RS65639B1

RS65639B1 - Novi glp-1 analozi

Info

Publication number: RS65639B1
Application number: RS20240706A
Authority: RS
Inventors: Rajamannar Thennati; Nishith Chaturvedi; Vinod Sampatrao Burade; Pradeep Dinesh Shahi; Muthukumaran Natarajan; Ravishankara Madavati Nagaraja; Rishit Mansukhlal Zalawadia; Kunal Pandya; Brijeshkumar Patel; Dhiren Rameshchandra Joshi; Krunal Harishbhai Soni; Abhishek Tiwari; Vipulkumar Shankarbhai Patel
Original assignee: Sun Pharmaceutical Ind Ltd
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2024-07-31
Also published as: SI4122954T1; US20190309040A1; EP4122954A1; WO2019193576A1; ZA202306729B; JP2023078367A; KR20250065720A; JOP20200251A1; JOP20200251B1; IL277483B1; MX2024007688A; CA3095988A1; DK4122954T3; IL277483A; US20240199718A1; ECSP20070185A; US11485766B2; HRP20240749T1; CN117964735A; US20210206823A1

Description

Opis

SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava zahteva korist od tri indijske privremene prijave patenta koje imaju br. IN 201821013109 (podneta 5. aprila 2018); IN 201821040468 (podneta 26. oktobra 2018) i IN 201821040474 (podneta 26. oktobra 2018), koje su ovim uključene kao reference.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na nove analoge glukagonu sličnih peptida-1 (GLP-1) (7-38) koji imaju sekvencu amino-kiselina sa Leu ili Ile na C-kraju. Novi analozi su snažni GLP-1 agonisti sa smanjenim štetnim dejstvom i poboljšanim trajanjem delovanja. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na acilovane derivate novih analoga, koji su dodatno poboljšali potentnost i trajanje delovanja i pogodni su za oralnu primenu. Analozi koji su ovde stavljeni na uvid javnosti su acilovani sa produžujućim delovima, koji povećavaju trajanje aktivnosti jedinjenja. Analozi koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu biti korisni u lečenju dijabetesa i gojaznosti.

STANJE TEHNIKE

[0003] Glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1) je hormon koji se uglavnom proizvodi u enteroendokrinim L ćelijama creva i izlučuje se u krvotok kada hrana koja sadrži masti, proteinski hidrolizat i/ili glukozu uđe u duodenum. GLP-1 je izveden iz ćelijski specifične post-translacione obrade preproglukagon gena. U početku, peptid GLP-1(1-37) je identifikovan iz ove obrade, ali su to bila dva N-terminalno skraćena proizvoda, GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) i GLP-1(7-36) amid, za koje je utvrđeno da prepoznaju receptor pankreasa i za koje je utvrđeno da su aktivna vrsta in vivo. Utvrđeno je da GLP-1 stimuliše lučenje insulina, uzrokujući na taj način unos glukoze u ćelije i smanjenje nivoa glukoze u serumu. Agonisti GLP-1 su dostupni za lečenje dijabetesa melitusa tipa 2 (T2DM) kao poželjni lekovi jer nemaju hipoglikemiju i imaju pozitivnu korist u vidu gubitka težine. Endogene supstance, GLP-1(7-37) i GLP-1(7-36)amid, cepaju se peptidazama i stoga imaju veoma kratko vreme poluraspada. Uloženi su napori da se poboljša učinak razvijanjem GLP-1 analoga sa poboljšanim poluživotom. Prvi lek odobren 2005. godine bio je Eksenatid (Exenatide) sa dozom dva puta dnevno u dozi od 10 mcg i utvrđeno je da pokazuje značajno poboljšanje HbA1c, markera kontrole glukoze. Nadalje, Novo Nordisk je razvio Liraglutid (United States Patent No.6,268,343) (SEQ ID NO: 2) sa jednom dnevnom dozom od 1,8 mg, s.c./dan koji je odobren 2010. Dalja istraživanja i razvoj proizvodila su proizvode za upotrebu jednom nedeljno kao što su Albiglutid koji je razvio GSK i Dulaglutide koji je razvio Eli Lilly. Nedavno je Semaglutid (Međunarodna publikacija br. WO 2006/097537 A2), GLP-1 analog, odobrila USFDA. Semaglutid (SEQ ID NO: 3) se prodaje pod brendom Ozempic<®>. Primenjuje se kao potkožna injekcija jednom sedmično.

[0004] Mnogi pokušaji da se naprave GLP-1 analozi koji bi poboljšali potentnost i trajanje delovanja su prijavljeni u literaturi. Patent Sjedninjenih Država br.7,291,594 B2 (US '594 patent) stavlja na uvid javnosti derivate GLP-1 (7-35) koji imaju dodate nekoliko ostataka arginina i/ili lizina na njihov C-kraj da bi se obezbedila visoka biodostupnost preko sluzokože. Patent US ’594 dalje stavlja na uvid javnosti da ovi derivati mogu biti otporni na dipeptidil peptidazu IV (DPP-IV) zamenom amino-kiseline 8 u njenoj GLP-1 sekvenci amino-kiseline sa Ser, ili sa otpornošću na tripsin zamenom amino-kiselina 26 i 34 sa Gln i Asn, tim redosledom. Patent Sjedinjenih Država br. 7,893,017 B2 (US ’017 patent) stavlja na uvid javnosti acilovani GLP-1 analog pri čemu je GLP-1 analog stabilizovan protiv DPP-IV modifikacijom najmanje jednog amino-kiselinskog ostatka na pozicijama 7 i 8 u odnosu na sekvencu GLP-1 (7-37) i pri čemu je data acilacija dijakiselina vezana direktno za C-terminalni amino-kiselinski ostatak datog GLP-1 analoga.

[0005] Patent Sjedinjenih Država br. 8,951,959 B2 (US ’959 patent) stavlja na uvid javnosti GLP-1 analog (7-37) otporan na DPP-IV koji ima neproteogeni amino-kiselinski ostatak koji sadrži trifluorometil grupu na poziciji 8 u odnosu na sekvencu GLP-1, i acilovan je delom koji sadrži dve kisele grupe do ostatka lizina na poziciji 26.

[0006] Patent Sjedinjenih Država br. 7,084,243 B2 (US ‘243 patent) stavlja na uvid javnosti GLP-1 analoge (7-37) koji imaju Val ili Gly na poziciji 8 u odnosu na sekvencu GLP-1 (7-37) kao peptide otporne na DPP-IV.

[0007] Međunarodna publikacija br. WO 2017/149070 A1(WO ’070) stavlja na uvid javnosti GLP-1 analoge koji imaju Trp na poziciji koja odgovara poziciji 8 GLP-1 (7-37) i pokazalo se da su ova jedinjenja Trp8 veoma stabilna protiv degradacije pomoću DPP-IV.

[0008] Međunarodna publikacija br. WO 2004/103390A2 (WO ’390) stavlja na uvid javnosti da modifikacija na P’1 poziciji (koja odgovara poziciji 9 u slučaju GLP-1 (7-37)) može da proizvede GLP-1 analoge sa znatno smanjenom osetljivošću na cepanje posredovano enzimima (kao što je DPP-IV) u odnosu na nativni supstrat, ali da zadržava biološku aktivnost nativnog supstrata. WO ’390 dalje stavlja na uvid javnosti GLP-1 analoge (7-37) koji imaju aminokiselinu sa tetrasupstituisanim Cβ ugljenikom (kao npr. terc- leucin) na poziciji 9 i daju GLP-analoge otporne na razgradnju DPP-IV.

[0009] Međunarodna publikacija br. WO 2015/086686 A2 (publikacija WO ’686) stavlja na uvid javnosti da je ugrađivanje alfa-metil-funkcionalizovanih amino-kiselina direktno u glavni lanac GLP-1 analoga utvrđeno da proizvodi peptide otporne na proteazu (uključujući DPP-IV otporne).

[0010] Razni drugi agonisti GLP-1 otporni na DPP-IV su stavljeni na uvid javnosti u patentnim publikacijama kao što su Međunarodne publikacije br. WO 2007/030519 A2, WO 2004/078777 A2, WO 2007/039140 A1, WO 2014/209886 A1, WO 2012/016419 A1, WO 2017/211922 A2, WO 2016/198544 A1 i WO 2013/051938 A2.

[0011] Različite patentne prijave stavlja na uvid javnosti GLP-1 analoge produžene na C-kraju sa povećanom stabilnošću i dužim trajanjem delovanja. Na primer, Patenti Sjedinjenih Država br. 7,482,321 B2, 9,498,534 B2 i 7,897,566 B2.

[0012] Različite patentne prijave stavljaju na uvid javnosti acilovane GLP-1 analoge pri čemu su analozi GLP-1 vezani za lipofilni supstituent opciono preko linkera da bi se obezbedilo duže trajanje delovanja.

[0013] Patent Sjedinjenih Država br.8,603,972 B2 (US ’972) stavlja na uvid javnosti monoacilovane derivate GLP-1 analoga pri čemu je Lys ostatak na poziciji 37 ili 38 GLP-1 analoga acilovan.

[0014] Patenti Sjedinjenih Država br. 8,648,041 B2,9,758,560 B2, 9,006,178 B2,9,266,940 B2, 9,708,383 B2 i Publikacija patentnih prijava Sjedinjenih Država br. US 2015/0152157 A1, US 2015/0133374 A1 stavljaju na uvid javnosti diacilovane derivate GLP-1 analoga.

[0015] Publikacija prijave patenta Sjedinjenih Država br. US 2016/0200791 A1 stavlja na uvid javnosti triacilovane derivate GLP-1 analoga.

[0016] Međunarodne publikacije br. WO 2016/083499 A1, WO 2016/097108 A1 i WO 2014/202727 A1 stavljaju na uvid javnosti acilovane GLP-1 analoge u kojima je Lys ostatak GLP-1 analoga vezan za dva produžujuća ostatka preko razgranatog linkera.

[0017] Međunarodne publikacije br. WO 2009/030771 A1 i WO 2018/083335 A1 stavljaju na uvid javnosti različita acilujuća sredstva (bočni lanac) koja se mogu vezati za Lys ostatak GLP-1 analoga da bi se obezbedilo duže trajanje delovanja.

[0018] Međunarodna publikacija br. WO 2013/186240 A2 stavlja na uvid javnosti analoge eksendin-4 peptida koji imaju Gly, Ser ili funkcionalizovan Ser, npr. Ser OCH3), D-Ser ili funkcionalizovani D-Ser, npr. D-Ser(OCH3), Aib, Ala ili D-Ala na poziciji 2 eksendin-4 sekvence amino-kiselinske.

[0019] Razni drugi analozi GLP-1 su stavljeni na uvid javnosti u patentnim prijavama kao što su Međunarodne publikacije br. WO 2005/027978 A2, WO 1998/008871 A1, WO 1999/043705 A1, WO 1999/043706 A1, WO 1999/043707 A1, WO 1999/043708 A1, WO 2000/034331 A2, WO 2009/030771 A1, WO 2011/080103 A1, WO 2012/140117 A1, WO 2012/062803 A1, WO 2012/062804 A1, WO 2013/037690 A1, WO 2014/202727 A1, WO 2015/000942 A1, WO 2015/022400 A1, WO 2016/083499 A1, WO 2016/097108 A1 i WO 2017/149070 A1.

[0020] Ipak, postoji potreba da se razviju GLP-1 analozi koji imaju optimalna željena svojstva u smislu stabilnosti i trajanja delovanja.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0021] Jedan aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34

pri čemu X2 je Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ili Aib, ;

X3 je odsutan ili je Gln;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu, D-Leu, D-Ile ili Ile;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

U je odsutan ili je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} pri čemu je } tačka vezivanja sa grupom W;

W je odsutan ili je izabran iz grupe koju čine -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], - C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O)-C(CH3)2-NH-] i

pri čemu je ] tačka vezivanja sa grupom Y;

Y je-C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-, pri čemu je - tačka vezivanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH ili -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n ceo broj od 14 do 20.

[0022] Polipeptidi predmetnog pronalaska su moćni agonisti GLP-1 sa manje neželjenih efekata. Dalje, polipeptidi prema ovom pronalasku su stabilni i imaju dugo trajanje delovanja i pogodni su za oralnu primenu.

OPIS SLIKA

[0023]

Slika 1A prikazuje pripremu Dela (grupe) A-OSu (Intermedijer 3). Slika 1B prikazuje pripremu grupe A-OSu (Intermedijer 3).

Slika 2 prikazuje pripremu Dela C-OSu.

Slika 3 prikazuje pripremu Dela D-OSu.

Slika 4 prikazuje pripremu Dela E-OSu.

Slika 5 prikazuje pripremu Dela F-OSu.

Slike 6A i 6B prikazuju rezultate oralnog testa tolerancije glukoze (OGTT) za jedinjenje 1 kod pacova; pojedinačna injekcija; 1mg/kg AUC glukoze 0-120 min (slika 6A=posle 22 sata, slika 6B=posle 46 sati).

Slika 7 prikazuje smanjenje nivoa glukoze u krvi kod db/db miševa sa dijabetesom tipa 2 nakon hroničnog tretmana Jedinjenjem 1.

Slika 8 prikazuje smanjenje unosa hrane kod db/db miševa nakon tretmana Jedinjenjem 1.

Slika 9 prikazuje efikasnost Jedinjenja 1 kod db/db miševa u smanjenju telesne težine.

Slika 10 prikazuje smanjenje Hb1Ac kod db/db miševa nakon tretmana Jedinjenjem 1.

SKRAĆENICE

[0024]

Aib: 2-Aminoizobuterna kiselina

ADO: 8-Amino-3,6-diokso-kaprilna

OGTT: Oralni test tolerancije glukoze

DIPEA: N,N'-Di-izopropiletilamin

HOBt: 1-Hidroksibenztriazol

DIPC: N,N'-Di-izopropilkarbodiimid

HOSu: A-Hodroksisukcinimid

IBCF: Izobutil hloroformat

NMM: N-Metilmorfolin

THF: Tetrahidrofuran

DCM: Dihlormetan

DMAP: 4-Dimetilaminopiridin

DCC: Dicikloheksil karbodiimid

DMAc: Dimetilacetamid

OPIS PRONALASKA

[0025] Predmetni pronalazak obezbeđuje stabilan GLP-1 analog dugog dejstva, koji ne zahteva često supkutano doziranje i takođe je pogodan za oralnu primenu. Iznenađujuće je otkriveno da dodavanje dodatnog Leu na C-kraju sekvence proizvodi peptide sa značajno poboljšanom potentnošću i trajanjem delovanja u poređenju sa roditeljskim peptidom. Peptidi sa dodatnim Ile takođe su pokazali sličan efekat poboljšane potentnosti i trajanja delovanja u poređenju sa roditeljskim peptidom. Dodatno, predmetni pronalazak pokazuje delove, koji se mogu dodati peptidima koji su GLP-1 analozi (7-37) reakcijom acilacije da bi se dobila jedinjenja sa značajno poboljšanom potentnošću i dužim trajanjem delovanja. Produženi delovi jedinjenja stavljenih na uvid javnosti imaju stabilnije veze, koje su manje podložne cepanju biološkim enzimima. Prema tome, jedinjenja koja su ovde stavljena na uvid javnosti su stabilnija i zahtevaju ređu primenu, što doprinosi saglasnosti pacijenata. Shodno tome, u nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34 (SEQ ID NO: 4)

pri čemu X2 je Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ili Aib, ;

X3 je odsutan ili Gln;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu, D-Leu, D-Ile ili Ile;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana.

[0026] U nekim realizacijama, X21 može biti acilovan sa produžujućim delovima navedenim u Patentima Sjedinjenih Država br. 6,268,343, 8,951,959 B2, 8,603,972 B2, 8,648,041 B2, 9,758,560 B2, 9,006,178 B2, 9,266,940 B2, 9,708,383 B2 i Publikacijama patentnih prijava Sjedinjenih Država br. US 2015/0152157 A1 i US 2015/0133374 A1; Međunarodnim publikacijama br. WO 2009/030771 A1, WO 2006/097537 A2 i WO 2018/083335 A1.

[0027] U nekim realizacijama, X21 Lys je acilovan na svojoj amino (Σ amino) grupi bočnog lanca sa ostatkom koji sadrži grupu masnih kiselina. Grupa masnih kiselina može biti vezana za X21 Lys preko linkera. Shodno tome, u nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34

pri čemu X2 je Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ili Aib;

X3 je odsutan ili Gln;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu, D-Leu, D-Ile ili Ile;

X34 je odsutan i

{-Q-T—U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

pri čemu je ] tačka vezivanja sa grupom Y; Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, pri čemu je -- tačka vezivanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH or -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n ceo broj od 14 do 20.

[0028] U nekim realizacijama, amino-kiselina na X2 je izabrana između Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ili Aib.

[0029] U nekim realizacijama X2 je Aib.

[0030] U nekim realizacijama, X3 je odsutan.

[0031] U nekim realizacijama, X33 je Leu.

[0032] U nekim realizacijama, X33 je Ile.

[0033] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu je W izabran iz grupe koju čine -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O)-C(CH3)2-NH-] i

[0034] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (ε amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su U i W oba odsutni i Z je -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n ceo broj 14.

[0035] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z ,

pri čemu W je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-].

[0036] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je -C(O)-C(CH3)2-NH-].

[0037] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je -C(O)-NH-(CH2)4-NH-].

[0038] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je -C(O)-NH-(CH2)3-NH-].

[0039] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je

[0040] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu Z je -C(O)-(CH2)n-COOH, wherein n is integer 16.

[0041] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu Z je -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n ceo broj 14.

[0042] U nekim realizacijama,

X2 je Ala ili Aib;

X3 je odsutan;

X33 je Leu;

U je odsutan;

W je odsutan;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, pri čemu je -- tačka vezivanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n ceo broj 14.

[0043] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34

pri čemu je X2 Aib;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

U je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} pri čemu je } tačka vezivanja sa grupom W;

W je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], pri čemu je ] tačka vezivanja grupe Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, pri čemu je -- tačka vezivanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n ceo broj 16.

[0044] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34

pri čemu je X2 Aib;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

W je -C(O)-C(CH3)2-NH-] pri čemu je ] tačka vezivanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, pri čemu je -- tačka vezivanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n ceo broj 16.

[0045] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34

pri čemu je X2 Aib,;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

W je -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-] pri čemu je ] tačka vezivanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, pri čemu je -- tačka vezivanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n ceo broj 16.

[0046] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je -C(O)-NH-(CH2)4-NH-].

[0047] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je is -C(O)-NH-(CH2)3-NH-].

[0048] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34

pri čemu je X2 Aib,;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

W je -C(O)-NH-(CH2)4-NH-], pri čemu je ] tačka vezivanja grupe Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, pri čemu je -- tačka vezivanja sa grupom Z;

[0049] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n ceo broj 16.

[0050] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu Z je -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n ceo broj 14.

[0051] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34

pri čemu je X2 Aib,;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

U je C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} pri čemu je } tačka vezivanja sa grupom W;

W je

pri čemu je ] tačka vezivanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, pri čemu je -- tačka vezivanja sa grupom Z; i

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n ceo broj 16.

[0052] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina:

H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L-V-R-G-R-G-

X33-X34

pri čemu je X2 Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe);

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (ε amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

W je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-, -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O)-C(CH3)2-NH-], pri čemu je ] tačka vezivanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, pri čemu je -- tačka vezivanja sa grupom Z; i

[0053] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (Σ amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-].

[0054] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (ε amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-;

[0055] U nekim realizacijama, X21 je Lys pri čemu je amino (ε amino) grupa bočnog lanca Lys acilovana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

pri čemu W je -C(O)-C(CH3)2-NH-]

[0055] U nekim realizacijama, X21 je lipid modifikovan Lys pri čemu je amino (ε amino) grupa bočnog lanca Lys acilovan sa ostatkom

{-Q-T-U-W-Y-Z

što je predstavljeno ostacima datim u Tabeli 1

Tabela 1: Re rezentativni delovi za ru u -Q-T-U-W-Y-Z

1

[0057] U drugoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid prema bilo kojoj od prethodnih realizacija, koji je izabran iz peptida datih u Tabeli 2:

Tabela 2: Representativna polipeptidna jedinjenja predmetnog pronalaska

(nastavak)

1 (nastavak)

[0058] Osim ako nije drugačije navedeno, pronalazak namerava da pokrije i L i D izomere amino-kiselina u sekvencama.

[0059] Ser(OMe) kako je ovde opisano u pronalasku je amino-kiselina serin sa metilovanom hidroksilnom grupom i ima sledeću strukturu.

[0060] Polipeptidne sekvence pomenute u pronalasku su predstavljene jednoslovnim kodom amino-kiselina koje je odobrio IUPAC.

[0061] Q, T, U, W, Y i Z kako se ovde koriste za definisanje acilujuće grupe u realizacijama predmetnog pronalaska razlikuju se od jednoslovnog koda amino-kiseline koja se koristi za označavanje polipeptidne sekvence.

[0062] Polipeptidi predmetnog pronalaska su iznenađujuće pokazali značajno smanjenje glukoze u krvi kada su podvrgnuti oralnom testu tolerancije glukoze (OGTT) kod SD pacova. Procenat smanjenja glukoze u krvi kod SD pacova kada je bio izazvan oralnom glukozom bio je značajno niži od odgovarajućih polipeptida kojima je nedostajao dodatni Leu ili Ile na poziciji X33.

[0063] Predmetni pronalazak je dalje detaljno prikazan upućivanjem na sledeće primere. Poželjno je da se primer u svakom pogledu smatra ilustrativnim i da nema nameru da ograniči obim pronalaska za koji se traži.

PRIMERI:

Opšti postupci pripreme:

[0064] Polipeptidno jedinjenje prema predmetnom pronalasku može biti pripremljeno postupcima opisanim u nastavku. Proces uključuje dva koraka, uključujući pripremu matičnog linearnog peptida i naknadno vezivanje lanca masnih kiselina za roditeljski peptid.

[0065] Peptidi opisani ovde mogu biti pripremljeni hemijskom sintezom korišćenjem tehnika čvrste faze kao što su one opisane u G. Barany and R. B. Merrifield, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology"; Volume 2-"Special Methods in Peptide Synthesis, Part A", pp.3-284, E. Gross and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980; and in J. M. Stewart and J. D. Young, "Solid-Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III., 1984. Željena strategija se zasniva na Fmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil) grupi za privremenu zaštitu α-amino grupe, u kombinaciji sa zaštitnim grupama kao što su terc-butil (-tBu), terc-butiloksikarbonil (-Boc), tritil (-Trt) grupe za privremenu zaštitu bočnih lanaca amino-kiselina (vidi npr. E. Atherton and R. C. Sheppard, "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology"; Volume 9-"Special Methods in Peptide Synthesis, Part C", pp. 1-38, S. Undenfriend and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego, 1987).

[0066] Peptidi se mogu sintetizovati postepeno na nerastvorljivom polimernom nosaču (koji se takođe naziva „smola“) počevši od C-kraja peptida. Sinteza se započinje dodavanjem C-terminalne amino-kiseline peptida na smolu kroz formiranje amidne ili estarske veze. Ovo omogućava eventualno oslobađanje dobijenog peptida kao C-terminalnog amida ili karboksilne kiseline, tim redosledom.

[0067] C-terminalna amino-kiselina i sve druge amino-kiseline koje se koriste u sintezi moraju imati svoje α-amino grupe i funkcije bočnog lanca (ako su prisutne) različito zaštićene tako da α-amino zaštitna grupa može biti selektivno uklonjena tokom sinteze. Kuplovanje amino-kiseline se vrši aktivacijom njene karboksilne grupe kao aktivnog estra i njenom reakcijom sa neblokiranom α-amino grupom N-terminalne amino-kiseline dodate smoli. Sekvenca uklanjanja zaštite i kuplovanja α-amino grupe se ponavlja sve dok se cela peptidna sekvenca ne sastavi. Peptid se zatim oslobađa iz smole uz istovremenu deprotekciju funkcionalnosti bočnog lanca, obično u prisustvu odgovarajućih čistača da bi se ograničile sporedne reakcije. Dobijeni peptid je konačno prečišćen pomoću HPLC reverzne faze.

[0068] Roditeljski peptid se zatim može spojiti na lanac masnih kiselina kuplovanjem aktiviranog lanca masnih kiselina sa roditeljskim peptidom. Lanac masnih kiselina se može napraviti postupcima dobro poznatim u organskoj hemiji. Na primer, lanac masnih kiselina može da se napravi korišćenjem postupaka sinteze čvrste faze što omogućava pripremu linearnih lanaca masnih kiselina.

[0069] Sintetizovani linearni peptidi su prečišćeni preparativnom HPLC procedurom kao što je navedeno u nastavku:

Preparativna HPLC: WATERS 2555 kvaternarni gradijentni modul (maksimalni ukupan protok: 300 mL/min, maksimalni pritisak: 3000 psi) ili

Shimadzu LC-8A (maksimalni ukupan protok: 150 mL: maksimalni pritisak: 20 Mpa)

Kolona: C18, 10μ

Protok: 75 mL/min

Mobilna faza:

Za prvo prečišćavanje

Mobilna faza A: pH 7,5 Fosfatni pufer

Mobilna faza B: acetonitril

Gradijent: 10 do 40% Mobilna faza-B za 300 min.

Za drugo prečišćavanje:

Mobilna faza A: 1% sirćetne kiseline u vodi

Mobilna faza B: 1% sirćetne kiseline u acetonitrilu:n-propanolu (50:50)

Gradijent: 15 do 45% Mobilna faza-B za 300min

[0070] Konačna jedinjenja predmetnog pronalaska su prečišćena preparativnom HPLC procedurom kao što je navedeno u nastavku: Preparativna HPLC: WATERS 2555 kvaternarni gradijentni modul (maksimalni ukupan protok: 300 mL/min, maksimalni pritisak: 3000 psi) ili Shimadzu LC-8A (maksimalni ukupan protok: 150 mL, maksimalni pritisak: 20 Mpa)

Kolona: C18, 10μ

1

Protok: 75 mL/min

Mobilna faza:

[0071] Čistoća jedinjenja predmetnog pronalaska je analizirana RP-HPLC metodom kao što je navedeno u nastavku:

HPLC Metoda B1:

[0072]

Kolona: YMC Pack-Ph (4.6 mm × 150 mm 3μ)

Eluent: Mobilna faza A: 0,1 % trifluorosirćetne kiseline u vodi

Mobilna faza B: 0,1 % trifluorosirćetne kiseline u acetonitrilu

Brzina protoka: 1,5 mL/min

Detekcija: UV detekcija na 210 nm

Temperatura kolone: 50 °C

Trajanje: 50 min

Gradijent:

HPLC Metoda B2:

[0073]

Kolona: YMC-Pack Pro C18 (4 mm × 250 mm, 3μ)

Eluent: Mobilna faza A: Pufer: Acetonitril (900:100)

Mobilna faza B: Pufer: Acetonitril (300:700)

Pufer: Kalijum dihidrogen ortofosfat u vodi, pH podešen na 3,0±0,1 ortofosfornom kiselinom Brzina protoka: 1,0 mL/min Detekcija: UV detekcija na 210 nm

Temperatura kolone: 50 °C

Temperatura posude za uzorke: 8 °C

Trajanje: 38 min.

1

HPLC Metoda B3:

[0074]

Kolona: Waters X-Select CSH-C18 (150mm × 4.6 mm; 2.5 μ)

Eluent: Mobilna faza A: Pufer: Acetonitril (900:100)

Mobilna faza B: Pufer: Acetonitril (300:700)

Pufer: Kalijum dihidrogen ortofosfat u vodi, pH podešen na 1,5±0,1 ortofosfornom kiselinom Brzina protoka: 0,9 mL/min Detekcija: UV detekcija na 210 nm

Temperatura kolone: 40 °C

Temperatura posude za uzorke: 5 °C

Trajanje: 100 min.

[0075] Jedinjenja predmetnog pronalaska su analizirana pomoću LCMS kao što je navedeno u nastavku:

Maseni spektri su snimljeni na LCMS korišćenjem Waters Acquity<®>QDa<®>, Waters Micromass Quattro Micro API ili Thermo scientific LCQ Fleet™. Testni rastvor je pripremljen rastvaranjem odgovarajuće količine analita u razblaživaču sa konačnom koncentracijom od 1 µg/ml do 50 µg/ml u zavisnosti od jonizacije analita. Testni rastvor je infundiran brzinom od oko 10 µl do 50 µl u minuti u LCMS tokom 1 min i maseni spektri su snimljeni u pozitivnom ili negativnom režimu elektrosprej jonizacije (ESI) i u odgovarajućem rasponu mase.

Primer 1 : Priprema bočnih lanaca aktiviranih masnih kiselina:

1. Priprema 18-[[(1S)-1-carboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinske kiseline (Deo A-OSu, Intermedijer-3)

[0076] Aktivirani bočni lanac masne kiseline, Deo A-OSu, pripremljen je sintezom u čvrstoj fazi korišćenjem 2-hlorotritil hloridne smole kao što je shematski prikazano na Slici 1A.2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi]sirćetna kiselina (Intermedijer-1) je vezana za 2-hlorotritilhloridnu smolu u prisustvu N,N'-di-izopropiletilamina (DIPEA) koji je dao 2-[2-(2- Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smolu. Intermedijer-1 se može dobiti kuplovanjem 2-[2-(2-amino etoksi)-etoksi] sirćetne kiseline sa Fmoc N-hidroksisukcinimid estrom. Alternativno, intermedijer-1 je dostupan komercijalno i može se nabaviti kao takav. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe 2-[2-(2- Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smole korišćenjem piperidina i slobodna amino grupa je zatim kuplovana na 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi]sirćetnu kiselinu korišćenjem 1-hidroksibenztriazola (HOBt) i N,N'-di-izopropilkarbodiimida (DIPC) čime se dobila 2-[2-[2-[[2-[2-(2-Fmocaminoetoksi)etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-Smola. Fmoc grupa je zatim uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe 2-[2-[2-[[2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-Smole korišćenjem piperidina i slobodna amino grupa je zatim kuplovana na Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC da bi se dobila 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-oksopentanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Dobijena 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]amino]etoksi] etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-Smola je selektivno deblokirana korišćenjem piperidina, a zatim kuplovana sa mono terc-butil estrom oktadekandionske kiseline čime se dobije intermedijer-2, odnosno [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-tercbutoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino] etoksi]etoksi] sirćetna kiselina]- 2-Cl-Trt-Smola. Intermedijer 2 je zatim ocepljen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola:DCM (1:1). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa N-hidroksisukcinimidom (HOSu) u prisustvu izobutil hloroformiata (IBCF) i N-metilmorfolina (NMM) nakon čega sledi deprotekcija sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (Deo A-OSu, intermedijer-3). Ceo proces se, takođe, može prikazati kao što je shematski prikazan na slici 1B.

1

2. Priprema N-palmitoil-L-γ-glutamil sukcinimid estra (Deo B-OSu)

[0077]

Deo B-OSu

[0078] L-Glutaminska kiselina alfa-terc-butil estar (H-Glu-OtBu) je reagovao sa palmitinskom kiselinom u prisustvu IBCF i NMM da bi se dobio CH3-(CH2)14-C(O)-Glu-OtBu, koji je zatim reagovao sa HOSu u prisustvu IBCF i NMM da bi se dobio CH3-(CH2)14-C(O)-Glu(OSu)-OtBu, koji je zatim uklonjen sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobio ostatak B-OSu.

3. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[4-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi]etilkarbamoilamino]butilamino-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina (Deo C-OSu)

[0079] Aktivirani bočni lanac masne kiseline, deo C-OSu je pripremljen korišćenjem čvrste faze sinteze korišćenjem 2-hlorotritil hlorid smole kao što je shematski prikazano na slici 2.2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina je vezana za 2-hlorotritil hlorid smolu u prisustvu DIPEA da bi se dobila 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je zatim aktivirana korišćenjem p-nitrofenilhlorformata u THF i DIPEA, nakon čega je usledila reakcija sa Fmoc-amino butilamin hidrohloridnom soli u THF: DMAc i DIPEA, čime se dobila 2-[2-[2-(4-Fmocaminobutilkarbamoilamino)etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je zatim spojena sa Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC, čime se dobila 2-[2-[2-[4-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-oksopentanoil]amino]butilkarbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Dobijena 2-[2-[2-[4-[[(4S)- 4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]amino]butilkarbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola je selektivno deblokirana upotrebom piperidina, a zatim kuplovana sa mono terc-butil estrom oktadekandionske kiseline koji daje intermedijer -[2-[2-[4-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-oksopentanoil]amino]butilkarbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smolu. Intermedijer je zatim ocepljen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola : DCM (1:1) da bi se dobila 2-[2-[2-[4-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-tercbutoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino]butilkarbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina (LCMS= m/z: 814,56 (M+H<+>)). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa HOSu u prisustvu dicikloheksil karbodiimida (DCC) da bi se dobio intermedijer zaštićen sukcinimidom, koji je uklonjen trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (Deo C-OSu).

4. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1,1-dimetil-2-okso-etil]amino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina (Deo D-OSu)

[0080] Bočni lanac masnih kiselina je pripremljen korišćenjem sinteze čvrste faze korišćenjem 2-hlorotritil hlorid smole kao što je shematski prikazano na slici 3. 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina je vezana za 2-hlorotritil hlorid smolu u prisustvu DIPEA da bi se dobila 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trtsmola. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe korišćenjem piperidina, nakon čega je usledilo kuplovanje sa Fmoc-Aib-OH u THF: DMAc korišćenjem DIPC i HOBt, čime se dobila 2-[2-[2-[(2-Fmoc-amino-2-metil-propanoil)amino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je spojena sa Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC da bi se dobila 2-[2-[2-[[2-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]amino]-2-metilpropanoil]amino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc grupa dobijenog jedinjenja je selektivno deblokirana korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je zatim spojena sa mono terc butil estrom oktadekandionske kiseline da bi se dobila 2-[2-[2-[[2-[[(4S)-5-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino]-2-metil-propanoil]-amino]etoksi]etoksi] sirćetne kiseline-2-Cl-Trt-smola. Intermedijer je zatim ocepljen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola:DCM (1:1) da bi se dobila 2-[2-[2-[2-[(4)S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino]-2-metil-propanoil]amino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina (LCMS= m/z: 786,39 (M+H<+>)). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa HOSu u prisustvu DCC da bi se dobio intermedijer zaštićen sukcinimidom, koji je uklonjen sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova

1

(Deo D-OSu).

5. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[3-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi]etilkarbamoilamino]propilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinske kiseline (Deo E-OSu)

[0081] Bočni lanac masnih kiselina je pripremljen korišćenjem sinteze čvrste faze korišćenjem 2-hlorotritil hlorid smole kao što je shematski prikazano na Slici 4. 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina je vezana za 2-hlorotritil hlorid smolu u prisustvu DIPEA da bi se dobila 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trtsmola. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je zatim aktivirana korišćenjem p-nitrofenilhloroformata u THF i DIPEA nakon čega je usledila reakcija sa 1,3-diaminopropanom u THF: DMAc u prisustvu DIPEA koristeći HOBt da formira NH2-(CH2)3-NH-C(O)-{(2-(2-aminoetoksi)-etoksi}-sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola Slobodna amino grupa je zatim kuplovana sa Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC, čime se dobila 2-[2-[2-[3-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-oksopentanoil]amino]propilkarbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Dobijena 2-[2-[2-[3-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]amino]propilkarbamoilamino]etoksi]-etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trtsmola je selektivno deblokirana korišćenjem piperidina i zatim kuplovana sa mono terc butil estrom oktadekandionske kiseline da bi se dobila 2-[2-[2-[3-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-oksopentanoil]amino]-propil karbamoilamino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Intermedijer je zatim ocepljen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola:DCM (1:1) da bi se dobila 2-[2-[2-[3-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-tercbutoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino]-propilkarbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina (LCMS= m/z: 801,41 (M+H<+>)). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa HOSu u prisustvu dicikloheksil karbodiimida (DCC) da bi se dobio intermedijer zaštićen sukcinimidom, koji je uklonjen sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (Deo E-OSu).

6. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[4-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi]etilkarbamoilamino]-1-piperidil]-4-okso-butil]amino]-18-okso-octadecanoic acid (Deo F-OSu)

[0082] Bočni lanac masnih kiselina je pripremljen korišćenjem čvrste faze sinteze korišćenjem 2-hlorotritil hlorid smole kao što je shematski prikazano na Slici 5. 2-[2-(2-Fmoc-amino etoksi)etoksi] sirćetna kiselina je vezana za 2-hlorotritil hlorid smolu u prisustvo DIPEA da bi se dobila 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trtsmola. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je zatim aktivirana korišćenjem p-nitrofenilhloroformata u THF i DIPEA, nakon čega je usledila reakcija sa 4-amino-Boc-piperidinom u THF: DMAc u prisustvu DIPEA korišćenjem HOBt čime se dobila (2-[2-[2-(4-Bocpiperidilkarbamoilamino) etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Dobijeno jedinjenje pri cepanju korišćenjem trifluorosirćetne kiseline dalo je 2-[2-[2-(4-piperidilkarbamoilamino)etoksi]etoksi] sirćetnu kiselinu koja je daljom reakcijom sa Fmoc-OSu u prisustvu trietilamina (TEA) dala 2-[2-[2-(4-piperidilkarbamoilamino)etoksi]etoksi] sirćetnu kiselinu. Dobijeno jedinjenje je zatim dodatno vezano za 2-hlorotritil hlorid smolu u prisustvu DIPEA da bi se dobila 2-[2-[2-(4-Fmoc-piperidilkarbamoilamino)etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem korišćenjem piperidina i slobodna amino grupa je zatim kuplovana sa Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC, čime se dobila 2-[2-[2-[[1-[(4S)-4-amino5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]-4-piperidil]karbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Dobijeno jedinjenje je selektivno deblokirano korišćenjem piperidina i zatim je spojeno sa mono terc-butil estrom oktadekandionske kiseline da bi se dobila 2-[2-[2-[[1-[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]-4-piperidil]karbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Intermedijer je zatim ocepljen od 2-Cl-Trtsmole korišćenjem trifluoroetanola:DCM (1:1) da bi se dobila 2-[2-[2-[[1-[(4S)-5-terc-butoksi-[(18-terc-butoksi-18-oksooktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]-4-piperidil] karbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina (LCMS= m/z: 827,40 (M+H<+>)). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa HOSu u prisustvu DCC da bi se dobio intermedijer zaštićen sukcinimidom, koji je uklonjen sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, Deo F-OSu.

Primer 2: Sinteza Jedinjenja 1 :

N-ε<26>-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Karboksiheptadekanoilamino)-4(S)karboksibutirilamino] etoksi) etoksi]acetilamino)etoksi]etoksi)acetil][(Aib<8>, Arg<34>, Leu<38>GLP-1 (7-38) peptid

Deo A. Sinteza matičnog linearnog peptida Aib<8>, Arg<34>, Leu<38>GLP-1(7-38)

[0083] Roditeljski (izvorni) peptid je sintetizovan metodom čvrste faze. Početna smola korišćena za sintezu bila je Wang smola. Fmoc zaštićen leucin je korišćen za spajanje sa Wang smolom. Kuplovanje je izvedeno korišćenjem diizopropilkarbodiimida, N-hidroksibenzotriazola (DIC-HOBt) kao reagensa za kuplovanje u prisustvu 4-

1

dimetilaminopiridina (DMAP) koji je dao Fmoc-Leu-Wang smolu. Selektivno deblokiranje amino grupe Fmoc-Leu-Wang smole korišćenjem piperidina praćeno kuplovanjem sa Fmoc-Gli-OH korišćenjem HOBt i DIPC dalo je Fmoc-Gli-Leu-Wang smolu. Ovim se kompletira jedan ciklus. Anhidrid sirćetne kiseline i diizopropiletilamin/piridin su korišćeni da se prekinu nekuplovane amino grupe pri svakom kuplovanju amino-kiselina.

[0084] Gornja 2 koraka, tj., selektivno deblokiranje Fmoc-zaštite amino-kiseline vezane za smolu i kuplovanje sledećeg amino-kiselinskog ostatka u nizu sa Fmoc-zaštićenom amino grupom ponovljeni su za preostalih 30 aminokiselinskih ostataka. Selektivno deblokiranje, tj. uklanjanje zaštite sa Fmoc grupe je urađeno korišćenjem piperidina, a kuplovanje sa sledećom Fmoc zaštićenom amino-kiselinom je urađeno korišćenjem HOBt/DIPC. Bočni lanac aminokiselina zaštićenih Fmoc je zaštićen ortogonalno, npr. hidroksilna grupa serina, tirozina ili treonina je zaštićena sa tercbutil (-tBu) grupom, amino i gvanido grupa lizina i arginina su zaštićene sa terc-butiloksikarbonil (-Boc) i 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil (-Pbf) grupom, tim redosledom, imidazol histidina je zaštićen tritil (-Trt) a karboksilne kiselinske grupe asparaginske kiseline ili glutaminske kiseline su zaštićene sa -tBu grupom. Gore pomenuta dva koraka, tj. selektivno deblokiranje i zatim kuplovanje sa sledećom Fmoc zaštićenom amino-kiselinom su izvedeni da bi se dobila Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(Ot-Bu)-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Leu-smola.

[0085] Deblokiranje Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Leu-smole korišćenjem piperidina, praćeno je cepanjem i uklanjanjem zaštite korišćenjem trifluorosirćetne kiseline sa etan-1,2-ditiolom rezultiralo je sirovim H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Leu-OH (Aib<8>, Arg<34>, Leu<38>GLP-1 (7-38) peptidom koji je prečišćen pomoću HPLC.

Deo B:

[0086] Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, dela A-OSu preko prečišćenog (linearnog peptida) H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Leu-OH dobijenog u Delu A, u acetonitrilu na pH oko 10, rezultiralo je sirovim naslovnim peptidom koji je prečišćen preparativnom HPLC. Karakterizacija jedinjenja je data u Tabeli 3.

Primer 3: Priprema jedinjenja 2, 3, 5, 9, 10 i 12

[0087] Linearni peptidi jedinjenja 2, 3, 5, 9, 10 i 12 su pripremljeni metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 1, deo A. Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, deo A-OSu, sledeći proces Primera 1, Deo B preko odgovarajućih linearnih peptida dao je jedinjenje 2, 3, 5, 9, 10 i 12.

Primer 4: Priprema jedinjenja 4 i 11:

[0088] Linearni peptidi jedinjenja 4 i 11 su pripremljeni metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A, osim što je ovde Fmoc zaštićeni D-leucin prvo kuplovan sa Wang smolom, a zatim su sekvencijalno kuplovane druge amino-kiseline. Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, dela A-OSu preko odgovarajućeg linearnog peptida, praćenjem procesa iz Primera 2, Deo B, dalo je jedinjenja 4 i 11.

Primer 5: Priprema jedinjenja 8

[0089] Linearni peptid je pripremljen metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A, osim što je ovde Fmoc zaštićeni izoleucin prvo spojen sa Wang smolom, a zatim su uzastopno spojene druge aminokiseline. Presađivanjem aktiviranog lanca masnih kiselina, grupe A-OSu preko linearnog peptida, prateći proces iz Primera 2, Deo B, dobijeno je Jedinjenje 8.

Primer 6: Priprema jedinjenja 6

[0090] Linearni peptid je pripremljen metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A. Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, grupe B-OSu preko linearnog peptida sledeći analogni proces Primera 2, Deo B dalo je Jedinjenje 6.

Primer 7: Priprema jedinjenja 7

[0091] Presađivanjem aktiviranog lanca masnih kiselina, dela B-OSu preko linearnog peptida iz Primera 2, Deo A,

2

sledeći analogni proces Primera 2, Deo B, dobijeno je Jedinjenje 7.

Primer 8: Priprema jedinjenja 13

[0092] Presađivanjem aktiviranog lanca masnih kiselina, dela C-OSu preko linearnog peptida Primera 1, Deo A, prateći analogni proces Primera 1, Deo B, dobijeno je Jedinjenje 13.

Primer 9: Priprema jedinjenja 14

[0093] Linearni peptid je pripremljen metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A. Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, grupe C-OSu preko linearnog peptida sledeći analogni proces Primera 2, Deo B dalo je Jedinjenje 14.

Primer 10: Priprema jedinjenja 15

[0094] Linearni peptid je pripremljen metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A, počevši od Fmoc zaštićenog izoleucina, prvo je spojen sa Wang smolom, a zatim su sekvencijalno kuplovane druge amino-kiseline. Presađivanjem aktiviranog lanca masnih kiselina, dela C-OSu preko linearnog peptida, sledeći analogni postupak iz Primera 2, Deo B, dobijeno je Jedinjenje 15.

Primer 11: Priprema jedinjenja 16

[0095] Kalemljenjem aktiviranog lanca masnih kiselina, dela D-OSu preko linearnog peptida Primera 2, Deo A, sledeći analogni proces Primera 2, Deo B dalo je Jedinjenje 16.

Primer 12: Priprema jedinjenja 17

[0096] Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, dela E-OSu preko linearnog peptida Primera 2, Deo A, sledeći analogni proces Primera 2, Deo B dalo je Jedinjenje 17.

Primer 13: Priprema jedinjenja 18

[0097] Presađivanjem aktiviranog lanca masnih kiselina, dela F-OSu preko linearnog peptida Primera 2, Deo A, sledeći analogni proces Primera 2, Deo B, dobijeno je Jedinjenje 18.

[0098] Podaci o karakterizaciji sintetizovanih jedinjenja predmetnog pronalaska su dati u nastavku u Tabeli 3.

Tabela 3: Podaci o karakteristikama reprezentativnih jedinjenja predmetnog pronalaska

(nastavak)

Primer 14: Oralni test tolerancije glukoze (OGTT) kod pacova; pojedinačna injekcija; 1mg/kg

[0099] Životinje su podeljene u tri grupe - normalnu kontrolnu grupu, test grupu i treću semaglutidnu grupu, sa po 4 životinje u svakoj grupi. Životinje su gladovane 12 sati pre početka OGTT. Životinjama test grupe, jedinjenje 1 je ubrizgano supkutano u dozi od 1 mg/kg. Grupi koja je primala semaglutid, supkutano je ubrizgana doza od 1 mg/kg. Nakon 22 sata, 166 sati i 334 sata od potkožne injekcije ispitivanog leka ili semaglutida, glukoza u krvi je merena meračem glukoze u krvi (vreme 0 merenja). Svim životinjama je zatim oralno dato 2 g/kg rastvora glukoze. Glukoza u krvi je merena 20, 40, 60, 90 i 120 minuta nakon testa opterećenja glukozom. Zabeležena je telesna težina i unos hrane. Podaci o glukozi u krvi su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVA praćene Bonferonijevim posttestovima korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03). Podaci o AUC0-120min glukozi u krvi, analizirani su pomoću t testa.

[0100] Polipeptidi predmetnog pronalaska su pokazali značajan efekat snižavanja glukoze u poređenju sa kontrolnom grupom kada su proučavani u Oralnom testu tolerancije glukoze (OGTT) kod pacova. Na primer, Slika 6 prikazuje promenu nivoa glukoze u krvi od vremena 0 do 120 min posle 22 sata i 46 sati u test grupi kojoj je dato Jedinjenje 1 i grupi koja je tretirana semaglutidom.22 sata nakon jednokratnog doziranja, Jedinjenje 1 je pokazalo statistički značajno smanjenje nivoa glukoze u krvi sa p<0,001 u odnosu na normalnu kontrolu u ANOVA praćenom Bonferonijevim posttestovima. Efekat snižavanja glukoze Jedinjenja 1 bio je superiorniji od efekta snižavanja glukoze primećenog kod semaglutida (vidi Sliku 6A). Superiornost efekta na snižavanje glukoze Jedinjenja 1 primećena je čak i nakon 46 sati od potkožne primene (Slika 6B). Dalje, i Jedinjenje 1 i semaglutid su pokazali statistički značajno smanjenje unosa hrane u poređenju sa kontrolom kada su posmatrani na dan 2, kao i na dan 4 (vidi Tabele 4 i 5). Smanjeni unos hrane prikazan Jedinjenjem 1, 4. dana bio je veći od semaglutida (vidi Tabelu 5). Što se tiče smanjenja telesne težine, samo je testno jedinjenje pokazalo značajno smanjenje telesne težine 4. dana.

Tabela 4: Uticaj tretmana na unos hrane i telesnu težinu 2. dana

(nastavak)

Tabela 5 : Uticaj tretmana na unos hrane i telesnu težinu 4. dana

[0101] Iznenađujuće je otkriveno da su jedinjenja koja imaju X33 kao Leu i Ile pokazala značajno smanjenje glukoze u krvi u datim studijama, dok su jedinjenja sa drugim amino-kiselinama osim Leu i Ile imala značajno manji efekat na snižavanje glukoze u krvi. Polipeptid prema predmetnom pronalasku je pokazao značajno smanjenje glukoze u krvi u poređenju sa kontrolnom grupom. Takođe su testirana jedinjenja koja imaju druge amino-kiseline osim Leu ili Ile na X33 pozicijama. Na primer, Leu na 32. poziciji u jedinjenju 1 (SEQ ID NO: 05) je zamenjen sa Lys i Ser da bi se dobila jedinjenja Std-1 i Std-2, tim redosledom. Std-1 i Std-2 su pokazali samo oko 35 i 15% smanjenje AUC0-120min glukoze u krvi (Tabela 6).

Tabela 6: Procentualno smanjenje AUC0-120min glukoze u krvi na OGTT test pri dozi od 1 mg/Kg nakon 24 sata.

[0102] Slično tome, Jedinjenje 6 koje se razlikuje od liraglutida po tome što ima dodatni Leu na 32. poziciji i Jedinjenje 7 koje se razlikuje od liraglutida po tome što je 2. amino-kiselina Ala zamenjena sa Aib i ima Leu kao dodatnu 32. amino-kiselinu, pokazalo je efekat snižavanja glukoze u krvi na 24 sata što je bilo značajno više od liraglutida (Tabela 6).

[0103] Kada je utvrđeno da je Jedinjenje 1 značajno bolje u smislu smanjenja glukoze, unosa hrane i smanjenja telesne težine, sprovedeni su eksperimenti da se odredi trajanje delovanja jedinjenja iz predmetnog pronalaska. Efekat reprezentativnih jedinjenja predmetnog pronalaska (jedinjenja 1, 13 i 16) posle 166 sati (7 dana) i 334 sata (14 dana) je proučavan i upoređen sa efektom semaglutida. Jedinjenja su testirana prema dole navedenoj metodi:

Životinje su podeljene u tri grupe - normalnu kontrolnu grupu, test grupu i treću semaglutidnu grupu, sa po 4 životinje u svakoj grupi. Životinje su gladovane 12 sati pre početka OGTT. Životinjama test grupe, Jedinjenje 1, Jedinjenje 13 i Jedinjenje 16 su ubrizgani supkutano u dozi od 1 mg/kg. Grupi koja je primala semaglutid, supkutano je ubrizgana doza od 1 mg/kg. Posle 22 sata, 166 sati i 334 sata supkutane injekcije test jedinjenja ili semaglutida, glukoza u krvi je merena meračem glukoze u krvi (merenja vremena 0). Svim životinjama je zatim oralno dato 2 g/kg rastvora glukoze. Glukoza u krvi je merena 20, 40, 60, 90 i 120 minuta nakon testa opterećenja glukozom. Zabeležena je telesna težina i unos hrane. Podaci o glukozi u krvi su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVA praćene Bonferonijevim posttestovima korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03). Podaci o AUC0-120 min glukoze u krvi, analizirani su pomoću t testa.

2

[0104] Tabela 7 prikazuje smanjenje AUC glukoze u krvi za reprezentativna jedinjenja predmetnog pronalaska (jedinjenja 1, 13 i 16) u poređenju sa kontrolnom grupom posle 1. dana, 7. dana i 14. dana primene.

Tabela 7: Procentualno smanjenje AUC0-120min glukoze u krvi u OGTT testu pri dozi od 1 mg/kg.

[0105] Jedinjenja 1 i 13 su proučavana i upoređena sa semaglutidom u jednom eksperimentu (Eksp.1), a jedinjenje 16 je proučavano i upoređeno sa semaglutidom u posebnom eksperimentu (Eksp. 2). Posle 168 sati od injekcije, jedinjenja 1, 13 i 16 predmetnog pronalaska pokazala su oko 60% smanjenja AUC glukoze u krvi u poređenju sa nultim nivoom glukoze u krvi. S druge strane, semaglutid je pokazao samo oko 25% smanjenja nivoa glukoze u krvi u odnosu na nulti nivo glukoze u krvi.

[0106] Slična zapažanja su zabeležena u količini konzumirane hrane i promeni telesne težine. Kao što se može videti u Tabeli 8 u nastavku, životinje kojima su davana reprezentativna jedinjenja (jedinjenje 1, 13 i 16) su konzumirale značajno manje hrane u poređenju sa životinjama kojima je davan semaglutid. Jedinjenje 16 je pokazalo značajno smanjenje telesne težine demonstrirajući potencijalnu korisnost za lečenje gojaznosti.

Tabela 8: Utica na unos hrane i telesnu težinu u OGTT testu ri dozi od 1 m /K

(nastavak)

Primer 15: Smanjenje HbAlc kod db/db miševa sa dijabetesom tipa 2 nakon hroničnog lečenja

[0107] Ova studija je urađena na modelu miša sa dijabetesom. Životinje su podeljene u tri grupe za lečenje – kontrolnu grupu za dijabetičare, test grupu i grupu za lečenje semaglutidom. Jedinjenje 1 predmetnog pronalaska je injektirano supkutano u dozi od 0,3 mg/kg jednom dnevno tokom 3 dana (qd*3), nakon čega je sledila doza od 0,1 mg/kg svakog drugog dana za 7 doza (q2d*7) praćena dozom od 0,1 mg/kg jednom svaka četiri dana za dva ciklusa doziranja (q4d*2). Isti režim doziranja je primenjen u grupi koja je tretirana semaglutidom. Merenja nivoa glukoze u krvi i telesne težine vršena su svakodnevno. %HbA1c je meren 0, 7, 14. i 27. dana hromatografijom na koloni. Kumulativni unos hrane izračunat je 27. dana. %HbA1C podaci su analizirani dvosmernom ANOVA-om praćenom Bonferonijevim posttestovima korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03).

Životinje test grupe kojima je dato Jedinjenje 1 pokazale su statistički značajno smanjenje nivoa glukoze u krvi u poređenju sa kontrolnom grupom dijabetičara (vidi Sliku 7), a efekat je bio bolji od grupe koja je tretirana semaglutidom u kasnijoj fazi studije. Životinje test grupe kojima je dato jedinjenje 1 pokazale su značajno smanjenje unosa hrane kao što se može videti u rezultatima datim na Slici 8. Slika 8 prikazuje kumulativni unos hrane od 0. do 27. dana kod kontrolnih i db/db miševa tretiranih sa test jedinjenjem. I test jedinjenje i semaglutid su pokazali statistički značajno smanjenje unosa hrane u poređenju sa kontrolnom grupom dijabetičara. Dalje, test jedinjenje je pokazalo značajno manji unos hrane u poređenju sa semaglutidom. U istoj studiji, Jedinjenje 1 je takođe pokazalo značajno smanjenje telesne težine u poređenju sa kontrolnom grupom dijabetičara. Slika 9 prikazuje rezultat % promene telesne težine za kontrolnu i test grupu od 0. dana do 27. dana. Test Jedinjenje 1 pokazalo je značajno smanjenje od -16% u poređenju sa -8% uočeno u grupi koja je tretirana semaglutidom (videti Sliku 09).

[0109] Kod dijabetesa melitusa, veće količine HbA1c, što ukazuje na lošiju kontrolu nivoa glukoze u krvi, povezane su sa kardiovaskularnim oboljenjima, nefropatijom, neuropatijom i retinopatijom. U studiji od 27 dana, Jedinjenje 1 je pokazalo statistički značajno smanjenje nivoa HbA1c kod db/db miševa sa dijabetesom tipa 2 nakon hroničnog lečenja. Tabela 9 u nastavku i Slika 10 prikazuju nivo HbA1c 0. i 27. dana u kontrolnoj grupi i grupi sa dijabetesom nakon hroničnog tretmana Jedinjenjem 1. Efekat je bio statistički značajan čak i u poređenju sa semaglutidom.

Tabela 9: Efekat tretmana na % HbA1c nivoe kod db/db miševa

2

[0110] U posebnoj studiji, ispitivana Jedinjenja 1, 13 i 16 su proučavana i upoređena sa semaglutidom zbog njihovog uticaja na nivo HbA1c i insulina i kumulativnu potrošnju hrane, promenu telesne težine i AUC glukoze u krvi. Studija je izvedena na sličan način kao gore na modelu miša sa dijabetesom. Životinje su podeljene u tri grupe za lečenje -kontrolnu grupu za dijabetičare, test grupu i grupu za lečenje semaglutidom. Reprezentativna jedinjenja predmetnog pronalaska, Jedinjenje 1, Jedinjenje 13 i Jedinjenje 16, su ubrizgana supkutano u dozi od 3,04 ili 6,078 nM (svakog naizmeničnog dana do 28. dana (q2d*15). Isti režim doziranja je davan u grupi koja je tretirana semaglutidom. Merenje nivoa glukoze u krvi i telesne težine rađeno je dnevno. %HbA1c, Insulin su mereni 0, 14. i 29. dana. Kumulativni unos hrane i promena telesne težine izračunati su 14. i 29. dana. Podaci o %HbA1c, insulinu su analizirani dvosmernim ANOVA nakon čega su usledili Bonferonijevi posttestovi korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03). Dok su podaci o AUC glukoze u krvi, promeni telesne težine i kumulativnom unosu hrane analizirani jednosmernom ANOVA, praćenom Bonferonijevim posttestovima korišćenjem PRISM-a (Grafikon verzija 5.03). Od 29. do 45. dana, životinje su držane u periodu oporavka tokom kojeg nije davan nikakav lek. Tokom ovog perioda mereni su glukoza u krvi i telesna težina.45. dana merene su promene telesne težine, %HbA1c, insulin.

[0111] Rezultati su dati u Tabelama 10, 11 i 12 u daljem tekstu.

2

7)=

5)(n*1

(q2d);

78n .0 6 & 40. (3 16 ej endinj

),Jen

6.078 &.04(3 13je jendin

),Je

8n .07 (6 1nje njeedi ): J (IC bA :H 10 a belTa

7)(n= 5) d*1 (q2);

8n 07 6.& 4.0(316 enjinje Jed),

8n

6.07 & 4 (3.013nje e nj ediJ

),

8n.07 (6 1 jejen

Jedin : L) /(ng in sul:In 11 ela Tab

Table 12: Kumulativni unos hrane, Šećer u krvi AUC(mg/dL*dani) i Promene u telesnoj težini:

Jedinjenje 1 (6.078nM), Jedinjenje 13 (3.04 & 6.078nM), Jedinjenje 16 (3.04 & 6.078nM); (q2d*15)

[0112] Reprezentativna jedinjenja prema predmetnom pronalasku (jedinjenja 1, 13 i 16) u dozi od oko 3 nM i 6 nM pokazala su značajno smanjenje HbA1c, glukoze u krvi, unosa hrane i telesne težine u poređenju sa kontrolom (Tabela 12). Smanjenje je bilo uporedivo sa onim koje je pokazao semaglutid u dozi od oko 12 nM. Štaviše, efekat je primećen čak i nakon 29 dana (Tabele 13 i 14) što pokazuje potencijal jedinjenja iz predmetnog pronalaska za razvoj dugo delujućih lekova koji ne zahtevaju čestu primenu i time povećavaju pristanak pacijenta.

Tabela 13: Studija oporavka – Šećer u krvi AUC (mg/dL*dani)

2

(nastavak)

Tabela 14: Studija oporavka-%HbA1C i Insulin (ng/mL)

[0113] Ovi rezultati pokazuju da jedinjenje predmetnog pronalaska može naći potencijalnu upotrebu za lečenje dijabetesa i gojaznosti.

Claims

Patentni zahtevi 1. Polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiselina: (a)

eo or (b)

eo ili (c)

Deo A ili (d)

eo ili (e)

ili (f)

eo ili (g)

eo ili (h)

Deo B ili (i)

ili (j)

eo ili (k)

ili (l)

eo ili (m)

eo ili (n)

ili (o)

ili (p)

ili (q)

eo ili (r)

pri čemu je DSer serinski ostatak koji ima D-konfiguraciju i DLeu je leucinski ostatak koji ima D-konfiguraciju; pri čemu je Ser(OMe) serinski ostatak koji ima strukturu:

pri čemu deo A ima strukturu:

pri čemu deo B ima strukturu:

pri čemu deo C ima strukturu:

pri čemu deo D ima strukturu:

pri čemu deo E ima strukturu:

i pri čemu deo F ima strukturu:
2. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

pri čemu deo A ima strukturu:
3. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu je Ser(OMe) serinski ostatak koji ima strukturu:

pri čemu deo A ima strukturu:
4. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

pri čemu deo A ima strukturu:
5. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

pri čemu DLeu je leucinski ostatak koji ima D-konfiguraciju; i pri čemu deo A ima strukturu:
6. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

pri čemu deo A ima strukturu:
7. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu deo B ima strukturu:
8. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu deo B ima strukturu:
9. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu deo A ima strukturu:
10. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu DSer je serinski ostatak koji ima D-konfiguraciju i DLeu je leucinski ostatak koji ima D-konfiguraciju; pri čemu je Ser(OMe) serinski ostatak koji ima strukturu: 4

pri čemu deo A ima strukturu:
11. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu DSer je serinski ostatak koji ima D-konfiguraciju; i pri čemu deo A ima strukturu:
12. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu DLeu je leucinski ostatak koji ima D-konfiguraciju; i pri čemu deo A ima strukturu:
13. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

pri čemu deo A ima strukturu:
14. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu deo C ima strukturu:
15. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu deo C ima strukturu:
16. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

pri čemu deo C ima strukturu: 4
17. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

pri čemu deo D ima strukturu:
18. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

eo pri čemu deo E ima strukturu:
19. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina:

pri čemu deo F ima strukturu:
20. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih zahteva za upotrebu u lečenju dijabetesa.
21. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 19 za upotrebu u lečenju gojaznosti. 4