CN118222690A - 一种检测人tgfbi基因突变的引物探针组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人TGFBI基因突变的引物探针组合物及其应用，属于生物技术领域。本发明要解决的技术问题是如何快速的检测人TGFBI基因的R124H突变，为解决上述技术问题，本发明提供用于检测人TGFBI基因突变的引物探针组合物，所述引物组合物包括引物探针组合物1和引物探针组合物2，所述探针组合物1包括特异性扩增和结合核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子的引物对和探针，所述探针组合物2包括特异性扩增和结合核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子的引物对和探针。本发明只需一次PCR扩增即可得到结果，操作简便，且省去了中间开盖过程，降低污染风险。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测人TGFBI基因突变的引物探针组合物及其应用。
背景技术
角膜营养不良(corneal dystrophy)是一组遗传性、对称性、非炎症性角膜疾病的总称，其共同特点是在角膜组织中形成形态各异的沉淀物。Avellino角膜营养不良(Avellino corneal dystrophy，ACD)是常染色体显性遗传病，外显率高，男女患病率大致相等。由于其临床表现与颗粒状角膜营养不良(granular corneal dystrophy,GCD)Ⅱ型相似，即发病早(10-20岁)、进展快、手术后复发快的特点，既往将该类疾病划归GCD。但该病的晚期又可出现线状混浊，即格子样改变，尤其是下方角膜多见，尽管出现较晚，但随着患者年龄增大出现比例明显增加。
TGFBI基因是第一个被发现，也是目前报道的最为常见的与角膜营养不良相关的基因。它位于人第五号染色体，包含17个外显子，编码一个由683个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白存在于角膜上皮细胞和基质细胞中，发挥创伤愈合和黏附作用，其病变可以导致淀粉样蛋白的沉淀。Avellino型角膜营养不良主要是由TGFBI基因第四外显子p.R124H位点突变(CGC>CAC)引起的。患者的临床症状与R124H位点的突变剂量存在累积效应，即纯合突变的患者较杂合子患者发病更早更严重，且更容易复发。
现有技术中采用荧光定量PCR加焦磷酸测序法检测R124H位点突变情况，要求先进行实时荧光PCR扩增之后，先经过琼脂糖凝胶电泳，有单一目的条带出现的则进行焦磷酸测序，反应中加入测序引物在QIAgen PyroMark Q24测序仪上进行测序反应，一次实验需进行三次反应，操作复杂，且频繁开盖，增加气溶胶污染风险。因此亟需开发操作简便、精度高的R124H位点突变情况的检测方法及相关的试剂或试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何快速的检测人TGFBI基因的是否产生R124H突变。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种用于检测人TGFBI基因突变的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括引物探针组合物1和引物探针组合物2，所述引物探针组合物1包括特异性扩增和结合核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子的引物对和探针，所述引物探针组合物2包括特异性扩增和结合核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子的引物对和探针。
进一步地，上述的引物探针组合物中，所述引物探针组合物1包括引物R124-F、引物R124wt-R和探针R124 probe，所述引物探针组合物2包括所述引物R124-F、引物R124H-R和所述探针R124 probe，
所述引物R124-F是核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的单链DNA；
所述引物R124wt-R是核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的单链DNA；
所述引物R124H-R是核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的单链DNA；
所述探针R124 probe的核苷酸序列是SEQ ID No.8。
本发明中，所述人TGFBI基因突变可为所述TGFBI基因R124突变，所述R124位点为GenBank Accession No.NG_012646.1(18-MAY-2020)的第22512-22514位，所述R124H突变的HGVS命名为NG_012646.1:g.22513G>A。
本发明中，核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子是人TGFBI基因R124野生型，核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子是人TGFBI基因R124H突变型。
进一步地，上述的引物探针组合物中，所述引物探针组合物1和引物探针组合物2还包括内参基因的引物对和探针，所述内参基因为B2M基因，所述内参基因的引物对包括引物B2M-F和引物B2M-R，所述内参基因的探针为B2M-probe，
所述引物B2M-F是核苷酸序列是SEQ ID No.6所示的单链DNA；
所述引物B2M-R是核苷酸序列是SEQ ID No.7所示的单链DNA；
所述探针B2M-probe的核苷酸序列是SEQ ID No.9。
本发明中，所述R124-Probe为特异性识别人TGFBI基因(包括R124野生型及R124H突变型)的探针，所述B2M-Probe为特异性识别B2M基因的探针，探针的5'端连接有荧光基团，3'端连接有淬灭基团。所述R124-Probe和所述B2M-Probe5'端连接的荧光基团的发光类型不同。
荧光基团可选自但不限于FAM(5/6-羧基荧光素)、VIC(绿色荧光蛋白)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、Cy3、TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)、ROX(羧基-X-罗丹明)、Texas Red、LC RED640、Cy5(花菁燃料)、LC RED705、FITC(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团，进行双重PCR检测引物组合物中探针的荧光基团的选择原则是两个荧光的显色不同。
所述淬灭基团可选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。
进一步地，上述的引物探针探针组合物中，所述引物探针组合物1中R124-F、R124wt-R、R124-probe、B2M-F、B2M-R、B2M-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1；所述引物探针组合物2中R124-F、R124H-R、R124-probe、B2M-F、B2M-R、B2M-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1。
进一步地，上述的引物探针组合物中，所述引物探针组合物还包括质控品质粒，所述质控品质粒选自下述任一种：
A1)、含有核苷酸序列是SEQ ID No.11的DNA分子的重组质粒；
A2)、含有核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA分子的重组质粒；
A3)、含有核苷酸序列是SEQ ID No.13的DNA分子的重组质粒。
在本发明的一个实施例中，上述质控品质粒分为A、B、C三组用于操作环节的质控。具体如下：
质控品A包含A2)和A3)2种重组质粒；
质控品B包含A1)、A2)和A3)共3种重组质粒；
质控品C包含A1)和A3)2种重组质粒。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述引物探针组合物在制备鉴定或辅助鉴定人TGFBI基因突变的试剂或试剂盒中的应用。
为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供鉴定或辅助鉴定人TGFBI基因突变的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有上述的引物探针组合物。
进一步地，上述试剂或试剂盒中含有引物探针组合物1和引物探针组合物2。
进一步地，上述试剂或试剂盒中所述引物探针组合物1中R124-F、R124wt-R、R124-probe、B2M-F、B2M-R、B2M-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1；所述引物探针组合物2中R124-F、R124H-R、R124-probe、B2M-F、B2M-R、B2M-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1。
进一步地上述试剂或试剂盒中的引物探针组合物中各组分分别包装。
为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供鉴定或辅助鉴定人TGFBI基因R124H突变的方法，包括用上述的引物探针组合物1和引物探针组合物2分别对待测样本的基因组DNA进行荧光定量PCR，根据式1的ΔCt得到引物探针组合物1的ΔCt和引物探针组合物2的ΔCt，根据这两个ΔCt按照下述步骤确定待测样本是否存在所述突变，
R1)引物探针组合物1的ΔCt＜5，且引物探针组合物2的ΔCt＜5，待测样本为杂合突变；
R2)引物探针组合物1的ΔCt≥5，且引物探针组合物2的ΔCt＜5，待测样本为纯合突变；
R3)引物探针组合物1的ΔCt＜5，且引物探针组合物2的ΔCt≥5，待测样本为野生型；
ΔCt＝│Ct(R124-Probe)-Ct(B2M-Probe)│ 式1，
其中，Ct(R124-Probe)为由所述探针R124-probe得到的荧光定量PCR的循环数，所述Ct(B2M-Probe)为由所述探针B2M-probe得到的荧光定量PCR的循环数。探针R124-probe得到的荧光定量PCR的循环数分别表示引物探针组合物1和引物探针组合物2的两个反应体系的荧光定量PCR的循环数。
在本发明的实施例中，Ct(R124-Probe)也用Ct(FAM)表示，Ct(B2M-Probe)也用Ct(ROX)表示。
本发明采用ARMS-PCR结合荧光PCR探针法，原理是PCR下游引物3’端碱基错配会导致产物急剧减少，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。现有技术针对待测基因SNP位点设计PCR引物，结合Taqman探针进行实时荧光定量PCR检测，同时引入内参基因，根据Ct待测基因与Ct内参基因之间的差值△Ct值来判断多态位点的型别，从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。
本发明利用两种反应体系检测TGFBI基因R124H突变位点及R124wt野生型位点，根据Ct目标基因与Ct内参基因之间的差值△Ct值来判断多态位点的型别，从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。为了降低管间差异导致的判读结果不准确的风险，每个反应体系中均引入内参基因同时进行检测。
上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。
本专利检测方法：1)提取样本中的DNA，将其作为DNA模板，DNA浓度不低于1ng/μL，DNA的OD260/OD280值在1.6-2.0之间；2)本试剂盒扩增反应体系为：25×Anstart MasterPCR Mix 0.8μL，5×Taq Buffer(Mg2+Plus)4μL，10×引物探针混合液2μL，模板3μL，超纯水补充至20μL。3)PCR反应体系：50℃2min，95℃3min；95℃30sec，60℃50sec，40个循环；25℃1min；4)结果判读。
结果判读：
R124判读结果：B2M基因荧光PCR的扩增曲线呈典型的S型，且Ct值≦30，ΔCt＝│Ct(R124-Probe)-Ct(B2M-Probe)│。
(2)技术效果
本发明只需一次PCR扩增(两组组合在同一反应程序，同一反应板上进行，可认为是同一次PCR扩增反应)即可得到结果，操作简便，且省去了中间开盖过程，降低污染风险。
附图说明
图1为准确性验证中样本1的引物探针组合物判断结果与一代测序结果。
图2为准确性验证中样本2的引物探针组合物判断结果与一代测序结果。
图3为准确性验证中样本3的引物探针组合物判断结果与一代测序结果。
图4为准确性验证中样本4的引物探针组合物判断结果与一代测序结果。
图5为准确性验证中样本5的引物探针组合物判断结果与一代测序结果。
图6为检测线测定实验中10ng/μL的sample-1的检测结果。
图7为检测线测定实验中1ng/μL的sample-1的检测结果。
图8为检测线测定实验中100pg/μL的sample-1的检测结果。
图9为检测线测定实验中10ng/μL的sample-2的检测结果。
图10为检测线测定实验中1ng/μL的sample-2的检测结果。
图11为检测线测定实验中100pg/μL的sample-2的检测结果。
图12为检测线验证实验中2ng/μL的sample-1的检测结果。
图13为检测线验证实验中2ng/μL的sample-2的检测结果。
图14为检测线验证实验中1ng/μL的sample-1的检测结果。
图15为检测线验证实验中1ng/μL的sample-2的检测结果。
图16为检测线验证实验中500pg/μL的sample-1的检测结果。
图17为检测线验证实验中500pg/μL的sample-2的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、R124H位点的检测引物设计
1.1、R124H位点的核苷酸序列
本发明采用ARMS-PCR结合荧光PCR探针法检测TGFBI基因第四外显子p.R124H位点突变(CGC>CAC)情况，在TGFBI基因第四外显子p.R124H位点突变(CGC>CAC)附近设计引物检测是否存在R124H突变。以B2M基因作为内参，设计引物如表1所示：
表1：引物序列
1.2、引物探针组合物
根据监测目的将引物探针组合物分为两组，具体分组如下：
引物探针组合物1：R124-F、R124wt-R、R124 probe、B2M-F、B2M-R和B2M-probe；
引物探针组合物2：R124-F、R124H-R、R124 probe、B2M-F、B2M-R和B2M-probe；
引物探针组合物1用于扩增SEQ ID No.1所示的R124野生型DNA片段和内参B2M；引物探针组合物2用于扩增SEQ ID No.2所示的R124H突变型DNA片段和内参B2M。上述两组引物探针组合物中各组份的物质的量见下表。使用时使用TE配制成下表终浓度的混合液。
表2：反应体系中引物组合物终浓度
上述检测方法还引入质控品伴随样本同时进行操作，监控整个操作过程，增加实验结果的可信度。
构建质控品质粒PUC-SP-R124H：用核苷酸序列是SEQ ID No.11的DNA分子插入载体PUC-SP的EcoRV酶切识别位点之间的片段，保持载体PUC-SP其它核苷酸序列不变，测序验证正确获得重组质粒PUC-SP-R124H。
构建质控品质粒PUC-SP-R124WT：用核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA分子插入载体PUC-SP的EcoRV酶切识别位点之间的片段，保持载体PUC-SP其它核苷酸序列不变，测序验证正确获得重组质粒PUC-SP-R124WT。
构建质控品质粒PUC-SP-B2M：用核苷酸序列是SEQ ID No.13的DNA分子插入载体PUC-SP的SmaI酶切识别位点之间的片段，保持载体PUC-SP其它核苷酸序列不变，测序验证正确获得重组质粒PUC-SP-B2M。
其中，载体PUC-SP全序列的核苷酸序列是SEQ ID No.10。
质控品A包含质控品质粒PUC-SP-R124WT以及PUC-SP-B2M；
质控品B包含质控品质粒PUC-SP-R124WT、PUC-SP-R124H以及PUC-SP-B2M；
质控品C包含质控品质粒PUC-SP-R124H以及PUC-SP-B2M。
1.3、检测方法
检测方法具体如下：
1)提取样本中的DNA，将其作为DNA模板，DNA浓度不低于1ng/μL，DNA的OD260/OD280值在1.6-2.0之间、OD260/OD230值在1.6-2.0之间；
2)反应体系
反应体系A为：25×Anstart Master PCR Mix 0.8μL，5×Taq Buffer(Mg2+Plus)4μL，10×引物探针组合物1的混合液2μL，模板3μL，超纯水补充至20μL；
反应体系B为：25×Anstart Master PCR Mix 0.8μL，5×Taq Buffer(Mg2+Plus)4μL，10×引物探针组合物2的混合液2μL，模板3μL，超纯水补充至20μL；
3)PCR反应体系：50℃2min，95℃3min；95℃30sec，60℃50sec，40个循环；25℃1min；
4)结果判读
R124判读结果：B2M基因荧光PCR的扩增曲线呈典型的S型，且Ct值≦30，ΔCt＝│Ct(R124-Probe)-Ct(B2M-Probe)│ 式1，
其中，Ct(R124-Probe)为FAM信号达到设定的阈值(指数扩增)时所经历的循环周期数，所述Ct(B2M-Probe)为ROX信号达到设定的阈值(指数扩增)时所经历的循环周期数
ΔCtR124H(反应体系B)和ΔCtR124wt(反应体系A)分别代表两个反应体系中Ct(R124-Probe)与Ct(B2M-Probe)差值的绝对值。
依据表3进行结果判读。
表3：结果判读的标准
实施例2、检测准确性验证
选用具有代表性的1-5例人的临床样本按照实施例1中1.3所示的检测方法进行检测，判读结果如下表和图1-5所示，图1-5中左侧为本专利试剂盒检测荧光结果，右侧为124位点一代测序结果。结果表明：对样本1-5的检测结果本申请提供的引物组合物检测结果与一代测序结果相比结论一致。临床样本为来源于合作医院的血样提取的DNA，且已经签署患者知情同意书。
表4：样品1-5的判读结果
实施例3、灵敏度检测
3.1、检测限测定
选择R124野生型和R124H突变临床样本各一例(实施例2中的样本1和样本3)，分别稀释至10ng/μL、1ng/μL和100pg/μL三个浓度梯度，每个浓度梯度重复4次，在保证阴阳性一致的情况下，摸索最低检出限。
判读时阈值设置为30000，自动设置基线，样本内参要求扩增曲线呈典型的S型，且Ct值≤30，通过对检测样本各反应管中的FAM通道与ROX通道的Ct值的差值计算，来判断样本的突变情况。
ΔCt＝│Ct(R124-Probe)-Ct(B2M-Probe)│ 式1
当反应体系BΔCt＜5时，无论反应体系A结果如何，均判断为R124H突变；当反应体系BΔCt≥5时，反应体系AΔCt＜5则判断为R124H无突变样本。
通过表1发现当样本浓度为100pg/μL时，CtROX＞30，不符合判读标准；当样本浓度为1ng/μL时，CtROX接近30，且判读结果与样本已知基因型相符，因此初定1ng/μL为本专利试剂盒检测限浓度。
数据统计见表5：(其中，sample-1为杂合型(实施例中样本1)，sample-2为野生型(实施例1中样本3))
表5：检测限测定数据统计
3.2、检测限验证
上述两例临床样本分别稀释至2ng/μL、1ng/μL和500pg/μL三个浓度梯度，每个浓度梯度重复20次，进行最低检测限验证。
当检测浓度为1ng/μL时，sample-1B体系中20次重复有1次检测结果与实际样本类型不符，检出符合率为95％(数据见表5)，当检测浓度为500pg/μL时，sample-1B体系中20次重复有5次检测结果与实际样本类型不符，检出符合率为75％(数据见表6)，故确定1ng/μL为本专利试剂盒最低检出限(参考《遗传性耳聋相关基因突变检测试剂注册技术审查指导原则》中检测限要求将具有95％检出率水平浓度作为最低检出限)。Sample-1A体系及Sample-2A体系检出率均为100％。
表6：检测限验证数据统计
备注：表中“/”表示Undetermined即未检出Ct值。
表7：
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备注：表中“/”表示Undetermined即未检出Ct值。
表8：
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备注：表中“/”表示Undetermined即未检出Ct值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种用于检测人TGFBI基因突变的引物探针组合物，其特征在于：所述引物探针组合物包括引物探针组合物1和引物探针组合物2，所述引物探针组合物1包括特异性扩增和结合核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子的引物对和探针，所述引物探针组合物2包括特异性扩增和结合核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子的引物对和探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于：所述引物探针组合物1包括引物R124-F、引物R124wt-R和探针R124-probe，所述引物探针组合物2包括所述引物R124-F、引物R124H-R和所述探针R124-probe，
所述引物R124-F是核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的单链DNA；
所述引物R124wt-R是核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的单链DNA；
所述引物R124H-R是核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的单链DNA；
所述探针R124-probe的核苷酸序列是SEQ ID No.8。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于：所述引物探针组合物1和引物探针组合物2还包括内参基因的引物对和探针，所述内参基因为B2M基因，所述内参基因的引物对包括引物B2M-F和引物B2M-R，所述内参基因的探针为B2M-probe，
所述引物B2M-F是核苷酸序列是SEQ ID No.6所示的单链DNA；
所述引物B2M-R是核苷酸序列是SEQ ID No.7所示的单链DNA；
所述探针B2M-probe的核苷酸序列是SEQ ID No.9。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于：所述引物探针组合物1中R124-F、R124wt-R、R124-probe、B2M-F、B2M-R、B2M-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1；所述引物探针组合物2中R124-F、R124H-R、R124-probe、B2M-F、B2M-R、B2M-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1。
5.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于：所述引物探针组合物还包括质控品质粒，所述质控品质粒选自下述任一种：
A1)、含有核苷酸序列是SEQ ID No.11的DNA分子的重组质粒；
A2)、含有核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA分子的重组质粒；
A3)、含有核苷酸序列是SEQ ID No.13的DNA分子的重组质粒。
6.权利要求1-5中任一项所述引物探针组合物在制备鉴定或辅助鉴定人TGFBI基因突变的试剂或试剂盒中的应用。
7.鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定人TGFBI基因R124H突变的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有权利要求1-5中任一项所述的引物探针组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中含有引物探针组合物1和引物探针组合物2。
9.根据权利要求7所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中所述引物探针组合物1中R124-F、R124wt-R、R124-probe、B2M-F、B2M-R、B2M-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1；所述引物探针组合物2中R124-F、R124H-R、R124-probe、B2M-F、B2M-R、B2M-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1。
10.鉴定或辅助鉴定人TGFBI基因R124H突变的方法，包括用权利要求3或4所述的引物探针组合物1和引物探针组合物2分别对待测样本的基因组DNA进行荧光定量PCR，根据式1的ΔCt得到引物探针组合物1的ΔCt和引物探针组合物2的ΔCt，根据这两个ΔCt按照下述步骤确定待测样本是否存在所述突变，
R1)引物探针组合物1的ΔCt＜5，且引物探针组合物2的ΔCt＜5，待测样本为杂合突变；
R2)引物探针组合物1的ΔCt≥5，且引物探针组合物2的ΔCt＜5，待测样本为纯合突变；
R3)引物探针组合物1的ΔCt＜5，且引物探针组合物2的ΔCt≥5，待测样本为野生型；
ΔCt＝│Ct(R124-Probe)-Ct(B2M-Probe)│ 式1，
其中，Ct(R124-Probe)为由所述探针R124-probe得到的荧光定量PCR的循环数，所述Ct(B2M-Probe)为由所述探针B2M-probe得到的荧光定量PCR的循环数。
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