RU2136694C1 - Полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора и способ их получения - Google Patents
Полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора и способ их получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2136694C1 RU2136694C1 RU97107892/04A RU97107892A RU2136694C1 RU 2136694 C1 RU2136694 C1 RU 2136694C1 RU 97107892/04 A RU97107892/04 A RU 97107892/04A RU 97107892 A RU97107892 A RU 97107892A RU 2136694 C1 RU2136694 C1 RU 2136694C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polyethylene glycol
- polypeptide
- hgf
- mpeg
- hgfm
- Prior art date
Links
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims abstract description 66
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 title claims description 9
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 title claims description 5
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 title claims 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 62
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 claims abstract 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 3
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 5
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 53
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 19
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 17
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 10
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000000256 facial nerve Anatomy 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 5
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 5
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- -1 glycol aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride Chemical compound FC(F)(F)CS(Cl)(=O)=O CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 241001573498 Compacta Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical group CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 2
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000027 (C1-C10) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- JAPYIBBSTJFDAK-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tri(propan-2-yl)benzenesulfonyl chloride Chemical compound CC(C)C1=CC(C(C)C)=C(S(Cl)(=O)=O)C(C(C)C)=C1 JAPYIBBSTJFDAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APRZHQXAAWPYHS-UHFFFAOYSA-N 4-[5-[3-(carboxymethoxy)phenyl]-3-(4,5-dimethyl-1,3-thiazol-2-yl)tetrazol-3-ium-2-yl]benzenesulfonate Chemical compound S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=C(OCC(O)=O)C=CC=2)=NN1C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 APRZHQXAAWPYHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 108010041884 CD4 Immunoadhesins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229940060205 adagen Drugs 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- WVMHLYQJPRXKLC-UHFFFAOYSA-N borane;n,n-dimethylmethanamine Chemical compound B.CN(C)C WVMHLYQJPRXKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N boron;n-methylmethanamine Chemical compound [B].CNC RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 108010046910 brain-derived growth factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000191 poly(N-vinyl pyrrolidone) Polymers 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- CCOXWRVWKFVFDG-UHFFFAOYSA-N pyrimidine-2-carbaldehyde Chemical compound O=CC1=NC=CC=N1 CCOXWRVWKFVFDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000011421 subcutaneous treatment Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/839—Nerves; brain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Treatment Of Sludge (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- Treatment Of Water By Ion Exchange (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
Abstract
Полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора получают взаимодействием полипептида, выбранного из фактора роста, полученного из головного мозга (ФРГМ) и нейротрофина-3 (НТ-3), с полиэтиленгликолем в условиях восстановительного алкилирования при кислом рН. Способ обеспечивает получение гомогенных полимер/ФРГМ или полимер/НТ-3 коньюгатных молекул, имеющих непосредственно присоединенные остатки полиэтиленгликоля к ФРГМ или НТ-3. 3 c. и 11 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к новому классу производных ФРГМ и НТ-3, в которых молекула ФРГМ и НТ-3 присоединена к водорастворимому полимеру, а также к способу получения таких производных.
Предшествующий уровень техники
Терапевтически используемые белки в настоящее время доступны в соответствующих формах и в адекватных количествах в большой степени благодаря достижениям в технологии рекомбинантной ДНК. Химические производные таких белков могут эффективно блокировать протеолитические энзимы от физических контактов с основой самого белка, предотвращая таким образом его разрушение. Дополнительные преимущества могут включать, при определенных обстоятельствах повышение стабильности и времени циркуляции терапевтических белков, а также снижение иммуногенности.
Терапевтически используемые белки в настоящее время доступны в соответствующих формах и в адекватных количествах в большой степени благодаря достижениям в технологии рекомбинантной ДНК. Химические производные таких белков могут эффективно блокировать протеолитические энзимы от физических контактов с основой самого белка, предотвращая таким образом его разрушение. Дополнительные преимущества могут включать, при определенных обстоятельствах повышение стабильности и времени циркуляции терапевтических белков, а также снижение иммуногенности.
Однако необходимо отметить, что эффект от модификации определенных белков не может быть предсказан. Модификация и расщепление белка описаны в обзорной статье Focus on Growth Factors 3: 4-10, опубликованной Mediscript, Mountview Court, Frien Bamet Lane, Лондон, Англия (1992).
Полиэтиленгликоль ("ПЭГ" или "пэг") является одним из химических соединений, которое может быть использовано при получении ("пэгировании") терапевтических белковых продуктов. Например, Адаген@, представляющий собой пэгированную аденозиндеаминазу с успехом применяется для лечения болезней, однозначно связанных с иммунодефицитом; пэгированная супероксиддисмутаза была использована в клинических испытаниях при лечении травм головы; пэгированный 7а 0-интерферон был протестирован в первой фазе клинических испытаний для лечения гепатита; пэгированный гликоцеребразид и пэгированный гемоглобин также, как было сообщено, прошли предклинические испытания. Было показано, что для некоторые белков присоединение полиэтиленгликоля защищает от протеолиза Sada и др., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991). Способы присоединения остатков определенных полиэтиленгликолей доступны. См. US, патент N 4179337 (Davis и др.) и US, патент 4002531 (Royer).
Для модификации белков были использованы другие водорастворимые полимеры, такие, как сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливиниловый пирролидон, поли-1,3-диоксалан, поли-1,3,6-триоксан, сополимеры этилена/малеинового ангидрида и полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо нерегулярные полимеры).
Что касается полиэтиленгликоля, то для его присоединения к молекулам белка было использовано большое разнообразие способов. Обычно молекулы полиэтиленгликоля присоединяются к белку через белковую реакционноспособную группу. Аминогруппы, такие, как аминогруппы лизинового остатка или N- концевые аминогруппы, являются наиболее удобными для присоединения. Например, в патенте Royer , приведенном выше, раскрывается, что для присоединения молекул полиэтиленгликоля к энзиму используют восстановительное алкилирование. В описании к Европейскому патенту 0539167, опубликованному 28 апреля 1993 г. , раскрывается, что пептиды и органические соединения со свободной аминогруппой(ами) модифицируются с помощью имидных производных ПЭГ или родственных водорастворимых органических полимеров. US, патент N 4904584 (Shaw) раскрывает модификацию лизиновых остатков белков путем присоединения молекул полиэтиленгликоля через реакционноспособные аминогруппы.
Одним из специфических терапевтических белков, которые были химически модифицированы, является фактор, стимулирующий грануляцию колоний, т.е. ФСГК(G-CSF). См.публикацию европейского патента ЕР 0401384, ЕР 0473268 и ЕР 0335423. Другим примером является пэгированный IL-6, описанный в US патенте N 5264209 (Mikayama и др.). Также в опубликованном 11 сентября 1985 г описании к европейскому патенту 0154316, сообщается о взаимодействии лимфокина с альдегидом полиэтиленгликоля.
Пэгирование белковых молекул обычно приводит к образованию смеси химически модифицированных белковых молекул. Иллюстрацией может служить следующее, белковая молекула с пятью лизиновыми остатками и одной свободной N-концевой аминогруппой, вступающая в реакцию в соответствии с приведенными выше способами, образует гетерогенную смесь, в которой некоторые из белков имеют шесть полиэтиленгликолевых остатков, некоторые пять полиэтиленгликолевых остатков, некоторые четыре, некоторые три, некоторые два, некоторые один и некоторые ноль (0). Среди молекул с несколькими остатками аминокислот остатки полиэтиленгликоля могут не присоединяться по одним и тем же положениям разных молекул. Приведенные выше способы обычно требуют наличия связывающей группы между белком и молекулой полиэтиленгликоля. Процесс, описанный Delgado и др. в "Присоединение ПЭГ к белку с использованием активации трезил хлоридом применительно к распределению иммуноаффиности клеток", Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications in Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, Нью-Йорк, NY(1989), стр. 211-213, включает использование трезил хлорида, и осуществляется без связывающей группы между полиэтиленгликолем и остатком белка. Этот способ может вызывать затруднения в случае его использования для получения терапевтических продуктов, поскольку использование трезил хлорида может привести к образованию токсичных побочных продуктов.
Chamow и др., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) описали модификацию CD-4 иммуноадгезина с помощью монометоксиполиэтиленгликоль ("МеПЭГгликоль") альдегида путем восстановительного алкилирования. Авторы сообщили, что связывающая способность in vitro модифицированного CD4 IgG (к белку гр 120) снижается со скоростью, коррелируемой степенью МеПЭГирования.
Фактор роста, полученный их головного мозга, ФРГМ (Brain derived growth factor, ФРГМ) и нейротрофин-3 (NT-3, HT-3) являются известными полипептидами, принадлежащими к известному классу нейротрофических факторов, называемых нейротрофинами, которые включают фактор роста нерва, ФРН (NGF). Эти факторы промотируют сохранение и поддержание функций нейронов и являются наиболее приемлемыми для терапевтического лечения нейродегенеративных заболеваний. Barde и др. , Neuron 2: 1525-1534 (1989); Snider и др. Cell 77: 627-638 (1994). Способы идентификации и рекомбинатного получения этих факторов были описаны в патентной литературе; см. US, патент N 5169762 (Gray и др.) для ФРН, US, патент N 5180820 (Barde и др.) и 5229500 (Barde и др.) для ФРГМ, a WO 91/03569 для НТ-3.
Сущность изобретения
Вкратце одним из аспектов настоящего изобретения является получение ФРГМ и НТ-3 производных, в которых ФРГМ или НТ-3 полипептидные остатки присоединяются к водорастворимым полимерам.
Вкратце одним из аспектов настоящего изобретения является получение ФРГМ и НТ-3 производных, в которых ФРГМ или НТ-3 полипептидные остатки присоединяются к водорастворимым полимерам.
В особенности настоящее изобретение включает производные ФРГМ и НТ-3, в соответствии с которым полипептиды взаимодействуют с реакционноспособными (т. е. "активированными") водорастворимыми полимерами таким образом, чтобы присоединить полимер к полипептиду. Такое присоединение может быть осуществлено с помощью реакций, обсужденных здесь, а именно, с помощью ацилирования или алкилирования. Ацилирование или алкилирование с использованием полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера может быть проведено при условиях, при которых в основном образуются моно- или полипроизводные. Полиприсоединение обычно включает присоединение полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера к ∈-аминогруппе лизинового остатка полипептида и может дополнительно включать присоединение полимера к N-концевому остатку полипептида. Моноприсоединение предпочтительно включает присоединение полимера к α-аминогруппе N-концевого остатка ФРГМ или НТ-3 полипептидного остатка, обеспечивая при этом селективное присоединение водорастворимого полимера именно к N-концу полипептида. Это приводит к получению, по существу, гомогенных полимер/ФРГМ или полимер/НТ-3 конъюгатных молекул, также, как (если используется полиэтиленгликоль) к получению пэгированных ФРГМ или НТ-3 молекул, имеющим непосредственно присоединенные остатки полиэтиленгликоля к ФРГМ или НТ-3.
Производные ФРГМ и НТ-3 в соответствии с настоящим изобретением являются наиболее полезными для тех же целей, для которых, как известно, полезны трофические факторы ФРГМ и НТ-3, в частности для промотирования сохранения и поддержания нейронов in vitro и in vivo, а также, в качестве потенциальных терапевтических агентов для лечения нейродегенеративных болезней человека, таких, как болезнь Паркинсона, амиотрофильный латеральный склероз (ALS), болезнь Хантингтона (Huntington), ретинальной дегенерации, периферического нервного заболевания, болезни Алзхеймера (Alzheimer), а также других. Как показано в некоторых из примеров, приведенных ниже, присоединение, проводимое в соответствии с настоящим изобретением, может также приводить к усилению способности молекул мигрировать через ткань мозга, что облегчает подачу их к терапевтическим целям, находящимся внутри мозга.
Другим аспектом изобретения, который также детально раскрыт ниже, является обеспечение способа получения производных ФРГМ и НТ-3 в соответствии со способами, приведенными выше, в которых водорастворимые полимеры, в особенности полиэтиленгликоль, присоединяются к N-концевой α - аминогруппе полипептида (ФРГМ или НТ-3), для образования гомогенной популяции производных молекул, т.е. конъюгатов этих полипептидов с полимером.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 : приведен пример ацилирования ФРГМ или НТ-3 с использованием N-гидроксисукцинимидил (NHS) активных эфиров монометоксиполиэтиленгликоль альдегидов с образованием полипэгированного продукта. На этой фигуре k обозначает число МПЭГ молекул, реагирующих с молекулой ФРГМ или НТ-3, n обозначает степень полимеризации МПЭГ, использованных в реакции (где n = 2000 для МПЭГ, имеющего молекулярный вес 100 кД и n=40 для МПЭГ, имеющего молекулярный вес 2 kD), и m обозначает общее число первичных аминогрупп в ФРГМ или НТ-3 молекуле.
Фигура 1 : приведен пример ацилирования ФРГМ или НТ-3 с использованием N-гидроксисукцинимидил (NHS) активных эфиров монометоксиполиэтиленгликоль альдегидов с образованием полипэгированного продукта. На этой фигуре k обозначает число МПЭГ молекул, реагирующих с молекулой ФРГМ или НТ-3, n обозначает степень полимеризации МПЭГ, использованных в реакции (где n = 2000 для МПЭГ, имеющего молекулярный вес 100 кД и n=40 для МПЭГ, имеющего молекулярный вес 2 kD), и m обозначает общее число первичных аминогрупп в ФРГМ или НТ-3 молекуле.
Фигура 2 : приведен пример неспецифического восстановительного алкилирования ФРГМ (или НТ-3) с использованием монометоксиполиэтиленгликоль активных альдегидов с получением полипэгированного продукта. На этой фигуре k, m, и n имеют указанные выше обозначения.
Фигура 3 : приведен пример направленного восстановительного алкилирования ФРГМ или НТ-3 по α -аминогруппе на N-конце в полипептиде, с использованием монометоксиполиэтиленгликоль активного альдегида с образованием, по существу, монопэгированного продукта (на N-концевой группе).
Фигура 4: изображена иммуногистохимия ацетилхолинтрансферазы (АХТ) аксотомизированных лицевых мотонейронов на модели животного in vivo при потере функции периферального нерва. Yan и др. , J.Neurosci. 14(9) :5281-5291 (1994). Рассекают правые лицевые нервы взрослых женских особей крыс, после чего животным вводят подкожно каждый день в течение семи дней следующее: Фосфатно-буферный раствор PBS(A), непэгированный ФРГМ в дозе 5 миллиграмм на килограмм живого веса, мг/кг (В), пэгированный по N-концу ФРГМ в дозе 0,3 мг/кг (C), или регулярный пэгированный ФРГМ в дозе 0,3 мг/кг (D). В случае PBS-обработанных крыс аксотомия приводит к сильному снижению АХТ иммунореактивности поврежденного лицевого ядра. (часть A лицевое нервное ядро на правой стороне). В противоположность, обработка как непэгированным ФРГМ, так и пэгированным ФРГМ (части B.C.D) ослабляет вызванное повреждением снижение АХТ иммунореактивности. Введены следующие обозначения: FN, лицевое ядро, ру, пиримидальный след, Sp5 -центральное ядро тригеминальной мышцы. Масштабная отметка (часть D) соответствует 1 мм.
Фигура 5 : изображена кривая зависимости от дозы, полученная при обработке испытуемых животных с помощью непэгированного ФРГМ и пэгированного ФРГМ в тех же моделях аксотомизированных лицевых мотонейронов, которые изображены на фигуре 4. Животные получали ежедневную подкожную инъекцию (s.c.) только растворитель (°), непэгированный ФРГМ (□), N-концевой пэгированный ФРГМ (•) или нерегулярный пэгированный ФРГМ (■) в дозах, отражающих период в семь дней. Значения представлены как средние ± SEM (n=4). Полученные результаты анализируют с помощью ANOVA, с последующим t тестом Диннетта (Dunnett). *, p<0,05; **, p, 0,01, ФРГМ обработки в сравнении с растворителем.
Фигура 6: изображена диаграмма, отражающая проникновение непэгированного ФРГМ ("NAT-ФРГМ") или пэгированного ФРГМ ("ПЭГ-ФРГМ") в мозг живых крыс после одноразовой инъекции в центр правого неостриатума. Двадцать часов спустя животные были усыплены обработкой 4%-ным параформальдегидом. Мозги были удалены, рассечены и помечены специальным антителом для ФРГМ с использованием процесса, описанного Yan и др. в Soc. Neurosci. Abs. 20: 1306(1994). Общий объем проникновения ФРГМ в ткань мозга подсчитывали по интеграции всех ФРГМ иммунореактивных тканевых секций. Значения представлены как средние ± SEM (n=4). Результаты анализируют с помощью Student t теста. *, p<0,0001.
Фигура 7: изображена диаграмма, отражающая проникновение непэгированного ФРГМ и пэгированного ФРГМ в мозг живых крыс после продолжающегося локального воздействия в течение периода, составляющего семь дней. Общий объем проникновения ФРГМ, как было подсчитано, оказался таким, как на фигуре 6. Значения представлены как средние ±SEM (n=4). Результаты анализируют с помощью Student t теста. *, p<0,0001.
Фигура 8: отражает обратное перемещение через ткань мозга непэгированного ФРГМ (части A и B) и пэгированного ФРГМ (части C и D) к локализованным снаружи допаминэргическим нейронам после инфузии в неостриатум головного мозга живых крыс, используя тот же процесс, который описан на фигуре 7. Части B и D представляют собой увеличение прямоугольных секций в частях A и C, соответственно. Обозначения в части A имеют следующие значения: SNC, субстанция nigra compacta, SNR, субстанция nigra reticulata; и VTA, площадь брюшной полости. Прямоугольник в части D составляет 500 μ для частей A и C и 200 μ для частей B и D.
Детальное описание изобретения
Рассматриваются для использования в сфере применения настоящего изобретения ФРГМ и НТ-3 природной (т.е. существующей в природе) последовательности, также, как их фрагменты, предшественники и полипептидные молекулы, представляющие одну или более аминокислотных заместителей, исключений или добавок, полученных из природных последовательностей, которые проявляют биологические свойства аналогично молекулам с природной последовательностью, например, химеры, аналоги и тому подобное. Таким образом, если здесь не будет оговорено особо, под терминами"ФРГМ" и "НТ-3" подразумевают полипептиды любой из оговоренных выше форм.
Рассматриваются для использования в сфере применения настоящего изобретения ФРГМ и НТ-3 природной (т.е. существующей в природе) последовательности, также, как их фрагменты, предшественники и полипептидные молекулы, представляющие одну или более аминокислотных заместителей, исключений или добавок, полученных из природных последовательностей, которые проявляют биологические свойства аналогично молекулам с природной последовательностью, например, химеры, аналоги и тому подобное. Таким образом, если здесь не будет оговорено особо, под терминами"ФРГМ" и "НТ-3" подразумевают полипептиды любой из оговоренных выше форм.
Способы, которые известны для получения ФРГМ и НТ-3, относятся, в частности, к рекомбинатных способам, которые являются наиболее типичными для получения их в больших количествах. Наиболее применительные процессы, описанные в научной и патентной литературе, включают такие, которые упоминались ранее в патентах Соединенных Штатов 5180820 и 5229500, а также в опубликованном описании PCT WO 91/03569. Особенно предпочтительны для использования на практике в соответствии с настоящим изобретением ФРГМ и НТ-3 природной последовательности аналогично выделенным рекомбинатно в прокариотических и эукариотических клетках, включая рекомбинатные полипептидные продукты, по выделенным из нуклеотидных последовательностей человека ("r-ЧФРГМ " и "r-ЧНТ-3"), включая выделяемые в бактериальных клетках, содержащих N-концевые остатки метионина (например, "r-metФРГМ" и "r-metHT-3"). Примерами таких полипептидов являются такие, которые имеют последовательность, показанную в SEQ ID N: 1 ("r-Ч-ФРГМ"), SEQ ID N:2 ("r-metЧ-ФРГМ"), SEQ ID N: 3 ("r-Ч-НТ-3") и SEQ ID N: 4 ("r-met4-HT-3").
Пэгирование ФРГМ и НТ-3 может быть осуществлено с помощью любой реакции пэгирования, известной в этой области. См., например; Focus on Growth Factors 3(2): 4-10 (1992); ЕР 0154316; ЕР 0401384 и другие публикации, упомянутые здесь и относящиеся к пэгированию. Предпочтительно, пэгирование проводят путем реакции ацилирования или алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичного реакционноспособного водорастворимого полимера). Эти предпочтительные способы для присоединения с помощью полиэтиленгликоля обсуждены ниже в деталях.
Ацилирование
Пэгирование путем ацилирования обычно включает взаимодействие активного эфирного производного полиэтиленгликоля (ПЭГ) с ФРГМ и НТ-3 полипептидом. Фактически любая реакционноспособная молекула ПЭГ может быть использована для пэгирования этих полипептидов. Предпочтительным активным ПЭГ эфиром является ПЭГ, этерифицированный N- гидроксисукцинимидом ("NHS"). В понятие "ацилирование" здесь включают, но не ограничивают их, следующие типы связывающих групп между ФРГМ или НТ-3 и водорастворимыми полимерами, такими, как ПЭГ: амидные, карбоматные, уретановые и тому подобное; см. Bioconjugate Chem. 5: 133-140(1994). Условия реакции могут быть выбраны в соответствии с известными в этой области или усовершенствованы, однако необходимо избегать таких условий, как температура, растворитель и pH, которые будут инактивировать модифицируемые ФРГМ и НТ-3 образования. Условия реакции, которые обычно применяют, будут описаны ниже. Типичная реакция с NHS эфиром монометокси-ПЭГ зафиксирована на фигуре 6.
Пэгирование путем ацилирования обычно включает взаимодействие активного эфирного производного полиэтиленгликоля (ПЭГ) с ФРГМ и НТ-3 полипептидом. Фактически любая реакционноспособная молекула ПЭГ может быть использована для пэгирования этих полипептидов. Предпочтительным активным ПЭГ эфиром является ПЭГ, этерифицированный N- гидроксисукцинимидом ("NHS"). В понятие "ацилирование" здесь включают, но не ограничивают их, следующие типы связывающих групп между ФРГМ или НТ-3 и водорастворимыми полимерами, такими, как ПЭГ: амидные, карбоматные, уретановые и тому подобное; см. Bioconjugate Chem. 5: 133-140(1994). Условия реакции могут быть выбраны в соответствии с известными в этой области или усовершенствованы, однако необходимо избегать таких условий, как температура, растворитель и pH, которые будут инактивировать модифицируемые ФРГМ и НТ-3 образования. Условия реакции, которые обычно применяют, будут описаны ниже. Типичная реакция с NHS эфиром монометокси-ПЭГ зафиксирована на фигуре 6.
Пэгирование с помощью ацилирования обычно приводит к образованию пэгированного ФРГМ или НТ-3 продукта, в котором ∈-аминогруппы лизина пэгируется через ацильную связывающую группу. Предпочтительной связывающей группой будет амидная группа. Также предпочтительно, что полученный продукт будет, по существу, (например, ≥ 95%) моно, ди- или трипэгированным. Однако некоторые продукты с высокой степенью пэгирования (вплоть до максимального числа ∈- аминогрупп лизина ФРГМ и НТ-3 плюс одна α- аминогруппа на N-конце ФРГМ и НТ-3) будут, как правило, образовываться в количестве, которое определяется специфическими условиями реакции, которые используют. В случае необходимости более очищенный пэгированный продукт может быть выделен из смеси, содержащей непрореагировавшие соединения с использованием стандартных методов очистки, включающих среди других диализ, высаливание, ультрафильтрацию, неионную хроматографию, гельфильтрацию, хроматографию и электрофорез.
Алкилирование
Пэгирование путем алкилирования обычно включает взаимодействие альдегидного производного ПЭГ с полипептидом, таким, как ФРГМ или НТ-3 в присутствии восстанавливающего агента. Пэгирование путем алкилирования может также приводить к полипэгированным ФРГМ и НТ-3. Типичный пример восстановительного алкилирования с образованием полипэгированного продукта приведен на фигуре 7. Кроме того, возможно в данном процессе создать такие условия, как перечисленные выше, которые приведут к преимущественному пэгированию только по α- аминогруппе на N-конце ФРГМ или НТ-3 полипептида (например, монопэгированным продуктам). Типичный пример восстановительного алкилирования ФРГМ и НТ-3 с образованием монопэгированного продукта приведен на фигуре 8. В любом из случаев как монопэгирования, так и полипэгирования, ПЭГ группы предпочтительно присоединяются к полипептиду через группу -CH2-NH-. Учитывая, что данная группа имеет остаток -CH2-, этот тип связи в данном описании определен как связь "алкил".
Пэгирование путем алкилирования обычно включает взаимодействие альдегидного производного ПЭГ с полипептидом, таким, как ФРГМ или НТ-3 в присутствии восстанавливающего агента. Пэгирование путем алкилирования может также приводить к полипэгированным ФРГМ и НТ-3. Типичный пример восстановительного алкилирования с образованием полипэгированного продукта приведен на фигуре 7. Кроме того, возможно в данном процессе создать такие условия, как перечисленные выше, которые приведут к преимущественному пэгированию только по α- аминогруппе на N-конце ФРГМ или НТ-3 полипептида (например, монопэгированным продуктам). Типичный пример восстановительного алкилирования ФРГМ и НТ-3 с образованием монопэгированного продукта приведен на фигуре 8. В любом из случаев как монопэгирования, так и полипэгирования, ПЭГ группы предпочтительно присоединяются к полипептиду через группу -CH2-NH-. Учитывая, что данная группа имеет остаток -CH2-, этот тип связи в данном описании определен как связь "алкил".
Присоединение путем восстановительного алкилирования для получения монопэгированного продукта основано на различной реакционноспособности различных типов первичных аминогрупп (лизина и, в противоположность N- концевой группы), способных к замещению в ФРГМ или НТ-3. Реакция проводится при pH (см. ниже), которая позволяет использовать различные значения рКа ∈- аминогрупп лизиновых остатков и соответственно N-концевой α аминогруппы полипептида. Такой селективно протекающий процесс присоединения водорастворимого полимера, который содержит такую реакционноспособную группу, как альдегидная, к полипептиду возможно контролировать. Конъюгация с полимером предпочтительно протекает по N-концу полипептида и при этом практически не затрагивает никакие другие реакционноспособные группы, например такие, как боковые аминогруппы лизина. Одним из важных аспектов настоящего изобретения является обеспечение, по существу, гомогенного получения монополимер/ФРГМ или монополимер/НТ-3 конъюгатных молекул, обозначенных ФРГМ или НТ-3, к которым молекула полимера был присоединена, по существу, (т.е. ≥ 90%) строго локализовано. Более характерно, в случае использования полиэтиленгликоля настоящее изобретение также обеспечивает получение пэгированного ФРГМ или НТ-3 возможно при отсутствии антигенных связывающих групп, при этом молекула полиэтиленгликоля непосредственно присоединяется к ФРГМ или НТ-3 полипептиду.
Таким образом, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к пэгированным ФРГМ и НТ-3, в которых ПЭГ группа(ы) присоединена (присоединены) через ацильные или алкильные связывающие группы. Как уже было обсуждено выше, такие продукты могут быть как монопэгированными, так и полипэгированными (например, содержащими 2-6, предпочтительно 2-5, ПЭГ группы). ПЭГ группы обычно присоединяются к полипептиду по α- и/или ∈- аминогруппе цепи полипептида, но также предполагается, что ПЭГ группы могут быть присоединены к любой аминогруппе полипептидной структуры, которая достаточно реакционноспособна, чтобы к ней могла быть присоединена ПЭГ группа при соответствующих условиях реакции.
Молекулы полимера, которые используют как при присоединении алкилированием, так и ацилированием, могут быть выбраны среди водорастворимых полимеров или их смесей. Выбранный полимер должен быть растворим в воде, так чтобы полипептид, к которому он присоединяется, не выпадал в осадок в водной среде, а именно физиологической среде. Выбранный полимер должен быть модифицирован и иметь одну реакционноспособную группу, такую, как активную эфирную группу для процесса ацилирования или альдегидную группу для процесса алкилирования, предпочтительно, такие группы, при которых можно контролировать степень полимеризации, что обеспечивается настоящим способом. Предпочтительным реакционноспособным ПЭГ альдегидом является пропиональдегид, который является устойчивым в воде соединением, или его моно C1-C10 алкокси или арилоксипроизводные. (см. US, патент 5252714). Полимер может быть прямым или разветвленным. Предпочтительно для терапевтического использования полученного конечного продукта, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. Водорастворимые полимеры могут быть выбраны из группы, состоящей, например, из полиэтиленгликоля (например, монометоксиполиэтиленгликоля), декстрана, поли-(N-винилпирролидона), гомополимеров пропиленгликоля, сополимеров оксида полипропилена/оксида этилена, полиоксиэтилированных полиолов (например, глицерина) и поливиниловых спиртов. Для реакций ацилирования выбранные полимеры должны иметь единственную реакционноспособную эфирную группу. Для используемого по изобретению восстановительного алкилирования выбранный полимер должен иметь единственную альдегидную группу. Обычно водорастворимый полимер не выбирают из природных углеводных остатков, поскольку их обычно получают более удобным способом, а именно с помощью рекомбинатной системы экспрессии животных. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть как прямым, так и разветвленным.
Наиболее предпочтительным водорастворимым полимером в соответствии с настоящим изобретением является полиэтиленгликоль. Под определением полиэтиленгликоль в данном случае подразумевают любую форму ПЭГ, которую использовали для присоединения к другим белкам, а именно MOHO-(C1-C10) алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоля.
Обычно присоединение может быть осуществлено при любых подходящих условиях, используемых в случае реакции биологически активного соединения с активизированной водорастворимой молекулой полимера. Способы получения пэгированных ФРГМ или НТ-3 обычно включают следующие стадии: а) взаимодействие ФРГМ или НТ-3 полипептида с полиэтиленгликолем (реакционноспособное эфирное или альдегидное производное ПЭГ) в условиях, при которых ФРГМ или НТ-3 оказываются присоединенными к одной или нескольким ПЭГ группам, и b) получение целевого продукта. Обычно оптимальные условия проведения процесса ацилирования от случая к случаю определяют исходя из известных параметров, а также желаемого результата. Например, чем больше соотношение ПЭГ : белок, тем выше процент полипэгированного продукта.
В соответствии с настоящим изобретением способ восстановительного алкилирования, приводящий к, по существу, гомогенной популяции монополимер/полипептид конъюгатных молекул обычно включает стадии: а) взаимодействия ФРГМ или НТ-3 полипептида с реакционноспособной ПЭГ молекулой в условиях восстановительного алкилирования, при pH, подходящей для осуществления селективной модификации α -аминогруппы на аминоконце полипептида и b) получение целевого продукта.
Для получения в основном гомогенной популяции монополимер/ФРГМ или монополимер/НТ-3 конъюгатных молекул восстановительное алкилирование проводят при таких условиях, которые позволяют провести селективное присоединение водорастворимого остатка полимера к N-концу полипептида. Такие условия проведения реакции обычно предусматривают различия в значениях рКа для ε -аминогрупп лизина и концевой α -аминогруппой (рКа определяется значением pH, при котором 50% аминогрупп протонированы и 50% - нет). Кроме того, pH влияет на соотношение полимера к полипептиду, которое должно быть использовано. Обычно, если значение pH низкое, необходим больший избыток полимера по отношению к полипептиду (т.е., чем менее реакционноспособна N-концевая α -аминогруппа, тем больше требуется полимера для достижения оптимальных условий). Если значение pH высокое, соотношение полимер:полипептид, которое требуется, не должно быть высоким (например, чем более реакционноспособные группы доступны, тем менее молекул полимера требуется). Для выполнения целей в соответствии с настоящим изобретением значение pH обычно находится в интервале от 3-9, предпочтительно, 3-6.
Другим важным условием является молекулярный вес полимера. Обычно, чем выше молекулярный вес полимера, тем меньшее число молекул полимера может быть присоединено к полипептиду. Одновременно должна приниматься во внимание при оптимизации условий процесса разветвленность полимера. Обычно, чем выше молекулярный вес (или чем больше разветвленность), тем выше соотношение полимер: полипептид. Обычно для реакции пэгирования, рассматриваемой здесь, предпочтительно использовать полимер со средним молекулярным весом, составляющим от около 2кД до около 100 1 кД (определение "около" обозначает ± 1 кД). Более предпочтителен средний молекулярный вес от около 5 кД до около 50 кД, и особенно, от около 12 кД до около 25 кД. Соотношение водорастворимого полимера и ФРГМ или НТ-3 будет обычно находиться в интервале от 1:1 до 100: 1, предпочтительно, (для полипэгирования) от 1:1 до 20:1 и (для монопэгирования) от 1:1 до 5:1.
Используя условия, оговоренные выше, восстановительное алкилирование в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает селективное присоединение полимера либо к ФРГМ, либо к НТ-3 полипептидной цепи белка, имеющей α - аминогруппу на аминоконце, а также обеспечивает, по существу, гомогенное получение конъюгата монополимер/полипептидный белок. Термин "монополимер/полипептидный конъюгат" используют здесь для обозначения композиции, состоящей из одной молекулы полимера, присоединенной к ФРГМ или НТ-3 молекуле. Монополимер/полипептидный конъюгат будет иметь молекулу полимера, локализованную на N-конце, но не на лизиновых боковых группах. Получение будет проходить предпочтительно с выходом более чем 80% конъюгата монополимер/полипептид, предпочтительно, более чем 90% конъюгата монополимер/полипептид, и некоторым остатком непрореагировавших молекул (например, полипептидов, не присоединившихся к полимеру). Примеры, приведенные ниже, обеспечивают получение конъюгата монополимер/полипептид с выходом по крайней мере около 90%, при этом непрореагировавший полипептид составляет около 10%. Конъюгат монополимер/полипептид является биологически активным.
Для предложенного здесь восстановительного алкилирования, восстановитель должен быть устойчивый в водном растворе и, предпочтительно, должен обладать способностью восстанавливать только основания Шиффа, образующиеся на начальном этапе процесса восстановительного алкилирования. Предпочтительные восстановители могут быть выбраны из группы, состоящей из натрий боргидрида, натрий цианоборгидрида, диметиламинборана, триметиламинборана или пиридинборана. Особенно предпочтительным восстанавливающим агентом является натрий цианоборгидрид.
Другие параметры реакции, такие, как растворитель, реакционное время, температура, и т.д., также, как способы очистки продуктов, могут быть определены от случая к случаю, основываясь на опубликованной информации, касающейся процессов взаимодействия белков с водорастворимыми полимерами (см. приведенные здесь публикации). Типичные детали процесса отражены в примерах, приведенных ниже.
Возможно выбрать путь приготовления смеси полимер/полипептидного конъюгата ацилированием и/или алкилированием, при этом преимущество, которое обеспечивается настоящим изобретением, заключается в том, что возможно подобрать пропорцию монополимер/полипептидного конъюгата, которая будет содержаться в смеси. Так, при желании, возможно приготовить смесь различных полипептидов с различным числом присоединенных молекул полимера (например, ди-, три-/тетра-, и т.д.) и смешать с конъюгатным монополимер/полипептидным продуктом, полученным с использованием данных способов, и иметь, таким образом, смесь с предопределенной пропорцией мономер/полипептидного конъюгата.
Как было отмечено, полимер/полипептидные конъюгаты в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для тех же целей, для которых используются ФРГМ и НТ-3. Ранее было показано, что эти полипептиды могут быть эффективными, например, в качестве трофических факторов, которые промотируют сохранение и поддержание нейронов in vitro, делая пригодным изучение и использование нейронов в исследованиях. Такие клетки обычно бывает затруднительно сохранять живыми в культуре. Нейтроны же, с той же самой биологической активностью позволяют использовать эти факторы для нейрологических исследований in vivo на животных и являются потенциальными терапевтическими агентами для лечения нейродегенеративных заболеваний, которые связаны с потерей нейронной функции.
Для терапевтических целей из полимер/полипептидных конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены лекарственные средства и введены с любым биосовместимым фармацевтическим носителем, включая, но не ограничивая и такие, как физиологический раствор, буферный физиологический раствор, декстрозу и воду. Количество ФРГМ/полимерного или НТ-3/полимерного конъюгата, которое будет эффективно при лечении определенного нарушения или состояния, будет зависеть от природы нарушения или состояния и может быть определено с помощью стандартной клинической техники. По возможности, желательно определить кривую зависимости от дозы фармацевтической композиции по изобретению вначале in vitro, например, как в ФРГМ и НТ-3 системах для количественного определения биологической активности, описанных в литературе, а затем на полезных моделях животных, прежде чем проводить тесты на человеке. Способы введения будут включать подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, легочный и оральный. Кроме того, может возникнуть потребность во введении фармацевтической композиции в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая интравентрикулярную или подоболочечную инъекцию. Далее, может возникнуть потребность во введении фармацевтической композиции локально на участок, который нуждается в обработке. Это возможно осуществить, например, с помощью локальной инфузии во время операции, инъекции, через катетер, или с использованием имплантата из пористого, непористого, желатинового, волокнистого или пленочного материала.
Экспериментальная часть
В последующем тексте описано получение некоторых ФРГМ и НТ-3 производных в соответствии с настоящим изобретением, а также их физические и биологические свойства. Эти примеры приведены для более полной характеристики изобретения, но не ограничивают его. В этих примерах используют человеческие ФРГМ и НТ-3, полученные рекомбинантно в E. coli (например, r-met ЧФРГМ и r-met ЧHT-3), если иное не оговорено специально.
В последующем тексте описано получение некоторых ФРГМ и НТ-3 производных в соответствии с настоящим изобретением, а также их физические и биологические свойства. Эти примеры приведены для более полной характеристики изобретения, но не ограничивают его. В этих примерах используют человеческие ФРГМ и НТ-3, полученные рекомбинантно в E. coli (например, r-met ЧФРГМ и r-met ЧHT-3), если иное не оговорено специально.
Пример 1
Получение моноМПЭГ(6kД-ФРГМ конъюгата с присоединением по N-конпевой α -аминогруппе (ам)
К охлажденному (4oC) перемешиваемому раствору r-met-ЧФРГМ (2,5 мг/мл) в 100 мМ фосфате натрия, pH 4,0, содержащему 20 мМ NaCNBH3, прибавляют 2-х кратный молярный избыток активированного метоксиполиэтиленгликоль (МПЭГ) альдегида, имеющего средний молекулярный вес 6000 дальтон (т.е. 6 кД).
Получение моноМПЭГ(6kД-ФРГМ конъюгата с присоединением по N-конпевой α -аминогруппе (ам)
К охлажденному (4oC) перемешиваемому раствору r-met-ЧФРГМ (2,5 мг/мл) в 100 мМ фосфате натрия, pH 4,0, содержащему 20 мМ NaCNBH3, прибавляют 2-х кратный молярный избыток активированного метоксиполиэтиленгликоль (МПЭГ) альдегида, имеющего средний молекулярный вес 6000 дальтон (т.е. 6 кД).
Степень модификации белка в процессе реакции анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superose 6HR 10/30 (Pharmacia), при элюировании со скоростью потока 0,4 мл/мин с помощью 100 мМ натрий фосфата, pH 6,9, содержащего 0,5 NaCl. Через десять часов анализ с помощью эксклюзионной хроматографии показал, что все полипептиды (которые существуют в растворе в виде димеров) были в значительной степени превращены в две возможные формы N-концевых пэгированных производных: МПЭГ конъюгированных по одной или обеим N-концевым группам димера ФРГМ.
Реакционную смесь разбавляют в общей сложности в пять раз стерилизованной водой и помещают на ионообменную колонку HiLoad 16/10 S Sephorose HP (Pharmacia), заполненную 20 мМ буферным раствором фосфата натрия, pH 7,5. Реакционную смесь загружают в колонку со скоростью потока 1 мл/мин, при этом непрореагировавший МПЭГ альдегид элюируют с помощью трех колоночных объемов того же буфера. Линейный пятисотминутный градиент от 0% до 100% 20 мМ натрий фосфата, pH 7,5, содержащий 0,75 М NaCl, используют для элюирования двух форм N-концевых пэгированных ФРГМ димера. Фракции, содержащие МПЭГ-ФРГМ производные, собирают, концентрируют и фильтруют в стерильных условиях.
Пример 2
Получение моноМПЭГ(20 kД)-ФРГМ конъюгата с боковым присоединением по N-концпевой α -аминогруппе(ам)
Повторяют процесс по примеру 1 за исключением того, что используют метоксиполиэтиленгликоль(МПЭГ) альдегид с молекулярным весом 20.000 дальтон (20 kД) и pH 5,0.
Получение моноМПЭГ(20 kД)-ФРГМ конъюгата с боковым присоединением по N-концпевой α -аминогруппе(ам)
Повторяют процесс по примеру 1 за исключением того, что используют метоксиполиэтиленгликоль(МПЭГ) альдегид с молекулярным весом 20.000 дальтон (20 kД) и pH 5,0.
Пример 3
Получение полиМПЭПГ(6kД)-ФРГМ конъюгатов путем восстановительного алкилирования с помощью МПЭГ альдегидов
К охлажденному (4oC) перемешиваемому раствору r-met ЧФРГМ (10 мг/мл) в 100 мМ BICINE, pH 8, содержащем 20 мМ NaCNBH3, прибавляют 4-х кратный молярный избыток метоксиполиэтиленгликоль (МПЭГ)активированного альдегида, имеющего средний молекулярный вес 6 кД.
Получение полиМПЭПГ(6kД)-ФРГМ конъюгатов путем восстановительного алкилирования с помощью МПЭГ альдегидов
К охлажденному (4oC) перемешиваемому раствору r-met ЧФРГМ (10 мг/мл) в 100 мМ BICINE, pH 8, содержащем 20 мМ NaCNBH3, прибавляют 4-х кратный молярный избыток метоксиполиэтиленгликоль (МПЭГ)активированного альдегида, имеющего средний молекулярный вес 6 кД.
Степень модификации белка в процессе реакции анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superose 6HR 10/30 (Pharmacia), при элюировании при 0,4 мл/мин, с помощью 100 мМ фосфата натрия, pH 6,9, содержащего 0,5 М NaCl Через десять часов анализ с помощью эксклюзивной хроматографии показал, что все полипептиды были модифицированы с помощью МПЭГ.
Реакционную смесь затем разбавляют пятикратным количеством стерилизованной воды, pH доводят до 7 (используя фосфорную кислоту), и смесь помещают на ионообменную колонку HiLoad 16/10 S Sepharose HP (Pharmacia), заполненную 20 мМ натрий фосфатным буфером, pH 7,5. Реакционную смесь загружают на колонку при скорости потока 1 мл/мин и непрореагировавший МПЭГ альдегид элюируют с помощью 3-х колоночных объемов того же буфера. Линейный пятисотминутный градиент от 0% до 100% 20 мМ натрий фосфата, pH 7,5, содержащий 0,75 NaCl, используют для элюирования МПЭГ-ФРГМ конъюгатов. Фракции, содержащие МПЭГ-ФРГМ конъюгаты, собирают, концентрируют и фильтруют в стерильных условиях.
Пример 4
Получение полиМПЭГ(6kД)-ФРГМ коньюгатов путем восстановительного ацилирования с помощью МПЭГ альдегидов
Повторяют процесс по примеру 3, за исключением того, что используют шестикратный молярный избыток МПЭГ альдегида.
Получение полиМПЭГ(6kД)-ФРГМ коньюгатов путем восстановительного ацилирования с помощью МПЭГ альдегидов
Повторяют процесс по примеру 3, за исключением того, что используют шестикратный молярный избыток МПЭГ альдегида.
Пример 5
Получение полиМПЭГ(6 kД)-ФРГМ конъюгатов путем ацилирования с помощью активированных МПЭГ производных
К охлажденному (4oC) перемешиваемому раствору r-metЧФРГМ (6 мг/мл) в 0,1 М BICINE буфере, pH 8, прибавляют четырехкратный молярный избыток сукцинимидилового эфира карбоксиметил МПЭГ со средним молекулярным весом 6 кДа. Полимер растворяют при легком перемешивании и реакцию выдерживают при той же температуре.
Получение полиМПЭГ(6 kД)-ФРГМ конъюгатов путем ацилирования с помощью активированных МПЭГ производных
К охлажденному (4oC) перемешиваемому раствору r-metЧФРГМ (6 мг/мл) в 0,1 М BICINE буфере, pH 8, прибавляют четырехкратный молярный избыток сукцинимидилового эфира карбоксиметил МПЭГ со средним молекулярным весом 6 кДа. Полимер растворяют при легком перемешивании и реакцию выдерживают при той же температуре.
Степень модификации белка в процессе реакции анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superose 6HR 10/30 (Phaimatia), при элюировании при 0,4 мл/мин, с помощью 100 мМ фосфата натрия, pH 6,9, содержащего 0,5 М NaCl Через три часа эксклюзионная хроматография показывает, что все ФРГМ димеры были модифицированы с помощью МПЭГ.
Реакционную смесь разбавляют четырехкратным количеством стерилизованной воды и pH смеси доводят до 7 (используя 0,5 М фосфорной кислоты). Этот раствор подают на HiLoad 16/10 S Sepharose HP ионообъемную колонку (Pharmacia), заполненную 20 мМ натрий фосфатным буфером, pH 7,5. Непрореагировавший МПЭГ альдегид элюируют с помощью трех колоночных объемов того же самого буфера. Линейный пятьсот-минутный градиент от 0% до 100% 20 мМ натрий фосфата, pH 7,5, содержащий 0,75 М NaCI, был использован для элюирования МПЭГ-ФРГМ конъюгатов. Фракции, содержащие МПЭГ-ФРГМ конъюгаты, собирают, концентрируют и фильтруют в стерильных условиях.
Пример 6
Получение полиМПЭПГ(6 кД)-ФРГМ конъюгатов ацилированием с помощью активированных МПЭГпроизводных
Повторяют процесс по примеру 5, за исключением того, что используют эквивалентное, моль на моль, соотношение реагентов.
Получение полиМПЭПГ(6 кД)-ФРГМ конъюгатов ацилированием с помощью активированных МПЭГпроизводных
Повторяют процесс по примеру 5, за исключением того, что используют эквивалентное, моль на моль, соотношение реагентов.
Пример 7
Получение полиМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгатов ацилированием МПЭГ с помощью активированных производных
Повторяют процесс по примеру 5, за исключением того, что используют МПЭГ сукцинимидилпропионат со средним молекулярным весом 20 кД и шестикратный молярный избыток МПЭГ по отношению к чФРГМ димеру.
Получение полиМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгатов ацилированием МПЭГ с помощью активированных производных
Повторяют процесс по примеру 5, за исключением того, что используют МПЭГ сукцинимидилпропионат со средним молекулярным весом 20 кД и шестикратный молярный избыток МПЭГ по отношению к чФРГМ димеру.
Пример 8
Получение моноМПЭГ(20 кД)-НТ-З конъюгата с присоединением по N-концевой α -аминогруппе
К охлажденному (4oC) перемешиваемому раствору r-metЧHT-3 (4,77 мг/мл) в 20 мМ ацетате натрия, pH 4,0, содержащему 150 мМ NaCl и 20 мМ NaCNBH3, добавляют трехкратный молярный избыток активированного МПЭГ со средним молекулярным весом 20 кД.
Получение моноМПЭГ(20 кД)-НТ-З конъюгата с присоединением по N-концевой α -аминогруппе
К охлажденному (4oC) перемешиваемому раствору r-metЧHT-3 (4,77 мг/мл) в 20 мМ ацетате натрия, pH 4,0, содержащему 150 мМ NaCl и 20 мМ NaCNBH3, добавляют трехкратный молярный избыток активированного МПЭГ со средним молекулярным весом 20 кД.
Степень модификации белка во время процесса анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием Superose 6HR 10/30 колонки (Pharmacia), при элюировании при скорости потока 0,4 мл/мин с помощью 10 мМ натрий фосфата, pH 7,1, содержащего 150 мМ NaCl. Через десять часов эксклюзионная хроматография показала, что весь белок (находящийся в растворе в виде димера) был превращен в две возможные формы N-концевых пэгированных производных: МПЭГ конъюгированных по одной или по обоим N-концевым группам НТ-3 димера.
Реакционную смесь разбавляют в общей сложности в пять раз 20мМ фосфатом натрия, pH 7, и подают на ионообменную колонку HiLoad 16/10S Sepharose HP (Pharmacia), заполненную 20 мМ натрий фосфатным буфером, pH 7,1. Реакционную смесь загружают в колонку при скорости потока 1 мл/мин и непрореагировавший МПЭГ альдегид элюируют тремя объемами колонки того же буфера. Линейный градиент от 0% до 100% 20 мМ натрий фосфата, pH 7,1, содержащего 0,4 М NaCl, используют для элюирования двух форм пэгированного по N-концу НТ-3 димера. Фракции, содержащие МПЭГ-НТ-3 производные, собирают, концентрируют и стерильно фильтруют.
Дополнительное количество МПЭГ-ФРГМ или МПЭГ-НТ-3 конъюгатов может быть получено модификацией ФРГМ или НТ-3 с помощью МПЭГ альдегидов различного среднего молекулярного веса, например, находящегося в интервале от 5 кД до 50 кД, с использованием тех же методов. Гомогенность полученных пэгированных ФРГМ или НТ-3 конъюгатов определяют с помощью Натрий Додецил Сульфат Полиакриламидного Гелевого Электрофореза (SDS-PAGE), с использованием 10-20% или 4-20% заранее приготовленного градиентного геля (Интеграционные Разделительные Системы). Для определения эффективного размера (гидродинамический радиус) каждого из МПЭГ-ФРГМ или МПЭГ-НТ-3 продукта используют гельфильтрационную колонку Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia). Белки определяют с помощью УФ-поглощения при 280 нм. BIO-RAD гельфильтрационные стандарты служат как сферические белковые маркеры молекулярного веса. Молекулярные веса конъюгатов определяют путем равновесной седиментации в аналитической ультрацентрифуге и с помощью масс-спекторометрического анализа с матричной лазерной десорбцией. Структура каждого из N-концевого МПЭГ-ФРГМ или МПЭГ-НТ-3 конъюгата определяется с использованием стандартных методов определения последовательностей N-концевых белков и пептидов.
Биологическую активность in vitro МПЭГ-ФРГМ конъюгатов, полученных в примерах 1-7, определяют с помощью их воздействия на 3-(4,5-диметилтиазол-2- ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)2Н-тетразолиевую внутреннюю соль, поглощенную PC12/pcDneo-trkB#18 клетками. Эти результаты, также, как основные параметры реакции, использованные при получении конъюгатов, суммированы в Таблице 1.
Пример 9
Оценка биологической активности in vivo МоноПЭГ(20кД)-ФРГМ конъюгата на мотонейронах взрослых крыс
Ранее было показано, что ФРГМ предохраняет развитие мотонейронов от природносуществующей и вызываемой аксотомией гибели клетки; Yan и др. Nature 360: 753-755 (1992); Oppenheim и др. , Nature 360: 755-757 (1992); и Sendtner и др. , Nature 360: 757-759 (1992). Также было продемонстрировано, что аксотомированные взрослые мотонейроны отзываются на экзогенный ФРГМ, и в особенности то, что ФРГМ, применяемый в различных вариантах введения, смягчает аксотомно вызываемое снижение иммунореактивности ацетилхолинтрансферазы (АХТ) в лицевых мотонейронах взрослых крыс; Yan и др. J.Neurosci. 14(9): 5281-5291(1994). Снижение активности АХТ отражает потерю функции мотонейронов, поскольку АХТ является жизненно необходимым нейромедиатором, продуцируемым мотонейронам. Таким образом, эти исследования отражают, что ФРГМ является важным потенциальным терапевтическим агентом при заболеваниях взрослых мотонейронов. В настоящем исследовании определена биологическая активность N-концевого пэгированного и нерегулярного пэгированного продукта ФРГМ (см. примеры 1 и 3) in vivo в отношении поврежденных взрослых мотонейронов.
Оценка биологической активности in vivo МоноПЭГ(20кД)-ФРГМ конъюгата на мотонейронах взрослых крыс
Ранее было показано, что ФРГМ предохраняет развитие мотонейронов от природносуществующей и вызываемой аксотомией гибели клетки; Yan и др. Nature 360: 753-755 (1992); Oppenheim и др. , Nature 360: 755-757 (1992); и Sendtner и др. , Nature 360: 757-759 (1992). Также было продемонстрировано, что аксотомированные взрослые мотонейроны отзываются на экзогенный ФРГМ, и в особенности то, что ФРГМ, применяемый в различных вариантах введения, смягчает аксотомно вызываемое снижение иммунореактивности ацетилхолинтрансферазы (АХТ) в лицевых мотонейронах взрослых крыс; Yan и др. J.Neurosci. 14(9): 5281-5291(1994). Снижение активности АХТ отражает потерю функции мотонейронов, поскольку АХТ является жизненно необходимым нейромедиатором, продуцируемым мотонейронам. Таким образом, эти исследования отражают, что ФРГМ является важным потенциальным терапевтическим агентом при заболеваниях взрослых мотонейронов. В настоящем исследовании определена биологическая активность N-концевого пэгированного и нерегулярного пэгированного продукта ФРГМ (см. примеры 1 и 3) in vivo в отношении поврежденных взрослых мотонейронов.
Методы
A. Хирургическая операция и обработка животных. Взрослые особи женского пола крыс Sprague-Dawley (всего 52 крысы по n=4 в каждой группе) были анестезированы с помощью смеси (43 мг/мл кетамина гидрохлорида, 8,6 мг/мл ксилазина и 1,43 мг/мл асепромазина) при дозе 0,7 мл/кг живого веса. Правый лицевой нерв рассекали около шилососцевидного отверстия. Животных подвергали подкожному введению один раз в день в течение семи дней, начиная со дня операции (0 день). Вводили следующие дозы: 0,1, 0,3, 1,0 и 5,0 мг на кг живого веса непэгированного ФРГМ, N-концевого моноМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата или нерегулярного полиПЭГ-ФРГМ конъюгата, каждый в PBS. Одну группу крыс обрабатывали только с помощью PBS в качестве контроля. Вес тела животных определяли ежедневно.
A. Хирургическая операция и обработка животных. Взрослые особи женского пола крыс Sprague-Dawley (всего 52 крысы по n=4 в каждой группе) были анестезированы с помощью смеси (43 мг/мл кетамина гидрохлорида, 8,6 мг/мл ксилазина и 1,43 мг/мл асепромазина) при дозе 0,7 мл/кг живого веса. Правый лицевой нерв рассекали около шилососцевидного отверстия. Животных подвергали подкожному введению один раз в день в течение семи дней, начиная со дня операции (0 день). Вводили следующие дозы: 0,1, 0,3, 1,0 и 5,0 мг на кг живого веса непэгированного ФРГМ, N-концевого моноМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата или нерегулярного полиПЭГ-ФРГМ конъюгата, каждый в PBS. Одну группу крыс обрабатывали только с помощью PBS в качестве контроля. Вес тела животных определяли ежедневно.
B. АХТ имунногистохимия. Крысы были усыплены с помощью сверхдозы анестизии и перфузированы транскардиально с помощью PBS, а затем с помощью 4%-ного параформальдегида в ОД М буфере фосфата натрия, pH 7,2. Удаляли стволы мозга, криопротектировали с помощью 30% сахарозы в PBS и замораживали, и с помощью скользящего блока микротома делали 80 мкм последовательные коронарные срезы из лицевой ядерной области. Затем срезы обрабатывали для иммуногистохимии моноклональными мышиными антителами против АХТ (асциды 1:500, Chemison, Temecula.CA) с последующим добавлением по 2 мг/мл вторичного биотинилированного лошадиного противомышиного антитела с использованием ABC метода (Vector Laboratories, Buriingame, CA), описанного Yan и Johnson в J. Neurosci.8(9): 3481-3498(1988).
C. Количественная оценка иммуногистохимических срезов. Анализатор изображения Quantimet 520 (Leica.Inc., Deerfield, IL), соединенный с микроскопом Nicon-FXA, используют для количественной оценки относительной интенсивности окрашивания АХТ. Для того, чтобы получить высоко контрастное изображение ядерной лицевой области в гистологических срезах, используют 510 нм узко-полосный фильтр (Oriel Corp., Stratford, CT), с Nicon-Plan Apochromatic 2-х кратным объективом. Относительную интенсивность АХТ иммунореактивности определяют по полученной средней интенсивности серой шкалы для каждого рассмотренного ядра за вычетом окраски фона смежного АХТ негативного серого вещества. Для количественной обработки в отношении каждого животного используют три или четыре среза, содержащих лицевые ядра. Поскольку обработка ФРГМ не влияет на АХТ иммуноокрашивание неповрежденных лицевых ядер, данные были представлены в виде отношения относительной оптической плотности поврежденных ядер к плотности неповрежденных лицевых ядер в одних и тех же срезах. Данные были статически обработаны с помощью ANOVA, с последующим Dunnett t тестом.
D. Результаты. Аксотомия взрослых крыс приводит к быстрому и воспроизводимому снижению АХТ иммунореактивности в мотонейронах; Lams и др., Brain Res. 475:401-406(1988) и Armstrong и др. J.Comp.Neurol. 304: 596-607 (1991). Для оценки эффективности непэгированного ФРГМ и пэгированного ФРГМ на взрослые мотонейроны был использован метод рассечения лицевого нерва, описанный выше, который позволяет изучить влияние этих полипептидов на экспрессию АХТ в мотонейронах.
Семь дней спустя, после того, как был рассечен правый лицевой нерв, практически исчезает АХТ иммунореактивность в поврежденных лицевых ядрах, подвергшихся PBS обработке (фигура 4, часть A, лицевое ядро на правой стороне). Подкожная обработка с помощью природного ФРГМ (5 мг/кг, фигура 4, часть B), N-концевого моноМПЭГ-ФРГМ конъюгата (0,3 мг/кг, фигура 4, часть C), и нерегулярного полиМПЭГ-ФРГМ конъюгата (0,3 мг/кт. фигура 4, часть D) значительно смягчает вызванное повреждением снижение иммунореактивности АХТ. Для того, чтобы количественно оценить это явление, были измерены средние оптические плотности как поврежденных, так и неповрежденных лицевых ядер в АХТ имммуноокрашенных срезах. Все природные N-концевые моноМПЭГ-ФРГМ конъюгаты и нерегулярные полиМПЭГ-ФРГМ конъюгаты снижали уменьшение вызванной повреждением иммунореактивности АХТ в варианте, в зависимой от дозы модели. (Фигура 5). Природный ФРГМ при дозе 5 мг/кг показал значительное ослабление вызванной повреждением иммунореактивности АХТ по сравнению с контрольным растворителем (p<0,01). Обработка либо N-концевым моноМПЭГ- ФРГМ конъюгатом, либо нерегулярным полиМПЭГ-ФРГМ конъюгатом приводит к значительному улучшению по сравнению с контрольным раствором в каждой тестовой дозе и над природным ФРГМ при более низких близких пробах (p<0,01). Как установлено, обработка пэгированным ФРГМ сдвигает кривую зависимости от дозы влево на примерно двадцать единиц над природным ФРГМ (фигура 5), отражая усиление действенности пэгированного ФРГМ на поврежденные мотонейроны.
Пример 10
Количественная оценка биологической активности in vitro N-концевого МоноМПЭГ-НТ-3 конъюгата в эмбрионной СКГ цыплят
Были измерены сравнительные биологические активности непэгированных НТ-3 и N-концевых моноМПЭГ (20 кД)-НТ-3 конъюгатов при использовании спинных корневых ганглий (СКГ) из эмбрионов цыплят, описанных Lindsay и др., Dev. Biol. 112: 319-328 (1985). Вкратце, пять эмбрионных (Е8) спинных корневых ганглий цыплят, помещенные в ячейку, культивируют как экплантаты в коллагеновом матриксе с 2 мл среды F14, содержащей 5% нормальной сыворотки крови лошади. Эффективность нейротрофического фактора (как непэгированного, так и пэгированного) был определен визуально с помощью фазового микроскопа и оценен по 0-5-ти бальной шкале (0 - нет роста нейритов, 5 - максимальный рост нейритов).
Количественная оценка биологической активности in vitro N-концевого МоноМПЭГ-НТ-3 конъюгата в эмбрионной СКГ цыплят
Были измерены сравнительные биологические активности непэгированных НТ-3 и N-концевых моноМПЭГ (20 кД)-НТ-3 конъюгатов при использовании спинных корневых ганглий (СКГ) из эмбрионов цыплят, описанных Lindsay и др., Dev. Biol. 112: 319-328 (1985). Вкратце, пять эмбрионных (Е8) спинных корневых ганглий цыплят, помещенные в ячейку, культивируют как экплантаты в коллагеновом матриксе с 2 мл среды F14, содержащей 5% нормальной сыворотки крови лошади. Эффективность нейротрофического фактора (как непэгированного, так и пэгированного) был определен визуально с помощью фазового микроскопа и оценен по 0-5-ти бальной шкале (0 - нет роста нейритов, 5 - максимальный рост нейритов).
Результаты, сведенные в таблицу 2, представленную ниже, показывают, что пэгированный НТ-3 не испытывает потерю активности по сравнению с непэгированным НТ-3, при этом удивительный результат был получен при проведении эксперимента in vitro с другими пэгированными белками, который выявил значительное снижение биоактивности.
Пример 11
Дальнейшая оценка биологической активности in vivo N-концевого МоноПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата во взрослых крысах
Прохождение через ткань мозга
1. Стриарная одноразовая инъекция
Один микролитр непэгированного ФРГМ или N-концевого моноПЭГ (20 кД)- ФРГМ конъюгата (1 мг/мл в растворе фосфатного буфера) вводят с помощью инъекции in vivo в центр правого неостриатума мозга взрослых женских особей крыс (n= 4) в течение 18-20 часов. Двадцатью часами позже животных усыпляли с помощью сверхдозы анестизии и перфузировали транскардиально с помощью PBS, с последующей обработкой 4%-ным параформальдегида в 0,1 М буфере фосфата натрия, pH 7,2. Головной мозг удаляют, криопротектируют с помощью 30%-ной сахарозы в PBS, замораживают, и с помощью скользящего блока микротома, делают 60 мкм последовательных коронарных срезов. Срезы обрабатывают для иммуногистохимии с помощью 1 мкм/мл анти-ФРГМ антитела кролика с последующим добавлением по 2 мкм/мл вторичного биотинилированного анти-ФРГМ антитела козы с использованием ABC метода, описанного выше. Очень сильное окрашивание было отмечено на стороне стриатума, в которую вводили инъекцию как непэгированного, так и пэгированного ФРГМ образцов. Пэгированный ФРГМ, как было определено, диффундировал в большую по площади область ткани, чем непэгированный ФРГМ, в около в 2,4 раз большую, как видно на Фигуре б. Только несколько нейронов в субстанции nigra, которые были позитивно мечены (не показано).
Дальнейшая оценка биологической активности in vivo N-концевого МоноПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата во взрослых крысах
Прохождение через ткань мозга
1. Стриарная одноразовая инъекция
Один микролитр непэгированного ФРГМ или N-концевого моноПЭГ (20 кД)- ФРГМ конъюгата (1 мг/мл в растворе фосфатного буфера) вводят с помощью инъекции in vivo в центр правого неостриатума мозга взрослых женских особей крыс (n= 4) в течение 18-20 часов. Двадцатью часами позже животных усыпляли с помощью сверхдозы анестизии и перфузировали транскардиально с помощью PBS, с последующей обработкой 4%-ным параформальдегида в 0,1 М буфере фосфата натрия, pH 7,2. Головной мозг удаляют, криопротектируют с помощью 30%-ной сахарозы в PBS, замораживают, и с помощью скользящего блока микротома, делают 60 мкм последовательных коронарных срезов. Срезы обрабатывают для иммуногистохимии с помощью 1 мкм/мл анти-ФРГМ антитела кролика с последующим добавлением по 2 мкм/мл вторичного биотинилированного анти-ФРГМ антитела козы с использованием ABC метода, описанного выше. Очень сильное окрашивание было отмечено на стороне стриатума, в которую вводили инъекцию как непэгированного, так и пэгированного ФРГМ образцов. Пэгированный ФРГМ, как было определено, диффундировал в большую по площади область ткани, чем непэгированный ФРГМ, в около в 2,4 раз большую, как видно на Фигуре б. Только несколько нейронов в субстанции nigra, которые были позитивно мечены (не показано).
2. Стриарная семидневная инфузия
Взрослые женские особи крыс (n=4) ежедневно получали инфузию 12 mг либо непэгированного ФРГМ, либо N-концевого моноМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата в неостриатум в течение периода в семь дней. Проникновение обеих форм ФРГМ была даже лучше во время этого исследования, чем во время введения одноразовой инъекции, запись о которой приведена выше. Пэгированный ФРГМ диффузировал в значительной большую область, чем природный ФРГМ, примерно в 6,1 кратное количество, как это видно на фигуре 7. Значительно большее количество нейронов в субстанции nigra compacta (SNC) и в брюшной наружной области (БНО) были положительно мечены после инфузии с помощью пэгированного ФРГМ (Фигура 8, части С и D), затем с помощью непэгированного ФРГМ (Фигура 8, части А и В ). Под более высоким воздействием ФРГМ-иммунореактивность была замечена и внутри перикарии, которая отражает, что ФРГМ была обратно транспортирована из нервного окончания в тело клетки. Позитивное окрашивание, отмеченное в средней вентральной части субстанции nigra reticulata ("SNR") находилось в нейрофиле и не было связано ни с каким телом клетки. Окрашивание происходило благодаря неспецифической диффузии вместо рецептр-медиаторному обратному транспортированию; J. Comp. Neurol & 313: 680-692 (1991).
Взрослые женские особи крыс (n=4) ежедневно получали инфузию 12 mг либо непэгированного ФРГМ, либо N-концевого моноМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата в неостриатум в течение периода в семь дней. Проникновение обеих форм ФРГМ была даже лучше во время этого исследования, чем во время введения одноразовой инъекции, запись о которой приведена выше. Пэгированный ФРГМ диффузировал в значительной большую область, чем природный ФРГМ, примерно в 6,1 кратное количество, как это видно на фигуре 7. Значительно большее количество нейронов в субстанции nigra compacta (SNC) и в брюшной наружной области (БНО) были положительно мечены после инфузии с помощью пэгированного ФРГМ (Фигура 8, части С и D), затем с помощью непэгированного ФРГМ (Фигура 8, части А и В ). Под более высоким воздействием ФРГМ-иммунореактивность была замечена и внутри перикарии, которая отражает, что ФРГМ была обратно транспортирована из нервного окончания в тело клетки. Позитивное окрашивание, отмеченное в средней вентральной части субстанции nigra reticulata ("SNR") находилось в нейрофиле и не было связано ни с каким телом клетки. Окрашивание происходило благодаря неспецифической диффузии вместо рецептр-медиаторному обратному транспортированию; J. Comp. Neurol & 313: 680-692 (1991).
Эти результаты имеют большое значение.
Как правило, как было установлено, после паренхимального введения в мозг животных ФРГМ диффундирует через мозговую ткань в незначительной степени. Настоящие исследования показали значительное улучшение возможности распространения таких диффузии в случае, когда применяют пэгированный ФРГМ, который обладает потенциально большей терапевтической эффективностью по крайней мере в случае указанных форм введения.
Claims (14)
1. Полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора, в котором указанный полипептид связан с указанным полиэтиленгликолем, и указанный полипептид выбран из группы, состоящей из фактора роста, полученного из головного мозга (ФРГМ) и нейротрофина-3 (НТ-3).
2. Производное по п.1, отличающееся тем, что полиэтиленгликоль является монометоксиполиэтиленгликолем.
3. Производное по п.1, отличающееся тем, что полиэтиленгликоль присоединен к полипептиду с помощью ацильной или алкильной связи.
4. Производное по п. 1, отличающееся тем, что полиэтиленгликоль имеет мол.в. от около 2 КД до около 100 кД.
5. Производное по п. 4, отличающееся тем, что полиэтиленгликоль имеет мол.в. от около 5 кД до около 50 кД.
6. Способ присоединения молекулы полиэтиленгликоля к полипептиду, выбранному из группы, состоящей из ФРГМ и НТ-3, отличающийся тем, что полиэтиленгликоль имеет единственную реакционноспособную альдегидную группу и указанный способ состоит из взаимодействия полипептида с полиэтиленгликолем в условиях восстановительного алкилирования, при, по существу, кислом рН, которое позволяет α-аминогруппе на аминоконце указанного полипептида, быть реакционноспособной, благодаря чему полиэтиленгликоль присоединяется к указанной α-аминогруппе и извлечения полипептида, монопэгированного по N-концевой α-аминогруппе, в по существу гомогенной форме.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что восстановительное алкилирование проводят с использованием натрий цианборгидрида в качестве восстановительного агента.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что а полиэтиленгликоль имеет молекулярный вес от около 2 кД около 100 кД.
9. Способ по п.6, отличающийся тем, что полипептид является ФРГМ.
10. Способ по п.6, отличающийся тем, что полипептид является НТ-3.
11. Способ по п.6, отличающийся тем, что рН находится в интервале от около 3 до около 9.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что рН находится в интервале от около 3 до около 6.
13. Гомогенный препарат ФРГМ, отличающийся тем, что он монопэгирован по N-концевой α-аминогруппе.
14. Гомогенный препарат НТ-3, отличающийся тем, что он монопэгирован по N-концевой α-аминогруппе.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/340,131 US5770577A (en) | 1994-11-14 | 1994-11-14 | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
| US08/340,131 | 1994-11-14 | ||
| PCT/US1995/014658 WO1996015146A1 (en) | 1994-11-14 | 1995-11-13 | Conjugates of bdnf and nt-3 with a water-soluble polymer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97107892A RU97107892A (ru) | 1999-04-27 |
| RU2136694C1 true RU2136694C1 (ru) | 1999-09-10 |
Family
ID=23332020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97107892/04A RU2136694C1 (ru) | 1994-11-14 | 1995-11-13 | Полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора и способ их получения |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5770577A (ru) |
| EP (1) | EP0792288B1 (ru) |
| JP (1) | JPH10508853A (ru) |
| KR (1) | KR100253762B1 (ru) |
| CN (1) | CN1173183A (ru) |
| AT (1) | ATE175973T1 (ru) |
| AU (1) | AU694589B2 (ru) |
| CA (1) | CA2204640C (ru) |
| CZ (1) | CZ137597A3 (ru) |
| DE (1) | DE69507507T2 (ru) |
| DK (1) | DK0792288T3 (ru) |
| ES (1) | ES2126331T3 (ru) |
| GR (1) | GR3029790T3 (ru) |
| HU (1) | HUT77747A (ru) |
| IL (1) | IL115965A (ru) |
| MX (1) | MX9703362A (ru) |
| NO (1) | NO972176L (ru) |
| NZ (1) | NZ296452A (ru) |
| RU (1) | RU2136694C1 (ru) |
| SK (1) | SK283083B6 (ru) |
| WO (1) | WO1996015146A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA959653B (ru) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| JPH10212241A (ja) * | 1996-05-27 | 1998-08-11 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | Ｂｄｎｆを安定に含有する製剤 |
| EP0938499A1 (en) | 1996-07-19 | 1999-09-01 | Amgen Inc. | Analogs of cationic proteins |
| ATE406907T1 (de) * | 1998-10-28 | 2008-09-15 | Cornell Res Foundation Inc | Methoden zur regulierung der angiogenese und vaskuläre integrität mittels trk rezeptor liganden bdnf, nt-3 und nt-4 |
| US6656474B1 (en) * | 1999-01-15 | 2003-12-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using a neurotrophin and its analogues for the treatment of gastrointestinal hypomotility disorders |
| EP1264844A4 (en) * | 2000-02-29 | 2004-08-18 | Ltt Bio Pharma Co Ltd | BDNF MODIFIED |
| US7514239B2 (en) * | 2000-03-28 | 2009-04-07 | Amgen Inc. | Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof |
| US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| JP4259868B2 (ja) * | 2001-02-01 | 2009-04-30 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | ニューブラスチンのポリマー結合体および同様の使用方法。 |
| US7442370B2 (en) * | 2001-02-01 | 2008-10-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Polymer conjugates of mutated neublastin |
| WO2002069232A2 (en) | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
| US7276580B2 (en) * | 2001-03-12 | 2007-10-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Neurotrophic factors |
| JP4571776B2 (ja) * | 2002-11-05 | 2010-10-27 | Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 | 潤滑油組成物 |
| GEP20084486B (en) * | 2002-12-26 | 2008-09-25 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency |
| JP2006519170A (ja) * | 2002-12-26 | 2006-08-24 | マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ポリペプチドホルモン、およびレセプター結合活性が保存されたそのアンタゴニストのポリマー結合体 |
| SI2246362T1 (sl) * | 2003-01-31 | 2014-04-30 | Biogen Idec Ma Inc. | Polimerni konjugati mutiranega neoblastina |
| PL1606409T3 (pl) | 2003-03-19 | 2011-02-28 | Biogen Ma Inc | Białko wiążące receptor Nogo |
| NZ543365A (en) | 2003-04-18 | 2009-02-28 | Biogen Idec Inc | Polymer-conjugated glycosylated neublastin |
| BRPI0506793A (pt) * | 2004-02-20 | 2007-05-22 | Rinat Neuroscience Corp | métodos de tratamento de obesidade ou diabetes com o uso de nt-4/5 |
| JP4960865B2 (ja) | 2004-06-24 | 2012-06-27 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 脱髄に関連する状態の処置 |
| US8722862B2 (en) * | 2004-08-19 | 2014-05-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Refolding transforming growth factor beta family proteins |
| EA013565B1 (ru) * | 2004-08-19 | 2010-06-30 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение |
| CA2610771A1 (en) | 2005-06-06 | 2006-12-14 | Wyeth | Anti-trkb monoclonal antibodies and uses thereof |
| SI1904104T1 (sl) | 2005-07-08 | 2013-12-31 | Biogen Idec Ma Inc. | Protitelesa SP35 in njihova uporaba |
| EP1988920A1 (en) * | 2006-02-02 | 2008-11-12 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating obesity by administering a trkb antagonist |
| CN101400367A (zh) * | 2006-02-02 | 2009-04-01 | 瑞纳神经科学公司 | 施用trkb激动剂治疗不希望的重量减轻或进食障碍的方法 |
| TWI501774B (zh) | 2006-02-27 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 神經性病症之治療 |
| EP1993590B1 (en) * | 2006-03-01 | 2013-12-25 | Biogen Idec MA Inc. | Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins |
| US8377448B2 (en) * | 2006-05-15 | 2013-02-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University | CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders |
| US20080131431A1 (en) * | 2006-05-15 | 2008-06-05 | Viral Logic Systems Technology Corp. | CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders |
| JP2010513461A (ja) * | 2006-12-20 | 2010-04-30 | ライナット ニューロサイエンス コーポレイション | 自己免疫障害を治療するためのＴｒｋＢアゴニスト |
| TWI445544B (zh) | 2007-05-01 | 2014-07-21 | Biogen Idec Inc | 增進血管形成之組合物及方法 |
| US20110135648A1 (en) * | 2007-08-08 | 2011-06-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-neublastin antibodies and uses thereof |
| EP2205071B1 (en) * | 2007-10-11 | 2015-07-22 | Biogen MA Inc. | Lingo-1 antagonists and trkb agonists for use in the treatment of glaucoma |
| CN101918540B (zh) * | 2007-11-08 | 2016-05-11 | 比奥根Ma公司 | Lingo-4拮抗剂在治疗涉及脱髓鞘的疾患中的应用 |
| CA2729961C (en) | 2008-07-09 | 2018-05-01 | Biogen Idec Ma Inc. | Li113, li62 variant co2, anti-lingo antibodies |
| CA2803646A1 (en) | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Angiochem Inc. | Short and d-amino acid-containing polypeptides for therapeutic conjugates and uses thereof |
| MX2014013950A (es) | 2012-05-14 | 2015-02-17 | Biogen Idec Inc | Antagonistas de proteina que interactua con el receptor nogo 2 que contiene repeticion rica en leucina y dominio de inmunoglobulina (lingo-2) para el tratamiento de afecciones que involucran neuronas motoras. |
| CN102964442B (zh) * | 2012-11-19 | 2015-04-29 | 未名生物医药有限公司 | 一种聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法 |
| CA2973266A1 (en) | 2015-01-08 | 2016-07-14 | Biogen Ma Inc. | Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders |
| CN111514279B (zh) * | 2020-06-16 | 2023-07-18 | 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） | 神经营养因子3在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用 |
| CN115025723A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-09-09 | 吉林大学 | 经神经生长因子及多巴胺改良的peg-plga微球 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| US5169762A (en) * | 1983-03-03 | 1992-12-08 | Genentech, Inc. | Human nerve growth factor by recombinant technology |
| DE3572982D1 (en) * | 1984-03-06 | 1989-10-19 | Takeda Chemical Industries Ltd | Chemically modified lymphokine and production thereof |
| GB8430252D0 (en) * | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| CA1340810C (en) * | 1988-03-31 | 1999-11-02 | Motoo Yamasaki | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| ATE135370T1 (de) * | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
| US5229500A (en) * | 1989-08-30 | 1993-07-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Brain derived neurotrophic factor |
| US5180820A (en) * | 1989-08-30 | 1993-01-19 | Barde Yves Alain | Brain-derived neurotrophic factor |
| GR1000980B (el) * | 1989-08-30 | 1993-03-31 | Max Planck Gesellschaft | Νευροτροφινη-3,ενας νεος neυροτροφικος παραγοντας που σχετιζεται με τον παραγοντα αναπτυξης νευρων και τον νευροτροφικο παραγοντα που προερχεται απο τον εγκεφαλο. |
| US5182107A (en) * | 1989-09-07 | 1993-01-26 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
| JPH04218000A (ja) * | 1990-02-13 | 1992-08-07 | Kirin Amgen Inc | 修飾ポリペプチド |
| IE912365A1 (en) * | 1990-07-23 | 1992-01-29 | Zeneca Ltd | Continuous release pharmaceutical compositions |
| AU654302B2 (en) * | 1990-09-25 | 1994-11-03 | Genentech Inc. | Novel neurothrophic factor |
| US5252714A (en) * | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
| US5389529A (en) * | 1991-06-12 | 1995-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins |
| NZ244778A (en) * | 1991-10-21 | 1994-03-25 | Ortho Pharma Corp | Peg imidates and protein derivatives thereof |
| US5260308A (en) * | 1991-11-06 | 1993-11-09 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Method to increase permeability of the blood-nerve/brain barriers to proteins |
| US5468872A (en) * | 1993-09-16 | 1995-11-21 | Cephalon, Inc. | K-252a functional derivatives potentiate neurotrophin-3 for the treatment of neurological disorders |
-
1994
- 1994-11-14 US US08/340,131 patent/US5770577A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-11-12 IL IL11596595A patent/IL115965A/en active IP Right Grant
- 1995-11-13 JP JP8516219A patent/JPH10508853A/ja not_active Ceased
- 1995-11-13 DE DE69507507T patent/DE69507507T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-13 NZ NZ296452A patent/NZ296452A/xx unknown
- 1995-11-13 CN CN95197321A patent/CN1173183A/zh active Pending
- 1995-11-13 HU HU9800671A patent/HUT77747A/hu unknown
- 1995-11-13 SK SK571-97A patent/SK283083B6/sk unknown
- 1995-11-13 CA CA002204640A patent/CA2204640C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-13 KR KR1019970703211A patent/KR100253762B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-11-13 RU RU97107892/04A patent/RU2136694C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-11-13 MX MX9703362A patent/MX9703362A/es not_active IP Right Cessation
- 1995-11-13 CZ CZ971375A patent/CZ137597A3/cs unknown
- 1995-11-13 AU AU41071/96A patent/AU694589B2/en not_active Ceased
- 1995-11-13 EP EP95939123A patent/EP0792288B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-13 AT AT95939123T patent/ATE175973T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-11-13 WO PCT/US1995/014658 patent/WO1996015146A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-11-13 ES ES95939123T patent/ES2126331T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-13 DK DK95939123T patent/DK0792288T3/da active
- 1995-11-14 ZA ZA9509653A patent/ZA959653B/xx unknown
-
1997
- 1997-05-12 NO NO972176A patent/NO972176L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-03-23 GR GR990400878T patent/GR3029790T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Abuchowski et.al. b "Enzymes as Drugs" (Holdberg and Roberts, eds). 1981, рр. 567 - 383. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO972176L (no) | 1997-07-14 |
| CA2204640C (en) | 2001-01-09 |
| WO1996015146A1 (en) | 1996-05-23 |
| NZ296452A (en) | 1999-01-28 |
| SK283083B6 (sk) | 2003-02-04 |
| ES2126331T3 (es) | 1999-03-16 |
| GR3029790T3 (en) | 1999-06-30 |
| DK0792288T3 (da) | 1999-09-13 |
| IL115965A0 (en) | 1996-01-31 |
| ATE175973T1 (de) | 1999-02-15 |
| AU694589B2 (en) | 1998-07-23 |
| JPH10508853A (ja) | 1998-09-02 |
| EP0792288A1 (en) | 1997-09-03 |
| AU4107196A (en) | 1996-06-06 |
| NO972176D0 (no) | 1997-05-12 |
| ZA959653B (en) | 1997-08-26 |
| EP0792288B1 (en) | 1999-01-20 |
| CZ137597A3 (cs) | 1998-10-14 |
| IL115965A (en) | 2001-01-28 |
| US5770577A (en) | 1998-06-23 |
| DE69507507D1 (de) | 1999-03-04 |
| CN1173183A (zh) | 1998-02-11 |
| HUT77747A (hu) | 1998-07-28 |
| MX9703362A (es) | 1997-08-30 |
| SK57197A3 (en) | 1999-02-11 |
| DE69507507T2 (de) | 1999-05-27 |
| KR100253762B1 (ko) | 2000-05-01 |
| CA2204640A1 (en) | 1996-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2136694C1 (ru) | Полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора и способ их получения | |
| MXPA97003362A (en) | Conjugates of bdnf and nt-3 with a polymer solubleen a | |
| US7119066B2 (en) | Modified ciliary neurotrophic factor (CNTF) | |
| RU2266129C2 (ru) | Способ воздействия на нейродегенеративное нарушение или нарушение миелинизации | |
| DE69836438T2 (de) | Substantiell reine histidin-gebundene protein polymerkonjugate | |
| JP5241037B2 (ja) | 截形グリア細胞系由来神経栄養因子 | |
| CA2637698C (en) | Medicament for treatment of a tumor comprising a endostatin and polyethylene glycol conjugate | |
| US5066590A (en) | Superoxide dismutase combined with a poly(alkylene oxide) | |
| AU704910B2 (en) | Recombinant adenoviruses encoding glial cell neurotrophic factor (GDNF) | |
| JPH11505548A (ja) | グリア細胞系由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）蛋白産物を用いたハンチントン病の治療方法 | |
| CA2113206A1 (en) | Modified pf4 compositions and methods of use | |
| CN1155706C (zh) | 肌萎缩性侧索硬化的治疗方法 | |
| AU647883B2 (en) | Pharmaceutical compositions comprising interleukin-2 | |
| US6017886A (en) | Use of NDF peptide as growth factor for sensory epithelium | |
| AU6382200A (en) | Modified ciliary neurotrophic factor, method of making and methods of use thereof | |
| JP2001524944A (ja) | 神経障害性疼痛の緩和方法 | |
| AU2002300005B2 (en) | Method of alleviating neuropathic pain |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20031114 |