CZ298269B6

CZ298269B6 - Orální farmaceutický prípravek

Info

Publication number: CZ298269B6
Application number: CZ0391199A
Authority: CZ
Inventors: Rossignol@Jean-François
Original assignee: Romark Laboratories, L. C.
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2007-08-08
Also published as: CN1552322A; DE69809928D1; NO335781B1; CZ391199A3; WO1998050035A1; EP1222921A1; DE69809928T2; AP9901675A0; CA2418634C; ES2150404T1; UA74388C2; EE04870B1; SI20149A; SI20149B; ME00530B; LV12492B; NO995406L; NZ513881A; PL193275B1; KR100426657B1

Abstract

Orální farmaceutický prípravek, který jako úcinnou složku obsahuje alespon jednu slouceninu vybranou ze skupiny zahrnující slouceninu vzorce I a slouceninu vzorce II, pricemž úcinná složka je ve forme aktivních cástic s velikostí cástic menší než 200 .mi.m a strední velikostí cásti vetší než 10 .mi.m. Farmaceutické kompozice se výhodne stabilizujínejméne jednou farmaceuticky prijatelnou kyselinou. Farmaceutické kompozice jsou zvlášte použitelnépri lécbe oportunních infekcí osob s kompromitovaným nebo suprimovaným imunitním systémem a pri lécbe infekcí motolicí.

Description

-------menší-než-200-pm-a-střední-velikostí-části větší-než-10-pm;—-------—— --- —-----—-------— Farmaceutické kompozice se výhodně stabilizují nejméně jednou farmaceuticky přijatelnou kyselinou. Farmaceutické kompozice jsou zvláště použitelné při léčbě oportunních infekcí osob s kompromitovaným nebo suprimovaným imunitním systémem a při léčbě infekcí motolicí.

Orální farmaceutický přípravek

Oblast techniky

Tento vynález se týká farmaceutické kompozice obsahující jako aktivní složku nejméně jednu sloučeninu vybranou ze skupiny, kterou tvoří vzorec (I) a vzorec (II)

(I)

Aktivní je v podobě částic velikosti pod 200 pm a střední velikosti částic je větší než 10 pm.

Vynález se též týká farmaceutických kompozic stabilizovaných nejméně jednou farmaceuticky přijatelnou kyselinou.

Farmaceutické kompozice jsou zvláště použitelné při léčbě oportunních infekcí osob s kompromitovaným nebo suprimovaným imunitním systémem a při léčbě infekcí motolicí.

Existuje naléhavá potřeba vývoje způsobů léčby četných parazitárních a bakteriálních infekcí 20 osob s kompromitovaným imunitním systémem, (AIDS, karcinom, starší osoby, nemoci stárnutý pnjemci^_imunosupresivmčh léčiv po transplantaci orgánů). Jinou oblastí použití jsou infekce motolicí zvláště v tropickém podnebí. Proto zde je potřeba farmaceutické kompozice, kterou by snášely i imunitně kompromitované osoby a jež byla skladovatelná i v tropickém prostředí.

Dosavadní stav techniky

Specifický prvok Toxoplasma gondií je mezi převládajícími příčinami latentních infekcí centrálního nervového systému ve světovém měřítku. Tímto parazitem je infikováno mnoho zdravých 30 lidí, ale obvykle jejich imunitní systém udrží organismus pod kontrolou. Toxoplasma gondií je nejobvyklejším oportunním patogenem mozku pacientů trpících AIDS. V dnešní době se toxoplazmóza stává stále větším problémem nejen kvůli AIDS, ale i vlivem rostoucího používání imunosupresivních léčiv (podávaných například pacientům po transplantaci orgánů). Toxoplazmóza se obvykle léčí kombinací pyrimethaminu a sulfadiazinu. Jsou to účinné léky, ale neza35 bíjejí cysty parazita, takže léčba musí pokračovat při udržovacích dávkách. Toxicita si často vynutí vysazení léku, zvláště u lidí imunosuprimovaných (přijímacích imunosupresivní léky) a následuje recidiva. Statistika proto není příznivá při uvádění úmrtnosti asi 70 % u imunodeficientních pacientů a průměrném přežívání čtyři měsíce.

Kryptosporidióza je způsobena mikroskopickým parazitním prvokem Cryptosporidium parvum. U osob s normální imunitou může být průjem způsobený tímto prvokem prudký a dlouhý, ale

- 1 CZ 298269 B6 dočasný (self-limiting). Lí pacientů trpících AIDS kryptosporidiální průjem často ohrožuje jejich život. Odhaduje se, že z pacientů AIDS asi 15 až 20 % trpí tímto onemocněním. Až dosud neexistuje žádná trvale účinná nebo osvědčená terapie kryptosporidiózy.

U pacientů trpících AIDS byl nejčastěji identifikován jako patogen Enterocytozoon bieneusi, parazitní mikrosporidie nalezená u téměř jedné čtvrtiny pacientů. Nyní se zdá, že tento drobný j parazit může být označen jako příčina značného podílu mnoha nevysvětlených případů poruch trávení, průjmu a tělesného chátrání nositelů HIV. Žádná účinné léčba dosud neexistuje. ?

HlV-pozitivní osoby infikuje několik dalších druhů mikrosporidií včetně Encephalitozhoon heliem a cuniculi a nový druh označený jako Septata intesíinalis. Nedávná zpráva zjišťuje, že infekce diseminovanými mikrosporidiemi v současnosti nabývá na významu.

Od kryptosporidiózy je klinicky neodlišitelná infekce parazitem Isospora belli. Je znám spíš v tropickém pásmu a v USA byl nalezen u méně než 1 % pacientů, i když jeho skutečný výskyt je pravděpodobně vyšší.

Pneumocystic carinii se všeobecně zařazuje jako parazitní prvok; některé práce však uvádějí, že by mohl patřit mezi fungi (houby), s nimiž sdílí určité genetické sekvence. Pneumocyslic carinii obvykle infikuje plíce (Pneumocystic Carinii Pneumonia (PCP) - zápal plic způsobený P.c.). Uvádí se, že léčba je úspěšná u 40 až 60 % pacientů, přičemž však jsou problémy s toxicitou léku zvláště u imunitně kompromitovaných pacientů. Mezi mnoha vážnými případy infekce dětí virem lidské imunodeficience (HIV) zaujímá PCP výjimečné postavení vlivem svého vysokého výskytu, ojedinělého rozložení podle věku a časté úmrtnosti. PCP je nejběžnější vážná oportunní infekce dětí infikovaných HIV; výskyt PCP mezi malými dětmi infikovanými HIV bez profylaktického ošetření je odhadován na nejméně 12 % v prvním roce života. Mnoho dětí umírá krátce po rozvinutí nemoci PCP.

Mycobacterium Avium Complex (MAC) patří i infekcím, jež působí čeleď velmi podobných mykobakteriálních organismů Mycobacterium avium a Mycobacterium intracellulare. Pokud se vyskytuje u lidí imunitně nekompromitovaných, je obvykle ve formě infekce dýchacího ústrojí. U pacientů trpících AIDS je MAC obvykle diseminován (diseminovaný MAC nebo DMAC) a téměř každý orgán může být zasažen. V nedávném výzkumu bylo zjištěno, že baktérie MAC .byly-nalezeny_ve_43_%.pacientů,.kteří.přežili.2.roky_po_diagnostikQvání.AIDS...Pro_diseminovaný_________;

MAC nebyla nalezena žádná standardní terapie. Obvykle se předepisují kombinace léků, a jsou-li úspěšné, vyžaduje se jejich doživotní podávání. Naléhavě je třeba účinnějšího způsobu léčby.

Osoby nakažené HIV jsou Zvláště náchylné k infekcím Mycobacterium tuberculosis a průběh nemoci se urychluje. Zatímco u osob neinfikovaných HIV je extrapulmonámí tuberkulóza neobvyklá, u HlV-pozitivních osob se často vyskytuje. CDC zveřejnila směrnice pro léčbu TBC, jež zohledňují rostoucí výskyt tuberkulózy odolné vůči širokému spektru léčiv (MDR-TB). Úmrtnost mezi pacienty AID s MDR-TB je velmi vysoká (asi 80 %) a postup nemoci je extrémně prudký.

Proto existuje naléhavá potřeba vývoje nových způsobů léčby těchto infekcí, jež jsou u lidí i zvířat tak časté a trvale je ohrožují.

Také existuje potřeba mít k dispozici širokospektré léky pro zjednodušení léčby infekcí způsobených motolicí (trematoda). V současné době je nutno diagnostikovat specifickou patogenní motolici a předepsat lékovou terapii specifickou pro danou motolici. Mnoho méně vyvinutých zení není vybaveno prostředky pro diagnostikování specifické motolice. Nalezení léku se širokou působností by odstranilo potřebu této diagnózy.

Schistosoma mansoni, krevní motolice, je původcem schistosomiázy, druhé nej významnější tropické parazitární choroby lidí po malárii, a nejdůležitější infekcí motolicí u lidí. Schistosoma

-2CZ 298269 B6 haematobium je jiný význam druhu infikující člověka. Ve světovém měřítku trpí schistosomiázou více než 200 milionů lidí včetně několika set tisíc osob v USA.

Fasciola hepatica, běžná jatémí motolice, je především chorobou ovcí, ale člověk bývá náhodným hostitelem. Tento parazit dokáže přežít i při silné imunitní odezvě hostitele. Pro léčbu se nabízí bithionol, který však není ve Spojených Státech schválen.

Proto trvá potřeba farmaceutické kompozice s dlouhou skladovatelností i v tropických podmínkách a se širokou působností proti motolicím.

Podstata vynálezu

Nyní bylo pozorováno při výzkumech na zvířatech a při klinických výzkumech na lidech, že účinnost léčby za použití sloučenin vzorce (I) a (II) závisí na velikosti částice aktivní složky léku a na stabilitě sloučeniny.

Předmětem vynálezu je orální farmaceutický přípravek, který jako účinnou složku obsahuje alespoň jednu sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující sloučeninu vzorce I

<I) a sloučeninu vzorce II

přičemž účinná složka je ve formě aktivních částic s velikostí částic menší než 200 μιη a střední velikostí částic větší než 10 μπι.

Výhodně přípravek dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou kyselinu zlepšující stabilitu.

Popsané farmaceutické kompozice jsou vhodné pro léčbu nákaz lidí a zvířat motolicí způsobených patogeny Schistosoma jako například schistosoma mansoni, Schistosoma haematobiurn, Schistosoma mekongi, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum; patogeny Fasciola jako například fasciola hepatica a Fasciola giganlica, Fasciolopsis biski: a Dicrocoelium dendriticum, Heterophyes heterophyes a Metagonimus yokogawa.

Farmaceutické kompozice jsou též účinné při léčbě imunokompromitovaných pacientů trpících oportunními infekcemi patogeny Cryptosporidium parvum, Isospora helii, Enterocytzoon bineusi, Encephalitozoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii a Toxoplasma gondii.

Farmaceutická kompozice může být ve formě vhodné pro orální aplikaci, jako pevná dávkovači forma, kapalná suspenze nebo jako pasta.

Přehled obrázků na výkresech

Pro lepší porozumění, podstaty a předmětu tohoto vynálezu by bylo užitečné odkázat na následu5 jící podrobný popis, který je třeba snímat s připojenými obrázky, ve kterých:

Obrázek 1: ukazuje procenta inhibice a přežívání buněk hostitele při aplikaci nitazoxanidu proti E. intestinalis.

ίο Obrázek 2: ukazuje procenta inhibice a přežívání buněk hostitele při aplikaci nitazoxanidu proti V. corneae.

Obrázek 3: ukazuje procenta inhibice a přežívání buněk hostitele při aplikaci aldendazolu proti E. intestinalis.

Obrázek 4: ukazuje procenta inhibice a přežívání buněk hostitele při aplikaci aldendazolu proti V. corneae.

Obrázek 5 a 6: ukazuje hodnoty optické hustoty získané pro každou kultivační jamku vyvýšené 20 proti koncentracím léku v kultuře.

Obrázek 7: je graf založený na zjišťování účinnosti nitazoxanidu proti mykobacterii pomnožené v kapalném živném bujónu,

Obrázek 8: ukazuje procento aktivních částic s objemem menší než příslušná hodnota velikosti 0 částic v pm.

Vynález se rovněž týká použití aktivní složky pro výrobu léčiva, které obsahuje jako aktivní složku nejméně jednu sloučeninu vybranou ze skupiny, kterou tvoří desacetylnitazoxanid vzorce (I)

a nitazoxanid vzorce (II)

Nitazoxanid (NTZ), sloučenina se vzorcem (II), je generický název 2-(acetyloxy)-N-(5-nÍtro-2thiazolyl)benzamidu, sloučeniny, kterou poprvé syntetizovali Rossignol a Cavier v r. 1975; 2 mg nitazoxanidu lze rozpustit v 1 ml DMSO. Nitazoxanid se snadno vstřebává při orálním podání.

Až dosud nebyl podán důkaz, že sloučeniny vzorce (I) a/nebo (II) by mohly být v širokém roz-j sáhu účinné proti infekcím způsobeným motolicemi nebo že by byly dostatečně netoxické, aby je' snášely i imunokopromitované osoby.Ϊ

-4CZ 298269 B6

Příprava a určitá použití pro nitazoxanid se popisuje v patentu US 3 950 351 a v pracích publiko- I váných přihlašovatelem. Desacetylnitazoxanid, sloučenina vzorce (I), se někdy uvádí jako I tizoxanid nebo d-NTZ a je metabolitem nitazoxanidu. 1

V patentu WO 95/28393 popsal přihlašovatel způsob přípravy čisté sloučeniny vzorce (II) J i použití kompozice obsahující směs sloučenin vzorce (I) a (II). 1

Nyní bylo pozorováno, že pevné částice sloučeniny vzorce (I), sloučeniny vzorce (II) nebo jejich směsí s velikostí částic mezi 170 a 520 gm (střední velikost částice = 352 gm) mají velice omezenou účinnost při orálním podávání lidem nebo zvířatům. Účinnost takových částic je menší než účinnost existujících farmaceutických produktů a proto je pro komerční účely nepřijatelná.

Na psech též bylo pozorováno, že orální podávání jednotlivé dávky 50 mg pevných částic sloučeniny vzorce (I) a sloučeniny vzorce (II) s velikostí částic pod 5 gm na kg hmotnosti psa způsobilo zvířatům závažné nepříznivé následky.

Nyní bylo zjištěno, že má-li být zajištěna účinná a bezpečná léčba infekcí způsobených lidem i zvířatům parazity, baktériemi, houbami a viry, musí farmaceutická kompozice, ať už v pevné dávkovači formě nebo kapalné suspenzi obsahovat účinnou dávku aktivní složky ve formě pevných částic obsahujících sloučeninu vzorce (I) a/nebo vzorce (II) s velikostí částice menší než 200 pm, přičemž střední velikost částice aktivních pevných částic je větší než 10 pm.

Přítomnosti vysokého obsahu částic aktivní složky s velikostí větší než 200 pm vzhledem k obsahu částic velikosti mezi 5 a 200 pm významně snižuje chemoterapeutickou aktivitu sloučenin. Je¹výhodné, když farmaceutické kompozice podle vynálezu neobsahují více než 5 % hmotnostních aktivních pevných částic velikosti větší než 200 pm. Nej výhodnější je, když farmaceutické kompozice podle vynálezu neobsahují prakticky žádné aktivní pevné částice s velikostí větší než 200 pm.

Přítomnost vysokého obsahu částic aktivní složky s rozměrem pod 5 pm vzhledem k obsahu částic rozměrů mezi 5 a 200 pm může vyvolat u zvířat nebo u lidí záporné účinky. Kromě toho bylo zjištěno, že částice s rozměry pod 5 pm jsou rychleji vstřebávány za zažívacího traktu do krevního oběhu a proto nejsou dostatečně účinné proti parazitům, baktériím, houbám a virům v zažívacím traktu zvířat a lidí:

Ani zkušení vědci nemohli předvídat, že velikost částice sloučeniny vzorce (I) a sloučeniny vzorce (II) by mohla mít tak významný dopad na jejich antimikrobiální aktivitu při léčbě zvířat u lidí. Na příklad při výzkumech prováděných přihlašovatelem nevykázaly antiparazitické sloučeniny jako albendazol, mebendazol, niklosamid, praziquantel a metronidazol tak výrazný rozdíl antiparazitické aktivity při léčbě zvířat a lidí v závislosti na jejich velikosti částic. Kromě toho by ani zkušený vědec nemohl předvídat, že rozměry částic sloučeniny vzorce (I) a sloučeniny vzorce (II) by měly tak nepříznivý dopad na schopnost zvířat a lidí snášet podávání uvedeného aktivního působku.

Sloučeniny vzorce (1) a (II) mohou být podávány buď v pevné dávkovači formě, nebo jako vodné suspenze, ale dává se přednost, aby farmaceutické kompozice obsahovaly.účinnou dávku aktivní složky ve formě pevné částice vzorce (I) a/nebo (II) s rozměrem částic pod 200 gm, přičemž je střední velikosti uvedené aktivní pevné částice větší než 10 gm jak lze zjistit přístrojem Coulter^(R)Counter LS 100. Toto zařízení používá laserové paprsky vlnové délky 750 nm pro třídění částic v rozmezí 0,4 gm do 900 gm (průměr) lomem světla. Vzorky jsou měřeny ve vodě s malým přídavkem přípravku Triton X-100 pro zvýšení smáčivosti a deflokulaci prášku.

Je výhodné, když střední velikost částic uvedených aktivních pevných částic je mezi a 100 gm, výhodně mezi 20 a 50 gm. Příklady výhodných kompozic jsou:

-5CZ 298269 B6 kompozice s méně než 10% hmotnostními uvedených aktivních pevných částic s velikostí .

částic nad 100 pm; 3

- kompozice s nejméně 50 % hmotnostními uvedených aktivních pevných částic s velikostí částic pod 50 pm;

Je výhodné, když střední velikost částice uvedených aktivních pevných částic je mezi 10 a 100 pm, výhodněji mezi 20 a 50 pm. Ve výhodném provedení kompozice má méně než 10 % uvedených aktivních pevných částic velikost částice menší než 5 pm.

Aktivní složka nebo složky použité v pevné dávkovači formě nebo suspenzi je výhodně směs pevných částic sloučenin vzorce (I) a vzorce (II) s velikostí částic menší než 200 pm, přičemž je hmotnostní obsah sloučeniny vzorce (I) vzhledem k hmotnosti sloučenin vzorce (I) a (II) v uvedené směsi mezí 0,5 a 20 %, výhodněji 0,5 a 10 %.

Vynález se též týká výše uvedených farmaceutických kompozic, které s výhodou obsahují nejméně jednu farmaceuticky přijatelnou kyselinu. Příklady takových kyselin představují: kyselina citrónová, kyselina glutamová, kyselina jantarová, kyselina ethansulfonová, kyselina octová, kyselina vinná, kyselina askorbová, kyselina methansulfonová, kyselina fumarová, kyselina adipová, kyselina jablečná a jejich směsi, Kyselina citrónová je velice vhodná. Přítomnost uvedené kyseliny zlepšuje stabilitu aktivní složky nebo složek.

Poměr hmotnosti farmaceuticky přijatelné kyseliny k hmotnosti uvedených aktivních pevných částic je výhodně mezi 0,01 a 0,5, ještě raději mezi 0,03 a 0,2. Je výhodné, když množství kyseliny postačuje upravit pH suspenze mezi 2 a 6, výhodněji mezi 3 a 5, nejvýhodněji mezi 3,5 a 4,5.

Způsoby přípravy pevných a kapalných dávkovačích forem této farmaceutické kompozice jsou popsány v patentu WO/95/28393 a tyto popisy jsou zde zahrnuty ve formě odkazu.

Tyto kompozice s výhodou obsahují zvlhčovadlo a případně i derivát škrobu jakje popsáno v patentu US 5 578 621, jehož obsah zde je zahrnut formou odkazu pokud jde o popisu případného zvlhčovadla a derivátů škrobu. Zvlhčovadlo popsané v patentu US 5 578 621 slouží jako disperzní činidlo.

Týto~farmaceutičke'kompozice v pevné“dávkovacíXóiTněrvkapálné”dávkovacíforměrjakopasty· nebo masti mohou v případě potřeby obsahovat další aktivní činidla jako jsou antibiotika, antivirové prostředky nebo inhibitory protonové pumpy. I když to není výhodné, tyto farmaceutické kompozice mohou též obsahovat aktivní pevné částice sloučeniny vzorce (1) a/nebo sloučeniny vzorce (II) větší než 200 pm.

Kompozice mohou obsahovat vehikula (excipienty) známé jako použitelné pro přípravu forem vhodných pro orální administraci.

Je výhodné, když v zájmu vynikající účinnosti proti širokému spektru parazitů, baktérií, hub a virů je rozdělovači součinitel uvedených aktivních pevných částic mezi 0,8 a 2, výhodně mezi

1,1 a 1,9, nejlépe vyšší než 1,5, přičemž se uvedený rozdělovači součinitel vypočítá podle vzorce:

F90% ⁼ (090% “ 01O%)/((09O% ⁺ 01O%)/2) ve kterém

F₉o% je rozdělovači součinitel při 90 %,

- 090% j^e maximální velikost částice ve frakci částic odpovídajících 90 % uvedených aktivních pevných částic a

-6CZ 298269 B6

- 0io% je maximální velikost částice ve frakci částic odpovídajících 10% uvedených aktiv- ních pevných částic.. j

Ve specifickém provedení vynálezu jsou Částice sloučeniny vzorce (I) a/nebo (II) připraveny výšeI uvedenými způsoby a pakjsou mlety, takže méně než 10 % uvedených aktivních částic přesahuje1 velikost 100 pm, méně než 50 % uvedených částic je větších než 50 pm a méně než 10 % uvede-j ných aktivních částic je menší než 5 pm, přičemž je střední velikost částic mezi 20 a 50 pm.J

Potom jsou uvedené aktivní částice granulovány za použití směsi obsahující aktivní pevné částice) a alespoň jedno granulační činidlo.

Příklady granulačního činidla představují:

polyvinylpyrrolidon, voda, alkohol, sacharóza, hydroxycelulóza a jejich směsi. Je výhodné, když se během granulačního procesu přidá alespoň jedna farmaceuticky přijatelná kyselina.

Vynález se týká pevných dávkovačích forem obsahujících kompozici podle vynálezu jako jsou tablety, dispergovatelné tablety, povlečené tablety, matrice atd. Dávkovači forma podle vynálezu obsahuje například:

Pevné aktivní částice s velikostí částic pod 200 pm, přičemž pod 10 % uvedených částic má velikost nad 100 pm, pod 50 % uvedených částic má velikost nad 50 pm a méně než 10 % uvede20 ných částic má velikost pod 5 pm, přičemž je střední velikost částic mezi 20 a 50 pm;

- nejméně jedno granulační činidlo;

nejméně jedno zvlhčovadlo;

- nejméně jeden derivát škrobu a nejméně jednu farmaceuticky přijatelnou kyselinu, která se výhodně přidává během granu25 lačního procesu.

Kapalné dávkovači formy jako jsou vodné suspenze sloučeniny podle vynálezu obsahují například:

- jako aktivní činidlo pevné aktivní částice obsahující sloučeninu vzorce (I) a/nebo sloučeninu vzorce (II) s velikostí částic pod 200 pm, přičemž pod 10 % uvedených částic má velikost , nad 100 pm, méně než 50 % uvedených částic má velikost nad 50 pm a méně než 10 % uve——dcných-částic-rná-velikost-pod-5-pm-a------------------------------------------------

- nejméně jedno granulační činidlo;

- nejméně jedno zvlhčovadlo;

- nejméně jednu farmaceuticky přijatelnou kyselinu, takže pH suspenze je mezi 2 a 6, výhodně mezi 3 a 5, nejraději mezi 3,5 a 4,5;

nejméně jedno zahušťovadlo, například xanthanovou, aguarovou nebo carruba klovatinu, krystalickou celulózu, klovatinu, krystalickou celulózu, karboxymethylcelulózu nebo jejich směsi.

Pastovité nebo masťové formy podle vynálezu, vhodné pro orální administraci, obsahují například:

- jako aktivní činidlo pevné částice obsahující sloučeninu vzorce (I) a/nebo sloučeninu vzorce (II) s velikostí částic pod 200 pm, přičemž pod 10 % uvedených částic má velikost nad

1 00 pm, méně než 50% uvedených částic má velikost nad 50 pm a méně než 10 % uvedených částic má velikost pod 5 pm a nejméně jedno zvlhčovadlo;

- nejméně jedno zahušťovadlo, například xanthanovou, aguarovou nebo carruba klovatinu, krystalickou celulózu, karboxymethylcelulózu nebo jejich směsi.

-7CZ 298269 B6

Pasty anebo masťové formy pro zevní nebo intravaginální aplikace obsahují například:

- jako aktivní činidlo pevné částice obsahující sloučeninu vzorce (I) a/nebo sloučeninu vzorce (II) s velikostí částic pod 200 pm, přičemž pod 10% uvedených částic má velikost nad lOOpm, pod 50% uvedených částic má velikost nad 50 pm a méně než 10% uvedených částic má velikost pod 5 pm a

- nejméně jedno zvlhčovadlo;

nejméně jednu farmaceuticky přijatelnou kyselinu, takže pH suspenze je mezí 2 a 6, výhodně mezi 3 a 5, nejraději mezi 3,5 a 4,5;

- cetylalkohol a/nebo glyceridové deriváty a/nebo propylenglykol;

nejméně jedno zahušťovadlo, například xanthanovou, aguarovou nebo carruba klovatinu, krystalickou celulózu, karboxymethylcelulózu nebo jejich směsi.

Suchá a čistá sloučenina vzorce (I) a suchá a čistá sloučenina vzorce (II) byly podrobeny mletí a třídění sítovou technikou.

Po mletí měly částice sloučeniny vzorce (I), sloučeniny vzorce (II) a jejich směsi distribuci velikosti částic podle obrázku 8. Obrázek 8 ukazuje procentuální podíl částic s menším rozměrem než příslušná hodnota velikosti 0 částic v pm.

Z uvedeného vyplývá že:

méně než 10 % hmotnostních částic mělo velikost částice menší než asi 5 pm;

- méně než 10 % hmotnostních částic mělo velikost částice větší než asi 70 pm;

- střední velikost částice je asi 40 pm;

rozdělovači součinitel částic je asi 1,73, přičemž se uvedený rozdělovači součinitel vypočítal podle rovnice:

F_90% - (090% - 01O%)/((09O% ⁺ 0lO%)/2) ve kterém

- F_90% je rozdělovači součinitel při 90 %;

090% je maximální velikost částice ve frakci částic odpovídajících 90 % uvedených aktivňíchpevných^_částica ' -----------------------------—

0io% j^e maximální velikost částice ve frakci částic odpovídajících 10 % uvedených aktivních pevných částic.

Následující tabulky ilustrují příklady takových kompozic.

Tabulka 1

Příklad kompozice dispergovatelných tablet pro orální podávání obsahujících jako aktivní složky sloučeniny vzorce (II) a sloučeninu vzorce (I)

Nitazoxanid (99 %) + desacetylnitazoxanid (1 %) Mikrokrystalická celulóza Avicel pH 102 od firmy FMC-USA Krospovidon Stearát horečnatý Koloidní oxid křemičitý Kyselina citrónová Jahodová příchuť č. 877720 od firmy Robertet Sacharinát sodný

200 mg 116 mg 25 mg 3 mg 5 mg 10 mg 10 mg 2 mg

-8CZ 298269 B6

Tabulka 2

Příklad kompozice povlečených tablet pro orální podávání obsahujících jako aktivní složky slou5 ceninu vzorce (II) a sloučeninu vzorce (I)

Nitazoxanid 500mg

Kukuřičný škrob 60mg

Předtelatinizovaný kukuřičný škrob 70mg ίο Hydroxypropyimethylcelulóza 5mg

Sacharóza 20mg

Sodný glykolát škrobu 30mg

Kyselina citrónová 25mg

Mastek 8mg

Stearát hořečnatý 7mg

Povlaky: na tablety nebo granule obsahující 500 mg aktivní složky se nastřikuje horký cukrový roztok nebo povlakový film

Tabulka 3

Příklad vodné suspenze obsahující sloučeninu vzorce (II) a sloučeninu vzorce (I) jako aktivní složky pro orální podávání; pH suspenze bylo kolem 4,1

Nitazoxanid (98 %) + desacetylnitazoxanid (2 %)2 g

Destilovaná voda 100 ml

Benzoát sodný 0,2g

Sacharóza 30,5g

Xanthanová klovatina 0,2g

Mikrokrystalická celulóza a sodná karboxýmethylcelulóza

Avicel RC-591 od firmy FMC-USA0,8 g

---—Kyselina-citronová________________________________________________.___________0,2_g. 35 Dihydrát citrátu sodného50 mg

Jahodová příchuť č. 877720 od firmy Robertet 125 mg

Červené barvivo č. 33 D a C1 mg ii

Tabulka 4

Příklad pasty pro orální administraci obsahující sloučeninu vzorce (II) a sloučeninu vzorce (I) jako aktivní složky

Nitazoxanid (98 %) + desacetylnitazoxanid (2 %)	500 mg
Minerální olej	10 g
Surový cukr	1 g
Mikrokrystalická celulóza a
sodná karboxýmethylcelulóza
Avicel RC-591 od firmy FMC-USA	0,8 g
Kyselina citrónová	0,2 g

Tabulka 5

Příklad pasty nebo masťová formulace pro intravaginální nebo zevní administraci, přičemž uvedená pasta nebo mast obsahuje sloučeninu vzorce (Π) a sloučeninu vzorce (I) jako aktivní složky

Nitazoxanid (98 %) + desacetylnitazoxanid (2 %) 8g

Kremofor A6 2g kremafor A251,5 g

Minerální olej 7g

Luvitol EHO 7g

Glycerylmonoester 4g

Cetylalkohol 3g

Simetikon 0,5g

Garmaben II 1g

Propylenglykol 3,5g

Destilovaná voda 62,5g

Farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou kompozice s širokým spektrem účinků na parazity, baktérie, houby a viry, zvláště když jsou podávány orálně.

Účinnost a bezpečnost výše popsaných farmaceutických kompozice při podávání zvířatům i lidem byly vynikající. Při klinických výzkumech na lidech bylo specificky zjištěno, že účinnost výše uvedených farmaceutických kompozic je při léčbě parazitárních onemocnění výrazně vyšší než u těchže formulací při použití aktivní sloučeniny s velikostí částice mezi 170 a 520 pm (střední velikost částice = 352 pm), i když se větší částice podávaly pacientům v dávkách až třikrát vyšších a po delší dobu. Příklady rychlostí uzdravení jsou uvedeny níže v tabulce 6.

Tabulka 6

Srovnání výsledků klinických výzkumů na lidech za použití sloučenin vzorce (1) a vzorce (II) s velikostmi částic v rozmezí 170 pm až 520 pm (průměr - 352 pm) s výsledky získanými při použitrsloučenin-vzorce-(I)-a-vzorce(n-)-s-velikostmi-částic-v-rozmezí-od-5-pm-do-200-pm-(průměr = 34 pm).

Sloučenina vzorce (I) (98 %) + sloučenina vzorce (II) (2 %)

Velikost částice

170 až 520 pm

Dávka 15 až 50 mg/kg/den během 3 až 7 dnů

Vyléčení/celek = = % vyléčených

Velikost částice až 200 pm

Dávka 15 mg/kg/den během 3 dnů Vyléčení/celek = = % vyléčených

Parazit

Blastocystis hominis Entamoeba histolytica Giardia lamblia Ascaris lumbricoides Trichuris trichiura

12/27 = 44% 29/47 = 62 %

11/37 = 30 % 3/69 = 4% 7/48 = 15 %

10/10= 100% 106/133 = 80%

50/73 = 68 %

144/179 = 80 %

58/79 = 73 %

V případě všech parazitů uvedených v tabulce 6 byl podíl uzdravených výrazně lepší pro pacienty léčení aktivními částicemi velikosti mezi 5 a 200 pm než při léčbě aktivními částicemi v rozmezí velikostí 170 až 520 pm, přičemž ve všech případech byla statistická významnost p < 0,02 (při

- in CZ 298269 B6 použití standardních testů X²). Tak tomu bylo třebaže dávky aktivního činidla s větší velikostí částic byly běžně vyšší a doba léčby byla často delší než doba podávání farmaceutických kompozic aktivního činidla s velikostí částic pod 200 pm. U žádné skupiny pacientů se nevyskytly nežádoucí účinky.

Výsledky podobné výše uvedeným údajům z výzkumu na lidech byly zjištěny i při testech na zvířatech.

Kromě toho nežádoucí účinky pozorované na psech po orální administraci jednorázové dávky 50 mg sloučeniny vzorce (I) a sloučeniny vzorce (II) na kg hmotnosti psa nebyly pozorovány při extenzivních výzkumech na zvířatech při použití sloučeniny vzorce (I) a sloučeniny vzorce (II) s velikostí částice mezi 5 a 200 pm (průměr > 10 pm), i když tatáž dávka nebo vyšší dávka těchto sloučenin byla podávána denně po dobu 90 dní nebo déle.

Kromě toho byly uvedené kompozice stálé i v podmínkách 40 °C a 65 % relativní vlhkosti po dobu šesti měsíců, nebo v případě kapalných suspenzí, když byly suspendovány ve vodě za uvedených podmínek, po dobu 3 měsíců, čímž je zajištěno, že aktivní složky nedegradují a že kompozice udržují svou účinnost po takovou dobu po přípravě, jež je vhodná pro léčebné a komerční účely.

V dalším bude ukázána účinnost farmaceutických kompozice.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Cryptosporidium parvum

V přípravném klinickém experimentu se 30 osob trpících AIDS s chronickým kiyptosporidálním průjmem léčilo orálním podáváním nitazoxanidu při denních dávkách 500 až 2000 mg. Pokud průjem neustal, podávání nitazoxanidu pokračovalo další 4 týdny s maximální denní dávkou 2000 mg.

DvacětošnTošolrčičkoňčilčrdvínTebo^více^týdnů-léčby-a-do-osmého-týdne-po-léčenrbylo-ló-z nich schopno vyhodnocení z hlediska terapeutické odezvy. V této poslední skupině 12 osob vykázalo 50% nebo větší omezení denní frekvence vyměšování a deset jednotlivců vykázalo výrazně snížení nebo úplné, vymýcení parazitů ve stolici, přičemž u čtyř osob byl tento organismus neprokazatelný. Šest pacientů splnilo kritéria klinické a parazitologické odezvy.

Pacienti, jímž byly podávány vyšší denní dávky léku po delší dobu, měli větší šanci na pozitivní odezvu.

Pokus s nitazoxanidem při kryptosporidiálním průjmu v důsledku AIDS za použití značení fluorescenční látkou prokázal pokles frekvence vyměšování u osob, jimž bylo denně podáváno 500, 1000, 1500 nebo 200 mg léku. Účastníci pokusu vykazovali počty CD4+ 42 buněk/mm³ (v rozsahu 0-303 buněk/mm³), průměrný počet denních stolic 6,7 během 15 měsíců, oocysty Cryptosporidium parvum ve stolici a žádné další zjevné střevní patogeny. Téměř u všech účastníků selhala terapie s azitromycinem nebo paromycinem.

Po 23 týdnech mělo 9 osob ze 13 kompletní klinickou odezvu (převážně varovanou stolici jednou až třikrát denně) a 4 ze 13 vykázaly částečnou klinickou odezvu (nejméně 50% pokles denní frekvence stolice nebo změnu konzistence stolice na nejméně 75 % tvarované stolice). Do ukončení pokusu došlo u 8 z 11 osob k úplnému vyhlazení parazita a další 3 vykázaly podstatné snížení koncentrace oocystů. Byl zjištěn trend k lepší odezvě při dávkách 1000 mg denně a vyšších

-11CZ 298269 B6 a při delší léčbě. Tři účastníci pokusu dostali kopřivkovou vyrážku na pokožce; zdravotní režim dodrželo více než 90 % účastníků více než čtyři týdny.

Příklad II

Cryptosporidium parvum

Pokus in vitro, údaje o dávkování:

Nitazoxanid se rozpustil ve sterilním dimethylsulfoxidu (DMSO) a zkoušel se na jednobuněčných vrstvách infikovaných intaktními oocystamí Crypotosporidium parvum pří koncentracích 100pg/ml, 10 pg/ml, 1 pg/ml a 0,1 pg/ml. Paralelně se provedl druhý test při koncentracích nitazoxanidu 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml a 0,02 pg/inl. Těchto koncentrací se docílilo technikou postupného ředění za použití kompletní živné půdy DMEM až do dosažení finální koncentrace DNMSO 0,5 %. U kontrolního média (půdy) se dosáhlo téhož zředění.

Při pokusu se užilo buněčné kultury MDBKF5D2 vypěstované v sedmimilimetrových komůrkách; jako Cyklosporidium parvum oocysty GCH1 v počtu 5 x 10⁴ na jamku; šlo o porovnání paromomycinu (pozitivní kontrola) proti nitazoxanidu (experimentální lék). Obsaženo bylo i imunitní králičí antisérum obsahující sporozoíty Crysptosporidium parvum (0,1 %) a s fluoresceinem konjugované kozí sérum proti králičí protilátce (1 %).

Test toxicity:

200 μΐ půdy obsahující nitazoxanid při koncentracích 100,10,1 a 0,1 pg/ml a příslušné kontrolní půdy se umístily do dvou jamek plotny s 96 jamkami obsahujících konfluentní jednobuněčné vrstvy buněk MDBKF5D2 a do dvou jamek bez této vrstvy. Lék se na jednobuněčných vrstvách inkuboval při 37 °C a 8% CO₂; po 24 hodinách (první pokus) a 48 hodinách (druhý pokus) se do každé jamky přidal MŤS (Owenův roztok) a PMS v množství 333 pg/ml resp. 25 μΜ. Plotna se vrátila do inkubátoru a potmě s vyvíjela dvě hodiny. Potom se odebralo svrchu kultury 100 μΐ supematantu a převedlo na novou plotu smikrotitrem pro zjištění optické hustoty přístroje ELISA při 490 nm. Výsledky se zaznamenaly a analyzovaly. Toxicita v procentech se vypočítala odečtenínrstřednroptické-hustoty(0D)-supematantu’Z-kultury-s-lékem-od-0D-supematantu-kontrolní půdy bez léku, vydělením střední optické hustotou supernatantu z kontrolní půdy a násobením 100.

OD půdy-OD léku

----------------X100

OD půdy

Test intaktních oocystů Cryptosporidium parvum

Na konfluentních jednobuněčných vrstvách MDBKF5D2 se při 37 °C a v prostředí 8% CO₂inkubovaly v nitazoxanidu (100, 20, 10, 2, 1, 0,2, 0,1 a 0,2 pg/ml) oocysty Cryptosporidiumparvum v množství 5 x 10⁴ na jamku. Stupen infekce v každé jamce se stanovil imunofluorescenční analýzou po 24 až 48 hodinách. Inhibice v procentech se stanovila odečtením průměrného počtu parazitů na 10 polí v medikovaných jamkách od průměrného počtu parazitů na 10 polí v jamkách s kontrolní půdou bez léku, dělením tohoto rozdílu průměrným počtem parazitů v kontrolních půdách a násobením stem.

počet v kontr. půdách - počet v půdách s lékem

---------------------------------- xlOO počet v kontrolních půdách

-12CZ 298269 B6

Výsledky:

Pokus 1: 24 hodin Ί

Sloučenina	Koncentrace	Středili ;(+SD)*	Toxicita %	Inhibice %
Infikovaná půda	0	983,5 (±128,2)	0.	0
Páromomycin	2 mg/ml	482 (±47,1)	23,8	51
NTZ	1.00 pjg/ml 10 pg/ml 1 μ^/ιηΐ 0,1. μς/πιΐ	ztráta ; 55,5(113,5) ^; 224,5(±28, 5) 474,5(±29, 5)	88,1 65,1 8.3 19.3	_NA ** 94, 4 77,2 51, 8;

* Počet parazitů/10 polí ** Není k dispozici vlivem toxicity

Pokus 2: 48 hodin

Sloučenina	Koncentrace	Střední (+SD)*	Toxicita %	Inhibice %
• infikovaná půda	.0.	2231,25 (+90,03)	0	0
Par omoiav c-i-n	2 ma/mi	SfiQ 42)		74, 01
			Λ ^{v v}
NTZ	20 gg/ml 2· pg/ml 0,2 μς/ml 0,02 μς/ml	68,75(+13,77) : 113,75(+-21, 36) .1.020 (+ 158, 48) 1041( + 191,4 6)	92,87 24, 93 .16,56 21,23	.96,92 94,90 54/2:9 53,33

* Počet parazitů/10 polí

Účinek nitazoxanidu na intaktní oocysty Cryptosporidium pcirvum

V pokusu 1 měl nitazoxadin při koncentracích 10, 1 a 0,1 μπι/ml za následek hodnoty inhibice parazitů 94,4, 77,2 a 51,8 % a toxicitu vůči buňkám v procentech 65,1, 8,3 a 19,3 %. Třebaže při zředění 10 pg/ml došlo k téměř úplné inhibici infekce parazity, byly zřejmé vysoké stupně toxicity. Při zředění 1 pg/ml nitazoxanidu vyšlo příznivě srovnání s paromomycinem koncentrace mg/ml z hlediska inhibice parazitů i toxicity vůči buňkám (77,2% inhibice parazitů a 8,3 %

-13 CZ 298269 B6 celulámí toxicity v případě nitazoxanidu při zředění 1 pg/ml ve srovnání s 51% inhibice parazitů a 23,8% toxicity vůči buňkám v případě paromomycinu při 2 mg/ml).

Při pokusu 2 se lék modifikoval s cílem dosáhnout lepší distribuce dávek při minimální toxicitě. V důsledku toho zůstaly kultury živé i po 48 hodinách a nejen po 24 hodinách jako v pokusu 1. Inkubace po dobu 48 hodin měla samozřejmě za následek vyšší relativní toxicitu vůči buňkám jak ukazuje srovnání s paromomycinem v obou pokusech. Koncentrace nitazoxanidu 20 pg/ml byla při inkubaci 48 hodin stále příliš toxická, i když se jednobuněčná vrstva zdála dosud intaktní. Je možné že vysoká toxicita nutně ovlivňující funkci buněk má rovněž účinek na vývoj infekce parazitem. Při zředění 2 pg/ml nitazoxanidu byla zábrana infekce parazitem značná při relativně nízké celulámí toxicitě. Další ředění rovněž měla za následek značnou inhibici a nízkou toxicitu vůči buňkám. Při koncentraci léku 2 pg/ml mírná toxicita vůči buňkám a inhibiční aktivita 94,90 % ukazuje, že nitazoxanid je při koncentraci 2 pg/ml vhodnější než paromomycin při infekci Cryptosporidiurn parvum in vitro než paromomycin při koncentraci 2 mg/ml (tisíckrát vyšší koncentrace).

Příklad III

Cryptosporidiurn parvum

Informace: dávkování a přechovávání in vitro

Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid (NTZ aNTZdes) byly zkoušeny na jednobuněčných vrstvách infikovaných intaktními oocystami Cryptosporidiurn parvum a excystovanými sporozoity při koncentracích 10,1, 0,1 a 0,01 pg/ml. Každá sloučenina se rozpustila v 100% dimethylsulfoxidu (DMSO) a zředila sterilním médiem DMEM. Každá koncentrace nitazoxanidu stejně jako kontrolní média obsahovala konstantní množství DMSO 0,025 %.

Pří pokusu se užilo buněčné kultury z buněk MDBKF5D2 vypěstované v sedmimilimetrových komůrkách; jako Cyklosporidium parvum použity oocysty GCH1 v počtu 5xl0⁴ na jamku; šlo porovnání paromomycinu (pozitivní kontrola) proti nitazoxanidu (experimentální lék). Obsaženo bylo i imunní králičí antisérum obsahující sporozoity Cryptosporidiurnparvum (0,1 %) as fluořěščěiňěm Kóňj ugovanékoží“serum· protrkráličí' prot i 1 átceýl- %-);--------------------------------Test toxicity:

200 pl půdy obsahují nitazoxanid při výše uvedených koncentracích a příslušné kontrolní půdy se umístily do dvou jamek plotny s 96 jamkami obsahujících konfluentní jednobuněčnou vrstvu buněk MDBKF5D2 a do dvou jamek bez této vrstvy. Lék se na vrstvách inkuboval při 37 °C 8 % CO; po 48 hodinách a do každé jamky přidal MTS (Owenův roztok) a PMS v množství 333 pg/ml resp, 25 pM. Plotna se vrátila do inkubátoru a potmě se vyvíjela dvě hodiny. Potom se odebralo svrchu kultury 100 pl každého supematantu a převedlo se na novou mikrotitrační plotnu pro zjištění optické hustoty přístroje ELISA při 490 nm. Výsledky se zaznamenaly a analyzovaly. Toxicita v procentech se vypočítala odečtením střední optické hustoty (OD) supematantu z léku od střední optické hustoty OD supematantu kontrolní půdy bez léku, vydělením střední optickou hustotou supematantu z kontrolní půdy a násobením 100.

OD půdy - OD léku -------------— xlOO OD půdy

Klasifikace cytotoxicity byla stanovena takto: 0,5% toxicita = 0,6 až 25% toxicita = 1, 26 až 50% toxicita = 2, 51 až 75 % toxicita = 3 a 76 až 100% toxicita = 4. Platí, že cytotoxicita 0 až 1 se má . 14 CZ 298269 B6 považovat za přijatelnou úroveň toxicity. Toxicity hodnot 2, 3 a 4 se uvažují jako vysoce toxické pro jednobuněčnou vrstvu.

Testování intaktní oocystů Cryptosporidium parvum

Na konfluentních jednobuněčných vrstvách MDBKF5D2 se při 37 °C a v prostředí 8% CO₂inkubovaly v nitazoxanidu při výše uvedených koncentracích oocysty Cryptosporidium parvum v množství 5 x 10⁴ na jamku. Stupeň infekce v každé jamce se stanovil imunofluorescenční analýzou po 48 hodinách a analyzoval počítačem. Inhibice v procentech se stanovila odečtením průměrného počtu parazitů na pole v medikovaných jamkách do průměrného poctu parazitů na pole v jamce s kontrolní půdou bez léku, dělením tohoto rozdílu průměrným počtem parazitů v kontrolních půdách a násobením stem, počet v kontr. půdách - počet v půdách s lékem

---------—--------- x 100 počet v kontrolních půdách

Výsledky:

Pokus s oocystami Cryptosporidium parvum (48 hod.)

Léky	Kónc.	Parazit	±sp	Tox/O D	±SD	inhib. %	Tox. •i	-Klasifikace*
vodná me*cia	0	681,5fl	±271,02	2,024	±0,18	0	0	0,
Paromomyciťi-	2000	115,75	±44,65	1,219	±0.009	83,02	39,79	2
DMSO média Ó; 025-	0 :	628,50	±171,94	i 1,799¹	±1,45	Ó	0	0
NTZ	,ío	11,75	±7,33	• 0<413	±0,73	9.8,13	77,07	4
		39,67	±13,Í3	: i₍618	±0,326	93,69	.10,09	i
	0; 1,	;643j 42,	±229,73	: 1,878	±Ó,Í54 ,	£0	io	0
	0,01	714,33'	±194,79.	' 1,617	±Ó,072	•šó	TO, 12	1
Nové NTZdes	io	13,75	±6, 66	: 0,337	±0,005	97,81	81,27-	4
	1	39,92¹	±13,49	1,7-10	±0,03-3	93,65	4,97	0
	C, 1	649,86	±152,19	1,50'6	±0,119	£0	. Γ6<29	1
	0,01	749,33	±139,49’	1,721	±0,144	£0	4,36	0

Konc. - pg/ml; Parazit - průměrný počet parazitů/pole (analyzováno 12 polí); Inhib. % - inhibice infekce parazitem v %; Tox % - toxicita léku vůči buňkám v %.

Z výše uvedeného je zřejmé, že inhibiční aktivita NTZdes je stejná jako u NTZ v příkladu II. Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid byly stejně účinné in vitro vůči Cryptosporidium parvum při paralelních testech, získány výsledky 98% a 94% inhibice při ředěních 10 a 1 pg/ml pro obě sloučeniny. V případě nitazoxanidu bylo zředění 1 μ^ΓηΙ nejnižší koncentrací dosahující více než 90% inhibice, zatímco 50% inhibice bylo možno dosáhnout s nižší koncentrací nitazoxanidu například 0,2, 0,1 a 0,02 μ^Ι, V těchže experimentálních podmínkách paromomycin použitý jako pozitivní kontrola byl 2000krát méně účinný, protože dosahoval při koncentraci 2000 pg/ml inhibiční účinnosti je 51 až 83 %.

- 15CZ 298269 B6

Příklad IV

E. intestinalis a V. comea

Buňky 2RK-13 (jatemí buňky králíka) se uložily na kultivační plotny s 24 jamkami v množství

2,6 x 10⁵ buněk na jamku (1,0 ml média, RPMI 1640 s 2 mM L-glutaminu a 5% teplem aktivované hovězí fetální sérum). Plotny se inkubovaly přes noc v inkubátoru s atmosférou CO₂ při teplotě 37 °C, během té doby se jamky spojily (jedno zdvojení, takže množství buněk na jamku bylo asi 5 x 10⁵).

K hostitelským buňkám se přidaly organismy Šeptala intestinalis (z tkáňových kultur) v množstevním poměru asi 3:1, tedy asi 15 x 10⁶ organismů na jamku. Výsledkem tohoto poměru bylo, že se infikovalo asi 50 % hostitelských buněk.

Léky se rozpustily v DMSO, vodě nebo methanolu (v závislosti na rozpustnosti) na roztoky koncentrace 1,0 mg/ml. Tyto roztoky se skladovaly při -70 °C. Všechna zředění v těchto experimentech se prováděla v kompletním tkáňovém kultivačním médiu. Všechna zředění se zkoušela ve třech jamkách.

Médium (obsahující čerstvě zředěné léky) se nahrazovalo každé tři až čtyři dny.

Šestý den po přidání parazitů a léků se na buňkách zjišťuje toxicita, Kontrolní buňky s léky ale bez parazitů jsou studovány z několika hledisek: konfluence, morfologie buněk a zda jsou přítomny mrtvé nebo plovoucí buňky. Buňky inkubované pouze s parazity jsou kontrolovány z hlediska infekčnosti parazitů (přítomnost parazitofomích vakuol). Buňky inkubované s parazity a léky se hodnotí z hlediska toxicity pro hostitelské buňky a množství přítomných parazitofomích vakuol (zdaje velké, střední, malé),

Desátého dne se do kultivačních jamek přidá 100 μΙ 10% SDS (cílová koncentrace 0,5 %), aby došlo k prasknutí membrán hostitelských buněk a uvolnily se mikrosporidie. Celkové množství parazitů v každé jamce se stanoví zjišťováním alikvotního množství hernacytometrem. Výsledky se vyjadřují v procentech inhibice (v poměru k počtu infikovaných buněk bez přídavku léku).

Výsledky ukazují obrázky 1 až 4.

Příklad V

Toxoplasma gondii

Nitazoxanid a desacetylnitazoxanid se testovaly proti parazitům, konkrétně proti Toxoplasma gondii kmen RH, udržovanému opakovanými pasážemi myšmi. Buněčné kultury fibroplastů MRC5 od firmy Bio-Merieux, Francie, byly v kultivačních plotnách o 96 jamkách inokulovány tímto kmenem Toxoplasma gondii. Do každé kultivační jamky (s výjimkou 8 kontrolních jamek použitých jako negativní kontrola) se přidalo 200 čerstvě odebraných tachyzoitů. Po 4 hodinách inkubace se do těchto kultur přidaly zředěné roztoky léků.

Nitazoxanid (NTZ) a desacetylnitazoxanid (dNTZ) se zkoušely v koncentracích v rozmezí mezi 8 x 10'⁴ a 40 mg/1. Léky se nejdříve rozpustily v DMSO při koncentracích 2 mg/ml a pak se postupným ředěním v kultivační půdě připravily v potřebných koncentracích. Nedošlo ke vzniku sraženin.

Tato zředění léků se přidala ke kulturám (na každé zředění 8 jamek) a následovala inkubace kultivačních ploten po dobu 72 hodin. Potom byly kultury fixovány studeným methanolem. Růst

-16CZ 298269 B6

Toxoplasma gondii se zjišťoval na přístroji ELISA za pomoci králičí protilátky proti Toxoplasma gondii značené peroxidázou. Pro každou jamku se zaznamenala hodnota optické hustoty, $

Výsledky se prezentují grafem v němž se vynášejí údaje optické hustoty proti koncentraci léku1 v kultuře.|

Statistický rozbor spočíval v regresní analýze při intervalu spolehlivosti 95 % a stanovení křivek| závislosti dávky/odezva z hodnot optické hustoty pro každý lék.'j

Jedna plotna byla kontaminována Giemsou pro zjištění jejího cytopatického účinku na kultury.

Byly provedeny tři oddělené experimenty. V každém experimentu se pro každou sloučeninu použilo dvou kultivačních ploten; v každé kultivační plotně se pro každou koncentraci léku použilo 8 replikaČních jamek.

Výsledky;

Ve třech sadách pokusů byly získány podobné výsledky. Grafické znázornění výsledků jednoho reprezentativního pokusu pro každý lék je ukázáno v obrázcích 5a, b, c a 6a, b, c.

Nitazoxanid (obrázky 5a, b, c);

Při koncentracích v rozmezí 10⁴ mg/1 a 0,3 mg/1 nebyl zaznamenán žádný inhibiční účinek.. Značný efekt vykázala koncentrace > 0,6 mg/1 a úplné inhibiee růstu Toxoplasma se dosáhlo při koncentracích > 2,5 mg/1. Při koncentracích > 2,5 mg/1 však byla na jednobuněčné vrstvě zaznamenána výrazná toxicita.

Mikroskopické zkoumání jednobuněčné vrstvy ukázalo, že NTZ při koncentraci 1,25 mg/1 vyvolalo na parazity infikovaných buňkách cytopatický efekt ve formě zvětšení parazitoforních vakuol a snížení počtu intraceiulámích parazitů. Na základě regresní analýzy lze odhadnout, že 50% inhibiční účinek má zředění 1,2 mg/1.

Desacetylnitazoxanid (obrázky 7a, b, c):

S desacetylnitazoxanidem byly dosaženy obdobné výsledky: žádný účinek při koncentracích v rozmezí 10⁴ mg/1 a 0,3 mg/1, inhibiee při koncentrací >0,6 mg/1 a výrazná toxicita při koncentraci > 2,5 mg/1. Lze odhadnout, že 50% inhibiční účinek má zředění 1,2 mg/1.

Získané výsledky byly reprodukovatelné ve třech oddělených pokusech při hodnocení inhibičního )činku léku na opakovaných kultivacích pro každou koncentraci léku.

U NTZ i desacetylnitazoxanidu bylo možno pozorovat při koncentracích kolem 1,2 mg/1 výraznou inhibici růstu Toxoplasma se změnami na parazitofomí vakuole, ale bez výrazných změn na samotném parazitu.

Tyto výsledky ukazují, že tyto léky mají dobrou aktivitu proti Toxoplasma gondii a že tento terapeutický účinek je možno očekávat in vivo při koncentracích kolem 1 mg/1 v séru nebo tkáních.

Příklad VI

Mycobacteria

Bylo zjištěno, že nitazoxanid má antimikrobiální aktivitu proti mykobakteríím tuberkulózy. Následující tabulka ukazuje výsledky zjišťování MIC nitazoxanidu a tizoxanidu (NTZdes) proti

-17CZ 298269 B6

Mycobacterium intracellular agerovou diluční technikou. Tyto výsledky jsou založeny na několika experimentech s použitím agarové diluční techniky na agaru Middlebrok, z nichž každý trval týdny. Získané údaje prokazují, že nitazoxanid má NIC proti Mycobacteria 2 pg/ml atizoxanid má MIC 4 pg/ml při použití standardního kmene Mycobacteriumintracelullar do ATCC a standardní agarové diluční techniky.

MIC (minimální inhibiční koncentrace) nitoxazoxanidu vůči Mycobacteria intracellulare

MIC*
nitazoxanid	2 pg/ml
tizoxanid	4 pg/ml

*MIC se stanovily standardní agarózovou diluční technikou během 3 týdnů s použitím agaru Míddlebrook 7H11. V tomto pokusu bylo použito M. intracellular ATCC 13950, standardního kmene.

Obrázek 7 je graf založený na studiu účinnosti nitazoxanidu proti mykobaktérii vypěstované v kapalném bujónu. Použili jsme kolometrickou analýzu MTS umožňující stanovit růst po 4 hodinách ve srovnání s počítáním na agaru, které to umožňuje po 3 týdnech. Jak lze vidět na údajích v obrázku 7, pokud se nitazoxanid přidal 72 hodin po zahájení kultivace, bylo možno pozorovat bezprostřední účinek na kontinuální růst ve srovnání s růstem v samotném kontrolním médiu. Při dávce 3 pg/ml nitazoxanidu se na příštích 24 hodin růst zastaví a potom další dva dny pokračuje pomalý růst. Dávka 50 pg/ml působila během 144 hodin kultivace dokonale bakteriostaticky.

Příklad VII

Cryptosporidium parvum

Účinek nitazoxanidu proti Cryptosporidiumparvum byl zkoušen na experimentálně infikovaných myších. Nitazoxanid byl dodán firmou Romark Laboratories, L.C. Tmpa, Florida.

Celková dávka pro člověka (1 g/den během 7 dní = 7 g) byla modifikována proti použití u myší podle Pageta a Bamese. Lidská dávka byla násobena faktorem 0,0026 pro myši (vážící přibližně 20 g) a získalo se celkové množství léku potřebné pro každého hostitele ráno a večěFběhem 7^-dňf následujících po sobě. Každá myš přijala denně 2,6 mg (7000 mg x 0,0026/7). Dávky byly administrovány orálně s použitím plastové injekční stříkačky se speciálně upravenou špičkou jehly (around tip needle).

Dvacet (20) dvoudenních sajících myších mláďat se infikovalo orálním podáním 100 000 oocyst Cryptosporidium parvum získaných z infikovaných telat. Před podáním myším se oocysty zkoncentrovaly pomocí cukerného roztoku technikou popsanou Fayerem a El lisem. Všem myším byly odebírány rektální výtěiy a denně zkoumány modifikovanou kontaminační technikou NiehlNeelsenovou popsanou Graczykem a dalšími. Oocysty se objevily v trusu 2 dny po orální infekci zvířat. Od třetího dne po infekci zvířat bylo deseti myším podávané 1,3 mg nitazoxanidu ráno a-večer 7 dní po sobě následujících, zatímco 10 zbývajících myší se použilo jako neléčená kontrola. Rektální výtěry byly odebírány denně všech sedm dní léčby a každý den sedm dní následujících po ukončení léčby. Oocysty byly suspendovány voleji a pod mikroskopem počítány v 100 polích.

Výsledky:

Výsledky ukázané v následující tabulce jasně dokazují, že nitazoxanid podávaný v denní dávce

2,6 mg/den 7 po sobě následujících dní byl účinný proti Cryptosporidium parvum a redukoval počet oocyst v trusu infikovaných myší, jak vyplývá ze srovnání s kontrolními zvířaty. Zkoušený

-18CZ 298269 B6 lék snížil na konci třetího dne léčby uvolňování oocyst do stolice u 6 z 10 léčených myší. Sedmého dne na konci léčby byla tato produkce oocyst zcela eliminována a všechna léčená zvířata vykázala negativní výsledky při kontrole trusu na rozdíl od neléčených kontrolních myší. Tento efekt trval po ukončení léčby nejméně 7 dní jak vyplývá z negativního výsledku kontroly třetí a sedmý den po ukončení léčby.

Počet zjištěných oocyst/póle v olejové imetzi

	.-3-. den léčby	poslední den léčby·	3. den po léčbě	7. den po léčbě
: ¢.,	Kontrol-..	Léčená	Kontrol-·	Léčená	Kontrol-	Léčená.	Kontrol-	Léčená
	: ní. -skup·.	skup.	ní skup.	skup.	ní skup.	skup.	ní skup.	skup.
1. ' '	3,0-	0,0	5,0	0,0	4,0	0,0	2,0	0,0
2	' '4,0	0,0	.4,0	0,0	.3,0	0,0	1,0	0,0.
3·	xo.	0,0	5/0	0,-0	4,0	0,0.	0/5	0/0
4	3,0	^2,0	3,0	0,0.	2,0.	0,0	1/0	0,0'
5'	-5;0	2,,0	3,0	0,0	3; o·	0,0	0,5	0, 0
6	3,0	0,0	4/0	0,0	5,0	0,0	2,0	0,0·
7	3,C	0,0	5„0	0,0	4,0	0,0	1,0	0,0'
8	5,0/	1,0	5,0	0,0	1,0	č?o	0,5	0,0
9	3,0	3;0	3/0	0,0	2,0	0,0	1,0	0,0
10		Q,.0	5/0	•0,0'	'2,0	0,0	0/5	0,0
. Celkem’	35	8,_;0	4,2	0,0	30 ,	0,0	10	0,0
: Průměr	3, 5	0,8	.4,,2	0, o	3,0	0,0	1,0	o, o:
,Účinnost		⁶⁰ %		100 Λ		100 v		100 %
Celkem	35	8,0	4,2	0,0	30	0,0	ID	0,0
PrŮmér	•3/S	0,8	4,2	0,0	xó	0,0-	1,0	0,0

Příklad VIII io Mycobacterium

Nitazoxanid se srovnával s antibiotikem izoniazidem. Jako mykobakteriálního kmene bylo použito BCG (bacil Calmette a Guerin). Citlivost tohoto kmene byla tatáž jako u M. tuberculosis, ale TěntFFmčřrbVl“ňěšl<odnější“a“proto’nevyžadoval’žádná-náročná-opatřenÉ---------------------15

Myším bylo denně podáváno 4 mg léku na myš v 0,2 ml slunečnicového oleje. Výsledky u myší léčených nitazoxanidem byly srovnatelné se skupinou léčenou izoniazidem.

		-
	Slezina	Játra	Plíce	Slezina	Játra	Plíce
Nitazo	1,575.000;	1,575.000	57:5,00'	68.250	70.000	50
	800,000	^! 1,550.000	Ϊ22.500	65.0,00	87.500	75
	875,000	1,550.000.	30.000	75.000	35.000	150.
	950;000	750.000	75.000	60.000	60.000	50
	475.000	1,050.000	11.000	20.000	21.250	50
	255.000	750.000	5.7S0	15.250	27.500	125
	,200.000 '	975.000	4.000	GOiOOÓ 20.000'	52.500 37.500	50 50
PBS	1,500,000	' 2,125.000	92.500 ’	102.500	195.000	750
	1,-525.000	1,800.000	98.000	140.000	175.OÚO	800
	1,92X000.	1,750,000	1,7.7.500	98.000	150.000	500
	1,675.000	1,800.000	117.500	105.000	150.000	750

-19CZ 298269 B6

Příklad IX

Fasciola hepatica

Účinnost nitazoxanidu a desacetylnitazoxanidu proti Fasciola hepatica byla zkoušena in vitro.

Dospělí jedinci Fasciola hepatica byli získány ze žlučovodů jater tří telat poražených kvůli fasciolosis ve veterinární diagnostické laboratoři firmy Hardy's Meat Packers, Bunkie, LA. io Motolice byly promývány jednu hodinu ve sterilním solném roztoku a přeneseny do sterilního roztoku nebo RPMI (pH 7,4) na další 3 hodiny. Potom byly motolice uchovávány přes noc při 37 °C v prostředí s 5% CO₂ ve sterilní směsi RPMI-králičí sérum (objemový poměr 50:50) nebo sterilním RPMI(pH 7,4).

Kultivace in vitro (37 °C a 5% CO₂) byla provedena modifikací způsobu Ibarra a Jenkinse (Z. parasitenkd. 70:655-661, 1984), Při dodržování sterilních podmínek se motolice dvakrát promyly po 2 až 3 minutách v Hankově rovnovážném solném roztoku (pH 7,2) a individuálně umístily do jamek kultivačních ploten Linbro se šesti jamkami obsahujícími alikvotních 10 ml zamýšleného zředění léku v kultivačním médiu. Toto médium sestávalo ze směsi (v objemovém 20 poměru 50:50) RPMI a králičího séra s 2 % králičí krve a 100 ppm penicilinu a 100 ppm streptomycinu. Použilo se výhradně motolic s normální aktivitou a morfologií.

Zásobní roztoky NTZ nebo jeho metabolitu D-NTZ od firmy Romark se rozpustily v DMSO (2000 pg/ml) a zředily v kultivačním médiu za použití volumerické baňky s objemem 100 ml pro 25 přípravu specifické koncentrace léku (100, 50, 25, 10, 5, 3, 1 pg/ml). V každé replikované kultuře byly umístěny dvě motolice, jedna v nesubstituované kultivační půdě s RBC a druhá v kultivační půdě bez léku s RBC.

Motolice se zkoušely z hlediska účinků léků, jak se projevovaly smrtí, poruchami hybnosti nebo 30 morfologickými změnami ve srovnání s nemedikovanými kontrolními motolicemi pomocí zezadu nasvíceného panelu a osvětlené třikrát zvětšující čočky.

Výsledky:

Experiment 1:

V případě D-NTZ byly motolice při zředění léku 50 a 100 pg během jedné hodiny mrtvé nebo skomírající. Při koncentraci 25 pg byly po první hodině 4 ze 7 motolic skomírající, dvě byly aktivní a jedna byla malátná; do tří hodin byly všechny mrtvé kromě dvou malátných ajen jedna motolice zůstala malátná naživu i po čtyřech hodinách. Při koncentraci léku 10 pg byla po 1, a 4 hodinách zaznamenána omezená aktivita a do 7 hodin byly všechny mrtvé nebo skomírající.

V případě zředění na 5 pg a 3 pg byla u některých jedinců pozorována snížená aktivita, přičemž v kategorii se zředěním 3 pg byl pozorován poněkud slabší nástup; ve skupinách s koncentrací léku 3 a 5 pg byly do 50 hodin všechny motolice mrtvé kromě jedné malátné motolice v každé skupině. Ve skupině s koncentrací léku 1 pg bylo po 42 až 74 hodinách pozorováno snížení aktivity a po 91 hodině zůstaly naživu jen 3 aktivní a jedna skomírající motolice; v této skupině 1 pg zůstala po 115 hodinách jen jedna malátná motolice. V kontrolní skupině s RBC byla úmrtnost sledována po 66 hodinách (jedna motolice), 91 hodinách (jedna motolice) a 115 hodinách (čtyři motolice). V kontrolní skupině bez RBC byly po 91 hodině naživu všechny motolice a po 50 115 hodinách byla jedna mrtvá.

-20CZ 298269 B6

Experiment 2:

V případě NTZ byla u 8 replikovaných případů pozorována ve srovnání s D-NTZ o něco větší aktivita časnějším ovlivněním hybnosti a úmrtnosti. U skupin s koncentrací léku 100, 50 a 25 pg byly po jedné hodině nebo skomírající všechny motolice kromě jedné ve skupině 25 pg, jež byla mrtvá po třech hodinách. Ve všech ostatních medikovaných skupinách bylo po jedné hodině patrné snížení hybnosti v závislosti na velikosti dávky. Ve skupině 10 pg po 16 hodinách přežila jen jedna motolice. Ve skupině s koncentrací léku 5 pg byly po 6 hodinách aktivní jen 3 motolice a žádná nebyla aktivní po 16 hodinách. Ve skupině 3 pg byly po 23 hodinách naživu jen 2 malátné motolice; tyto však byly po 41 hodinách mrtvé. Ve skupině 1 pg uhynula do 16 hodin jedna motolice, do 41. hodiny tři motolice a do 74 hodin pět motolic; po 91 hodinách byly aktivní 3 motolice a po 115 hodinách si uchovala aktivitu jedna motolice. V kontrolní skupině s RBC bylo po 74 hodinách aktivních 7 z 8 motolic, po 91 hodinách 3 a dvě motolice zůstaly aktivní po 115 hodinách. V kontrolní skupině bez RBC bylo po 74 hodinách aktivních 6 z 8 motolic, po 91 hodinách 4 a dvě motolice zůstaly aktivní po 115 hodinách.

Ve skupinách s vysokou dávkou (25, 50, 100 pg) byla smrt motolic iychlá a byla spojena s kontrakcí a svraštěním („curling“) ventrální části. Při medikaci v nižších koncentracích většina motolic načas zpomalila a po smrti nebo při umírání byla ochablejší a zploštěná, Počínaje 91 hodinou se u některých replikovaných případů stala pro výsledky experimentů omezujícím faktorem kontaminace. V případě D-NTZ došlo po 115 hodinách k vytvoření souvislého překrytí dvou replikovaných ploten bakteriálním nebo plísňovým porostem s následným úhynem...Při pokusu sNTZ toto překrytí a úhyn motolice na celých replikovaných plotnách nastalo po 91 hodinách (dvě replikované plotny) a 115 hodinách (5 replikovaných ploten). Pozorování po 139 hodině nebylo uznáno za validní pro celkovou kontaminaci většiny ploten.

Závěry:

Z pokusů s oběma zkoušenými léky vyplývá jejich značná účinnost při usmrcování motolic. Poněkud vyšší účinnost proti F. hepatica byla pozorována u nitazoxanidu než u desacetylnitazoxanidu, jeho hlavního metabolitu, o němž se soudí, že je účinný na hepatické úrovni.

Klý^filě^ňrtilňotoličTióclFáží^řÍ^lil^i'D^NTZ4řrvitfoVkoncentracích'>50'pg'během~hodiny, při koncentracích 25 pg během 4 hodin a při koncentracích 10 pg během 6 až 7 hodin. Deset pg může být vhodnou jednorázovou léčebnou cílenou dávkou léku pokud farmakokinetická data ukazují, že tkáňové koncentrace se udrží >6 až 8 hodin po jednorázové léčbě.

Silná schopnost usmrcovat motolice do 74 hodin (tři dny) byla u obou sloučenin zjištěna při koncentracích 3 pg a 5 pg. Delší přežívání, avšak ne tak dlouhé jako u kontrolních nemedikovaných motolic, bylo pozorováno při koncentraci 1 pg; použití tohoto léku v této koncentraci na motolice v játrech po dobu 3 až 4 dnů proto může mít na parazity nedostatečný účinek.

Příklad X

Fasciola gigantica

Nitazoxanid byl testován na účinnost proti dospělým a dospělým jedincům Fasciola gigantica na experimentálně infikovaných králících.

Encystované metacerkárie Fasciola gigantica (EMC) byly shromážděny na celofánové bláně až 35 dní po infekci plazů L. calludi miracidiem Fasciola gigantica za použití techniky již popsal Abdel-Ghany, v níž jsou plži denně vystaveni na 30 minut v Čisté odchlorované vodě

-21 CZ 298269 B6 z vodovodu umělému světlu. Získané encystované metacerkárie (EMC) se 5 až 8 dní skladovaly pří 4 °C v chladničce pod hladinou vody, dříve než se použily pro infekci experimentálních zvířat.

V tomto výzkumu bylo použito čtyřicet (40) králíků Boscat hmotnosti 1,5 až 2 kg, kteří byli zařazení do dvou experimentálních skupin po 20 jedincích.

Zvířata ve skupině 1 se orálně infikovala 35 až 40 encystovanými metacerkáriemi zabalenými v listu hlávkového salátu vloženém na kořen jazyka zvířat. Tlamy zvířat byly ručně drženy zavřené dokud nedošlo ke spolknutí encystovaných metacerkáríí. Této skupiny 1 se použilo pro testování nitazoxanidu proti nedospělým stádiím (4 až 5 týdnů starým) Fasciola gigantica.

Zvířata ze skupiny 2 se orálně infikovala stejně jako v první skupině 10 a 15 encystovanými metacerkáriemi a použilo se jich pro zkoušku účinnosti mitazoxanidu proti motolicím v ranném stádiu dospělosti (starým >10 týdnů).

Deseti zvířatům ve skupině 1 bylo v době vzdálené 4 týdny od jejich infekce parazity v nedospělém stádiu jejich vývojového cyklu podáváno 7 po sobě následujících dní ráno a večer 35 mg nitazoxanidu. Zbývajících 10 zvířat skupiny 1 tvořilo neléčenou kontrolní skupinu.

Deseti zvířatům ve skupině 2 bylo v době vzdálené 10 týdnů od jejich infekce parazity v dospělém stádiu jejich vývojového cyklu podáváno 7 po sobě následujících dní ráno a večer 35 mg nitazoxanidu. Zbývajících 10 zvířat skupiny 2 tvořilo neléčenou kontrolní skupinu.

Až do ukončení experimentu byla všechna zvířata krmena suchou pící.

Sedm dní po podání poslední dávky nitazoxanidu byla všechna zvířata v obou skupinách usmrcena. Povrch jater se zkoumal z hlediska přítomnosti migrujících nekrotických rýh zvláště pro vývojová stádia nedospělých parazitů. Tyto nekrotické oblasti byla studovány pomocí dvou chirurgických jehel s cílem získat migrující juvenilní motolice technikou, kterou popsal El-Bahy. Játra se rozřezala na malé kousky zvláště v okolí migrujících rýh a macerovala pod mikroskopem s cílem extrahovat motolice. Břišní dutina a viscerální povrchy se promyly teplou vodou. Tato výplachová voda se pojila, prolila sítem a zkoumala na přítomnost juvenilních motolic. Všichni naiezení-parazité-včetně-ieiich-tělesných-částí_se_spočítali_u_léčených í nelécených zvířat v obou skupinách 1 a 2. Živé motolice měly světle růžovou barvu, byly průsvitné a měly neporušené integumenty, snadno se teplou vodou vyplavovaly z jaterních tkání, zatímco mrtvé motolice měly barvu našedlou, byly uvolněné a vykazovaly porušené nekrotické povrchy. Účinnost nitazoxanidu se vypočítala pomocí vzorce:

% účinnost = a- b

----xlOO a

kde: a = počet motolic získaných ze stolice kontrolních zvířat;

b: počet motolic získaných ze stolice léčených zvířat.

Výsledky:

Výsledky výzkumu uvedené v tabulce 7 ukazují výrazný pokles počtu nedospělých motolic extrahovaných z králičích jater léčené skupiny ve srovnání s kontrolní skupinou. Tento pokles v procentech byl průměrně 46,77 % (v rozmezí 40 až 60 %).

-22CZ 298269 B6

Tabulka 7

Účinnost nitazoxanidu proti nedospělým jedincům (4 týdny starým) Fasciola gigantica u pokusně infikovaných králíků

Počet motolic získaných z králičích: jater

Králík č.	Néléčená kontrola	Léčení králíci	Účinnost %
1	7	,i	42 %
2	7	4	42 Ϊ
3	6	3	50' S
4	8	4	50 V
' S	5'	3	40 «
6	5	2	60
T	5	3	40 8
8	6	3	50 %
9	8	....... 4	50 «
10	5	3	40 %
Průměr.	6,2	3,3	46,77 4

Ve vývojovém stádiu ranné dospělosti motolic, jimiž byli králíci infikováni, vykazoval nitazoxanid totální účinnost (1000% redukci) a při zkoumání jater léčených králíků nebyli zjištěni žádní červi (motolice) ve srovnání se zvířaty z kontrolní skupiny neléčených králíků, jak je zřejmé io z tabulky 8.

Tabulka 8

Účinnost nitazoxanidu proti jedincům v ranném stádiu dospělosti (10 týdnům starým) Fasciola -----gigantica-vpokusněinfikovaných-králících;--—--------------------------------------Počet motolic: získaných ž králičích jater

Králík č.	Noléčená kontrola	Léčeni králíci	Účinnost V
	’ 4;	0,0	100 %
2	4	0, Ó.	100 % '
3		0,0	100 4
4.	: 3	.0,0	100 g
	2	0,0	100 g
”6.....	.2	0,0	100 8
7	2-	0,0	100 í
8	3‘	0,0	100 8
9	3	o:,o	100 Ϊ
ío	3	0,0	100 %
Průměr	2,9	0,0	100

Nitazoxanid podávaný 7 po sobě následujících dní v dávce 70 mg/den je mírně účinný proti nedospělým jedincům Fasciola gigantica a kompletně účinný proti těmto parazitům ve vývojo- a vém stádiu ranné dospělosti. j í Příklad XIII ,í

Schistosoma i

Nitazoxanid byl zkoušen proti Schistosoma mansoni a Schistosoma hematobium v experimentálně infikovaných myších.

Čtyřicet (40) bílých myší hmotnosti 30 až 50 g bylo rozděleno do dvou léčených skupin po 20 zvířatech. První skupina byla infikována 300 až 500 volnými aktivními cerkáriemi Schistosoma mansoni suspendovanými v 0,25 ml destilované vody a intraperitoneální injekcí podanými všem myším. Druhá skupina byla infikována stejným způsobem, ale cerkáriemi Schistosoma hematobium. Obě skupiny potom byla chovány v laboratoři celkem 70 dní.

Sedmdesát dní po infikování zvířat bylo v každé skupině 10 zvířat léčeno nitazoxanidem dávkou

1,3 podávanou sedm po sobě následujících dní orálně ráno i večer. Sedm dní po ukončení léčby byla usmrcena všechna zvířata a z jater každé myši se perfuzí vlažnou vodou (37 °C) extrahovali červi. Získaní jedinci Schistosoma u všech léčených a kontrolních zvířat byli spočítání. Účinnost nitazoxanidu bylo vypočítána s použitím následujícího vzorce:

% účinnost = a - b ——xlOO a

kde: a ~ počet jedinců Schistosoma získaných z výplachu kontrolních zvířat b - počet jedinců Schistosoma získaných z výplachu léčených zvířat.

Výsledky:

Výsledky v tabulkách 9 a 10 jasně prokázaly, že nitazoxanid podávaný v dávkách 2,6 mg/den 7 dní po sobě následujících byl účinnější proti Schistosoma hematobium, kde bylo pozorováno snížení počtu červů o 82,85 % ve srovnání s kontrolními zvířaty, než proti Schistosoma mansoni, kde snížení proti kontrolní skupině myší dosáhlo jen 59,91 %. Tyto výsledky jsou konsistentní s výsledky ve zprávě Abaza a dalších, podle které nitazoxanid nebyl účinný při léčbě pacientů proti S. mansoni, jak vyplývá z positivního nálezu vajíček po léčbě nitazoxanidem.

-74CZ 298269 B6

Tabulka 9

Účinnost nitazoxanidu proti dospělým jedincům (13 týdnů starým) Schistosoma mansoni v myších.

^lí!

Počet motolic odstraněných z myších jater
Myš. č.	Neléčené kontrolní : myši	Léčené myši
1	21	10
2	29	9
3	32	10
4	26:	11
5	2 A	1'3'
6	19	10
7	20	9
8	24	12
9·	22	8
IC	30	'7
Celkem	247	99
Průměr/myš	24,7	9,9
Účinnost.		59,91

Tabulka 10

Účinnost nitazoxanidu proti dospělým jedincům (13 týdnů starým) Schistosoma hematobium v myších.

Počet motolic odstraněných z myších jater
Myš či	Neléčené kontrolní myši	Léčené myši
1’	18	3	.1
2	16	3	-
3	14	2
4	19	2
5'	12	4
6	10	4
7	13.	2
8.....	12	.2
9.	17	0,0
10	9	2
Celkem	140	24
Průměr/myš:	14	2,4
Účinnost		82,85	'*

-25CZ 298269 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Orální farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje alespoň jednu sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující sloučeninu vzorce I a sloučeninu vzorce II přičemž účinná složka je ve formě aktivních částic s velikostí částic menší než 200 pm a střední velikostí částic větší než 10 pm.

2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že střední velikost aktivních pev-

15 ných částic je mezi 10 a 100 pm.

3, Přípravek podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že střední velikost aktivních pevných částic je mezi 20 a 50 pm.

20___

4.__Přípravek podle nároku ^vyznačující se tím, že méně než 10 % hmotnostních aktivních pevných částic má velikost částic větší než 100 pm.

5. Přípravek podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se tím, že alespoň 50 % hmotnostních aktivních pevných částic má velikost částic menší než 50 pm.

6* Přípravek podle nároku 1, vyznač uj ící se tí m , že méně než 10 % hmotnostních aktivních pevných částic má velikost částic menší než 5 pm.

7. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že distribuční faktor aktivních 30 pevných částic je mezi 0,8 a 2, počítáno podle rovnice

F90% “ (090% “ 01O%)/((09O% ⁺ 01O%)/2), kde

F₉₀% je distribuční faktor při 90 %,

0₉q% je maximální velikost částic frakce částic odpovídající 90 % aktivních pevných částic a

40 0io% je maximální velikost částic frakce částic odpovídající 10 % aktivních pevných částic.

-26CZ 298269 B6

8. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že distribuční faktor aktivních pevných částic je mezi 1,1 a 1,9, počítáno podle rovnice

Ft)0% ⁼ (090% ~ 01O%)/((09O% ⁺ 0 i 0%X2),' J kdeJ

F₉o% je distribuční faktor při 90 %,j

0_9o% je maximální velikost částic frakce částic odpovídající 90 % aktivních pevných částic a\

0io% je maximální velikost částic frakce částic odpovídající 10 % aktivních pevných částic.

9. Přípravek podle nároku l,vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou kyselinu v množství zlepšujícím stabilitu.

10. přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že farmaceuticky přijatelná kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující kyselinu citrónovou, kyselinu glutamovou, kyselinu jantarovou, kyselinu ethan sul fonovou, kyselinu octovou, kyselinu vinnou, kyselinu askorbovou, kyselinu methansulfonovou, kyselinu fumarovou, kyselinu adipovou, kyselinu jablečnou ajejich směsi.

11. Přípravek podle nároku 9, vy z n ač u j í c í se t í m , že poměr hmotnosti farmaceuticky přijatelné kyseliny a hmotnosti aktivních pevných částic je mezi 0,01 a 0,5.

12. Přípravek podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se t í m , že poměr hmotnosti farmaceuticky přijatelné kyseliny a hmotnosti aktivních pevných Částic je mezi 0,03 a 0,2. _;

13. Použití alespoň jedné sloučeniny vybrané ze skupiny zahrnující sloučeninu vzorce I jako účinné složky pro výrobu farmaceutického přípravku pro ošetřování infekce u imunokompromizovaného savce, vyvolané mikroorganismem vybraným ze skupiny zahrnující Cryptosporidium parvum, Isospora betli, Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii a Toxoplasma gondii, kde uvedená účinná složka je ve formě aktivních částic s velikostí částic menší než 200 pm a střední velikostí částic větší než 10 pm.

14. Použití podle nároku 13, kde účinná složka je ve formě částic se střední velikostí částic mezi

20 a 50 pm.