BR112020020419A2 - Novos análogos de glp-1 - Google Patents
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Abstract
a presente divulgação refere-se aos novos análogos do peptídeo semelhante a glucagon-1 (glp-1) (7-37) com uma sequência de aminoácidos com leu ou ile no terminal c. os novos análogos são potentes agonistas de glp-1 com efeito adverso reduzido e duração de ação melhorada. a presente divulgação refere-se ainda a derivados acilados dos novos análogos que possuem ainda potência e a duração de ação melhoradas e são adequados para administração oral. os análogos da presente divulgação podem ser úteis no tratamento de diabetes e obesidade.
Description
“NOVOS ANÁLOGOS DE GLP-1”
[001]Este pedido reivindica o benefício de três pedidos provisórios indianos, sendo os n° dos pedidos IN 201821013109 (depositado em 05 de abril de 2018); IN 201821040468 (depositado em 26 de outubro de 2018) e IN 201821040474 (depositado em 26 de outubro de 2018), que estão incorporados neste documento por referência.
[002]A presente divulgação refere-se aos novos análogos do Peptídeo semelhante a Glucagon-1 (GLP-1) (7-38) possuindo uma sequência de aminoácidos com Leu ou Ile no terminal C. Os novos análogos são potentes agonistas de GLP-1 com efeito adverso reduzido e duração de ação melhorada. A presente divulgação se refere ainda a derivados acilados dos novos análogos, que têm ainda mais potência e duração de ação melhoradas e são adequadas para administração oral. Os análogos divulgados neste documento são acilados com frações prolongadas, que aumentam a duração da atividade dos compostos. Os análogos divulgados neste documento podem ser úteis no tratamento de diabetes e obesidade.
[003]Peptídeo semelhante a glucagon-1 (GLP-1) é um hormônio que é produzido principalmente em células L enteroendócrinas do intestino e é secretado no fluxo sanguíneo quando o alimento contendo gordura, hidrolisado de proteína e/ou glicose entra no duodeno. O GLP-1 é derivado do processamento pós- traducional específico da célula do gene pré-proglucagon. Inicialmente, o peptídeo GLP-1(1-37) foi identificado a partir deste processamento, mas foram os dois produtos truncados de modo N-terminal, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)e GLP-1(7-36) amida, que reconheceram o receptor pancreático e que foram determinadas como sendo as espécies ativas in vivo. Descobriu-se que o GLP-1 estimula a secreção de insulina, causando, assim, a absorção de glicose pelas células e diminuiu os níveis de glicose sérica. Agonistas de GLP-1 estão disponíveis para o tratamento para Diabetes Mellitus Tipo 2 (T2DM) como drogas favorecidas, pois são desprovidos de hipoglicemia e com um benefício positivo de perda de peso. A substância endógena, GLP-1(7-37) e GLP-1(7-36)amida, é clivada por peptidases e, portanto, têm uma meia-vida muito curta. Esforços foram feitos para melhorar o desempenho ao desenvolver-se análogos de GLP-1 com meia-vida melhorada. A primeira droga aprovada em 2005 foi Exenatida com dosagem de duas vezes ao dia no nível de dose de 10 mcg e demonstrou uma melhora significativa na HbA1c, um marcador de controle de glicose. Além disso, Novo Nordisk desenvolveu Liraglutida (Patente dos EUA Nº 6,268,343) (SEQ ID NO: 2) com dosagem diária de 1,8 mg, s.c./dia e aprovada em 2010. Pesquisa e desenvolvimento adicionais produziram produtos de administração semanal, como o Albiglutida desenvolvido pela GSK e Dulaglutida desenvolvido pela Eli Lilly. Recentemente, Semaglutida (Publicação Internacional Nº WO 2006/097537 A2), um análogo de GLP-1 foi aprovado pela USFDA. O Semaglutida (SEQ ID NO: 3) é comercializado sob o nome comercial Ozempic®. É administrado como uma injeção subcutânea uma vez por semana.
[004]Muitas tentativas de produzir análogos de GLP-1 com potência e duração de ação melhoradas são relatadas na literatura. A Patente dos EUA Nº 7,291,594 B2 (a patente US '594) divulga os derivados de GLP-1 (7-35) tendo adicionado vários resíduos de arginina e/ou lisina ao terminal C destes para fornecer alta biodisponibilidade através de membranas mucosas. A patente US '594 divulga ainda que esses derivados podem ser conferidos com resistência à dipeptidil peptidase IV (DPP-IV), substituindo o aminoácido 8 em sua sequência de aminoácidos de GLP-1 por Ser, ou com resistência à tripsina substituindo os aminoácidos 26 e 34 por Gln e Asn, respectivamente.
[005]A Patente dos EUA Nº 7,893,017 B2 (a patente US '017) divulga análogo de GLP-1 acilado em que o análogo de GLP-1 é estabilizado contra DPP- IV pela modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido nas posições 7 e 8 em relação à sequência de GLP-1 (7-37) e em que a referida acilação é um diácido ligado diretamente ao resíduo de aminoácido C-terminal do referido análogo de GLP-1.
[006]A Patente dos EUA Nº 8,951,959 Β2 (a patente US '959) divulga um análogo de GLP-1 (7-37) resistente a DPP-IV possuindo um resíduo de aminoácido não proteogênico contendo grupo triflurometil na posição 8 em relação à sequência de GLP-1, e é acilado com uma fração que compreende dois grupos ácidos para o resíduo de lisina na posição 26.
[007]A Patente dos EUA Nº 7,084,243 B2 (a patente US '243) divulga os análogos de GLP-1 (7-37) possuindo Val ou Gly na posição 8 em relação à sequência de GLP-1 (7-37) como peptídeos resistentes a DPP-IV.
[008]A Publicação Internacional Nº WO 2017/149070 A1 (a WO '070) divulga análogos de GLP-1 possuindo um Trp em uma posição correspondente à posição 8 de GLP-1 (7-37) e estes compostos de Trp8 mostraram ser muito estáveis contra a degradação por DPP-IV.
[009]A Publicação Internacional nº WO 2004/103390A2 (a WO '390) divulga que a modificação na posição P'1 (correspondente à posição 9 no caso de GLP-1 (7-37)) pode produzir análogos de GLP-1 com suscetibilidade significativamente reduzida à clivagem mediada por enzima (tal como DPP-IV) em relação ao substrato nativo, mantendo ainda a atividade biológica do substrato nativo. A WO '390 divulga ainda análogos de GLP-1 (7-37) possuindo um aminoácido com carbono Cβ tetrassubstituído (como terc- leucina) na posição 9 fornece análogos de GLP com resistência à degradação por DPP-IV.
[010]A Publicação Internacional Nº WO 2015/086686 A2 (a publicação de WO '686) divulga que a incorporação de aminoácidos alfa-metil funcionalizados diretamente na cadeia principal de análogos de GLP-1 foi determinada para produzir peptídeos resistentes a protease (inclui resistente a DPP-IV).
[011]Vários outros agonistas de GLP-1 resistentes a DPP-IV são divulgados em publicações de patentes, tais como as Publicações Internacionais Nº WO 2007/030519 A2, WO 2004/078777 A2, WO 2007/039140 A1, WO 2014/209886 A1, WO 2012/016419 A1, WO 2017/211922 A2, WO 2016/198544 A1 e WO 2013/051938 A2.
[012]Vários pedidos de patente divulgam análogos de GLP-1 estendidos no terminal C com maior estabilidade e maior duração de ação. Por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nº 7,482,321 B2, 9,498,534 B2 e 7,897,566 B2.
[013]Vários pedidos de patente divulgam análogos de GLP-1 acilados em que os análogos de GLP-1 são ligados a substituintes lipofílicos opcionalmente através de um ligante peptídico para fornece maior duração de ação.
[014]A Patente dos Estados Unidos N° 8,603,972 B2 (a US ‘972) divulga derivados monoacilados de análogos de GLP-1, em que o resíduo de Lys na posição 37 ou 38 do análogo de GLP-1 é acilado.
[015]Patente dos Estados Unidos Nº 8,648,041 B2, 9,758,560 B2, 9,006,178 B2, 9,266,940 B2, 9,708,383 B2 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº US 2015/0152157 A1, US 2015/0133374 A1 divulgam derivados di-acilados de análogos de GLP-1.
[016]A Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº U.S. 2016/0200791 A1 divulga derivados triacilados de análogos de GLP-1.
[017]Publicações Internacionais Nº WO 2016/083499 A1, WO 2016/097108 A1 e WO 2014/202727 A1 divulga análogos de GLP-1 acilados em que o resíduo de Lys de análogos de GLP-1 é ligado a duas frações prolongadas através de um ligante peptídico ramificado.
[018]As Publicações Internacionais Nº WO 2009/030771 A1 e WO 2018/083335 Α1 divulgam vários agentes de acilação (cadeia lateral) que podem ser anexados ao resíduo de Lys de análogos de GLP-1 para fornecer maior duração de ação.
[019]A Publicação Internacional Nº WO 2013/186240 A2 divulga análogos de peptídeo exendina-4 tendo Gly, Ser ou Ser funcionalizada, por exemplo, Ser (OCH3), D-Ser ou D-Ser funcionalizada, por exemplo, D-Ser(OCH3), Aib, Ala, ou D- Ala na posição 2 da sequência de aminoácidos de exendina-4.
[020]Vários outros análogos de GLP-1 são divulgados em pedidos de patente, tais como as Publicações Internacionais N° WO 2005/027978 A2, WO 1998/008871 A1, WO 1999/043705 A1, WO 1999/043706 A1, WO 1999/043707 A1, WO 1999/043708 A1, WO 2000/034331 A2, WO 2009/030771 A1, WO 2011/080103 A1, WO 2012/140117 A1, WO 2012/062803 A1, WO 2012/062804 A1, WO 2013/037690 A1, WO 2014/202727 A1, WO 2015/000942 A1, WO 2015/022400 A1, WO 2016/083499 A1, WO 2016/097108 A1 e WO 2017/149070 A1.
[021]Ainda assim, há necessidade de desenvolver análogos de GLP-1 que tenham propriedades desejadas ideais em termos de estabilidade e duração de ação.
[022]Um aspecto da presente divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ou Aib, ; X3 está ausente ou é Gln; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu, D-Leu, D-Ile ou Ile; X34 está ausente e
X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: em que Q e T estão ausentes; U está ausente ou é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W; W está ausente ou é selecionado de um grupo consistindo em –C(O)-CH2- O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], –C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], –C(O)-C(CH3)2-NH-] e C(O) NH N ] em que ] é o ponto de ligação com o grupo Y; Y é–C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z; Z é –C(O)-(CH2)n-COOH ou –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é um número inteiro de 14 a 20.
[023]Os polipeptídeos da presente divulgação são potentes agonistas de GLP-1 com menos efeitos adversos. Além disso, os polipeptídeos do presente divulgação são estáveis e têm longa duração de ação e são adequados para administração oral.
[024]A Figura 1A ilustra a preparação da Fração A-OSu (Intermediário 3). A Figura 1B ilustra a preparação da Fração A-OSu (Intermediário 3).
[025]A Figura 2 ilustra a preparação da Fração C-OSu.
[026]A Figura 3 ilustra a preparação da Fração D-OSu.
[027]A Figura 4 ilustra a preparação da Fração E-OSu.
[028]A Figura 5 ilustra a preparação da Fração F-OSu.
[029]As Figuras 6A e 6B ilustram os resultados de um teste de tolerância à glicose oral (OGTT) para o Composto 1 em ratos; injeção única; 1 mg/kg de AUC de glicose 0-120 min (Figura 6A = após 22 h, Figura 6B = após 46 hrs).
[030]A Figura 7 ilustra a redução nos níveis de glicose no sangue em camundongos db/db diabéticos tipo 2 após o tratamento crônico com o Composto
1.
[031]A Figura 8 ilustra a redução na ingestão de alimentos em camundongos db/db após o tratamento com o Composto 1.
[032]A Figura 9 ilustra a eficácia do Composto 1 em camundongos db/db na redução do peso corporal.
[033]A Figura 10 ilustra a redução em Hb1Ac em camundongos db/db após o tratamento com o Composto 1.
ABREVIAÇÕES Aib: Ácido 2-aminoisobutírico ADO: Ácido 8-amino-3,6-dioxo-octanoico OGTT: Teste de tolerância à glicose oral DIPEA: N,N'-Di-isopropiletilamina HOBt: 1-Hidroxibenztriazol DIPC: N,N'-Di-isopropilcarbodiimida HOSu: N-Hidroxissuccinimida IBCF: Cloroformiato de isobutila NMM: N-Metilmorfolina THF: Tetraidrofurano DCM: Diclorometano DMAP: 4-Dimetilaminopiridina DCC: Diciclo-hexil carbodiimida DMAc: Dimetilacetamida
[034]A presente divulgação fornece um análogo de GLP-1 de ação prolongada estável, que não requer dosagem subcutânea frequente e também é adequada para administração oral. Surpreendentemente, descobriu-se que a adição de uma Leu extra no terminal C da sequência produziu peptídeos com potência significativamente melhorada e duração de ação quando comparado com o peptídeo de origem. Os peptídeos com uma Ile adicional também mostraram um efeito semelhante de potência e duração da ação melhoradas quando comparados ao peptídeo de origem. Além disso, a divulgação neste documento demonstra frações, que podem ser anexadas a peptídeos que são análogos de GLP-1(7-37) através de reação de acilação para produzir compostos com potência significativamente melhorada e duração de ação mais longa. As frações prolongadas dos compostos divulgados têm ligações mais estáveis, que são menos suscetíveis à clivagem por enzimas biológicas. Assim, os compostos divulgados neste documento são mais estáveis e exigem uma administração menos frequente, adicionando à conformidade do paciente. Consequentemente, em algumas modalidades, a divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 (SEQ ID NO: 4) em que X2 é Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ou Aib, ; X3 está ausente ou é Gln; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu, D-Leu, D-Ile ou Ile; X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo de amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado.
[035]Em algumas modalidades, X21 pode ser acilado com as frações prolongadas relatadas nas Patentes dos Estados Unidos Nº 6,268,343, 8,951,959 Β2, 8,603,972 B2, 8,648,041 B2, 9,758,560 B2, 9,006,178 B2, 9,266,940 B2, 9,708,383 B2 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° US
2015/0152157 A1 e US 2015/0133374 A1; Publicação Internacional Nº WO 2009/030771 A1, WO 2006/097537 A2 e WO 2018/083335 Α1.
[036]Em algumas modalidades, a X21 Lys é acilada em seu grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) com uma fração compreendendo um grupo de ácido graxo. O grupo de ácido graxo pode ser ligado a X21 Lys através de um ligante. Consequentemente, em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ou Aib ; X3 está ausente ou é Gln; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu, D-Leu, D-Ile ou Ile; X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: em que Q e T estão ausentes; U está ausente ou é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W; W está ausente ou é selecionado de um grupo consistindo em –C(O)-CH2- O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], –C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], –C(O)-C(CH3)2-NH-] e C(O) NH N ] em que ] é o ponto de ligação com o grupo Y; Y é–C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z;
Z é –C(O)-(CH2)n-COOH ou –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é um número inteiro de 14 a 20.
[037]Em algumas modalidades, o aminoácido em X2 é selecionado dentre Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ou Aib.
[038]Em algumas modalidades X2 é Aib.
[039]Em algumas modalidades, X3 está ausente.
[040]Em algumas modalidades, X33 é Leu.
[041]Em algumas modalidades, X33 é Ile.
[042]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é selecionado dentre um grupo consistindo em –C(O)-NH- C(O) NH N ] (CH2)3-4-NH-], –C(O)-C(CH3)2-NH-] e .
[043]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que U e W estão ambos ausentes e Z é –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é o número inteiro 14.
[044]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-].
[045]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-C(CH3)2-NH-].
[046]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-NH-(CH2)4-NH-].
[047]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-NH-(CH2)3-NH-].
[048]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , C(O) NH N ] em que W é .
[049]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que Z é –C(O)-(CH2)n-COOH, em que n é o número inteiro 16.
[050]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que Z é –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é um número inteiro 14.
[051]Em algumas modalidades, X2 é Ala ou Aib; X3 está ausente; X33 é Leu; U está ausente; W está ausente; Y é –C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z; Z é –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é o número inteiro 14.
[052]Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Aib; X3 está ausente; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu; X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: em que Q e T estão ausentes; U é–C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W; W é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], em que ] é o ponto de ligação do grupo Y; Y é–C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z; Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
[053]Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Aib ; X3 está ausente;
X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu; X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: em que Q e T estão ausentes; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W; W é –C(O)-C(CH3)2-NH-] em que ] é o ponto de ligação com o grupo Y; Y é–C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z; Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
[054]Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Aib, ; X3 está ausente; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu; X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração:
em que Q e T estão ausentes; U é–C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W; W é –C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-] em que ] é o ponto de ligação com o grupo Y; Y é–C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z; Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
[055]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-NH-(CH2)4-NH-].
[056]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-NH-(CH2)3-NH-].
[057]Em algumas modalidades, a divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Aib, ; X3 está ausente; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu; X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: em que Q e T estão ausentes; U é–C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W; W é –C(O)-NH-(CH2)4-NH-], em que ] é o ponto de fixação do grupo Y; Y é –C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z; Z é –C(O)-(CH2)n-COOH ou –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é um número inteiro de 14 a 20.
[058]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
[059]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que Z é –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é o número inteiro 14.
[060]Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Aib, ; X3 está ausente; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu;
X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: em que Q e T estão ausentes; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W; C(O) NH N ] Wé em que ] é um ponto de ligação com o grupo Y; Y é –C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z; e Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
[061]Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe); X3 está ausente; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu; X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: em que Q e T estão ausentes; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W;
W é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-, –C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], –C(O)- C(CH3)2-NH-], em que ] é um ponto de ligação com o grupo Y; Y é –C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--, em que -- é o ponto de ligação com o grupo Z; e Z é –C(O)-(CH2)n-COOH ou –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é um número inteiro de 14 a 20.
[062]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-].
[063]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-;
[064]Em algumas modalidades, X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: , em que W é –C(O)-C(CH3)2-NH-]
[065]Em algumas modalidades, X21 é Lys modificado por lipídio em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) é acilado com uma fração que é representada pelas frações fornecidas na Tabela 1 Tabela 1: Frações representativas para o grupo {-Q-T-U-W-Y-Z Designação Fração
Fração A H O O N O O }
O Fração B O OH
H O Fração C H O O N O }
O Fração D H O
O Fração E H H H O
O Fração F H H O
[066]Em outra modalidade, a presente divulgação fornece um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que é selecionado a partir dos peptídeos fornecidos na Tabela 2: Tabela 2: Compostos de polipeptídeo representativos da presente divulgação Comp. Estrutura* Seq # ID 1 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO: 05 Fração A NH Moiety A 2 H O SEQ H-Ser(OMe)-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO:: 06 Fração A NH Moiety A 3 H O O SEQ
ID NO: 07 Fração Moiety A
NH 4 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-(DLeu)
ID NO: 08 Fração NH Moiety A
A 5 H O SEQ H-S-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO:: 09 Fração NH Moiety A
A 6 H O SEQ H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO: 10 Fração NH Moiety BB
7 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO:: 05 Fração B NH Moiety B 8 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-I
ID NO: 11 Fração A NH Moiety A
O 9 H SEQ H-(DSer(OMe))-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO: 12 Fração A NH Moiety A 10 H O SEQ H-(DSer)-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO: 13 Fração A NH Moiety A 11 H O H O SEQ H N Q-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-(DLeu)
ID NO: 14 Fração A NH Moiety A 12 H O SEQ H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L ID NO: 10 Fração A NH Moiety A 13 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO: 05 Fração C NH Moiety C
14 H O SEQ H-S-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO:: 09 Fração C NH Moiety C 15 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-I
ID NO:: 11 Fração C NH Moiety C 16 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO: 05 Fração D NH Moiety D 17 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO: 05 Fração E NH Moiety E 18 H O H O SEQ H N E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A N E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-L
ID NO: 05 Fração F NH Moiety F * Salvo indicação em contrário, todos os aminoácidos nas estruturas têm configuração L na posição α. D quando usado como um prefixo ao aminoácido na sequência denota a configuração D do aminoácido. Por exemplo (DSer) denota que o aminoácido Serina na sequência tem a configuração D.
[067]Salvo indicação em contrário, a divulgação pretende cobrir os isômeros L e D dos aminoácidos nas sequências.
[068]Ser(OMe) conforme descrito neste documento na divulgação é o aminoácido serina com seu grupo hidroxila metilado e tem a seguinte estrutura.
OMe * *
[069]As sequências de polipeptídeos mencionadas na divulgação são representadas pelo código de letra única dos aminoácidos conforme aprovado pelo IUPAC.
[070]Q, T, U, W, Y e Z conforme usados neste documento para definir a fração de acilação das modalidades da presente divulgação são diferentes do código de letra única do aminoácido usado para denotar a sequência polipeptídica.
[071]Os polipeptídeos da presente divulgação surpreendentemente mostraram redução significativa na glicose no sangue quando submetidos a um teste de tolerância à glicose oral (OGTT) em ratos SD. A porcentagem de redução de glicose no sangue em ratos SD quando expostos com glicose oral foi significativamente menor do que os polipeptídeos correspondentes que carecem da Leu ou Ile adicional na posição X33.
[072]A presente invenção é ilustrada em detalhes com referência aos exemplos a seguir. É desejável que o exemplo seja considerado em todos os aspectos como ilustrativo e não se destina a limitar o escopo da invenção reivindicada. EXEMPLOS: Métodos Gerais de Preparação:
[073]O composto de polipeptídeo da presente divulgação pode ser preparado por métodos descritos abaixo neste documento. O processo envolve duas etapas, envolvendo a preparação do peptídeo linear de origem e subsequente ligação de cadeia de ácido graxo ao peptídeo de origem.
[074]Os peptídeos descritos neste documento podem ser preparados por síntese química usando técnicas de fase sólida tais como aquelas descritas em G. Barany e R. B. Merrifield, “The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology” Volume 2—
“Special Methods in Peptide Synthesis, Part A”, pp. 3-284, E. Gross e J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980; e em J. M. Stewart e J. D. Young, “Solid- Phase Peptide Synthesis”, 2ª Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984. A estratégia desejada baseia-se no grupo Fmoc (9-Fluorenilmetil-oxicarbonil) para proteção temporária do grupo α-amino, em combinação com os grupos de proteção, tais como grupos terc-butila (-tBu), terc-butiloxicarbonil (-Boc), tritil (-Trt) para proteção temporária das cadeias laterais de aminoácidos (ver, por exemplo E. Atherton e R. C. Sheppard, “The Fluorenylmethoxyicarbonil Amino Protect Group”, em “The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology” Volume 9-“Special Methods in Peptide Synthesis, Part C”, pp. 1-38, S. Undenfriend e J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego, 1987).
[075]Os peptídeos podem ser sintetizados de forma gradual em um suporte polimérico insolúvel (também referido como "resina") começando a partir do terminal C do peptídeo. Uma síntese é iniciada pela anexação do aminoácido C- terminal do peptídeo à resina através da formação de uma ligação de amida ou éster. Isto permite a liberação eventual do peptídeo resultante como uma amida ou ácido carboxílico C-terminal, respectivamente.
[076]O aminoácido C-terminal e todos os outros aminoácidos usados na síntese são obrigados a ter seus grupos α-amino e funcionalidades de cadeia lateral (se presentes) diferencialmente protegidos de modo que o grupo de proteção α- amino pode ser seletivamente removido durante a síntese. O acoplamento de um aminoácido é realizado pela ativação de seu grupo carboxila como um éster ativo e reação deste com o grupo α-amino desbloqueado do aminoácido N-terminal anexado à resina. A sequência de desproteção e acoplamento de grupo α-amino é repetida até que toda a sequência peptídica seja montada. O peptídeo é então liberado da resina com desproteção concomitante das funcionalidades da cadeia lateral, geralmente na presença de eliminadores apropriados para limitar reações colaterais. O peptídeo resultante é finalmente purificado por HPLC de fase reversa.
[077]O peptídeo de origem pode então ser acoplado à cadeia de ácido graxo acoplando a cadeia de ácido graxo ativada com o peptídeo de origem. A cadeia de ácido graxo pode ser produzida por métodos bem conhecidos na química orgânica. Por exemplo, a cadeia de ácidos graxos pode ser feita usando métodos sintéticos de fase sólida que permitem a preparação de cadeias de ácidos graxos lineares.
[078]Os peptídeos lineares sintetizados foram purificados pelo procedimento de HPLC preparativa conforme descrito abaixo: HPLC preparativa: Módulo de gradiente quaternário WATERS 2555 (Fluxo total máx: 300 mL/min, Pressão máx: 3000 psi) ou Shimadzu LC-8A (Fluxo total máx: 150 mL: Pressão máxima: 20 Mpa) Coluna: C18, 10µ Fluxo: 75 mL/min Fase Móvel: Para primeira purificação Fase Móvel A: pH 7,5 Tampão fosfato p Fase Móvel B: Acetonitrila Gradiente: 10 a 40% Fase Móvel-B em 300 min. Para segunda purificação: Fase Móvel A: 1% de ácido acético em água Fase Móvel B: 1% de ácido acético em Acetonitrila:n-Propanol(50:50) Gradiente: 15 a 45% Fase Móvel B em 300 min
[079]Os compostos finais da presente divulgação foram purificados pelo procedimento de HPLC preparativa conforme descrito abaixo: HPLC preparativa: Módulo de gradiente quaternário WATERS 2555 (Fluxo total máx: 300 mL/min, Pressão máx: 3000 psi) ou Shimadzu LC-8A (Fluxo total máximo: 150 mL, pressão máxima: 20 Mpa) Coluna: C18, 10µ Fluxo: 75 mL/min
Fase Móvel: Para primeira purificação Para segunda purificação Fase Móvel Tampão fosfato pH 7,5 1% de ácido acético em água
A Fase Móvel Acetonitrila 1% de ácido acético em B Acetonitrila:n-Propanol (50:50) Gradiente 10 a 40% Fase Móvel B em 15 a 45% Fase Móvel B em 300 min 300 min
[080]A pureza dos compostos da presente divulgação foi analisada por método de RP-HPLC conforme descrito abaixo: Método B1 de HPLC: Coluna: YMC Pack-Ph (4,6 mm X 150 mm 3μ) Eluente: Fase Móvel A: 0,1% de ácido trifluroacético em água Fase móvel B: 0,1% de ácido trifluroacético em Acetonitrila Taxa de fluxo: 1,5 mL/min Detecção: Detecção de UV a 210 nm Temperatura da Coluna: 50 °C Tempo de Execução: 50 min. Gradiente: Tempo Fase Móvel A % Fase Móvel B % 0,01 90 10 35,0 20 80 40,0 20 80 41,0 90 10 50,0 90 10 Método B2 de HPLC: Coluna: YMC-Pack Pro C18 (4 mm x 250 mm, 3μ) Eluente: Fase Móvel A: Tampão: Acetonitrila (900:100)
Fase móvel B: Tampão: Acetonitrila (300:700 Tampão: Ortofosfato de di-hidrogênio potássio em água, pH ajustado para 3,0±0,1 com ácido ortofosfórico Taxa de fluxo: 1,0 mL/min Detecção: Detecção de UV a 210 nm Temperatura da Coluna: 50 °C Temperatura da Bandeja de Amostra: 8 °C Tempo de Execução: 38 min. Tempo Fase Móvel A % Fase Móvel B % 0 100 0 5 100 0 30 0 100 32 0 100
32.1 100 0 38 100 0 Método B3 de HPLC: Coluna: Waters X-Select CSH-C18 (150 mm X 4,6 mm; 2,5 μ) Eluente: Fase Móvel A: Tampão: Acetonitrila (900:100) Fase móvel B: Tampão: Acetonitrila (300:700 Tampão: Ortofosfato de di-hidrogênio potássio em água, pH ajustado para 1,5±0,1 com ácido ortofosfórico Taxa de fluxo: 0,9 mL/min Detecção: Detecção de UV a 210 nm Temperatura da Coluna: 40 °C Temperatura da Bandeja de Amostra: 5 °C Tempo de Execução: 100 min. Tempo Fase Móvel A Fase Móvel B 0 50 50
[081]Os compostos da presente divulgação foram analisados pelo LCMS conforme descrito abaixo:
[082]Os espectros de massa foram registrados no LCMS usando Waters Acquity® QDa®, Waters Micromass Quattro Micro API ou Thermo scientific LCQ Fleet™. A solução de teste foi preparada dissolvendo-se uma quantidade adequada de analito em diluente com uma concentração final de 1 μg/ml a 50μg/ml, dependendo da ionização do analito. A solução de teste foi infundida a uma taxa de cerca de 10 µl a 50 µl por minuto em LCMS por 1 min e os espectros de massa foram registrados em modo positivo ou negativo de Ionização por Eletrospray (ESI) e em uma faixa de massa apropriada. Exemplo 1: Preparação de cadeias laterais de ácido graxo ativado:
1. Preparação de ácido 18-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5- dioxopirrolidin-1-il)oxi-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4- oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico (Fração A-OSu, Intermediário-3)
[083]A cadeia lateral de ácido graxo ativado, Fração A-OSu foi preparada por síntese de fase sólida usando resina de cloreto de 2-clorotritila como esquematicamente representado na Figura 1A. Ácido 2-[2-(2-Fmoc- aminoetoxi)etoxi]acético (Intermediário-1) foi ligado à resina de cloreto de 2- clorotritila na presença de N,N'-di-isopropiletilamina (DIPEA) que gerou ácido 2-[2- (2-Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O intermediário-1 pode ser preparado pelo acoplamento do ácido 2-[2-(2-amino etoxi)-etoxi]acético com éster N- hidroxissuccinimídico de Fmoc. Alternativamente, intermediário-1 está disponível comercialmente e pode ser adquirido como tal. O grupo de proteção Fmoc foi removido pelo desbloqueio seletivo do grupo amino de ácido 2-[2-(2- Fmoc-aminoetoxi)etoxi] acético-Resina 2-Cl-Trt usando piperidina e o grupo amino livre foi então acoplado a ácido 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acético ácido usando 1-hidroxibenztriazol(HOBt) e N,N'-di-isopropilcarbodiimida (DIPC) que gerou ácido 2-[2-[2-[[2-[2-(2-Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acetil] amino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2- Cl-Trt. O grupo Fmoc foi então removido pelo desbloqueio seletivo do grupo amino de ácido 2-[2-[2-[[2-[2-(2-Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acetil] amino]etoxi]etoxi]acético- Resina 2-Cl-Trt usando piperidina e o grupo amino livre foi então acoplado a Fmoc- Glu-OtBu usando HOBt e DIPC para obter ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-Fmoc- amino-5-terc-butoxi-5-oxo-pentanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi] acético-Resina 2-Cl-Trt. O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc- butoxi-5-oxo-pentanoil]amino]etoxi] etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2- Cl-Trt resultante foi desbloqueado seletivamente usando piperidina e então acoplado a mono-terc-butil éster de ácido octadecanodioico para obter um intermediário-2 a saber ácido [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc- butoxi-18-oxo-octadecanoil)amino]-5-oxo-pentanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi] acético]-Resina 2-Cl-Trt. O intermediário 2 foi então clivado da Resina 2-Cl-Trt usando trifluoroetanol:DCM (1:1). O composto resultante reagiu então com N-hidroxissuccinimida (HOSu) na presença de cloroformiato de isobutila (IBCF) e N-metilmorfolina (NMM) seguida por desproteção com ácido trifluoroacético para gerar o composto do título (Fração A-OSu, intermediário-3). O processo inteiro também pode ser representado como esquematicamente representado na Figura 1B.
2. Preparação de éster de N-palmitoil-L-γ-glutamil succinimida (Fração B- OSu)
O Fração Moiety B-OSu
[084]Alfa-terc-butil éster de L-ácido glutâmico (H-Glu-OtBu) reagiu com ácido palmítico na presença de IBCF e NMM para gerar CH3-(CH2)14-C(O)-Glu- OtBu, que reagiu então com HOSu na presença de IBCF e NMM para gerar CH3- (CH2)14-C(O)-Glu(OSu)-OtBu, que foi então desprotegido com ácido trifluoroacético para gerar a fração B-OSu.
3. Preparação de ácido 18-[[(1S)-1-carboxi-4-[4-[2-[2-[2-(2,5- dioxopirirolidin-1-il)oxi-2-oxo-etoxi]etoxi]etilcarbamoilamino]butilamino]-4-oxo- butil]amino]-18-oxo-octadecanoico (Fração C-OSu)
[085]A cadeia lateral do ácido graxo ativado, Fração C-OSu foi preparada usando síntese de fase sólida usando resina de cloreto de 2-clorotritila conforme esquematicamente representado na Figura 2. Ácido 2-[2-(2-Fmoc- aminoetoxi)etoxi]acético foi ligado à resina de cloreto de 2-clorotritila na presença de DIPEA para gerar ácido 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O grupo de proteção Fmoc foi removido pelo desbloqueio seletivo do grupo amino usando piperidina e o grupo amino livre foi então ativado usando p- nitrofenilcloroformiato em THF e DIPEA seguido pela reação com sal de cloridrato butilamina de Fmoc-amino em THF: DMac e DIPEA, que geraram ácido 2-[2-[2-(4- Fmoc-aminobutilcarbamoilamino)etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O grupo Fmoc foi removido por desbloqueio seletivo usando piperidina e o grupo amino livre foi então acoplado a Fmoc-Glu-OtBu usando HOBt e DIPC, que gerou ácido 2-[2-[2- [4-[[(4-S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoxi-5-oxo-pentanoil]amino] butilcarbamoilamino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O ácido 2-[2-[2-[4-[[(4S)-4- Fmoc-amino-5-terc-butoxi-5-oxo-pentanoil]amino]- butilcarbamoilamino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt resultante foi desbloqueado seletivamente usando piperidina e, em seguida, acoplado a mono-terc-butil éster de ácido octadecanodioico para obter o intermediário ácido 2-[2-[2-[4-[[(4S)-5-terc- butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxo-octadecanoil)amino]-5-oxo- pentanoil]amino]butilcarbamoil amino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O intermediário foi então clivado da Resina 2-Cl-Trt usando trifluoroetanol:DCM (1:1) para obter ácido 2-[2-[2-[4-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxo- octadecanoil)amino]-5-oxo-pentanoil] amino]butilcarbamoilamino]etoxi]etoxi]acético (LCMS = m/z: 814,56 (M+H+)). O composto resultante reagiu então com HOSu na presença de diciclohexil carbodiimida (DCC) para gerar intermediário protegido de succinimida, que foi desprotegido com ácido trifluoroacético para gerar o composto do título (Fração C- OSu).
4. Preparação de ácido 18-[[(1S)-1-carboxi-4-[[2-[2-[2-[2-(2,5- dioxopirirolidin-1-il)oxi-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1,1-dimetil-2-oxo-etil]amino]-4- oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico (Fração D-OSu)
[086]A cadeia lateral de ácido graxo foi preparada usando síntese de fase sólida usando resina de cloreto de 2-clorotritila conforme esquematicamente representado na Figura 3. Ácido 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acético foi ligado à resina de cloreto de 2-clorotritila na presença de DIPEA para gerar ácido 2-[2-(2- Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O grupo de proteção Fmoc foi removido pelo desbloqueio seletivo do grupo amino usando piperidina seguido por acoplamento com Fmoc-Aib-OH em THF: DMAc usando DIPC e HOBt que geraram ácido 2-[2-[2-[(2-Fmoc-amino-2-metil-propanoil)amino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2- Cl-Trt. O grupo Fmoc foi removido pelo desbloqueio seletivo usando piperidina e o grupo amino livre foi acoplado a Fmoc-Glu-OtBu usando HOBt e DIPC para gerar ácido 2-[2-[2-[[2-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoxi-5-oxo-pentanoil]amino]-2-metil- propanoil] amino] etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O grupo Fmoc do composto resultante foi desbloqueado seletivamente usando piperidina e o grupo amino livre foi então acoplado a mono-terc-butil éster de ácido octadecanodioico para obter ácido 2-[2-[2-[[2-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxo-octadecanoil)amino]- 5-oxo-pentanoil]amino]-2-metil-propanoil]- amino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl- Trt. O intermediário foi então clivado da Resina 2-Cl-Trt usando trifluoroetanol:DCM (1:1) para obter ácido 2-[2-[2-[[2-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxo- octadecanoil)amino]-5-oxo-pentanoil]amino]-2-metil- propanoil]amino]etoxi]etoxi]acético (LCMS = m/z: 786,39 (M+H+)). O composto resultante reagiu então com HOSu na presença de DCC para gerar intermediário protegido de succinimida, que foi desprotegido com ácido trifluoroacético para gerar o composto do título (Fração D-OSu).
5. Preparação de ácido 18-[[(1S)-1-carboxi-4-[3-[2-[2-[2-(2,5- dioxopirrolidin-1-il)oxi-2-oxo-etoxi]etoxi]etilcarbamoilamino]propilamino]-4-oxo- butil]amino]-18-oxo-octadecanoico (Fração E-OSu)
[087]A cadeia lateral de ácido graxo foi preparada usando síntese de fase sólida usando resina de cloreto de 2-clorotritila conforme esquematicamente representado na Figura 4. Ácido 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acético foi ligado à resina de cloreto de 2-clorotritila na presença de DIPEA para gerar ácido 2-[2-(2- Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O grupo de proteção Fmoc foi removido por desbloqueio seletivo do grupo amino usando piperidina e o grupo amino livre foi então ativado usando-se p-nitrofenilcloroformiato em THF e DIPEA seguido pela reação com 1,3-diaminopropano no THF: DMac na presença de DIPEA usando HOBt para formar ácido NH2-(CH2)3-NH-C(O)-{(2-(2-amino-etoxi)- etoxi}-acético-Resina 2-Cl-Trt. O grupo amino livre foi então acoplado a Fmoc-Glu- OtBu usando HOBt e DIPC, que gerou ácido 2-[2-[2-[3-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc- butoxi-5-oxo-pentanoil]amino] propilcarbamoamino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl- Trt. O ácido 2-[2-[2-[3-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoxi-5-oxo- pentanoil]amino]propilcarbamoilamino]etoxi]-etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt resultante foi desbloqueado seletivamente usando piperidina e, em seguida, acoplado a mono-terc-butil éster de ácido octadecanodioico para gerar ácido 2-[2-
[2-[3-[[(4-S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxo-octadecanoil)amino]-5-oxo- pentanoil]amino]-propil carbamoilamino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O intermediário foi então clivado da Resina 2-Cl-Trt usando trifluoroetanol:DCM (1:1) para obter ácido 2-[2-[2-[3-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxo- octadecanoil)amino]-5-oxo-pentanoil]amino]- propilcarbamoilamino]etoxi]etoxi]acético (LCMS = m/z: 801,41 (M+H+)). O composto resultante reagiu então com a HOSu na presença de diciclohexil carbodiimida (DCC) para gerar intermediário protegido de succinimida, que foi desprotegido com ácido trifluoroacético para gerar o composto do título (Fração E- OSu).
6. Preparação de ácido 18-[[(1S)-1-carboxi-4-[4-[2-[2-[2-(2,5- dioxopirrolidin-1-il)oxi-2-oxo-etoxi]etoxi]etilcarbamoilamino]-1-piperidil]-4-oxo- butil]amino]-18-oxo-octadecanoico (Fração F-OSu)
[088]A cadeia lateral de ácido graxo foi preparada usando síntese de fase sólida usando resina de cloreto de 2-clorotritila conforme esquematicamente representado na Figura 5. Ácido 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoxi)etoxi]acético foi ligado à resina de cloreto de 2-clorotritila na presença de DIPEA para gerar 2-[2-(2-Fmoc- aminoetoxi)etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O grupo de proteção Fmoc foi removido por desbloqueio seletivo do grupo amino usando piperidina e o grupo amino livre foi então ativado usando-se p-nitrofenilcloroformato em THF e DIPEA seguido pela reação com 4-amino-Boc-piperidina em THF: DMAc na presença de DIPEA usando HOBt que gerou ácido (2-[2-[2-(4-Boc-piperidilcarbamoilamino) etoxi]etoxi]acético- Resina 2-Cl-Trt. O composto resultante na clivagem usando o trifluoro acético ácido produziu ácido 2-[2-[2-(4-piperidilcarbamoilamino)etoxi]etoxi]acético que, em reação adicional com Fmoc-OSu na presença de trietilamina (TEA) gerou ácida 2- [2-[2-(4-Fmoc-piperidilcarbamoilamino)etoxi]etoxi]acético. O composto obtido foi então ligado a resina de cloreto de 2-clorotritila na presença de DIPEA para produzir gerar ácido 2-[2-[2-(4-Fmoc-piperidilcarbamoilamino)etoxi]etoxi]acético-Resina 2-
Cl-Trt. O grupo Fmoc foi removido por bloqueio seletivo usando piperidina e o grupo amino livre foi então acoplado a Fmoc-Glu-OtBu usando HOBt e DIPC, que gerou ácido 2-[2-[2-[[1-[(4S)-4-amino-5-terc-butoxi-5-oxo-pentanoil]-4- piperidil]carbamoilamino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O composto resultante foi desbloqueado seletivamente usando piperidina e foi então acoplado a mono- terc-butil éster de ácido octadecanodioico para gerar ácido 2-[2-[2-[[1-[(4S)-5-terc- butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxo-octadecanoil)amino]-5-oxo-pentanoil]-4-piperidil] carbamoilamino]etoxi]etoxi]acético-Resina 2-Cl-Trt. O intermediário foi então clivado da Resina 2-Cl-Trt usando trifluoroetanol:DCM (1:1) para obter ácido 2-[2- [2-[[1-[(4S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxo-octadecanoil)amino]-5-oxo- pentanoil]-4-piperidil]carbamoilamino]etoxi]etoxi]acético (LCMS= m/z: 827,40 (M+H+)). O composto resultante reagiu então com a HOSu na presença de DCC para gerar intermediário protegido de succinimida, que foi desprotegido usando ácido trifluoroacético para gerar o composto do título, Fração F-OSu. Exemplo 2: Síntese do Composto 1:
[089]A cadeia lateral de ácido graxo ativado, Fração A-OSu foi preparada por síntese de fase sólida usando resina de cloreto de 2-clorotritila como esquematicamente representado na Figura 1A. Parte A. Síntese do peptídeo linear de origem Aib8, Arg34, Leu38 GLP-1(7- 38)
[090]O peptídeo de origem foi sintetizado por método de fase sólida. A resina inicial usada para síntese era resina Wang. Leucina protegida por Fmoc foi usada para acoplamento com a resina Wang. O acoplamento foi realizado usando diisopropilcarbodiimida, N-hidroxibenzotriazol (DIC-HOBt) como reagente de acoplamento na presença de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) que gerou a Resina Fmoc-Leu-Wang. O desbloqueio seletivo do grupo amino de resina Fmoc-Leu- Wang usando piperidina seguida por acoplamento com Fmoc-Gly-OH usando HOBt e DIPC gerou a Resina Fmoc-Gly-Leu-Wang. Isso conclui um ciclo. Anidrido acético e di-isopropiletil amina/piridina foram usados para terminar os grupos amino desacoplados em cada acoplamento de aminoácido.
[091]As 2 etapas acima, ou seja, desbloqueio seletivo da proteção Fmoc- do aminoácido ligado à resina e acoplamento do próximo resíduo de aminoácido em sequência com grupo amino protegido por Fmoc foram repetidas para de 30 resíduos de aminoácidos restantes. O desbloqueio seletivo, isto é, a desproteção do grupo Fmoc foi feito usando piperidina e o acoplamento ao próximo aminoácido protegido por Fmoc foi feito usando HOBt/DIPC. A cadeia lateral dos aminoácidos protegidos por Fmoc foi protegida ortogonalmente, por exemplo, grupo hidroxila de Serina, Tirosina ou Treonina foi protegido com o grupo terc-butil(-tBu), grupo amino e guanido de Lisina e Arginina foram protegidos com grupo terc-butiloxicarbonil (- Boc) e 2,2,4,6,7-pentametildi-hidrobenzofuran-5-sulfonil (-Pbf) respectivamente, o imidazol da histidina foi protegido com trítil (–Trt) e grupos de ácido carboxílico de ácido aspártico ou ácido glutâmico foram protegidos com o grupo -tBu. As duas etapas acima mencionadas, isto é, desbloqueio seletivo e depois acoplamento com o próximo aminoácido protegido por Fmoc foram realizadas para obter Fmoc- His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe–Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val- Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)- Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Leu-resina.
[092]Desbloqueio de Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe– Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly- Gln-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)- Gly-Leu-Resina usando piperidina seguido por clivagem e desproteção usando ácido trifluoroacético com etano-1,2-ditiol resultou em H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe– Thr-Ser-Asp-Val-Ser- Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp- Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Leu-OH bruto (peptídeo Aib8, Arg34, Leu38 GLP-1 (7-38)) que foi purificado por HPLC. Parte B:
[093]Enxerto de cadeia de ácido graxo ativada, fração A-OSu sobre H-His- Aib-Glu-Gly-Thr-Phe–Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys- Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Leu-OH purificado (Peptídeo Linear) obtido na Parte A, em acetonitrila em cerca de pH 10 resultou no peptídeo do título bruto que foi purificado por HPLC preparativa. A caracterização dos compostos é fornecida na Tabela 3. Exemplo 3: Preparação do Composto 2, 3, 5, 9, 10 e 12
[094]Os peptídeos lineares dos compostos 2, 3, 5, 9, 10 e 12 foram preparados por método de fase sólida, conforme o processo análogo fornecido para o Exemplo 1, Parte A. Enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração A-OSu seguindo o processo do Exemplo 1, Parte B sobre os respectivos peptídeos lineares gerou o composto 2, 3, 5, 9, 10 e 12. Exemplo 4: Preparação do Composto 4 e 11:
[095]Os peptídeos lineares do Composto 4 e 11 foram preparados por método de fase sólida, conforme o processo análogo dado para o Exemplo 2, Parte A, exceto aqui, a D-Leucina protegida por Fmoc foi primeiro acoplada à resina de Wang e, em seguida, outros aminoácidos sequencialmente foram acoplados. Enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração A-OSu sobre o respectivo peptídeo linear, seguindo o processo do Exemplo 2, Parte B, gerou o Composto 4 e 11. Exemplo 5: Preparação do Composto 8
[096]O peptídeo linear foi preparado por método de fase sólida, conforme o processo análogo dado para o Exemplo 2, Parte A, exceto aqui, a Isoleucina protegida por Fmoc foi primeiramente acoplada à resina de Wang e, em seguida, outros aminoácidos sequencialmente foram acoplados. O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração A-OSu sobre o peptídeo linear, seguindo o processo do Exemplo 2, Parte B gerou o Composto 8. Exemplo 6: Preparação do Composto 6
[097]O peptídeo linear foi preparado por método de fase sólida, conforme o processo análogo dado para o Exemplo 2, Parte A. O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração B-OSu sobre o peptídeo linear seguindo o processo análogo do Exemplo 2, Parte B gerou o Composto 6. Exemplo 7: Preparação do Composto 7
[098]O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração B-OSu sobre o peptídeo linear do Exemplo 2, Parte A, seguindo o processo análogo do Exemplo 2, Parte B gerou o Composto 7. Exemplo 8: Preparação do Composto 13
[099]O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração C-OSu sobre o peptídeo linear do Exemplo 1, Parte A, seguindo o processo análogo do Exemplo 1, Parte B, gerou o Composto 13. Exemplo 9: Preparação do Composto 14
[0100]O peptídeo linear foi preparado por método de fase sólida, conforme o processo análogo dado para o Exemplo 2, Parte A. O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração C-OSu sobre o peptídeo linear seguindo o processo análogo do Exemplo 2, Parte B gerou o Composto 14. Exemplo 10: Preparação do Composto 15
[0101]O peptídeo linear foi preparado por método de fase sólida, conforme o processo análogo dado para o Exemplo 2, Parte A, começando com Isoleucina protegida por Fmoc foi primeiramente acoplado à resina de Wang e, em seguida, outros aminoácidos sequencialmente foram acoplados. O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, fração C-OSu sobre o peptídeo linear seguindo o processo análogo do Exemplo 2, Parte B gerou o Composto 15. Exemplo 11: Preparação do Composto 16
[0102]O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração D-OSu sobre o peptídeo linear do Exemplo 2, Parte A, seguindo o processo análogo do Exemplo 2, Parte B gerou o Composto 16.
Exemplo 12: Preparação do Composto 17
[0103]O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração E-OSu sobre o peptídeo linear do Exemplo 2, Parte A, seguindo o processo análogo do Exemplo 2, Parte B, gerou o Composto 17. Exemplo 13: Preparação do Composto 18
[0104]O enxerto da cadeia de ácido graxo ativado, Fração F-OSu sobre o peptídeo linear do Exemplo 2, Parte A, seguindo o processo análogo do Exemplo 2, Parte B gerou o Composto 18.
[0105]Os dados de caracterização dos compostos sintetizados da presente divulgação são fornecidos abaixo na seguinte Tabela 3. Tabela 3: Dados de caracterização de compostos representativos da presente divulgação Comp. Dados LCMS Pureza de HPLC # 1 m/z = 1057,52 (MH4 4+), Massa 98,32% (Método B2), Calculada = 4226,05 RT=24,85 min. 2 m/z = 1061,74 (MH4 4+), Massa 99,02% (Método B1), Calculada = 4242,93 RT=18,53 min. 3 m/z = 1087,65 (M-4H)-4, Massa 98,12% (Método B1), Calculada = 4354,63 RT=18,48 min. 4 m/z = 1055,68 (M-4H)-4, Massa 98,97% (Método B1), Calculada = 4226,75 RT=18,32 min. 5 m/z = 1057,88 (MH4 4+), Massa 96,75% (Método B1), Calculada = 4227,49 RT=17,09 min. 6 m/z = 967,26 (MH4 4+), Massa 98,68% (Método B3), calculada: 3865,01 RT=44,04 min. 7 m/z= 968,53 (M-4H)-4, Massa 97,39% (Método B3), Calculada = 3878,15 RT=27,79 min. 8 m/z = 1057,72 (MH4 4+), Massa 95,70% (Método B1), Calculada = 4226,85 RT=16,62 min. 9 m/z = 1061,67 (MH4 4+), Massa 95,15% (Método B1), Calculada = 4242,65 RT=16,48 min. 10 m/z = 1058,18 (MH4 4+), Massa 93,66% (Método B1), Calculada = 4228,69 RT=16,13 min. 11 m/z = 1056,95 (MH4 4+), Massa 95,70% (Método B2), Calculada: 4223,77 RT=24,46 min 12 m/z = 1405,12 (MH3 3+), Massa 97,51% (Método B1), Calculada: 4212,34 RT=19,06 min. 13 m/z = 1049,59 (MH4 4+), Massa 96,01% (Método B2),
Calculada = 4194,33 RT=25,16 min. 14 m/z = 1050,13 (MH4 4+), Massa 92,06% (Método B2), Calculada = 4196,49 RT=24,55 min. 15 m/z = 1049,61 (MH4 4+), Massa 94,41% (Método B2), Calculada = 4194,41 RT=24,82 min. 16 m/z = 1042,34 (MH4 4+), Massa 94,56% (Método B2), Calculada = 4165,32 RT=25,26 min. 17 m/z = 1046,18 (MH4 4+), Massa 94,33% (Método B2), Calculada = 4180,72 RT=25,17 min. 18 m/z = 1052,77 (MH4 4+), Massa 93,12% (Método B2), Calculada = 4207,08 RT=24,92 min.
Exemplo 14: Teste de tolerância à glicose oral (OGTT) em ratos; Injeção Única; 1 mg/kg
[0106]Os animais foram divididos em três grupos – um grupo de controle normal, um grupo de teste e um terceiro grupo de semaglutida, com 4 animais em cada grupo. Os animais foram submetidos a jejum por 12 horas antes do início do OGTT. Para os animais do grupo de teste, o Composto 1 foi injetado por via subcutânea em dose de 1 mg/kg. Para o grupo de semaglutida, uma dose de 1 mg/kg foi injetada por via subcutânea. Após 22 horas, 166 horas e 334 horas de injeção subcutânea de droga de teste ou semaglutida, a glicose no sangue foi medida com medidor de glicose no sangue (medições no tempo 0). Todos os animais receberam, então, 2 g/kg de solução de glicose por via oral. A glicose no sangue foi medida em 20, 40, 60, 90 e 120 minutos após o desafio de glicose. O peso corporal e a ingestão de alimentos foram registrados. Os dados de glicose no sangue foram analisados usando ANOVA bidirecional seguido por pós-testes de Bonferroni usando PRISM (Graph Pad versão 5.03). Dados de AUC0-120 min de glicose no sangue foram analisados usando teste t.
[0107]Os polipeptídeos da presente divulgação mostraram um efeito de redução de glicose significativo em comparação com o grupo de controle quando estudados no Teste de Tolerância a Glicose Oral (OGTT) em ratos. Por exemplo, a Figura 6 fornece a alteração no nível de glicose no sangue do tempo 0 a 120 min após 22 horas e 46 horas no grupo de teste ao qual foi administrado o Composto 1 e no grupo de tratamento com semaglutida. 22 horas após a dosagem única, o Composto 1 mostrou redução estatisticamente significativa no nível de glicose no sangue com p<0,001 vs controle normal na ANOVA seguido de pós-testes de Bonferroni.
O efeito de redução de glicose do Composto 1 foi superior ao efeito de redução de glicose observado com semaglutida (ver Figura 6A). A superioridade do efeito de redução da glicose do Composto 1 foi observada mesmo após 46 horas de administração subcutânea (Figura 6B). Além disso, o Composto 1 e a semaglutida mostraram redução estatisticamente significativa na ingestão de alimentos em comparação com o controle quando observados no dia 2, bem como no dia 4 (ver Tabela 4 e 5). A ingestão de alimento reduzida mostrada pelo Composto 1 no dia 4 foi maior do que a semaglutida (ver Tabela 5). Em termos de redução do peso corporal, apenas o composto de teste mostrou redução significativa no peso corporal no dia 4. Tabela 4: Efeito do tratamento na ingestão de alimentos e no peso corporal no Dia 2
Consumo de alimento (g) Peso corporal (g) (dia 0 ao dia 2) (Dia 2)
Média SD Média SD % de Alteração vs Referência
Controle normal 33,0 4,7 480,6 15,6 8,89
Composto 1 2,63*** 2,5 365,6 21,0 -9,33
Semaglutida 5,03*** 3,4 428,1 42,3 -7,65
*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs Controle Normal; ANOVA unidirecional seguido por pós-testes de Bonferroni Tabela 5: Efeito do tratamento na ingestão de alimentos e no peso corporal no Dia 4
Consumo de alimento (g) Peso corporal (g) (dia 0 ao dia 4) (Dia 4) Média SD Média SD % de Alteração vs Referência Controle normal 90,5 5,6 491,3 16,9 2,1 Composto 1 43,25***,## 2,8 436,2* 21,1 -7,5 Semaglutida 55,73*** 4,1 427,2 42,3 -5,3 *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs Controle Normal; ANOVA unidirecional seguido por pós-testes de Bonferroni #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 vs Semaglutida; ANOVA unidirecional seguido por pós-testes de Bonferroni
[0108]Surpreendentemente, descobriu-se que os compostos com X33 como Leu e Ile mostraram redução significativa da glicose no sangue nos estudos determinados, enquanto que os compostos com aminoácidos diferentes de Leu e Ile tiveram significativamente menos efeito na redução da glicose no sangue. O polipeptídeo da presente divulgação mostrou redução significativa na glicose no sangue quando comparado ao grupo de controle. Compostos com aminoácidos diferentes de Leu ou Ile nas posições X33 também foram testados. Por exemplo, Leu na 32ª posição no Composto 1 (SEQ ID NO:05) foi substituída por Lys e Ser para obter os compostos Std-1 e Std-2, respectivamente. Std-1 e Std-2 mostraram apenas cerca de 35 e 15% de redução na AUC de glicose no sangue0-120 min (Tabela 6). Tabela 6: Redução percentual na AUC de glicose no sangue0-120 min no teste de OGTT à dose de 1 mg/Kg após 24 horas.
Comp. # % de Comp. # % de Redução Redução de Semaglutida de Liraglutida Glicose comp/std Glicose Comp/std Std-1 35,1 0,71 6 75,8 1,83 Std-2 14,8 0,30 7 71,9 1,73 Semaglutida 49,3 Liraglutida 41,5
[0109]Da mesma forma, o composto 6 que difere de liraglutida por ter uma Leu adicional na 32ª posição e o composto 7 que difere de liraglutida, por ter o 2º aminoácido Ala substituído por Aib e tendo Leu como um 32º aminoácido adicional, mostrou efeito de redução de glicose no sangue em 24 horas, o que foi significativamente maior do que a liraglutida (Tabela 6).
[0110]Uma vez constatado que o Composto 1 foi significativamente melhor em termos de redução de glicose, ingestão de alimento e redução de peso corporal, experimentos foram realizados para determinar a duração da ação do composto da presente invenção. O efeito dos compostos representativos da presente invenção (Composto 1, 13 e 16) após 166 horas (7 dias) e 334 horas (14 dias) foi estudado e comparado com o da semaglutida. Os compostos foram testados de acordo com o método fornecido abaixo:
[0111]Os animais foram divididos em três grupos – um grupo de controle normal, um grupo de teste e um terceiro grupo de semaglutida, com 4 animais em cada grupo. Os animais foram submetidos a jejum por 12 horas antes do início do OGTT. Aos animais do grupo de teste, o Composto 1, o Composto 13 e o Composto 16 foram injetados por via subcutânea a uma dose de 1 mg/kg. Para o grupo de semaglutida, uma dose de 1 mg/kg foi injetada por via subcutânea. Após 22 horas, 166 horas e 334 horas de injeção subcutânea do composto de teste ou semaglutida, a glicose no sangue foi medida com medidor de glicose no sangue (medições no tempo 0). Todos os animais receberam, então, 2 g/kg de solução de glicose por via oral. A glicose no sangue foi medida em 20, 40, 60, 90 e 120 minutos após o desafio de glicose. O peso corporal e a ingestão de alimentos foram registrados. Os dados de glicose no sangue foram analisados usando ANOVA bidirecional seguido por pós-testes de Bonferroni usando PRISM (Graph Pad versão 5.03). Dados de AUC0- 120 min de glicose no sangue foram analisados usando teste t.
[0112]A Tabela 7 fornece a redução na AUC de glicose no sangue para os compostos representativos da presente invenção (Composto 1, 13 e 16) em comparação com o grupo de controle após 1 dia, 7 dias e 14 dias de administração. Tabela 7: Redução percentual na AUC de glicose no sangue0-120 min em teste de OGTT à dose de 1 mg/Kg. Composto # Tempo AUC de glicose no Alteração na AUC sangue (mg/dL*min) (mg/dL*min) Média Semaglutida 22 horas 5458,0 -63,4 Exp. 1 168 12785,0 -25,5 horas 336 16223,0 -2,4 horas Comp. 1 22 horas 3173,0 -78,7 Exp. 1 168 5941,0 -65,4 horas 336 11920,0 -28,3 horas Comp. 13 22 horas 2795,0 -81,2 Exp. 1 168 6950,0 -59,5 horas 336 11368,0 -31,6 horas Semaglutida 22 horas 4258 -50 Exp. 2 168 7410 -26,6 horas 336 8023,0 -5,5 horas Comp. 16 22 horas 1646 -80,7 Exp. 2 168 4283 -57,6 horas 336 8295,0 -2,3 horas
[0113]Os compostos 1 e 13 foram estudados e comparados com a semaglutida em um experimento (Exp. 1) e o Composto 16 foi estudado e comparado com a semaglutida em um experimento separado (Exp. 2). Após 168 horas da injeção, o Composto 1, 13 e 16 da presente invenção mostraram cerca de
60% de redução na AUC de glicose no sangue quando comparado com o tempo zero do nível de glicose no sangue. Por outro lado, a semaglutida mostrou apenas cerca de 25% de redução no nível de glicose no sangue com relação ao tempo zero no nível de glicose no sangue.
[0114]Observações semelhantes foram feitas na quantidade de alimento consumido e alteração no peso corporal. Conforme pode ser visto na Tabela 8 abaixo, os animais administrados com os compostos representativos (Composto 1, 13 e 16) consumiram significativamente menos alimentos quando comparados aos animais administrados com semaglutida. O composto 16 mostrou redução substancial do peso corporal demonstrando potencial utilidade para o tratamento da obesidade. Tabela 8: Efeito no consumo de alimento e no peso corporal no teste de OGTT à dose de 1 mg/Kg Consumo de Alteração no peso Composto # Tempo alimento (g) corporal (%) Média Média Semaglutida 48 h 17,5 -6,5 Exp. 1 154 h 86,3 4,5 324 h 107,9 11,8 Comp. 1 48 h 8,3 -9,8 Exp. 1 154 h 69,6 5,2 324 h 99,4 9,3 Comp. 13 48 h 8,4 -10,2 Exp. 1 154 h 62,3 4,5 324 h 82,44 8,2 Semaglutida 48 h 19,3 -8,7 Exp. 2 154 h 50,4 0,2 324 h 96,8 3,8 Comp. 16 48 h 5,9 -10,7 Exp. 2 154 h 44,1,0 -7,0
324 h 104,3 -4,3 Exemplo 15: Redução de HbA1c em camundongos db/db diabéticos tipo 2 após tratamento crônico
[0115]Este estudo foi feito em modelo de camundongo diabético. Os animais foram divididos em três grupos de tratamento - um grupo de controle diabético, um grupo de teste e um grupo de tratamento com semaglutida. O composto 1 da presente divulgação foi injetado por via subcutânea a uma dose de 0,3 mg/kg uma vez ao dia por 3 dias (qd*3) seguido de dose de 0,1 mg/kg em dias alternados por 7 doses (q2d*7) seguido de dose de 0,1 mg/kg uma vez a cada quatro dias para dois ciclos de dose (q4d*2). O mesmo regime de dosagem foi administrado no grupo de tratamento com semaglutida. As medições dos níveis de glicose no sangue e do peso corporal foram feitas diariamente. %HbA1c foi medida no Dia 0, dia 7, dia 14 e dia 27 por cromatografia em coluna. A ingestão cumulativa de alimentos foi calculada no dia 27. Os dados de %HbA1C foram analisados por ANOVA bidirecional seguido pelos pós-teste de Bonferroni usando PRISM (Graph Pad versão 5.03).
[0116]Os animais do grupo de teste administrados com o Composto 1 mostraram redução estatisticamente significativa nos níveis de glicose no sangue em comparação com o grupo de controle diabético (ver Figura 7), e o efeito foi superior ao grupo de tratamento com semaglutida na última fase do estudo. Os animais do grupo de teste administrados com o Composto 1 mostraram redução significativa na ingestão de alimentos, como pode ser visto nos resultados fornecidos na Figura 8. A Figura 8 fornece ingestão de alimento cumulativa do 0 ao 27o dia por camundongos de controle e db/db tratados com o composto de teste. Tanto o composto de teste quanto a semaglutida mostraram uma redução estatisticamente significativa na ingestão de alimentos em comparação com o grupo de controle diabético. Além disso, o composto de teste mostrou uma ingestão de alimento significativamente menor, em comparação com a semaglutida. No mesmo estudo, o Composto 1 também mostrou redução significativa no peso corporal quando comparado ao grupo de controle diabético. A Figura 9 fornece o resultado da % de alteração no peso corporal para o grupo de controle e teste do dia 0 ao dia 27. O composto de teste 1 mostrou uma redução significativa de -16% em comparação com -8% conforme observado no grupo de tratamento com semaglutida (ver Figura 09).
[0117]Em diabetes mellitus, quantidades mais elevadas de HbA1c, indicando controle mais pobre dos níveis de glicose no sangue, foram associadas com doenças cardiovasculares, nefropatia, neuropatia e retinopatia. Em um estudo de 27 dias, o Composto 1 mostrou redução estatisticamente significativa no nível de HbA1c em camundongos db/db diabéticos tipo 2 após tratamento crônico. A Tabela 9 abaixo e Figura 10 fornecem o nível de HbA1c nos dias 0 e 27 no grupo de controle Diabético e grupo após tratamento crônico com o Composto 1. O efeito foi estatisticamente significativo mesmo quando comparado à semaglutida. Tabela 9: Efeito do tratamento em % de níveis de HbA1c em camundongos db/db Ponto % de HbA1c no Controle Composto 1 Semaglutida tempo Diabético (DC) (dias) % de % de Média SD n Média SD n Alteração Média SD n Alteração vs DC vs DC 0 4,70 0,52 6 4,87 0,59 6 - 5,05 0,35 5 - 27 7,30 1,17 6 3,73***## 0,86 6 -3,57 5,03*** 0,69 5 -2,26 *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs Controle Diabético; ANOVA bidirecional seguido por pós-teste de Bonferroni #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 vs Semaglutida; ANOVA unidirecional seguido por pós-testes de Bonferroni
[0118]Em um estudo separado, os compostos de teste 1, 13 e 16 foram estudados e comparados com a semaglutida por seu efeito sobre HbA1c e nível de insulina e consumo de alimento cumulativo, alteração no peso corporal e AUC de glicose no sangue. O estudo foi realizado de maneira semelhante como acima em modelo de camundongo diabético. Os animais foram divididos em três grupos de tratamento - um grupo de controle diabético, um grupo de teste e um grupo de tratamento com semaglutida. Os compostos representativos da presente divulgação, o Composto 1, o Composto 13 e o Composto 16, foram injetados por via subcutânea em doses de 3,04 ou 6,078 nM (em dias alternados até o dia 28 (q2d*15). O mesmo regime de dosagem foi administrado no grupo de tratamento com semaglutida. As medições dos níveis de glicose no sangue e do peso corporal foram feitas diariamente. % HbA1c, a insulina foi medida no Dia 0, dia 14 e dia 29. A ingestão cumulativa de alimentos e a alteração no peso corporal foram calculadas nos dias 14 e 29. %HbA1c, os dados de insulina foram analisados por ANOVA bidirecional seguido pelos pós-testes de Bonferroni usando PRISM (Graph Pad versão 5.03). Enquanto que a AUC de glicose no sangue, a alteração do peso corporal e os dados de ingestão de alimentos cumulativos foram analisados por ANOVA unidirecional seguido pelos pós-testes de Bonferroni usando PRISM (Graph Pad versão 5.03). Do dia 29 ao dia 45, os animais foram mantidos no período de recuperação durante o qual nenhum tratamento com droga foi administrado. A glicose no sangue e o peso corporal foram medidos durante esse período. No dia 45, alterações no peso corporal, %HbA1c, insulina foram medidas.
[0119]Os resultados são fornecidos nas Tabelas 10, 11 e 12 abaixo. Tabela 10: HbA1C (%): Composto 1 (6,078 nM), Composto 13 (3,04 & 6,078 nM), Composto 16 (3,04 & 6,078 nM); (q2d*15) (n=7)
Pon % HbA1C to Control Compo Compo Compost Compost Compost Semaglut no e sto 1, sto 13, o 13, o 16, o 16, ida, tem diabétic 6,078n 3,04nM, 6,078nM 3,04nM, 6,078nM 12,15 po o M, q2d*15 , q2d*15 q2d*15 , q2d*15 nM, (dia (DC) q2d*15 q2d*15 s) Mé S Mé S Mé S Mé S Mé S Mé S Mé
SD dia D dia D dia D dia D dia D dia D dia 1, 0, 1, 7,8 0, 7,7 1, 7,8 0, 7,6 1,1 0 7,7 7,8 7,7 2 8 5 3 76 4 27 3 99 6 3 6,0 5,6 5,6 1, 6,4 0, 0, 0, 0, 0, 7,0 1,1 14 8,0 6,6* 0 7 4 0 ** 5 9 53 68 49 4 5 *** ***# ***# 5,6 5,3 5,1 6,4 1, 6,2 0, 6,4 0, 0, 0, 0, 1,0 29 8,3 4 3 6 7 0 *** 5 *** 8 51 39 24 3 *** ***# ***# *** *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001 vs. Controle Diabético, #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 vs Semaglutida; ANOVA unidirecional seguido por pós- testes de Bonferroni Tabela 11: Insulina (ng/mL): Composto 1 (6,078 nM), Composto 13 (3,04 &6,078 nM), Composto 16 (3,04 & 6,078 nM); (q2d*15) (n=7) Insulina (ng/mL) Composto Composto Composto Composto Composto Ponto Sema, Controle 1, 13, 13, 16, 16, no 12,15 nM, diabético 6,078nM, 3,04nM, 6,078nM, 3,04nM, 6,078nM, tempo q2d*15 q2d*15 q2d*15 q2d*15 q2d*15 q2d*15 (dias) Médi Médi Médi Médi Médi SD Média SD SD Média SD SD SD SD a a a a a 0 17,6 5,5 18,0 5,8 21,7 12,1 26,2 14,0 13,9 6,6 21,8 9,6 18,7 10,3 10, 61,2** 50,8 58,1* 14 23,0 58,1** 31,6 41,8 28,2 23,7 27,7 12,5 37,5 26,5 7 * * *
54,4 59,4** 53,8 68,2* 48,1 29 16,9 6,6 54,7** 6,4 27,0 22,4 23,5 27,1 25,3 ** * ** ** ** *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001 vs Controle Diabético, #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 vs Semaglutida; ANOVA unidirecional seguido por pós- testes de Bonferroni Tabela 12: Consumo cumulativo de alimentos, AUC de glicose no sangue (mg/dL*dias) e alterações no peso corporal: Composto 1 (6,078 nM), Composto 13 (3,04 & 6,078 nM), Composto 16 (3,04 & 6,078nM); (q2d*15) AUC de glicose no sangue Alteração do Ingestão (Dia 0-29) (mg/dL*dias) peso corporal Dia cumulativa de 29, alimentos (g) % de alteração x Grupos (n=7) Dia 0-29 Dia 0 % Média SD Média SD Alteração Média SD vs controle Controle diabético 99,3 37,16 16948,1 281,48 9,4 6,4 Composto 1, 79,8 25,09 9194,6*** 450,84 -0,3 2,2 6,078 nM -45,75 Composto 13, 75,2 18,45 9515,4*** 805,21 1,2 3,8 3,04 nM -43,86 Composto 13, 70,4 10,85 8451,7***## 612,94 -1,1 2,4 6,078 nM -50,13 Composto 16, 77,4 23,82 9399,0*** 680,38 -1,4 5,4 3,04 nM -44,54 Composto 16, 66,7 29,48 8086,1***## 623,80 -5,5 3,1 6,078 nM -52,29 Semaglutida, 92,0 6,64 9867,9*** 832,73 0,7 3,9 12,155 nM -41,78 *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001 vs Controle Diabético, #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 vs Semaglutida; ANOVA unidirecional seguido por pós- testes de Bonferroni
[0120]Os compostos representativos da presente divulgação (Composto 1, 13 e 16) a cerca de 3 nM e 6 nM de dose mostraram redução significativa em HbA1c, glicose no sangue, consumo de alimento e peso corporal quando comparados ao controle (Tabela 12). A redução foi comparável àquela mostrada por semaglutida a cerca de 12 nM de dose.
Além disso, o efeito foi visto mesmo após 29 dias (Tabelas 13 e 14), o que demonstra o potencial dos compostos da presente invenção para desenvolver drogas de longa ação que não exigem administração frequente e, portanto, acrescentam à conformidade do paciente.
Tabela 13: Estudo de recuperação - AUC de glicose no sangue (mg/dL*dias) % AUC de glicose no % AUC de glicose no Alteraçã sangue (Dia 38-45) Alteração sangue (Dia 30-37) Grupos (n=3) o vs (mg/dL*dias) vs Controle (mg/dL*dias) Controle Média SD Média SD Controle diabético 3591,7 47,04 3601,7 38,66 Composto 1, 6,078 2787,3* 17,67 3335,7 66,11 nM -22,39 -7,39 Composto 13, 3,04 2588,7** 411,97 3401,0 61,00 nM -27,93 -5,57 Composto 13, 2875,7 436,87 3361,0 205,83 6,078 nM -19,94 -6,68 Composto 16, 3,04 2420,0** 89,71 3284,0* 81,66 nM -32,62 -8,82 Composto 16, 2167,7*** 210,19 3134,7** 103,39 6,078 nM -39,65 -12,97 Semaglutida, 3032,0 182,40 3415,7 88,82 12,155 nM -15,58 -5,16
*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs Controle Diabético e #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 vs Semaglutida; ANOVA unidirecional seguido por pós-testes de Bonferroni Tabela 14: Estudo de recuperação-%HbA1C e Insulina (ng/mL) % HbA1C Delta Insulina (ng/mL) % Alteração Peso Grupos (n=3) HbA1C corporal vs Dia 45 Média SD vs.
DC Média SD Média SD Controle diabético 8,5 0,4 20,6 12,0 7,8 1,08 Composto 1, 6,078 30,9 8,9 3,68 nM 7,6 0,5 -0,9 5,9 Composto 13, 3,04 31,2 32,7 0,86 nM 7,5 0,4 -1,0 6,6 Composto 13, 34,3 12,4 2,19 6,0788 nM 7,3 0,4 -1,2 5,5 Composto 16, 3,04 15,5 8,2 0,38 nM 7,1* 0,2 -1,4 6,1 Composto 16, 7,2* 0,5 -1,3 18,4 18,7 5,7 0,36
6,078 nM Semaglutida, 19,7 4,2 4,68 12,155 nM 7,8 0,3 -0,7 9,5 *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs Controle Diabético e #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 vs Semaglutida; ANOVA unidirecional seguido por pós-testes de Bonferroni
[0121]Estes resultados demonstram que o composto da presente invenção pode encontrar uso potencial para o tratamento de diabetes e obesidade.
Claims (10)
1.Polipeptídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos: H-X2-X3-X4-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-X16-G-Q-A-A-X21-E-F-X24-A-W-L- V-R-G-R-G-X33-X34 em que X2 é Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ou Aib, ; X3 está ausente ou é Gln; X4 é Glu; X16 é Glu; X24 é Ile; X33 é Leu, -D-Leu, D-Ile ou Ile; X34 está ausente e X21 é Lys em que o grupo amino de cadeia lateral (Ɛ amino) de Lys é acilado com uma fração: em que Q e T estão ausentes; U está ausente ou é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} em que } é o ponto de ligação com o grupo W; W está ausente ou é selecionado de um grupo consistindo em –C(O)-CH2- O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], –C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], –C(O)-C(CH3)2-NH-] e C(O) NH N ] em que ] é o ponto de ligação com o grupo Y; Y é–C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-- e -- é um ponto de ligação com o grupo Z; Z é –C(O)-(CH2)n-COOH ou –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é um número inteiro de 14 a 20.
2.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X2 é Aib; X3 está ausente;
X33 é Leu; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-] e Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
3.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X2 é Aib; X3 está ausente; X33 é Leu; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W é –C(O)-C(CH3)2-NH-] e Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
4.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X2 é Aib; X3 está ausente; X33 é Leu; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W é –C(O)-NH-(CH2)4-NH-] e Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
5.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X2 é Aib; X3 está ausente; X33 é Leu; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; Wé C(O) NH N ] e Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
6.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X2 é Aib;
X3 está ausente; X33 é Leu; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W é –C(O)–NH-(CH2)3-NH-] e Z é –C(O)-(CH2)n-COOH em que n é o número inteiro 16.
7.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X2 é Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe); X3 está ausente; X33 é Leu; U é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W é –C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], –C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], –C(O)- C(CH3)2-NH-] e Z é –C(O)-(CH2)n-COOH ou –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é um número inteiro de 14 a 20.
8.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que W é selecionado de um grupo consistindo em –C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], –C(O)-C(CH3)2-NH-] e C(O) NH N ]
9.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X2 é Ala; X3 está ausente; X33 é Leu; W está ausente; Z é –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é o número inteiro 14.
10.Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X2 é Aib; X3 está ausente; X33 é Leu;
W está ausente; Z é –C(O)-(CH2)n-CH3 em que n é o número inteiro 14.
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