CZ298270B6

CZ298270B6 - Farmaceutické kompozice tizoxanidu a/nebo nitazoxanidu

Info

Publication number: CZ298270B6
Application number: CZ20060366A
Authority: CZ
Inventors: Rossignol@Jean-François
Original assignee: Romark Laboratories, L. C.
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2007-08-08
Also published as: KR20040004544A; UA57079C2; AU740022B2; KR100576646B1; NO335781B1; HK1025907A1; DE69809928T2; SK283947B6; EP1005342A4; UA74388C2; GEP20032970B; IL155799A; SI20149B; NO20021832L; AU7289598A; NO20021832D0; BR9808722A; CA2288003A1; IL155799A0; JP2001503067A

Abstract

Farmaceutický prípravek, obsahující jako úcinnou složku alespon jednu slouceninu vybranou ze skupiny zahrnující slouceninu vzorce I a slouceninu vzorce II a dále obsahující alespon jednu farmaceuticky prijatelnou kyselinu v množství zlepšujícím stabilitu. Úcinná složka je prednostne ve forme cástico velikosti cástic menší než 200 .mi.m a o strední velikosti cástic vetší než 10 .mi.m. Farmaceutické prípravky jsou vhodné zejména pro lécení oportunních infekcí u osob s kompromitovaným nebo potlaceným imunitním systémem a pri lécbe infekcí zpusobených motolicemi.

Description

Farmaceutické kompozice tizoxanidu a/nebo nitazoxanidu

Oblast techniky

Tento vynález se týká farmaceutické kompozice obsahující jako aktivní složku nejméně jednu sloučeninu vybranou ze skupiny, kterou tvoří sloučenina vzorce I

(I)

která dále obsahuje alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou kyselinu.

Aktivní složka je výhodně v podobě částic velikosti pod 200 pm a střední velikost částice je větší než 10 pm.

Vynález se též týká farmaceutických kompozic stabilizovaných nejméně jednou farmaceuticky přijatelnou kyselinou.

Farmaceutické kompozice jsou zvláště použitelné při léčbě oportunních infekcí osob s kompromitovaným nebo suprimovaným imunitním systémem a při léčbě infekcí motolicí.

Dosavadní stav techniky

Existuje naléhavá potřeba vývoje způsobů léčby četných parazitárních a bakteriálních infekcí osob s kompromitovaným imunitním systémem (AIDS, pacienti s rakovinou, starší osoby, stárnoucí, příjemci imunosupresivních léčiv po transplantaci orgánů). Jinou oblastí použití jsou infekce motolicí, zvláště v tropickém podnebí. Proto zde je potřeba farmaceutické kompozice, kterou by snášely i imunitně kompromitované osoby a jež by byla stálá při skladování i v tropickém prostředí.

Specificky prvek Toxoplasma gondií je mezi převládajícími příčinami latentních infekcí centrálního nervového systému ve světovém měřítku. Tímto parazitem je infikováno mnoho zdravých lidí, ale obvykle jejich imunitní systém udrží organizmus pod kontrolou. Toxoplasma gondií je nej obvyklejším oportunním patogenem mozku pacientů trpících AIDS. V dnešní době se toxoplasmóza stává stále větším problémem nejen kvůli AIDS, ale i vlivem rostoucího používání imunosupresivních léčiv (podávaných například pacientům po transplantaci orgánů). Toxoplasmóza se obvykle léčí kombinací pyrimethaminu a sulfadiazinu. Jsou to účinné léky, ale nezabíjejí cysty parazita, takže léčba musí pokračovat při udržovacích dávkách. Toxicita si často vynutí vysazení léku, zvláště u lidí imunosuprimovaných, a následuje recidiva. Statistika proto

-1CZ 298270 B6 není příznivá pří uváděné úmrtnosti asi 70 % u imunodeficientních pacientů a průměrném přežívání čtyři měsíce.

Kryptosporidióza je způsobena mikroskopickým parazitním prvokem Cryptosporidium parvum.

U osob s normální imunitou může být průjem způsobený tímto prvokem prudký a dlouhý, aleje spontánně mizející. U pacientů trpících AIDS kiyptosporidiální průjem často ohrožuje jejich život. Odhaduje se, že z pacientů AIDS asi 15 až 20 % trpí tímto onemocněním. Až dosud neexistuje žádná trvale účinná nebo osvědčená terapie kryptosporidiózy.

U pacientů trpících AIDS byl nejčastěji identifikován jako patogen Enterocytozoon bieneusi, parazitní mikrosporidie nalezená u téměř jedné čtvrtiny pacientů. Nyní se zdá, že tento drobný parazit může být označen jako příčina značného podílu mnoha nevysvětlených případů poruch trávení, průjmu a tělesného chátrání nositelů HIV. Žádná účinná léčba dosud neexistuje.

HlV-pozítívní osoby infikuje několik dalších druhů mikrosporidií včetně Encephalitozoon heliem a cuniculi a nový druh označený jako Septata intestinalis. Nedávná zpráva zjišťuje, že infekce diseminovanými mikrosporidiemi v současnosti nabývá na významu.

Od kryptosporidiózy je klinicky neodlišitelná infekce parazitem Isospora belli. Je znám spíš 20 v tropickém pásmu a v USA byl nalezen u méně než 1 % pacientů, i když jeho skutečný výskyt je pravděpodobně vyšší.

Pneumocystis cdrinii se všeobecně zařazuje jako parazitní prvok; některé práce však uvádějí, že by mohl patřit mezi fúngi (houby), s nimiž sdílí určité genetické sekvence. Pneumocystis carinii 25 obvykle infikuje plíce (Pneumocystis Carinii Pneumonia (PCP) - zápal plic způsobený P.c.).

Uvádí se, že léčba je úspěšná u asi 40 až 60 % pacientů, přičemž však jsou problémy s toxicitou, léku zvláště u imunitně kompromitovaných pacientů. Mezi mnoha vážnými případy infekce dětí virem lidské imunodeficience (HIV) zaujímá PCP výjimečné postavení vlivem svého vysokého výskytu, ojedinělého rozložení podle věku a časté úmrtnosti. PCP je nejběžnější vážná oportunní 30 infekce dětí infikovaných HIV; výskyt PCP mezi malými dětmi infikovanými HIV bez profylaktického ošetření je odhadován na nejméně 12 % v prvním roce života. Mnoho dětí umírá krátce· po rozvinutí nemoci PCP.

Mycobacterium Avium Complex (MAC) patří k infekcím, jež působí čeleď_velmLpodobnvch_ 35 mykobakteriálních organizmů Mycobacterium avium a Mycobacterium intracellulare, Pokud se vyskytuje u lidí imunitně nekompromitováných, je obvykle ve formě infekce dýchacího ústrojí. U pacientů trpících AIDS je MAC obvykle diseminován (diseminovaný MAC nebo DMAC) a· téměř každý orgán může být zasažen, V nedávném výzkumu bylo zjištěno, že baktérie MAC byly nalezeny u 43 % pacientů, kteří přežili 2 roky po diagnostikování AIDS. Pro diseminovaný 40 MAC nebyla nalezena žádná standardní terapie. Obvykle se předepisují kombinace léků, a jsou-li úspěšné, vyžaduje se jejich doživotní podávání. Naléhavě je třeba účinnějšího způsobu léčby.

Osoby nakažené HIV jsou zvláště náchylné k infekcím Mycobacterium tuberculosis a průběh nemoci se urychluje. Zatímco u osob neinfikovaných HIV je extrapulmonární tuberkulóza neob45 vyklá, u HlV-pozitivních osob se často vyskytuje. CDC zveřejnila směrnice pro léčbu TBC, jež zohledňují rostoucí výskyt tuberkulózy odolné vůči širokému spektru léčiv (MDR-TB). Úmrtnost mezi pacienty AIDS s MDR-TB je velmi vysoká (asi 80 %) a postup nemoci je extrémně prudký.

Proto existuje naléhavá potřeba vývoje nových způsobů léčby těchto infekcí, jež jsou u lidí i zvířat tak časté a trvale je ohrožují.

Také existuje potřeba mít k dispozici širokospektré léky pro zjednodušení léčby infekcí způsobených motolicí (trematoda). V současné době je nutno diagnostikovat specifickou patogenní moto55 liči a předepsat lékovou terapii specifickou pro danou motolici. Mnoho méně vyvinutých zemí

-2CZ 298270 B6 není vybaveno prostředky pro diagnostikování specifické motolice. Nalezení léku se širokou působností by odstranilo potřebu této diagnózy.

Schisíosoma mansoni, krevní motolic, je původcem schistosomiázy, druhé nej významnější tro5 pické parazitární choroby lidí po malárii, a nejdůležitější infekcí motolicí u lidí. Schisíosoma haematobium je jiný významný druh infikující člověka. Ve světovém měřítku trpí schistosomiázou více než 200 miliónů lidí včetně několika set tisíc osob v USA.

Fasciola hepatica, běžná jatemá motolice, je především chorobou ovcí, ale člověk bývá náhod10 ným hostitelem. Tento parazit dokáže přežít i při silné imunitní odezvě hostitele. Pro léčbu se nabízí bithionol, který však není ve Spojených státech schválen.

Proto trvá potřeba farmaceutické kompozice s dlouhou skladovatelností i v tropických podmínkách a se širokou působností proti motolicím.

Podstata vynálezu

Nyní bylo pozorováno při výzkumech na zvířatech a při klinických výzkumech na lidech, že účinnost léčby za použití sloučenin vzorce I a II závisí na velikosti částice aktivní složky léku a na stabilitě sloučeniny.

Popsané farmaceutické kompozice jsou vhodné pro léčbu nákaz lidí a zvířat motolicí způsobených patogeny Schisíosoma, jako například Schistosoma mansoni, Schisíosoma haematobium,?

Schistosoma mekongi, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum; patogeny Fasciola,i jako například Fasciola hepatica a Fasciola gigantica, Fasciolopis biski; a Dicrocoelium dendri-* ticum, Heterophyes heterophyes a Metagonimus yokogawa.

Farmaceutické kompozice jsou též účinné při léčbě imunokompromitovaných pacientů trpících oportunními infekcemi patogeny Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Enterocytozoon bineusi, Encephalitozoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii a Toxoplasma gondii.

______Farmaceutická kompozice může byt ve formě vhodné pro orální aDlikaciJako_pevná_dávkovací_____________ 35 forma, kapalná suspenze nebo jako pasta.

Přehled obrázků na výkresech

Pro lepší porozumění podstaty a předmětu tohoto vynálezu by bylo užitečné odkázat na následující podrobný popis, který je třeba vnímat s připojenými obrázky, ve kterých:

Obrázek 1: ukazuje procenta inhibice a přežívání buněk hostitele při aplikaci nitazoxanidu proti E. intestinalis.

Obrázek 2: ukazuje procenta inhibice a přežívání buněk hostitele při aplikaci nitazoxanidu proti K corneae.

Obrázek 3: ukazuje procenta inhibice a přežívání buněk hostitele při aplikaci albendazolu proti

E. intestinalis.

Obrázek 4: ukazuje procenta inhibice a přežívání buněk hostitele při aplikaci albendazolu proti

K corneae.

-3CZ 298270 B6

Obrázek 5 a 6: ukazuje hodnoty optické hustoty získané pro každou kultivační jamku vynášené proti koncentracím léku v kultuře.

Obrázek 7: je graf založený na zjišťování účinnosti nitazoxanidu proti mykobakterii pomnožené v kapalném živném bujónu.

Obrázek 8: ukazuje procento aktivních částic s objemem menším než příslušná hodnota velikosti Φ částic v pm.

Předmětem vynálezu jsou farmaceutické přípravky, obsahující jako aktivní složku nejméně jednu sloučeninu vybranou ze skupiny, kterou tvoří sloučenina vzorce I

a dále obsahující farmaceuticky přijatelnou kyselinu v množství zvyšujícím stabilitu.

Předmětem vynálezu je dále farmaceutický přípravek, obsahující jako účinnou složku sloučeninu vzorce II

a farmaceuticky přijatelnou kyselinu v množství postačujícím k nastavení pH farmaceutického přípravku mezi 2 a 6, uvede-li se farmaceutický přípravek do styku s vodou, přičemž uvedená účinná složka je ve formě pevných částic a přičemž poměr hmotnosti farmaceuticky přijatelné kyseliny k hmotnosti uvedených pevných částic je mezi 0,01 a 0,5.

Příklady takových kyselin jsou: kyselina citrónová, kyselina glutamová, kyselina jantarová, kyselina ethan sulfo nová, kyselina octová, kyselina vinná, kyselina askorbová, kyselina methansulfonová, kyselina fumarová, kyselina adipová, kyselina jablečná a jejich směsi. Velmi vhodná je kyselina citrónová. Přítomnost této kyseliny zvyšuje stabilitu účinné složky nebo složek.

Poměr hmotnosti farmaceuticky přijatelné kyseliny k hmotnosti uvedeným účinným pevným částicím je výhodně mezi 0,03 a 0,2. Výhodně je množství kyselina dostatečné pro nastavení pH suspenze mezi 2 až 6, výhodně mezi 3 a 5, zejména mezi 3,5 až 4,5.

Metody přípravy pevných a kapalných dávkových forem farmaceutického přípravku a jejich výhodné příklady jsou popsány v WO 95/28393, přičemž na tento dokument se zde odkazuje.

-4CZ 29827U B6

Přípravky výhodně obsahují smáčedlo a popřípadě derivát škrobu, jak je například popsáno v US 5 578 621, na jehož obsah se zde odkazuje. Smáčedlo, popsané v US 5 578 621, slouží jako dispergační prostředek.

Takovéto farmaceutické přípravky, ať jako pevné či kapalné dávkové formy nebo jako pasty nebo masti, mohou popřípadě obsahovat další účinné složky jako antibiotika, protivirové prostředky nebo inhibitory protonové pumpy. Ačkoli to není výhodné, je možné, aby tyto farmaceutické přípravky obsahovaly také účinné pevné částice sloučeniny vzorce I a/nebo sloučeniny vzorce II, které jsou větší než 200 pm.

Přípravky mohou obsahovat excipienty, jako takové známé, například za účelem přípravy forem vhodných pro orální aplikaci.

Výhodně, za účelem dosažení vynikající účinnosti proti širokému spektru parazitů, bakterií, hub a virů, je distribuční faktor uvedených účinných pevných částic mezi 0,8 a 2, výhodně mezi

1,1 a 1,9, zejména větší než 1,5, přičemž se tento distribuční faktor počítá podle rovnice

F⁽;o% ⁼ (Φ90% - Φιο%)/((Φ9ο% ⁺ Φιο%)/2), kde

F9o% je distribuční faktor při 90 %,

Φ₉ο% je maximální velikost částic frakce částic odpovídající 90 % aktivních pevných částic a;

Φιο% je maximální velikost částic frakce částic odpovídající 10 % aktivních pevných částic.

Podle konkrétního provedení vynálezu se částice sloučeniny vzorce I a/nebo vzorce II připraví výše uvedenou metodou a rozemelou tak, že méně než 10 % uvedených aktivních částic má, velikost větší než 10 pm, méně než 50 % Částic má velikost větší než 50 pm a méně než 10 % těchto účinných částic má velikost menší než 5 pm, přičemž střední velikost částic je mezi 20 a 50 pm. Tyto aktivní částice se pak granulují s použitím směsi obsahující aktivní pevné částice a alespoň jedno granulační činidlo. Příklady granulačních činidel jsou polyvinylpyrrolidon, voda, alkohol, .sacharóza-hydroxy.l-celulóza-a-jejich-směsi—V-ýhedně-se-během-granulačního-procesu-přidává· alespoň jedna farmaceuticky přijatelná kyselina.

Vynález se týká také pevný dávkových forem obsahujících přípravek podle vynálezu, jako jsou tablety, dispergovatelné tablety, povlékané tablety, matrice atd. Dávková forma podle vynálezu obsahuje například pevné aktivní částice s velikostí částic menší než 200 pm, přičemž méně než 10 % těchto částic má velikost větší než 100 pm, méně než 50% těchto částic má velikost větší než 50 pm a méně než 10 % těchto částic má velikost menší než 5 pm, přičemž střední velikost částic je mezi 20 a 50 pm;

alespoň jedno granulační činidlo;

- alespoň jedno smáčedlo;

alespoň jeden derivát škrobu a

- . alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou kyselinu, která se přednostně přidává během granu- lačního procesu.

Kapalné dávkové formy, jako jsou vodné suspenze podle vynálezu, obsahují například

- jako účinnou složku pevné Částice obsahující sloučeninu vzorce I a/nebo sloučeninu vzorce II s velikostí částic menší než 200 pm, přičemž méně než 10 % těchto částic má velikost

-5CZ 298270 B6 větší než 100 pm, méně než 50 % těchto částic má velikost větší než 50 pm a méně než % těchto částic má velikost menší než 5 pm;

alespoň jedno granulační činidlo;

alespoň jedno smáčedlo;

- alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou kyselinu, přičemž pH suspenze je mezi 2 a 6, přednostně mezi 3 a 5, zejména mezi 3,5 a 4,5;

alespoň jedno zahušťovadlo, například xanthanovou gumu, aguarovou gumu, krystalickou celulózu, carrubskou gumu, karboxymethylcelulózu nebo jejich směs.

ío Pastové nebo masťové formy podle vynálezu, vhodné pro orální aplikaci, obsahují například

- jako účinnou složku pevné částice obsahující sloučeninu vzorce I a/nebo sloučeninu vzorce II s velikostí částic menší než 200 pm, přičemž méně než 10 % těchto částic má velikost větší než 100 pm, méně než 50 % těchto částic má velikost větší než 50 pm a méně než 10 % těchto částic má velikost menší než 5 pm;

- alespoň jedno smáčedlo;

alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou kyselinu, přičemž pH suspenze je mezi 2 a 6, přednostně mezi 3 a 5, zejména mezi 3,5 a 4,5;

Pastové nebo masťové formy pro lokální nebo intravaginální aplikaci obsahující například

- jako účinnou složku pevné částice obsahující sloučeninu vzorce I a/nebo sloučeninu vzorce II s velikostí částic menší než 200 pm, přičemž méně než 10 % těchto částic má· velikost větší než 100 pm, méně než 50 % těchto částic má velikost větší než 50 pm a méně než

10 % těchto částic má velikost menší než 5 pm;

alespoň jedno smáčedlo;

- cetylalkohol a/nebo deriváty glycerídu a/nebo propylenglykol;

- alespoň jedno zahušťovadlo, například xanthanovou gumu, aguarovou gumu, krystalickou

---------celuIózurcarrubskou-gumu7karboxymethylcelulózu^_n'ebojějičlTšměš^ “

Způsob léčby infekcí zahrnuje podávání farmaceutického přípravku zahrnujícího jako účinnou složku alespoň jednu sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující desacetylnitazoxanid vzorce 1

-6CZ 298270 B6

Nitazoxanid (NTZ), sloučenina vzorce II, je generický název 2-(acetyloxy)-N-(5-nitro-2~thiazolyl)benzamidu, sloučeniny, kterou poprvé syntetizovali Rossignol a Cavier vr, 1975. 2 mg nitazoxanidu lze rozpustit v 1 ml DMSO. Nitazoxanid se snadno vstřebává při orálním podání.

Až dosud nebyl podán důkaz, že sloučeniny vzorce I a/nebo II by mohly být v širokém rozsahu účinné proti infekcím způsobeným motolicemi, nebo že by byly dostatečně netoxické, aby je snášely i imunokompromitované osoby.

Příprava a určitá použití pro nitazoxanid se popisují v patentu US 3 950 351 a v pracích publikovaných přihlašovatelem. Desacetyl-nitazoxanid, sloučenina vzorce I, se někdy uvádí jako tizoxanid nebo d-NTZ a je metabolitem nitazoxanidu.

V přihlášce WO 95/28393 popsal přihlašovatel způsob přípravy čisté sloučeniny vzorce II i použití kompozice obsahující směs sloučenin vzorce I a II.

Nyní bylo pozorováno, že pevná částice sloučeniny vzorce I, sloučeniny vzorce II nebo jejich směsí s velikostí částic mezi 170 a 520 μιη (střední velikost částice = 352 μπι) mají velice omezenou účinnost při orálním podávání lidem nebo zvířatům. Účinnost takových částic je menší než účinnost existujících farmaceutických produktů, a proto je pro komerční účely nepřijatelná.

Na psech též bylo pozorováno, že orální podávání jednotlivé dávky 50 mg pevných částic sloučeniny vzorce I a sloučeniny vzorce II s velikostí částic pod 50 μπι na kg hmotnosti psa způsobilo zvířatům závažné nepříznivé následky.

Nyní bylo zjištěno, že má-li být zajištěna účinná a bezpečná léčba infekcí způsobených lidem i zvířatům parazity, baktériemi, houbami a viry, musí farmaceutická kompozice, ať už v pevné dávkovači formě nebo kapalné suspenzi obsahovat účinnou dávku aktivní složky ve formě pevných částic obsahujících sloučeninu vzorce I a/nebo sloučeninu vzorce II s velikostí částice menší než 200 pm, přičemž střední velikost částice aktivních pevných částic je větší než 10 pm.

Přítomnost vysokého obsahu částic aktivní složky s velikostí větší než 200 pm vzhledem k obsahu částic velikosti mezi 5 a 200 pm významně snižuje chemoterapeutickou aktivitu sloučenin. Je výhodné, když farmaceutické kompozice podle vynálezu neobsahují více než 5 % hmotnostních aktivních-pevných-částic-velikosti-větší-než—200-pm—Nejvýhodnějšrje—když~farmaceuticke· kompozice podle vynálezu neobsahují prakticky žádné aktivní pevné Částice s velikostí větší než 200 pm.

Přítomnost vysokého obsahu částic aktivní složky s rozměrem pod 5 pm vzhledem k obsahu částic rozměrů mezi 5 a 200 pm může vyvolat u zvířat nebo u lidí záporné účinky. Kromě toho bylo zjištěno, že částice s rozměry pod 5 pm jsou rychleji vstřebávány ze Zažívacího traktu do krevního oběhu, a proto nejsou dostatečně účinné proti parazitům, baktériím, houbám a virům v zažívacím traktu zvířat a lidí.

Ani zkušení vědci nemohli předvídat, že velikost částice sloučeniny vzorce I a sloučeniny vzorce II by mohla mít tak významný dopad na jejich antimikrobiální aktivitu při léčbě zvířat a lidí. Například při výzkumech prováděných přihlašovatelem nevykázaly antiparazitické sloučeniny jako albendazol, mebendazol, niklosamid, praziquantel a metronidazol tak výrazný rozdíl antiparazitické aktivity při léčbě zvířat a lidí v závislosti na jejich velikosti částic. Kromě toho by ani zkušený vědec nemohl předvídat, že rozměry částic sloučeniny vzorce I a sloučeniny vzorce II by měly tak nepříznivý dopad na schopnost zvířat a lidí snášet podávání uvedeného aktivního prostředku.

Sloučeniny vzorce 1 a II mohou být podávány buď v pevné dávkovači formě, nebo jako vodné suspenze, ale dává se přednost, aby farmaceutické kompozice obsahovaly účinnou dávku aktivní

-7CZ 298270 B6 složky ve formě pevné Částice vzorce I a/nebo 11 s rozměrem částic pod 200 pm, přičemž je střední velikost uvedené aktivní pevné částice větší než 10 pm, stanoveno přístrojem Coulter®

Counter LS 100. Toto zařízení používá laserové paprsky vlnové délky 750 nm pro třídění částic v rozmezí 0,4 pm do 900 pm (průměr) podle lomu světla. Vzorky jsou měřeny ve vodě s malým přídavkem přípravku Triton X-100 pro zvýšení smáčivosti a deflokulaci prášku.

Je výhodné, když střední velikost částice uvedených aktivních pevných částic je mezi 10 a 100 pm, výhodně mezi 20 a 50 pm. Příklady výhodných kompozic jsou:

kompozice s méně než 10 % hmotnostními uvedených aktivních pevných částic s velikostí částic nad 100 pm;

kompozice s nejméně 50% hmotnostními uvedených aktivních pevných Částic s velikostí částic pod 50 pm;

Je výhodné, když střední velikost částice uvedených aktivních pevných částic je mezi 10 a 100 pm, výhodněji mezi 20 a 50 pm. Ve výhodném provedení kompozice má méně než 10 % uvedených aktivních pevných částic velikost částice menší než 5 pm.

Aktivní složka nebo složky použité v pevné dávkovači formě nebo suspenzi je výhodně směs pevných částic sloučenin vzorce I a vzorce II s velikostí částic menší než 200 pm, přičemž je hmotnostní obsah sloučeniny vzorce I vzhledem k hmotnosti sloučenin vzorce I a II v uvedené směsi mezi 0,5 % a 20 %, výhodněji mezi 0,5 % a 10 %.

Suchá čistá sloučenina vzorce I a suchá čistá sloučenina vzorce II byly podrobeny mletí a třídění sítovou technikou.

Po mletí měly částice sloučeniny vzorce I, vzorce II a jejich směsi distribuci velikosti částic podle obrázku 8. Obrázek 8 ukazuje procentuální podíl částic s menším rozměrem než příslušná hodnota velikosti Φ částic v pm.

Z tohoto obrázku vyplývá že:

- méně než 10 % hmotnostních částic mělo velikost částice menší než přibližně 5 pm;

méně než 10 % hmotnostních částic mělo velikost částice větší než přibližně 70 pm;________ střední velikost částice je přibližně 40 pm;

- distribuční faktor částic je asi 1,73, přičemž se uvedený distribuční vypočítal podle rovnice:

~ (Φ«ο% ^_ Φιο%)/((Φ90% + Φιο%)/2) ve které

F_90O/o je rozdělovači součinitel při 90 %,

- ®9o% je maximální velikost částice ve frakci částic odpovídajících 90 % uvedených aktivních pevných částic a

Φιο% je maximální velikost částice ve frakci částic odpovídaj ících 10 % uvedených aktivních pevných částic.

Následující tabulky ilustrují konkrétní příklady takových kompozic.

Tabulka 1

Příklad kompozice dispergovateiaých tablet pro orální podávání obsahujících jako aktivní složky sloučeninu vzorce II a sloučeninu vzorce I
Nitazoxaníd (99 %) + desacetylrmtazoxanid (1 %)	200: mg
Mikrokrystalická celulóza Aviccl pH 1,02 od firmy FMC-USA	116 mg
Krospovidón	25mg
Stearát hořečnatý	3mg
Koloidní oxid křemičitý	5mg
Kyselina citrónová	10 mg
Jahodová příchuť č. 877720 od firmy Robertct	lOmg
Sacharinát, sodný	2mg

Tabulka 2

Příklad kompozice povlečených tablet pro orální podávání obsahujících; jako aktivní složky sloučeninu vzorce II a sloučeninu vzorce I
Nitažoxanid	500 mg
Kukuřičný škrob	60 mg
Předželatinovaný kukuřičný škrob	70 mg
: Hydroxyprópylmethylcelulóža	5 mg
Sačharóza	20-mg-

Sodná sůl glykolátu: škrobu	3,0 mg
Kyselina citrónová	25 mg
Mastek	8 mg
Stearát hořečnatý	7 mg

Povlaky: na tablety nebo granule obsahující 500 mg aktivní složky se nastřikuje horký cukrový roztok nebo povlakový film.

Tabulka 3

Příklad vodné suspenze pro orální podávání obsahující jako aktivní složky sloučeninu vzorce II a sloučeninu vzorce I. Suspenze měla pH asi 4,1.
Nitazoxanid (98 %) + desacetyl-nitazoxamd (2 %)	2.;g
Destilovaná voda	....... 100 ml
Benzoát sodný	o^g
Sacharóza	30,5 g
Xanthanová guma	0,2 g
Mikrokrýstalickácelulóza. a sodná sůl karboxymethylcelulózy Avicel RC-591 od firmy FMC - USA	0,8 g
Kyselina- citrónová	0,2 g
Dihydrát citrátu sodného	50 mg
i Jahodová pří chuť č. 877720 od firmy Robertet	ί 25 mg
Červené barvivo č. 33 D a C	1 mg

Tabulka 4

Příklad pasty pro orální podávání obsahujících jako aktivní složky sloučeninu vzorce II a sloučeninu vzorce I
Nitazoxanid (98 %)·+ desáčetyl-nitazóxanid (2 %)	500 mg
.Minerální olej	10g
Hnčdýcukr	lg
Mikrokrystalická celulóza a sodná sůl karboxymethylcelulózy Avičcl RC-591od firmy .FMC - USA	0,8 g
Kyselina citrónová	0,2 g

. 10CZ 298270 B6

Tabulka 5

Příklad formulace pasty nebo masti pro intravaginální nebo lokální aplikaci, kde pasta obsahuje jako aktivní složky sloučeninu vzorce II a sloučeninu vzorce I
Nitazoxanid (98 %) + desacetyl-nitazoxanid (2 %)	8g
Cremaphor A6	2g
Cremaphoř A25	1.5 g .
Minerálníolej	7g·
Luvitol EHO	T.z
Monoester glycerólu	^{4 g;}.
Cetylalkohol	3g
Simetičoh	: 0,5 g
GermabenU	ig:
Propylenglykol	3,5g
Destilovaná voda	'62,5 g

Farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou kompozice s širokým spekťrem účinků na parazity, baktérie, houby a viry, zvláště když jsou podávány orálně.

Účinnost a bezpečnost výše popsaných farmaceutických kompozic při podávání zvířatům i lidem byly vynikající, Při klinických výzkumech na lidech bylo konkrétně zjištěno, že účinnost výše uvedených farmaceutických kompozic je při léčbě parazitárních onemocnění výrazně vyšší než u těchže formulací při použití aktivní sloučeniny s velikostí částice mezi 170 a 520 pm (střední 10 velikost částice = 352 pm), i když se větší částice podávaly pacientům v dávkách až třikrát vyšších a po delší dobu. Příklady rychlostí uzdravení jsou uvedeny níže v tabulce 6.

-11CZ 298270 B6

Tabulka 6

Porovnání výsledků klinických výzkumů na lidech za použití sloučenin vzorce I, a vzorce Π š velikostmi Částic v rozmezí 170 pm až 520 pm (střed = 352 pm) s výsledky získanými při použití sloučenin vzorce ί a vzorce II s velikostmi Částic v rozmezí od 5 pm do 200 pm (střed = 34 pm)
Sloučenina vzorce I (98 %) T sloučenina vzorce II (2 %)
	Velikost Částic 170 až 520 pm	Velikost částic 5 až 200 pm
	Dávka: 15 až 50 mg/kg/dén po dobu 3 až 7 dní	Dávka: 15mg/kg/denpo dobu 3 dní
	Počet vyléčených/celkem = % vyléčení	Počet vyléčených/celkem = % vyléčení
Parazit
Blastocystis homirns	12/27 =44 %	10/10 = 100%
Entampeba histolytica	28/47 = 62,%	106/133 = 80 0
Giardia lambiá	11/37 = 30%	50/73 = 68 %
Ascarís lumbricoides	^! _s 3/39 = 4%	144/179 = 80%
Trichuns trichiura	7/48 = 15 %	58/79 = 73%

V případě všech parazitů uvedených v tabulce 6 byl podíl uzdravených výrazně lepší pro pacienty léčené aktivními částicemi velikosti mezi 5 a 200 pm než při léčbě aktivními částicemi v rozmezí velikostí 170 až 520 pm, přičemž ve všech případech byla statistická významnost p < 0,02 (při použití standardního testu X²). Tak tomu bylo i když dávky aktivního činidla s větší velikostí částic byly běžně vyšší a doETlěčby bylacasto dělšíňěž^_doBapodáváňrfarmaceutičl<ýčlTkompozic aktivního činidla s velikostí částic pod 200 pm. U žádné skupiny pacientů se nevyskytly nežádoucí účinky.

...

Výsledky podobné výše uvedeným údajům z výzkumů na lidech byly zjištěny i při testech na zvířatech.

Kromě toho nežádoucí účinky pozorované na psech po orální aplikaci jednorázové dávky 50 mg 15 sloučeniny vzorce 1 a sloučeniny vzorce II na kg hmotnosti psa nebyly pozorovány při důkladných výzkumech na zvířatech při použití sloučeniny vzorce 1 a sloučeniny vzorce II s velikostí částice mezi 5 a 200 pm (střed > 10 pm), i když byla podávána tatáž dávka nebo vyšší dávka těchto sloučenin denně po dobu 90 dní nebo déle.

Kromě toho byly uvedené kompozice stálé (i v podmínkách 40 °C a 65 % relativní vlhkosti po dobu šesti měsíců, nebo v případě kapalných suspenzí, když byly suspendovány ve vodě za uvedených podmínek, po dobu 3 měsíců), čímž je zajištěno, že aktivní složky nedegradují a že kompozice udržují svou účinnost po takovou dobu po přípravě, jež je vhodná pro léčebné a komerční účely.

V dalším bude ukázána účinnost farmaceutických kompozic.

- 19. CZ 298270 B6 j

i í

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Cryptosporidium parvum

V přípravném klinickém experimentu se 30 osob trpících AIDS s chronickým kryptosporidiálním průjmem léčilo orálním podáváním nitazoxanidu při denních dávkách 500 až 2000 mg. Pokud průjem neustal, podávání nitazoxanidu pokračovalo další 4 týdny s maximální denní dávkou 2000 mg.

Dvacet osm osob dokončilo dva nebo více týdnů léčby a do osmého týdne po léčení bylo 16 žních schopno vyhodnocení z hlediska terapeutické odezvy, V této poslední skupině 12 osob vykázalo 50% nebo větší omezení denní frekvence vyměšování a deset jednotlivců vykázalo výrazné snížení nebo úplné vymýcení parazitů ve stolici, přičemž u čtyř osob byl tento organizmus neprokazatelný. Šest pacientů splnilo kritéria klinické a parazitologické odezvy.

Pacienti, jimž byly podávány vyšší denní dávky léku po delší dobu, měli větší šanci na pozitivní odezvu.

Pokus s nitazoxanidem při kryptosporidiálním průjmu v důsledku AIDS za použití značení fluorescenční látkou prokázal pokles frekvence vyměšování u osob, jimž bylo denně podáváno 500, 1000, 1500 nebo 2000 mg léku. Účastníci pokusu vykazovali počty CD4+ 42 buněk/mm³(v rozsahu 0-303 buněk/mm³), průměrný počet denních stolic 6,7 během 15 měsíců, oocysty Cryptosporidium parvum ve stolici a žádné další zjevné střevní patogeny. Téměř u všech účastníků selhala terapie s azithromycinem nebo paromycinem.

Po 23 týdnech mělo 9 osob ze 13 kompletní klinickou odezvu (převážně tvarovanou stolici.jednou až třikrát denně) a 4 ze 13 vykázaly částečnou klinickou odezvu (nejméně 50% pokles denní frekvence stolice nebo změnu konzistence stolice na nejméně 75 % tvarované stolice). Do ukončení pokusu došlo u 8 z 11 osob k úplnému vyhlazení parazita a další 3 vykázaly podstatné sní.žení-koncentrace-oocystů.-By.Lzjištěn-trend-k-lepší-odezvě-při.dávkách_1.000_mg.denně_a_v.yšších. a pří delší léčbě. Tri účastníci pokusu dostali kopřivkovou vyrážku na pokožce; zdravotní režim dodržovalo více než 90 % účastníků více než čtyři týdny.

Příklad II

Ciyptosporidium parvum

Pokus in vitro, údaje o dávkování:

Nitazoxanid se rozpustil ve sterilním dimethylsulfoxidu (DMSO) a zkoušel se na jednobuněčných vrstvách infikovaných intaktními oocystami Cryptosporidium parvum při koncentracích 100 pg/ml, 10pg/ml, 1 pg/ml a 0,1 pg/ml. Paralelně se provedl druhý test při koncentracích nitazoxanidu 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml a 0,02 pg/ml. Těchto koncentrací se docílilo technikou postupného ředění za použití kompletní živné půdy DMEM až do dosažení finální koncentrace DMSO 0,5%. U kontrolního média (půdy) se dosáhlo téhož zředění.

Při pokusu se užilo buněčné kultury MDBKF5D2 vypěstované v sedmimilimetrových komůrkách; jako Cyklosporidium parvum oocysty GCH1 v počtu 5 x 10⁴ na jamku; šlo o porovnání paromomycinu (pozitivní kontrola) proti nitazoxanidu (experimentální lék). Obsaženo bylo i . n CZ 298270 B6 imunní králičí antisérum obsahující sporozoity Cryptosporidium parvum (0,1 %) a s fluoresceinem konjugované kozí sérum proti králičí protilátce (1 %).

Test toxicity:

200 μΐ půdy obsahující nitazoxanid při koncentracích 100, 10, 1 a 0,1 pg/ml a příslušné kontrolní půdy se umístily do dvou jamek plotny s 96 jamkami obsahujících konfluentní jednobuněčné vrstvy buněk MDBKF5D2 a do dvou jamek bez této vrstvy. Lék se na jednobuněčných vrstvách inkuboval při 37 °C a 8% CO₂; po 24 hodinách (první pokus) a 48 hodinách (druhý pokus) se do io každé jamky přidal MTS (Owenúv roztok) a PMS v množství 333 pg/ml resp. 25 μΜ. Plotna se vrátila do inkubátoru a potmě se vyvíjela dvě hodiny. Potom se odebralo svrchu kultury 100 μΐ supematantu a převedlo na novou plotnu s mikrotitrem pro zj ištění optické hustoty přístrojem ELISA při 490 nm. Výsledky se zaznamenaly a analyzovaly. Toxicita v procentech se vypočítala odečtením střední optické hustoty (OD) supematantu z kultury s lékem od OD supematantu kont15 rolní půdy bez léku, vydělením střední optickou hustotou supematantu z kontrolní půdy a násobením 100.

OD půdy - OD léku x 100

OD půdy

Test intaktních oocystů Cryptosporidium parvum

Na konfluentních jednobuněčných vrstvách MDBKF5D2 se při 37 °C a v prostředí 8% CO₂inkubovaly v nitazoxanidu (100, 20, 10, 2, 1, 0,2, 0,1 a 0,02 pg/ml) oocysty Cryptosporidium 25 parvum v množství 5 x 10⁴ na jamku. Stupeň infekce v každé jamce se stanovil imunofluorescenční analýzou po 24 a 48 hodinách. Inhibice v procentech se stanovila odečtením průměrného počtu parazitů na 10 polí v medikováných jamkách od průměrného počtu parazitů na 10 polí v jamkách s kontrolní půdou bez léku, dělením tohoto rozdílu průměrným počtem parazitů v kontrolních půdách a násobením stem.

počet v kontr. půdách - počet v půdách s lékem x 100 počet v kontrolních půdách

V ýsl edky:------Pokus 1: 24 hodin

Sloučenina.	Koncentrace	Střední (+SD)*	Toxicita %	Inhibice %
Infikovaná půda	o	983.5 (±128,2)	0;	0
Paromomycin	2 mg/ml	482 (±47,1)	23,8	51
NTZ	100 pg/ml 10 pg/ml 1- pg/ml 0,1 Mg/ml	ztráta 55,5(±13,S) 224,5(±28,5) 474,5(+29,5)	88,1 65,1 8.3 19.3	NA** 94,4 77,2 51,8

* Počet parazitů/10 polí ** Není k dispozici vlivem toxicity _ ld _

Pokus 2: 48 hodin

Sloučenina	Koncentrace	: Střední (+SD)*	Tóxičita %	Inhibice %
Infikovaná půda	0	2231,25 (+90,03)	0	0
Paromomycin	.2 mg/ml	580(+33,42)	40,8	74,01
NTZ	70 pg/ml 2 pg/ml 0,2 pg/ml 0,02 pg/ml	68,75(+13,77): 113,75(+21,36). 1020(+158,48) 1041(+191,46)	92,87 24,93 16,56 21,23	96,92 94,90 54,29 53,33

* Počet parazitů/10 polí

Účinek nitazoxanidu na intaktní oocysty Cryptosporidium parvum

V pokusu 1 měl nitazoxanid při koncentracích 10, 1 a 0,1 pm/ml za následek hodnoty inhibice parazitů 94,4, 77,2 a 51,8 % a toxicitu vůči buňkám v procentech 65,1, 8,3 a 19,3 %. Třebaže při zředění 10 pg/ml došlo k téměř úplné inhibici infekce parazity, byly zřejmé vysoké stupně toxi- city. Při zředění 1 pg/ml nitazoxanidu vyšlo příznivě srovnání s paromomycinem koncentrace 2 mg/ml z hlediska inhibice parazitů i toxicity vůči buňkám (77,2% inhibice parazitů a 8,3 % celulární toxicity v případě nitazoxanidu při zředění 1 pg/ml ve srovnání s 51% inhibici parazitů a 23,8% toxicity vůči buňkám v případě paromomycinu při 2 mg/ml).

Při pokusu 2 se lék modifikoval s cílem dosáhnout lepší distribuce dávek při minimální toxicitě.

V důsledku toho zůstaly kultury živé i po 48 hodinách a nejen po 24 hodinách jako v pokusu 1. Inkubace po dobu 48 hodin měla samozřejmě za následek vyšší relativní toxicitu vůči buňkám jak ukazuje srovnání s paromomycinem v obou pokusech. Koncentrace nitazoxanidu 20 pg/ml byla při inkubaci 48 hodin stále příliš toxická, i když se jednobuněčná vrstva zdála dosud

20----intaktní-Je-možné-že-vysoká-toxicita-nutně-ovlivňuj ící-funkc i-buněk-má-rovněž-účin ek-na-v-ý-vojinfekce parazitem. Při zředění 2 pg/ml nitazoxanidu byla zábrana infekce parazitem značná při relativně nízké celulární toxicitě. Další ředění rovněž měla za následek značnou inhibici a nízkou toxicitu vůči buňkám. Při koncentraci léku 2 pg/ml mírná toxicita vůči buňkám a inhibiční aktivita 94,90 % ukazuje, že nitazoxanid je při koncentraci 2 pg/ml vhodnější než paromomycin při infekci Cryptosporidium parvum in vitro než paromomycin při koncentraci 2 mg/ml (tisíckrát vyšší koncentrace).

Příklad III

Cryptosporidium parvum

Informace: dávkování a přechovávání in vitro

Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid (NTZ a NTZdes) byly zkoušeny na jednobuněčných vrstvách infikovaných intaktními oocystami Cryptosporidium parvum a excystovanými sporozoity při 35 koncentracích 10, 1, 0,1 a 0,01 pg/ml. Každá sloučenina se rozpustila v 100% dimethylsulfoxidu (DMSO) a zředila sterilním médiem DMEM. Každá koncentrace nitazoxanidu stejně jako kontrolní média obsahovala konstantní množství DMSO 0,025 %.

Při pokusu se užilo buněčné kultury z buněk MDBKF5D2 vypěstované v sedmimilimetrových komůrkách; jako Cyklosporidium parvum použity oocysty GCH1 v počtu 5 x 10⁴ na jamku; šlo

-15CZ 298270 B6 o porovnání paromomycinu (pozitivní kontrola) proti nitazoxanidu (experimentální lék). Obsaženo bylo i imunní králičí antisérum obsahující sporozoity Cryptosporidium parvum (0,1 %) a s fluoresceinem konjugované kozí sérum proti králičí protilátce (l %).

Test toxicity:

200 μΐ půdy obsahující nitazoxanid při výše uvedených koncentracích a příslušné kontrolní půdy se umístily do dvou jamek plotny s 96 jamkami obsahujících konfluentní jednobuněčnou vrstvu buněk MDBKF5D2 a do dvou jamek bez této vrstvy. Lék se na vrstvách inkuboval při 37 °C 8% 10 CO₂; po 48 hodinách se do každé jamky přidal MTS (Owenův roztok) a PMS v množství 333 pg/ml resp, 25 μΜ. Plotna se vrátila do inkubátoru a potmě se vyvíjela dvě hodiny. Potom se odebralo svrchu kultury 100 μΐ každého supematantu a převedlo na novou mikrotitrační plotnu pro zjištění optické hustoty přístrojem ELISA při 490 nm. Výsledky se zaznamenaly a analyzovaly. Toxicita v procentech se vypočítala odečtením střední optické hustoty (OD) supematantu 15 z léku od střední optické hustoty OD supematantu kontrolní půdy bez léku, vydělením střední optickou hustotou supematantu z kontrolní půdy a násobením 100.

OD půdy - OD léku x 100

OD půdy

Klasifikace cytotoxicity byla stanovena takto: 0,5% toxicita = 0,6% až 25% toxicita = 1, 26% až 50% toxicita = 2, 51 % až 75% toxicita = 3 a 76 až 100% toxicita = 4. Platí, že cytotoxicita 0 až 1 se má považovat za přijatelnou úroveň toxicity. Toxicity hodnot 2, 3 a 4 se uvažují jako vysoce toxické pro jednobuněčnou vrstvu.

Testování intaktních oocystů Cryptosporidiumparvum

Na konflueňtních jednobuněčných vrstvách MDBKF5D2 se při 37 °C a v prostředí 8% CO₂inkubovaly v nitazoxanidu při výše uvedených koncentracích oocysty Cryptosporodium parvum v množství 5 x 10⁴ na jamku. Stupeň infekce v každé jamce se stanovil ímunofluorescenční ana30 lýzou po 48 hodinách a analyzoval počítačem. Inhibice v procentech se stanovila odečtením průměrného počtu parazitů na pole v medikovaných jamkách od průměrného počtu parazitů na pole v jamce s kontrolní půdou bez léku, dělením tohoto rozdílu průměrným počtem parazitů v kon______trolních půdách a násobením stem.__________________________________________________________ počet v kontr. půdách - počet v půdách s lékem x 100 počet v kontrolních půdách

Výsledky:

Pokus s oocystami Cryptosporidium parvum (48 hod.)

Léky	Konc.	Parazit	±SD	Tox/0 D	±SD	Inhib. %	Tóx; %	Klasifikace
Vodná média	0	681,58	±271,02	2,024	±0,18:	0	o	0
Paromomycin	2000	115,75	±44,65	1,219'	±0.009	83,02	39,79	2
DM$0 média 0,025	0	628,50.	±171,94	1,799	±1,45	0	0	0
ΝΊΖ	10^L	11,75	±733	0413 1,618	±0,13'	98,13	77,07	4
	1	. 39,67	±1323	±0326	93,69	10,09	1
	0,1 0,01	643*42	±229,73	1 87»	±0,154	SO	£0	0
	. '714.33	±194/79	. 1,617'	±0,072	£0	10,12	1
Nové NTZdes·	10	13,75	16,66	0337	±0,005	97,81	: 8127	4
	1	39,92.	±13,49	1.710r	±0,033	93,65	4,97	0:
	o.l	649,86·	±152,19	1.506	±0,119	S0	i 1629	1
	0,01	749,33	±139,49	1,721	’ ±0,144	£0	436	0

- ΐή.

Konc. - pg/ml; Parazit - průměrný poěet parazitů/pole (analyzováno 12 polí); Inhib. % - inhibice infekce parazitem v %; Tox % - toxicita léku vůči buňkám v %.

Z výše uvedeného je zřejmé, že inhibiční aktivita NTZdes je stejná jako u NTZ v příkladu II.

Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid byly stejně účinné in vitro vůči Cryptosporidium parvum při paralelních testech, získány výsledky 98% až 94% inhibice při ředěních 10 a 1 pg/ml pro obě sloučeniny. V případě nitazoxanidu bylo zředění 1 pg/ml nejnižší koncentrací dosahující více než 90% inhibice, zatímco 50% inhibice bylo možno dosáhnout s nižší koncentrací nitazoxanidu například 0,2, 0,1 a 0,02 pg/ml. V těchže experimentálních podmínkách paromomycin použitý 10 jako pozitivní kontrola byl 200krát méně účinný, protože dosahoval při koncentraci 2000 pg/ml inhibiční účinností jen 51 až 83 %.

Příklad IV

E. intestinalis a V. comea

Buňky 2RK-13 (jatemí buňky králíka) se uložily na kultivační plotny s 24 jamkami v množství

2,6 x 10⁵ buněk na jamku (1,0 ml média, RPMI 1640 s 2 mM L-glutaminu a 5% teplem aktivo20 vaně hovězí fetální sérum). Plotny se inkubovaly přes noc v inkubátoru s atmosférou CO₂ při teplotě 37 °C, během té doby se jamky spojily (jedno zdvojení, takže množství buněk na jamku bylo asi 5 x 10⁵).

K hostitelským buňkám se přidaly organizmy Septata intestinalis (z tkáňových kultur) v množ25 stevním poměru asi 3:1, tedy asi 15 x 10⁶ organizmů na jamku. Výsledkem tohoto poměru bylo, že se infikovalo asi 50 % hostitelských buněk.

Léky se rozpustily v DMSO, vodě nebo methanolu (v závislosti na rozpustnosti) na roztoky koncentrace l,0mg/ml. Tyto roztoky se skladovaly při -70 °C. Všechna zředění v těchto experi30 mentech se prováděla v kompletním tkáňovém kultivačním médiu. Všechna zředění se zkoušela ve třech jamkách.

Médium (obsahující čerstvě zředěné léky) se nahrazovalo každé tři až čtyři dny.

Šestý den po přidání parazitů a léků se na buňkách zjišťuje toxicita. Kontrolní buňky s léky ale bez parazitů jsou studovány z několika hledisek: konfluence, morfologie buněk a zda jsou přítomny mrtvé nebo plovoucí buňky. Buňky inkubované pouze s parazity jsou kontrolovány z hlediska infekčnosti parazitů (přítomnost parazitofomích vakuol). Buňky inkubované s parazity a léky se hodnotí z hlediska toxicity pro hostitelské buňky a množství přítomných parazitofomích 40 vakuol (zdaje velké, střední, malé).

Desátého dne se do kultivačních jamek přidá 100 μΐ 10% SDS (cílová koncentrace 0,5 %), aby došlo k prasknutí membrán hostitelských buněk a uvolnily se mikrosporidie. Celkové množství parazitů v každé jamce se stanoví zjišťováním alikvotního množství hemacytometrem. Výsledky 45 se vyjadřují v procentech inhibice (v poměru k počtu infikovaných buněk bez přídavku léku).

Výsledky ukazují obrázky 1 až 4.

Příklad V

Toxoplasma gondii

-17CZ 298270 B6

Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid se testovaly proti parazitům, konkrétně proti Toxoplasma gondii kmen RH, udržovanému opakovanými pasážemi myšmi. Buněčné kultury fibroplastů MRC5 od firmy Bio-Merieux, Francie, byly v kultivačních plotnách o 96 jamkách inokulovány tímto kmenem Toxoplasma gondii. Do každé kultivační jamky (s výjimkou 8 kontrolních jamek 5 použitých jako negativní kontrola) se přidalo 200 čerstvě odebraných tachyzoitů. Po 4 hodinách inkubace se do těchto kultur přidaly zředěné roztoky léků.

Nitazoxanid (NTZ) a desacetylnitazoxanid (dNTZ) se zkoušely v koncentracích v rozmezí mezi 8x 10’⁴ a 40mg/l. Léky se nejdříve rozpustily v DMSO při koncentracích 2 mg/ml a pak se 10 postupným ředěním v kultivační půdě připravily v potřebných koncentracích. Nedošlo ke vzniku sraženin.

Tato zředění léků se přidala ke kulturám (na každé zředění 8 jamek) a následovala inkubace kultivačních ploten po dobu 72 hodin. Potom byly kultury fixovány studeným methanolem. Růst 15 Toxoplasma gondii se zjišťoval na přístroji ELISA za pomoci králičí protilátky proti Toxoplasma gondii značené peroxidázou. Pro každou jamku se zaznamenala hodnota optické hustoty.

Výsledky se prezentují grafem v němž se vynášejí údaje optické hustoty proti koncentraci léku v kultuře. Statistický rozbor spočíval v regresní analýze při intervalu spolehlivosti 95 % a stano20 vení křivek závislosti dávka/odezva z hodnot optické hustoty pro každý lék.

Jedna plotna byla kontaminována Giemsou pro zjištění jejího cytopatického účinku na kultury.

Byly provedeny tři oddělené experimenty. V každém experimentu se pro každou sloučeninu pou25 žilo dvou kultivačních ploten; v každé kultivační plotně se pro každou koncentraci léku použilo 8 replikačních jamek.

Výsledky:

Ve třech sadách pokusů byly získány podobné výsledky. Grafické znázornění výsledků jednoho reprezentativního pokusu pro každý lék je ukázáno v obrázcích 5 a, b, c a 6a, b, c.

Nitazoxanid (obrázky 5a, b, c);

Při koncentracích v rozmezí 10 ⁴ mg/1 a 0,3 mg/1 nebyl zaznamenán žádný inhibiční účinek. Značný efekt vykázala koncentrace >0,6 mg/1 a úplné inhibice růstu Toxoplasma se dosáhlo při koncentracích > 2,5 mg/1. Při koncentracích > 2,5 mg/1 však byla na jednobuněčné vrstvě zaznamenána výrazná toxicita.

Mikroskopické zkoumání jednobuněčné vrstvy ukázalo, že NTZ při koncentraci 1,25 mg/l vyvolalo na parazity infikovaných buňkách cytopatický efekt ve formě zvětšení parazitofomích vakuol a snížení počtu intracelulárních parazitů. Na základě regresní analýzy lze odhadnout, že 50% inhibiční účinek má zředění 1,2 mg/1.

Desacetylnitazoxanid (obrázky 7a, b, c):

S desacetylnitazoxanidem byly dosaženy obdobné výsledky: žádný účinek při koncentracích v rozmezí 10 ⁴ mg/1 a 0,3 mg/1, inhibice při koncentraci > 0,6 mg/1 a výrazná toxicita při koncentraci > 2,5 mg/1. Lze odhadnout, že 50% inhibiční účinek má zředění 1,2 mg/1,

Získané výsledky byly reprodukovatelné ve třech oddělených pokusech při hodnocení inhibičního účinku léku na opakovaných kultivacích pro každou koncentraci léku.

- IRCZ 298270 B6

U NTZ i desacetylnitazoxanidu bylo možno pozorovat při koncentracích kolem 1,2 mg/1 výraznou inhibici růstu Toxoplasma se změnami na parazitofomí vakuole, ale bez výrazných změn na samotném parazitu.

Tyto výsledky ukazují, že tyto látky mají dobrou aktivitu proti Toxoplasma gondii a že tento terapeutický účinek je možno očekávat in vivo při koncentracích kolem 1 mg/1 v séru nebo tkáních.

Příklad VI

Mycobacteria

Bylo zjištěno, že nitazoxanid má antimikrobiální aktivitu proti mykobakteriím tuberkulózy. Následující tabulka ukazuje výsledky zjišťování MIC nitazoxanidu a tizoxanidu (NTZdes) proti Mycobacterium intracellulare agarovou diluční technikou. Tyto výsledky jsou založeny na několika experimentech s použitím agarové diluční techniky na agaru Middlebrook, z nichž každý trval 3 týdny. Získané údaje prokazují, že nitazoxanid má MIC proti Mycobacteria 2 pg/ml a tizoxanid má MIC 4 pg/ml při použití standardního kmene Mycobacterium intracellulare od ATCC a standardní agarové diluční techniky.

MIC (minimální ínhibiční koncentrace) nitazoxanidu vůči Mycobacteria intracellulare

MIC*
nitazoxanid		2 pg/ml
tizoxanid		4 pg/ml

*MIC se stanovily standardní agarovou diluční technikou během 3 týdnů s použitím agaru Middlebrook 7H11. V tomto pokusu bylo použito M. intracellulare ATCC 13950, standardního kmene.

Obrázek 7 je graf založený na studiu účinnosti nitazoxanidu proti mykobakterii vypěstované v kapalném bujónu. Použili jsme kolorimetrickou analýzou MTS umožňující stanovit růst po 4hodinách ve~srovnán í~s'počítánímnaagarurkteré· to^- umožňuj e-po-3- týdnech—Jak-lze-vidět-naúdajích v obrázku 7, pokud se nitazoxanid přidal 72 Hodin po zahájení kultivace, bylo možno pozorovat bezprostřední účinek na kontinuální růst ve srovnání s růstem v samotném kontrolním médiu. Při dávce 3 pg/ml nitazoxanidu.se na příštích 24 hodin růst zastaví a potom další dva dny pokračuje pomalý růst. Dávka 50 pg/ml působila během 144 hodin kultivace dokonale bakteriostaticky.

Příklad VII

Cryptosporidium parvum

Účinek nitazoxanidu proti Cryptosporidium parvum byl zkoušen na experimentálně infikovaných myších. Nitazoxanid byl dodán firmou Romark Laboratoři es, L.C. Tampa, Florida.

Celková dávka pro člověka (1 g/den během 7 dní = 7 g) byla modifikována pro použití u myší podle Pageta a Bamese. Lidská dávka byla násobena faktorem 0,0026 pro myši (vážící přibližně

g) a získalo se celkové množství léku potřebné pro každého hostitele ráno a večer během 7 dní následujících po sobě. Každá myš přijala denně 2,6 mg (7000 mg x 0,0026/7). Dávky byly aplikovány orálně s použitím plastové injekční stříkačky se zakulaceným hrotem.

-19CZ 298270 B6

Dvacet (20) dvoudenních sajících myších mláďat se infikovalo orálním podáním 100 000 oocyst

Cryptosporidium parvum získaných z infikovaných telat. Před podáním myším se oocysty zkoncentrovaly pomocí cukerného roztoku technikou popsanou Fayerem a Ellisem. Všem myším byly odebírány rektální výtěry a denně zkoumány modifikovanou kontaminační technikou

Niehl-Neelsenovou popsanou Graczykem a dalšími. Oocysty se objevily v trusu 2 dny po orální í infekci zvířat. Od třetího dne po infekci zvířat bylo deseti myším podáváno 1,3 mg nitazoxanidu ráno a večer 7 dní po sobě následujících, zatímco 10 zbývajících myší se použilo jako neléčená ‘^! kontrola. Rektální výtěry byly odebírány denně všech sedm dní léčby a každý den sedm dní ;

následujících po ukončení léčby. Oocysty byly suspendovány v oleji a pod mikroskopem počítány v 100 polích.

Výsledky:

Výsledky ukázané v následující tabulce jasně dokazují, že nitazoxanid podávaný v denní dávce

2,6 mg/den 7 po sobě následujících dní byl účinný proti Cryptosporidium parvum a redukoval počet oocyst v trusu infikovaných myší, jak vyplývá ze srovnání s kontrolními zvířaty. Zkoušený lék snížil na konci třetího dne léčby uvolňování oocyst do stolice u 6 z 10 léčených myší. Sedmého dne na konci léčby byla tato produkce oocyst zcela eliminována a všechna léčená zvířata vykázala negativní výsledky při kontrole trusu na rozdíl od ne léčných kontrolních myší. Tento efekt trval po ukončené léčbě nejméně 7 dní jak vyplývá z negativního výsledku kontroly třetí a sedmý den po ukončení léčby.

Počet zjištčných oócysťpole v olejové imera
	3. den léčby	poslední den léčby	3. den po léčbž	7.dcnpoléCW
MyŠ č.	Kontrolní skup.	Léčená skup..	Kontrol· ni skup:	Léčená Skup;	Kontrolní skup.	Léčená skup.	Kontrol· ni skup.	Léčená skup.
1	3.0	0,0	5,0	0,0	. 4.0	0.0:	2.0	0,0
	4.0	0,0	4.0	0,0	3,0	0,0	1.0	0,0
3'	6,0	0,0‘	5.0	0,0	4,0	0,0	0,5	0,0
4.	3.0	2,0:	3.0	0.0	2,0	0,0	1.0	0.0
5	5.0	2,0	3.0	0,0	3,0	0.0.	0Λ	0,0.
ή	3.0.	0.0	4,0	0,0	5,0	0,0	2,0	0,0
7	3,0	0,0	5.0	ó,o	4.0	- ο,ο Ί	1,0	0;0

a·	5,0	1,0:	5.0	0,0	1,0	o,o-—	0.5	0,0
9<	3.0	3,0	3,0	°>9	2,0	0,0	i.o	0,0
10		0,0	5,0	0,0	2,0	0,0	o_?s	0.0
Celkem	, 35	8,0:	4.2 .	0,0	„30.	0.0	10	o,o
Pntmčr	'33	0,8	4,2	0,0	3,0	0,0	1.0	0.0
Účinnost		60%		100%		100%		100%

Příklad Vili

Mycobacterium

Nitazoxanid se srovnával s antibiotikem izoniazidem. Jako mykobakteriálního kmene bylo použito BCG (bacil Calmette a Guerin). Citlivost tohoto kmene byla tatáž jako u M. tuberculosis, ale tento kmen byl neškodnější a proto nevyžadoval žádná náročná opatření.

Myším bylo denně podáváno 4 mg léku na myš v 0,2 ml slunečnicového oleje. Výsledky u myší léčených nitazoxanidem byly srovnatelné se skupinou léčenou izoniazidem.

-20CZ 298270 Β6

	7--------	10⁵
	Slezina	Játra,	Plíce	Slezina	Játra	Plíce
Nilazo	lili	1,575.000 1,550.000 1,550.000 750.000;	57.500 122.500' 30.000 75.000	68.250 65.000 75.000 60.000	70.000 87.500 35.000 60.000	50 75 150 50
INH	.475,000 255.000 200.000	1,050.000. 750.000 975.000^:	11.000 5.750 4.000	20.000 15.250 60.000 20-000	21.250 27.500 52.5Ó0 37.500	50 125 50 50
PBS	¹ 1,500.000 1,525.000 ^! 1,925.000 1,675:000	2,125.000: 1,800,000 1,750 000· 1,8001000	92.500 98-000 177.500 '117.500	102.500 140.000 98.000 105.000	195.000 175,000 Í50.Ů00 15Q1000	750 800 500 750

Příklad IX

Fasciola hepatica

Účinnost nitazoxanidu a desacetylnitazoxanidu proti Fasciola hepatica byla zkoušena in vitro.

Dospělí jedinci Fasciola hepatica byli získáni ze žlučovodů jater tri telat poražených kvůli fasciolosis ve veterinární diagnostické laboratoři firmy Hardy's Meat Packers, Bunkie, LA. Motolice byly promývány jednu hodinu ve sterilním soleném roztoku a přeneseny do sterilního roztoku nebo RPMI (pH 7,4) na další 3 hodiny. Potom byly motolice uchovávány přes noc při 37 °C v prostředí s 5% CO₂ ve sterilní směsi RPMI-králičí sérum (objemový poměr 50:50) nebo sterilním RPMI (pH 7,4).

Kultivace in vitro (37 °C a 5% CO₂) byla provedena modifikací způsobu Ibarra a Jenkinse (Z. Parasítenkd. 70:655-661, 1984). Při dodržování sterilních podmínek se motolice dvakrát promyly po 2 až 3 minutách v Hankově rovnovážném solném roztoku (pH 7,2) a individuálně umístily do jamek kultivačních ploten Linbro se šesti jamkami obsahujícími alikvotních 10 ml zamýšleného zředění léku v kultivačním médiu. Toto médium sestávalo ze směsi (v objemovém poměřiTS 0”50)“ RPMEa král ič 1110367^2^-%^-král ičf krve a 100 ppm peniči 1 iima lOO^ppm^-Střep“ tomycinu. Použilo se výhradně motolic s normální aktivitou a morfologií.

Zásobní roztoky NTZ. nebo jeho metabolitu D-NTZ od firmy. Romark se rozpustily v DMSO (2000 μg/ml) a zředily v kultivačním médiu za použití volumetrické buňky s objemem 100 ml pro přípravu specifické koncentrace léku (100, 50, 25, 10, 5, 3, 1 pg/ml). V každé replikované kultuře byly umístěny dvě motolice, jedna v nesubstituované kultivační půdě s RBC a druhá v kultivační půdě bez léku a s RBC.

Motolice se zkoušely z hlediska účinků léků, jak se projevovaly smrtí, poruchami hybnosti nebo morfologickými změnami ve srovnání s nemedikovanými kontrolními motolicemi pomocí zezadu nasvíceného panelu a osvětlené třikrát zvětšující čočky.

Výsledky:

Experiment 1:

V případe D-NTZ byly motolice při zředění léku 50 a 100 μg během jedné hodiny mrtvé nebo skomírající. Při koncentraci 25 μg byly po první hodině 4 ze 7 motolic skomírající, dvě byly aktivní a jedna byla malátná; do tří hodin byly všechny mrtvé kromě dvou malátných a jen jedna motolice zůstala malátná naživu i po čtyřech hodinách. Při koncentraci léku 10 pg byla po 1,

-21 CZ 298270 B6 a 4 hodinách zaznamenána omezená aktivita a do 7 hodin byly všechny mrtvé nebo skomírající.

V případě zředění na 5 pg a 3 pg byla u některých jedinců pozorována snížená aktivita, přičemž v kategorii se zředěním 3 pg byl pozorován poněkud slabší nástup; ve skupinách s koncentrací léku 3 a 5 pg byly do 50 hodin všechny motolice mrtvé kromě jedné malátné motolice v každé skupině. Ve skupině s koncentrací léku 1 pg bylo po 42 až 74 hodinách pozorováno snížení aktivity a po 91 hodině zůstaly naživu jen 3 aktivní a jedna skomírající motolice; v této skupině 1 pg zůstala po 115 hodinách jen jedna malátná motolice. V kontrolní skupině s RBC byla úmrtnost sledována po 66 hodinách (jedna motolice), 91 hodinách (jedna motolice) a 115 hodinách (čtyři motolice). V kontrolní skupině bez RBC byly po 91 hodině naživu všechny motolice a po 115 hodinách byla jedna mrtvá.

Experiment 2:

V případě NTZ byla u 8 replikovaných případů pozorována ve srovnání s D-NTZ o něco větší aktivita časnějším ovlivněním hybnosti a úmrtnosti. U skupin s koncentrací léku 100, 50 a 25 pg byly po jedné hodině mrtvé nebo skomírající všechny motolice kromě jedné ve skupině 25 pg, jež byla mrtvá po třech hodinách. Ve všech ostatních medikovaných skupinách bylo po jedné hodině patrné snížení hybnosti v závislosti na velikosti dávky. Ve skupině 10 pg po 16 hodinách přežila jen jedna motolice. Ve skupině s koncentrací léku 5 pg byly po 6 hodinách aktivní jen 3 motolice a žádná nebyla aktivní po 16 hodinách. Ve skupině 3 pg byly po 23 hodinách naživu jen 2 malátné motolice; tyto však byly po 41 hodinách mrtvé. Ve skupině 1 pg uhynula do 16 hodin jedna motolice, do 41. hodiny tři motolice a do 74 hodin pět motolic; po 91 hodinách byly aktivní 3 motolice a po 115 hodinách si uchovala aktivitu jedna motolice. V kontrolní skupině s RBC bylo po 74 hodinách aktivních 7 z 8 motolic, po 91 hodinách 3 a dvě motolice zůstaly aktivní po 115 hodinách. V kontrolní skupině bez RBC bylo po 74 hodinách aktivních 6z8 motolic, po 91 hodinách 4 a dvě motolice zůstaly aktivní po 115 hodinách.

Ve skupinách s vysokou dávkou (25, 50, 100 pg) byla smrt motolic rychlá a byla spojena s kontrakcí a svraštěním („curling“) ventrální části. Při medikaci v nižších koncentracích většina motolic načas zpomalila a po smrti nebo při umírání byla ochablejší a zploštěná. Počínaje 91. hodinou se u některých replikovaných případů stala pro výsledky experimentů omezujícím faktorem kontaminace. V případě D-NŤZ došlo po 115 hodinách k vytvoření souvislého překrytí dvou replikovaných ploten bakteriálním nebo plísňovým porostem s následným úhynem. Při pokusu sNTZ toto překrytí a úhyn motolice na celých replikovaných plotnách nastalo po 91 hodinách (dvě replikované plotny) a 115 hodinách (5 replikovaných ploten). Pozorování po 139 hodině nebylo uznáno za validní pro celkovou kontaminaci většiny ploten.

Závěry:

Z pokusů s oběma zkoušenými léky vyplývá jejich značná účinnost při usmrcování motolic. Poněkud vyšší účinnost proti F. hepatica byla pozorována u nitazoxanidu než u desacetylnitazoxanidu, jeho hlavního metabolitu, o němž se soudí, zeje účinný na hepatické úrovni.

K rychlé smrti motolic dochází při aplikaci D-NTZ in vitro v koncentracích >50 pg během hodiny, při koncentracích 25 pg během 4 hodin a při koncentracích 10 pg během 6 až 7 hodin. Deset pg může být vhodnou jednorázovou léčebnou cílenou dávkou léku pokud farmakokínetická data ukazují, že tkáňové koncentrace se udrží >6 až 8 hodin po jednorázové léčbě.

Silná schopnost usmrcovat motolice do 74 hodin (tři dny) o obou sloučenin zjištěna při koncentracích 3 pg a 5 pg. Delší přežívání, avšak ne tak dlouhé jako u kontrolních nemedikovaných motolic, bylo pozorováno při koncentraci 1 pg; použití tohoto léku v této koncentraci na motolice v játrech po dobu 3 až 4 dnů proto může mít na parazity nedostatečný účinek.

Příklad X

Fasciola gigantica

Nitazoxanid byl testován na účinnost proti nedospělým a dospělým jedincům Fasciola gigantica na experimentálně infikovaných králících.

Encystované metacerkárie Fasciola gigantica (EMC) byly shromážděny na celofánové bláně až 35 dní po infekci plžů L calludi miracidiem Fasciola gigantica za použití techniky již 10 popsal Abdel-Ghany, v níž jsou plži denně vystaveni na 30 minut v čisté odchlorované vodě z vodovodu umělému světlu. Získané encystované metacerkárie (EMC) se 5 až 8 dní skladovaly při 4 °C v chladničce pod hladinou vody, dříve než se použily pro infekci experimentálních zvířat.

V tomto výzkumu bylo použito čtyřicet (40) králíků Boscat hmotnosti 1,5 až 2 kg, kteří byli zařazeni do dvou experimentálních skupin po 20 jedincích.

Zvířata ve skupině 1 se orálně infikovala 35 až 40 encystovanými metacerkáriemi zabalenými v listu hlávkového salátu vloženém na kořen jazyka zvířat. Tlamy zvířat byly ručně drženy zavře20 né dokud nedošlo ke spolknutí encystovaných metacerkárií. Této skupiny 1 se použilo pro testování nitazoxanidu proti nedospělým stádiím (4 až 5 týdnů starým) Fasciola gigantica.

Zvířata ze skupiny 2 se orálně infikovala stejně jako v první skupině 10 až 15 encystovanými metacerkáriemi a použilo se jich pro zkoušku účinnosti nitazoxanidu proti motolicím v ranném 25 stádiu dospělosti (stalým >10 týdnů).

Deseti zvířatům ve skupině 1 bylo v době vzdálené 4 týdny od jejich infekce parazity v nedospělém stádiu jejich vývojového cyklu podáváno 7 po sobě následujících dní ráno a večer 35 mg nitazoxanidu. Zbývajících 10 zvířat skupiny 1 tvořilo ne léčenou kontrolní skupinu.

Deseti zvířatům ve skupině 2 bylo v době vzdálené 10 týdnů od jejich infekce parazity v dospělém stádiu jejich vývojového cyklu podáváno 7 po sobě následujících dní ráno a večer 35 mg nitazoxanidu. Zbývajících 10 zvířat skupiny 2 tvořilo neléčenou kontrolní skupinu.

Až do ukončení experimentu byla všechna zvířata krmena suchou pící.

Sedm dní po podání poslední dávky nitazoxanidu byla všechna zvířata v obou skupinách usmrcena. Povrch jater se zkoumal z hlediska přítomnosti migrujících nekřótických rýh zvláště pro vývojová stádia nedospělých parazitů. Tyto nekrotické oblasti byly studovány pomocí dvou 40 chirurgických jehel s cílem získat migrující juvenilní motolice technikou, kterou popsal El-Bahy.

Játra se rozřezala na malé kousky zvláště v okolí migrujících rýh a macerovala pod mikroskopem s cílem extrahovat motolice. Břišní dutina a viscerální povrchy se promyly teplou vodou. Tato výplachová voda se spojila, prolila sítem a zkoumala na přítomnost juvenilních motolic. Všichni nalezeni parazité včetně jejich tělesných částí se spočítali u léčených i neléčených zvířat v obou 45 skupinách 1 a 2. Živé motolice měly světle růžovou barvu, byly průsvitné a měly neporušené integumenty, snadno se teplou vodou vyplavovaly z jaterních tkání, zatímco mrtvé motolice měly barvu našedlou, byly uvolněné a vykazovaly porušené nekrotické povrchy. Účinnost nitazoxanidu se vypočítala pomocí vzorce:

% účinnosti = a-b x 100 a

kde: a = počet motolic získaných ze stolice kontrolních zvířat;

b; počet motolic získaných ze stolice léčených zvířat.

. CZ 298270 B6

Výsledky:

Výsledky výzkumu uvedené v tabulce 7 ukazují výrazný pokles počtu nedospělých motolic extrahovaných z králičích jater léčené skupiny ve srovnání s kontrolní skupinou. Tento pokles v procentech byl průměrně 46,77 % (v rozmezí 40 až 60 %).

Tabulka 7

Účinnost nitazoxanidu proti nedospělým jedincům (4 týdny starým) Fasciola gigantica u pokusně infikovaných králíků.

Počet motolic získaných z králičích jater
Králík č.	Ncléčcnúkontrola	Léčení králíci	Účinnost %
1	7	^{? 4}	42%
2	7.	4-	42%
3.	6	3.	’ 50 %
........4'	8	4	50%
' 5_:	5	3,	40%
6.	•5	2'	60%
7		’ 3 ·	40%
8	6	.. ..	50%
9	8	-4	50%
10	5	3	40%
Průměr	&		46,77 %

Ve vývojovém stádiu ranné dospělosti motolic, jimiž byli králíci infikováni, vykazoval

---------------i-5^j----nitazoxanid-totální-účinnost-(-l-00%-redukci)-a.při.zkoumánLjater_léčených.králíků.nebylLzjíštěni_______________ žádní červi (motolice) ve srovnání se zvířaty z kontrolní skupiny neléčených králíků, jak je zřejmé z tabulky 8.

Tabulka 8

Účinnost nitazoxanidu proti jedincům v ranném stádiu dospělosti (10 týdnů starým) Fasciola 5 gigantica u pokusně infikovaných králíků.

Počet motolic získaných z.králičičh jater
Králík č._	Neléčcná kontrola	Léčctií králíci	Účinnost %
1	.4	0,0	100%
.2	4	0,0	100%
3	•3	.o;o	100%
'4	3 ’	0,0	100.%
.5	2	o;o	100%
6	2	0,0	100%
7	2	0,0	..... 100 %
,'8	3........	0,0	100%'
9	'3	0,0	100 %
io :	3	Q,0	100%
Prúrnér	2\9	0>0	100·%

Nitazoxanid podávaný 7 po sobě následujících dní v dávce 70 mg/den je mírně účinný proti nedospělým jedincům Fasciola gigantica a kompletně účinný proti těmto parazitům ve vývojovém stádiu ranné dospělosti, io

Příklad XIII

Schistosoma

T5----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------:--------Nitazoxanid byl zkoušen proti Schistosoma mansoni a Schistosoma hematobium v experimentálně infikovaných myších.

Čtyřicet (40) bílých myší hmotnosti 30 až 50 g bylo rozděleno do dvou léčených skupin po 20 20 zvířatech. První skupina byla infikována 300 až 500 volnými a aktivními cerkáriemi

Schistosoma mansoni suspendovanými v 0,25 ml destilované vody a intraperitoneální injekcí podanými všem myším. Druhá skupina byla infikována stejným způsobem, ale cerkáriemi Schistosoma hematobium. Obě skupiny potom byly chovány v laboratoři celkem 70 dní,

Sedmdesát dní po infikování zvířat bylo v každé skupině 10 zvířat léčeno nitazoxanidem dávkou

1,3 mg podávanou sedm po sobě následujících dní orálně ráno i večer. Sedm dní po ukončení léčby byla usmrcena všechna zvířata a z jater každé myši se perfuzí vlažnou vodou (37 °C) extrahovali červi. Získaní jedinci Schistosoma u všech léčených a kontrolních zvířat byli spočítáni. Účinnost nitazoxanidu byla vypočítána s použitím následujícího vzorce:

% účinnosti = a-bx 100 a

kde: a = počet jedinců Schistosoma získaných z výplachu kontrolních zvířat b = počet jedinců Schistosoma získaných z výplachu léčených zvířat.

-9S CZ 298270 B6

Výsledky:

Výsledky v tabulkách 9 a 10 jasně prokázaly, že nitazoxanid podávaný v dávkách 2,6 mg/den

7 dní po sobě následujících byl účinnější proti Schistosoma hematobium, kde bylo pozorováno snížení počtu červů o 82,85 % ve srovnání s kontrolními zvířaty, než proti Schistosoma mansoni, kde snížení proti kontrolní skupině myší dosáhlo jen 59,91 %. Tyto výsledky jsou konzistentní s výsledky ve zprávě Abaza a dalších, podle které nitazoxanid nebyl účinný při léčbě pacientů proti S. mansoni, jak vyplývá z pozitivního nálezu vajíček po léčbě nitazoxanidem.

Tabulka 9

Účinnost nitazoxanidu proti dospělým jedincům (13 týdnů starým) Schistosoma mansoni umyší.

Počet motolic odstraněných z myších jater
Mtyšč.	Neléčené kontrolní myši	Léčené myši
i.......	21	10
2	29	9
3 '	32	10
4	26	11
5	24	B
6‘	19	10
7^:	20	9
8	24	12
9	22	8
10	30	Ί
Celkem	24?	99
Průměř/myŠ	24,7	9,9
Účinnost		59,91

-26CZ 298270 B6

Tabulka 10

Účinnost nitazoxanidu proti dospělým jedincům (13 týdnů starým) Schistosoma hematobium u myší.

Počet motolic odstraněných z myších jater
Myš č.	Nelcčcnc kontrolní, myši¹	Léčené myši
í	18.	3
2	16	3
3	14	2
4	19	2
5	12	4
6	10	4
7	13·	2
8	12	2
9	17	0,0
ÍO	9	2
Celkem	140	24
Průměr/myš	14	2,4
Účinnost		§2,85

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tí m, že jako účinnou složku obsahuje alespoň jednu sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující sloučeninu vzorce I a sloučeninu vzorce II a dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou kyselinu v množství zlepšujícím stabilitu.

-27CZ 298270 B6
2. Farmaceutický přípravek podle nároku / vyznačující se tím, že farmaceuticky přijatelná kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující kyselinu citrónovou, kyselinu glutamovou, kyselinu jantarovou, kyselinu ethansulfonovou, kyselinu octovou, kyselinu vinnou, kyselinu

5 askorbovou, kyselinu methansulfonovou, kyselinu fumarovou, kyselinu adipovou, kyselinu jablečnou a jejich směsi.
3. Přípravek podle nároku 2, vyznaču j ící se tí m , že farmaceuticky přijatelnou kyselinou je kyselina citrónová.
4. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že farmaceuticky přijatelnou kyselinou je kyselina askorbová.
5. Přípravek podle nároku / vyzn a č u j í c í se tí m , že obsahuje jako účinnou složku sloučeninu vzorce II a farmaceuticky přijatelnou kyselinu v množství dostačujícím k úpravě pH farmaceutického, přípravku při styku s vodou na 2 až 6, přičemž uvedená účinná složka je ve formě pevných částic a přičemž poměr hmotnosti farmaceuticky přijatelné kyseliny k hmotnosti uvedených pevných 20 částic je mezi 0,01 a 0,5.
6. Přípravek podle nároku 5, vy zn a č u j íc i se t i m , že poměr hmotnosti farmaceuticky přijatelné kyseliny k hmotnosti uvedených aktivních pevných částic je mezi 0,03 a 0,2.

25
7. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že přípravek je v pevné dávkové formě, přičemž aktivní částice jsou granulovány v přítomnosti alespoň granulačního činidla za vzniku granulovaných aktivních pevných částic.
8. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že aktivní částice před granulací 30 mají velikost částic menší než 200 pm a střední velikost částic větší než 10 pm.
9. Přípravek podle nároku 8, vyznačující se tím, že střední velikost aktivních částic je mezi
10 a 100 pm.

35 10. Přípravek podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m, že granulační činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující polyvinylpyrrolidon, vodu, alkohol, sacharózu, hydroxylcelulózu a jejich směsi.
11. Přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že v granulovaných aktivních pev40 ných částicích je hmotnostní poměr farmaceuticky přijatelné kyseliny a účinné složky mezi 0,01 a 0,5.
12. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se t í m , že je ve formě suspenze pevných částic alespoň jedné sloučeniny vzorce I a vzorce II v kapalině,
13. Přípravek podle nároku 12, vyznačující se tím, že pevné částice před vytvořením suspenze jsou granulovány v přítomnosti alespoň jednoho granulačního činidla za vzniku granulovaných aktivních pevných částic.

-28CZ 298270 B6
14. Přípravek podle nároku 12, vyznačující se t í m , že kapalinou je voda.
15. Přípravek podle nároku 12, vyznačující se t í m , že pH suspenze je mezi 2 a 6.
16. Přípravek podle nároku 12, vyznačující se t í m , že pH suspenze je mezi 3 a 5.
17. Přípravek podle nároku 2, vy zn a č u j íc í se tí m , že je ve formě pasty zahrnující aktivní částice alespoň jedné sloučeniny vzorce I a vzorce II, smáčedlo a zahušťovadlo.
18. Přípravek podle nároku 17, vyznač u j ící se tí m, že aktivní částice mají velikost částic menší než 200 pm, méně než 10 % hmotnostních těchto částic má velikost větší než 100 μιη, méně než 50 % těchto částic má velikost větší než 50 μτη a méně než 10 % hmotnostních těchto částic má velikost menší než 5 pm.