CN115960196A - 导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的mfsd8基因复合突变体、复合突变体蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因复合突变体、复合突变体蛋白和应用。本发明提供了导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因突变体，所述MFSD8基因突变体与野生型MFSD8基因相比包括c.217_218insA突变；所述c.217_218insA突变与现有的c.1444C>T突变复合组成复合杂合突变，进而形成MFSD8基因复合突变体。通过检测该MFSD8复合突变体蛋白在生物样品中是否存在，可以有效地检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断神经元腊样脂褐质沉积症7型致病基因突变携带者或患者。

Description

导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因复合突变体、复合突变体蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因复合突变体、复合突变体蛋白和应用。

背景技术

神经元腊样脂褐质沉积症(NCL)是一组儿童最常见的遗传性、进行性神经系统变性病。虽然多数患者在儿童期发病，偶尔也出现在成年人，其临床特点：包括进行性痴呆、难治性癫痫发作和视力丧失。总体发病率为1/12500。

临床表现：1)婴儿型CLN1、2)晚期婴儿型NCL及其变异型、3)青少年型(CLN3)、4)成年型(CLN4)、5)进行性癫痫伴智能发育延迟CLN8、6)先天型(CLN10)和7)CLN9型，其中晚期婴儿型NCL及其变异型又包括经典的晚期婴儿型(CLN2)、芬兰变异型(CLN5)、早期青少年型(CLN6)和土耳其型(CLN7)(MIM 610951)。

神经元腊样脂褐质沉积症7型(土耳其型/CLN7；MIM 610951)是一种常染色体隐性遗传性疾病，其致病基因MFSD8(MIM 611124)定位于染色体4q28.2，基因全长48.2kb，包含13个外显子和12个内含子，编码518个氨基酸组成的溶酶体膜蛋白，包含1个转运结构域和1个主要协助转运蛋白超家族结构域，拓扑结构预测具有12个跨膜域，这些结构域高度保守。迄今MFSD8基因已发现数十种种致病性突变，突变类型包括错义突变、无义突变、移码突变、剪切位点突变和插入 /缺失突变，其中以错义突变为主。这些突变可造成蛋白功能缺陷，造成神经发育异常。在病理上本病表现为具有黄色自发荧光特性的脂色素沉积在神经细胞和其他细胞内，导致大脑皮质和视网膜为主的神经细胞丧失。超微结构检查发现脂色素在不同的临床亚型由颗粒型、曲线体和指纹状物质构成。这些沉积物质在中枢神经系统的神经细胞内存在外，可以在皮肤活检和淋巴细胞的超微结构检查中发现。

基因突变是导致神经元腊样脂褐质沉积症7型发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊神经元腊样脂褐质沉积症7型的重要标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，现有技术中对基因突变位点基因型的检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的，所以需要针对特异突变位点设计引物，并结合Sanger 测序技术完成基因序列检测工作。

发明内容

本发明的目的在于提供导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因复合突变体、复合突变体蛋白和应用，本发明发现了新的MFSD8基因突变位点，与现有MFSD8基因突变位点复合形成新的MFSD8基因复合突变体，可以作为神经元腊样脂褐质沉积症7型的筛查和诊断位点，将患者、携带者和正常人群区分开，指导患者的精准治疗和优生优育。

本发明提供了一种MFSD8基因突变体，所述MFSD8基因突变体与野生型MFSD8基因相比包括c.217_218insA突变。

本发明还提供了上述技术方案所述的MFSD8基因突变体编码的MFSD8突变体蛋白，所述 MFSD8突变体蛋白与野生型MFSD8蛋白相比包括p.T73Nfs*10突变。

本发明提供了导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因复合突变体，所述MFSD8基因复合突变体包括复合杂合突变，所述复合杂合突变包括上述技术方案所述的c.217_218insA突变和c.1444C>T突变。

本发明还提供了上述技术方案所述的MFSD8基因复合突变体编码的MFSD8复合突变体蛋白，所述MFSD8复合突变体蛋白包括上述技术方案所述的p.T73Nfs*10突变和p.R482*突变。

本发明还提供了上述技术方案所述的MFSD8基因复合突变体或所述的MFSD8复合突变体蛋白作为检测靶点在制备下述Ⅰ～Ⅶ中的一种或多种的试剂盒中的应用：

Ⅰ：神经元腊样脂褐质沉积症7型诊断试剂盒；

Ⅱ：神经元腊样脂褐质沉积症7型筛查试剂盒；

Ⅲ：神经元腊样脂褐质沉积症7型产前诊断试剂盒；

Ⅳ：神经元腊样脂褐质沉积症7型产前筛查试剂盒；

Ⅴ：神经元腊样脂褐质沉积症7型孕前诊断试剂盒；

Ⅵ：神经元腊样脂褐质沉积症7型孕前筛查试剂盒；

Ⅶ：辅助防治神经元腊样脂褐质沉积症7型的试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的MFSD8基因复合突变体或所述的MFSD8 复合突变体蛋白的试剂，所述试剂包括引物、探针、抗体和质谱检测试剂中的至少一种。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的MFSD8基因复合突变体的引物组，所述引物组包括检测所述c.217_218insA突变的引物对MFSD8-1和检测所述c.1444C>T突变的引物对 MFSD8-2；

所述引物对MFSD8-1的上游引物MFSD8-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物对 MFSD8-1的下游引物MFSD8-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物对MFSD8-2的上游引物MFSD8-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物对 MFSD8-2的下游引物MFSD8-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种用于诊断和/或筛查神经元腊样脂褐质沉积症7型的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物组。

优选的，所述试剂还包括测序引物和扩增所需要的试剂；

所述测序引物包括所述c.217_218insA突变的测序引物MFSD8-Seq1和所述c.1444C>T突变的测序引物MFSD8-Seq2；

所述测序引物MFSD8-Seq1的上游引物MFSD8-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述测序引物MFSD8-Seq1的下游引物MFSD8-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述测序引物MFSD8-Seq2的上游引物MFSD8-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述测序引物MFSD8-Seq2的下游引物MFSD8-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂在制备诊断、筛查和辅助防治神经元腊样脂褐质沉积症7型的任意一种或多种试剂盒中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种MFSD8基因突变体，所述MFSD8基因突变体与野生型MFSD8基因相比包括c.217_218insA突变。本发明所述MFSD8基因突变体为首次发现的MFSD8基因突变体，所述 c.217_218insA突变指野生型MFSD8基因第5号外显子的第217位和第218位之间插入A碱基，形成MFSD8基因突变体，可导致所编码的MFSD8蛋白第73位氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺，并造成移码突变，在后面10个氨基酸后终止，形成MFSD8突变体蛋白。

本发明还提供了导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因复合突变体，所述MFSD8 基因复合突变体包括上述技术方案所述的c.217_218insA突变和c.1444C>T突变。本发明所述 MFSD8基因复合突变体中的c.1444C>T突变为现有MFSD8基因突变位点，指野生型MFSD8基因第13号染色体上的第1444位C突变为A，该突变可能导致所编码的蛋白质第482位氨基酸残基由精氨酸变为终止密码子。由本发明首次发现的c.217_218insA突变与现有的c.1444C>T突变复合组成复合杂合突变，进而形成MFSD8基因复合突变体。本发明所述MFSD8基因复合突变体可以形成MFSD8复合突变体蛋白，所述突变体蛋白包括p.T73Nfs*10突变和p.R482*突变。本发明首次发现MFSD8基因复合突变体或MFSD8复合突变体蛋白可以导致神经元腊样脂褐质沉积症7型，且与神经元腊样脂褐质沉积症7型的发病密切相关，通过检测该MFSD8突变体蛋白在生物样品中是否存在，可以有效地检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断神经元腊样脂褐质沉积症7 型致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导为治疗神经元腊样脂褐质沉积症7 型提供可能的药物靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1显示神经元腊样脂褐质沉积症7型1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，

表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图2显示利用Sanger测序检测1号家系MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*位点基因型的结果图，其中，A层和C层：1号家系中突变者；B层：1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图3显示利用Sanger测序检测1号家系MFSD8:NM_152778.4:exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10 位点基因型的结果图，其中，B层和C层：1号家系中突变者；A层：1号家系中基因型为野生型 (测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图4显示神经元腊样脂褐质沉积症7型2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，

表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者；

图5显示利用试剂盒检测2号家系MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*位点基因型的结果图；其中，B层和C层：2号家系中突变者；A和D层：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图6显示利用试剂盒检测2号家系MFSD8:NM_152778.4:exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点基因型的结果图；其中，A、C层和D层：2号家系中突变者；B层：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

具体实施方式

本发明提供了一种MFSD8基因突变体，所述MFSD8基因突变体与野生型MFSD8基因相比包括c.217_218insA突变。

本发明野生型MFSD8基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_152778的序列。本发明所述c.217_218insA突变指野生型MFSD8基因第5号外显子的第217位和第218位之间插入A碱基，形成MFSD8基因突变体。

本发明还提供了上述技术方案所述的MFSD8基因突变体编码的MFSD8突变体蛋白，所述 MFSD8突变体蛋白与野生型MFSD8蛋白相比包括p.T73Nfs*10突变。本发明所述MFSD8突变体蛋白中的p.T73Nfs*10突变是由c.217_218insA突变引起的。

本发明提供了导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因复合突变体，所述MFSD8基因复合突变体包括复合杂合突变，所述复合杂合突变包括上述技术方案所述的c.217_218insA突变和c.1444C>T突变。

本发明针对自行收集的一例神经元腊样脂褐质沉积症7型家系(其中1号家系包括先证者、先证者父亲和母亲)通过全外显子测序、家系分析联合Sanger测序验证的方法对此家系进行致病变异检测和验证。在MFSD8基因确定了新的复合杂合突变，包括新发现的c.217_218insA突变和现有的c.1444C>T突变，c.217_218insA突变和c.1444C>T突变分别来自患者父源和母源的等位基因，二者组成新的复合杂合突变，可以导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的发生。本发明首次发现了 MFSD8基因上c.217_218insA突变，并确认了将c.217_218insA突变和c.1444C>T突变组成的复合杂合突变与神经元腊样脂褐质沉积症7型的密切关系，可用于神经元腊样脂褐质沉积症7型的分子遗传学研究和神经元腊样脂褐质沉积症7型相关疾病的诊断。

本发明所述c.1444C>T突变指野生型MFSD8基因第13号染色体上的第1444位C突变为A，该突变可能导致所编码的蛋白质第482位氨基酸残基由精氨酸变为终止密码子。本发明所述 c.1444C>T突变与首次发现的c.217_218insA突变形成复合杂合突变，进而形成本发明中MFSD8基因复合突变体。通过检测受试者是否携带有上述复合杂合突变，能够筛查或诊断神经元腊样脂褐质沉积症7型致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断神经元腊样脂褐质沉积症7型。另一方面，本发明为神经元腊样脂褐质沉积症7型的发病机制研究奠定了重要基础，为神经元腊样脂褐质沉积症7型患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗神经元腊样脂褐质沉积症7型提供可能的药物靶点。

本发明还提供了上述技术方案所述的MFSD8基因复合突变体编码的MFSD8复合突变体蛋白，所述MFSD8复合突变体蛋白包括上述技术方案所述的p.T73Nfs*10突变和p.R482*突变。本发明所述MFSD8复合突变体蛋白中的p.R482*突变由c.1444C>T突变引起；与由c.217_218insA突变引起的所述的p.T73Nfs*10突变组成本发明中的MFSD8复合突变体蛋白。

本发明还提供了上述技术方案所述的MFSD8基因复合突变体或所述的MFSD8复合突变体蛋白作为检测靶点在制备下述试剂盒中的应用：Ⅰ：神经元腊样脂褐质沉积症7型诊断试剂盒；Ⅱ：神经元腊样脂褐质沉积症7型筛查试剂盒；Ⅲ：神经元腊样脂褐质沉积症7型产前诊断试剂盒；Ⅳ：神经元腊样脂褐质沉积症7型产前筛查试剂盒；Ⅴ：神经元腊样脂褐质沉积症7型孕前诊断试剂盒；Ⅵ：神经元腊样脂褐质沉积症7型孕前筛查试剂盒；Ⅶ：辅助防治神经元腊样脂褐质沉积症7型的试剂盒。本发明通过检测生物样本中是否含有所述MFSD8基因复合突变体，可以有效检测生物样本是否患有神经元腊样脂褐质沉积症7型，或是否易患神经元腊样脂褐质沉积症7型。本发明通过检测所述含有MFSD8复合突变体蛋白在生物样本中是否表达，可以有效确证生物样本中是否患有神经元腊样脂褐质沉积症7型，或是否易患神经元腊样脂褐质沉积症7型。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的MFSD8基因复合突变体或所述的MFSD8 复合突变体蛋白的试剂，所述试剂包括引物、探针、抗体和质谱检测试剂中的至少一种，进一步优选包括引物和/或探针，更优选包括引物。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述的MFSD8基因复合突变体的引物组，所述引物组包括检测所述c.217_218insA突变的引物对MFSD8-1和检测所述c.1444C>T突变的引物对 MFSD8-2；所述引物对MFSD8-1的上游引物MFSD8-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述引物对MFSD8-1的下游引物MFSD8-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物对MFSD8-2 的上游引物MFSD8-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物对MFSD8-2的下游引物 MFSD8-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明所述SEQ ID NO.1～4的核苷酸序列具体如下：SEQ ID NO.1： 5’-AAATGAGCCTCCCAAGC-3’；SEQ ID NO.2：5’-ACAATCCACGAGCAACC-3’；SEQ ID NO.3： 5’-TTTCCCTTTACACTCCTT-3’；SEQ ID NO.4：5’-TGTTCTGCTATGGCTAAT-3’。

本发明还提供了一种用于诊断和/或筛查神经元腊样脂褐质沉积症7型的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的试剂。本发明所述试剂优选还包括测序引物和扩增所需要的试剂；所述测序引物优选包括所述c.217_218insA突变的测序引物MFSD8-Seq1和所述c.1444C>T突变的测序引物 MFSD8-Seq2；所述测序引物MFSD8-Seq1的上游引物MFSD8-Seq1F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示，所述测序引物MFSD8-Seq1的下游引物MFSD8-Seq1R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示；所述测序引物MFSD8-Seq2的上游引物MFSD8-Seq2F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7 所示，所述测序引物MFSD8-Seq2的下游引物MFSD8-Seq2R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示。本发明所述SEQ ID NO.5～8的核苷酸序列具体如下：SEQ ID NO.5： 5’-GAAGTTTGAATCCCTTACTA-3’；SEQ ID NO.6：5’-TCCACGAGCAACCAGCAT-3’；SEQ ID NO.7：5’-TAAGTTTGCTGTAGTTTGGT-3’；SEQ ID NO.8：5’-AGACTGGCTCACCGCAAT-3’。

本发明所述PCR扩增所需要的试剂优选包括但不限于dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶。本发明所述PCR缓冲液优选为10×PCR缓冲液，具体包括500mmol/LKCl，100mmol/L Tris-Cl (pH 8.3)和15mmol/LMgCl₂。本发明所述试剂中优选还包括DNA测序用试剂。本发明对所述DNA 测序用试剂的类型没有特殊限定，采用本领域中常规DNA测序用试剂即可。本发明所述试剂中的测序引物能够对扩增所述MFSD8基因复合突变体的引物组的扩增产物进行测序，从而判断MFSD8 基因上是否存在c.217_218insA突变和c.1444C>T突变，快速精准诊断神经元腊样脂褐质沉积症7 型。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂在制备诊断、筛查和辅助防治神经元腊样脂褐质沉积症7型的任意一种或多种试剂盒中的应用。本发明所述试剂盒具体优选包括Ⅰ：神经元腊样脂褐质沉积症7型诊断试剂盒；Ⅱ：神经元腊样脂褐质沉积症7型筛查试剂盒；Ⅲ：神经元腊样脂褐质沉积症7型产前诊断试剂盒；Ⅳ：神经元腊样脂褐质沉积症7型产前筛查试剂盒；Ⅴ：神经元腊样脂褐质沉积症7型孕前诊断试剂盒；Ⅵ：神经元腊样脂褐质沉积症7型孕前筛查试剂盒；Ⅶ：辅助防治神经元腊样脂褐质沉积症7型的试剂盒。

本发明还提供了一种检测神经元腊样脂褐质沉积症7型的方法，包括如下步骤：采用所述 MFSD8基因突变体的引物对对待测样本DNA进行扩增，将扩增得到的产物进行测序和比对，结果判定。

本发明对待测样本DNA的获取方法没有特殊限定，采用本领域中常规DNA提取方法即可。本发明所述致病基因突变体的引物对优选与上述技术方案相同，不再进行赘述。本发明对扩增、测序和比对的步骤和具体过程没有特殊限定，采用本领域中常规方式即可。本发明所述待测样本DNA 的来源优选为血液。本发明所述结果判定优选包括：如果发现 MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*和exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点的基因型是“c.1444C>T杂合突变和c.217_218insA杂合突变”，则判断MFSD8基因存在复合杂合突变，个体为患者；若两位点的基因型是“c.1444C>T杂合突变”或“c.217_218insA杂合突变”，则判断MFSD8 基因存在单个杂合突变，个体是携带者；若两个位点的基因型是“野生型”，则判断MFSD8基因为野生型，个体是正常人。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(第三版；Molecular CloningALABORATORYMANUAL 1SECOND EDITION；NewYork： Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1样本获取

发明人发现了一个神经元腊样脂褐质沉积症7型家系(简称1号家系)，该1号家系部分成员的临床信息见表2。图1显示了MFSD8基因突变1号家系图谱，其中，表示男性携带者，

表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版。

神经元腊样脂褐质沉积症根据发病年龄、秉承、超微病理改变和基因异常本病分为5个主要亚型和5个地区性的变异型。其中先天型、婴儿型和晚期型属于急性病，而青少年型和成年型属于慢性病。

表1神经元腊样脂褐质沉积症(NCL)的分型

疾病分类	发病年龄	脂褐素	突变蛋白	NCL分型
					CLN1	3个月至10岁	颗粒型	PPTT1	婴儿型(INCL)
CLN2	2-8岁	曲线体/混合	TPP1	晚期婴儿型(LINCL)
					CLN3	4-10岁	指纹体/混合	跨膜蛋白	青少年型(JNCL)
CLN4	11-55岁	混合	-	成年型(ANCL)
					CLN5	3-6岁	指纹体/混合	跨膜蛋白	芬兰变异型(LINCL)
CLN6	18个月至8岁	曲线体/混合	-	非芬兰变异型(LINCL)
					CLN7	1-6岁	指纹体/混合	-	土耳其型(LINCL)
CLN8	5-10岁	颗粒型	跨膜蛋白	癫痫智能发育迟缓型
					CLN9	学龄期	混合	RDCS	-
CLN10	胎儿期	颗粒型	CTSD	先天型

表2神经元腊样脂褐质沉积症7型1号家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1外周血DNA用于测序。

实施例2外显子测序

1.仪器设备如表3所示。

表3仪器设备一览表

仪器名称	生产厂家
		高通量测序仪NextSeq500	Illumina
QubitFluorometer核酸定量计	Invitrogen
		PCR仪	Bio-RAD
离心机5810R	Eppendorf
		离心机5424	Eppendorf
5418小型高速离心机	Eppendorf
		生物安全柜	苏净
超净工作台	苏净
		制冰机	Grant
UPS电源	Santa
		MilliQ超纯水仪	Millipore
高性能计算机(包括服务器、机柜、交换机、存储等)	DELL
		-25度冷藏箱	美菱
超低温冰箱	Eppendorf
		微波炉	美的

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表4配制。

表4 5×TBE电泳液配方

试剂	体积/重量
		Tris	5.4g
硼酸	750.0mg
		EDTA(pH8.0,0.5mol/L)	2.0mL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	90.0mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表5配制。

表5 10×红细胞裂解液配方

试剂	体积/重量
		NH4Cl	82.9g
<![CDATA[KHCO<sub>3</sub>]]>	10.0g
		EDTA	0.37g
<![CDATA[加dH<sub>2</sub>O]]>	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表6配制。

表6 1×细胞核裂解液配方

试剂	体积/重量
		2MTris-HCl，pH8.2	0.5mL
4MNaCl	10mL
		2mMEDTA	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集家系中Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1成员的外周血3-5mL作为研究样品。

4.1样本DNA提取

1)样本3-5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。

2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加酚和氯仿混合液混匀，酚：氯仿的体积比是1:1，室温3000转 /分钟离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular CloningALABORATORYMANUAL 1SECOND EDITION；NewYork：Cold Spring HarborLaboratoryPress，2014)操作指南。

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到具有致病意义的基因复合杂合突变MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482* 和exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10，分别来自患者的父源和母源的等位基因；其中c.217_218insA 的突变为首次发现，该突变可能导致所编码的蛋白质第73位氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺，并造成移码突变，在后面10个氨基酸后终止；另c.1444C>T的突变为曾经发现过的突变，该突变可能导致所编码的蛋白质第482位氨基酸残基由精氨酸变为终止密码子；在1号家系患者个体中 MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*和exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点的基因型是“c.1444C>T杂合突变+c.217_218insA杂合突变”的复合杂合突变，在MFSD8家系携带者个体中两位点的基因型是“c.1444C>T杂合突变”或“c.217_218insA杂合突变”的单个杂合突变。

实施例3Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对 MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*和exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲)和100名家系外正常人进行MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*和exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例2的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库 hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或 http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对旧突变位点c.1444C>T和新发现突变位点c.217_218insA分别设计15对候选引物(见表7和表8)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。

表7 c.217_218insA各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

表8 c.1444C>T各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。

2.3候选引物PCR验证反应

按照表9中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表9 中序号1至8)。

表9引物检测PCR反应体系

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；第二步：30个循环(95℃，30sec→Tm，30sec→72℃，60sec)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)；第三步：72℃，7min；第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子；2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却；3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右；4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中；5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底；6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳；7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10～15分钟；8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表7～8验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表7中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，表8中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)作为突变家系检测用引物。

针对MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*位点的引物序列如下所示：5’- TTTCCCTTTACACTCCTT-3’(SEQ ID NO.3)5’-TGTTCTGCTATGGCTAAT-3’(SEQ ID NO.4)

针对新发现突变MFSD8:NM_152778.4exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点的引物序列如下所示：5’-AAATGAGCCTCCCAAGC-3’(SEQ ID NO.1)5’-ACAATCCACGAGCAACC-3’(SEQ ID NO.2)

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表10中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表10突变位点PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR缓冲液	2.0μL
10mmol/LdNTPs	0.4μL
		100ng/μLMFSD8-1F(或MFSD8-2F)	0.5μL
100ng/μLMFSD8-1R(或MFSD8-2R)	0.5μL
		100ng/μL外周血抽提DNA	1.0μL
5u/μLTaq酶	0.2μL
		ddH2O	15.4μL

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：针对c.1444C>T位点，反应程序为：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→46℃，30秒→72℃，60秒)；第三步： 72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

针对c.217_218insA位点，反应程序为：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃， 30秒→52℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表11。

表11 BigDye反应体系

试剂	用量
		PCR产物纯化后DNA	2.0μL
3.2pmol/μL测序引物	1.0μL
		BigDye	0.5μL
5×BigDye测序缓冲液	2.0μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	4.5μL

测序PCR循环条件：第一步：96℃，1分钟；第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物。

针对MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*位点的测序引物序列如下所示： 5’-TAAGTTTGCTGTAGTTTGGT-3’(SEQ ID NO.7)5’-AGACTGGCTCACCGCAAT-3’(SEQ IDNO.8)

针对新发现突变位点MFSD8:NM_152778.4:exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10的测序引物序列如下所示：5’-GAAGTTTGAATCCCTTACTA-3’(SEQ ID NO.5)5’-TCCACGAGCAACCAGCAT-3’ (SEQ ID NO.6)

9、结果分析

Sanger测序结果显示，1号家系中1名患者MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482* 和exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点基因型是“c.1444C>T杂合突变+c.217_218insA杂合突变”的复合杂合突变；1号家系中2名携带者该位点的基因型分别是“c.1444C>T杂合突变”或“c.217_218insA杂合突变”的单杂合突变；100个无血缘关系的正常对照的 MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*和exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点基因型是“野生型”。图2测序图中箭头所指位置A层和C层显示家系中个体MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*位点基因型是“c.1444C>T杂合突变”，图2中B层显示家系中个体MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*位点基因型是“野生型”。图3测序图中箭头所指位置B层和C层显示家系中个体 MFSD8:NM_152778.4:exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点基因型是“c.217_218insA杂合突变”，图3中A层显示家系中个体MFSD8:NM_152778.4:exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点基因型是“野生型”。

实施例4神经元腊样脂褐质沉积症7型诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例3中表7中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和表8中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列，2)缓冲液：10×PCR缓冲液具体组分未：500mmol/LKCl，100mmol/LTris-Cl (pH8.3)，15mmol/LMgCl₂，3)Taq酶，4)dNTPs，5)MFSD8:c.1444C>T和c.217_218insA阳性突变参考品DNA，c.1444C>T阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示： TTTCCCTTTACACTCCTTTTATTTTTTTTAATCTGACTTAATATTAAATGCTATATTTATAGGAGGC ATTTTATGTTTAATTTAAAAGTAAAAGATGCAGAAATGATTCTTGTAAGTTTGCTGTAGTTTGGT AATACCATTTCTTTGCTTTTAAATAACTAAACCCCAATATCAATCTGCTTGTCCTCCATTTCACCC CCAACAGGGTGTATACATGGGCTGGTTAACAGCATCTGGAAGTGGAGCCCGGATTCTTGGGCC TATGTTCATCAGCCAAGTGTATGCTCACTGGGGACCATGATGGGCATTCAGCCTGGTGTGTGGA ATAATAGTGCTCACCATCACCCTCCTGGGAGTGGTTTACAAAAGACTCATTGCTCTTTCTGTAA GATATGGGAGGATTCAGGAATAAACTAGCTAAGACTGTGATGGAAACTACTTGCTGTGTGGCA CTTCCTGGTCTAAAGCTCTGCTAGACAATTGCGGTGAGCCAGTCTCCAAGAATCAGACTACAG ATATTGCAGATTTTGAAGAACAAGAACATATGTTGAATAACAGAGAGAATTCTACATGTCATTG TGAATAGTAGGTTATATAAAAACATACTAGATGATAATTTCCTTACCTCAGAAATGAAATATTATT CTTATAATACCTTTTTGTGGTTGCATGAACTAATGAGTGAATGGACAATGATGAATAAATGTGA AGCTGTATTCTTAATACCCACTGCAGAAGTGTCATTAAAATAATATACAGTGGAACCAGAAAGA GGGTTCTGTAAGAATTAGCCATAGCAGAACA(SEQ ID NO.65)

c.217_218insA阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：

AAATGAGCCTCCCAAGCATTTTTCCCTTGTGTACAGTCTATTGTTAGCACATTTAATTGTAT TGTCAGAAGTTTGAATCCCTTACTATAAGTAATAGTGTTATAAAACTTATACGTTAGAATTGTTT TTATTTTTTGATAGGAAATCTTACATGGTATGACAAATGTATTTAGTTTTAAACTTTTCTTGGATA ACAATTCTTAAAGCACTGTACCTTTTTCTGCAGATTGATCCGACAGCTGATAACAAGTTTTTTG GGCTGGGTTATTGCTTCATATAGTCTTGGCCAAATGGTAGCTTCACCTATATTTGGTTTATGGTCT AATTATAGACCAAGAAAAGAGCCTCTTATTGTCTCCATCTTGATTTCCGTGGCAGCCAACTGCC TCTATGCATATCTCCACATCCCAGCTTCTCATAATAAATACTACATGCTGGTTGCTCGTGGATTGT (SEQ ID NO.66)

6)测序引物：如实施例3所示

2、使用方法：

应用于2号家系患者检测(见表12)。

表12神经元腊样脂褐质沉积症7型2号家系成员的临床信息

如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。其中，表示男性携带者，

表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者患者。

2号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1和Ⅱ2外周血DNA用于该试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

试剂盒检测结果显示，2号家系中先证者MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*和 exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点基因型是“c.1444C>T杂合突变+c.217_218insA杂合突变”的复合杂合突变。图5测序图中箭头所指位置显示家系中先证者和先证者母亲 MFSD8:NM_152778.4:exon13:c.1444C>T:p.R482*位点基因型是“c.1444C>T杂合突变”杂合突变，先证者父亲和弟弟为野生型；图6测序图中箭头所指位置显示家系中先证者、先证者父亲和弟弟 MFSD8:NM_152778.4:exon5:c.217_218insA:p.T73Nfs*10位点基因型是“c.217_218insA杂合突变”，先证者母亲为野生型；图5和图6结果排除先证者弟弟为神经元腊样脂褐质沉积症7型患者，仅为 c.217_218insA突变携带者；先证者父母为携带者，下次妊娠时，建议产前诊断。

由以上实施例可以得出：本发明确认了新的MFSD8基因复合突变体，即包括c.217_218insA 突变和c.1444C>T突变，且确认了新突变体与神经元腊样脂褐质沉积症7型的发病密切相关，所述基因突变体可用于神经元腊样脂褐质沉积症7型的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种MFSD8基因突变体，其特征在于，所述MFSD8基因突变体与野生型MFSD8基因相比包括c.217_218insA突变。

2.权利要求1所述的MFSD8基因突变体编码的MFSD8突变体蛋白，其特征在于，所述MFSD8突变体蛋白与野生型MFSD8蛋白相比包括p.T73Nfs*10突变。

3.导致神经元腊样脂褐质沉积症7型的MFSD8基因复合突变体，其特征在于，所述MFSD8基因复合突变体包括复合杂合突变，所述复合杂合突变包括权利要求1所述的c.217_218insA突变和c.1444C>T突变。

4.权利要求3所述的MFSD8基因复合突变体编码的MFSD8复合突变体蛋白，其特征在于，所述MFSD8复合突变体蛋白包括权利要求2所述的p.T73Nfs*10突变和p.R482*突变。

5.权利要求3所述的MFSD8基因复合突变体或权利要求4所述的MFSD8复合突变体蛋白作为检测靶点在制备下述Ⅰ～Ⅶ中的一种或多种的试剂盒中的应用：

Ⅰ：神经元腊样脂褐质沉积症7型诊断试剂盒；

Ⅱ：神经元腊样脂褐质沉积症7型筛查试剂盒；

Ⅲ：神经元腊样脂褐质沉积症7型产前诊断试剂盒；

Ⅳ：神经元腊样脂褐质沉积症7型产前筛查试剂盒；

Ⅴ：神经元腊样脂褐质沉积症7型孕前诊断试剂盒；

Ⅵ：神经元腊样脂褐质沉积症7型孕前筛查试剂盒；

Ⅶ：辅助防治神经元腊样脂褐质沉积症7型的试剂盒。

6.一种用于检测权利要求3所述的MFSD8基因复合突变体或权利要求4所述的MFSD8复合突变体蛋白的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物、探针、抗体和质谱检测试剂中的至少一种。

7.一种用于检测权利要求3所述的MFSD8基因复合突变体的引物组，其特征在于，所述引物组包括检测所述c.217_218insA突变的引物对MFSD8-1和检测所述c.1444C>T突变的引物对MFSD8-2；

所述引物对MFSD8-1的上游引物MFSD8-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物对MFSD8-1的下游引物MFSD8-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物对MFSD8-2的上游引物MFSD8-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物对MFSD8-2的下游引物MFSD8-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8.一种用于诊断和/或筛查神经元腊样脂褐质沉积症7型的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求7所述的引物组。

9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括测序引物和扩增所需要的试剂；

所述测序引物包括所述c.217_218insA突变的测序引物MFSD8-Seq1和所述c.1444C>T突变的测序引物MFSD8-Seq2；

所述测序引物MFSD8-Seq1的上游引物MFSD8-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述测序引物MFSD8-Seq1的下游引物MFSD8-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述测序引物MFSD8-Seq2的上游引物MFSD8-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述测序引物MFSD8-Seq2的下游引物MFSD8-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

10.权利要求8或9所述的试剂在制备诊断、筛查和辅助防治神经元腊样脂褐质沉积症7型的任意一种或多种试剂盒中的应用。

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