CN1063224C - 气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养方法及培养反应器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物细胞、组织和器官培养的方法和培养反应器。反应器由主体，光源，隔层、接种管、气体分布器，其特征在于还包括储液槽、电磁阀、气液循环管、气液分配管组成。方法经蒸气灭菌，灭菌温度为100-121℃，灭菌时间为40-200分钟，再通入无菌空气保护；在室温下，在无菌环境中将培养物逐层加入；盖好封帽，输入培养液；按所需培养物要求的浸没时间和通气周期调好时序仪自动实现培养。

Description

气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养方法及培养反应器

本发明涉及一种植物细胞、组织和器官培养的方法，特别是涉及一种适于大规模生产用的气升式周期浸没光照植物细胞、组织和器官的培养方法及其反应器。

植物细胞培养生物反应器已研究较多，主要分为机械搅拌生物反应器、非机械搅拌生物反应器、鼓泡塔及气升式生物反应器，填充床生物反应器，流化床生物反应器，膜生物反应器等(陈英良等“细胞培养工程”，华东化工学院出版社，1992年，上海P285-294)。由于植物细胞、组织和器官有很多不同于动物细胞及微生物的特点，如需氧量较少，细胞对剪切力耐受性差，细胞体积大等，所以对植物细胞培养生物反应器提出了不同的要求。其中机械搅拌式反应器的高剪切特性容易对细胞造成损害，必须对搅拌器加以改进，减小搅拌过程中的剪切力，才能用于植物细胞和组织等培养(邢建民等，生物工程进展，1997，17(5)，P49-53)。流体剪切力对植物细胞有两方面的作用。其一是增加通气，保持良好的混合状态及细胞分散性等，其二是在大多数情况下则对细胞有机械损伤，改变细胞形态，影响胞内化合物释放，改变代谢，影响产率，使细胞丧失活性等，因此研究开发新型的适用于各类植物细胞培养的生物反应器已成为各国生化工程学家努力的方向(曹孟德等，生物工程进展，1996，16(4)，P51-53)。流体剪切力对植物细胞有两方面的作用。其一是增加通气，保持良好的混合状态及细胞分散性等，其二是在大多数情况下则对细胞有机械损伤，改变细胞形态，影响胞内化合物释放，改变代谢，影响产率，使细胞丧失活性等，因此研究开发新型的适用于各类植物细胞培养的生物反应器已成为各国生化工程学家努力的方向(曹孟德等，生物工程进展，1996，16(4)，P51-53)。至于植物器官、组织比植物细胞大几十倍甚至上百倍。这些器官和组织主要包括：丛生芽、毛状根(发根)、体细胞胚、幼苗等。由于这些组织、器官的特殊形态，在培养过程中流动性差，易堆积，对剪切力更敏感，长期浸没更易产生玻璃化和变异，因此，相对于植物细胞，在反应器内实现大规模培养就更为复杂、困难。从七十年代后期开始植物细胞、组织和器官培养较多地采用了气升式生物反应器。如文献M.A.Rodrigueg-Mendiola等(“Bioreactors for growth of plant roots”M.A.Rodrigueg-Mendiolaet al.Enzyme Microb.Technol.1991，Vol.13 sep.697-702)所介绍的9立升植物发根培养反应器，其结构见图1。反应器主体1由带有扩大段的耐热玻璃制成。主体内由玻璃支撑管15固定一尼龙网卷成的中心管28。在反应器内位于中心管下方，设置一烧结板气体分布器6，所需空气经进气管30进入中心管，由于中心管内外的液体表观密度差使营养液实现循环流动。反应器顶部设置一接种口25，发根种子由此接入反应器内。反应器内的气体经冷凝器21后排出。反应器内温度由加热器19控制。在培养过程中，发根种子挂在中心网上生长，此反应器特点解决了接种及挂在中心管上固定分布和生长，部分解决了发根堆积问题，营养液可以循环及有一定程度的混合。但由于无隔层空间大，所以并未根本解决接种的均匀性，发根生长过程的均匀分布，甚至在底部特别是在中心管网下口周围仍会形成局部发根的堆积，以至在发根生长期间影响营养液的循环流动，从而影响混合特性和传质、传热过程，而且此类反应器属于全浸没式反应器，植物组织器官长期浸没其中会产生玻璃化现象和变异，由于反应器内未设置内部光源，对喜光照的发根培养，反应器直径的放大必然受到限制。因此，此类反应器难以放大以适应植物发根的大规模培养。

又如Chun-zhao Liu，Yuchun Wang等(“Production of arthmisinin byshoot cultures of Arthmisia annua L in a modified inner-loop mistbioreactor”，Plant science，已接收并正在出版，1988)研究开发出2.5立升改造的内环流超声波雾化反应器。其主要结构如图2所示。此反应器主体1由耐热玻璃制成，内置一带有孔20的中心管18，围绕中心管有三层不锈钢隔网26，在反应器底部安装一雾化头17，并与雾化器16连接，除菌空气由进气管30进入反应器底部营养液中。反应器内气体由排气口27排放，此反应器无接种装置，需将反应器放在超净台上开盖接种，使发根均匀接至各层隔网上，启动雾化器，雾化头产生超声波使液面位于中心管下方的营养液雾化，营养雾由中心管上升，经中心管孔及顶部出口进入各隔层，并沿反应器壁与中心管之间的环间下降而充满整个反应器，提供给发根、芽生长所需养分。雾化间歇进行，两次雾化之间通入无菌空气，以满足发根及芽对氧的需要。此反应器解决了发根以及丛生芽在反应器内均匀分布和生长，利用超声雾化原理产生营养雾可迅速扩散并分布均匀，间歇雾化和供气使反应器内供养充足，并避免了浸没反应器中由于植物器官组织长期被液体浸泡所带来的玻璃化和畸形化现象。但雾化反应器仍未解决接种装置，使得接种不易操作，易染菌。由于无内部光源，光分布及光强受到影响。由于雾滴细小并间歇产雾，器官表面营养液膜更新差，使得新的营养供应不足。同时气体夹带营养液雾滴易从排气口排出，造成营养液的流失。又由于产雾高度受到限制，使得雾化反应器不易放大以进行植物组织器官的大规模培养。

上述目前现有的气升式反应器和雾化反应器与其它类型的反应器相比，虽然更适合于植物细胞、组织器官的培养，但仍存在许多影响大规模培养和提高有用次生代谢产物的问题和缺欠。而且现有生物反应器在用于植物细胞、组织器官培养时专一性较强，应用范围受到限制。因此，在具体应用时，必须针对植物细胞、组织器官生长代谢特性对其加以改进，才能更好地适应大规模培养的要求。

本发明的目的在于：克服上述现有技术的缺点和不足，为实现植物组织、器官的均匀接种，生长分布均匀，具有良好的混合、传质、传热特性，同时克服植物组织、器官长期浸没培养产生的玻璃化和变异的现象，以及实现气液交替半浸没周期的调节和控制，光照周期和强度可调，从而提供一种适合大规模生产用的气升式半浸没光照植物细胞组织器官培养反器。

本发明的目的是这样实现的：本发明提供的气升式周期浸没光照植物细胞、组织器官培养反应器是由反应器主体，光源，带筛网的隔层、接种管、气体分布器组成，其特征在于：还包括储液槽、电磁阀、气液循环管、气液分配管；其中在反应器主体内安装多层筛网的隔层，隔层上有一中心孔，内置光照管从孔中插入并固定在其上，隔层间距根据培养物决定。中心管的侧边开有接种管插入孔，孔上活动连接一盖孔的带有筛网的翻板，一分段接种管穿过此孔，每段接种管螺合固定；储液槽安装在反应器主体的下面，通过一根管子把储液槽内的气体分布器与电磁阀和反应器主体内底部的气体分布器连接上，另一不锈钢管通过一电磁阀将反应器主体底部与储液槽顶部连通。储液槽另一侧壁接出一根气液循环管连通到反应器主体内的气液分配管上。反应器主体上盖上插入一根排气管；光源放置在内置光照管中。气液分配管在反应器主体内各隔层之间。在隔层上开有根据不同深度不同直径和数目的通孔，以利于不同气体和营养液的均匀分配。还包括在反应器主体的外侧设有外置光照管。还包括电磁阀与时序控制仪连接，时序控制仪与内置光源电连接。还包括在反应器主体底部设置加热器，并与温度探头及温控仪电连接，温控仪又与时序控制仪电连接。还包括在反应器主体外设一气体控温装置。

本发明提供的采用气升式周期浸没光照植物细胞组织的培养方法：

1.经气、水冷试后通入蒸气灭菌，灭菌温度为100-121℃，灭菌时间为40-200分钟，再通入无菌空气保护。

2.在室温下打开接种管上部封帽，在无菌环境中将培养物种子(植物细胞、组织、器官等)逐层加入，完成一层接种后再提高一段接种管并取下，新一层上翻板自动落下再接种，依次从低到高完成接种。

3.盖好封帽，输入培养液

4.按所需温度调好温控仪

5.按所需培养物要求的浸没时间和通气周期调好时序仪，启动本系统，按照下列条件要求自动实现培养。按培养物的要求所需浸没时间3-60分钟、非浸没时间30-100分钟、储液罐通气搅拌时间1-20分钟、上下料时间10-20分钟、光照时间8-24小时/天，光照强度500lux-5000lux。

培养过程中培养条件可调，不同培养物需不同培养液和培养条件。

本发明的优点在于：本发明的气升式周期浸没光照植物细胞组织器官反应器是大规模培养的一种新型生物反应器，可以实现周期性浸没、通气、周期性光照及停止光照和无光的培养操作，可实现植物组织器官的均匀接种，生长分布均匀，具有优良的混合传质、传热特性，无机械运动部件，结构简单，易密封，不易染菌以及易于放大到工业化规模。

本发明培养方法解决了目前植物细胞组织和器官培养中接种不均，长期浸没培养产生玻璃化和变异现象，雾化培养不易放大，气液固三相混合及传质差，光照不易调节，生长后期出现气液短路，温度分布不均及以往的反应器功能单一等问题。本发明通过分段接种管及隔层翻板设计使接种操作简单，接种均匀。气液交替半浸没周期调节培养，符合生物生长代谢节律，强化了传质的均匀性，光照强度及周期可调可实现光照-无光照周期交替培养及暗培养。储液罐的设计进一步强化了营养物及气液均匀混合，增加了培养物溶氧，实现了反应器内气液交替切换的周期性操作。同时，气体温度按培养最佳温度可调节。因此本发明的培养系统具有多功能性，植物细胞、组织器官生长及代谢可调控性，环境因子可调控及最佳选择性，易于放大等特点，是目前植物组织器官培养系统的创新和突破。下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明：

图1是一种现有的9立升植物发根培养反应器示意图图2是一种现有的2.5立升内环流超声雾化反应器示意图图3是本发明的结构示意图图4是本发明气升式周期浸没光照植物细胞、组织器官培养反应器的一种实施例的结构示意图

图面说明如下：1-反应器主体   2-分段接种管      3-隔层                 4-翻板5-内置光照管   6-气体分布器      7，8，10，11-电磁阀    9-外置光源12-储液槽      13-气、液分配管   14-气、液循环管        15-玻璃支撑管16-雾化器      17-雾化头         18-带孔中心管          19-加热器20-中心管孔    21-冷凝器         25-接种口              26-不锈钢隔网(图中未标明)27-排气口      28-尼龙网中心管   29-压力表              30-进气管31-温控仪                        32-pH探头及控制仪      33-溶氧探头及控制仪34-尾气气相色谱检测              35-时序控制仪          36-气体控温装置37-补液罐     38-气体流量计     39-除菌过滤器           40-安全阀41-蠕动泵     42-酸液储罐       43-碱液储罐

实施例1：

按图3制备一台40立升的气升式半浸没光照植物细胞、组织器官培养反应器，由φ230mm×1400mm耐热玻璃制造的反应器主体1，将带有翻板4的10层φ204mm的不锈钢隔层及筛网3通过不锈钢气液分配管13，固定后置入反应器主体1内，通过间距为10cm的各层不锈钢隔层上φ42mm的孔插入不锈钢分段接种管2，各层不锈钢隔板上的筛网中心开孔，经此孔插入φ40mm耐热玻璃内置光照管5，日光灯插入内置光照管5中作为内置光源。反应器主体1底部设置气体分布器6，并用不锈钢管穿过反应器主体1底部后将气体分布器与市售电磁阀7连接。位于反应器下部，设置一φ408mm×408mm的不锈钢储液槽12，储液槽12内安装一气体分布器6，一不锈钢管通过储液槽12顶部焊接一不锈钢管同电磁阀11连接，然后再同反应器底部连通。另一不锈钢管同电磁阀10连接，并连通到气液循环管14上。气、液循环管14在反应器主体1上方同伸入反应器主体1内的两支气液分配管13连通。气液分配管13穿过反应器主体1内不锈钢隔层而固定，各层之间的空间部分根据不同深度开有不同直径和数目的通孔，以利于不同隔层和营养液及气体的均匀分配。

实施例2：

按图4制作一台40立升的气升式周期浸没光照植物细胞组织反应器，由耐热玻璃中心光照管5，耐热玻璃反应器主体1，带筛网的不锈钢隔层3及翻板4，不锈钢气、液分配管13，在反应器主体外有日光灯管作外部光源9，加热器、温度探头及温控仪31，不锈钢气体分布器6，不锈钢电磁阀7，8，10，11，不锈钢储液槽12，pH探头及控制仪32，溶氧探头及控制仪33，尾气气相色谱检测34，时序控制仪35，不锈钢分段接种管2，气体控温装置36，尾气冷凝器21，补液罐37，气体流量计38，除菌过滤器39，压力表29，安全阀40，蠕动泵41，酸液储槽42，碱液储槽43组成；其中在反应器主体内安装多层不锈钢筛网隔层3，隔层3上有孔，内置光照管从孔中插入，隔板固定在其上，隔层间距根据培养物决定。中心管孔20的侧边开有接种管2插入孔，孔上活动连接一盖孔的带有不锈钢筛网的翻板4，一分段接种管穿过此孔，每段接种管螺合固定；储液槽12安装在反应器主体的下面，通过一根管子把储液槽12内的气体分布器6与电磁阀和反应器主体内底部的气体分布器6连接上，另一不锈钢管通过一电磁阀将反应器主体底部与储液槽12顶部连通。储液槽12另一侧壁接出一根气液循环管14连通到反应器主体1内的气液分配管13上。反应器主体1上盖上插入一根排气管；光源放置在内置光照管5中。气液分配管13在反应器主体1内各隔层3中穿过，其中内置光照管5从孔中插入并固定在其上，隔层3间距根据培养物决定。中心管孔20的侧边开有接种管2插入孔，孔上活动连接一盖孔用的带有不锈钢筛网的翻板4，一分段接种管2穿过此孔，每段接种管2螺合固定；储液槽安装在反应器主体的下面，通过一根管子把储液槽12内的气体分布器6与电磁阀和反应器主体内底部的气体分布器6连接上，另一不锈钢管通过一电磁阀将反应器主体底部与储液槽顶部连通。储液槽12另一侧壁接出一根气，在反应器主体1内其中内部光源5与外部光源9可调节光强及光照周期。分段接种管2，有不锈钢筛网的隔层3及翻板4的设计易于接种及种子在反应器内分布均匀，避免培养物局部堆积。电磁阀7，8，10，11与时序控制仪35结合可实现气液周期交替浸没培养。加热器、温度探头及温度控制仪31可实现液体浸没培养时的加热和控制。气体控温装置36可将气体控制在所需温度，气体流到38调节气体流量后经除菌过滤器39除菌。气体分布器6可实现气体在溶液中均匀分布。气、液分配管13将气体及培养液输送到反应器各层。尾气冷凝器21可冷凝尾气中夹带水分。补液罐37可补加损失水分。反应器主体及储液罐安装压力表29及安全阀40，保证操作安全。

实施例3：

在40立升本发明的反应器系统中应用本发明的方法，对中科院植物所提供的发根农杆菌R1601诱导青蒿叶片形成植物器官毛状根进行大规模培养，接种量为0.1--1克干重/升，半浸没周期为：3-10分钟浸没，30-60分钟非浸没并通气。光照强度500lux-5000lux，光照周期：每天光照8-24小时，温度20-35℃，培养20-30天，整个反应器长满发根，获得发根干重为5--30克干重/升，生物量增加30-60倍。操作步骤：1.经气、水冷试后通入蒸气灭菌，灭菌温度为100-121℃，灭菌时间为40-200分钟，再通入无菌空气保护。

2. 在室温下打开接种管上部封帽，在无菌环境中将培养物种子(植物细胞、组织、器官等)逐层加入，完成一层接种后提高一段接种管并取下，新一层上翻板自动落下再接种，依次从低到高完成接种。

3.盖好封帽，输入培养液

4.按所需温度调好温控仪

按所需培养物要求的浸没时间和通气周期调好时序仪，启动本系统，按照下列条件要求自动实现培养。按培养物的要求所需浸没时间3-60分钟、非浸没时间30-100分钟、储液罐通气搅拌时间1-20分钟、上下料时间10-20分钟、光照时间8-24小时/天，光照强度500lux-5000lux。

实施例4：

在40立升规模本发明的反应器系统中，对中科院植物所提供的青蒿丛生芽进行大规模培养，接种量为0.1-0.6克干重/升，浸没周期、光照强度、光照周期及温度同实例1。培养20-30天后，整个反应器长满丛生芽，获得青蒿丛生芽干重为5--30克干重/升，生物量增加15--20倍，所得生物量分别为固体培养和摇瓶培养的1.7倍和2.5倍。

本发明方法和培养反应器已实现了青蒿器官毛状根、青蒿丛生芽周期性浸没培养。试验中生长良好，反应器有效体积充分利用，培养物无玻璃化现象及变异发生，整个反应器密封良好，无染菌现象，反应器内培养物、温度分布均匀，气液间传质良好，周期性输送液体和气体。pH、温度、溶氧可监测并调控到最佳范围，整个系统操作可靠。国内首次设计的40升植物组织、器官大规模培养首次获得成功。

Claims (7)

1.气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养反应器，包括反应器主体，光源，隔层、接种管、气体分布器，其特征在于还包括储液槽、电磁阀、气液循环管、气液分配管；其中在反应器主体内安装多层带筛网的隔层，隔层上设有一孔，内置光照管从孔中插入固定在其上；隔层侧边开有接种管插入孔，孔边上活动连接一盖孔的带有不锈钢筛网的翻板，一分段接种管穿过一隔层的孔，每段接种管穿出隔层与下段接种管螺合固定；储液槽安装在反应器主体的下面，通过一根管子把储液槽内的气体分布器与电磁阀和反应器主体内底部的气体分布器连接上，另一不锈钢管通过一电磁阀将反应器主体底部与储液槽顶部连通；储液槽另一侧壁接出一根气液循环管连通到反应器主体内的气液分配管上；反应器主体上盖上插入一根排气管；光源放置在内置光照管中；气液分配管在反应器主体内各隔层之间，根据不同深度开有不同直径和数目的通孔，以利于不同隔层中营养液及气体的均匀分配。

2.按权利要求1所述的气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养反应器，其特征在于：还包括在反应器主体的外侧设有外置光照管。

3.按权利要求1所述的气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养反应器，其特征在于：还包括电磁阀与时序控制仪连接，时序控制仪与内置光源电连接。

4.按权利要求1所述的气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养反应器，其特征在于：还包括在隔层上活动连接一翻板，翻板中间为不锈钢筛网。

5.按权利要求1所述的气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养反应器，其特征在于：还包括在反应器主体外设一气体控温装置。

6.按权利要求1所述的气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养反应器，其特征在于：还包括在反应器主体底部设置加热器，并与温度探头及温控仪电连接，温控仪又与时序控制仪电连接。

7.一种使用权利要求1所述的气升式周期浸没光照植物细胞组织器官培养反应器进行植物细胞组织器官培养的方法，其特征在于：

(1)经气、水冷试后通入蒸气灭菌，灭菌温度为100-121℃，灭菌时间为40-200分钟，再通入无菌空气保护；

(2).在室温下打开接种管上部封帽，在无菌环境中将培养物种子逐层加入，完成一层接种后提高一段接种管并取下，新一层上翻板自动落下再接种，依次从低到高完成接种；

(3)盖好封帽，输入培养液；

(4)按所需温度调好温控仪；

(5)按所需培养物要求的浸没时间和通气周期调好时序仪，启动本系统，按照下列条件要求自动实现培养，按培养物的要求所需浸没时间3-60分钟、非浸没时间30-100分钟、储液罐通气搅拌时间1-20分钟、上下料时间10-20分钟、光照时间8-24小时，光照强度500lux-5000lux。

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