RU2235767C2

RU2235767C2 - Твердофазный ферментёр и способ твердофазного культивирования

Info

Publication number: RU2235767C2
Application number: RU2000130228/13A
Authority: RU
Inventors: Петер ЛЮТ (DE); Петер ЛЮТ; Уте АЙБЕН (DE); Уте АЙБЕН
Original assignee: Профита Биологишер Пфланценшутц Гмбх
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-27
Publication date: 2004-09-10
Also published as: NZ507738A; WO1999057239A3; AU4601199A; UA65616C2; BG64130B1; AU749402B2; EP1073708B1; CA2329815C; ATE208810T1; HU225994B1; WO1999057239A2; CA2329815A1; CN1212385C; JP4180798B2; US6620614B1; EP1073708A2; DE59900442D1; HUP0101547A2; CZ20003988A3; PL188683B1

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает использование твердого субстрата для культивирования микроорганизмов. Его размещают на модульных основаниях, расположенных в емкости твердофазного ферментера, и равномерно засевают посевным материалом, в качестве которого можно использовать микроорганизмы. Через субстрат с посевным материалом пропускают увлажненный воздух при небольшом расходе. Температуру в емкости регулируют при помощи узла охлаждения. Модульные основания выполнены в виде пластин, расположенных одна над другой и выполненных проницаемыми для воздуха и воды. Пластины соединены со стенкой емкости так, что ни воздух, ни вода не могут проходить сбоку. Под каждым модульным основанием установлен узел охлаждения, подключенный быстросоединяемым соединением к трубам для слива и подачи охлаждающей жидкости, которые расположены снаружи емкости. Последняя имеет отверстия для подачи посевного материала и воды и снабжена патрубком для подачи воздуха и патрубками для слива воды и выпуска воздуха. Изобретение обеспечивает стерильные условия в процессе ферментации, равномерное аэрирование субстрата и регулирование его температуры и увеличение производительности ферментера. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 4 ил.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к твердофазному ферментеру, в частности для больших объемов культивирования, а также к способу твердофазного культивирования.

Предшествующий уровень техники

Твердофазное культивирование используется для массового выращивания микроорганизмов либо с целью выделения микроорганизмов как таковых, либо метаболического продукта, либо микробного измененного питательного субстрата (например, в технологии производства пищевых продуктов). Несмотря на то, что в наше время уже созданы ферментеры для твердофазного культивирования (ферментеры с жидким питательным субстратом) емкостью до 200000 литров, до сих пор еще не удалось создать ферментеры (ферментеры с твердым питательным субстратом) для больших объемов, которые могут поддерживаться в рабочем состоянии (незагрязненном посторонними микроорганизмами) в течение долгого времени. Однако определенные нитевидные грибы (гифомицеты) требуют конструкций, где они могут развиваться и образовывать споры. Самый большой ферментер для производства нитевидных грибов, где исключено загрязнение посторонними микроорганизмами, находится во Франции (INRA, Durand, 1997) и имеет емкость 50 литров. Однако емкость этого ферментера достаточно мала для экономичного получения грибковых спор, которые могут использоваться, например, в качестве биологических сельскохозяйственных пестицидов.

Твердофазное культивирование касается роста микроорганизмов или грибков на твердых субстратах в газовой фазе, но без свободной водной фазы.

Твердофазное культивирование использовалось в древнем мире для производства ферментированной пищи, продуктов Koji (японских овощей), содержащих ферменты (энзимы), и съедобных грибов на некоторых территориях Востока, Азии и Африки. Попытки, предпринимавшиеся в западных странах, сосредотачивались на глубинной ферментации с 1940 года, в то время как твердофазное культивирование использовалось только для повторной обработки органических отходов. Однако многие институты и фирмы в последнее время проявляют интерес к твердофазному культивированию, так как по сравнению с обычной ферментацией существуют определенные преимущества. Такими преимуществами являются:

возможность эффективного производства вторичных метаболитов, как например, ферментов, ароматических веществ, вкусовых добавок и красителей, а также фармацевтически активных веществ;

возможность производства микроорганизмов как биологически активных агентов в сельскохозяйственных пестицидах;

устранение токсинов или других вредных веществ из пищевых и кормовых продуктов или обогащение их протеинами или витаминами.

Существует шесть типов твердофазных ферментеров: биореактор типа лотка, биореактор с уплотненным слоем, биореактор типа вращающегося барабана, качающийся твердофазный биореактор, биореактор в виде емкости, снабженной мешалкой, воздушный твердофазный биореактор с псевдоожиженным слоем.

Первый тип - “биореактор типа лотка”, где ферментируемый субстрат распределяется в емкости, специально предназначенной для этой цели, и выдерживается в помещении со специальным воздушным кондиционированием ("Koji"-Raum, Ramana Murthy, M.V.; Karanth, N.G.; Raghava Rao, K.S.M.S. “Прогресс в прикладной микробиологии” Advance in Applied Microbiology, 38, 1993, стр.99-147), и который может использоваться для производства больших количеств продукта, однако в нем допускается возможность небольшого загрязнения ядрами кристаллизации. Кроме того, реактор и способ требуют большого пространства и больших затрат труда. Ферментируемый субстрат надо перемещать вручную в емкостях. Он не подходит для производства больших количеств грибковых спор конкурирующих видов.

В “биореакторе с уплотненным слоем” влажный гранулированный субстрат, размещенный в замкнутой емкости, засевается микроорганизмом, который там развивается без перемещения субстрата. Для этого субстрат должен постоянно продуваться воздухом. Возникают следующие проблемы, которые не позволяют использовать большие количества субстрата с самого начала.

Микроорганизм выделяют тепло 300 кДж на 1 кг сухого веса в час (Saucedo-Castaneda, G.; Gutierrez-Rojas, M.; Bacquet, G.; Raimbault, M.; Viniegra-Gonzalez, G.: Biotechnologie and Bioengeniering, 35, 1990, стр.802-808 “Биотехнология и биоинженерия”), которое может удаляться через наружную стенку емкости, либо путем увеличения циркуляции воздуха. Это невозможно, если емкости имеют большие объемы. Рост микроорганизмов замедляется с увеличением выделения тепла, и в конце концов они умирают.

Постоянное аэрирование высушивает субстрат. В результате в массе формируются воздушные каналы. Их наличие не может обеспечить дальнейшего равномерного аэрирования субстрата. Постепенное высушивание субстрата также приводит к ухудшению роста микроорганизма.

“Биореактор типа вращающегося барабана” состоит из цилиндрической емкости, которая расположена горизонтально и вращается. Емкость заполняется не более чем на одну треть своего объема гранулированным субстратом для выращивания микроорганизмов. Тепло, выделяемое при росте микроорганизма, может удаляться в значительной степени частично охлаждаемой оболочкой емкости. Это происходит при медленном вращении цилиндра, что приводит к тому, что субстрат снова и снова контактирует с оболочкой и выделяет тепло в нее. Однако способ имеет тот недостаток, что внутри движущегося субстрата действуют усилия сдвига, что приводит к разрушению грибковых структур (мицелиума, спорангиума, фруктовегетативной массы). Таким образом, для многих грибков с самого начала невозможно добиться высокого урожая спор. Существующая проблема обезвоживания решается в этом типе ферментера аэрированием влажным воздухом, так как нет необходимости испарять воду из субстрата (холод испарения не нужен). Кроме того, распылительные насадки могут способствовать увлажнению субстрата, также обеспечивая хорошее распределение свободной воды.

Однако большие количества субстрата для выращивания микроорганизмов приводят к другим проблемам в ферментерах такого типа:

они имеют дорогостоящую конструкцию особенно для больших ферментеров;

непрерывное движение ферментера может вызвать агломерацию влажного субстрата;

необходимы поверхности для сообщения с внешней средой (патрубок для впуска воздуха и патрубок для выпуска воздуха, патрубок подачи воды), которые легко могут стать источниками загрязнения внешними микроорганизмами.

Таким же недостатки имеет “качающийся твердофазный биореактор”, различие заключается в том, что перемешивание субстрата происходит не при вращательном движении, а встряхивающем движением. Кроме того, ограничен объем этого типа ферментера, так как конструкция сложного механизма встряхивания с трудом допускает вес, превышающий 100 кг при заполненной емкости.

“Биореактор в виде емкости, снабженной мешалкой” может быть представлен как закрытый чан с движущейся в нем мешалкой. Для этого типа реактора неизбежны проблемы, возникающие при использовании больших количеств субстрата, так как эти количества не могут перемешиваться равномерно, не вызывая разрушения структуры субстратов.

В твердофазном биореакторе с псевдоожиженным слоем субстрат для выращивания микроорганизмов находится в виде псевдоожиженного слоя, что вызывает необходимость в относительно большого внутреннего объема реактора. Необходимый воздух для псевдоожижения слоя подводится путем циркуляции. Воздух должен иметь точно заданное содержание влаги. Этот процесс требует большого количества энергии для поддержания псевдоожиженного слоя. В уже проводящемся проекте AiF (Bahr, D.; Menner, M.: BIOforum, 18, 1995, стр.16-21) доказано, что выращивание дрожжевых клеток возможно осуществлять в псевдоожиженном слое.

Однако твердофазный биореактор с псевдоожиженным слоем имеет относительно небольшой объем и небольшой выход по сравнению с твердофазным ферментером. Выращивание нитевидных грибов на больших количествах гранулированных субстратов (более 100 кг на партию) в течение нескольких недель с использованием этой технологии возможно только при очень высоких затратах.

Другие известные ферментеры имеют слишком малый объем для получения с их помощью экономически выгодного количества грибковых спор (ЕР-А1-0683815 и FR 8508555) или же, в ферментере с достаточной емкостью невозможно предотвратить загрязнение субстрата ядрами кристаллизации в течение долгого времени (DE 4406632).

Краткое изложение существа изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание твердофазного ферментера для твердофазного культивирования, имеющего большие объемы, а также создание способа твердофазного культивирования, который позволяет экономично выращивать небольшие объемы различных конкурирующих микроорганизмов в больших ферментерах.

Поставленная задача решена тем, что в твердофазном ферментере, содержащем емкость с крышкой и днищем, множество модульных оснований в виде пластин, расположенных одно над другим и предназначенных для размещения твердого субстрата для культивирования микроорганизмов, узел охлаждения, установленный под каждым модульным основанием, отверстия для подачи посевного материала и воды в емкость, патрубок для подачи воздуха, расположенный на дне емкости, патрубок для слива воды и патрубок выпуска воздуха на крышке, согласно изобретению, пластины выполнены проницаемыми для воздуха и воды и соединены со стенкой емкости так, что ни воздух, ни вода не могут проходить сбоку, при этом узел охлаждения соединен быстросоединяемым соединением с трубами для слива и подачи охлаждающей жидкости, которые расположены снаружи емкости.

Полезно, чтобы емкость имела в сечении круг, эллипс или прямоугольник, и в стенке емкости было размещено по меньшей мере одно отверстие для подачи посевного материала.

Целесообразно, чтобы ферментер содержал металлические пластины, имеющие высокую теплопроводность, которые связаны с узлом охлаждения, и через соответствующее модульное основание проходят в субстрат для культивирования микроорганизмов.

Предпочтительно, чтобы модульные основания были размещены на кольцах, установленных в емкости и снабженных термостойким уплотнением, при этом модульные основания имели бортик, высота которого определяется толщиной слоя субстрата для культивирования микроорганизмов.

Выгодно, чтобы емкость содержала дополнительные отверстия для подачи посевного материала, расположенные в стенке между отдельными модульными основаниями.

Полезно, чтобы емкость состояла из нескольких модулей, установленных один над другим и герметизированных один относительно другого посредством расположенных на кромках пластин термостойких уплотнений, при этом в каждом из модулей пластины были снабжены наружным кольцом для перекрытия зазора между модулями, причем узел охлаждения соединен посредством муфты с трубами для впуска и выпуска охлаждающей жидкости, расположенными снаружи емкости.

Предпочтительно, чтобы твердый субстрат для культивирования микроорганизмов являлся пористым гранулятом с добавленным к нему питательным раствором или представляет собой натуральные гранулированные материалы.

Выгодно, чтобы в качестве натуральных гранулированных материалов были использованы материалы, выбранные из группы, состоящей из зерен, отрубей в гранулах или отходов от производства сахара.

Целесообразно, чтобы по меньшей мере на самом нижнем модульном основании был размещен слой увлажняющего материала, который является гранулированным материалом с большим объемом пор, способным поглощать воду.

Полезно, чтобы узлы охлаждения были выполнены в виде труб или пластин и установлены на определенном расстоянии от модульных оснований и параллельно им.

Поставленная задача решается также путем создания способа твердофазного культивирования, осуществляемого в указанном устройстве, который заключается в том, что используют твердый субстрат для культивирования микроорганизмов, который размещают на нескольких модульных основаниях в емкости, равномерно засеивают субстрат посевным материалом и через него пропускают увлажненный воздух при его относительно небольшом объемном расходе, при этом температуру в емкости регулируют с помощью узла охлаждения.

Полезно, чтобы в качестве посевного материала использовали микроорганизмы, которые требуется размножить, заполняют емкость водой, в которую добавляют микроорганизмы в достаточном количестве, осуществляют циркуляцию воды, при этом засев всех слоев субстрата на модульных основаниях в процессе заполнения, а также в процессе слива воды осуществляют равномерно при протекании воды через слои субстрата.

Полезно, чтобы теплоту реакции удаляли из твердого субстрата в процессе культивирования микроорганизмов.

Предпочтительно, чтобы дополнительно засеивали твердый субстрат посевным материалом через отверстия между модульными основаниями.

Предложенная конструкция твердофазного ферментера позволяет предотвратить загрязнение посторонними микроорганизмами, сохранить стерильные условия в течение всего процесса ферментации, удалять тепло, выделяемое при росте грибков, без обезвоживания субстрата, предотвратить возникновение усилий сдвига в ферментере, т.е. исключить движение субстрата, гарантировать аэрирование без обезвоживания и регулирование температуры субстрата.

Краткое описание чертежей

В дальнейшем изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов его воплощения со ссылками на сопровождающие чертежи, на которых:

фиг.1 изображает ферментер (продольный разрез), согласно изобретению;

фиг.2 - средство охлаждения ферментера с теплопроводными пластинами, согласно изобретению;

фиг.3 - ферментер в виде открытого цилиндра (разрез), согласно изобретению;

фиг.4 - ферментер (разрез), согласно изобретению.

Описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения

Твердофазный ферментер согласно изобретению, содержит емкость (фиг.1) объемом по меньшей мере, 50 литров, предпочтительно от 500 литров до 1000 литров и более.

Емкость закрыта крышкой 1, снабженной, если это необходимо, патрубком 2 для выпуска воздуха, а также отверстием 3 для засева. В емкости размещено множество модульных оснований 4 в виде пластин, расположенных ярусами и проницаемых для воздуха и пара, которые предназначены для размещения субстрата 5 для выращиваемых микроорганизмов.

Субстрат представляет собой материал для питания выращиваемого микроорганизма. Этот материал предпочтительно имеет гранулированную структуру, чтобы обеспечить достаточную проницаемость для воздуха. Он может состоять из зерен, отрубей в гранулах или других продуктов органических отходов, отходов от производства сахара или пропитанных раствором гранулятов.

Количество пластин зависит от требований, предъявляемых к выращиваемому микроорганизму, а также от простоты обслуживания всего ферментера. Слишком большое количество пластин может нарушить необходимую подачу кислорода для роста микроорганизмов в верхние слои субстрата. Очень большое количество пластин также ухудшает простоту эксплуатации ферментера. Однако, согласно изобретению, в ферментере может быть установлено 20 или более пластин.

Модульные основания соединены со стенкой емкости таким образом, что ни воздух ни вода не могут протекать сбоку между модульным основанием и стенкой. Расстояние между модульными основаниями зависит от оптимальной толщины слоя субстрата, которая определяется потребностями выращиваемого микроорганизма.

Узел 6 охлаждения расположен под модульными основаниями, которые могут быть выполнены либо как охлаждающие змеевики, либо как охлаждающие пластины. Узел 6 охлаждения соединен быстро соединяемым соединением с трубами для слива и подачи охлаждающей жидкости, которые расположены снаружи емкости.

Змеевики или пластины позволяют удалять выделяемое тепло из субстрата. В предпочтительном варианте пластины, имеющие высокую теплопроводность, могут погружаться в субстрат от модульного основания от каждого узла охлаждения (фиг.2). Это упрощает удаление теплоты реакции. После завершения процесса ферментации узел охлаждения удаляют в направлении вниз от модульного основания для удаления субстрата. Затем можно выгружать субстрат с выращенными микроорганизмами без помех со стороны охлаждающих пластин.

Возможно также устанавливать узел охлаждения на определенном расстоянии над пластинами. В этом случае он должен быть установлен таким образом, чтобы охлаждающие пластины проходили в середине слоя субстрата. Установка узла охлаждения внутри слоев субстрата (параллельно модульным основаниям) особенно необходима, когда в процессе культивирования вырабатывается большое количество теплоты.

Основание емкости содержит патрубок 7 для впуска воздуха в ферментер, куда вдувается стерильный увлажненный воздух. Воздух циркулирует через все слои субстрата и выходит из ферментера через патрубок 2 для выпуска воздуха, установленный на крышке.

Пространство между пластинами, где расположен узел охлаждения, гарантирует равномерное распределение воздуха во всем ферментере.

Если в ферментере не может использоваться влажный воздух для аэрирования, воздух может увлажняться внутри ферментера. Это достигается тем, что, по меньшей мере, самое нижнее модульное основание не заполняется субстратом, а заполняется гранулированным материалом, который может поглощать воду, циркулирующую с вдуваемым воздухом, прежде чем воздух проникает в ферментер. Если для развития микроорганизма требуется большое количество воды, в ферментере на определенных расстояниях могут быть установлены несколько модулей для увлажнения воздуха. Количество вдуваемого воздуха зависит от потребности выращиваемого организма в кислороде. Оно может изменяться от 1 до 100 литров в час на литр субстрата.

Ферментер заполняется стерильной водой до самого верхнего слоя субстрата для засева (инокуляции) субстрата микроорганизмом, предназначенным для выращивания, после стерилизации его содержимого. Для этого установлен патрубок 8 для подачи воды, в который вставлен стерильный фильтр. Однако патрубок для подачи воды также может быть установлен в другом месте ферментера, например, на крышке. После заполнения водой вводится посевной материал через предназначенное для этого отверстие в крышке. Отверстия для засева могут располагаться между модульными основаниями, особенно если пластин очень много. В первом случае распределение посевного материала в ферментере осуществляется исключительно введением воды через отверстие 9 в днище ферментера.

Посевной материал - суспензия микроорганизмов протекает через все слои субстрата и остается с достаточным количеством связанной воды. Если слоев, по которым протекает суспензия слишком много, может произойти разбавление в зависимости от строения субстрата. Это означает, что микроорганизмы будут фильтроваться через субстрат, поэтому их концентрация в воде уменьшается, чем ниже в ферментере они находятся. Чтобы это предотвратить, отверстия для введения посевного материала в ферментер могут располагаться между модульными основаниями. Посевной материал, который уже введен во время заполнения ферментера водой, распределяется затем с потоком воды, который направлен вверх, а также с потоком воды, который направлен вниз.

Посевной материал, используемый для засева ферментера, состоит из суспензии высокой концентрации маленьких зачаточных микроорганизмов (предпочтительно спор, бактериальных микроорганизмов или конидиоспор) микроорганизмов, предназначенных для выращивания.

В условиях равномерного и достаточного засева длительность выращивания и урожай продукта, а также качество грибковых спор зависит от параметров, т.е. влажности воздуха и температуры. Расход воздуха зависит от пропускной способности воздушного стерильного фильтра. Регулирование температуры в ферментере обеспечивается использованием узла охлаждения, который установлен в ферментере. Отвод тепла должен быть рассчитан таким образом, чтобы можно было удалить все тепло, выделившееся из субстрата, и сохранить оптимальную температуру для выращивания микроорганизма. Это зависит от толщины слоя, и таким образом, от объема субстрата. Чем больше субстрата для роста микроорганизмов, тем больше выделяется теплоты реакции. Вот почему оба параметра должны быть оптимальными. Требуется по возможности быстрое развитие микроорганизмов, а также высокий урожай продукта, при этом продуктами могут быть в зависимости от задачи ферментации грибковые споры, бактериальные клетки, ферменты, антибиотики, красящие вещества и другие вещества.

Ниже описаны два варианта выполнения ферментера.

Вариант 1

Ферментер (фиг.3) выполнен в виде емкости, имеющей в сечении круг или многоугольник. Цилиндр или призма могут иметь диаметр 1 метр и более. Высота определяется простотой обслуживания, а также возможностью сохранения оптимальных условий роста для микроорганизмов. Возможна высота от 2 м и больше.

Модульные основания 4, заполненные субстратом 5, вставляются сверху в емкость. Внутри емкости установлены кольца или в случае использования призматического корпуса средства 11 удерживания модульных оснований. Каждое кольцо или средство 11 снабжено термостойким уплотнением 10, например, из кремния, на которое устанавливаются своими наружными кромками модульные основания, что обеспечивает уплотнение между модульным основанием и стенкой емкости, непронициемое для воздуха и воды. Кольца или средства 11 можно извлекать из корпуса. Узел 6 охлаждения под модульным основанием, например, в виде охлаждающего змеевика, выполненного из меди, соединен быстро соединяемым и быстро разъединяемым соединением 13 с трубами 14 для подачи и вывода охлаждающей жидкости, которые расположены снаружи ферментера. Каждое модульное основание имеет утолщение по краю, высота которой выбирается в соответствии с толщиной слоя субстрата. Это предотвращает загрязнение субстрата.

Ферментер плотно закрыт сверху крышкой 1. Он представляет собой сосуд высокого давления и может стерилизоваться подаваемым горячим паром под давлением. Поэтому нет необходимости в использовании автоклава.

Вариант 2

Ферментер (фиг.4) состоит из нескольких емкостей небольшой высоты, предпочтительно около 7-30 см, которые могут иметь круглое, овальное, прямоугольное сечение и установлены одно над другим. В каждую емкость подается воздух и вода через отверстия в днище. Узел охлаждения расположен под каждым днищем, а на днище расположен субстрат для выращивания микроорганизмов. Днища каждой емкости используются как модульные основания 4 для составного ферментера и герметизированы одно от другого термостойкими уплотнениями 15, которые расположены на кромках. Днище первого модульного основания снизу служит днищем ферментера, а последнее модульное основание сверху закрывается крышкой. Таким образом, ферментер может быть собран предпочтительно из 10 или более модульных оснований. Так как сконструировать такой составной ферментер в виде сосуда высокого давления сложно, стерилизация ферментера и субстрата внутри выполняется в автоклаве. Поэтому высота ферментера в первую очередь зависит от емкости автоклава. В результате она должна быть снижена в большинстве случаев до объема от 500 до 1000 литров. Во время обработки автоклавом модульные основания слегка подняты один над другим приблизительно на 5 мм. Это дает возможность подавать горячий пар для стерилизации внутрь ферментера. Ферментер герметизируется после обработки автоклавом. Каждое модульное основание снабжено кольцом 16, которое предназначено для перекрытия зазора между модульными основаниями, когда ферментер открыт, чтобы предотвратить загрязнение ферментера внешними микроорганизмами после обработки автоклавом.

После того, как ферментер закрывают, узлы 6 охлаждения под модульными основаниями, соединяют с трубами 14, которые используются для подачи и вывода охлаждающей жидкости.

В предпочтительном варианте выполнения гранулированный субстрат, где будут развиваться микроорганизмы, расположен в виде слоя толщиной 5-6 см. До 10 таких слоев расположены один поверх другого на модульных основаниях. Гранулированный субстрат, расположенный слоями, каждый раз устанавливается на перфорированное и поэтому проницаемое для воздуха дно, ниже которого находится охлаждающий змеевик (витая медная трубка), который может использоваться для удаления теплоты, выделяемой в субстрате. Подача стерильного фильтрованного воздуха происходит снизу. Воздух циркулирует, проходя по всем слоям субстрата равномерно, чему способствует герметичное уплотнение сбоку, перед выходом из ферментера на верхнем конце. На самом нижнем модульном основании находится насыщенный водой слой, предпочтительно гранулят SERAMIS, через который проходит, увлажняясь таким образом, воздух.

Стерилизация ферментера вместе с субстратом выполняется предпочтительно паром, который нагревается до 121°С в автоклавах, когда одиночные модули слегка подняты один над другим в автоклаве, что позволяет горячему пару проникать в модули.

Параметры:

объем 500 литров,

количество субстрата 250 литров,

объемный расход воздуха 1500 литров в час,

мощность системы охлаждения 2,5 кВт.

В отличие от ферментеров, используемых до сих пор (качающийся ферментер или ферментер типа вращающегося барабана), где требуется постоянное переворачивание субстрата для удаления тепла, аэрирование и подача воды, больше не нужно перемещать субстрат. Хранение субстрата в ярусах или слоях, которые целиком заключены в закрытую оболочку, обеспечивает следующие преимущества:

собственный вес субстрата не приводит к его уплотнению и, в результате, снижению проницаемости для воздуха;

установка узла охлаждения под каждым модульным основанием упрощает удаление тепла;

вследствие относительно небольшой толщины модульных оснований, а также расстояний между ними гарантируется равномерное аэрирование слоев субстрата;

так как аэрирование субстрата используется для подачи кислорода, а также для удаления вырабатываемых газов, а не для охлаждения субстрата, можно работать с очень небольшим объемом потока воздуха, что уже не приведет к обезвоживанию субстрата, так как воздух увлажнен;

так как больше нет необходимости в перемещении субстрата, механическое разрушение грибковых структур (спорангиума, фруктовегетативной массы и т.д.) исключено.

Пример 1. Выращивание beauveria brongniartii в массе для получения грибковых конидий

Используемый для выращивания beauveria brongniartii ферментер имеет емкость около 50 литров. Он имеет форму цилиндра диаметром 30 см и высотой 70 см. Наружная оболочка ферментера выполнена из термостойкого стекла. В ферментере установлено восемь модульных оснований, дно которых состоит из нержавеющего сита с размером отверстия сита 3 мм. Расстояние между модульными основаниями 8 см. Нижнее дно заполнено слоем гранулята SERAMIS толщиной 6 см. Расположенные выше 7 модульных оснований содержат дробленые зерна ячменя в качестве субстрата. Толщина слоя субстрата приблизительно 6 см. В целом использовано 30 литров субстрата.

Ферментер стерилизовали в автоклаве. Для этого ферментер нагревали горячим паром до 121°С в течение получаса. Крышка ферментера была немного открыта во время обработки в автоклаве, чтобы пар проникал внутрь ферментера. Сразу после обработки крышка была закрыта.

Ферментер был заполнен выше верхнего слоя субстрата стерильной водой. Для этого использовали капсулу размером 500 см² типа S+S-EXELON PES 20/5 НС (Schleicher und Schuell. Dassel). После этого вводили посевной материал через отверстие в крышке. Используемым посевным материалом было 100 мл суспензии конидиума в концентрации 1 х 10⁹ конидий на мл. После введения посевного материала через клапан в днище ферментера выпустили воду. Все слои субстрата были равномерно обсеменены грибковыми конидиями.

После засева ферментера он выдерживался в помещении с температурой 20°С. Затем подавался воздух, а также подключалась система охлаждения. Объемный расход воздуха в течение всего процесса ферментации составлял 150 литров в час. В качестве охлаждающей жидкости использовали воду с температурой при подаче 17°С. Охлаждение проводилось таким образом, что охлаждающая жидкость прокачивалась через охлаждающий змеевик, если температура в субстрате превышала 22°С, пока она не снижалась до 20°С. Таким образом могла поддерживаться средняя температура субстрата приблизительно около 21°С в течение всего периода выращивания.

Целью выращивания было получение по возможности большего количества грибковых конидий. Стеклянные стенки ферментера позволяли наблюдать за ростом. Примерно через 10 дней весь субстрат был покрыт белым мицелием. Этот мицелий менял свой внешний вид начиная с 13-го дня из-за образования конидий и конидиофор. Он изменился и превратился в порошкообразную структуру. Приблизительно после 19 дней в ферментере заметно уменьшилась активность метаболизма. Выделение тепла уменьшилось, что заметно уменьшило необходимость охлаждения. Через 21 день после засева ферментера субстрат был изъят и согласно специальной технологии из субстрата были извлечены конидии, которые затем были окончательно выращены с beauveria brongniartii.

Из ферментера смогли извлечь общее количество 3,3×10¹³ конидий.

Claims

1. Твердофазный ферментер, содержащий емкость с крышкой и днищем, множество модульных оснований в виде пластин, расположенных одно над другим и предназначенных для размещения твердого субстрата для культивирования микроорганизмов, узел охлаждения, установленный под каждым модульным основанием, отверстия для подачи посевного материала и воды в емкость, патрубок для подачи воздуха, расположенный на дне емкости, патрубок для слива воды и патрубок выпуска воздуха на крышке, отличающийся тем, что пластины выполнены проницаемыми для воздуха и воды и соединены со стенкой емкости так, что ни воздух, ни вода не могут проходить сбоку, при этом узел охлаждения соединен быстросоединяемым соединением с трубами для слива и подачи охлаждающей жидкости, которые расположены снаружи емкости.

2. Ферментер по п.1, отличающийся тем, что емкость имеет в сечении круг, эллипс или прямоугольник, и в стенке емкости размещено по меньшей мере одно отверстие для подачи посевного материала.

3. Ферментер по любому из п.1 или 2, отличающийся тем, что содержит металлические пластины, имеющие высокую теплопроводность, которые связаны с узлом охлаждения, и через соответствующее модульное основание проходят в субстрат для культивирования микроорганизмов.

4. Ферментер по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что модульные основания размещены на кольцах, установленных в емкости и снабженных термостойким уплотнением, при этом модульные основания имеют бортик, высота которого определяется толщиной слоя субстрата для культивирования микроорганизмов.

5. Ферментер по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что емкость содержит дополнительные отверстия для подачи посевного материала, расположенные в стенке между отдельными модульными основаниями.

6. Ферментер по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что емкость состоит из нескольких модулей, установленных один над другим и герметизированных один относительно другого посредством расположенных на кромках пластин термостойких уплотнений, при этом в каждом из модулей пластины снабжены наружным кольцом для перекрытия зазора между модулями, причем узел охлаждения соединен посредством муфты с трубами для впуска и выпуска охлаждающей жидкости, расположенными снаружи емкости.

7. Ферментер по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что твердый субстрат для культивирования микроорганизмов является пористым гранулятом с добавленным к нему питательным раствором или представляет собой натуральные гранулированные материалы.

8. Ферментер по п.7, отличающийся тем, что в качестве натуральных гранулированных материалов использованы материалы, выбранные из группы, состоящей из зерен, отрубей в гранулах или отходов от производства сахара.

9. Ферментер по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что по меньшей мере на самом нижнем модульном основании размещен слой увлажняющего материала.

10. Ферментер по п.9, отличающийся тем, что увлажняющий материал является гранулированным материалом с большим объемом пор, способным поглощать воду.

11. Ферментер по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что узлы охлаждения выполнены в виде труб или пластин и установлены на определенном расстоянии от модульных оснований и параллельно им.

12. Способ твердофазного культивирования, осуществляемый в устройстве по пп.1-13, заключающийся в том, что используют твердый субстрат для культивирования микроорганизмов, который размещают на нескольких модульных основаниях в емкости, равномерно засеивают субстрат посевным материалом и через него пропускают увлажненный воздух при его относительно небольшом объемном расходе, при этом температуру в емкости регулируют с помощью узла охлаждения.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве посевного материала используют микроорганизмы, которые требуется размножить, заполняют емкость водой, в которую добавляют микроорганизмы в достаточном количестве, осуществляют циркуляцию воды, при этом засев всех слоев субстрата на модульных основаниях в процессе заполнения, а также в процессе слива воды осуществляют равномерно при протекании воды через слой субстрата.

14. Способ по любому из пп.12 и 13, отличающийся тем, что теплоту реакции удаляют из твердого субстрата в процессе культивирования микроорганизмов.

15. Способ по п.12, отличающийся тем, что дополнительно засеивают твердый субстрат посевным материалом через отверстия между модульными основаниями.