KR100253762B1 - Bdnf 및 nt-3 의 폴리에틸렌 글리콜 유도체 - Google Patents
Bdnf 및 nt-3 의 폴리에틸렌 글리콜 유도체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신경영양성 인자 BDNF 및 NT-3에 수용성 중합체, 예를들어 폴리에틸렌 글리콜을 부가시켜서 제조한 이들 BDNF 및 NT-3 유도체에 관한 것이다.
Description
[발명의 명칭]
BDNF 또는 NT-3의 폴리에틸렌 글리콜 유도체
[발명의 배경]
재조합 DNA 기술의 진보 결과로서, 치료학적 용도를 위한 단백질은 현재 대량으로 충분한 양의 적합한 형태로서 이용가능하다. 그러한 단백질의 화학 유도체는 단백질 골격 자체와의 물리적 접촉으로부터 단백질 가수분해 효소를 효과적으로 차단시켜, 분해를 방지시킬 것이다. 특정 조건하에서의 부가적인 잇점으로는, 분해를 방지시킬 것이다. 특정 조건하에서의 부가적인 잇점으로는, 치료학적 단백질의 안정도 및 순환시간을 증가시키고 면역원성을 감소시킴이 포함될 것이다. 그러나, 특정 단백질의 변형 효과는 예측할 수 없음을 주목해야 한다. 단백질 변형 및 융합 단백질에 관하여 기술하고 있는 평론지는 영국 런던 프리에른 버네트 레인 마운트뷰 코오트 메디스크립트에서 발행(1992)한, Francis 의 Focus on Growth Factors 3:4-10이다.
폴리에틸렌 글리콜(이하 "PEG" 또는 peg"라 함)은 치료학적 단백질 산물(이하 "폴리에틸렌 글리콜화된 단백질"이라 함)을 제조(이하 "폴리에틸렌 글리콜화"라 함)하는데 사용되어 온 하나의 그와 같은 화학성분이다. 예를들어, Adagen
, 즉 폴리에틸렌 글리콜화된 아데노신 탈 아미노효소의 제제형은 중증 합병형 면역결핍증을 치료하는 것으로 승인된 것이고 ; 폴리에틸렌 글리콜화된 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스는 머리 손상을 치료하기 위한 임상실험에 사용되어 왔고 ; 폴리에틸렌 글리콜화된 알파 인터페론은 간염을 치료하기 위한 I기 임상실험에 시험되어 왔으며 ; 폴리에틸렌 글리콜화된 글루코세레브로시데이스 및 폴리에틸렌 글리콜화된 헤모글로빈은 예비임상실험에 사용되어 온 것으로 보고되어 있다. 어떤 단백질에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 부가됨으로써 단백질 가수분해가 방어되는 것으로 보여진다[Sada 등의 J.Fermentation Bioengineering 71 : 137-139(1991)참조]. 어떤 폴리에틸렌 글리콜 성분을 부가시키는 방법은 이용가능하다.
미국 특허 제 4,179,337 호(Davis등) 및 미국 특허 제 4,002,531 호 (Royer)를 참조하라.
단백질을 변형시키는데 있어 다른 수용성 중합체가 사용되어 왔다.
예를 들어, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 데스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레익무수물 중합체 및 폴리아미노산(동종중합체나 아니면 무작위 공중합체).
폴리에틸렌 글리콜에 있어서, 단백질에 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부가 시키기 위해 다양한 수단이 사용되어 왔다. 일반적으로, 단백질 상에 발견되는 반응기를 통하여 단백직에 폴리에틸렌 글리콜 분자를 결합시킨다. 리신 잔기 상이나 N-말단에서의 아미노기가 그와같은 부가를 위해 유리하다. 예를들어, 상기한 Royer의 특허는 효소에 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부가시키기 위해 환원성 알킬화를 이용하였음을 기술하고 있다. 1993년 4월 28일자 공개된 유럽 특허 출원 번호 제 0 539 167호는 펩티드 및, 유리 아미노기(들)을 갖는 유기화합물이 PEG의 이미데이트 유도체 또는 이와 관련된 수용성 유기 중합체로써 변형됨을 기술하고 있다. 미국 특허 번호 제 4,904,584 호(Shaw)는 반응성 아민기를 통하여 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부가시키기 위한, 단백질내 리신 잔기의 변형에 관한 것이다.
화학적으로 변형되어진 하나의 특별한 치료학적 단백질은 과립구 군체자극 인자, 즉 G-CSF이다. 유럽 특허 공개 번호 제 EP 0 401 384호, 제 EP 0 473 268호 및 제 EP 0 335 423 호 참조. 다른 예로는 미국 특허 번호 제 5,264,209호(Mikayama등)에 기술되어 있는 폴리에틸렌 글리콜화된 IL-6이 있다. 또한, 1985년 9월 11일자로 공개된 유럽 특허 출원 번호 제 0 154 316호에는 폴리에틸렌 글리콜의 알데히드를 림포카인과 반응시키는 것에 관하여 기술되어 있다.
단백질 분자의 폴리에틸렌 글리콜화는 대개 화학적으로 변형된 단백질 분자의 혼합물을 형성시킬 것이다. 설명하면, 5개의 리신 잔기와 N- 말단에 유리 아미노기를 갖는 단백질 분자를 상기 방법으로 반응시키면, 어떤 것은 6개의 폴리에틸렌 글리콜 성분을 가지고, 어떤 것은 5개, 어떤 것은 4개, 어떤 것은 3개, 어떤 것은 2개, 어떤 것은 1개 및 어떤 것은 0개의 폴리에틸렌 글리콜 성분을 가지는 불균일 혼합물이 생성될 수 있다. 여러 가지 분자 중에서, 폴리에틸렌 글리콜 성분은 상이한 분자상의 동일 위치에 부가되지 않을 수도 있다. 상기 방법은 전형적으로 단백질과 폴리에틸렌 글리콜 분자간에 결합성분을 필요로 한다. 이 과정은 Delgado 등의 "Coupling of PEG to Protein by Activation with Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Partitioning", Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, New York, NY(1989), at pages 211-213에 기술되어 있는데, 이 기술내용은 트레실 염화물을 사용한 결과 폴리에틸렌 글리콜과 단백질 성분간에 기가 결합되지 않는다는 것에 관한 것이다. 이 방법은 치료학적 산물을 생성하는데 이용하기 어려울 수도 있는데 그 이유는 트레실 염화물을 사용한 결과 독성 부산물이 생성될 수 있기 때문이다.
Chamow 등의 Bioconjugate Chem. 5:133-140(1994)호는 환원성 알킬화를 통한, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜("MePEG 글리콜")알데히드를 수반한 CD4 이뮤노아드헤진의 변형에 관하여 기술하고 있다. 저자는 변형된 CD4-IgG의 시험관 내 결합 능력(단백질 gp120에 대한)이 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜화의 정도와 서로 관련된 속도로 감소된다는 것을 보고하였다.
뇌 유래의 성장인자(BDNF) 및 뉴로트리핀-3(NT-3)은 신경 성장인자(NGF)를 포함하는, 뉴로트로핀이라고 불리는 독특한 종류의 신경영양성 인자에 속하는 공지된 폴리펩티드이다. 이 인자는 뉴론 기능의 생존 및 유지를 촉진시키며 신경변성 질환의 치료학적 치료를 위한 후 보물(candidate)을 제공한다[Barde 등의, Neuron 2 : 1525-1534(1989) ; Snider등의 Cell 77 : 627 - 638(1994)참조]. 이들 인자를 확인하고 재조합적으로 생산하는 방법은 다음 특허 문헌에 기술되어 있다 ; NGF에 대하여는 미국 특허 번호 제 5,169,762 호(Gray 등), BDNF에 대하여는 미국 특허 번호 제 5,180,820호(Barde 등)와 제 5,229,500호(Barde 등), 및 NT-3에 대하여는 공개 PCT 출원 번호 제 WO 91/03569호를 참조하시오.
[발명의 요약]
간단히 설명하면, 본 발명의 한 양상은 BDNF 또는 NT-3 폴리펩티드 성분에 폴리에틸렌 글리콜을 부가시켜 BDNF 및 NT-3 유도체를 제공하는 것이다.
특히, 본 발명은 BDNF 및 NT-3유도체를 포함하며, 여기서 중합체를 폴리펩티드에 부가시키기 위해 폴리펩티드를 반응성(즉, 활성) 수용성 중합체 성분과 반응시킨다. 그와 같은 부가는 본원에서 기술한, 아실화 또는 알킬화와 같은 반응으로써 수행할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜이나 다른 수용성 중합체를 수반하는 아실화 또는 알킬화는 대다수의 생성물이 모노-또는 폴리-유도화되는 조건하에서 수행시킨다. 폴리유도체화는 일반적으로 폴리펩티드의 리신 잔기의
-아미노기에 폴리에틸렌 글리콜이나 다른 수영성 중합체가 부가되며 부가적으로 폴리펩티드의 N-말단에 상기 중합체가 부가된다. 모노유도체화는 바람직하게 BDNF 나 NT-3 폴리펩티드 성분의 N- 말단 잔기의
-아미노기에 중합체가 부가됨으로써, 폴리펩티드의 N-말단 상에 수용성 중합체 성분이 선택적으로 부가된다. 이것은 BDNF 나 NT-3 성분에 직접 결합된 폴리에틸렌 글리콜 성분을 가지는 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 나 NT-3 분자의 제제형(만일 폴리에틸렌 글리콜이 사용된 경우)뿐만 아니라 중합체/BDNF 또는 중합체1NT-3 복합체 분자의 실질적으로 균질한 제제형을 제공한다.
영영인자 BDNF 및 NT-3이 특히, 시험관내 및 생체내에서 뉴론의 생존과 유지를 촉진시키는 데 유용하다고 알려져 있고, 신경변성 질환, 그 중에서도 파킨슨병, 근위축성측상경화증(ALS), 헌팅톤병, 망막변성, 말초성 신경병 및 알쯔하이머병을 앓고 있는 인체를 치료하기 위한 잠재적 치료제로서 알려져 있는 바와 동일한 목적에 본 발명의 BDNF 나 NT-3 유도체가 유용하다.
보다 상세히 하기되어 있는 본 발명의 다른 양상은, 수용성 중합체, 특히 폴리에틸렌 글리콜이 폴리펩티드(BDNF 또는 NT-3)의 N-말단의
-아미노기에 부가되어, 유도체화된 분자, 즉 이들 폴리펩티드와 중합체의 복합체의 균질한 집단을 수득하는, 상기 언급한 변형을 갖는 BDNF 및 NT-3 유도체의 제조방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 알데히드의 N-하이드록시숙시니미딜(NHS)활성 에스테르를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜화된 생성물을 생성시키는 BDNF(또는 NT-3) 아실화의 예를 도시한 것이다. 이 도에서 k는 BDNF 또는 NT-3 분자와 반응하는 MPEG 분자의 수를 나타내고, n은 이 반응에 사용되는 MPEG의 중합체화 정도를 나타내며(100kDa의 분자량을 가지는 MPEG에 대하여 n=2000이고 2kDa의 분자량을 가지는 MPEG에 대하여 n=40이다), m은 BDNF 또는 NT-3분자당 일차 아미노기의 총수를 나타낸다.
제2도는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 활성 알데히드를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜화된 생성물을 생성시키는 BDNF (또는 NT-3)의 비특이 환원성 알킬화의 예를 도시한 것이다. 이 도에서, k,m 및 n은 상기 정의한 바와 동일하다.
제3도는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 활성 알데히드를 사용하여 실질적으로 모노폴리에틸렌 글리콜화된 생성물(N-말단에서)을 생성시키는 폴리펩티드의 N-말단 잔기의
-아미노기에서의 BDNF 또는 NT-3의 특정 부위 환원성 알킬화의 예를 도시한 것이다.
제4도는 생체내 동물 모델에서 말초 신경 기능의 상싱에 대한 축색 절단된 안면 운동성신경원의 콜린 아세틸트랜스페라제(ChAT) 면역조직화학을 도시한 것이다[Yan 등의 J.Neurosci. 14(9) : 5281-5291(1994)참조]. 성숙한 암컷 랫(rat)의 우측 안면 신경을 절단하고 그 동물에게 다음과 같이 7일간 각 날에 피하주사하였다 : PBS(A), 5mg/kg 체중의 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF(B), 0.3 mg/kg의 N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF (C), 또는 0.3mg/kg의 무작위적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF(D). PBS로 처리한 랫에게서, 축색절단은 손상된 안면 핵의 ChAT 면역반응성의 큰 감소로 나타났다(패널 A 오른쪽면 상의 안면 핵). 대조적으로, 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 와 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 둘 다로 처리한 경우(패널 B,C 및 D)에는 손상-유도 감소의 ChAT 면역반응성이 감소되었다. 기호은 다음과 같다 : FN, 안면 핵 ; py, 추체로 ; Sp5, 삼차신경의 척수로 핵. 눈금막대(패널D)는 1mm를 표시한 것이다.
제5도는 제4도에서와 동일한 축색절단된 안면 운동성신경원 모델에서 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 및 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF로 시험 동물을 처리한 바에 따른 투여량-반응 곡선을 도시한 것이다. 동물에게 부형제 단독(
), 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF(?), N-말단 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF(
) 또는 무작위적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF(■)를 7일간 지정 투여량으로 매일 피하주하(S.C.)하였다. 값은 평균±SEM(n=4)으로서 나타나 있다. 데이터를 아노바(ANOVA)로 분석한 후 듀넷 t-검정하였다. *, p ＜ 0.05 ; **, p ＜ 0.01, BDNF 치료 대 부형제.
제6도는 우선조체의 중추내로 1회 주사한 후 살아있는 랫의 뇌 내로 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF("NAT-BDNF")또는 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF("PEG-BDNF")를 침투시킨 결과를 나타낸 막대 그래프이다. 20시간후에 4% 파라포름알데히드로 동물을 관류 - 고정시켰다. 뇌를 제거하여 절편화시킨 다음, Yan 등의 in Soc. Neurosci. Abs. 20 : 1366(1994)문헌에 기술되어 있는 방법에 따라 BDNF에 대한 특이 항체로 염색시켰다. 뇌 내로 침투된 BDNF 의 총 부피는 모든 BDNF 면역반응성 조직 절편을 적분하여 정량하였다. 값은 평균 ±SEM(n=4)으로서 나타나 있다. 데이터는 스투덴트 t-검정으로 분석하였다. *, p＜0.0001.
제7도는 7일간 연속적으로 국소 투여시킨 후 살아있는 랫의 뇌 내로 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 및 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF를 침투시킨 결과를 나타내는 막대 그래프이다. BDNF 침투의 총부피는 제6도에서와 동일하게 정량하였다. 데이터는 스투덴트 t-검정으로 분석하였다. *, p＜0.0001.
제8도는 제7도에 기술한 바와 동일한 방법을 사용하여, 살아있는 랫의 뇌 선조체내로 주입시킨 후 내부에 위치한 도파민작용성 뉴론에 대해 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF(패널 A 및 B)와 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF(패널 C 및 D)를 뇌 조적을 통하여 역행성 수송시킨 결과를 나타낸 것이다. 패널 B와 D는 각각 패널 A와 C의 사각형 부분을 확산시킨 것이다. 패널 A에서 기호는 다음의 의미를 갖는다 : SNC, 흑색질 치밀층 ; SNR, 흑색질 망상층 ; 및 VTA, 복측피개영역. 피널 D의 막대는 패널 A와 C에 대하여 500㎛ 을 표시하고 패널 B 와 D 에 대하여는 200㎛를 표시한다.
[발명의 상세한 설명]
BDNF 및 NT-3의 천연(즉, 자연발생적인)서열 이외에 예를들어 키메라, 유사체 등의 분자와 유사한 생물학적 특성을 나타내는 천연 서열로 부터 유래된 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삭제 또는 부가를 나타내는 단편, 전구체 및 폴리펩티드 분자도 본 발명을 실시하는데 사용하고자 한다. 결과적으로, 특별한 다른 지시가 없는한, 용어 "BDNF" 및 "NT-3"은 앞서 말한 형태 중 임의의 형태를 갖는 이들 폴리펩티드를 의미할 것이다.
BDNF 및 NT-3의 제조방법, 특히 재조합 수단에 의한 방법은 공지되어 있으며, 이 방법은 전형적으로 대량 수득하기 위해서는 가장 실제적이다. 상기 언급한 미국 특허 번호 제 5,180,820호와 제 5,229,500호, 및 공개 PCT 출원 번호 제 WO 91/03569호에 기술된 내용을 포함하여, 과학문헌 및 특허문헌에 유용한 과정들이 기술되어 있으며, 이들 모두를 본원의 참고문헌으로 인용한다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위해 특히 바람직한 것은 원핵 및 진핵세포에서 재조합적으로 발현되는 것으로서 천연 서열로 된 BDNF 및 NT-3이며, 이와 같은 것에는 인체 누클레오티드 서열로부터 발현된 재조합 폴리 펩티드 산물("r-HuBDNF" 및 "r-HuNTNF-3")이 포함되고, N-말단에서 메티오닌 잔기를 포함하도록 박테리아 세포에서 발현된 산물(즉, "r-metBDNF" 및 r-metNT-3")도 포함된다. 그와 같은 폴리펩티드의 예는 서열 : 1("r-metBDNF"), 서열 3("r-HuNT-3") 및 서열 4("r-metHuNT03")에 나타낸 서열을 가지는 폴리펩티드이다.
BDNF 및 NT-3 의 폴리에틸렌 글리콜화는 본 기술분야에서 공지되어 있는 폴리에틸렌 글릴콜화 반응 중 임의의 반응을 이용하여 수행할 수 있다. 예를들어 다음을 참조하시오 : Focus on Growth Factors 3(2) : 4- 10(1992) 문헌 ; 제 EP 0 154 316호 ; 제 EP 0 401 384 호 ; 및 폴리에틸렌 글리콜화와 관련 있는, 본원에서 인용한 다른 공개 문헌. 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 유사한 반응성의 수용성 중합체)를 수반하는 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통하여 수행한다. 폴리에틸렌 글리콜을 수반한 유도체화를 위한 바람직한 수단은 하기에 보다 상세히 기술되어 있다
[아실화]
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의활성 에스테르 유도체를 BDNF 또는 NT-3 폴리펩티드와 반응 시키는 것이다. 실질적으로 이들 폴리펩티드를 폴리에틸렌 글리콜화 시키는데 있어 어떠한 반응성 PEG 분자라도 사용될 수 있다. 바람직한 활성화 PEG 에스테르는 N-하이드록시니미드("NHS")에 대하여 에스테르화된 PEG 이다. 본원에 사용된 바와 같이, "아실화"는 PEG와 같은 수용성 중합체와 BDNF 또는 NT-3간에 다음 유형의 결합을 제한 없이 포함하고자 한다 : 아미드, 카르밤산염, 우레탄 등 ; Bioconjugate Chem. 5 : 133-140(1994) 문헌 참조. 반응 조건은 본 기술분야에 공지되어 있는 조건 중 어떠한 조건이나 또는 실질적으로 발전된 조건으로 부터 선택할 수 있으나, 변형되어진 BDNF 또는 NT-3종을 비활성화시킬 수 있는 온도, 용매 및 pH와 같은 조건은 피해야 한다. 일반적으로 적용되는 반응 조건은 하기에 기술될 것이다. 모노메톡시-PEG 의 NHS 에스테르를 수반하는 전형적인 반응은 제6도에 도시되어 있다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 폴리폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 및 NT-3 생성물을 생성시킬 것이며, 여기서 리신
-아미노산기가 아실 결합기를 톤하여 폴리에틸렌 글리콜화된다. 바람직하게, 연결 결합은 아미드일 것이다. 또한 바람직하게, 결과적인 생성물은 실질적으로(예를들어,
95%) 모노, 디-또는 트리-폴리에틸렌 글리콜화될 것이다. 그러나, 더 높은 정도로 폴리에틸렌 글리콜화된(BDNF 및 NT-3의 리신
-아미노산기의 최대 수+BDNF 또는 NT-3의 아미노 말단에서 하나의
-아미노기 까지)일부 종은 보통, 사용된 특정 반응 조건에 따르는 양으로 형성될 것이다. 원한다면, 표준 정제 기술, 특히 투석, 염석, 한외여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 포함하는 기술에 의해, 비반응된 종을 포함하는 혼합물로부터 더 정제된 폴리에틸렌 글리콜화된 종을 분리할 수 있다.
[알킬화]
알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 PEG 의 알데히드 유도체를 환원제의 존재하에서 BDNF 또는 NT-3 과 같은 폴리펩티드와 반응시키는 것이다. 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 또한 폴리폴리에틸렌글리콜화된 BDNF 또는 NT-3을 생성시킬 수 있다. 폴리폴리에틸렌 글리콜화된 생성물을 생성시키는 전형적인 환원성 알킬화 반응은 제7도에 도시되어 있다. 또한 BDNF 및 NT-3 폴리펩티드의 N-말단의
-아미노기에서만 실질적으로 폴리에틸렌 글리콜화 시키기 위해(즉, 모노폴리에틸렌 글리콜화된 종) 본원에서 기술한 반응 조건을 조작할 수 있다. 모노폴리에틸렌 글리콜화된 생성물을 생성시키는, BDNF 또는 NT-3을 수반한 전형적인 환원성 알킬화 반응은 제8도에 도시되어 있다. 모노폴리에틸렌 글리콜화나 폴리폴리에틸렌 글리콜화 중 어느 경우에나, PEG 기를 -CH2-NH-기를 통하여 폴리펩티드에 부가시키는 것이 바람직하다. -CH2-기에 대한 특별한 언급으로서, 이러한 유형의 결합을 본원에서 "알킬"결합이라 언급한다.
모노폴리에틸렌 글리콜화된 생성물을 생성시키는 환원성 알킬화를 통한 유도체화는 BDNF 또는 NT-3의 유도체화에 유용한 일차 아미노기(리신 대 N-말단)를 갖는 다른 유형의 개별적인 반응성을 이용하는 것이다. 폴리펩티드의 리신 잔기의
-아미노기와 N-말단 잔기의
-아미노기간의 pKa 차이의 잇점을 얻을 수 있게 하는 pH(하기참조)에서 반응을 수행한다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 알데히드와 같은 반응기를 포함하는 수용성 중합체가 폴리펩티드에 부가되는 것이 조절된다. 중합체를 수반하는 복합체는 폴리펩티드의 N-말단에서 주로 일어나며, 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기의 상당한 변형은 발생되지 않는다. 하나의 중요한 양상에서, 본 발명은 중합체 분자가 실질적으로(즉,
90%) BDNF 또는 NT-3의 단일 위치에서만 부가된, 모노중합체/BDNF 또는모노중합체/ NT-3 복합체 분자의 실질적으로 균질한 제제형을 제공한다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 경우에도 본 발명은 항원 결합기가 결여되고 BDNF 또는 NT-3 폴리펩티드에 직접 결합된 폴리에틸렌 글리콜 분자를 가지는 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 또는 NT-3을 제공한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양상은 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 및 NT-3에 관한 것이며, 여기서 PEG 기(들)은 아실 또는 알킬 결합을 통해 부가된다. 상기한 바와 같이, 그러한 생성물은 모노폴리에틸렌 글리콜화되거나 폴리폴리에틸렌 글리콜화(예를들어, 2-6, 바람직하게 2-5개의 PEG기를 포함)될 수 있다. PEG기는 일반적으로 폴리펩티드 사슬의
및/또는
아미노기에서 그 폴리펩티드에 부가되지만, 또한 이 PEG 기가 적합한 반응 조건하에서, PEG 기에 부가되도록 충분하게 반응성인 폴리펩티드 구조의 어떠한 아미노기에도 부가될 수 있음을 포함하고자 한다.
아실화 및 알킬화에 사용되는 중합체 분자는 수용성 중합체 또는 그의 혼합물 중에서 선택할 수 있다. 선택한 중합체는, 이 중합체에 생리학적 환경과 같은 수용액 환경에서 침전되지 않도록 하기 위해 수용성이어야 한다. 선택한 중합체는 단일 반응기-아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드-를 가지도록 변형시켜야 하며, 바람직하게는 중합체의 정도가 본 방법이 제공하는 바 대로 조절될 수 있도록 변형되어야 한다. 바람직한 반응성 PEG 알데히드는 물에 안정한 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드이거나, 모노 C1-C10 알콕시 또는 그의 아릴록시 유도체이다(미국 특허 번호 제 5,252,714호 참조). 중합체는 분기되거나 분기되지 않을 수 있다. 바람직하게, 최종 - 산물 제제형의 치료학적 용도를 위해 중합체는 제약학적으로 용인가능할 것이다. 수용성 중합체는 예를들어 다음으로 구성된 그룹 중에서 선택할 수 있다 : 폴리에틸렌 글리콜(예를들어, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜), 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈), 프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를들어, 글리셀롤)및 폴리비닐 알콜. 아실화 반응을 위해, 선택된 중합체는 단일 활성 에스테르기를 가져야 한다. 환원성 알킬화를 위해, 선택된 중합체는 단일 활성 알데히드를 가져야 한다. 일반적으로, 수용성 중합체는 자연발생적인 글리코실 잔기로 부터는 선택하지 않을 것인데 그 이유는 이들이 보통 포유동물 재조합 발현계에 의해 보다 알맞게 형성되기 때문이다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분기되거나 분기되지 않을 수도 있다.
본원에 사용하기에 특히 바람직한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 다른 단백질, 예를들어 모노-(C1-C10)알콕시-또는 아릴록시-폴리에틸렌 글리콜과 같은, 단백질을 유도체화시키는데 상용되어 온 어떠한 형태의 PEG 도 포함함을 의미한다.
일반적으로, 생물학적 활성 물질을 활성화 수용성 중합체 분자와 반응시키는데 사용되는 어떤 적합한 조건하에서도 유도체화를 수행할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 또는 NT-3을 제조하는 방법은 일반적으로 다음 단계를 포함할 것이다 : (a)BDNF 또는 NT-3 을 하나 또는 그 이상의 PEG기에 부가시키는 조건하에서 BDNF 또는 NT-3 폴리펩티드를 폴리에틸렌 글리콜(PEG 의 활성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같음)과 반응시키는 단계, 및 (b)반응 생성물을 수득하는 단계. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적 반응 조건은 공지의 변수 및 원하는 결과를 기초로 하여 그때그때 결정할 것이다. 예를들어, PEG : 단백질의 비율이 보다 커질수록 폴리에틸렌 글리콜화된 생성물의 백분율은 더 많아질 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, 모노중합체/폴리펩티드 복합체 분자의 실질적으로 균질한 집단을 생성시키는 환원성 알킬화는 일반적으로 다음 단계를 포함할 것이다:(a) 폴리펩티드의 아미노 말단에서
-아미노기를 선택적으로 변형시키기에 적합한 pH, 환원성 알킬화 조건하에서 BDNF 또는 NT-3 폴리펩티드를 반응성 PEG 분자와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물을 수득하는 단계.
모노중합체/BDNF 또는 모노중합체/NT-3 복합체 분자의 실질적으로 균질한 집단을 위한 환원성 알킬화 반응 조건은 수용성 중합체 성분을 폴리펩티드의 N-말단에 선택적으로 부가시키는 조건이다. 그러한 반응 조건은 일반적으로 리신
-아미노기와 N-말단의
-아미노기 간의 pKa 차이를 제공한다(pKa는 아미노기의 50%는 양성자 첨가되고 50%는 양성자 첨가되지 않을 때의 pH이다). 또한 pH는 사용될 폴리펩티드에 대한 중합체의 비율에 영향을 미친다. 일반적으로, pH가 보다 낮으면, 폴리펩티드에 대해 보다 많은 과량의 중합체가 요구되 것이다(즉, 활성 N-말단
-아미노기가 보다 적을수록, 최적 조건을 획득하는데 필요한 중합체는 보다 많아질 것이다). pH가 보다 높다면, 중합체 : 폴리펩티드의 비율은 클 필요가 없다(즉, 보다 많은 반응기가 이용될 수 있으므로 보다 적은 중합체 분자가 필요하다). 본 발명의 목적을 위한 pH는 일반적으로 3-9범위, 바람직하게는 3-6 범위 이내일 것이다.
또 다른 중요한 고려할 사항은 중합체의 분자량이다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 높을수록 폴리펩티드에 부가되는 중합체 분자의 수는 더 적을 것이다. 유사하게, 중합체의 분기는 이들 변수가 최적화될 때 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 더 높을수록(또는 더 많이 분기될수록), 중합체 : 폴리펩티드의 비율은 더 높다. 일반적으로, 본원에서 의도하고자 하는 폴리에틸렌 글리콜화 반응을 위한, 중합체에 대한 바람직한 평균 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100kDa이다(용어 "약"은 ±1 kDa을 의미한다). 보다 바람직한 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50kDa이며, 특히 약 12 kDa 내지 약 25 kDa 이다. BDNF 또는 NT-3 에 대한 수용성 중합체의 비율은 일반적으로 1:1 내지 100:1 의 범위일 것이며, 바람직하게 1:1 내지 20:1(폴리폴리에틸렌 글리콜에 대한 비율) 및 1:1 내지 5:1(모노폴리에틸렌 글리콜에 대한 비율)일 것이다.
상기한 조건을 이용하여 본 발명에 따라 환원성 알킬화시키면, 아미노 말단에
-아미노기를 가지는 어떠한 BDNF 또는 NT-3 폴리펩티드 단백질에도 중합체가 선택적으로 부가될 것이며, 모노중합체/폴리펩티드 단백질 복합체의 실질적으로 균질한 제제형이 제공될 것이다. 본원에서 사용하는 용어 "모노중합체/폴리펩티드 복합체"는 BDNF 또는 NT-3분자에 부가된 단일 중합체 분자로 구성되는 조성물을 의미한다. 모노중합체/폴리펩티드 복합체는 리신 곁기(side group) 상이 아니라 N-말단에 위치하는 중합체 분자를 가질 것이다. 제제형은 80% 이상의 모노중합체/폴리펩티드 복합체가 바람직할 것이며, 특히 90%이상의 모노중합체/폴리펩티드 복합체가 바람직할 것인데, 관찰가능한 분자의 잔류물은 반응하지 않는다(즉, 중합체 성분이 결여되어 있는폴리펩티드). 하기한 예는 최소한 약 90%가 모노 중합체/폴리펩티드 복합체이고, 약 10%가 비반응 폴리펩티드인 제제형을 제공한다. 모노중합체/폴리펩티드 복합체는 생물학적으로 활성이다.
본 환원성 알킬화를 위한 환원제는 수용액에 안정해햐 하며 환원성 알킬화의초기 과정에서 형성되는 시프염기만을 환원시킬 수 있는 것이 바람직하다. 바람직한 환원제는 소디움 보로하이드라이드라이드, 소디움 시아노보로하이드라이드, 디메틸아민 보레인, 티메틸아민 보레인 및 피리딘 보레인으로 구성된 그룹 중에서 선택한다. 특히 바람직한 환원제는 소디움 시아노보로하이드라이드이다.
용매, 반응시간, 온도 등과 같은 다른 반응 변수 뿐만 아니라 생성물의 정제 수단도 수용성 중합체를 수반한 단백질의 유도체화와 관련 되는 공개된 정보를 기초로 하여 그때 그때 결정할 수 있다(본원에서 인용한 공개문헌 참조). 전형적인 설명은 하기 실시예에 나타나 있다.
아실화 및/또는 알킬화 방법에 의해 중합체/폴리펩티드 복합체 분자의 혼합물을 제조하면, 본원에서 제공하는 잇점은 혼합물에 포함되는 모노 중합체/폴리펩티드 복합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서 원한다면, 여러 가지 수의 중합체 분자(즉, 디-, 트리-, 테트라-등)가 부가된 다양한 폴리펩티드 혼합물을 제조하여 본 방법을 이용하여 제조한 모노중합체/폴리펩티드 복합체 물질과 결합시킴으로써, 모노중합체/폴리펩티드 복합체의 예정 비율을 갖는 혼합물을 만들 수 있다.
언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 중합체/폴리펩티드 복합체는, BDNF 및 NT-3이 유용하다고 공지되어 있는 동일 목적에 사용할 수 있다. 이들 폴리펩티드는, 시험관내에서 뉴론의 생존 및 유지를 촉진시키는 영양인자로서 효과적이라고 이미 알려져 왔으므로, 연구가 가능하고 연구시 뉴론의 상용을 가능하게 한다. 보통 그와 같은 세포는 배양시 생존을 유지시키기가 매우 어렵다. 이들의 동일한 생물학적 활성도는 동물의 신경학적 연구를 위해 생체내에서 그와 같은 인자의 사용을 지지하며, 뉴론 기능의 상실과 관련되는 신경변성 질병을 치료하기 위한 치료제로서의 잠재력을 제공한다.
치료 목적을 위해, 본 발명의 중합체/폴리펩티드 복합체를 제형화시켜 어떠한 무균 생체적합성 제약학적 담체-식염수, 완충식염수, 덱스트로스 및 및 물이 포함되나 이에 제한되지는 않음-내에서도 함께 투여시킬 수 있다. BDNF /중합체 또는 NT-3/중합체 복합체의 양은 질병의 성질이나 증상에 따를 특정 질병이나 증상을 치료하는데 효과적일 것이며 이 양은 표준 임상기술로써 결정할 수 있다. 가능한 경우에, 본 발명의 제약학적 조성물에 대한 투여량-반응 곡선을, 맨 먼저 시험관 내에서, 예를들어, 참고문헌에 기술되어 있는 BDNF 및 NT-3 생물검정계에서와 같이 측정한 다음 인체를 시험하기 전에 유용한 동물 모델에서 측정하는 것이 바람직하다. 투여방법에는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 폐 및 경구투여가 포함될 것이다. 이외에도, 심실내 또는 초내 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로를 통해 제약학적 조성물을 중추 신경계내로 도입시키는 것이 바람직할 것이다. 또한, 치료가 필요한 영역에 국소적으로 제약학적 조성물을 투여하는 것이 바람직할 것이다. 이것은 예를 들어 다음에 의해 획득될 수 있다 : 외과수술시 국소주입, 주사, 카테터 수단, 또는 다공, 무공, 젤란틴양, 섬유성 또는 막성 물질의 이식 이용.
[특정 실시형태의 기술]
본 발명에 따른 개재의 BDNF 및 NT-3 유도체 제조 및 그들의 물리적, 생물학적 성질은 하기 본문에 나타나 있다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 충분히 설명하기 위해 제시하는 것이며, 이것으로 한정하려는 것은 아니다. 이들 실시예에서는, 달리 특정화하지 않는한 E. coli 내에서 재조합적으로 제조한 인체 BDNF 및 NT-3 (즉, r-metHuBDNF 및 - r-metHuNT-3)을 이용하였다.
[실시예 1]
[N-말단의 α-아미노기에 부착 부위를 갖는 모노MPEG(6 kDa)-BDNF 복합체의 제조]
2-mM NaCNBH3를 함유하는 100mM 인산 나트륨, pH 4.0 내지 냉각(4℃), 교반시킨 r-metHuBDNF 용액(2.5mg/ml)에, 6,000 달톤(즉, 6 kDa)의 평균 분자량을 갖는 2배 몰 초과량의 활성화 메톡시폴리에틸렌 글리콜(MPEG) 알데히드를 가하였다.
0.5 M NaCl 을 함유하는 100mM 인산나트륨, pH6.9 를 0.4ml/분의 유량으로 용리시킨 수포로스 6 HR 10/30 컬럼(파마시아에서 구입)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 반응 진행 중에 단백질의 변이 정도를 모니터하였다. 10시간 후, 크기 배제 크로마토그래피 분석으로, 모든 폴리펩티드(용액내에서는 이합체로 존재함)가 실질적으로 N-말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 유도체의 가능한 두 형태 : BDNF 이합체의 N-말단 중 하나 또는 둘다에 MPEG가 복합된 형태로 전환되었음을 확인하였다.
반응 혼합물을 멸균수로 총 5배 희석한 다음, 20mM 인산나트륨 완충액, pH 7.5로 평형화시킨 하이로드 16/10 S 세파로스 HP 이온 교환 컬럼(파마시아에서 구입)에 가하였다. 반응 혼합물을 1 ml/분의 유량으로 컬럼에 적하하고, 비반응 MPEG 알데히드를 3컬럼 부피의 동일 완충액으로 용리하였다. N- 말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 이합체의 두 형태를 용리하는 데에 0.75 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산나트륨, pH 7.5의 0% 내지 100% 선형 500 분 기울기를 이용하였다. MPEG-BDNF 유도체를 함유하는 분획의 풀을 제조하고 농축한 다음 멸균여과하였다.
[실시예 2]
[N-말단의 α-아미노기에 부착 부위를 갖는 모노MPEG(20 kDa)BDNF 복합체의 제조]
20,000달톤(20 kDa)의 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MPEG) 알데히드 및 pH 5.0 을 이용하는 것을 제외한 실시예 1의 과정을 반복하였다.
[실시예 3]
[MPEG 알데히드로 인한 환원성 알킬화에 의한 폴리MPEG(6 kDa)-BDNF 복합체의 제조]
6 kDa 의 평균 분자량을 갖는 4배 몰 초과량의 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MPEG) 활성화 알데히드를, 20 mM NaCHBH3를 함유하는 100 mM 비신 (BICINE), pH 8 내의 냉각(4℃), 교반시킨 r-metHuNDNF 용액(10mg/ml)에 가하였다.
0.5M NaCl을 함유하는 100 mM 인산나트륨, pH 6.9를 4 ml/분으로 용리시킨 수퍼로스 6 HR 10/30 컬럼(파마시아에서 구입)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 반응 진행 중에 단백질의 변이 정도를 모니터하였다. 10시간 후, 크기 배제 크로마토그래피 분석으로 모든 폴리펩티드가 MPEG에 의해 변이되었음을 확인하였다.
반응 혼합물을 멸균수로 5배 희석한 다음 pH를 7로 맞추고(인산을 이용), 20mM 인산나트륨 완충액, pH 7.5로 평형화시킨 하이로드 16/10 S 세파로스 HP 이온 교환 컬럼(파마시아)에 혼합물을 가하였다. 반응 혼합물을 1 ml/분의 유량으로 컬럼에 적하한 다음, 3 컬럼 부피의 동일 완충액으로 비반응 MPEG 알데히드를 용리하였다. MPEG-BDNF 복합체를 용이하는 데에 0.75 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산나트륨, pH 7.5의 0% 내지 100% 선형 500분 기울기를 이용하였다. MPEG-BDNF 복합체를 함유하는 분획의 풀을 제조하고 농축한 다음 멸균여과 하였다.
[실시예 4]
[MPEG 알데히드로 인한 환원성 알킬화에 의한 폴리MPEG(6 kDa)-BDNF 복합체의 제조]
6배 몰 초과량의 MPEG 알데히드를 이용한 것을 제외하고는 실시예 3의 과정을 반복하였다.
[실시예 5]
[활성화 MPEG 유도체로 인한 아실화에 의한 폴리MPEG(6 kDa)-BDNF 복합체의 제조]
0.1 M 비신 완충액, pH 8 내의 냉각(4℃), 교반시킨 r-metHuBDNF 용액(6mg/ml)에, 6 kDa의 평균 분자량을 갖는 4배 몰 초과량의 카르복시메틸 MPEG 의 숙시니미딜 에스테를를 가하였다. 가벼운 교반에 의해 중합체를 해리시키고, 동일 온도에서 반응을 지속시켰다.
05 M NaCl 을 함유하는 100 mM 인산나트륨, pH 6.9 를 0.4ml/ 분씩 용리시킨 스퍼로스 6 HR 10/30 컬럼(파마시아에서 구입)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 반응 진행 중에 단백질의 변이 정도를 모니터 하였다. 3시간 후, 크기 배제 크로마토그래피는 모든 BDNF 이합체가 MPEG 에 의해 변이되었음을 나타내었다.
반응 혼합물을 멸균수로 4배 희석한 다음 혼합물의 pH를 7로 맞추었다(0.5M 인산을 이용). 20 mM 인산나트륨, pH 7.5 로 평형화 시킨 하이로드 16/10 S 세파로스 HP 이온 교환 컬럼(파마시아에서 구입)에 이 용액을 가하였다. 비반응 MPEG 알데히드를 3 컬럼 부피의 동일 완충액으로 용리하였다. 0.75 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산나트륨, pH7.5의 0% 내지 100% 선형 500분 기울기를 MPEG-BDNF 복합체를 용리하는 데에 이용하였다. MPEG-BDNF 복합체를 함유하는 분획의 풀을 제조하여 농축한 다음 멸균여과 하였다.
[실시예 6]
[활성화 MPEG 유도체로 인한 아실화에 의한 폴리MPEG(6 kDa)-BDNF 복합체의 제조]
동일한 몰-대-몰 비의 반응물을 이용한 것을 제외하고는 실시예 5의 과정을 반복하였다.
[실시예 7]
[활성화 MPEG 유도체로 인한 아실화에 의한 폴리MPEG(6 kDa)-BDNF 복합체의 제조]
20kDa 의 평균 분자량을 갖는 MPEG 숙시니미딜 프로피오네이트 및 BDNF 이합체에 대한 6배 몰 초과량의 MPEG 를 이용한 것을 제외하고는 실시예 5의 과정을 반복하였다.
[실시예 8]
[N-말단의 α-아미노 잔기에 부착 부위를 갖는 모노MPEG(20 kDa)-NT-3 복합체의 제조]
150mM NaCl 및 20 mM NaCNBH3를 함유하는 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.0 내의 냉각 (4℃), 교반시킨 r-metHuBNT-3 용액(4.77 mg/ml)에, 20 kDa 의 평균 분자량을 갖는 3배 몰 초과량의 활성화 MPEG를 가 하였다.
150 mM NaCl 을 함유하는 10 mM 인산나트륨, pH 7.1을 0.4 ml/분의 유량으로 용리시킨 수퍼로스 6 HR 10/30 컬럼(파마시아에서 구입)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 반응 진행 중에 단백질의 변이 정도를 모니터 하였다. 10시간 후, 모든 단백질(용액내에서는 이합체로 존재)은 N-말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 유도체의 두 가지 가능한 형태 : NT-3 이합체의 N- 말단 중 하나 또는 둘다에 MPEG 가 복합된 형태로 전환되었음을 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
반응 혼합물을 20mM 인산나트륨, pH 7.1로 총 5배 희석한 다음, 20mM 인산나트륨 완충액, pH7.1로 평형화시킨 하이로드 16/10 S 세파로스 HP 이온 교환 컬럼(파마시아에서 구입)에 가하였다. 1ml/분의 유량으로 반응 혼합물을 컬럼에 적하한 다음 비반응 MPEG 알데히드를 3컬럼 부피의 동일 완충액으로 용이하였다. N-말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 NT-3 이합체의 두 형태를 용이하는 데에, 0.4 M NaCl 을 함유하는 20mM 인산나트륨, pH 7.1의 0% 내지 100% 선형 기울기를 이용하였다. MPEG-NT-3 유도체를 함유하는 분획의 풀을 제조하고 농축한 다음 멸균여과하였다.
부가적인 MPEG-BDNF 또는 MPEG-NT-3 복합체는 서로 다른 평균 분자량, 예를들어 5 kDa 내지 50 kDa 의 MPEG 알데히드로 BDNF 또는 NT-3 을 변이시킴으로써 수득할 수 있으며, 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 10-20% 또는 4-20%의 미리 제조된 구배 겔[인테그레이티드 세퍼레이션 시스템스(Integrated Separation Systems)에서 구입]을 이용한 도데실황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해, 결과적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 또는 NT-3 복합체의 균질성을 결정하였다. MPEG-BDNF 또는 MPEG-NT-3 각 종의 효과적인 크기를 특정화하기 위해, 수퍼로스 6 HR 10/30(파마시아에서 구입)겔 여과 컬럼을 이용하였다. 280nm UV 흡광도로 단백질을 검출하였다. 바이오-래드(BIO-RAD) 겔 여과 기준을 구형 단백질의 분자량 표식으로 삼았다. 참강 평형 분석 초원심분리(sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation) 및 매트릭스-보조 레이져 탈착 질량 분광 분석 (matrix-assisted laser desorption mass spectrometric analysis)을 이용하여 복합체의 분자량을 결정하였다. MPEG-BDNF 또는 MPEG-NT-3 복합체의 각 N-말단 구조는 N-말단 단백질 서열 결정 및 펩티드 지도화의 표준적인 방법을 이용하여 확인하였다.
PC12/pcDneo-trkB#18 세포에 의해 흡수되는 분자내 염인 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-3(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-4 술포페닐)2H-테트라졸리움에 미치는 영향에 따라, 실시예 1-7에서 제조한 MPEG-BDNF 복합체의 시험관내 생물학적 활성도를 결정하였다. 복합체의 제조에 이용된 주요 반응 변수 뿐만 아니라 결과를 표1에 요약하였다.
[표 1] MPEG-BDNF 복합체의 특성 및 제조 반응의 주요 변수의 요약
a - BDNF 이합체의 몰/몰
b - 겔 여과에 의해 측정한 겉보기 분자량
n/a - 적용할 수 없음
[실시예 9]
[성숙한 랫의 운동성신경원에 대한 모노MPEG (20 kDa)-BDNF 복합체의 생체내 생물학적 활성도의 평가]
BDNF는 앞서 자연발생적이고 축색절단-유도성인 세포 사멸로부터 발육상태의 운동성신경원을 구제하는 것으로 나타났다 ; Yan 등의 Nature 360 : 755-757 (1992) ; 및 Sendtner 등의 Nature 360 : 757-759(1992)참조. 또한, 축색절단된 성숙한 운동성신경원은 외인성 BDNF 와 반응하며, 특히 여러 형태로 투여되는 BDNF는 성숙한 랫의 안면 운동성신경원에 있어서 콜린 아세틸트랜스페라제 (ChAT) 면역 반응성의 축색절단-유도성 감소를 줄이는 것으로 설명되어 왔다 ; Yan 등의 J. Neurosci. 14(9):5281-5291(1994) 참조.
ChAT 가 운동성신경원에 의해 생산되는 생체 신경전달물질이므로, ChAT 활성도의 감소는 운동성신경원 기능의 손실을 암시한다. 따라서, 이러한 연구는 BDNF 가 성숙한 운동성신경원 감소에 대한 치료제로서 유용함을 나타낸다. 본 연구에 있어서, 생체내 손상된 성숙 운동성신경원 상의 N-말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 및 무작위로 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 종(실시예 1 및 3 참조) 의 생물학적 활성도를 측정한다.
[방법]
A. 동물의 수술 및 치료
암컷의 성숙한 스프래그-돌레이랫(총 52 마리의 랫, 각 군의 n=4)을 0.7 ml/kg 체중의 투여량의 칵테일 (43 mg/ml 케타민 히드로클로라이드, 8.6 mg/ml 크실라진 및 1.43 mg/ml 아세프로마진)로 마취시켰다. 경유돌공 근처의 우측 안면 신경을 가로로 절개하였다. 수술한 날부터 시작하여 (0 일째) 7일 동안 1일 1회씩 동물을 피하치료하였다. 이용한 투여량은, 각각 PBS 내에서 비폴리에틸렌글리콜화된 BDNF, N- 말단 모노 MPEG (20 kDa)- BDNF 복합체 또는 무작위 폴리 MPEG-BDNF 복합체의 kg 체중 당 0.1, 0.3, 1.0 및 5.0 mg 이었다. 한 군의 랫은 대조로서 PBS 만으로 처리하였다. 동물의 체중을 매일 측정하였다.
B. ChAT 면역조직화학
과도하게 마취시켜 랫을 희생시키고 PBS를 살포한 다음 0.1 M 인산나트륨 완충액, pH 7.2 내의 4% 파라포름 알데히드를 살포하였다. 뇌간을 제거하여 PBS 내지 30% 수크로스로 항냉동시키고 활주 마이크로톰 척 상에서 동결시킨 다음 안면핵부를 관통하여 80 ㎛ 연속 관상절단면을 절단하였다. 절단면을 Yan 및 Johnson 에 의해 J. Neurosci. 8(9) : 3481-3498 (1988) 에 기술된 ABC 방법 (미국 캘리포니아 벌링게임 소재 벡터 라보라토리스)을 이용하여 ChAT 에 대한 마우스 단클론성 항체 (복수, 1 : 500, 미국 캘리포니아 테메큘라 케미콘에서 구입)로 면역조직화학 처리한 다음, 2 ㎍/ml 의 2 차 비오틴화된 말의 항 -마우스 항체로 면역조직화학 처리하였다.
C. 면역조직화학 절편의 정량
ChAT 염색의 상대적 세기를 정하기 위해 니콘 옵티포트 - FXA 현미경과 짝으로 연결된 콴티메트 520 상 분석기 (Quantimet 520 image analyzer) (미국 일리노이 디어필드 소재 레이카 인코포레이티드에서 구입) 를 이용하였다. 조직학적 절편의 안면 핵부위의 고콘트라스트 상 (high contrast image) 을 만들기 위해 니콘 - 플랜 아포크로매틱 2X 대물 렌즈와 함께 510 nm 의 협소 - 밴드 통과 여과기 (narrow - band pass filter) (미국 코네티컷 스트랫포드 소재 오리엘 코포레이션에서 구입)를 이용하였다.
ChAT 면역반응성의 상대적인 정도는 주변 핵에서 ChAT 음성 회색 물질 부근의 배경 염색을 뺀 평균 회색 등급의 정도를 수득함으로써 결정하였다. 각 동물에 대하여 안면 핵을 함유하는 셋 또는 네 개의 절편을 정량에 이용하였다. BDNF 치료는 손상되지 않은 안면 핵의 ChAT 면역염색에 영향을 미치지 않았으므로, 동일한 절편의 비손상 안면 핵에 대한 손상 안면 핵의 상대적 흡광도의 비로 데이터를 나타내었다. 데이터는 아노바에 이어 듀넷 t - 검정에 의해 통계학적으로 분석하였다.
D. 결과
성숙한 랫의 축색절단으로 운동성신경원의 ChAT 면역반응성은 신속하고 재생가능한 감소를 일으킨다 ; Lams 등의 Brain Res. 475 : 401 - 406 (1988) 및 Armstrong 등의 J. Comp. Neurol. 304 : 596 - 607 (1991) 참조. 비폴리에틸렌 그리콜화 된 BDNF 와 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 가 성숙한 운동성신경원에 미치는 영향을 평가하기 위해, 이들 폴리펩티드가 운동성신경원내 ChAT의 발현에 미치는 영향을 연구하는 데에 상기 안면 신경 횡단 예를 이용하였다.
우측안면 신경을 횡단한 지 며칠 후, ChAT 면역반응성은 PBS 처리한 손상된 안면 핵으로부터 대부분 소실되었다 (제 4 도의 패널 A, 우측의 안면 핵). 천연 BDNF (5 mg/kg, 제 4 도의 패널 B), N - 말단 모노MPEG - BDNF 복합체 (0.3 mg/kg, 제 4 도의 패널 C) 및 무작위 폴리MPEG - BDNF 복합체 (0.3 mg/kg, 제 4 도의 패널 D)로 피하처리하면, ChAT 면역반응성의 손상 - 유도 감소가 현저히 줄었다. 이러한 현상을 정량화하기 위하여, ChAT 면역염색된 절편의 손상 및 비손상 안면 핵 둘다의 평균 흡광도를 측정하였다. 천연, N - 말단 모노MPEG - BDNF 복합체 및 무작위 폴리MPEG - BDNF 복합체 모두 투여량 - 의존 형태로 ChAT 면역반응성의 손상 - 유도 감소가 줄었다(제 5 도 참조). 5 mg/kg 투여량의 천연 BDNF 는 부형제 대조 (p ＜0.01) 이상으로 손상 - 유도 ChAT 면역반응성 감소의 현저한 약화를 보였다. N - 말단 모노MPEG - BDNF 복합체 또는 폴리MPEG - BDNF 복합체 중 어느 하나로 처리하면, 실험한 각 투여량에서는 부형제 대조 이상으로, 실험한 투여량보다 더 낮은 투여량에서는 천연 BDNF 이상으로 현저히 증진되었다. 대충, 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 로 처리하면 투여량 - 반응 곡선을 천연 BDNF 보다 왼쪽으로 약 20 배 이동시켰는데. 이것은 손상된 운동성신경원에 미치는 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 의 효과가 증진되었음을 의미한다.
[실시예 10]
[미발달 닭의 DRG 생물학적검정을 통한 N - 말단 모노MPEG - NT -3 복합체의 시험관내 생물학적 활성도 측정]
Lindsay 등의 Dev. Biol. 112 : 319 - 328 (1985) 문헌에 기술된 미발달 닭(embryonic chicken)의 배근신경절 (DRG) 검정을 이용하여 비폴리에틸렌 글리콜화된 NT -3 및 N - 말단 모노MPEG (20 kDa) - NT - 3 복합체의 상대적인 생물학적 활성도를 측정하였다. 간단히, 웰당 5 개의 미발달 (E8) 병아리의 배근신경절을 5 % 정상적인 말의 혈청을 함유하는 2 ml 의 F14 배지를 수반하는 콜라겐 매트릭스 내에서 외이식편으로 배양하였다. 신경영양성 인자 (비폴리에틸렌 글리콜화 및 폴리에틸렌 글리콜화된 것 둘다)의 영향을 위상차 현미경 하에서 가시적으로 평가하여 0 - 5 등급을 매겼다 (0 = 신경돌기 성장 안함, 5= 신경돌기 성장 최대).
하기 표 2 에 나타나 있는 결과는, 생활성도에 있어서 상당히 감소된 것으로 시험관내에서 분석된 다른 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질에 비추어 놀라운 결과로서 폴리에틸렌 글리콜화된 NT - 3 은 비폴리에틸렌 글리콜화된 NT - 3 에 비해 활성도의 손실을 입지 않았다.
[표 2] E8 닭의 DRG 시험관내 생물학적검정
[실시예 11]
[뇌조직을 통한 성숙한 랫 -침투에 대한 N -말단 모노PEG (20 kDa)-BDNF 복합체의 생체내 생물학적 작용의 부가적인 평가
1. 선조체 1 회 주입
1마이크로리터의 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 또는 N -말단 모노MPEG (20 kDa) - BDNF 복합체 (인산완충식 염수내 1 mg/ml) 를 성숙한 암컷 랫의 뇌 (n = 4) 우선조체의 중추로 18 -20 시간 동안 생체내 주입하였다. 20 시간 후, 과도하게 마취하여 동물을 희생시키고 PBS 에 이어 0.1 M 인산나트륨 완충액, pH 7.2 내의 4 % 파라포름알데히드를 살포하였다. 뇌를 제거하여 PBS 내 30 % 수크로스로 항냉동시키고 활주 마이크로톰 척 상에서 동결시킨 다음 60 ㎛ 연속 관상절단면을 절단하였다. 상기한 ABC 방법을 이용하여 1 ㎛/ml 의 토끼 항 - BDNF 항체에 이어 2 ㎛/ml 의 2 차 비오틴화된 염소의 항 - BDNF 항체로 절단면을 면역조직화학 처리하였다. 비폴리에틸렌 글리콜화 및 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 시료 둘다를 수반하는 선조체 주입 부위가 매우 진하게 염색되었다. 제 6 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 는 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 보다 약 2.4 배 더 넓은 조직의 영역으로 확산된 것으로 보였다. 명확하게 표지된 (보이지 않음) 흑질내 뉴론은 거의 없다.
2. 선조체의 7일 주입
성숙한 암컷의 랫 (n = 4) 의 선조체내로 7 일에 걸쳐 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 또는 N - 말단 모노MPEG (20 kDa) - BDNF 복합체 중 하나를 매일 주입하였다. 본 실험에 있어서, 상기 1 회 주입 프로토콜의 경우보다 BDNF 의 두 형태의 침투가 더 잘 되었다. 제 7 도에 나타나 있는 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 는 천연 BDNF 보다 약 6.1 배 더 넓은 영역으로 확산되었다. 비폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF (제 8 도의 패널 A 및 B) 보다 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF (제 8 도의 패널 C 및 D) 주입 후에, 흑질 치밀층 (" SNC ") 및 복측피개영역 (" VTH ") 의 보다 많은 뉴론이 명확히 표지되었다. 고배율하에서 BDNF - 면역반응성은 점상이며 핵주위부세포체 내에서 나타나는데, 이것은 BDNF 가 신경 말단에서 세포체로 역수송되었음을 의미한다. 흑색질 망상층 (" SNR ") 의 복측 중앙부에 나타나 있는 명확한 염색은 신경망이며, 어떤 세포체와는 관계가 없었다. 이러한 염색은 수용체 - 조절 역수송 보다는 비 -특이 확산에서 기인한 것이었다 ; Ferguson 등의 J. Comp. Neurol. 313 : 680 -692 (1991) 참조.
이러한 결과는 매우 중요하다. 전형적으로, 동물의 뇌에 대한 실질성 투여 후, BDNF 는 뇌 조직을 통해 매우 불충분하게 확산되는 것으로 나타난다. 본 데이터는 폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 사용시 그러한 확산 능력이 매우 개선되었음을 보여주는데 이것은 최소한, 이러한 투여 형태가 치료법으로서 잠재적으로 더 큰 효과를 가짐을 의미한다.
[서열목록]
(1) 서열들에 관한 일반정보 :
(i) 출원인 : 암젠 인코포레이티드
(i ) 발명의 명칭 : 수용성 중합체와 BDNF 및 NT - 3 의 복합체
(iii) 서열의 갯수 : 4
(iv) 통신 주소 :
(A) 수신인 : 암젠 인코포레이티드
(B) 가 : 디하빌랜드 드라이브 1840
(C) 시 : 사우전드 오크스
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국명 : 미국
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(v) 컴퓨터 판독 형태 :
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(B) 컴퓨터 : 범용 IBM PC
(C) 운영 체계 : PC - DOS/ MS - DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25
(vi) 현출원 데이터 :
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(viii) 대리인/관리인 정보 :
(A) 성명 : 마자. 리차드 제이.
(C) 참조/문서 번호 : A - 298
(2) 서열번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 119 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : 단백질
(xi) 서열 1 :
(2) 서열번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 120 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : 단백질
(xi) 서열 2 :
(2) 서열 번호 3에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 119 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류 : 단백질
(xi) 서열 3 :
(2) 서열 번호 4에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 120 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : 단백질
(xi) 서열 4 :
Claims (13)
- 폴리에틸렌 글리콜과 결합시킨 BDNF 또는 NT-3을 포함하는, BDNF 또는 NT-3 의 폴리에틸렌 글리콜 유도체.
- 제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜임을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 아실 결합이나 알킬 결합에 의해 BDNF 또는 NT-3 과 결합시킴을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 유도체.
- 제 4 항에 있어서, 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 임을 특징으로 하는 유도체.
- 다음 단계를 포함하는, 단일 반응성 알데히드기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 BDNF 또는 NT-3 과 결합시킴으로써 모노폴리에틸렌 글리콜화된 종을 제조하는 방법 :(a) BDNF 또는 NT-3 의 N-말단에서 알파(α) 아미노기를 활성화 시킬 수 있는 산성 pH 의 환원성 알킬화 조건하에서 BDNF 또는 NT-3을 폴리에틸렌 글리콜과 반응시킴으로써 상기 부위에서 BDNF 또는 NT-3 과 폴리에틸렌 글리콜을 결합시키는 단계 ; 및(b) N-말단의 알파(α)기 상에서 실질적으로 균질한 형태로 모노폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 또는 NT-3을 회수하는 단계.
- 제 6 항에 있어서, 환원성 알킬화 조건이 환원제로서 소디움시아노보로하이드라이드를 사용함을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 임을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, pH 는 3 내지 6 임을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항의 방법으로 제조한, N-말단의 알파(α) 아미노기 상에서 실질적으로 균질하게 모노폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF.
- 제 6 항의 방법으로 제조한, N-말단의 알파(α) 아미노기 상에서 실질적으로 균질하게 모노폴리에틸렌 글리콜화된 NT-3.
- 제 11 항의 모노폴리에틸렌 글리콜화된 BDNF 또는 제 12 항의 모노폴리에틸렌 글리콜화된 NT-3과 함께 제약학적으로 용인가능한 담체를 포함하는 신경변성 질환 치료용 제약학적 조성물.
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