PL188683B1

PL188683B1 - Sposób fermentacji na podłożu stałym oraz fermentor z podłożem stałym

Info

Publication number: PL188683B1
Application number: PL99344455A
Authority: PL
Inventors: Peter Lueth; Ute Eiben
Original assignee: Prophyta Biolog Pflanzenschutz
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-27
Publication date: 2005-03-31
Also published as: NZ507738A; WO1999057239A3; AU4601199A; UA65616C2; BG64130B1; AU749402B2; EP1073708B1; CA2329815C; ATE208810T1; RU2235767C2; HU225994B1; WO1999057239A2; CA2329815A1; CN1212385C; JP4180798B2; US6620614B1; EP1073708A2; DE59900442D1; HUP0101547A2; CZ20003988A3

Abstract

1. Sposób ferm entacji na podlozu stalym , znajdujacym sie na kilku um ieszczonych jed n a nad dru g a pólkach m odulowych, z których kazda chlodzona je st za pom oca um ieszczonych pod nia elem entów chlodzacych, zna- mienny tym, ze podloze nam nazajace (5) zaszczepia sie m ikroorganizm am i podlegajacym i rozm noze niu przez wypelnienie ferm entora w oda ze znaczaca iloscia zalaz - ków tych organizm ów , przy czym szczepionka przechodzi równom iernie przez wszystkie warstw y podloza, zarówno w czasie napelniania ferm entora woda, jak i podczas jego oprózniania z wody 3 Ferm entor z podlozem stalym , stanow iacy pionowy, zam kniety od góry pokryw a zbiornik, w ew natrz którego znajduja sie um ieszczone jeden nad drugim m oduly zaw ie- rajace warstwy stalego podloza nam nazajacego do roz- mnaz ania m ikroorganizm ów, przy czym pod kazdym z m odulów znajduje sie elem ent chlodzacy zlozony z pionowych listew z m aterialu o dobrym przew odnictw ie cieplnym oraz z otaczajacych je wezow nic, przez które przeplywa ciecz chlodzaca, znamienny tym, ze jego m oduly skladaja sie z pólek m odulow ych (4), których dna, korzystnie perforow ane wzglednie siatkow e, sa przepusz- czalne dla pow ietrza i wody, zas wystajace do góry na ich obrzezu scianki boczne (12) m aja w ysokosc nieco w ieksza od grubosci warstwy podloza nam nazajacego (5), przy czym pólki m odulow e (4) sa osadzone na polaczonych z w ew netrzna sciana zbiornika pierscieniach podporo- wych (11) i uszczelnione za pom oca uszczelek (10) w zgle- dem bocznych scian zbiornika Fig. 1 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób fermentacji na podłożu stałym, znajdującym się na kilku umieszczonych jedna nad drugą półkach modułowych, z których każda chłodzona jest za pomocą umieszczonych pod nią elementów chłodzących.

Przedmiotem wynalazku jest również fermentor z podłożem stałym, zwłaszcza fermentor o dużej objętości, stanowiący pionowy, zamknięty od góry pokrywą zbiornik, wewnątrz

188 683 którego znajdują się umieszczone jeden nad drugim moduły zawierające warstwy stałego podłoża namnażającego do rozmnażania mikroorganizmów. Pod każdym z modułów znajduje się element chłodzący złozony z pionowych listew z materiału o dobrym przewodnictwie cieplnym oraz z otaczających je wężownic, przez które przepływa ciecz chłodząca.

Fermentory z podłożem stałym oraz ciekłym są wykorzystywane zwłaszcza w przemyśle przetwarzania żywności do namnazania masy mikroorganicznej, a także w celu izolacji mikroorganizmów, uzyskania produktu metabolicznego oraz zmienionego mikrobiologicznie podłoża. Chociaż znane aktualnie fermentory z odżywczym podłożem: ciekłym lub półciekłym mają objętość do 200 000 dm³, to nie są dotychczas znane fermentory z odzywczym podłożem stałym o podobnie dużej objętości, które mogłyby być utrzymywane przez dłuższy okres czasu w stanie wolnym od zanieczyszczeń obcymi mikroorganizmami, a równocześnie charakteryzowałyby się optymalnym namnażaniem mikroorganizmów.

Największy znany fermentor do hodowli grzybów włóknistych, które wymagają dla właściwego rozwoju, bez jakichkolwiek obcych zanieczyszczeń, dużych powierzchni - ma objętość 50 dm³ i znajduje się-w INRA we Francji. Objętość ta nie jest jednak wystarczająca do masowej produkcji zarodników grzybów, które mogą być użyte na przykład jako rolne pestycydy biologiczne.

Z brytyjskiego opisu patentowego nr GB 1 156 739 znany jest sposób fermentacji ciągłej przy użyciu modułowego fermentora stosowanego wyłącznie do podłoża ciekłego albo półciekłego, doprowadzanego z boku oddzielnie do każdego modułu i spływającego pod działaniem siły ciężkości przez wszystkie warstwy złoża fluidalnego. Ciekłe albo półciekłe podłoże namnażające, zawierające mikroorganizmy, umieszcza się w postaci wielu cienkich warstw umieszczonych jedna nad drugą na półkach wewnątrz kolumny fermentora i doprowadza się do nich powietrze przepływające przez podłoże i równomiernie rozprowadzane w poszczególnych warstwach. Składniki podłoża przepływają pod działaniem siły ciężkości przez nachylone pod niewielkim kątem do poziomu płyty ze złozem fluidalnym i są odprowadzane w sposób ciągły w dolnej części kolumny fermentora Korzystnie po kilka warstw podłoża jest zgrupowanych w modułach, do których doprowadza się składniki czynnika reakcyjnego oraz przez które przepływa powietrze. Równomierny przepływ podłoża przez fermentor jest zapewniony przez regulowane listwy przepływowe.

Po zakończeniu cyklu technologicznego fermentor samoczynnie opróżnia się, co ułatwia jego sterylizację. Od góry doprowadzany jest również czynnik zmniejszający ilość piany powstającej podczas fermentacji, której nadmiar odprowadza specjalne urządzenie. Fermentor jest również zaopatrzony w instalację wodną, umożliwiającą regulację temperatury podłoża, przy czym elementy chłodzące jego poszczególne warstwy składają się z pionowych listew zanurzonych w podłożu i otoczonych w dolnej części wężownicą połączoną z instalacją chłodzącą.

Z francuskiego opisu patentowego nr FR 1 474 370 znany jest sposób prowadzenia ciągłej, trójfazowej fermentacji substancji organicznych, stosowany zwłaszcza do wytwarzania piwa i innych sfermentowanych napojów. Kolumna fermentacyjna o przekroju prostokątnym jest wyposażona w rozmieszczone jedne nad drugimi nachylone płyty, które odchylają strumień reagujących substancji. Pod płytami znajdują się wężownice grzewcze i chłodzące. Mieszaninę zacieru z ośrodkiem fermentacyjnym doprowadza się od dołu do I strefy klarowania, a następnie do II strefy napowietrzania, po czym - do III strefy fermentacji właściwej i wreszcie do IV strefy fermentacji ostatecznej i klarowania. W górnej części kolumny fermentacyjnej jednym przewodem odprowadza się produkt poddawany fermentacji, a innym, usytuowanym nad nim - odprowadza się gaz. W dnie kolumny fermentacyjnej znajduje się zawór do okresowego odprowadzania słodzin i martwych komórek. Podczas unoszenia się do góry ośrodek przemieszcza się stosunkowo wolno ruchem zygzakowym z prędkością, która jest zależna od szerokości nachylonych płyt. Kolumna fermentacyjna jest zaopatrzona na swych bocznych ścianach, na różnych poziomach, w okna kontrolne oraz w przewody wlotowe do doprowadzania powietrza albo tlenu do strefy napowietrzania, w regulator poziomu cieczy w tej strefie, oraz w otwory do odprowadzania gazu i drożdży, jak również w zawory do pobierania próbek.

188 683

W ostatnim okresie czasu do opartej na fermentacji produkcji żywności, produktów enzymowych (Koji) oraz grzybów jadalnych, zwłaszcza w Afryce i w Azji, coraz szersze zastosowanie ma fermentacja na stałym podłożu (SSF), umożliwiająca wzrost mikroorganizmów, zwykle grzybów, na podłożu stałym w określonej fazie gazowej, lecz bez wolnej fazy wodnej.

W krajach zachodnich podobne zadania produkcyjne realizowane były od 1940 r. z wykorzystaniem fermentacji na podłożu ciekłym, natomiast fermentacja na podłożu stałym (SSF) była wykorzystywana jedynie do ponownego przetwarzania odpadów organicznych. Aktualnie znacznie wzrosło zainteresowanie fermentacją na stałym podłożu, która wykazuje szereg zalet w stosunku do fermentacji z odzywczym podłożem ciekłym. Główne zalety to: możliwość efektywnej produkcji drugorzędnych metabolitów, na przykład enzymów, substancji zapachowych, aromatycznych i barwiących oraz substancji aktywnych farmaceutycznie, a także możliwość produkcji mikroorganizmów jako środków biologicznych w rolnych pestycydach, eliminacja toksyn lub innych szkodliwych substancji z żywności oraz wzbogacanie jej w proteiny lub witaminy.

W stanie techniki wyróżnia się sześć typów fermentorów z odżywczym podłożem stałym: bioreaktor talerzowy, bioreaktor ze spakowanym łożem, bioreaktor z obrotowym bębnem, bioreaktor z wahliwym podłożem stałym, bioreaktor z mieszalnikiem oraz bioreaktor ze stałym łożem fluidyzowanym powietrzem.

Bioreaktor talerzowy, w którym fermentowane podłoże jest rozłożone w płaskim zbiorniku, jest zwykle przeznaczony do procesów fermentacyjnych zachodzących na płaszczyźnie. Taki bioreaktor umożliwia uzyskanie znacznej ilości produktu, jednak mimo umieszczenia go w pomieszczeniu z klimatyzacją („Koji” - Raum, Ramana Murthy, M.V.; Karanth, N.G.; Raghava Rao, K.S.M.S.: Advance in Applied Microbiology 38 (1993), str. 99-147) przeważnie występują niepożądane zanieczyszczenia zarodkami krystalizacji. Ponadto tego rodzaju bioreaktor zajmuje bardzo duzą przestrzeń produkcyjną, zaś prowadzenie procesu jest stosunkowo pracochłonne, wymaga bowiem ręcznego przesuwania zbiorników z fermentowanym podłożem, a ponadto uniemożliwia wytworzenie dużej liczby zarodników grzybów.

Bioreaktor ze spakowanym łożem jest wyposażony w umieszczone wewnątrz zamkniętego zbiornika wilgotne, granulowane i ciągle przepłukiwane powietrzem podłoże, zaszczepione mikroorganizmami, rozwijającymi się bez konieczności jego przesuwania. Na początku procesu fermentacji nie jest możliwe, ze względu na wydzielanie ciepła przez mikroorganizmy, użycie dużej ilości suchego podłoża (mikroorganizmy wydzielają przeciętnie 300 kJ ciepła/h-kg suchego podłoża (Saucedo-Castaneda, G; Gutierrez-Rojas, M.; Backuet,G.; Raimbault, M.; Viniegra-Gonzalez, G.; Biotechnologie and Bioengeniering 35 (1990), str. 802-808). Wydzielane ciepło jest odprowadzane zarówno przez zewnętrzną ściankę reaktora, jak i przez przepływające przez podłoże powietrze, jednakże wydajność odprowadzania ciepła jest zbyt mała wtedy, gdy rektor ma dużą objętość. W wyniku tego następuje wzrost temepratury podłoża, powodujący spowolnienie wzrostu mikroorganizmów, a w końcu ich obumarcie. Ponadto stałe napowietrzanie wysusza podłoże, tworząc w nim kanały powietrzne, których obecność nie gwarantuje z kolei skutecznego napowietrzenia, prowadząc do pogorszenia procesu wzrostu mikroorganizmów.

Bioreaktor z obrotowym bębnem jest wyposażony w poziomy, cylindryczny zbiornik, wypełniony do 1/3 objętości granulowanym podłożem, na którym namnazająsię' mikroorganizmy. Ciepło wytworzone podczas wzrostu mikroorganizmów jest usuwane przez chłodzoną ściankę obracającego się z niewielką prędkością zbiornika. Niedogodnością procesu prowadzonego przy użyciu tego bioreaktora są siły ścinające, powstające wewnątrz ruchomego podłoża, które prowadzą do zaburzeń struktury rosnących grzybów (grzybni, zarodni oraz ciał owocowo-warzywnych). Wskutek tego osłabiony zostaje wzrost grzybów, uniemożliwiając produkcję o dużej wydajności namnażanio zarodników.

Problem osuszania podłoża został w bioreaktorze tego typu rozwiązany przez doprowadzenie wilgotnego powietrza, które nie powoduje odparowywania wody z podłoża. Ponadto nawilgocenie powietrza, przy użyciu dysz rozpylających, powoduje korzystny rozkład wolnej wody w przemieszczającym się podłożu. Okazało się jednak, że duża masa przemieszczającego się podłoża namnażającego prowadzi do aglomeracji wilgotnego podłoża oraz występowa188 683 nia wyraźnych granic rozdziału między podłożem a otoczeniem zewnętrznym, zwłaszcza w obszarze wlotu i wylotu powietrza oraz wody, które są źródłami zanieczyszczeń podłoża.

Bioreaktor z wahliwym podłożem stałym różni się od wyżej opisanego bioreaktora z obrotowym bębnem tym, że mieszanie podłoża realizowane jest nie przez ruch obrotowy, lecz przez oscylacyjne wstrząsanie podłożem. Ponadto bioreaktor tego typu charakteryzuje się podobnymi zaletami i niedogodnościami jak bioreaktor z obrotowym bębnem, jednakże jego dodatkową niedogodnością jest ograniczenie jego pojemności, spowodowane konstrukcją mechanizmu wstrząsowego oraz dużymi siłami bezwładności jedynie do 100 kg podłoża.

Bioreaktor z mieszalnikiem stanowi zbiornik z przemieszczającym się w jego wnętrzu mieszadłem. Również i w tym reaktorze nie jest możliwe użycie większej ilości podłoża, bowiem jego ruch spowodowany mieszadłem prowadzi do zniszczenia struktur podłoża.

Bioreaktor ze stałym łożem fluidyzowanym powietrzem ma podłoże namnazające dla mikroorganizmów, stale utrzymywane we fluidyzowanym łożu i charakteryzuje się, w porównaniu do opisanych typów bioreaktorów, stosunkowo dużą objętością. Powietrze niezbędne do fluidyzacji łoża musi mieć ściśle określoną wilgotność i jest doprowadzane w zamkniętym obiegu cyrkulacyjnym. W celu utrzymania właściwych warunków fluidyzacji łoża proces wymaga zuzycia dużej ilości energii. Z realizowanego projektu AiF (Bahr, D.; Menner,M.; BIOforum 18 (1995), str. 16-21) wynika, że we fluidyzowanym łozu możliwe jest namnazanie komórek drożdży. Jednakże uzyskuje się je w stosunkowo niewielkiej skali, przy czym wydajność procesu jest mniejsza niż w przypadku bioreaktora z podłożem ciekłym. Natomiast namnożenie grzybów włóknistych na dużej ilości granulowanego podłoża namnażającego (ponad 100 kg w każdym wsadzie) trwało kilka tygodni przy bardzo dużych kosztach procesu.

Jak wynika z europejskiego opisu patentowego nr EP O 683 815 oraz z francuskiego opisu patentowego nr FR 85.08555 innego rodzaju fermentory są zbyt małe, aby możliwe i ekonomiczne uzasadnione było namnażanie zarodników grzybów.

Natomiast z niemieckiego opisu patentowego nr DE 4 406 632 wynika, ze w przypadku fermentorów o większej objętości - nie jest możliwe wykluczenie przez dłuższy okres czasu przedostania się do podłoża namnażającego zanieczyszczeń, stanowiących zarodzie krystalizacji.

Celem wynalazku jest opracowanie takiego sposobu fermentacji na podłożu stałym, który umożliwi prowadzenie procesu równocześnie w dużej objętości podłoża, zapewniając równomierne napowietrzanie oraz utrzymanie w przybliżeniu stałej temperatury podłoża.

Cel ten zrealizowano w sposobie fermentacji na podłożu stałym, który charakteryzuje się tym, że podłoże namnażające zaszczepia się mikroorganizmami podlegającymi rozmnożeniu przez wypełnienie fermentora wodą ze znaczącą ilością zalążków tych organizmów, przy czym szczepionka przechodzi równomiernie przez wszystkie warstwy podłoża, zarówno w czasie napełniania fermentora wodą, jak i podczas jego opróżniania z wody.

W trakcie procesu namnażania utrzymuje się w przybliżeniu stałą temperaturę podłoża namnażającego przez włączanie elementów chłodzących do instalacji chłodniczej wtedy, gdy temperatura podłoża osiąga jej górną granicę i wyłączanie ich wtedy, gdy osiąga dolną granicę temperatury namnażania.

Celem wynalazku jest również opracowanie takiej konstrukcji fermentora z podłożem stałym, który wyeliminuje niedogodności znanych fermentorów tego typu i zapewni fermentację w dużej objętości podłoża przy niewielkiej ilości obcych mikroorganizmów, jak również utrzymanie sterylnych warunków podczas całego procesu fermentacji oraz skuteczne odprowadzanie ciepła wytwarzanego w czasie metabolizmu grzybów, bez konieczności osuszania podłoża. Fermentor według wynalazku winien równocześnie wyeliminować występowanie wewnątrz niego sił ścinających, gwarantując równomierne napowietrzanie i kontrolę temperatury podłoża.

Cel ten zrealizowano w konstrukcji fermentora z podłożem stałym, o konstrukcji modułowej według wynalazku, który charakteryzuje się tym, że jego moduły składają się z półek modułowych, których dna, korzystnie perforowane względnie siatkowe, są przepuszczalne dla powietrza i wody, zaś wystające do góry na ich obrzezu ścianki boczne mają wysokość nieco większą od grubości warstwy podłoża namnażającego. Półki modułowe są osadzone na połą6

188 683 czonych z wewnętrzną ścianą zbiornika pierścieniach podporowych i uszczelnione za pomocą uszczelek względem bocznych ścian zbiornika.

Dno zbiornika fermentora jest korzystnie wyposażone w otwór wlotowy wody oraz otwór wlotowy powietrza, zaś jego pokrywa jest wyposażona w otwór wylotowy wody oraz otwór wylotowy powietrza, jak również w otwór do wprowadzania szczepionki do wnętrza fermentora.

Szczególnie korzystną konstrukcję fermentora uzyskuje się wówczas, gdy jego zbiornik składa się z kilku ustawionych jeden nad drugim i połączonych szczelnie ze sobą za pośrednictwem uszczelek - segmentowych zbiorników pierścieniowych. W każdym z tych segmentowych zbiorników znajduje się półka modułowa z podłożem namnażającym, wyposażona w element chłodzący, zaś miejsce jego połączenia z sąsiednim segmentowym zbiornikiem jest osłonięte za pomocą zewnętrznej osłony.

Podłoże namnażające fermentora według wynalazku stanowi korzystnie porowaty granulat z dodatkiem roztworu pożywki, względnie naturalny granulat z roślin zbożowych, z otrębów względnie z odpadów z produkcji cukru.

Fermentor według wynalazku jest korzystnie wyposażony w znajdującą się na najniższej półce modułowej warstwę nawilżającą z materiału ziarnistego o bardzo dużej objętości porów, mającego właściwości absorbowania wody.

Fermentor z podłożem stałym według wynalazku jest uwidoczniony w przykładowym rozwiązaniu konstrukcyjnym na rysunku, na którym: fig. 1 - przedstawia fermentor w przekroju osiowym; fig. 2 - schemat elementu chłodzącego poszczególne półki modułowe fermentora, w widoku perspektywicznym; fig. 3 - część fermentora w przekroju osiowym, a fig. 4 część odmiany fermentora w przekroju osiowym.

Pojemność fermentora z podłożem stałym według wynalazku wynosi przynajmniej 50 dm³, korzystnie zaś od 500 dm³ do 1000 dm ³ lub więcej. Przedstawiony na fig. 1 fermentor ma postać zbiornika o przekroju kołowym lub innym, zamkniętego od góry pokrywą 1, zaopatrzoną w otwór wylotowy 2 powietrza oraz w otwór 3 do wprowadzania szczepionki do wnętrza fermentora.

Wewnątrz zbiornika fermentora znajdują się umieszczone jeden nad drugim moduły, stanowiące półki modułowe 4 z dnem przepuszczalnym dla powietrza i wody, wykonanym korzystnie z blachy perforowanej lub siatki, oraz z wystającymi do góry na obrzeżu ściankami bocznymi 12. Na półkach modułowych 4 znajduje się warstwa podłoża namnażającego 5, której grubość winna być nieco mniejsza od wysokości ścianek bocznych 12.

Podłoże namnażające 5, w zależności od pożywki wymaganej do namnażania mikroorganizmów, składa się z różnych materiałów, korzystnie o granulowanej strukturze, zapewniającej dobrą przepuszczalność powietrza. Podłoże namnażające 5 może na przykład stanowić porowaty granulat z dodatkiem roztworu pożywki albo tez naturalny granulat z roślin zbożowych, z otrębów względnie z odpadów materiałów organicznych, na przykład z odpadów uzyskiwanych w procesie wytwarzania cukru.

Liczba półek modułowych 4 w zbiorniku fermentora zależy od zapotrzebowania namnazanych mikroorganizmów, jak również od sposobu jego obsługi. Zbyt duża liczba półek modułowych 4 może utrudniać dopływ tlenu, niezbędnego dla wzrostu mikroorganizmów, do górnych warstw podłoża namnażającego 5, jak również utrudniać obsługę fermentora. Doświadczenie wykazało, że wewnątrz fermentora według wynalazku może być zamocowanych 20 do 30 półek modułowych 4. Odległość między sąsiadującymi półkami modułowymi 4 zależy od grubości warstwy podłoża namnażającego 5, która z kolei określona jest warunkami namnażania konkretnych mikroorganizmów.

Każda z półek modułowych 4 jest korzystnie zaopatrzona w oddzielny, umieszczony pod nią, element chłodzący 6, złozony z pionowych listew wykonanych z materiału o dobrym przewodnictwie cieplnym, umieszczonych w szczelinach dna półki, oraz z umieszczonych pod tym dnem, równolegle do listem, rur wężownicy chłodzącej, połączonej za pomocą złączek 13 i 17 z rurami 14 przez które doprowadzona jest i odprowadzana ciecz chłodząca.

Elementy chłodzące 6 służą do odprowadzania ciepła wytwarzanego w wyniku reakcji w podłożu namnażającym 5 oraz utrzymania w przybliżeniu stałej temperatury procesu fermentacji.

188 683

Po zakończeniu procesu fermentacji elementy chłodzące 6 są wysuwane do dołu z każdej półki modułowej 4, dzięki czemu możliwe jest wyjęcie z fermentora podłoża z namnożonymi w nim mikroorganizmami.

Elementy chłodzące 6 mogą być również zamocowane nad półkami modułowymi 4 tak, aby ich równoległe listwy znajdowały się wewnątrz warstwy podłoża namnażającego 5. Rozwiązanie to jest szczególnie zalecane w przypadku, kiedy w procesie fermentacji jest wytwarzana znaczna ilość ciepła.

W podstawie fermentora zamykającej od dołu jego zbiornik znajduje się otwór wlotowy 7 powietrza, przez który wpompowywane jest do wnętrza fermentora sterylne i wilgotne powietrze przepływające w obiegu zamkniętym kolejno przez wszystkie warstwy podłoża, a następnie odprowadzane z wnętrza fermentora przez otwór wylotowy 2 powietrza w jego pokrywie 1. Szczeliny utworzone w dnach półek modułowych 4, w których są osadzone pionowe listwy elementów chłodzących 6, zapewniają także równomierny przepływ powietrza przez cały fermentor. Powietrze wprowadzone do fermentora może być nawilżane również wewnątrz fermentora. W tym celu najnizszą półkę modułową 4 nie wypełnia się podłożem namnażającym 5, lecz porowatym granulatem absorbującym wodę zawartą we wprowadzanym powietrzu, zanim przepłynie ono w głąb fermentora. Ta zaabsorbowana woda służy do nawilgocenia powietrza znajdującego się wewnątrz fermentora. Jeżeli do rozwoju mikroorganizmów konieczna jest znaczna ilość wody, wówczas wewnątrz fermentora może być zainstalowanych kilka półek nawilżających, oddzielonych od siebie przez półki modułowe z podłożem namnażającym 5. Ilość powietrza wprowadzanego do fermentora zależy od ilości tlenu koniecznego dla rozwoju mikroorganizmów i wynosi od 1 dm³/h-dm³p0dł do 100 dm3/h-dm3Pod •

W celu zaszczepienia wysterylizowanego podłoża namnażającego 5 miklroorganizmami fermentor wypełnia się naprzód sterylną wodą do poziomu górnej powierzchni najwyższej warstwy podłoża namnażającego, doprowadzając ją przez sterylny filtr i otwór wlotowy 8 wody, znajdujący się korzystnie w podstawie fermentora.

Po napełnieniu wodą do wnętrza fermentora wprowadza się otworem 3, znajdującym się w jego pokrywie 1, szczepionkę mikroorganizmów. W przypadku, kiedy fermentów jest wyposażony w duzą liczbę półek modułowych, otwory 3 do wprowadzenia szczepionki mogą być umieszczone między tymi półkami. Szczepionka stanowiąca zawiesinę o wysokiej koncentracji małych zarodków namnażalnych mikroorganizmów, korzystnie sporów, konidisporów lub zalążków bakterii, jest rozprowadzona równomiernie we wszystkich warstwach podłoża, zarówno w czasie napełniania fermentora wodą, jak i podczas jego opróżniania z wody odprowadzanej otworem wylotowym 9. Jeżeli w fermentorze jest zbyt dużo warstw, przez które ma przepływać szczepionka, może wówczas wystąpić efekt rozszerzenia, polegający na tym, ze mikroorganizmy zostają podczas przejścia przez podłoże przefiltrowane, bowiem ich koncentracja w wodzie jest tym mniejsza, im mniejsze są ich wymiary. Właśnie w celu uniknięcia tego zjawiska otwory 3 do wprowadzania szczepionki do fermentora mogą się również znajdować między półkami modułowymi 4.

W warunkach równomiernego i właściwego ilościowo zaszczepienia fermentora przebieg procesu namnażania, zwłaszcza zaś czas jego trwania i uzysk, jak również jakość namnożonego produktu (na przykład zarodników grzybów), zależą głównie od parametrów procesu namnażania. Proces winien przy tym umożliwiać odpowiednią regulację wilgotności i temperatury wewnątrz fermentora, zaś natężenie przepływu powietrza winno być dostosowane do przepustowości sterylnego filtra powietrza.

Regulacja temperatury w fermentorze jest realizowana za pomocą zainstalowanych w nim elementów chłodzących 6, przy czym wydajność chłodzenia winna być tak obliczona, aby możliwe było odprowadzenie całego ciepła wytwarzanego podczas reakcji w podłożu oraz utrzymanie w przybliżeniu stałej, optymalnej temperatury dla namnazających się mikroorganizmów. Wymagana wydajność chłodzenia zalezy również od grubości warstwy, a więc od objętości podłoża namnażającego. Im większa jest ta objętość, tym więcej jest wytwarzanego ciepła. Z tego powodu obydwa te parametry procesu powinny być zoptymalizowane, aby uzyskać możliwie szybki rozwój mikroorganizmów oraz odpowiednio wysoki uzysk produktu

188 683 zalezny od celu fermentacji, na przykład zarodników grzybów, komórek bakteryjnych, enzymów, antybiotyków, substancji bawiących oraz innych substancji.

Na fig. 3 i 4 rysunku są przedstawione odmienne rozwiązania konstrukcyjne fermentora według wynalazku.

Fermentor przedstawiony na fig. 3 jest wyposażony w, szczelnie zamknięty zbiornik w postaci cylindra lub graniastosłupa o dowolnym przekroju. Średnica cylindra lub bok przekroju graniastosłupa wynosi około 1 m lub więcej, zaś wysokość zbiornika, ograniczona możliwością łatwej obsługi oraz utrzymaniem optymalnych warunków wzrostu mikroorganizmów wynosi 2 m lub nieco więcej.

Półki modułowe 4, wypełnione podłożem namnażającym 5, są wkładane do zbiornika od góry i podtrzymywane' wewnątrz zbiornika za pomocą przymocowanych do jego ścianek pierścieni podtrzymujących 11 o kształcie odpowiadającym kształtowi przekroju zbiornika. Każdy pierścień podtrzymujący 11 jest zaopatrzony w uszczelkę 10 odporną na działanie ciepła, na przykład w uszczelkę silikonową. Uszczelki 10, na których oparte są półki modułowe, tworzą uszczelnienie między tymi półkami a ścianą zbiornika.

Fermentor przedstawiony na fig. 1, szczelnie zamknięty pokrywą zapobiegającą zanieczyszczeniu jego wnętrza, został zaprojektowany jako zbiornik ciśnieniowy, dzięki czemu może być sterylizowany przez przepuszczanie przegrzanej pary pod zwiększonym ciśnieniem.

Odmiana fermentora według wynalazku ma konstrukcję segmentową i składa się z ułożonych jeden nad drugim i szczelnie połączonych pierścieniowych zbiorników o niewielkiej wysokości, korzystnie od 7 cm do 30 cm i odpowiednio dużej średnicy (około 100 cm). Każdy segmentowy zbiornik pierścieniowy pełni funkcję półki modułowej 4 i jest wyposażony w perforowane dno, przepuszczalne dla powietrza i wody, przy czym pod każdą półką znajduje się opisany powyżej element chłodzący 6. W miejscu połączenia z sąsiednim segmentowym zbiornikiem pierścieniowym znajduje się osadzona na krawędzi pierścienia uszczelka 15, odporna na działanie ciepła.

Pierwszy segmentowy zbiornik pierścieniowy znajduje się bezpośrednio nad podstawą fermentora, natomiast ostatni jest zamknięty od góry jego pokrywą. Cały fermentor składa się z dziesięciu lub więcej, umieszczonych jeden nad drugim i połączonych ze sobą, segmentowych zbiorników pierścieniowych.

W przypadku, gdy opisany wyżej fermentor nie pracuje jako zbiornik ciśnieniowy, jego sterylizację oraz sterylizację podłoża namnażającego przeprowadza się w autoklawie. Wysokość fermentora zależy wówczas od pojemności dostępnego autoklawu. W większości przypadków objętość takiego fermentora wynosi od 500 dm³ do 1000 dm³.

Podczas sterylizacji w autoklawie fermentor pozostaje otwarty, a poszczególne segmentowe zbiorniki pierścieniowe są nieznacznie odsunięte od siebie (o około 5 mm), co umożliwia skuteczne wprowadzanie do wnętrza fermentora, a więc do poszczególnych półek modułowych 4 przegrzanej pary sterylizującej. W tym celu poszczególne segmentowe zbiorniki pierścieniowe są wyposażone w zewnętrzną osłonę 16, która zakrywa szczelinę między sąsiednimi segmentowymi zbiornikami w otwartym położeniu fermentora, zapobiegając jego zanieczyszczeniu zarodkami krystalizacji po zakończeniu obróbki w autoklawie, a przed zamknięciem fermentora, czyli w trakcie, kiedy jest on wyjmowany z autoklawu. Po sterylizacji i połączeniu znajdujących się pod półkami modułowymi 4 wężownic rurowych elementów chłodzących 6 za pomocą złączek 17 z rurami 14 doprowadzającymi i odprowadzającymi ciecz chłodzącą fermentor jest szczelnie zamykany.

W korzystnym rozwiązaniu konstrukcyjnym fermentora według wynalazku składa się on z dziesięciu ułożonych jedna nad drugą półek modułowych wypełnionych warstwami granulowanego podłoża namnażającego 5 do wzrostu mikroorganizmów o grubości od 5 cm do 6 cm.

Granulowane podłoże namnażające jest równomiernie rozłożone w warstwach na perforowanych dnach półek modułowych 4, przepuszczalnych dla powietrza i wody, pod którymi umieszczone są elementy chłodzące 6, odprowadzające ciepło wytworzone w podłożu namnazającym.

Przefiltrowane sterylne powietrze jest nadmuchiwane od dołu fermentora, tworząc wymuszony strumień przepływający w kierunku do góry, równomiernie przez wszystkie warstwy

188 683 podłoża namnażającego 5. Najniższa półka modułowa 4 jest korzystnie warstwą granulatu SERAMIS nasyconego wodą, która nawilża przepływające przez nią powietrze.

Sterylizacja fermentora oraz znajdującego się w nim podłoża namnażającego jest realizowana w autoklawie, korzystnie parą przegrzaną o temperaturze 121°C, która winna dopływać do wszystkich półek modułowych 4.

Przykładowe parametry robocze fermentora według wynalazku są następujące:

Objętość: - 500 dm³

Ilość podłoża namnażającego: - 250 dnE

Natężenie przepływu powietrza: - 1500 dm³/h

Moc systemu chłodzącego: - 2,5 kW.

W przeciwieństwie do znanych dotychczas fermentorów z podłożem stałym, na przykład biorektorów z obrotowym bębnem lub z wahliwym podłożem stałym, w których dla odprowadzenia ciepła, napowietrzenia i doprowadzenia wody konieczne jest przemieszczanie podłoża namnażającego - w fermentorze i w sposobie fermentacji według wynalazku podłoże zachowuje swe stałe położenie w ułożonych kondygnacyjnie i całkowicie osłoniętych warstwach. Brak ruchu podłoża namnażającego zapobiega destrukcji struktur grzybowych (zarodni i ciał owocowo warzywnych). Wskutek tego ciężar własny podłoża namnazającego nie powoduje jego zagęszczania, a więc nie prowadzi do zmniejszania przepustowości powietrza, zaś niewielka grubość warstw podłoża namnażającego i niewielka odległość między tymi warstwami zapewnia ich równomierne napowietrzenie. Ponadto zainstalowanie elementów chłodzących 6 pod każdą półką modułową 4 umożliwia efektywne odprowadzanie ciepła. Należy przy tym wyjaśnić, że wprowadzane do fermentora powietrze służy jedynie do dostarczenia tlenu oraz odprowadzenia wytworzonych w nim gazów, a nie do odprowadzania ciepła, dzięki czemu natężenie przepływu powietrza w fermentorze według wynalazku może być bardzo małe, co zapobiega wysuszeniu podłoża namnażającego w przypadku stosowania powietrza nawilżonego przez warstwę nawilżającą, znajdującą się w pierwszej półce modułowej.

Przykład

W celu uzyskania konidiów grzybowych jako masy namnażającej użyto szczepu beauveria brongniartii w fermentorze o pojemności około 50 dm/, przy czym średnica fermentora wynosiła 30 cm, zaś jego wysokość 70 cm. W fermentorze zamocowano osiem półek modułowych 4, których dna były wykonane z nierdzewnej blachy perforowanej, z otworami o średnicy 3 mm. Odległość między półkami modułowymi wynosiła 8 cm. Dolna półka modułowa została wypełniona warstwą granulatu SERAMIS o grubości 6 cm. Pozostałe siedem półek modułowych zostało wypełnionych skruszonym ziarnem jęczmiennym, pełniącym funkcję podłoża namnażającego i tworzącym warstwy o grubości około 6 cm. Całkowita objętość podłoża namnażającego wynosiła 30 dm3. Zewnętrzna osłona fermentora była wykonana ze szkła odpornego na działanie ciepła, umożliwiając obserwację procesu.

Fermentor wraz z całą zawartością został wysterylizowany w autoklawie przegrzaną parą o temperaturze 121°C w czasie pół godziny, przy czym podczas sterylizacji pokrywa fermentora była uniesiona, umożliwiając przenikanie pary przez całe jego wnętrze, lecz została zamknięta niezwłocznie po sterylizacji w autoklawie.

Fermentor został następnie wypełniony sterylną wodą, aż do najwyzszej warstwy podłoża namnażającego, zaczerpniętą z kapsuły typu S+S-EXELON PES 20/5 HC (Schleicher i Schuell, Dassel) o objętości 500 dm3. Następnie przez otwór w pokrywie fermentora wprowadzona została szczepionka, stanowiąca 100 ml zawiesiny konidiów o koncentracji 10⁹ konidiów/ml. Po wprowadzeniu szczepionki do podłoża namnażającego, odprowadzono z niego wodę przez otwór wylotowy z zaworem znajdujący się w dnie fermentora. Dzięki temu wszystkie warstwy fermentora zostały równomiernie skażone konidiami grzybowymi.

Po zaszczepieniu fermentor został zainkubowany w pomieszczeniu o temperaturze 20°C oraz podłączony do źródła sprężonego powietrza i instalacji chłodzącej.

W czasie całego procesu fermentacji natężenie przepływu powietrza wynosi 150 dm ³/h. Jako ciecz chłodzącą użyto wodę z instalacji wodnej o temperaturze 17°C, a jej przepływ przez węzownice elementów chłodzących 6 włączono wtedy, gdy temperatura podłoża namnażającego przekroczyła 22°C i wyłączono, gdy spadłą ona do wartości 20°C. W ten

188 683 sposób średnia temperatura procesu fermentacji była utrzymywana w przybliżeniu na stałym poziomie 21°C.

Celem prowadzonego procesu namnażania było uzyskanie jak największej ilości konidiów grzybowych, przy czym szklana osłona fermentora umożliwiła śledzenie tego procesu.

Po dziesięciu dniach wszystkie podłoża namnażające były pokryte białą grzybnią, zaś w trzynastym dniu namnażania grzybnia zmieniła swoją strukturę na proszkową ze względu na rozwój konidiów i konidiforów (strzępków konidialnych), zaś po dziewiętnastu dniach namnażania aktywność metaboliczna fermentora wyraźnie osłabła, co spowodowało gwałtowne obniżenie ilości wytwarzanego ciepła. Tym samym odpowiednio zmniejszono częstotliwość włączania instalacji chłodzącej. Po 21 dniach od zaszczepienia podłoże namnażające zostało wyjęte z fermentora, po czym zostały z niego wydzielone, przy użyciu specjalnych technik filtracyjnych, konidia grzybowe wyhodowane na beauveria brongniartii. Całkowita ilość tych konidiów grzybowych wynosiła 3,3 x 10¹³.

Osłona fermentora

Podstawa

Podłoże namnażające

Płytka chłodząca, odbierająca ' Przewód chłodzący^cieP^{ło z} P^odłoża namnażającego z rury miedzianej

Szczelina w podstawie do osadzenia płytki chłodzącej

Fig.2

188 683

Fig.3

Fig.4

188 683

Fig.1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób fermentacji na podłożu stałym, znajdującym się na kilku umieszczonych jedna nad drugą półkach modułowych, z których każda chłodzona jest za pomocą umieszczonych pod nią elementów chłodzących, znamienny tym, że podłoże namnazające (5) zaszczepia się mikroorganizmami podlegającymi rozmnożeniu przez wypełnienie fermentora wodą ze znaczącą ilością zalążków tych organizmów, przy czym szczepionka przechodzi równomiernie przez wszystkie warstwy podłoża, zarówno w czasie napełniania fermentora wodą, jak i podczas jego opróżniania z wody.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie procesu namnażania utrzymuje się w przybliżeniu stałą temperaturę podłoża namnażającego przez włączanie elementów chłodzących do instalacji chłodniczej wtedy, gdy temperatura podłoża osiąga jej górną granicę i wyłączanie ich wtedy, gdy osiąga dolną granicę temperatury namnażania.
3. Fermentor z podłożem stałym, stanowiący, pionowy, zamknięty od góry pokrywą zbiornik, wewnątrz którego znajdują się umieszczone jeden nad drugim moduły zawierające warstwy stałego podłoża namnażającego do rozmnazania mikroorganizmów, przy czym pod każdym z modułów znajduje się element chłodzący złożony z pionowych listew z materiału o dobrym przewodnictwie cieplnym oraz z otaczających je wężownic, przez które przepływa ciecz chłodząca, znamienny tym, że jego moduły składają się z półek modułowych (4), których dna, korzystnie perforowane względnie siatkowe, są przepuszczalne dla powietrza i wody, zaś wystające do góry na ich obrzezu ścianki boczne (12) mają wysokość nieco większą od grubości warstwy podłoża namnażającego (5), przy czym półki modułowe (4) są osadzone na połączonych z wewnętrzną ścianą zbiornika pierścieniach podporowych (li) i uszczelnione za pomocą uszczelek (10) względem bocznych ścian zbiornika.
4. Fermentor według zastrz. 3, znamienny tym, że dno jego zbiornika jest wyposażone w otwór wlotowy (8) wody oraz otwór wlotowy (7) powietrza, zaś jego pokrywa (1) jest wyposażona w otwór wylotowy (9) wody oraz otwór wylotowy (2) powietrza, jak również w otwór (3) do wprowadzania szczepionki do wnętrza fermentora.
5. Fermentor według zastrz. 3, znamienny tym, ze jego zbiornik składa się z kilku ustawionych jeden nad drugim i połączonych szczelnie ze sobą za pośrednictwem uszczelek (15) - segmentowych zbiorników pierścieniowych, przy czym w każdym z tych segmentowych zbiorników znajduje się półka modułowa (4) z podłożem namnazającym (5), wyposażona w element chłodzący (6), zaś miejsce jego połączenia z sąsiednim segmentowym zbiornikiem jest osłonięte za pomocą zewnętrznej osłony (16).
6. Fermentor według zastrz. 3, znamienny tym, że jego podłoże namnażające (5) stanowi porowaty granulat z dodatkiem roztworu pożywki.
7. Fermentor według zastrz. 3, znamienny tym, że jego podłoże namnazające (5) stanowi naturalny granulat z roślin zbożowych, z otrębów względnie z odpadów z produkcji cukru.
8. Fermentor według zastrz. 3, znamienny tym, że jest wyposażony w znajdującą się na najniższej półce modułowej (4) warstwę nawilżającą z materiału ziarnistego o bardzo dużej objętości porów, mającego właściwości absorbowania wody.