CN115141884A - 一种新的atp7b突变基因及其诊断试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的ATP7B突变基因及其诊断试剂，属于医学诊断技术领域。本发明通过外显子组测序技术首次发现了ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点发生复合杂合突变可以导致肝豆状核变性。本发明的研究成果可以用于肝豆状核变性的遗传学诊断，为肝豆状核变性的发病机制研究提供了新的基础和途径，为肝豆状核变性的治疗提供新的理论依据，可以为治疗肝豆状核变性提供可能的药物靶点。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种新的ATP7B突变基因及其诊断试剂。
背景技术
肝豆状核变性又称Wilson病(MIM 277900)，一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病，以铜代谢障碍引起的肝硬化、基底节损害为主的脑变性疾病为特点，以不同程度的肝细胞损害、脑退行性病变和角膜边缘有铜盐沉着环为临床特征。世界范围发病率为1/30000～1/100000，致病基因携带者约为1/90。好发于青少年，男性比女性稍多，如不恰当治疗将会致残甚至死亡。该病也是少数几种可治的神经遗传病之一，关键是早发现、早诊断、早治疗。
铜是人体所必需的微量元素之一。许多酶促反应都需要铜离子参与，如细胞色素氧化酶、过氧化物歧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶、赖氨酰氧化酶和铜蓝蛋白等。但是，机体内铜含量过多时，高浓度的铜会使细胞受损和坏死、导致脏器功能损伤。肝脏是进行铜代谢的主要器官。人体内总铜量的8％贮存于肝内，其浓度居各脏器之首，其次为脑、心、肾等组织。肝细胞依靠其溶酶体合成铜蓝蛋白并分泌入胆汁，人体每日经由胆汁排出铜1.2～1.7mg，尿中排出量仅0.07mg左右。当这种机制发生缺陷时，铜自胆汁中排出锐减，但患者肠道吸收铜功能正常，因此大量铜贮积在肝细胞中最终导致肝脏受损、肝功能异常和肝硬化。同时，血液中非铜蓝蛋白铜含量增高，致使由尿中排出增加和在脑、肾、肌肉和眼等组织中明显大量沉积，临床上出现各系统被累及并呈现相应症状。通常发生于儿童和青少年期，少数成年期发病。病情缓慢发展，可有阶段性缓解或加重，亦有进展迅速者。
肝豆状核变性致病基因ATP7B(MIM 606882)定位于染色体13q14.3，基因全长79.5kb，包含21个外显子和20个内含子，编码1466个氨基酸组成的铜转运P型ATP酶,参与铜的跨膜转运，ATP7B蛋白一方面转运铜至反高尔基体网络并与铜蓝蛋白前体结合、形成功能性的全铜蓝蛋白入血；另一方面转运铜至胆汁以便排泄。ATP7B蛋白主要在肝脏表达，当ATP7B基因突变导致ATP7B蛋白对铜的转运功能障碍时，铜在肝脏过量沉积，引起肝细胞线粒体氧化应激反应并对脂质、蛋白质、DNA和RNA等分子造成损伤，导致肝细胞损伤、肝脏脂肪变性；铜还可激活肝星状细胞，加速肝纤维化进程。当铜超过了肝脏储存容量，就会以游离铜的形式进入血液，并在脑部、肾脏、角膜、关节以及肠道等部位过量沉积，产生肝脏外的铜毒性，引起相应的临床表现。
人类基因数据库已公开了数百个个ATP7B基因突变位点，其中绝大部分在肝豆状核变性发病中具有明确致病作用。欧洲肝豆状核变性患者人群中最常见的突变为p.His1069Gln，突变频率为13％～61％；亚洲人群的常见突变为p.Arg778Leu，突变频率为34％～38％。我国肝豆状核变性患者有3个高频致病突变p.Arg778Leu、p.Pro992Leu和p.Thr935Met，占所有致病突变的50％～60％；相对常见的致病突变还有p.Ala874Val、p.Ile1148Thr、p.Gly943Asp、p.Gln511X、p.Arg919Gly、p.Asn1270Ser、p.Arg778Gln等。基因突变以错义突变为主，主要为纯合突变以及复合杂合突变，少部分患者只找到单一杂合突变。对于临床表现不典型而又高度疑诊患者，可先行ATP7B基因的热点突变检测，无阳性发现者应筛查ATP7B基因全长编码区及其侧翼序列。
基因突变是导致肝豆状核变性发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊肝豆状核变性的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，现有技术中对基因突变位点基因型的检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的ATP7B突变基因及其诊断试剂，首次发现ATP7B一种新型复合杂合突变，可导致肝豆状核变性，并据此研制相应的诊断试剂盒，助力肝豆状核变性基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种引发肝豆状核变性的突变基因，所述突变基因包括在ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点发生复合杂合突变。
本发明所述c.2929A>C突变指野生型ATP7B基因的第13号外显子的第2929位由A突变为C，形成基因突变体，所述基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.11(ACGTCCATCCCGGTGCTGTGC)所示。所导致的ATP7B突变体蛋白与野生型ATP7B基因编码的蛋白相比，第977位氨基酸由苏氨酸(T)突变为脯氨酸(P)，即所述ATP7B突变体蛋白含有p.T977P的突变，所述突变是由于c.2929A>C的错义突变引起的；所述突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12(TSIPVLC)所示。
本发明所述c.3724G>A突变指野生型ATP7B基因的第18号外显子的第3724位由G突变为A，形成基因突变体，所述基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.13(GTCTTTGCAAAGGTGCTGCCT)所示。所导致的ATP7B突变体蛋白与野生型ATP7B基因编码的蛋白相比，第1242位氨基酸由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，即所述ATP7B突变体蛋白含有p.E1242K的突变，所述突变是由于c.3724G>A的错义突变引起的；所述突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14(VFAKVLP)所示。
本发明还提供了一种由上述突变基因引发的肝豆状核变性的检测试剂，所述检测试剂包括针对所述基因突变的位点设计的特异性扩增引物。
优选的，所述特异性扩增引物包括ATP7B-1F、ATP7B-1R、ATP7B-2F和ATP7B-2R，所述ATP7B-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ATP7B-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ATP7B-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ATP7B-2R的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明还提供了一种肝豆状核变性的检测试剂盒，包括上述检测试剂。
优选的，还包括PCR扩增反应的试剂，和/或DNA测序时所需的试剂和测序引物。
优选的，所述测序引物包括ATP7B-Seq1F、ATP7B-Seq1R、ATP7B-Seq2F和ATP7B-Seq2R，所述ATP7B-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述ATP7B-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ATP7B-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ATP7B-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了述检测试剂或上述检测试剂盒在制备肝豆状核变性的诊断试剂中的应用。
优选的，所述诊断试剂的检测样本包括血液或羊水。
有益效果：本发明提供了一种新的引发肝豆状核变性的突变基因，在ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点发生复合杂合突变。本发明利用外显子测序筛选与肝豆状核变性高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得肝豆状核变性的致病基因复合杂合突变，ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K，分别来自父源和母源13号染色体上的等位基因。本发明筛选的致病基因突变中可以将肝豆状核变性患者、携带者和正常人群区分开，因此，本发明的致病基因突变可以作为诊断肝豆状核变性的生物标志物。具体的，可通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断肝豆状核变性致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导，如本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断肝豆状核变性；本发明为肝豆状核变性的发病机制研究奠定了重要基础，为肝豆状核变性患者的治疗提供全新的理论依据；本发明可以为治疗肝豆状核变性提供可能的药物靶点。
附图说明
图1显示肝豆状核变性1号家系遗传图谱；其中，
表示男性携带者，
表示女性携带者，↗表示先证者，■表示男性患者，◇表示胎儿；
图2显示利用Sanger测序检测1号家系ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点基因型的结果图，其中，A层和C层：家系中突变者；B层和D层：1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图3显示利用Sanger测序检测1号家系ATP7B:NM_000053.4:exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点基因型的结果图，其中，B层和C层：家系中突变带者；A层和D层：1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图4显示肝豆状核变性2号家系遗传图谱；其中，
表示男性携带者，
表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者；
图5显示利用试剂盒检测2号家系ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点基因型的结果图，其中，B层和C层：家系中突变带者；A层：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；
图6显示利用试剂盒检测2号家系ATP7B:NM_000053.4:exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点基因型的结果图，其中，A层和C层：家系中突变者；B层：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
本发明提供了一种引发肝豆状核变性的突变基因，所述突变基因包括在ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点发生复合杂合突变。
本发明首次发现ATP7B的一种新型复合杂合突变，可导致肝豆状核变性，可将所述突变基因作为一个新的生物标志物，如将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，如果发现ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点的基因型是“A/C；G/A”，则判断ATP7B基因存在复合杂合突变，个体为患者；若两位点的基因型是“A/C；G/G”或“A/A；G/A”，则判断ATP7B基因存在单个杂合突变，个体是携带者；若位点的基因型是“A/A；G/G”，则判断ATP7B基因为野生型，个体是正常人。
本发明还提供了一种由上述突变基因引发的肝豆状核变性的检测试剂，所述检测试剂包括针对所述基因突变的位点设计的特异性扩增引物。
本发明所述特异性扩增引物，优选包括：
ATP7B-1F(SEQ ID NO.1):CTCCTATGCCAGGTGTT；
ATP7B-1R(SEQ ID NO.2):TGTTGATAAAGCGTTCC；
ATP7B-2F(SEQ ID NO.3):ATGGAGAAGACAGTTGGAGG；
ATP7B-2R(SEQ ID NO.4):GAGCACAGTGGGTAAGAGC。
本发明还提供了一种肝豆状核变性的检测试剂盒，包括上述检测试剂。
本发明所述试剂盒，优选还包括PCR扩增反应的试剂，和/或DNA测序时所需的试剂和测序引物。本发明所述PCR扩增反应的试剂，优选包括dNTP、PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。本发明所述测序引物，优选包括：
ATP7B-Seq1F(SEQ ID NO.5):TCTGCTCCTGTAATGCCT；
ATP7B-Seq1R(SEQ ID NO.6):TACAGGCTGACCTTGTGC；
ATP7B-Seq2F(SEQ ID NO.7):TTGGGGCAGGAGCCAGGGAT；
ATP7B-Seq2R(SEQ ID NO.8):TCCCAGCACCCACAGCCT。
本发明还提供了检测ATP7B基因是否存在上述基因突变的方法，优选包括一下步骤：
1)提取样本基因组DNA；
2)扩增ATP7B基因序列；
3)DNA测序；
4)将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，如果发现ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点的基因型是“A/C；G/A”，则判断ATP7B基因存在复合杂合突变，个体为患者；若两位点的基因型是“A/C；G/G”或“A/A；G/A”，则判断ATP7B基因存在单个杂合突变，个体是携带者；若位点的基因型是“A/A；G/G”，则判断ATP7B基因为野生型，个体是正常人。
在本发明中，所述扩增ATP7B基因序列的体系，以20μL计，优选包括：10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/LdNTPs 0.4μL、100ng/μLATP7B-1F(或ATP7B-2F)0.5μL、100ng/μLATP7B-1R(或ATP7B-2R)0.5μL、100ng/μL抽提DNA 1.0μL、5U/μLTaq酶0.2μL和余量的ddH2O 15.4μL。在本发明中，由于所述突变基因存在两个突变位点，所以进行扩增时，虽然体系相同，但是程序略有差别，如针对ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点时，扩增程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃再延伸7min。当针对ATP7B:NM_000053.4exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点时，本发明所设计的扩增程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸7min。
本发明对所述DNA测序的方法并没有特殊限定，优选利用本领域的常规测序手段进行测序即可，如sanger测序。
本发明还提供了述检测试剂或上述检测试剂盒在制备肝豆状核变性的诊断试剂中的应用。
本发明所述诊断试剂的检测样本优选包括血液或羊水，本发明所述诊断试剂的使用方法优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种新的ATP7B突变基因及其诊断试剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在本发明中，术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估；术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的；“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。在本发明中，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增ATP7B基因是指，在PCR反应中引物只扩增ATP7B基因，而不扩增其他基因。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1样本获取
发明人发现了一个肝豆状核变性家系(简称ATP7B家系)，该ATP7B家系部分成员的临床信息见表2。图1显示了ATP7B基因突变家系图谱，其中，
表示男性携带者，
表示女性携带者，↗表示先证者，■表示男性患者，◇表示胎儿。
1.诊断标准：
可参照《肝豆状核变性的诊断与治疗指南》2022版：
指南中对于肝豆状核变性的诊断应用Leipzig评分系统，总分≥4分可确诊，3分为疑似诊断，≤2分则排除诊断(表1)。
表1 2001年莱比锡第8届Wilson病国际会议的诊断标准(Leipzig评分系统)
注：总分≥4分可确诊；总分3分为疑似诊断，需进一步检查；总分≤2分基本不考虑诊断；a：肝铜定量不可及时；ULN：正常值上限。
表2肝豆状核变性1号家系成员的临床信息
如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
1号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1外周血DNA用于测序，Ⅱ2羊水DNA用于测序。
实施例2外显子测序
1.仪器设备如表3所示。
表3仪器设备一览表
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表4配制。
表4 5×TBE电泳液配方
| 试剂 | 体积/重量 |
| Tris | 5.4g |
| 硼酸 | 750mg |
| EDTA(pH8.0,0.5mol/L) | 2mL |
| ddH<sub>2</sub>O | 90mL |
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表5配制。
表5 10×红细胞裂解液配方
| 试剂 | 体积/重量 |
| NH<sub>4</sub>Cl | 82.9g |
| KHCO<sub>3</sub> | 10g |
| EDTA | 0.37g |
| 加ddH<sub>2</sub>O | 至1000mL |
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表6配制。
表6 1×细胞核裂解液配方
| 试剂 | 体积/重量 |
| 2MTris-HCl,pH8.2 | 0.5mL |
| 4MNaCl | 10mL |
| 2mMEDTA | 0.4mL |
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集家系中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1成员的外周血3～5mL以及Ⅱ2成员羊水5～10mL作为研究样品。
4.1样本DNA提取
1)如为肝素抗凝外周血样本，则将外周血3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明；如如为羊水则直接进入下一步骤。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到2个具有致病意义的基因复合杂合突变ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K，分别来自患者的父源和母源的等位基因；其中exon13:c.2929A>C的突变可能导致所编码的蛋白质第977位氨基酸残基由苏氨酸变为脯氨酸，exon18:c.3724G>A的突变可能导致所编码的蛋白质第1242位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸。在家系患者个体中ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点的基因型是“A/C；G/A”复合杂合突变，在ATP7B家系正常个体中两位点的基因型是“A/A；G/G”，在ATP7B家系携带者个体中两位点的基因型是“A/C；G/G”或“A/A；G/A”单个杂合突变。
实施例3Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点进行验证。分别对实施例1中的4名家系人员和100名家系外正常人进行ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例2的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，引物序列由上海生工生物技术公司合成。
2.2针对c.2929A>C和c.3724G>A位点分别设计15对候选引物(见表7)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况
表7各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；
②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
④引物内部不应出现互补序列；
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
2.3候选引物PCR验证反应
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表8中序号1至8)。
表8引物检测PCR反应体系
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10-15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表7验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表7中两位点候选1号对引物)作为突变家系检测用引物，针对ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
针对ATP7B:NM_000053.4exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点的引物序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表9中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表9突变位点PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 10×PCR缓冲液 | 2.0μL |
| 10mmol/LdNTPs | 0.4μL |
| 100ng/μLATP7B-1F(或ATP7B-2F) | 0.5μL |
| 100ng/μLATP7B-1R(或ATP7B-2R) | 0.5μL |
| 100ng/μL抽提DNA | 1.0μL |
| 5u/μLTaq酶 | 0.2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 15.4μL |
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
针对针对ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点采用如下步骤：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→47℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
针对ATP7B:NM_000053.4exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点采用如下步骤：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→53℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表8。
表8 BigDye反应体系
| 试剂 | 用量 |
| PCR产物纯化后DNA | 2.0μL |
| 3.2pmol/μL测序引物 | 1.0μL |
| BigDye | 0.5μL |
| 5×BigDye测序缓冲液 | 2.0μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 4.5μL |
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc(pH5.2)；
2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。
针对ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点的测序引物序列如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
针对ATP7B:NM_000053.4:exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点的测序引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
9、结果分析
Sanger测序结果显示，家系中1名患者ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点基因型是“A/C；G/A”；家系中2名携带者该位点的基因型分别是“A/C；G/G”或“A/A；G/A”，家系中1名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点基因型是“A/A；G/G”。图2测序图中箭头所指位置A层和C层显示家系中个体ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点基因型是“A/C；G/G”杂合突变，图2中B层和D层显示家系中个体ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点基因型是“A/A；G/G”。图3测序图中箭头所指位置B层和C层显示家系中个体ATP7B:NM_000053.4:exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点基因型是“A/A；G/A”杂合突变，图3中A层和D层显示家系中个体ATP7B:NM_000053.4:exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点基因型是“A/A；G/G”。
实施例4肝豆状核变性诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物：如实施例3所示
2)缓冲液
3)Taq酶
4)dNTPs
5)ATP7B:c.2929A>C和c.3724G>A阳性突变参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，其中c.2929A>C突变位点阳性参考品序列如SEQ ID NO.9所示。其中c.3724G>A突变位点阳性参考品序列如SEQ ID NO.10所示。
6)测序引物：如实施例3所示
2、使用方法：
应用于2号家系的突变基因检测。
表11肝豆状核变性2号家系成员的临床信息
如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1外周血DNA用于试剂盒检测。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；
3)对PCR扩增产物进行纯化；
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5)对BiyDye反应产物纯化；
6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
图5显示利用试剂盒检测2号家系ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P位点基因型的结果显示家系中先证者和其母亲为突变带者；先证者父亲基因型为野生型。图6显示利用试剂盒检测2号家系ATP7B:NM_000053.4:exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点基因型的结果显示家系中先证者和其父亲为突变携带者；先证者母亲基因型为野生型。综合图5和图6结果，先证者为ATP7B基因复合杂合突变，检测结果确认先证者为肝豆状核变性患者。遗传咨询意见为，先证者父母均为携带者，他们生育下一代中有1/4的概率生育先证者一样的患儿，有1/4的概率生育完全正常个体，有1/2的概率生育携带者；下次妊娠后建议产前诊断或妊娠前行胚胎植入前遗传学诊断。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的ATP7B基因突变，且确认了新突变与肝豆状核变性的发病密切相关，所述致病突变体可用于肝豆状核变性的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南家辉生物技术有限公司
<120> 一种新的ATP7B突变基因及其诊断试剂
<160> 66
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcctatgcc aggtgtt 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttgataaa gcgttcc 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagaaga cagttggagg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagcacagtg ggtaagagc 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctgctcctg taatgcct 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacaggctga ccttgtgc 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttggggcagg agccagggat 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcccagcacc cacagcct 18
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcctatgcc aggtgttatg tactgtgtat atttatatgt ttatatgtgt attgcctcat 60
tcaatccttg ccacaattta tgagctatgc attatcatct ccattttgtg tatgaggaaa 120
ccaggatctg gatctgtgtg gtccatctcc agagtctgct ttcccctatc aagggctttt 180
atttgactct gctcctgtaa tgcctctttg agggaaacct gtaggatgaa gttggatagc 240
tgggatgtgg agagcagtaa cgtgttctct atgatggcag agcagtgtgg aataccatct 300
gtttccggaa cccaagttcg tcacgttgtg tccagtgccc ccctgaaatg tccttatgtg 360
attagagttc tgggagcttc cttattgaac tctcaacctg cctctgactc tgtcctgttt 420
tcagaacccc aacaagcaca tctcccagac agaggtgatc atccggtttg ctttccagac 480
gtccatcccg gtgctgtgca ttgcctgccc ctgctccctg gggctggcca cgcccacggc 540
tgtcatggtg ggcaccgggg tggccgcgca gaacggcatc ctcatcaagg gaggcaagcc 600
cctggagatg gcgcacaagg tcagcctgta gcacggcttt ccccatcctg agagatgaaa 660
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tagccaccag tcatataatg gaacgc 806
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atggagaaga cagttggagg actgagccgt ggacagggag accagcaagg gggttgtttg 60
cacatccaga aaaggacagg gcctaaacca gtgcagggtg ttggggcagg agccagggat 120
aaactggccc tgtgacagca aacctgcagg gtgtggttga ccaacatcac tgactggacc 180
cagaggccga gggcagaggg ggcaagggta acttgaggtt tctgctgcta tctgatacct 240
tttgccaaca ctaggcattg ccttcctttt gtcttaggtt ggcatcaaca aagtctttgc 300
aaaggtgctg ccttcgcaca aggtggccaa ggtccaggag ctccagaata aagggaagaa 360
agtcgccatg gtgggggatg gggtcaatga ctccccggcc ttggcccagg cagacatggg 420
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agtgagcgtg gctgcagcca ggctgtgggt gctgggaggg caatgggcag accccttcct 540
cactgtgtgc tcctctccat cagaatgatt tgctggatgt ggtggctagc attcaccttt 600
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ttgggatacc cattgcagca ggtaggcagc tcttacccac tgtgctc 707
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgtccatcc cggtgctgtg c 21
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Thr Ser Ile Pro Val Leu Cys
1 5
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtctttgcaa aggtgctgcc t 21
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Val Phe Ala Lys Val Leu Pro
1 5
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctcctatgc caggtgtt 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgttgataaa gcgttcca 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctcctatgc caggtgtt 18
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcccagtta tacttgactt cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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acctgtagga tgaagttgga ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actgctgtct tgagtggc 18
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<212> DNA
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<212> DNA
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cattcaatcc ttgccaca 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacaggctga ccttgtgc 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttgcctcatt caatcctt 18
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgttgctact gttgttattc c 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcattcaat ccttgccaca 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgtgctaca ggctgacc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcctgtaat gcctcttt 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcccagtta tacttgactt cc 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcattcaat ccttgccaca 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcccagtta tacttgactt cc 22
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<211> 18
<212> DNA
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<400> 37
cattcaatcc ttgccaca 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtgctacagg ctgacctt 18
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcctgtaat gcctcttt 18
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tgcaggcgtt tggtcaag 18
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caggagccag ggataaac 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gagcacagtg ggtaagagc 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggagccag ggataaac 18
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<400> 44
ataaatcagt gccaggacc 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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atggagaaga cagttggagg 20
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cacgctcact ctgataagga 20
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atggagaaga cagttggagg 20
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<212> DNA
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ttggaaaggt gaatgctag 19
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<212> DNA
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atggagaaga cagttggagg 20
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<400> 54
agctggagca cagtgggt 18
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ccaggggcac agagtagc 18
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ccaggggcac agagtagc 18
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aggggcacag agtagcac 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
agtgccagga ccaggttg 18
Claims (8)
1.一种引发肝豆状核变性的突变基因，其特征在于，所述突变基因包括在ATP7B:NM_000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点发生复合杂合突变。
2.一种由权利要求1所述突变基因引发的肝豆状核变性的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括针对所述基因突变的位点设计的特异性扩增引物。
3.根据权利要求1所述检测试剂，其特征在于，所述特异性扩增引物包括ATP7B-1F、ATP7B-1R、ATP7B-2F和ATP7B-2R，所述ATP7B-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ATP7B-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ATP7B-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ATP7B-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种肝豆状核变性的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述检测试剂。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增反应的试剂，和/或DNA测序时所需的试剂和测序引物。
6.根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述测序引物包括ATP7B-Seq1F、ATP7B-Seq1R、ATP7B-Seq2F和ATP7B-Seq2R，所述ATP7B-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述ATP7B-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ATP7B-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ATP7B-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
7.权利要求2或3所述检测试剂或权利要求4～6任一项所述检测试剂盒在制备肝豆状核变性的诊断试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述诊断试剂的检测样本包括血液或羊水。
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