,0	3.0	o.o	3.0	0.0	0.5	o.o
	3.0	0.0	4.0	0.0	5.0	0.0	2.0	0.0
	3.0	0.0	5.0	0.0	4.0	0.0	1.0	0,0
	5.0	1.0	5.0	o.o	1.0	0.0	0.5	0.0
	3.0	3.0	3.0	0.0	2.0	0.0	l.o	o.o
10		0.0	5.0	o.o	2.0	0.0	0.5	0.0
Celkom	3 5	8.0	4,2	0.0	30	0.0	10	o.c
Priemer	3.5	0.8	4.2	o.o	3.0	0.0	1.0	0.0
Účinnosť		60 %		100 ·/»		100 %		100 %

Príklad 8

Mycobacterium

Nitazoxanid sa porovnával s antibiotikom izoniazidom. Ako mykobakteriálny kmeň bol použitý BCG (bacil Calmette a Guerin). Citlivosť tohto kmeňa bola tá istá ako pri

M. tuberculosis, ale tento kmeň bol neškodnej ši a preto nevyžadoval žiadne náročné vybavenia.

Myšiam bolo denne podávané 4 mg lieku na myš v 0,2 ml slnečnicového oleja. Výsledky pri myšiach liečených nitazoxanidom boli porovnateľné so skupinou liečenou izoniazidom.

	I0¹	10'
	SI a ina	Pečeň	Pľúca	Slezina	Pečeň	P ľíi c a
Nlifazo	1,575.000	1,575.000	5 7.5 00	68.250	70 000	50
	800 00(1	i,550.000	122 500	05.000	87 500	75
	875.000	l,550 0Ό0	30 000	75 ODO	35 OOO	150
	950.000	750.000	75.000	60.000	60 000	50
	47$.000	1,050.000	11 000	20.000	21 250	50
	255.000	750 000	5.750	1 5.250	27 500	125
	200.000	975.000	4 000	60.000 20.000	52.500 37 500	50 50
PBS	1,500.000	2.125 000	92 500	102.500	195 000	750
	1,525.000	1.800.000	98.000	140.000	175.000	800
	1,925.000	1,750.000	177.500	98.000	150.000	500
	1,675.000	1,800 000	117.500	105.000	150.000	750

Príklad 9

Fasciola hepatica

Účinnosť nitazoxanidu a desacetylnitazoxanidu proti Fasciola hepatica bola skúšaná in vitro.

Dospelé jedince Fasciola hepatica boli získané zo žlčovodov pečene troch teliat porazených kvôli fasciolosis vo veterinárnom diagnostickom laboratóriu firmy Hardy's Meat Packers, Bunkie, LA. Motolice boli premývané jednu hodinu v sterilnom soľnom roztoku a prenesené do sterilného roztoku alebo RPMI (pH 7,4) na ďalšie 3 hodiny. Potom boli motolice uchovávané cez noc pri 37 ^CC v prostredí s 5 % CO₂ v sterilnej zmesi RPMI-králičie sérum (objemový pomer 50 : 50) alebo v sterilnom RPMI (pH 7,4).

Kultivácia in vitro (37 °C a 5 % CO₂) bola uskutočnená modifikáciou spôsobu Ibarra a Jenkinsa (Z. Parasitenkd. 70 : 655 - 661, 1984). Pri dodržovaní sterilných podmienok sa motolice dvakrát premyli po 2 - 3 minútach v Hankovom rovnovážnom soľnom roztoku (pH 7,2) a individuálne umiestnili do jamiek kultivačných platní Linbro so šiestimi jamkami obsahujúcimi alikvotných 10 ml zamýšľaného zriedenia lieku v kultivačnom médiu. Toto médium pozostávalo zo zmesi (v objemovom pomere 50 : 50) RPMI a králičieho séra s 2 % králičej krvi a 100 ppm penicilínu a 100 ppm streptomycínu. Použili sa výhradne motolice s normálnou aktivitou a morfológiou.

Zásobné roztoky NTZ alebo jeho metabolitu D-NTZ od firmy Romark sa rozpustili v DMSO (2000 pg/ml) a zriedili v kultivačnom médiu s použitím volumetrickej banky s objemom 100 ml na prípravu špecifickej koncentrácie lieku (100, 50, 25, 10, 5, 3, 1 pg/ml). V každej replikovanej kultúre boli umiestnené dve motolice, jedna v nesubstituovanej kultivačnej pôde s RBC a druhá v kultivačnej pôde bez lieku a s RBC.

Motolice sa skúšali z hľadiska účinkov liekov, ako sa prejavovali smrťou, poruchami hybnosti alebo morfologickými zmenami v porovnaní s nemedikovanými kontrolnými motolicami pomocou zozadu vysvieteného panelu a osvetlenej trikrát zväčšujúcej šošovky.

Výsledky Experiment 1

V prípade D-NTZ boli motolice pri zriedení lieku 50 a 100 pg počas jednej hodiny mŕtve alebo umierajúce. Pri koncentrácii 25 pg boli po prvej hodine 4 zo 7 motolíc umierajúce, dve boli aktívne a jedna bola malátna; do troch hodín boli všetky mŕtve okrem dvoch malátnych a len jed na motolica zostala malátna nažive aj po štyroch hodinách. Pri koncentrácii lieku 10 pg bola po 1, 3 a 4 hodinách zaznamenaná obmedzená aktivita a do 7 hodín boli všetky mŕtve alebo umierajúce. V prípade zriedenia na 5 pg a 3 pg bola pri niektorých jedincoch pozorovaná znížená aktivita, pričom v kategórii so zriedením 3 pg bol pozorovaný o niečo slabší nástup; v skupinách s koncentráciou lieku 3 a 5 pg boli do 50 hodín všetky motolice mŕtve okrem jednej malátnej motolice v každej skupine. V skupine s koncentráciou lieku 1 pg bolo po 42 až 74 hodinách pozorované zníženie aktivity a po 91 hodine zostali nažive len 3 aktívne a jedna umierajúca motolica; v tejto skupine 1 pg zostala po 115 hodinách len jedna malátna motolica. V kontrolnej skupine s RBC bola úmrtnosť sledovaná po 66 hodinách (jedna motolica), 91 hodinách (jedna motolica) a 115 hodinách (štyri motolice). V kontrolnej skupine bez RBC boli po 91 hodine nažive všetky motolice a po 115 hodinách bola jedna mŕtva.

Experiment 2

V prípade NTZ bola pri 8 replikovaných prípadoch pozorovaná v porovnaní s D-NTZ o niečo väčšia aktivita skorším ovplyvnením hybnosti a úmrtnosti. Pri skupinách s koncentráciou lieku 100, 50 a 25 pg boli po jednej hodine mŕtve alebo umierajúce všetky motolice okrem jednej v skupine 25 pg, ktorá bola mŕtva po troch hodinách. Vo všetkých ostatných medikovaných skupinách bolo po jednej hodine zreteľné zníženie hybnosti v závislosti od veľkosti dávky. V skupine 10 pg po 16 hodinách prežila len jedna motolica. V skupine s koncentráciou lieku 5 pg boli po 6 hodinách aktívne len 3 motolice a žiadna nebola aktívna po 16 hodinách. V skupine 3 pg boli po 23 hodinách nažive len 2 malátne motolice; tieto však boli po 41 hodinách mŕtve. V skupine 1 pg uhynula do 16 hodín jedna motolica, do 41 hodiny tri motolice a do 74 hodín päť motolic; po 91 hodinách boli aktívne 3 motolice a po 115 hodinách si uchovala aktivitu jedna motolica. V kontrolnej skupine s RBC bolo po 74 hodinách aktívnych 7 z 8 motolíc, po 91 hodinách 3 a dve motolice zostali aktívne po 115 hodinách. V kontrolnej skupine bez RBC bolo po 74 hodinách aktívnych 6 z 8 motolíc, po 91 hodinách 4 a dve motolice zostali aktívne po 115 hodinách.

V skupinách s vysokou dávkou (25, 50, 100 pg) bola smrť motolíc rýchla a bola spojená s kontrakciou a zvraštením („curling“) ventrálnej časti. Pri medikácii v nižších koncentráciách väčšina motolíc načas spomalila a po smrti alebo pri umieraní bola ochablejšia a sploštená. Počínajúc 91. hodinou sa pri niektorých replikovaných prípadoch stala pre výsledky experimentov obmedzujúcim faktorom kontaminácia. V prípade D-NTZ došlo po 115 hodinách k vytvoreniu súvislého prekrytia dvoch replikovaných platní bakteriálnym alebo pliesňovým porastom s následným úhynom. Pri pokuse s NTZ toto prekrytie a úhyn motolice na celých replikovaných platniach nastalo po 91 hodinách (dve replikované platne) a 115 hodinách (5 replikovaných platní). Pozorovanie po 139 hodine nebolo uznané za platné z dôvodu celkovej kontaminácie väčšiny platní.

Závery

Z pokusov s oboma skúšanými liekmi vyplýva ich značná účinnosť pri usmrcovaní motolíc. O niečo vyššia účinnosť proti F. hepatica bola pozorovaná pri nitazoxanidu ako pri desacetylnitazoxanidu, jeho hlavného metabolitu, o ktorom sa usudzuje, že je účinný na hepatickej úrovni.

K rýchlej smrti motolíc dochádza pri aplikácii D-NTZ m vitro v koncentráciách >50 pg počas hodiny, pri kon centráciách 25 pg počas 4 hodín a pri koncentráciách 10 pg počas 6 až 7 hodín. Desať pg môže byť vhodnou jednorazovou liečebnou cielenou dávkou lieku pokiaľ farmakokinetické údaje ukazujú, že tkanivová koncentrácia sa udrží >6 až 8 hodín po jednorazovej liečbe.

Silná schopnosť usmrcovať motolice do 74 hodín (tri dni) bola pri oboch zlúčenín zistená pri koncentráciách pg a 5 pg. Dlhšie prežívanie, ale nie tak dlhé ako pri kontrolných nemedikovaných motoliciach, bolo pozorované pri koncentrácii 1 pg; použitie tohto lieku v tejto koncentrácii na motolice v pečeni počas 3 až 4 dní preto môže mať na parazity nedostatočný účinok.

Príklad 10

Fasciola gigantica

Nitazoxanid bol testovaný na účinnosť proti nedospelým a dospelým jedincom Fasciola gigantica na experimentálne infikovaných králikoch.

Encystované metacerkárie Fasciola gigantica (EMC) boli zhromaždené na celofánovej blane 28 až 35 dní po infekcii slimákov Ĺ. calludi miracídiom Fasciola gigantica s použitím techniky, ktorú opísal Abdel-Ghany, v ktorej sú slimáky denne vystavené na 30 minút v čistej odchlórovanej vode z vodovodu umelému svetlu. Získané encystované metacerkárie (EMC) sa 5 až 8 dní skladovali pri 4 °C v chladničke pod hladinou vody, skôr než sa použili na infekciu experimentálnych zvierat.

V tomto výskume bolo použitých štyridsať (40) králikov Boscat s hmotnosťou 1,5 až 2 kg, ktoré boli zaradené do dvoch experimentálnych skupín po 20 jedincoch.

Zvieratá v skupine 1 sa orálne infikovali 35 - 40 encystovanými metacerkáriami zabalenými v liste hlávkového šalátu vloženom na koreň jazyka zvierat. Papuľky zvierat boli ručne držané zavreté, dokým nedošlo k zhltnutiu encystovaných metacerkárií. Táto skupina 1 sa použila na testovanie nitazoxanidu proti nedospelým štádiám (4 - 5 týždňov starým) Fasciola gigantica.

Zvieratá zo skupiny 2 sa orálne infikovali rovnako ako v prvej skupine 10 až 15 encystovanými metacerkáriami a použili sa na skúšku účinnosti nitazoxanidu proti motoliciam v skorom štádiu dospelosti (starým >10 týždňov).

Desiatim zvieratám v skupine 1 bolo v čase vzdialenom týždne od ich infekcie parazitmi v nedospelom štádiu ich vývojového cyklu podávaných 7 po sebe nasledujúcich dní ráno a večer 35 mg nitazoxanidu. Zostávajúcich 10 zvierat skupiny 1 tvorilo neliečenú kontrolnú skupinu.

Desiatim zvieratám v skupine 2 bolo v čase vzdialenom 10 týždňov od ich infekcie parazitmi v dospelom štádiu ich vývojového cyklu podávaných 7 po sebe nasledujúcich dní ráno a večer 35 mg nitazoxanidu. Zostávajúcich 10 zvierat skupiny 2 tvorilo neliečenú kontrolnú skupinu.

Až do ukončenia experimentu boli všetky zvieratá kŕmené suchou potravou.

Sedem dní po podaní poslednej dávky nitazoxanidu boli všetky zvieratá v oboch skupinách usmrtené. Povrch pečene sa skúmal z hľadiska prítomnosti migrujúcich nekrotických rýh zvlášť pre vývojové štádiá nedospelých parazitov. Tieto nekrotické oblasti boli študované pomocou dvoch chirurgických ihiel s cieľom získať migrujúce juvenilné motolice technikou, ktorú opísal El-Bahy. Pečeň sa rozrezala na malé kúsky zvlášť v okolí migrujúcich rýh a macerovala sa pod mikroskopom s cieľom extrahovať motolice. Brušná dutina a viscerálne povrchy sa premyli teplou vodou. Táto výplachová voda sa spojila, preliala sitom a skúmala na prítomnosť juvenilných motolíc. Všetky nájdené parazity, vrátane ich telesných častí, sa spočítali pri liečených i neliečených zvieratách v oboch skupinách 1 a 2.

Živé motolice mali svetloružovú farbu, boli priesvitné a mali neporušené integumenty, ľahko sa teplou vodou vyplavovali z pečeňových tkanív, zatiaľ čo mŕtve motolice mali farbu sivastú, boli uvoľnené a mali porušené nekrotické povrchy. Účinnosť nitazoxanidu sa vypočítala pomocou vzorca:

% účinnosti = x 100 , a

kde: a = počet motolíc získaných zo stolice kontrolných zvierat;

b = počet motolíc získaných zo stolice liečených zvierat.

Výsledky

Výsledky výskumu uvedené v tabuľke 7 ukazujú výrazný pokles počtu nedospelých motolíc extrahovaných z králičej pečene liečenej skupiny v porovnaní s kontrolnou skupinou. Tento pokles v percentách bol priemerne 46,77 % (v rozmedzí 40 až 60 %).

Tabuľka 7

Účinnosť nitazoxanidu proti nedospelým jedincom (4 týždne starým) Fasciola gigantica pri pokusne infikovaných králikov

Počet motolíc získaných 2 králičej pečene
Králik í	Neliečená kontrola	Liečené králiky	Účinnosť %
i	7	4	42 %
2	7	4	42 %
2	6		50 %
4	8		— 50 %
5	5		40 %
6	5	2	60 %
7	5		40 %
8			50 %
9	8		50 %
10			40 %
Priemer	6.2	3.3	46,77 %

Vo vývojovom štádiu ranej dospelosti motolíc, ktorými boli králiky infikované, mal nitazoxanid totálnu účinnosť (100 % redukciu) a pri skúmaní pečene liečených králikov neboli zistené žiadne červy (motolice) v porovnaní so zvieratami z kontrolnej skupiny neliečených králikov, ako je zrejmé z tabuľky 8.

Tabuľka 8

Účinnosť nitazoxanidu proti jedincom v ranom štádiu dospelosti (10 týždňov starým) Fasciola gigantica v pokusne infikovaných králikoch.

Počet motolíc získaných z králičej pečene
Králik č	Neliečená kontrola	Liečené králiky	Účinnosť %
1	4	0.0	100%
2	4	o.o	100 %
3	3	0.0	100 %
4	3	0.0	100 %
5	2	0.0	100 %
6	2	0,0	100 %
7	2	0.0	100 %
	3	o.o	100 %
9	3	0.0	100 %
10		0.0	100 %
Priemer	2.9	o.o	100 %

Nitazoxanid podávaný 7 po sebe nasledujúcich dní v dávke 70 mg/deň je mierne účinný proti nedospelým jedincom Fasciola gigantica a kompletne účinný proti týmto parazitom vo vývojovom štádiu ranej dospelosti.

Príklad 13

Schistosoma

Nitazoxanid bol skúšaný proti Schistosoma mansoni a Schistosoma hematobium v experimentálne infikovaných myšiach.

Štyridsať (40) bielych myší s hmotnosťou 30 až 50 g bolo rozdelených do dvoch liečených skupín po 20 zvieratách. Prvá skupina bola infikovaná s 300 - 500 voľnými a aktívnymi cerkáriami Schistosoma mansoni suspendovanými v 0,25 ml destilovanej vody a intraperitoneálnou injekciou podanými všetkým myšiam. Druhá skupina bola infikovaná rovnakým spôsobom, ale cerkáriami Schistosoma hematobium. Obe skupiny potom boli chované v laboratóriu celkovo 70 dní.

Sedemdesiat dní po infikovaní zvierat bolo v každej skupine 10 zvierat liečených nitazoxanidom dávkou 1,3 mg podávanou sedem po sebe nasledujúcich dní orálne ráno aj večer. Sedem dní po ukončení liečby boli usmrtené všetky zvieratá a z pečene každej myši sa perfúziou vlažnou vodou (37 °C) extrahovali červy. Získané jedince Schistosoma pri všetkých liečených a kontrolných zvieratách boli spočítané. Účinnosť nitazoxanidu bola vypočítaná s použitím nasledujúceho vzorca:

% účinnosti = x 100 , a

kde: a = počet jedincov Schistosoma získaných z výplachu kontrolných zvierat b = počet jedincov Schistosoma získaných z výplachu liečených zvierat.

Výsledky

Výsledky v tabuľkách 9 a 10 jasne ukázali, že nitazoxanid podávaný v dávkach 2,6 mg/deň 7 dni po sebe nasledujúcich bol účinnejší proti Schistosoma hematobium, kde bolo pozorované zníženie počtu červov o 82,85 % v porovnaní s kontrolnými zvieratami, ako proti Schistosoma mansoni, kde zníženie proti kontrolnej skupine myší dosiahlo len 59,91 %. Tieto výsledky sú konzistentné s výsledkami v správe Abaza a ďalších, podľa ktorej nitazoxanid nebol účinný pri liečbe pacientov proti S. mansoni, ako vyplýva z pozitívneho nálezu vajíčok po liečbe nitazoxanidom.

Tabuľka 9

Účinnosť nitazoxanidu proti dospelým jedincom (13 týždňov starým) Schistosoma mansoni v myšiach.

Počet motolic odstránených z myšej pečene
Myš Č	Neliečené kontrolné mv5i	Liečené myši
1	21	10
	29	9
3	32	10
4	26	1 1
5	24	1 3
	19	10
	20	9
8	24	12
	22	S
10	30	7
Celkom	247	99
Priemer/myš	24,7	0,9
Účinnosť		59,9 1

Tabuľka 10

Účinnosť nitazoxanidu proti dospelým jedincom (13 týždňov starým) Schistosoma hematobium v myšiach.

Počet	motolic odstránených z myšej pečene
Myš č	Neliečené kontrolné myši	Liečené tnyši
1	_IS	^r 1 ~
2	16	3
3	14	2
4	19	2
5	12	4
6	IC	4
7	13	2
8	12	2
9	17	O,í)
10	9	2
Celkom	140	24
ľriemer/myš	14	2,4
Účinnosť		82,85

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Orálny farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa t ý m, že ako účinnú zložku obsahuje aspoň jednu zlúčeninu vybranú zo skupiny zahrnujúcej desacetylnitazoxanid vzorca (I) a nitazoxanid vzorca (II) pričom účinná zložka je vo forme aktívnych častíc s veľkosťou častíc menšou než 200 pm a strednou veľkosťou častíc väčšou než 5 pm.
2. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že stredná veľkosť aktívnych pevných častíc je medzi 10 a 100 pm.
3. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že stredná veľkosť aktívnych pevných častíc je medzi 20 a 50 pm.
4. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že menej než 10 % hmotnostných aktívnych pevných častíc má veľkosť častíc väčšiu než 100 pm.
5. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m . že aspoň 50 % hmotnostných aktívnych pevných častíc má veľkosť častíc menšiu než 50 pm.
6. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že aspoň 10 % hmotnostných aktívnych pevných častíc má veľkosť častíc menšiu než 5 pm.
7. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že distribučný faktor aktívnych pevných častíc je medzi 0,8 a 2, počítané podľa rovnice

Fío·/· ^— (Φ90% * Φ|0“/ο)/((Φ90% + Φιο%)/2), kde

F_Qo% je distribučný faktor pri 90 %,

090% je maximálna veľkosť častíc frakcie častíc zodpovedajúcej 90 % aktívnych pevných častíc a

0io%je maximálna veľkosť častíc frakcie častíc zodpovedajúcej 10 % aktívnych pevných častíc.
8. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že distribučný faktor aktívnych pevných častíc je medzi 1,1 a 1,9, počítané podľa rovnice ^90% - (Φ?ο% - Φιο%)/((Φβο% ⁺ Φιο%)/2), kde

F_9o%je distribučný faktor pri 90 %,

Φ₉₀je maximálna veľkosť častíc frakcie častíc zodpovedajúcej 90 % aktívnych pevných častíc a

Φιο % je maximálna veľkosť častíc frakcie častíc zodpovedajúcej 10 % aktívnych pevných častíc.
9. Orálny farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú zložku aspoň jednu zlúčeninu vybranú zo skupiny zahrnujúcej desacetylnitazoxanid vzorca (I)

OH a nitazoxanid vzorca (II) a ďalej farmaceutický prijateľnú kyselinu.
10. Prípravok podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že farmaceutický prijateľná kyselina je vybraná zo skupiny zahrnujúcej kyselinu citrónovú, kyselinu glutámovú, kyselinu jantárovú, kyselinu etánsulfónovú, kyselinu octovú, kyselinu vínnu, kyselinu askorbovú, kyselinu metánsulfónovú, kyselinu fumarovú, kyselinu adipovú, kyselinu jablčnú a ich zmesi.
11. Prípravok podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že pomer hmotnosti farmaceutický prijateľnej kyseliny a hmotnosti aktívnych pevných častíc je medzi 0,01 a 0,5.
12. Prípravok podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že pomer hmotnosti farmaceutický prijateľnej kyseliny a hmotnosti aktívnych pevných častíc je medzi 0,03 a 0,2.
13. Použitie aspoň jednej zlúčeniny vybranej zo skupiny zahrnujúcej desacetylnitazoxanid vzorca (I) a nitazoxanid vzorca (II) ako účinnej zložky na výrobu farmaceutického prípravku na ošetrovanie infekcie pri imunokompromizovanom cicavcovi, vyvolanej mikroorganizmom vybraným zo skupiny zahrnujúcej Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii a Toxoplasma gondii.
14. Použitie podľa nároku 13, kde účinná zložka je vo forme aktívnych častíc s veľkosťou častíc menšou než 200 gm a strednou veľkosťou častíc väčšou než 5 gm.
15. Použitie podľa nároku 13, kde účinná zložka je vo forme častíc so strednou veľkosťou častíc medzi 20 a 50 gm.
16. Použitie podľa nároku 13, kde farmaceutický prípravok ďalej obsahuje aspoň jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu.
17. Použitie podľa nároku 16, kde farmaceutický prijateľná kyselina je vybraná zo skupiny zahrnujúcej kyselinu citrónovú, kyselinu glutámovú, kyselinu jantárovú, kyselinu etánsulfónovú, kyselinu octovú, kyselinu vínnu, kyselinu askorbovú, kyselinu metánsulfónovú, kyselinu fumarovú, kyselinu adipovú, kyselinu jablčnú a ich zmesi.
18. Použitie podľa nároku 13, kde účinnou zložkou je desacetylnitazoxanid.
19. Použitie podľa nároku 13, kde účinnou zložkou je nitazoxanid.
20. Použitie podľa nároku 13, kde cicavcom je človek a kde sa účinná zložka podáva v množstve 500 až 2000 mg denne.
21. Použitie aspoň jednej zlúčeniny vybranej zo skupiny zahrnujúcej desacetylnitazoxanid vzorca (I) ako účinnej zložky na výrobu farmaceutického prípravku na ošetrovanie parazitickej infekcie vyvolanej motolicou.
22. Použitie podľa nároku 21, kde motolica je vybraná zo skupiny zahrnujúcej rody Schistosoma, Fasciola, Fasciolopsis, Dicrocoelium, Heterophyes a Metagonimus.
23. Použitie podľa nároku 21, kde motolica je vybraná zo skupiny zahrnujúcej Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma mekongi, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum, Fasciola hepatica, Fasciola gigantica, Fasciolopsis biski, Dicrocoelium dendrlticum, Heterophyes heterophyes a Metagonimus yokogawa.
24. Použitie podľa nároku 23, kde účinná zložka je vo forme aktívnych častíc s veľkosťou častíc menšou než 200 gm a strednou veľkosťou častíc väčšou než 5 gm.
25. Použitie podľa nároku 24, kde účinná zložka je vo forme častíc so strednou veľkosťou častíc medzi 20 a 50 gm.
26. Použitie podľa nároku 23, kde farmaceutický prípravok ďalej obsahuje aspoň jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu.
27. Použitie podľa nároku 26, kde farmaceutický prijateľná kyselina je vybraná zo skupiny zahrnujúcej kyselinu citrónovú, kyselinu glutámovú, kyselinu jantárovú, kyselinu etánsulfónovú, kyselinu octovú, kyselinu vínnu, kyselinu askorbovú, kyselinu metánsulfónovú, kyselinu fumarovú, kyselinu adipovú, kyselinu jablčnú a ich zmesi.
28. Použitie podľa nároku 26, kde pomer hmotnosti farmaceutický prijateľnej kyseliny a hmotnosti aktívnych častíc je medzi 0,01 a 0,5.
29. Použitie podľa nároku 23, kde účinnou zložkou je desacetylnitazoxanid.
30. Použitie podľa nároku 23, kde účinnou zložkou je nitazoxanid.
31. Farmaceutická pasta na topickú aplikáciu, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje ako účinnú zložku pevné častice aspoň jednej zlúčeniny vybranej zo skupiny zahrnujúcej desacetylnitazoxanid vzorca (I) a nitazoxanid vzorca (II) pričom tieto pevné častice majú veľkosť častíc menšiu než 200 pm a strednú veľkosť častíc väčšiu než 5 pm, aspoň jedno zahusťovadlo, aspoň jedno zmáčadlo a aspoň jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu, pričom pH pasty je medzi 2 a 6.
32. Farmaceutická pasta podľa nároku 31, v y z n a čujúca sa tým, že ďalej zahrnuje aspoň jednu prísadu vybranú zo skupiny zahrnujúcej cetylalkohol, glyceridové deriváty, propylénglykol a ich zmesi.
33. Farmaceutický prípravok na orálnu aplikáciu, obsahujúci účinnú zložku granulovanú v prítomnosti granulačného činidla, vyznačujúci sa tým, že účinná zložka je vo forme pevných aktívnych častíc aspoň jednej zlúčeniny vybranej zo skupiny zahrnujúcej desacetylnitazoxanid vzorca (I)

OH a nitazoxanid vzorca (II)

O - CO CH a nitazoxanid vzorca (II) pričom aktívne častice majú veľkosť častíc menšiu než 200 pm a strednú veľkosť častíc väčšiu než 5 pm.

39. Farmaceutický prípravok podľa nároku 38, v y značujúci sa tým, že ďalej zahrnuje aspoň jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu.

40. Kvapalná suspenzia účinnej zložky na orálnu aplikáciu, vyznačujúca sa tým, že obsahuje ako účinnú zložku aspoň jednu zlúčeninu vybranú zo skupiny zahrnujúcej desacetylmtazoxanid vzorca (I) a nitazoxanid vzorca (11) pričom účinná zložka je vo forme aktívnych častíc s veľkosťou častíc menšou než 200 pm a strednou veľkosťou častíc väčšou než 5 pm, a aspoň jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu, pričom pH suspenzie je medzi 2 a 6.

41. Suspenzia podľa nároku 40, vyznačujúca sa t ý m , že pH suspenzie je medzi 3 a 5.

42. Suspenzia podľa nároku 40, vyznačujúca sa t ý m , že ďalej zahrnuje granulačné činidlo.

pričom aktívne častice majú veľkosť častíc menšiu než 200 pm a strednú veľkosť častíc väčšiu než 5 pm.
34. Prípravok podľa nároku 33, vyznačujúci sa t ý m , že granulačné činidlo je vybrané zo skupiny zahrnujúcej polyvinylpyrolidón, vodu, alkohol, sacharózu, hydroxylcelulózu a ich zmesi.
35. Prípravok podľa nároku 33, vyznačujúci sa t ý m , že granulované aktívne pevné častice obsahujú aspoň jednu farmaceutický prijateľnú kyselinu.
36. Prípravok podľa nároku 35, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že farmaceutický prijateľná kyselina je vybraná zo skupiny zahrnujúcej kyselinu citrónovú, kyselinu glutámovú, kyselinu jantárovú, kyselinu etánsulfónovú, kyselinu octovú, kyselinu vínnu, kyselinu askorbovú, kyselinu metánsulfónovú, kyselinu fumarovú, kyselinu adipovú, kyselinu jablčnú a ich.
37. Prípravok podľa nároku 35, vyznačujúci sa t ý m , že pomer hmotnosti farmaceutický prijateľnej kyseliny a hmotnosti účinnej zložky je medzi 0,01 a 0,5.
38. Farmaceutický prípravok na orálnu aplikáciu, obsahujúci účinnú zložku, zmáčadlo a škrobový derivát, vyznačujúci sa tým, že účinná zložka je vo forme pevných aktívnych častíc aspoň jednej zlúčeniny vybranej zo skupiny zahrnujúcej desacetylmtazoxanid vzorca (D