RU2017100005A

RU2017100005A - Способ очистки белка слияния

Info

Publication number: RU2017100005A
Application number: RU2017100005A
Authority: RU
Inventors: Абир БАНЕРДЖИ; Чандранатх ГАНАПАТХИ; Рустом Сораб МОДИ; Ашок МИШРА
Original assignee: Люпин Лимитед
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2015-06-13
Publication date: 2018-07-13
Also published as: US20170152298A1; JP6747985B2; PH12016502482A1; MA40232A; AU2015273049A1; WO2015189832A1; RU2698654C2; JP2017521389A; CN106536565A; US10556942B2; RU2017100005A3; CA2951766A1; MX2016016318A; EP3155009A1; BR112016029157A8; AU2015273049B2; BR112016029157A2

Claims

1. Способ очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси HCP, при этом указанный способ включает:

a) получение из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует во второй смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

d) нанесение второй смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок слияния TNFR:Fc практически не содержит примесей HCP, содержащих по меньшей мере один протеолитический фермент.

2. Способ по п. 1, дополнительно предусматривающий колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием.

3. Способ по п. 2, где колонка для хроматографии с гидрофобным взаимодействием работает в режиме связывания-элюирования.

4. Способ по п. 3, где колонка для хроматографии с гидрофобным взаимодействием выбрана из колонок со смолой Butyl Toyopearl 650 M, Toyopearl Phenyl-650, Butyl Sepharose 6 Fast Flow и Phenyl Sepharose 6 Fast Flow.

5. Способ очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и по меньшей мере одну примесь HCP, которая содержит протеолитический фермент, при этом указанный способ включает:

d) нанесение второй смеси белков на колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием;

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием, где элюированный белок, представляющий интерес, присутствует в третьей смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

f) нанесение третьей смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

g) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок, представляющий интерес, практически не содержит примеси HCP, содержащей по меньшей мере один протеолитический фермент.

6. Способ по п. 1 или 5, дополнительно предусматривающий колонку для анионообменной хроматографии.

7. Способ по п. 6, где колонка для анионообменной хроматографии работает в режиме связывания-элюирования.

8. Способ по п. 6, где колонка для анионообменной хроматографии выбрана из колонок с четвертичным аммонием, сульфоновой кислотой, диэтиламиноэтилом и карбоксиметилом.

9. Способ по п. 8, где колонка для анионообменной хроматографии представляет собой колонку с диэтиламиноэтилом.

10. Способ очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и по меньшей мере одну примесь HCP, которая содержит протеолитический фермент, при этом указанный способ включает:

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует в третьей смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

f) нанесение третьей смеси белков на колонку для анионообменной хроматографии;

g) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для анионообменной хроматографии, где элюированный белок, представляющий интерес, присутствует в четвертой смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

h) нанесение четвертой смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

i) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок слияния TNFR:Fc практически не содержит примеси HCP, содержащей по меньшей мере один протеолитический фермент.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где колонку для хроматографии со смешанным режимом применяют на любой стадии после колонки для аффинной хроматографии.

12. Способ по п. 1, или 5, или 10, где хроматография со смешанным режимом предусматривает анионообменную хроматографию и хроматографию с гидрофобным взаимодействием.

13. Способ по п. 12, где хроматографию со смешанным режимом осуществляют в проточном режиме.

14. Способ по п. 13, где колонка для хроматографии со смешанным режимом выбрана из колонок с Capto adhere (N-бензил-N-метилэтаноламин), Capto MMC (лиганд MMC), MEP Hypercel (4-меркаптометилпиридин), HEA Hypercel (гексиламин) и PPA Hypercel (фенилпропиламин).

15. Способ по п. 14, где колонка для хроматографии со смешанным режимом представляет собой колонку с Capto adhere (N-бензил-N-метилэтаноламин).

16. Способ по п. 1, или 5, или 10, где смесь белков наносят на колонку для хроматографии со смешанным режимом при подходящем значении pH, выбранном из диапазона от приблизительно pH 6 до приблизительно pH 6,8.

17. Способ по п. 1, или 5, или 10, где смесь белков наносят на колонку для хроматографии со смешанным режимом при подходящем значении проводимости смеси белков, доведенной до значения от приблизительно 30 мСм/см до приблизительно 42 мСм/см.

18. Способ по п. 1, где стадию (d), или по п. 5, где стадию (f), или по п. 10, где стадию (h) осуществляют после уравновешивания колонки для смешанного режима с использованием уравновешивающего буфера, выбранного из буферов, содержащих от приблизительно 10 мM до 50 мM гидрохлорида гистидина, фосфат, цитрат, от приблизительно 180 мM до 300 мM ацетата натрия и от приблизительно 180 до 300 мM NaCl.

19. Способ по п. 18, где уравновешивающий буфер выбран из буферов, содержащих 20 мM гидрохлорида гистидина, 240 мM ацетата натрия и 220 мM NaCl.

20. Способ очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси HCP, при этом указанный способ включает:

a) получение из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего смеси белков, содержащей белок слияния и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

c) применение более чем одной промывки в отношении колонки для аффинной хроматографии;

d) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc содержит сниженное количество примесей HCP по сравнению с осуществлением указанного способа без применения более чем одной промывки в отношении колонки для аффинной хроматографии.

21. Способ по п. 1, или 5, или 10, где колонка для аффинной хроматографии выбрана из колонок с белком А или белком G.

22. Способ очистки по любому из предыдущих пунктов, где чистота белка слияния TNFR:Fc составляет ≥80%.

23. Способ очистки по любому из предыдущих пунктов, где чистота белка слияния TNFR:Fc составляет ≥99%.

24. Способ по любому из предыдущих пунктов, где белок слияния TNFR:Fc представляет собой этанерцепт.

25. Способ по п. 1, или 5, или 10, или 20, где стадию (b) осуществляют после уравновешивания колонки для аффинной хроматографии с использованием уравновешивающего буфера, выбранного из буферов, содержащих от приблизительно 30 мM Трис-Cl при значении pH 8 и проводимости 10 мСм/см до приблизительно 60 мM Трис-Cl при значении pH 9 и проводимости 30 мСм/см.

26. Способ по п. 25, где уравновешивающий буфер представляет собой буфер, содержащий приблизительно 50 мM Трис-Cl при значении pH 8,5 и проводимости 18 мСм/см.

27. Способ по п. 1, или 5, или 10, или 20, где стадия (b) дополнительно включает:

a’) промывку связанного белка слияния TNFR:Fc буфером, характеризующимся диапазоном значений pH, выбранных от приблизительно pH 8 до приблизительно pH 9, и/или

b’) промывку связанного белка слияния TNFR:Fc буфером, характеризующимся диапазоном значений pH, выбранных от приблизительно pH 4 до приблизительно pH 5.

28. Способ по п. 27, где стадия (a’) предусматривает буфер, характеризующийся значениями проводимости, выбранными от приблизительно 10 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см.

29. Способ по п. 27, где стадия (a’) предусматривает буфер, характеризующийся значениями проводимости, выбранными от приблизительно 50 мСм/см до приблизительно 75 мСм/см.

30. Способ по п. 27, где стадия (a’) предусматривает буфер, выбранный из Трис-основания, Трис-хлорида, HEPES, триэтаноламина, бората и глицин-NaOH.

31. Способ по п. 1, или 5, или 10, где стадия (c), или по п. 20, где стадия (d) включает элюирование белка слияния TNFR:Fc в режиме линейного градиента, или ступенчатого градиента, или комбинации обоих градиентов.

32. Способ по п. 31, где элюирование белка слияния TNFR:Fc осуществляют в режиме комбинации линейного градиента и ступенчатого градиента.

33. Способ по п. 32, где линейный градиент достигается за счет использования элюирующего буфера, выбранного из буферов с диапазоном значений рН от приблизительно 2 до приблизительно 3,5, и промывочного буфера, выбранного из буферов с диапазоном значений рН от приблизительно 4 до 5, в подходящем соотношении.

34. Способ по любому из предыдущих пунктов, где удаляют по меньшей мере 90% протеолитического фермента.

35. Способ по любому из предыдущих пунктов, где удаляют по меньшей мере 99,9% протеолитического фермента.

36. Способ по любому из предыдущих пунктов, где элюированный белок слияния TNFR:Fc, практически не содержащий по меньшей мере один протеолитический фермент, является стабильным в течение по меньшей мере двух недель.

37. Способ по любому из предыдущих пунктов, где элюированный белок слияния TNFR:Fc, практически не содержащий по меньшей мере один протеолитический фермент, является стабильным в течение по меньшей мере одного месяца.

38. Способ по любому из предыдущих пунктов, где примеси HCP выбраны из агрегатов, неправильного свернутого белка, фрагментов, эндотоксинов, нуклеиновых кислот, вирусов и протеаз.