RU2534817C2 - Праймеры для диагностики дистрофии роговицы авеллино - Google Patents

Праймеры для диагностики дистрофии роговицы авеллино Download PDF

Info

Publication number
RU2534817C2
RU2534817C2 RU2011146553/10A RU2011146553A RU2534817C2 RU 2534817 C2 RU2534817 C2 RU 2534817C2 RU 2011146553/10 A RU2011146553/10 A RU 2011146553/10A RU 2011146553 A RU2011146553 A RU 2011146553A RU 2534817 C2 RU2534817 C2 RU 2534817C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
seq
nos
corneal dystrophy
primers
probe
Prior art date
Application number
RU2011146553/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011146553A (ru
Inventor
Чин ЛИ
Чон Кук ЮН
Original Assignee
Авеллино Ко., Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Авеллино Ко., Лтд filed Critical Авеллино Ко., Лтд
Publication of RU2011146553A publication Critical patent/RU2011146553A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2534817C2 publication Critical patent/RU2534817C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описана пара праймеров и зонды для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино. Изобретение позволяет точно диагностировать присутствие или отсутствие в экзоне 4 гена BIGH3 мутации, которая является ответственной за дистрофию роговицы Авеллино. Также применение пары праймеров и зонда согласно настоящему изобретению может обеспечить диагностику дистрофии роговицы Авеллино более быстрым и точным способом, чем стандартный способ с применением ДНК-чипа или ПЦР. 4 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

Description

Область техники
Настоящее изобретение касается пары праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино и, более конкретно, такой пары праймеров и зонда для ПЦР в реальном времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино, которые могут точно диагностировать присутствие или отсутствие в экзоне 4 гена BIGH3 мутации, которая является ответственной за дистрофию роговицы Авеллино.
Уровень техники
Дистрофия роговицы представляет собой аутосомное доминантное наследственное заболевание, которое начинается с появления помутнения в центре роговицы, и постепенно распространяясь, в конце концов, приводит к потере зрения по мере старения пациента. Дистрофия роговицы включает дистрофию роговицы Авеллино, гранулярную (зернистую) дистрофию роговицы, решетчатую дистрофию роговицы типа 1, дистрофию роговицы Рейса-Бюклерса и т.д. и является результатом мутации в гене, кодирующем белок βIG-H3.
У гетерозиготных пациентов, страдающих от дистрофии роговицы Авеллино, проявляется тяжелая потеря зрения по мере их старения, а у гомозиготных пациентов полная потеря зрения проявляется, начиная с шестилетнего возраста. Дистрофия роговицы Авеллино является новым заболеванием, получившим свое название в 1988 году, когда она была выделена в отдельное заболевание из так называемой гранулярной дистрофии роговицы, поскольку было установлено, что она имеет специфические симптомы и другую генетическую природу. Также известно, что она является наиболее распространенной дистрофией роговицы во всем мире, коэффициент распространенности этого заболевания, основанный на генетическом анализе, составляет в Корее от 1/340 до 1/1000 (в случае гетерозигот) и говорит о том, что она представляет собой распространенную дистрофию (Holland, E.J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S.M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, A.M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N.A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H.S. Hum. Mutat., 14:126, 1999).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что если пациенту, страдающему от гетерозиготной дистрофии роговицы Авеллино, проводили лазерную коррекцию зрения LASIK, то через 2 года у него начинается агрессивное развитие помутнения роговицы, которое обычно приводит к потере зрения (Jun, R. M. et al., Opthalmology, 111:463, 2004). Ранее хирургическое лечение глаз проводилось с надеждой на то, что LASIK или Эксимерная лазерная хирургия позволит избавить пациента, страдающего от дистрофии роговицы, от нечеткости зрения. Даже в Корее было проведено примерно триста тысяч хирургических операций LASIK, что по оценкам привело к тому, что 300 человек потеряло зрение. Это основано на оценке того, что минимум 1/1000 пациентов это пациенты с гетерозиготной дистрофией роговицы Авеллино. Пациенты, которым проводились хирургические операции LASIK, являются, главным образом, 20- и 30-летними активными членами общества; таким образом, потеря ими зрения приводит к серьезным проблемам в социальной сфере и в экономике.
Кроме того, после одобрения в 2000 году в США хирургических операций LASIK было установлено, что афроамериканские пациенты, страдающие от дистрофии роговицы Авеллино и получившие хирургическое лечение LASIK, теряют зрение, что позволяет заключить, что множество подобных случаев может иметь место по всему миру.
Таким образом, хотя правильная диагностика дистрофии роговицы Авеллино является необходимой для предотвращения прогрессирования дистрофии роговицы Авеллино с помощью хирургического лечения LASIK, диагностика дистрофии роговицы Авеллино обычно проводится с помощью микроскопического обследования помутнения роговицы и, следовательно, врачи часто упускают скрытые симптомы у пациентов, которым назначается хирургическое лечение LASIK, что приводит к потере зрения. Таким образом, быстрая и точная диагностика дистрофии роговицы является жизненно необходимой.
Был разработан чип ДНК для диагностики мутации в гене BIGH3, которая является ответственной за дистрофию роговицы Авеллино (Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2007-0076532). Однако, к сожалению, диагностика дистрофии роговицы Авеллино с применением указанного ДНК-чипа требует нескольких стадий, включая стадию амплификации ДНК в образце, стадию гибридизации амплифицированной ДНК с ДНК-чипом, стадию отмывки гибридизованного ДНК-чипа и стадию регистрации положительного ответа.
В соответствии с этим, авторы настоящего изобретения приложили большие усилия для разработки способа, позволяющего более эффективно проводить диагностику дистрофии роговицы Авеллино, и в результате обнаружили, что если диагностика дистрофии роговицы Авеллино проводится с применением пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, и зондов, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:25 и SEQ ID NO:26, методом ПЦР в режиме реального времени, то дистрофия роговицы Авеллино может быть диагностирована более быстрым и точным способом по сравнению со стандартным способом, что и привело к осуществлению настоящего изобретения.
Раскрытие изобретения
Основным объектом настоящего изобретения является предоставление пары праймеров и зонда для более эффективной и точной диагностики дистрофии роговицы Авеллино с применением метода ПЦР в реальном времени.
Для достижения указанной выше цели настоящее изобретение предоставляет пару праймеров для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино, которая представлена нуклеотидными последовательностями, выбираемыми из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:1 и 2, SEQ ID NOs:3 и 4, SEQ ID NOs:5 и 6, SEQ ID NOs:7 и 8, SEQ ID NOs:9 и 10, SEQ ID NOs:11 и 12, SEQ ID NOs:13 и 14, SEQ ID NOs:15 и 16, SEQ ID NOs:17 и 18, SEQ ID NOs:19 и 20, SEQ ID NOs:21 и 22 и SEQ ID NOs:23 и 24.
Настоящее изобретение также предоставляет зонд для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино, который представлен нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:25 до SEQ ID NO:42.
Краткое описание фигур
Фигура 1 показывает результаты, полученные с применение разработанных праймеров и зондов для ПЦР в режиме реального времени. На Фигуре 1 «А» показаны результаты ПЦР в режиме реального времени, которая проводилась с применением оптимальных праймеров и зондов, на панелях «В» и «С» показаны результаты ПЦР в режиме реального времени, которая проводилась с применением праймеров, отличающихся от таковых в случае «А».
Фигура 2 показывает результаты ПЦР в режиме реального времени, которая проводилась с применением праймеров для ПЦР в режиме реального времени согласно настоящему изобретению для выявления мутации гена, вызывающей дистрофию роговицы Авеллино.
Наилучший способ осуществления изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на пару праймеров для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино, которая представлена нуклеотидными последовательностями, выбираемыми из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:1 и 2, SEQ ID NOs:3 и 4, SEQ ID NOs:5 и 6, SEQ ID NOs:7 и 8, SEQ ID NOs:9 и 10, SEQ ID NOs:11 и 12, SEQ ID NOs:13 и 14, SEQ ID NOs:15 и 16, SEQ ID NOs:17 и 18, SEQ ID NOs:19 и 20, SEQ ID NOs:21 и 22 и SEQ ID NOs:23 и 24.
Дистрофия роговицы Авеллино представляет собой заболевание, вызываемое генетическим нарушением, при котором последовательность CGC в экзоне 4 гена BIGH3 мутирована в САС, в результате чего остаток аргигина в белке BIGH3 заменяется на гистидин (R124H).
При проведении ПЦР в режиме реального времени с применением праймеров настоящего изобретения дистрофия роговицы Авеллино может быть диагностирована более быстрым и точным способом по сравнению с обычным способом с применением ДНК-чипа.
Для метода ПЦР в режиме реального времени очень трудно подобрать температурные условия, поскольку эксперименты с применением праймеров и зондов должны проводиться в одинаковых температурных условиях. В частности, если необходимо определить только одно положение мутации, как в случае дистрофии роговицы Авеллино, праймеры и зонды должны применяться в таких температурных условиях, при которых они могут связываться. Кроме того, зонды могут связываться в очень узком температурном диапазоне от 1°С до 3°С при условии, что зонд для определения нормального гена и зонд для определения мутантного гена различаются только на один нуклеотид.
Вследствие этого важно найти общие температурные условия, в которых зонды и праймеры могут связываться с желаемым геном. В частности, необходимо сконструировать «мутантный» зонд и «нормальный» зонд таким образом, чтобы температуры для них отличались максимально, насколько это возможно, в пределах ограниченного диапазона. Иными словами, температуры для праймеров и зондов должны хорошо соответствовать друг другу, температурные условия для прямого праймера и обратного праймера должны хорошо соответствовать друг другу, и разница между температурами для «мутантного» зонда и «нормального» зонда должна, по возможности, быть максимальной. Фигура 1А показывает результаты применения хорошо сконструированных праймеров и зондов, и Фигуры 1В и 1C показывают результаты применения праймеров, отличающихся от таковых, которые применялись на Фигуре 1А, несмотря на то, что применялись те же самые зонды, что и в случае, показанном на Фигуре 1А. Как можно видеть из Фигур, конструирование праймеров и зондов оказывает значительное влияние на получаемые результаты.
В настоящем изобретении для создания оптимальных праймеров для диагностики дистрофии роговицы Авеллино с применением метода ПЦР в режиме реального времени были сконструированы пары праймеров с последовательностями SEQ ID NOs:1 и 2, SEQ ID NOs:3 и 4, SEQ ID NOs:5 и 6, SEQ ID NOs:7 и 8, SEQ ID NOs:9 и 10, SEQ ID NOs:11 и 12, SEQ ID NOs:13 и 14, SEQ ID NOs:15 и 16, SEQ ID NOs:17 и 18, SEQ ID NOs:19 и 20, SEQ ID NOs:21 и 22 и SEQ ID NOs:23 и 24, и ПЦР в режиме реального времени была проведена с применением каждой из сконструированных пар праймеров. В результате было установлено, что применение пары праймеров с последовательностями SEQ ID NOs:1 и 2 дает оптимальные результаты.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на зонд для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино, который представлен нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:25 до SEQ ID NO:42.
В настоящем изобретении для создания оптимальных зондов для диагностики дистрофии роговицы Авеллино с применением метода ПЦР в режиме реального времени были сконструированы зонды с последовательностями SEQ ID NOs: от 25 до 42, и ПЦР в режиме реального времени была проведена с применением каждого из сконструированных зондов. В результате было установлено, что применение зондов с последовательностями SEQ ID NOs:25 и 26 дает оптимальные результаты.
Примеры
Далее настоящее изобретение будет раскрыто более детально с помощью примеров. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что эти примеры приводятся исключительно для иллюстрации и не должны рассматриваться, как ограничивающие объем настоящего изобретения. Таким образом, следующие стадии будут описываться в качестве иллюстративных примеров, которые не ограничивают объем настоящего изобретения.
Пример 1. Конструирование праймеров для ПЦР в режиме реального времени и зондов MGB
Для конструирования праймеров, способных амплифицировать участок, включающий мутацию в экзоне 4 гена BIGH3, были получены пары праймеров с последовательностями SEQ ID NOs:1 и 2, SEQ ID NOs:3 и 4, SEQ ID NOs:5 и 6, SEQ ID NOs:7 и 8, SEQ ID NOs:9 и 10, SEQ ID NOs:11 и 12, SEQ ID NOs:13 и 14, SEQ ID NOs:15 и 16, SEQ ID NOs:17 и 18, SEQ ID NOs:19 и 20, SEQ ID NOs:21 и 22 и SEQ ID NOs:23 и 24 с помощью программного обеспечения Primer Express 3.0 (Applied Biosystems U.S.A).
ACD Прямой праймер: 5'-TCC ACC ACC ACT CAG CTG ТА (SEQ ID NO:1)
ACD Обратный праймер: 5'-CCA TCT CAG GCC TCA GCT Т (SEQ ID NO:2) (60 п.о.)
AV Прямой праймер: 5'-TGC AGC CCT ACC ACT CTC AA (SEQ ID NO:3)
AV Обратный праймер: 5'-AGG CCT CGT TGC TAG G (SEQ ID NO:4) (150 п.о.)
Real Прямой праймер: 5'-TAG TCT CTT ATT СТА ATA GA (SEQ ID NO:5)
Real Обратный праймер: 5'-GCT GCA GAC TCT GTG TTT AA (SEQ ID NO:6) (860 п.о.)
ACD Прямой праймер 2: 5'-CCA ТСС CTC CTT CTG TCT TCT G (SEQ ID NO:7)
ACD Обратный праймер 2: 5'-CGG GCC CCT CCA TCT С (SEQ ID NO:8) (140 п.о.)
ACD Прямой праймер 3: 5'-CAG AGA AGG GAG GGT GTG GTT (SEQ ID NO:9)
ACD Обратный праймер 3: 5'-GGG CGA AGA TGG TGA AGC Т (SEQ ID NO:10) (190 п.о.)
ACD Прямой праймер 4: 5'-TCC TCG ТСС TCT CCA CCT GTA (SEQ ID NO:11)
ACD Обратный праймер 4: 5'-AGC TGG CAA GGA GGC CC (SEQ ID NO:12)
ACD Прямой праймер 5: 5'-TTT GGG CTT ТСС CAC ATG С (SEQ ID NO:13)
ACD Обратный праймер 5: 5'-GGC AGA CGG AGG TCA TCT CA (SEQ ID NO:14)
ACD Прямой праймер 6: 5'-GTA GTA CCG TGC TCT CTG (SEQ ID NO:15)
ACD Обратный праймер 6: 5'-AGT ТСС CCA TAA GAA ТСС ССС SEQ ID NO:16)
ACD Прямой праймер 7: 5'-GGC TGG ACC ССС AGA GG (SEQ ID NO:17)
ACD Обратный праймер 7: 5'-ACC CCT CGG GGA AGT AAG G (SEQ ID NO:18)
ACD Прямой праймер 8: 5'-AAC CTT TAC GAG ACC CTG GGA (SEQ ID NO:19)
ACD Обратный праймер 8: 5'-GAC ТСС CAT CCA TCA TGC CC (SEQ ID NO:20)
ACD Прямой праймер 9: 5'-AGT CGT TGG АТС CAC CAC CA (SEQ ID NO:21)
ACD Обратный праймер 9: 5'-GAC GTC ATT ТСС TAC TGT TTC AGG (SEQ ID NO:22)
ACD Прямой праймер 10: 5'-CCC ССС AGA AAC AGC CTG (SEQ ID NO:23)
ACD Обратный праймер 10: 5'-TTC TAA GGG GTT AAG GAG AAA GCT Т (SEQ ID NO:24)
Для выявления мутации гуанин-аденин в экзоне 4 гена BIGH3 были сконструированы зонды с последовательностями SEQ ID NOs: от 25 до 42.
Зонд, связывающийся с нормальным фрагментом гена, не содержащим мутацию, был помечен красителем VIC, и зонд, связывающийся с фрагментом гена, содержащим мутацию, был помечен красителем FAM, и агент, обеспечивающий связывание с малой бороздкой ДНК (minor groove binder, MGB) был присоединен к зонду для облегчения связывания с комплементарным фрагментом гена.
«Нормальный» зонд 1: VIC-CAC GGA CCG CAC GGA-NFQ (SEQ ID NO:25) (15 п.о.)
«Мутантный» зонд 1: FAM-CAC GGA CCA CAC GGA-NFQ (SEQ ID NO:26)
«Нормальный» зонд 2: VIC-ACA CGG ACC GCA CG-NPQ (SEQ ID NO:27)
«Мутантный» зонд 2: FAM-ACA CGG ACC АСА CG-NFQ (SEQ ID NO:28) (14 п.о.)
«Нормальный» зонд 3: VIC-TAC ACG GAC CGC A-NFQ (SEQ ID NO:29)
«Мутантный» зонд 3: FAM-TAC ACG GAC CAC A-NFQ (SEQ ID NO:30) (13 п.о.)
«Нормальный» зонд 4: VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG-NFQ (SEQ ID NO:31)
«Мутантный» зонд 4: FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG-NFQ (SEQ ID NO:32) (18 п.о.)
«Нормальный» зонд 5: VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG GAG-NFQ (SEQ ID NO:33)
«Мутантный» зонд 5: FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG GAG-NFQ (SEQ ID NO:34) (21 п.о.)
«Нормальный» зонд 6: VIC-GCT GTA CAC GGA CCG CAC GGA GAA-NFQ (SEQ ID NO:35)
«Мутантный» зонд 6: FAM-GCT GTA CAC GGA CCA CAC GGA GAA-NFQ (SEQ ID NO:36)
«Нормальный» зонд 7: VIC-ACC GCA CGG AGA AGC-NFQ (SEQ ID NO:37)
«Мутантный» зонд 7: FAM-ACC АСА CGG AGA AGC-NFQ (SEQ ID NO:38)
«Нормальный» зонд 8: VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ (SEQ ID NO:39)
«Мутантный» зонд 8: FAM-ACC АСА CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ (SEQ ID NO:40)
«Нормальный» зонд 8 (9?): VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ (SEQ ID NO:41)
«Мутантный» зонд 8 (9?): FAM-ACC АСА CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ (SEQ ID NO:42)
Пример 2. Диагностика дистрофии роговицы Авеллино с применением ПЦР в режиме реального времени
У тестируемых субъектов были взяты образцы крови, корней волос и эпителия ротовой полости и из образцов была выделена ДНК. Выделение и очистку ДНК проводили с использованием частично модифицированного метода фенол/хлороформной экстракции (Miller, SA et al., Nucl. Acids Res. 16:1215, 1988) и выделенную ДНК растворяли в подходящем количестве буфера ТЕ (10 мМ Tris-Cl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4), анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и использовали в качестве матрицы в ПЦР.
Реакции ПЦР проводили с применением праймеров (SEQ ID NOs: от 1 до 24) для амплификации фрагмента, содержащего мутантный участок, и зондов (SEQ ID NOs: от 25 до 42), сконструированных в Примере 1.
Для проведения реакции ПЦР было приготовлено и использовано в реакции 25 мкл смеси мастер-микс, содержащей 10 пмолей каждого праймера и 5 пмолей каждого зонда
Реакцию ПЦР в режиме реального времени проводили в следующих условиях: 36 циклов, каждый из которых состоял из 10 мин при 95°С, 15 сек при 92°С и 1 мин при 60°С, с последующей инкубацией в течение 5 мин при 60°С.
После каждого цикла измерялась флуоресценция. Образец, положительный по красителю VIC, был диагностирован, как содержащий нормальный ген, и образец, положительный по FAM, был диагностирован, как содержащий мутантный ген.
В результате можно видеть, что применение пары праймеров с последовательностями SEQ ID NOs:1 и 2 и зондов с последовательностями SEQ ID NOs:25 и 26 демонстрировало наиболее точные и эффективные результаты (Фигура 2).
Хотя настоящее изобретение было раскрыто в деталях со ссылкой на специфические особенности, специалисту в данной области техники очевидно, что это раскрытие описывает только предпочтительное воплощение и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, основной объем настоящего изобретения будет определен в прилагаемой Формуле изобретения и ее эквивалентах.
Промышленная применимость
Применение пары праймеров и зонда согласно настоящему изобретению может обеспечить диагностику дистрофии роговицы Авеллино более быстрым и точным способом, чем стандартный способ с применением ДНК-чипа или ПЦР.

Claims (4)

1. Пара праймеров для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино, которая представлена нуклеотидными последовательностями, выбираемыми из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs: 1 и 2.
2. Зонд для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино, который представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 25.
3. Зонд для ПЦР в режиме реального времени для диагностики дистрофии роговицы Авеллино, который представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 26.
4. Способ диагностики дистрофии роговицы Авеллино, включающий ПЦР амплификацию в режиме реального времени с использованием пары праймеров по п.1 и зондов по пп.2 и 3.
RU2011146553/10A 2009-04-17 2009-12-01 Праймеры для диагностики дистрофии роговицы авеллино RU2534817C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2009-0033528 2009-04-17
KR1020090033528A KR101251538B1 (ko) 2009-04-17 2009-04-17 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
PCT/KR2009/007099 WO2010120027A1 (ko) 2009-04-17 2009-12-01 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011146553A RU2011146553A (ru) 2013-05-27
RU2534817C2 true RU2534817C2 (ru) 2014-12-10

Family

ID=42982670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011146553/10A RU2534817C2 (ru) 2009-04-17 2009-12-01 Праймеры для диагностики дистрофии роговицы авеллино

Country Status (13)

Country Link
US (4) US20120077200A1 (ru)
EP (2) EP2420574B1 (ru)
JP (1) JP5738842B2 (ru)
KR (1) KR101251538B1 (ru)
CN (3) CN110872613A (ru)
AU (1) AU2009344501A1 (ru)
BR (1) BRPI0924016A2 (ru)
CA (1) CA2759222A1 (ru)
IL (1) IL215845A0 (ru)
RU (1) RU2534817C2 (ru)
SG (1) SG175732A1 (ru)
WO (1) WO2010120027A1 (ru)
ZA (1) ZA201107967B (ru)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101251538B1 (ko) * 2009-04-17 2013-04-08 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
KR101125212B1 (ko) * 2010-10-01 2012-03-21 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템
KR101480522B1 (ko) * 2013-02-15 2015-01-08 솔젠트 (주) 아벨리노 각막 이상증 판별용 진단 키트
KR20220100079A (ko) 2013-03-15 2022-07-14 아벨리노 랩 유에스에이, 인크. 대립유전자 검출을 위한 게놈 dna 주형의 개선된 단리 방법
KR101577109B1 (ko) * 2013-04-23 2015-12-11 주식회사 녹십자엠에스 아벨리노 각막이상증 진단용 조성물 및 이의 진단방법
AU2014348279B2 (en) * 2013-11-15 2021-02-18 Avellino Lab Usa, Inc. Methods for multiplex detection of alleles associated with ophthalmic conditions
EP3374502B1 (en) 2015-11-13 2021-10-27 Avellino Lab USA, Inc. Methods for the treatment of corneal dystrophies
CN106480200A (zh) * 2016-10-25 2017-03-08 北京亿昊基因技术有限公司 一种快速高效的与角膜营养不良相关基因突变位点的检测方法
CN108085375B (zh) * 2016-11-07 2020-10-16 北京华大通瀛科技有限公司 检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法及其试剂盒
KR101957919B1 (ko) * 2017-01-02 2019-03-13 부산대학교 산학협력단 각막이상증 진단용 바이오센서 및 이의 용도
KR20200129539A (ko) 2019-05-09 2020-11-18 주식회사 왓슨알앤디 Pcr 및 제한효소를 이용한 각막이상증 분자 진단 방법.
KR102249878B1 (ko) 2019-09-24 2021-05-11 주식회사 에이엠에스바이오 과립형 각막이상증 진단용 조성물
CN118222690A (zh) * 2022-12-21 2024-06-21 北京中因医学检验实验室有限公司 一种检测人tgfbi基因突变的引物探针组合物及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2348695C2 (ru) * 2006-05-23 2009-03-10 Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6018713A (en) 1997-04-09 2000-01-25 Coli; Robert D. Integrated system and method for ordering and cumulative results reporting of medical tests
JP3380744B2 (ja) 1998-05-19 2003-02-24 株式会社日立製作所 センサおよびこれを利用した測定装置
US6171112B1 (en) 1998-09-18 2001-01-09 Wyngate, Inc. Methods and apparatus for authenticating informed consent
WO2000058509A2 (en) 1999-03-29 2000-10-05 Genset Prostate cancer associated human fibronectin gene and biallelic markers
US7179597B2 (en) 2000-04-13 2007-02-20 Georgetown University Genetic diagnosis for QT prolongation related adverse drug reactions
US8438042B2 (en) 2002-04-25 2013-05-07 National Biomedical Research Foundation Instruments and methods for obtaining informed consent to genetic tests
WO2003014703A2 (en) 2001-08-09 2003-02-20 Curagen Corporation Nucleic acids, polypeptides, single nucleotide polymorphisms and methods of use thereof
EP1451558A1 (de) 2001-11-28 2004-09-01 Graffinity Pharmaceuticals Aktiengesellschaft Spr-sensorflächenträger
US20030211141A1 (en) * 2001-12-11 2003-11-13 Lebaron Richard G. Genetic and protein manipulation of betaIG-H3 for the treatment and cure of muscular dystrophies
US6943417B2 (en) 2003-05-01 2005-09-13 Clemson University DNA-based memory device and method of reading and writing same
US20050019757A1 (en) 2003-06-12 2005-01-27 Stolarchuk Danylo J. Contaminant detection apparatus
WO2005015198A1 (ja) 2003-08-06 2005-02-17 Nippon Telegraph And Telephone Corporation 多孔質材料を用いた分子の検出方法ならびに該多孔質材料及び該多孔質材料の製造方法
CA2544129A1 (en) 2003-10-22 2005-05-06 The Regents Of The University Of California Methods for preparing and functionalizing nanoparticles
WO2005047534A2 (en) 2003-10-28 2005-05-26 Bayer Healthcare Ag Methods and compositions for the response prediction of malig-nant neoplasia to treatment
EP1541528A1 (en) 2003-12-08 2005-06-15 Institut Jozef Stefan Quasi-one-dimensional polymers based on the metal-chalcogen-halogen system
US20060057604A1 (en) 2004-03-15 2006-03-16 Thinkfar Nanotechnology Corporation Method for electrically detecting oligo-nucleotides with nano-particles
CA2566123C (en) 2004-05-19 2014-02-18 Vp Holding, Llc Optical sensor with layered plasmon structure for enhanced detection of chemical groups by sers
US7713849B2 (en) 2004-08-20 2010-05-11 Illuminex Corporation Metallic nanowire arrays and methods for making and using same
US7332329B2 (en) 2004-09-24 2008-02-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Versatile substrate for SPR detection
WO2006096011A1 (en) * 2005-03-08 2006-09-14 Medigenes Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING AVELLINO CORNEA DYSTROPHY COMPRISING AN ANTIBODY AGAINST TGF-β
JP2006250668A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Tatsuro Endo 非標識バイオチップ
EP1715326A1 (en) 2005-04-22 2006-10-25 Universität Heidelberg Sensor chip with connected non-metallic particles comprising a metallic coating
WO2007002567A2 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Nanosphere, Inc. Selective isolation and concentration of nucleic acids from complex samples
KR20070076532A (ko) * 2006-01-18 2007-07-24 메디제네스(주) 각막이영양증 진단용 ｄｎａ 칩
CN101374850A (zh) * 2006-01-18 2009-02-25 株式会社美迪基尼斯 用于角膜营养不良诊断的dna芯片
MX2008012026A (es) 2006-03-21 2008-11-04 Univ Washington Polimorfismos geneticos en el gen de hormona que libera corticotropina (crh) como marcadores para mejorar el registro de marmoleo de carne de res y/o profundidad de grasa subcutanea.
EP1932922A1 (de) 2006-12-13 2008-06-18 Desitin Arzneimittel GmbH Schnelltest zum Nachweis von DNA-Sequenzen
WO2008089280A2 (en) 2007-01-16 2008-07-24 Applied Biosystems, Llc Selective lysis of sperm cells
US7898658B2 (en) 2007-01-23 2011-03-01 The Regents Of The University Of California Platform for chemical and biological sensing by surface-enhanced Raman spectroscopy
KR100891096B1 (ko) 2007-02-13 2009-03-31 삼성전자주식회사 올리고머 프로브 어레이 및 이의 제조 방법
JP5222599B2 (ja) 2007-07-20 2013-06-26 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置
CN101144812B (zh) 2007-10-17 2012-02-22 中国科学院光电技术研究所 一种局域表面等离子体生化传感器的制作方法
US20120231537A1 (en) 2008-04-30 2012-09-13 Gradalis, Inc. Highly Pure Plasmid DNA Preparations
KR101251538B1 (ko) * 2009-04-17 2013-04-08 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
US8865402B2 (en) 2009-08-26 2014-10-21 Clemson University Research Foundation Nanostructured substrates for surface enhanced raman spectroscopy (SERS) and detection of biological and chemical analytes by electrical double layer (EDL) capacitance
KR101125212B1 (ko) 2010-10-01 2012-03-21 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템
AU2014348279B2 (en) 2013-11-15 2021-02-18 Avellino Lab Usa, Inc. Methods for multiplex detection of alleles associated with ophthalmic conditions

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2348695C2 (ru) * 2006-05-23 2009-03-10 Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YOO S.J et al., Br.J. Ophthalmol., 91, 722-727, 2007. . *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009344501A1 (en) 2011-11-17
SG175732A1 (en) 2011-12-29
CA2759222A1 (en) 2010-10-21
US20180274034A1 (en) 2018-09-27
ZA201107967B (en) 2013-08-28
EP2420574A4 (en) 2012-08-29
JP2012523831A (ja) 2012-10-11
US20120077200A1 (en) 2012-03-29
EP2420574A1 (en) 2012-02-22
EP2420574B1 (en) 2014-10-29
KR20100115030A (ko) 2010-10-27
WO2010120027A1 (ko) 2010-10-21
CN102459593A (zh) 2012-05-16
BRPI0924016A2 (pt) 2016-10-11
US9938581B2 (en) 2018-04-10
US20220205044A1 (en) 2022-06-30
US20150093751A1 (en) 2015-04-02
CN110872613A (zh) 2020-03-10
CN104774930A (zh) 2015-07-15
RU2011146553A (ru) 2013-05-27
IL215845A0 (en) 2012-01-31
US11268146B2 (en) 2022-03-08
KR101251538B1 (ko) 2013-04-08
EP2848689A1 (en) 2015-03-18
CN102459593B (zh) 2015-04-08
JP5738842B2 (ja) 2015-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2534817C2 (ru) Праймеры для диагностики дистрофии роговицы авеллино
EP2128273B1 (en) Primer set for gene amplification, gene amplification reagent containing the same and use thereof
AU2006220604A1 (en) Diagnostic and therapeutic target for macular degeneration
EP2502994A1 (en) Primer set for amplification of mthfr gene, mthfr gene amplification reagent comprising same, and use of same
CN115141884A (zh) 一种新的atp7b突变基因及其诊断试剂
EP2055775A1 (en) Primer set for amplification of cyp2c9 gene, reagent for amplification of cyp2c9 gene comprising the same, and use of the same
KR101231899B1 (ko) 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
KR101231902B1 (ko) 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
KR101231903B1 (ko) 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
KR101231901B1 (ko) 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
KR101231900B1 (ko) 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
RU2796350C1 (ru) Молекулярно-генетическая система детекции делеции экзона 7 гена SMN1, пригодная для проведения неонатального скрининга
KR20160088028A (ko) Tgfbi-연관 각막이상증 진단방법 및 키트
KR20240099477A (ko) 유전자 다형을 이용한 판정 방법
KR20240041142A (ko) 타액, 혈액 및 정액 동시 검출을 위한 다중분석 역전사 중합효소 연쇄반응용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 검출 키트
JP2016052301A (ja) Ａｌｋ融合遺伝子を増幅するためのプライマー試薬、それを含むａｌｋ融合遺伝子の増幅試薬キット、それを用いたａｌｋ融合遺伝子の増幅方法および分析方法
JP2004121150A (ja) 緑内障発症リスク判断のための遺伝子検査方法
JP2004208661A (ja) 緑内障発症リスク判断のための遺伝子検査方法