RS60416B1 - Lečenje imunoloških i zapaljenskih bolesti - Google Patents

Description

Opis

1. OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovde je obezbeđen 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion za upotrebu u postupcima za lečenje, prevenciju i praćenje imunoloških bolesti ili zapaljenskih bolesti. Farmaceutske kompozicije i režimi doziranja za upotrebu u takvom lečenju, prevenciji i/ili upravljanju tokom lečenja, takođe su ovde opisani.

2. OSNOV PRONALASKA

[0002] Zapaljenske i imunološke bolesti modulisane limfocitnom aktivnošću, uključujući aktivnost B ćelija i/ili T ćelija, kao što su lupus, skleroderma, lupus pernio, sarkoidoza, Sjegrenov sindrom, ANCA pozitivan vaskulitis, anti-fosfolipidni sindrom i mijastenija gravis, i dalje su značajni medicinski problemi.

[0003] Lupus ili eritemski lupus je skup autoimunskih poremećaja koji mogu da izazovu hronično zapaljenje u različitim delovima tela, naročito u koži, zglobovima, krvi i bubrezima. Imunski sistem tela normalno pravi proteine pod nazivom antitela kako bi se telo zaštitilo od virusa, bakterija i drugih stranih materijala (tj., antigena). U autoimunskom poremećaju kao što je lupus, imunski sistem gubi svoju sposobnost da napravi razliku između antigena i sopstvenih ćelije i tkiva i može da pravi antitela usmerena protiv sopstvenih ćelija i tkiva kako bi se obrazovali imunski kompleksi. Ovi imunski kompleksi mogu da se nagomilavaju u tkivima i da dovode do zapaljenja, povrede tkiva i/ili bola. Tri najčešće vrste lupusa uključuju sistemski eritemski lupus (SLE), kožni eritemski lupus (CLE) i lekovima izazvan lupus. Detaljniji opisi lupusa ili eritemskog lupusa mogu da se nađu u publikaciji Wallace, 2000, The Lupus Book: A Guide for Patients and Their Families, Oxford University Press, Revised and Expanded Edition.

[0004] Skleroderma je retka bolest sa stabilnom incidencom od približno 19 slučajeva na 1 milion osoba. Tačan uzrok skleroderme nije poznat. Poremećaji uključuju autoimunost i izmene funkcije endotelskih ćelija i fibroblasta. Sistemska skleroderma obično otpočinje zadebljavanjem kože, obično prstiju, praćeno Rejnoovim fenomenom. Rejnoova bolest uobičajeno prethodi daljim manifestacijama sistemske skleroderme. Rano tokom bolesti, pogođena koža može da bude podbula i meka. Uobičajeno mesto najvećeg zadebljavanja i otvrdnjavanja kože su lice, šake i prsti. Često je prisutna sklerodaktilija. Trenje tetivnih ivica često može da se napipa prilikom pregleda i može da bude bolno. Kada bolest uznapreduje, mogu da se jave digitalni ulkusi i autoamputacija. Poremećaj gastrointestinalne pokretljivosti je svojstvo koje se često ispoljava kao gorušica ili kao dijareja sa smanjenom apsopcijom ili pseudoopstrukcijom. Novootkrivena hipertenzija ili bubrežna insuficijencija predstavljaju ispoljavanja povezanog vaskularnog oštećenja. Srčana insuficijencija ili aritmija su takođe moguće usled srčane fibroze. (Hachulla E, Launay D, Diagnosis and classification of systemic sclerosis, Clin Rev Allergy Immunol 2010; 40(2):78-83).

[0005] Glavne manifestacije skleroderme i naročito sistemske skleroze su neodgovarajuća preterana sinteza i deponovanje kolagena, poremećena funkcija endotela, spazam, kolaps ili opstrukcija usled fibroze. Što se tiče dijagnoze, važan klinički parametar je zadebljavanje kože u blizini metakarpofalangealnih zglobova. Rejnoov fenomen je česta, skoro univerzalna komponenta skleroderme. Dijagnoza se postavlja na osnovu promena boje kože pri izlaganju hladnoći. Ishemija i zadebljavanje kože su simptomi Rejnoove bolesti.

[0006] Sarkoidoza je bolest koju odlikuje obrazovanje granuloma, koje pospešuju limfociti i makrofagi, što se obično klasifikuje kao odgovor pomoćničkih T ćelija tipa 1. Smatra se da je prekomerna proizvodnja tumorskog faktora nekroze (TNF)-α, IL-8 i IL-18 faktor koji doprinosi postojećem zapaljenju pluća. Lupus pernio je hronično ispoljavanje u vidu deformacije kože koje se primarno javlja na licu. Za sarkoidozu i sa njom povezani lupus pernio postoje ograničene mogućnosti lečenja kao što su kortikosteroidi koji obezbeđuju samo umereno poboljšanje (Baughman RP, Judson MA, Teirstein AS, Moller DR, Lower EE. Thalidomide for chronic sarcoidosis. Chest. 2002 Jul; 122(1):227-32).

[0007] Khanna, Expert review of Dermatology, vol.6, no.3, strane 287-302, opisuje dijagnozu i lečenje sistemske i lokalizovane skleroderme. WO 2011/100380 prikazuje derivate 4’-arilmetoksi izoindolina za lečenje kožnih bolesti, plućnih poremećaja i poremećaja u vezi sa TNF-α.

[0008] Potreba za profilaktičkim i terapijskim lekovima koji mogu da se koriste za lečenje ili prevenciju imunskih i inflamatornih bolesti, uključujući lupus, sklerodermu, lupus pernio, sarkoidozu, Sjegrenov sindrom, ANCA pozitivan vaskulitis, anti-fosfolipidni sindrom i mijasteniju gravis, i dalje postoji.

3. KRATAK OPIS PRONALASKA

[0009] Ovde je obezbeđeno jedinjenje za upotrebu u postupku za lečenje prevenciju ili upravljanje tokom lečenja imunske ili zapaljenske bolesti, pri čemu postupak sadrži primenu efikasne količine navedenog jedinjenja kod pacijenta kome je to potrebno, i pri čemu jedinjenje predstavlja jedinjenje formule I

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemsku smešu, i pri čemu je bolest lupus, skleroderma, lupus pernio, sarkoidoza, Sjegrenov sindrom, ANCA pozitivan vaskulitis, anti-fosfolipidni sindrom ili mijastenija gravis.

[0010] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion.

[0011] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je farmaceutski prihvatljiva so 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-diona.

[0012] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion hidrohlorid.

[0013] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion, koji ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat ili tautomer.

[0014] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion.

[0015] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je farmaceutski prihvatljiva so (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-diona.

[0016] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion hidrohlorid.

[0017] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion, koji ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat ili tautomer.

[0018] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion.

[0019] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je farmaceutski prihvatljiva so (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-diona.

[0020] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion hidrohlorid.

[0021] U nekim primerima izvođenja, bolest je odabrana od lupusa, skleroderme, Sjegrenovog sindroma, ANCA pozitivnog vaskulitisa, anti-fosfolipidnog sindroma i mijastenije gravis.

[0022] Ovde su takođe opisani postupci za modulisanje, npr., smanjenje, leukocitne aktivnosti, uključujući aktivnost B ćelija i/ili T ćelija, monocita, makrofaga, i drugih limfoidnih ili mijeloidnih tipova ćelija, koji sadrže ostvarivanje kontakta između B ćelije i/ili T ćelije, sa efikasnom količinom jedinjenje I.

[0023] Ovde su takođe opisane farmaceutske kompozicije, pojedinačni oblici doze i kitovi pogodni za upotrebu u lečenju, prevenciji, poboljšanju i/ili praćenju bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanih imunskih i inflamatornih bolesti, koji sadrže jedinjenje I, po izboru u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava.

[0024] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje I se primenjuje u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava, tj., farmaceutskih sredstava koja predstavljaju modulatore leukocitne aktivnost, uključujući aktivnost B ćelija i/ili T ćelija, monocita, makrofaga i drugih limfoidnih ili mijeloidnih tipova ćelija. Kombinacije obuhvataju istovremenu kao i sekvencijalnu primenu.

4. KRATAK OPIS CRTEŽA

[0025]

SL. 1 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na diferencijaciju plazmablasta i aktiviranih B ćelija.

SL. 2 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na vijabilnost ćelija tokom diferencijacije plazmablasta.

SL. 3 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na ekspresiju transkripcionih faktora B i plazma ćelija.

SL. 4 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju IgG u kulturama plazmablasta.

SL. 5A i 5B prikazuju efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na ekspresiju transkripcionih faktora B i plazma ćelija. SL. 6 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju IgG u kulturama B ćelija na dane 4, 7 i 10.

SL. 7 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, samog i u kombinaciji sa prednizolonom, na proizvodnju IgG od strane plazmablasta/plazma ćelija diferenciranih in vitro.

SL. 8 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na ekspresiju CD20/CD38 tokom diferencijacije B ćelija, na dan 7. SL. 9 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na vijabilnost ćelija tokom diferencijacije plazmablasta.

SL. 10 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na diferencijaciju i funkcionisanje B ćelija na PBMC ćelijama SLE pacijent in vitro.

SL.11A i 11B prikazuju efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju IgG i IgM, redom, u kulturama B ćelija na dan 7.

SL. 12 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na diferencijaciju CD19+ B ćelija u plazmablaste/plazma ćelije.

SL. 13 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na veliku populaciju ćelija (gejt p2) u testu diferencijacije normalnih B ćelija.

SL. 14 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na transkripcione faktore plazma ćelija u kulturi B ćelija tokom diferencijacije.

SL. 15A-15E prikazuju efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona (20 nM) na ekspresiju transkripcionih faktora plazma ćelija u kulturi B ćelija na dan 7.

SL. 16 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na ekspresiju transcripcionih faktora u CD38+ plazmablastima/plazma ćelijama iz PBMC ćelija SLE pacijenta tokom diferencijacije.

SL. 17 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona (predstavljen kao jedinjenje I na slici) na CD44 MFI na dan 7 u kulturi B ćelija tokom diferencijacije.

SL. 18 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na CD20hi/CD44hi ćelije na dan 7 u testu diferencijacije normalnih B ćelija.

SL. 19 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona (predstavljen kao jedinjenje I na slici) na CD83+ ćelije i ekspresiju na dan 4 i dan 7 u kulturi B ćelija tokom diferencijacije.

SL. 20 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-dion (predstavljen kao jedinjenje I na slici) na ekspresiju Ig J lanca u kulturi B ćelija tokom diferencijacije.

SL. 21 ilustruje efekat 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju nekih citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen u vidu apsolutne proizvedene količine.

SL. 22 ilustruje efekat 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju nekih citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen kao procenat kontrole.

SL. 23 ilustruje efekat (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju nekih citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen u vidu apsolutne proizvedene količine.

SL. 24 ilustruje efekat (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju nekih citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen kao procenat kontrole.

SL. 25 ilustruje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju nekih citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen u vidu apsolutne proizvedene količine.

SL. 26 ilustruje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju nekih citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen kao procenat kontrole.

SL. 27 ilustruje inhibiciju proizvodnje nekih citokina i hemokina u mononuklearnim ćelijama periferne krvi, koje su stimulisane lipopolisaharidima, pomoću 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 28 ilustruje pojačanje proizvodnje nekih citokina i hemokina u mononuklearnim ćelijama periferne krvi, koje su stimulisane lipopolisaharidima, pomoću 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 29 ilustruje inhibiciju proizvodnje nekih citokina i hemokina u mononuklearnim ćelijama periferne krvi, koje su stimulisane lipopolisaharidima, pomoću (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 30 ilustruje pojačanje proizvodnje nekih citokina i hemokina u mononuklearnim ćelijama periferne krvi, koje su stimulisane lipopolisaharidima, pomoću (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 31 ilustruje inhibiciju proizvodnje nekih citokina i hemokina u mononuklearnim ćelijama periferne krvi, koje su stimulisane lipopolisaharidima, pomoću (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 32 ilustruje pojačanje proizvodnje nekih citokina i hemokina u mononuklearnim ćelijama periferne krvi, koje su stimulisane lipopolisaharidima, pomoću (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 33 ilustruje pojačanje proizvodnje IFN-gama u NK ćelijama pomoću 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, kao odgovor na imobilisani IgG i IL-2, izraženo u vidu apsolutne proizvedene količine.

SL. 34 ilustruje pojačanje proizvodnje IFN-gama u NK ćelijama pomoću (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, kao odgovor na imobilisani IgG i IL-2, izraženo u vidu apsolutne proizvedene količine.

SL. 35 ilustruje pojačanje proizvodnje IFN-gama u NK ćelijama pomoću (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, kao odgovor na imobilisani IgG i IL-2, izraženo u vidu apsolutne proizvedene količine.

SL. 36 ilustruje pojačanje proizvodnje IFN-gama u NK ćelijama pomoću 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, kao odgovor na imobilisani IgG i IL-2, izraženo u vidu procenta količine IFN-gama koji se proizvodi u prisustvu 1 µm pomalidomida.

SL. 37 ilustruje pojačanje proizvodnje IFN-gama u NK ćelijama pomoću (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, kao odgovor na imobilisani IgG i IL-2, izraženo u vidu procenta količine IFN-gama koji se proizvodi u prisustvu 1 µm pomalidomida.

SL. 38 ilustruje pojačanje proizvodnje IFN-gama u NK ćelijama pomoću (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, kao odgovor na imobilisani IgG i IL-2, izraženo u vidu procenta količine IFN-gama koji se proizvodi u prisustvu 1 µm pomalidomida.

SL. 39 prikazuje efekat ovde obezbeđenih jedinjenja na proliferaciju humanih vaskularnih endotelnih ćelija pupčane vrpce, indukovanih faktorom rasta.

SL. 40 prikazuje efekat ovde obezbeđenih jedinjenja na obrazovanje cevi kod humanih vaskularnih endotelnih ćelija pupčane vrpce, indukovanih faktorom rasta.

SL. 41 prikazuje efekat ovde obezbeđenih jedinjenja na invaziju humanih vaskularnih endotelnih ćelija pupčane vrpce, indukovanih faktorom rasta.

SL. 42 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na dermalnu debljinu kožne lezije kod mišijeg modela dermalne fibroze indukovane bleomicinom (prevencija fibroze).

SL. 43 prikazuje fotomikrografije preseka kože obojenih hematoksilinom i eozinom koji pokazuju dermalnu debljinu kožne lezije kod mišijeg modela dermalne fibroze indukovane bleomicinom (prevencija fibroze do koje dolazi usled zapaljenja).

SL. 44 prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na brojeve alfa-SMA miofibroblasta u kožnoj leziji kod mišijeg modela dermalne fibroze indukovane bleomicinom (prevencija fibroze do koje dolazi usled zapaljenja)

SL. 45 prikazuje efekat testiranog jedinjenja na dermalnu debljinu kožne lezije kod mišijeg modela dermalne fibroze indukovane bleomicinom (regresija ustanovljene fibroze).

SL. 46 prikazuje fotomikrografije preseka kože obojenih hematoksilinom i eozinom koji pokazuju dermalnu debljinu kožne lezije kod mišijeg modela dermalne fibroze indukovane bleomicinom (regresija ustanovljene fibroze).

SL. 47 prikazuje smanjenje brojeve alfa-SMA miofibroblasta u kožnoj leziji kod mišijeg modela dermalne fibroze indukovane bleomicinom (regresija ustanovljene fibroze).

SL. 48A prikazuje smanjenje dermalne debljine delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona kod TSK-1 miševa. SL. 48B prikazuje smanjenje relativnih sadržaja hidroksiprolina delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona kod TSK-1 miševa.

SL. 49A prikazuje modulaciju CTGF delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 49B prikazuje modulaciju PAI-1 delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 49C prikazuje modulaciju COL1A delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 49D prikazuje modulaciju aSMA delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 49E prikazuje modulaciju CCMP delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 49F prikazuje modulaciju TGFB1 delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 50 prikazuje modulaciju COL1, aSMA i FN delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 51 prikazuje modulaciju MMP1 i PAI delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 52 prikazuje modulaciju Dnmt1 delovanjem (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona.

SL. 53 prikazuje nivo ekspresije mRNK cereblona u normalnim i SSc fibroblastima.

SL. 54 prikazuje nivo ekspresije mRNK cereblona u normalnim i SSc kožnim tkivima.

5. DETALJAN OPIS

[0026] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto ono značenje koje za njih podrazumeva stručnjak u oblasti. U slučaju da za izraz koji se ovde koristi postoji veći broj definicija, definicije iz ovog odeljka će imati prednost, osim ako nije drugačije navedeno.

[0027] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, izrazi “lečiti”, “lečenje” i "tretman" odnose se na ublažavanje ili smanjenje ozbiljnosti bolesti ili simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem koje se leči.

[0028] Kako se ovde koristi, “prevenirati”, “prevencija” i drugi oblici ove reči uključuju inhibiciju nastupanja ili napredovanja bolesti ili poremećaja ili simptoma konkretne bolesti ili poremećaja. U nekim primerima izvođenja, subjekti sa porodičnom istorijom kancera predstavljaju kandidate za režime prevencije. Uopšteno, u kontekstu kancera, izraz “preveniranje” odnosi se na primenu leka pre nastupanje znakova ili simptoma kancera, naročito kod subekata kod kojih postoji rizik od dobijanja kancera.

[0029] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, izraz “praćenje” obuhvata prevenciju ponovne pojave određene bolesti ili poremećaja kod subjekta koji je od njega patio,

1

produžavanje vremena koje subjekt koji je patio od bolesti ili poremećaja ostaje u remisiji, smanjenje stope mortaliteta subjekata, i/ili održavanje smanjenja ozbiljnosti ili izbegavanje simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem koje se prati.

[0030] Kako se ovde koristi, “subjekat” označava životinju, tipično sisara, uključujući ljudsko biće. Kako se ovde koristi, “pacijent” označava ljudski subjekat.

[0031] Kako se ovde koriste, i osim ako nije drugačije naznačeno, izrazi “terapeutski efikasna količina” i “efikasna količina” jedinjenja odnose se na količinu dovoljnu da obezbedi terapeutsku korist u lečenju, prevenciji i/ili praćenju bolesti, da odloži ili u najvećoj meri smanji jedan ili više simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem koji se leči. Izrazi “terapeutski efikasna količina” i “efikasna količina” mogu da obuhvataju količinu koja u celini poboljšava terapiju, smanjuje ili sprečava pojavu simptoma ili uzroka bolesti ili poremećaja ili poboljšava terapeutsku efikasnost drugog terapeutskog sredstva.

[0032] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, izraz “profilaktički efikasna količina” jedinjenja označava količinu dovoljnu da spreči bolest ili stanje, ili jedan ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem, ili da spreči njeno ponovno javljanje. Profilaktički efikasna količina jedinjenja označava količinu terapeutskog sredstva, samog ili u kombinaciji sa drugim sredstvima, koja obezbeđuje profilaktičku korist u prevenciji i lečenju bolesti. Izraz “profilaktički efikasna količina” može da obuhvata količinu koja poboljšava ukupnu profilaksu ili pojačava profilaktičku efikasnost drugog profilaktičkog sredstva.

[0033] Kako se ovde koristi i osim ako nije drugačije naznačeno, izraz “farmaceutski prihvatljiva so” uključuje, ali nije ograničen na, so kisele grupe koja može da bude prisutna u ovde obezbeđenim jedinjenjima. Pod izvesnim kiselim uslovima, jedinjenje može da obrazuje niz različitih soli sa različitim neorganskim i organskim kiselinama. Kiseline koje mogu da se koriste za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli ovih baznih jedinjenja su one koje obrazuju soli koje sadrže farmakološki prihvatljive anjone uključujući, ali ne i ograničeno na, acetat, benzensulfonat, benzoat, bikarbonat, bitartrat, bromid, kalcijum edetat, kamsilat, karbonat, hlorid, bromid, jodid, citrat, dihidrohlorid, edetat, edisilat, estolat, esilat, fumarat, gluceptat, glukonat, glutamat, glikolilarsanilat, heksilrezorcinat, hidrabamin, hidroksinaftoat, isetionat, laktat, laktobionat, malat, maleat, mandelat, metanesulfonat (mezilat), metilsulfat, muskat, napsilat, nitrat, pantotenat, fosfat/difosfat, poligalakturonat, salicilat, stearat, sukcinat, sulfat, tanat, tartrat, teoklat, trietjodid i pamoat.

[0034] Kako se ovde koristi i osim ako nije drugačije naznačeno, izraz “hidrat” označava ovde obezbeđeno jedinjenje ili njegovu so, koja dodatno uključuje stehiometrijsku ili nestehiometrijsku količinu vode vezanu nekovalentnim međumolekulskim silama. Hidrati mogu da budu kristalni ili nekristalni.

[0035] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije izričito navedeno, izraz “solvat” označava solvat obrazovan iz povezivanja jednog ili više molekula rastvarača sa ovde obezbeđenim jedinjenjem. Izraz "solvat" uključuje hidrate (npr., monohidrat, dihidrat, trihidrat, tetrahidrat, i slično). Solvati mogu da budu kristalni ili nekristalni.

[0036] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, izraz “stereoizomer” obuhvata sva ovde obezbeđena enantiomerno/stereometrijski čista i enantiomerno/stereometrijski obogaćena jedinjenja.

[0037] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, izraz “stereometrijski čist” ili “enantiomerno čist” označava da jedinjenje sadrži jedan stereoizomer i da u osnovi ne sadrži suprotan stereoizomer ili enantiomer. Na primer, jedinjenje je stereometrijski ili enantiomerno čisto kada sadrži 80%, 90%, ili 95% ili više jednog stereoizomera i 20%, 10%, ili 5% ili manje suprotnog stereoizomera. U nekim slučajevima se smatra da je ovde obezbeđeno jedinjenje optički aktivno ili stereometrijski/enantiomerno čisto (tj., u osnovi R-oblika ili u osnovi S-oblika) u odnosu na hiralni centar, kada je oko 80% ev (enantiomerni višak) ili više, poželjno, jednako ili veće od 90% ev u odnosu na određeni hiralni centar, i poželjnije 95% ev u odnosu na određeni hiralni centar.

[0038] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, izraz “stereometrijski obogaćen” ili ”enantiomerno obogaćen” obuhvata racemske smeše kao i druge smeše stereoizomera ovde obezbeđenih jedinjenja (npr., R/S = 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35 i 70/30).

[0039] Izrazi "ko-primena" i “u kombinaciji sa” uključuju primenu dva ili više terapeutskih sredstava (na pr., ovde obezbeđeno jedinjenje I i drugi modulator leukocitne aktivnosti, uključujući aktivnost B ćelija i/ili T ćelija, monocita, makrofaga, i drugih limfoidnih ili mijeloidnih ćelijskih vrsta, ili drugo aktivno sredstvo) bilo istovremeno, paralelno ili postupno bez specifičnih vremenskih ograničenja. U jednom primeru izvođenja, jedinjenje I i najmanje jedno drugo sredstvo prisutni su u ćeliji ili u telu subjekta u isto vreme ili ispoljavaju svoj biološki ili terapeutski efekat. U jednom primeru izvođenja, terapeutsko sredstvo(a) je u istom sastavu ili jediničnom obliku doze. U jednom primeru izvođenja, terapeutsko sredstvo(a) je u posebnim kompozicijama ili jediničnim oblicima doze.

[0040] “B ćelija” je limfocit koji sazreva u koštanoj srži, i uključuje naivnu B ćeliju, memorijsku B ćeliju ili efektorsku B ćeliju (plazma ćelije). Ovde B ćelija može da bude normalna ili nemaligna B ćelija.

[0041] “T ćelija” je limfocit koji sazreva u timusu, i uključuje pomoćničku T ćeliju, memorijsku T ćeliju i citotoksičnu T ćeliju.

[0042] Kako se ovde koristi, “ukupno preživljavanje” se odnosi na vreme od randomizacije do smrti iz bilo kog razloga i meri se u populaciji predviđenoj za lečenje. Ukupno preživljavanje može da se ocenjuje u randomizovanim kontrolisanim studijama.

[0043] Kako se ovde koristi, “objektivna stopa odgovora” se odnosi na udeo pacijenata sa smanjenim predefinisanim simptomima skleroderme na kraju predefinisanog vremenskog perioda. Trajanje odgovora se obično meri od trenutka inicijalnog odgovora pa do dokumentovane progresije skleroderme.

[0044] Kako se ovde koristi, “vreme do progresije” označava vreme od randomizacije do objektivne progresije skleroderme. U nekim primerima izvođenja, vreme do progresije ne uključuje smrt.

[0045] Kako se ovde koristi, “preživljavanje bez progresije” označava vreme od randomizacije do objektivne progresije skleroderme ili smrti.

[0046] Kako se ovde koristi “vreme do neuspeha u lečenju” označava vreme merenja bilo koje ishodne tačke(aka), od randomizacije do prekida lečenja iz bilo kog razloga, uključujući progresiju bolesti, toksičnost tretmana i smrt.

[0047] Kako se ovde koristi, “mortalitet” označava meru broja umrlih u datoj populaciji.

[0048] Kako se ovde koristi, “respiratorni mortalitet” označava pacijente koji umiru od akutne hipoksemije ili drugog specifičnog respiratornog pogoršanja koje dovodi do smrti kao što je potreba za mehaničkom ventilacijom koja dovodi do smrti, respiratorni zastoj, ili bilo koji drugi događaj kod subjekta, za koji se procenjuje da je respiratorne prirode.

[0049] Kako se ovde koristi, “hospitalizacija zbog respiratornih problema” označava pacijente hospitalizovane zbog pogoršanja pulmonarnog statusa, koje se dokumentuje izveštajem prilikom prijema pacijenta u bolnicu ili drugim medicinskim mišljenjem.

[0050] Kako se ovde koristi, “modifikovani skor za kožu po Rodnanu” označava validiran numerički sistem bodovanja za procenu dermalne debljine kože.

[0051] Kako se ovde koristi, “debljina kože” označava tvrdu ili otvrdlu kožu, koja se može procenjivati različitim tehnikama, uključujući durometar i mRSS.

[0052] Kako se ovde koristi, “otvrdnjavanje kože” označava kožu koja je tvrda, crvena, upaljena, zadebljala ili osetljiva.

[0053] Kako se ovde koristi, “dermatološki indeks kvaliteta života” označava evaluaciju kvaliteta života u vezi sa kožnim simptomima kod pacijenta koji ima sklerodermu.

[0054] Kako se ovde koristi “funkcija pluća” označava bilo koje merenje forsiranog ekspiratornog protoka, forsiranog vitalnog kapaciteta, FEV 25-75%, zapremine pluća ili vitalnog kapaciteta.

1

[0055] Kako se ovde koristi, “difuzioni kapacitet ugljen-monoksida” označava procenu preuzimanja ugljen-monoksida kroz alveolarno-kapilarnu membranu. Ona može da bude zamena za merenje sposobnosti pluća da prenose kiseonik iz pluća u krvotok.

[0056] Kako se ovde koristi, “indeks dispneje po Maleru” označava instrument koji obezbeđuje kliničko merenje plitkosti daha.

[0057] Kako se ovde koristi, “skor na respiratornom upitniku Univerziteta Sent Džordž” označava instrument kojim se meri kvalitet života kod pacijenata sa plućnom bolešću.

[0058] Kako se ovde koristi, “skor gastrointestinalnog trakta UCLA konzorcijuma kliničkog ispitivanja skleroderme” označava upitnik koji se daje pacijentima sa sklerodermom, kako bi se evaluirali gastrointestinalni simptomi u vezi sa sklerodermom (sistemskom sklerozom).

[0059] Kako se ovde koristi, “endotel-zavisna dilatacija” označava bilo koje merenje funkcije vaskularnog endotela kod pacijenta koji ima sklerodermu.

[0060] Kako se ovde koristi “pešačko rastojanje od šest minuta” označava bilo koju evaluaciju rastojanja koje pacijent sa sklerodermom može da pređe peške u toku 6 minuta ili bilo koju standardizovanu proceduru za evaluaciju sposobnosti hodanja za fiksni period vremena ili fiksno rastojanje.

[0061] Kako se ovde koristi, pomalidomid se odnosi na sledeće jedinjenje:

5.1 JEDINJENJE I

[0062] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje I za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima, uključujući kombinovanu terapiju, i u ovde opisanim kompozicijama, predstavlja jedinjenje formule:

,

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše.

[0063] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion, koji ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat ili tautomer.

[0064] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion.

[0065] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je farmaceutski prihvatljiva so (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-diona.

[0066] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion hidrohlorid.

[0067] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion, koji ima sledeću strukturu:

,

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat ili tautomer.

[0068] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion.

[0069] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je farmaceutski prihvatljiva so (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-diona.

[0070] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje se bira od 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-diona, 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion hidrohlorida, (R)-3-[4-(4-morfolin-4-

1

ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion hidrohlorida, (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona i (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion hidrohlorida.

[0071] Jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše mogu da se pripremaju postupcima koji su poznati stručnjaku u oblasti, na primer, u skladu sa postupkom opisanim u SAD objavi patenta br.2011/0196150.

[0072] Primer postupka za pripremu je opisan u primeru 1.

5.2 JEDINJENJE 1 ZA UPOTREBU U POSTUPCIMA LEČENJA

[0073] Ovde je opisano jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima lečenja, prevencije i/ili praćenja bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa imunskom ili zapaljenskom bolešću, koji sadrže primenu terapeutski efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša, kod pacijenta kome je to potrebno. U nekim primerima izvođenja, bolest je odabrana od lupusa, skleroderme, Sjegrenovog sindroma, ANCA pozitivnog vaskulitisa, anti-fosfolipidnog sindroma i mijastenije gravis. U nekim primerima izvođenja, bolest je lupus ili skleroderma.

[0074] Senzitivnost jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša može da se proučava u različitim in vivo i in vitro testovima, uključujući životinjske modele, poznate stručnjaku u oblasti, za imunske i zapaljenske bolesti, uključujući, ali ne i ograničeno na, mišiji model MRL/MpJ-Faslpr/J sistemskog eritemskog lupusa, mišiji model NZBWF1/J sistemskog eritemskog lupusa, model kožne fibroze indukovane bleomicinom i mišiji model miša zategnute kože-1 (Tsk-1).

5.2.1 Lečenje skleroderme

[0075] U nekim primerima izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima lečenja, prevencije i/ili praćenja lečenja skleroderme ili njenih simptoma, koji sadrže primenu terapeutski efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša, kod pacijenta koji ima sklerodermu. U jednom primeru izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima lečenja, prevencije i/ili praćenja lečenja skleroderme ili njenih simptoma, koji sadrže primenu efikasne količine (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0076] U nekim primerima izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima prevencije skleroderme ili njenog simptoma, koji sadrže primenu terapeutski efikasne količine

1

jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta kod koga postoji rizik da dobije sklerodermu. U jednom primeru izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima prevencije skleroderme ili njenog simptoma, koji sadrže primenu terapeutski efikasne količine (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0077] U nekim primerima izvođenja, skleroderma je lokalizovana, sistemska, ograničena ili difuzna skleroderma.

[0078] U nekim primerima izvođenja, sistemska skleroderma obuhvata CREST sindrom (kalcinoza, Rejnoov sindrom, poremećena funkcija ili pokretljivost jednjaka, sklerodaktilija, teleangijektazija). Skleroderma je takođe poznata kao sistemska skleroza ili progresivna sistemska skleroza. U nekim primerima izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima lečenja ili prevencije Rejnoove bolesti ili sindroma. U nekim primerima izvođenja, sistemska skleroza obuhvata sklerodermijsku plućnu bolest, sklerodermijsku bubrežnu krizu, srčane manifestacije, mišićnu slabost (uključujući zamor ili ograničeni CREST), poremećaj gastrointestinalne pokretljivosti i spazam, i poremećaje u centralnom, perifernom i autonomnom nervnom sistemu (uključujući sindrom karpalnog tunela praćen neuralgijom trigeminusa). Takođe uključuje uopštenu onesposobljenost, uključujući depresiju i uticaj na kvalitet života.

[0079] U nekim primerima izvođenja, ograničena skleroderma je ograničena na šake, lice, vrat, ili njihove kombinacije.

[0080] U nekim primerima izvođenja, difuzna skleroderma obuhvata zatezanje kože i takođe se javlja iznad zglobova (ili laktova). U nekim primerima izvođenja, difuzna sistemska skleroza je bez skleroderme, i obuhvata fibrozu unutrašnjih organa, ali bez zatezanja kože; ili je porodična progresivna sistemska skleroza.

[0081] U jednom primeru izvođenja, skleroderma nije povezana sa gubitkom mase, kao što je gubitak mase usled bolesti.

[0082] Ovde su takođe opisani postupci za smanjenje, inhibiciju ili prevenciju jednog ili više od sledećih simptoma skleroderme: (i) postepenog otvrdnjavanja, zadebljavanja i zatezanja kože, (npr., na ekstremitetima kao što su šake, na licu i stopalima); (ii) obezbojavanja kože; (iii) ukočenosti ekstremiteta; (iv) sjajne kože; (v) malih belih grudvica ispod kože koje izbijaju u vidu bele krečnjačke tečnosti; (vi) Rejnoovog poremećaja funkcije jednjaka (bol, ukočenost, i/ili promene boje u šakama do kojih dolazi usled spazma krvnih sudova pri izlaganju hladnoći ili emotivnom stresu); (vii) teleangijektazije (crvene fleke, npr., na šakama, dlanovima, podlakticama, licu i usnama); (viii) bola i/ili ukočenosti zglobova; (ix) oticanja šaka i stopala; (x) svraba kože; (xi) ukočenosti i krivljenja prstiju; (xii) ulcera (čireva) na spoljašnjosti nekih

1

zglobova kao što su zglobovi na prstima i laktovi; (xiii) problema sa varenjem, kao što je gorušica, otežano gutanje, dijareja, nadražljivost creva i zatvor; (xiv) zamora i slabosti; (xv) plitkog daha; (xvi) artritisa; (xvii) gubitka kose; (xviii) problema sa unutrašnjim organima; (xix) digitalnog ulkusa; ili (xx) autoamputacije prstiju, koji obuhvataju primenu efikasne količina jedinjenja I kod pacijenta kome je to potrebno.

[0083] Bez vezivanja za bilo koju konkretnu teoriju, veruje se da jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše poboljšavaju Th1 imunski odgovor, i suprimiraju Th2 imunski odgovor, što može da dovede do anti-fibroznih efekata u koži.

[0084] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje ili smanjenje debljine kože pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta. Na primer, debljina kože se smanjuje za oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70% oko 80%, oko 90% ili više.

[0085] Ovde su dalje opisani postupci za postizanje jednog ili više kliničkih ishoda u vezi sa sklerodermom, koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša, kod pacijenta kome je to potrebno.

[0086] Ovde su dalje opisani postupci za povećanje ukupnog preživljavanja, objektivne stope odgovora, vremena do progresije, preživljavanja bez progresije i/ili vremena do neuspeha lečenja pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta.

[0087] Ovde su dalje opisani postupci za smanjenje mortaliteta, respiratornog mortaliteta i/ili hospitalizacije usled respiratornih problema pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta.

[0088] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje modifikovanog skora za kožu po Rodnanu, pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta. Na primer, poboljšanje modifikovanog skora za kožu po Rodnanu iznosi 5, 10, 15 ili 20 poena ili više.

[0089] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje ili smanjenje debljine kože kod pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod

1

pacijenta. Na primer, debljina kože se smanjuje za oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70% oko 80%, oko 90% ili više.

[0090] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje ili smanjenje otvrdnjavanja kože kod pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta.

[0091] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje dermatološkog indeksa kvaliteta života pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta.

[0092] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje funkcije pluća pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta.

[0093] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje difuzionog kapaciteta ugljen-monoksida kod pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta. Na primer, difuzioni kapacitet ugljen-monoksida kod pacijenta poboljšava se putem poboljšanja difuzionog kapaciteta pluća za ugljen-monoksid (DLco) od oko 10%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70% oko 80%, oko 90% ili više.

[0094] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje indeksa dispneje po Maleru kod pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta. Na primer, poboljšanje indeksa dispneje po Maleru iznosi 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 poena ili više.

[0095] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje skora na respiratornom upitniku Univerziteta Sent Džordž, pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta. Na primer, poboljšanje skora na respiratornom upitniku Univerziteta Sent Džordž iznosi 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 poena ili više.

[0096] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje skora gastrointestinalnog trakta UCLA konzorcijuma kliničkog ispitivanja skleroderme, kod pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta.

1

[0097] Dalje, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima za lečenje ili prevenciju digitalnog ulkusa kod pacijenta ili populacije pacijenata koji imaju sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša, kod pacijenta.

[0098] Dodatno je ovde obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima za poboljšanje endotel-zavisne dilatacije kod pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta.

[0099] Ovde su dalje opisani postupci za poboljšanje ili povećanje pešačkog rastojanja od šest minuta kod pacijenta koji ima sklerodermu, a koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta. Na primer, poboljšanje pešačkog rastojanja od šest minuta iznosi oko 200 metara, oko 250 metara, oko 300 metara, oko 350 metara, oko 400 metara ili više.

5.2.2 Lečenje eritemskog lupusa

[0100] U nekim primerima izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima lečenja, prevencije i/ili praćenja lečenja eritemskog lupusa ili njegovih simptoma, koji sadrže primenu terapeutski efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša, kod pacijenta koji ima eritemski lupus. U jednom primeru izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima lečenja, prevencije i/ili praćenja eritemskog lupusa ili njegovih simptoma, koji sadrže primenu efikasne količine (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kod pacijenta koji ima eritemski lupus.

[0101] U jednom primeru izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima prevencije eritemskog lupusa ili njegovih simptoma, koji sadrže primenu terapeutski efikasne količine jedinjenja I njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta kod koga postoji rizik da dobije eritemski lupus. U jednom primeru izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima prevencije eritemskog lupusa ili njegovih simptoma, koji obuhvataju primenu terapeutski efikasne količine (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kod pacijenta kod koga postoji rizik da dobije eritemski lupus.

2

[0102] U nekim primerima izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima lečenja, prevencije, i/ili praćenja sistemskog eritemskog lupusa (SLE), kožnog eritemskog lupusa (CLE) ili lekovima indukovanog lupusa.

[0103] Fraza “sistemski eritemski lupus” se ovde naizmenično koristi sa izrazima SLE i lupus i odnosi se na sva ispoljavanja bolesti koja su poznata u oblasti (uključujući remisije i razbuktavanja). U SLE ključnu ulogu igraju patološka hiperaktivnost B limfociti i obimna patološka proizvodnja imunoglobulinskih gama (IgG) autoantitela. Ovaj patološki proces dovodi do sekvestriranja i razaranja ćelija obloženih sa Ig, fiksiranja i degradacije proteina komplementa i oslobađanja hemotaksina, vazoaktivnih peptida i destruktivnih enzima u tkiva (Hahn BH. Systemic Lupus Erythematosus. U: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson, JL, editors. U: Harrison's Principles of Internal Medicine (16th edition). New York (US): McGraw-Hill; 2005. pp.1960-1967).

[0104] Simptomi SLE razlikuju se od osobe do osobe i mogu da se javljaju i prolaze. Kod većine pacijenta simptomi uključuju bol i oticanje zglobova. Često su pogođeni zglobovi prstiju, šake, ručni zglobovi i kolena. Kod nekih pacijenata se razvija artritis. Drugi uobičajeni simptomi uključuju: bol u grudima prilikom dubokog udaha, zamor, povišenu temperaturu bez drugih uzroka, uopštene smetnje, nelagodnost ili loš osećaj (slabost), gubitak kose, čireve u ustima, otečene limfne čvorove, osetljivost na sunčevu svetost, osip kože – osip u formi “leptira” preko obraza i korena nosa javlja se kod oko polovine ljudi sa SLE, kod nekih pacijenata se osip pogoršava na suncu i može jako da se raširi.

[0105] Drugi simptomi zavise od toga koji je deo tela pogođen, i mogu da uključuju sledeće:

Mozak i nervni sistem: glavobolje, otupelost, zujanje u ušima, napade, probleme sa vidom, promene ličnosti,

Digestivni trakt: bol u abdomenu, mučninu i povraćanje,

Srce: poremećen srčani ritam (aritmije),

Pluća: iskašljavanje krvi i otežano disanje i, i

Kožu: fleke na koži, prste koji menjaju boju kada je hladno (Rejnoov fenomen).

[0106] Neki pacijenti imaju samo kožne simptome. Ovo se označava kao diskoidni lupus.

[0107] U jednom primeru izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima lečenja umerenog, teškog i veoma teškog SLE. Izraz “težak SLE”, kako se ovde koristi, odnosi se na stanje SLE u kome pacijent ime jedan ili više teških simptoma ili simptoma opasnih po život (kao što su hemolitička anemija, veliki uticaj na srce i pluća, bubrežna bolest ili uključenost centralnog nervnog sistema).

[0108] Ovde su dalje opisani postupci za postizanje jednog ili više kliničkih ishoda u vezi sa SLE, koji obuhvataju primenu efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta kome je to potrebno.

[0109] Ovde su dalje opisani postupci za povećanje ukupnog preživljavanja, objektivne stope odgovora, vremena do progresije, preživljavanja bez progresije i/ili vremena do neuspeha lečenja pacijenta koji ima SLE primenom efikasne količine jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša kod pacijenta.

[0110] U nekom primeru izvođenja, jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše deluju kao inhibitori diferencijacije primarnih humanih memorijskih CD19+ B-ćelija do stadijuma plazmablasta. Bez vezivanja za bilo koju konkretnu teoriju, veruje se da jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše blokiraju ćelije u nekom nezrelom stadijumu čime se smanjuje broj plazmablasta koji su u stanju da proizvode visoke nivoe imunoglobulina. Funkcionalna posledica ovog efekta je smanjena proizvodnja imunoglobulina G (IgG) i imunoglobulina M (IgM) u kulturama u kojima se odvija diferencijacija.

[0111] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše inhibiraju sposobnost primarnih humanih memorijskih CD19+ B-ćelija da se deferenciraju do plazmablasta. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše nemaju značajan efekat na zrele CD138+ plazma ćelije u kratkoročnim kulturama. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše inhibiraju faktore diferencijacije B ćelija uključujući interferonski regulatorni faktor 4 (IRF4), limfocitno indukovan protein sazrevanja (BLIMP), X-blok vezujući protein 1 (XBP-1) i B ćelijski limfom 6 (Bcl6).

5.2.3 Lečenje drugih imunskih bolesti ili poremećaja

[0112] Ovde su dalje opisani postupci lečenja, praćenja ili prevencije drugih imunskih bolesti ili stanja, upotrebom jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemske smeše. Na primer, ovde su opisani postupci lečenja, praćenja ili prevencije drugih imunskih bolesti ili stanja, upotrebom (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Na primer, ovde je opisan postupak lečenja osobe koja ima bolest ili poremećaj, pri čemu su ta bolest ili poremećaj izazvani, ili su u vezi sa, neodgovarajućim ili neželjenim imunskim odgovorom, npr., bolest, poremećaj ili stanje koji mogu korisno da se leče imunosupresijom, uključujući primenu kod osobe jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša. Na primer, ovde je opisan postupak lečenja osobe koja ima bolest ili poremećaj, pri čemu su ta bolest ili poremećaj izazvani, ili su u vezi sa, neodgovarajućim ili neželjenim imunskim odgovorom, npr., bolest, poremećaj ili stanje koji mogu korisno da se leče imunosupresijom, uključujući primenu kod osobe (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0113] U različitim specifičnim primerima izvođenja, ovde je obezbeđeno jedinjenje 1 za upotrebu u postupcima za lečenje, prevencije ili praćenja imunskih bolesti odabranih od Sjegrenovog sindroma, ANCA pozitivnog vaskulitisa, anti-fosfolipidnog sindroma i mijastenije gravis. Ovde su takođe opisane druge imunske bolesti kao što su spondilitis, sindrom antifosfolipidnog antitela, antifosfolipidni sindrom (primarni ili sekundarni), astma, autoimuni gastritis, autoimuna hemolitička anemija, autoimuni hepatitis, autoimuna bolest unutrašnjeg uha, autoimuna limfoproliferativna bolest, autoimuna trombocitopenija purpura, Baloova bolest, Behčetova bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatija, celijakija, Šagasova bolest, hronična inflamatorna demijelinizujuća polineuropatija, ožiljni pemfigoid (npr., pemfigoid mukozne membrane), bolest hladne aglutinizacije, Degosova bolest, hepatiformni dermatitis, esencijalna mešana krioglobulinemija, Gudpejščerov sindrom, Grejvsova bolest, Gilen-Barov sindrom, Hašimotov tiroiditis (Hašimotova bolest; autoimuni tiroiditis), idiopatska plućna fibroza, idiopatska trombocitopenija purpura, IgA nefropatija, juvenilni artritis, lichen planus, Menijerova bolest, mešana bolest vezivnog tkiva, morfea, narkolepsija, neuromiotonija, pedijatrijski autoimunoneuropsihijatrijski poremećaji (PANDA), obični pemfigus, perniciozna anemija, poliarteritis nodoza, polihondritis, reumatska polimijalgija, primarna agamaglobulinemija, primarna bilijarna ciroza, Rejnoova bolest (Rejnoov fenomen), Rajterov sindrom, povratni polihondritis, reumatska groznica, sindrom ukočenog čoveka (Moersch-Woltmannov sindrom), Takajasuov arteritis, temporalni arteritis (arteritis džinovskih ćelija), uveitis, vaskulitis (npr., vaskulitis koji nije u vezi sa eritemskim lupusom), vitiligo, i/ili Vegenerova granulomatoza.

5.2.4 Lečenje za pacijente sa oštećenjem bubrega

[0114] Ovde su takođe opisani postupci lečenja, prevencije, i/ili praćenja bolesti kod pacijenata sa oštećenjem bubrežne funkcije. Takođe su opisani postupci za obezbeđivanje odgovarajućeg prilagođavanja doze za pacijente sa oštećenjem bubrežne funkcije usled, ali ne i ograničeno na, bolesti, starosti ili druge faktore u vezi sa pacijentom.

[0115] Ovde su takođe opisani postupci lečenja, prevencije, i/ili praćenja bolesti ili njenih simptoma, kod pacijenata sa oštećenom bubrežnom funkcijom, a koji obuhvataju primenu

2

terapeutski efikasne količine ovde obezbeđenog jedinjenja kod pacijenta sa oštećenjem bubrežne funkcije. Takođe su ovde opisani postupci lečenja, prevencije, i/ili praćenja bolesti u relapsu, ili njenih simptoma, kod pacijenata sa oštećenjem bubrežne funkcije, a koji obuhvataju primenu terapeutski efikasne količine (S)-3-(4-((4-morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-diona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kod pacijenta kod koga postoji bolest u relapsu sa oštećenom bubrežnom funkcijom.

[0116] Ovde su takođe opisani postupci prevencije relapsa kod pacijenata sa oštećenom bubrežnom funkcijom, koji obuhvataju primenu efikasne količine ovde obezbeđenog jedinjenja kod pacijenta sa oštećenom bubrežnom funkcijom kod koga postoji rizik od relapsa. Ovde su takođe opisani postupci prevencije relapsa kod pacijenata sa oštećenom bubrežnom funkcijom, koji obuhvataju primenu efikasne količine (S)-3-(4-((4-morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin -2-il)piperidin-2,6-diona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kod pacijenta sa oštećenom bubrežnom funkcijom kod koga postoji rizik od relapsa.

[0117] Kao što je ovde opisano, kada se leči pacijent sa oštećenjem bubrega, postoji potreba da se kod pacijenta sa oštećenjem bubrega primeni niža doza jedinjenja od doze koja se primenjuje kod normalnog pacijenta (npr., pacijenta bez bubrežnog oštećenja) pošto je kod pacijenta sa oštećenjem bubrega sposobnost eliminacije pomalidomida ili njegovih metabolita smanjena. Dakle, ovde je takođe opisan postupak za lečenje pacijenta sa oštećenjem bubrega dozom ovde obezbeđenog jedinjenja koja je niža od doze primenjene kod normalnog pacijenta.

[0118] Na primer, terapeutski ili profilaktički efikasna količina jedinjenja iznosi od oko 0.005 do oko 1,000 mg na dan, od oko 0.01 do oko 500 mg na dan, od oko 0.01 do oko 250 mg na dan, od oko 0.01 do oko 100 mg na dan, od oko 0.1 do oko 100 mg na dan, od oko 0.5 do oko 100 mg na dan, od oko 1 do oko 100 mg na dan, od oko 0.01 do oko 50 mg na dan, od oko 0.1 do oko 50 mg na dan, od oko 0.5 do oko 50 mg na dan, od oko 1 do oko 50 mg na dan, od oko 0.02 do oko 25 mg na dan, ili, od oko 0.05 do oko 10 mg na dan.

5.3 DOZE I KOLIČINE ZA DOZIRANJE

[0119] Doza jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša koja se primenjuje kod pacijenta mogu da budu veoma raznolike variable i može biti predmet procene zdravstvenog radnika judgment of a health-care practitioner. Doze jedinjenja I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša menjaju se u zavisnosti od faktora kao što su: specifična indikacija koja se leči, prevenira ili prati; godine i stanje pacijenta; i količina drugog aktivnog sredstva koje se koristi, ukoliko se neko koristi. U principu, jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše mogu da se primenjuju kod pacijenta jedan do četiri ili više puta na dan u dozi od oko 0.005 mg/kg telesne težine pacijenta do oko 10 mg/kg telesne težine pacijenta, ali ova navedena doza može pravilno da se varira u zavisnosti od starosti, telesne težine i medicinskog stanja pacijenta i vrste primene. U jednom primeru izvođenja, doza iznosi oko 0.01 mg/kg telesne težine pacijenta do oko 5 mg/kg telesne težine pacijenta, oko 0.05 mg/kg telesne težine pacijenta do oko 1 mg/kg telesne težine pacijenta, oko 0.1 mg/kg telesne težine pacijenta do oko 0.75 mg/kg telesne težine pacijenta ili oko 0.25 mg/kg telesne težine pacijenta do oko 0.5 mg/kg telesne težine pacijenta.

[0120] U jednom primeru izvođenja, daje se jedna doza na dan. U svakom datom slučaju, primenjena količina jedinjenja I ili njegovih farmaceutski prihvatljive soli, solvata, hidrata, stereoizomera, tautomera ili racemskih smeša administered zavisiće od faktora kao što su rastvorljivost aktivne komponente, korišćene formulacije i rute primene. U jednom primeru izvođenja, primena topikalne koncentracije obezbeđuje unutarćelijska izlaganja ili koncentracije od oko 0.01 - 10 µM.

[0121] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše koriste se u količini od oko 0.1 mg do oko 1000 mg na dan, i mogu da se podešavaju na uobičajen način (npr., ista količina primenjena svakog dana tokom perioda lečenja, prevencije ili praćenja), u ciklusima (npr., jedne nedelje se daje, druge nedelje ne), ili u količini koja se povećava ili smanjuje tokom lečenja, prevencije ili praćenja. U drugim primerima izvođenja, doza može da bude od oko 1 mg do oko 300 mg, od oko 0.1 mg do oko 150 mg, od oko 1 mg do oko 200 mg, od oko 10 mg do oko 100 mg, od oko 0.1 mg do oko 50 mg, od oko 1 mg do oko 50 mg, od oko 10 mg do oko 50 mg, od oko 20 mg do oko 30 mg ili od oko 1 mg do oko 20 mg. U drugim primerima izvođenja, doza može da bude od oko 0.1 mg do oko 100 mg, od oko 0.1 mg do oko 50 mg, od oko 0.1 mg do oko 25 mg, od oko 0.1 mg do oko 20 mg, od oko 0.1 mg do oko 15 mg, od oko 0.1 mg do oko 10 mg, od oko 0.1 mg do oko 7.5 mg, od oko 0.1 mg do oko 5 mg, od oko 0.1 mg do oko 4 mg, od oko 0.1 mg do oko 3 mg, od oko 0.1 mg do oko 2 mg ili od oko 1 mg do oko 1 mg.

5.4 KOMBINOVANA TERAPIJA

[0122] Jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše mogu da se kombinuju sa drugim farmakološki aktivnim jedinjenjima (“druga aktivna sredstva”) u postupcima i kompozicijama koje su ovde obezbeđene. Neke kombinacije mogu da deluju sinergistički u lečenju određenih vrsta bolesti ili poremećaja, i stanja i simptoma povezanih sa tim bolestima ili poremećajima. Jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše takođe

2

mogu da deluju tako što ublažavaju štetne efekte povezane sa određenim drugim aktivnim sredstvima, i obrnuto.

[0123] Jedan ili više drugih aktivnih sastojaka ili sredstava mogu da se koriste u ovde obezbeđenim postupcima i kompozicijama. Druga aktivna sredstva mogu da budu veliki molekuli (npr., proteini) ili mali molekuli (npr., sintetički neorganski, organometalni ili organski molekuli).

[0124] U drugom primeru izvođenja, ovde obezbeđen postupak lečenja obuhvata primenu drugog terapeutskog sredstva, pri čemu je drugo terapeutsko sredstvo antizapaljenski lek, npr., steroidni antizapaljenski lek ili nestaroidni antizapaljenski lek (NSAID), acetaminofen, naproksen, ibuprofen, acetilsalicilna kiselina i slično. U specifičnijem primeru izvođenja u kome se primenjuje NSAID, takođe može da se primenjuje i inhibitor protonske pumpe (PPI), npr., omeprazol. U jednom primeru izvođenja, antizapaljensko sredstvo je kortikosteroid. U drugom primeru izvođenja, antizapaljensko sredstvo je kolhicin.

[0125] U drugom primeru izvođenja, drugo terapeutsko sredstvo je imunomodulatorno jedinjenje ili imunosupresivno jedinjenje kao što su azatioprin (Imuran™, Azasan™), metotreksat (Rheumatrex™, Trexall™), penicilamin (Depen™, Cuprimine™), ciklofosfamid (Cytoxan™), mikofenalat (CellCept™, Myfortic™), bosentan (Tracleer®), prednizon (Deltasone™, Liquid Pred™), i PDE5 inhibitor. U drugom primeru izvođenja, gde pogođena osoba ima digitalne ulkuse i plućnu hipertenziju, može da se primenjuje vazodilatator kao što je prostaciklin (iloprost).

[0126] U drugom primeru izvođenja, drugo terapeutsko sredstvo je inhibitor HDAC, kao što je romidepsin, vorinostat, panobinostat, valproinska kiselina, ili belinostat; ili biološko sredstvo, kao što je interleukin, imunomodulatorno monoklonsko antitelo, ili Bacillus Calmette-Guérin (BCG).

[0127] U drugom primeru izvođenja, drugo terapeutsko sredstvo je inhibitor ActRII receptora ili inhibitor aktivina-ActRII. Inhibitori ActRII receptora uključuju inhibitore ActRIIA i inhibitore ActRIIB. Inhibitori ActRII receptora mogu da budu polipeptidi koji sadrže aktivin-vezujuće domene ActRII. U nekim primerima izvođenja, polipeptidi koji sadrže aktivin-vezujući domen vezani su sa Fc delom nekog antitela (tj., formira se konjugat koji sadrži polipeptid ActRII receptora koji sadrži aktivin-vezujući domen i Fc deo antitela). U nekim primerima izvođenja, aktivin-vezujući domen povezn je sa Fc delom antitela putem linkera, npr., peptidnog linkera.

[0128] Primer aktivin-vezujućeg ActRIIA polipeptida fuzionisanog sa humanim Fc domenom obezbeđen je u SEQ ID NO: 1.

2

[0129] Primer fuzionog proteina koji sadrži solubilni vanćelijski domen ActRIIB fuzionisan sa Fc domenom obezbeđen je u SEQ ID NO: 2.

[0130] Dodatni primeri proteina koji nisu antitela, a koji su odbrani za vezivanje aktivina ili ActRIIA, kao i postupci za njihovo dizajniranje i selekciju, nalaze se u publikacijama WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939 i US 2005/0238646.

[0131] U jednom primeru izvođenja, inhibitor ActRII receptora je ACE-11. U drugom primeru izvođenja, inhibitor ActRII receptora je ACE-536.

[0132] Bilo koja kombinacija upravo navedenih terapeutskih sredstava, pogodna za lečenje bolesti ili njihovih simptoma, može da bude primenjena. Ova terapeutska sredstva mogu da se primenjuju u bilo kojoj kombinaciji sa jedinjenjem I ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, solvatom, hidratom, stereoizomerom, tautomerom ili racemskim smešama, u isto vreme ili u vidu posebne ture lečenja.

5.5 CIKLIČNA TERAPIJA

[0133] U nekim primerima izvođenja, ovde obezbeđeno jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše primenjuju se kod pacijenta ciklično. Ciklična terapija uključuje primenu aktivnog sredstva tokom nekog vremenskog perioda, koji je praćen pauzom (tj., prestankom primene) koja traje neki vremenski

2

period, i ponavljanja ovakve postupne primene. Ciklična terapija može da smanji razvoj rezistencije na jednu ili više terapija, spreči ili smanji sporedne efekte jedne od terapija i/ili poboljša efikasnost lečenja.

[0134] Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, ovde obezbeđeno jedinjenje primenjuje se svakog dana u jednoj ili podeljenim dozama u ciklusu od četiri do šest nedelja sa periodom pauze od oko jedne ili dve nedelje. Ciklična terapija dalje omogućava da se poveća učestalost, broj i dužina ciklusa doziranja. Tako, drugi primer izvođenja obuhvata primenu ovde obezbeđenog jedinjenje tokom više ciklusa nego što je uobičajeno kada se primenjuje sâmo. U dodatnom primeru izvođenja, ovde obezbeđeno jedinjenje primenjuje se u većem broju ciklusa nego što bi uobičajeno dovelo do toksičnosti koja ograničava dozu, kod pacijenta kod koga se drugi aktivni sastojak takođe ne primenjuje.

[0135] U jednom primeru izvođenja, ovde obezbeđeno jedinjenje primenjuje se svakodnevno i kontinuirano tokom tri ili četiri nedelje u dozi od oko 0.03 mg do oko 10 mg na dan, nakon čega sledi pauza od jedne ili dve nedelje. U drugim primerima izvođenja, doza može da bude od oko 0.1 mg do oko 8 mg, od oko 0.3 mg do oko 6 mg, od oko 1 mg do oko 4 mg, ili oko 2 mg, nakon čega sledi pauza.

[0136] U jednom primeru izvođenja, ovde obezbeđeno jedinjenje i drugi aktivni sastojak primenjuju se oralno, pri čemu se primena ovde obezbeđenog jedinjenja odvija 30 do 60 minuta pre drugog aktivnog sastojka, tokom ciklusa od četiri do šest nedelja. U drugom primeru izvođenja, kombinacija ovde obezbeđenog jedinjenja i drugog aktivnog sastojka se primenjuje intravenskom infuzijom tokom oko 90 minuta u svakom ciklusu.

[0137] Uobičajeni broj ciklusa tokom kojih se kombinovani tretman primenjuje kod pacijenta biće od oko jednog do oko 24 ciklusa, od oko dva do oko 16 ciklusa, ili od oko četiri do oko tri ciklusa.

5.6 BIOMARKERI

[0138] Ovde su takođe opisani biomarkeri za lečenje ovde obezbeđenih različitih bolesti ili poremećaja. Na primer, biomarker je klaster diferencijacije-44 (“CD44”), molekul koji se nalazi na površini B ćelija. Na primer, biomarker je klaster diferencijacije-83 (“CD83”), molekul koji se nalazi na površini B ćelija. U drugim primerima izvođenja, biomarker je kombinacija CD44 i CD83.

[0139] Nivoi proteinskih biomarkera mogu da se detektuju ili kvantitativno odrede bilo kojim metodama poznatim u oblasti. Na primer, koriste se metode na bazi antitela. Na primer, metoda za detekciju i kvantitativno određivanje je imunoblotovanje (Westarn blot), enzimski

2

imunosorbentni test (ELISA), imunohistohemija, protočna citometrija, citometrijska matrica sa zrncima ili masena spektroskopija.

[0140] Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je imunobloting (Westarn blot). Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je enzimski imunosorbentni test (ELISA). Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je direktni ELISA test. Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je indirektni ELISA test. Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je sendvič ELISA test. Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je imunohistohemija. Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je protočna citometrija. Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je citometrijska matrica sa zrncima. Na primer, metod za detekciju ili kvantitativno određivanje je masena spektroskopija.

[0141] Neki primeri uključuju postupke za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje. Na primer, postupak uključuje određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta. Na primer, biomarker je CD44. Na primer, biomarker je CD83.

[0142] Na primer, postupci za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD44, CD83 ili njihova kombinacija; i b) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa referentnim nivoom biomarkera; gde postoji verovatnoća da će subjekt biti responsivan na tretman, ukoliko je nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta izmenjen u poređenju sa referentnim nivoom biomarkera.

[0143] Na primer, postupci za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD44, CD83 ili njihova kombinacija; b) određivanje nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku; i c) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku; gde postoji verovatnoća da će subjekt biti responsivan na tretman, ukoliko je nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta izmenjen u poređenju sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku.

[0144] Na primer, postupci za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD83; i b) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa referentnim nivoom

2

biomarkera; gde postoji verovatnoća da će subjekt biti responsivan na tretman, ukoliko je nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta viši od referentnog nivoa biomarkera.

[0145] Na primer, postupci za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD83; b) određivanje nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku; i c) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku; gde postoji verovatnoća da će subjekt biti responsivan na tretman, ukoliko je nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta viši od nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku.

[0146] Na primer, postupci za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD44; i b) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa referentnim nivoom biomarkera; gde postoji verovatnoća da će subjekt biti responsivan na tretman, ukoliko je nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta niži od referentnog nivoa biomarkera.

[0147] Na primer, postupci za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD44; b) određivanje nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku; i c) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku; gde postoji verovatnoća da će subjekt biti responsivan na tretman, ukoliko je nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta niži od nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku.

[0148] Na primer, postupci za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD44, CD83 ili njihova kombinacija; i b) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku sa referentnim nivoom biomarkera; gde je razlika između nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta i referentnog nivoa biomarkera u korelaciji sa responsivnošću subjekta na tretman.

[0149] Na primer, postupci za identifikaciju subjekta koji će verovatno biti responsivan na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD44, CD83 ili njihova kombinacija; b) određivanje nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku; i c) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku; gde je razlika između nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta i nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku u korelaciji sa responsivnošću subjekta na tretman.

[0150] Na primer, postupci za predviđanje responsivnosti subjekta na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD83; i b) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku sa referentnim nivoom biomarkera; gde je povišeni nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta u poređenju sa referentnim nivoom biomarkera u korelaciji sa povišenom responsivnošću subjekta na tretman.

[0151] Na primer, postupci za predviđanje responsivnosti subjekta na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD83; b) određivanje nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku; i c) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku; gde je povišeni nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta u poređenju sa nivoom biomarkera u korelaciji sa povišenom responsivnošću subjekta na tretman.

[0152] Na primer, postupci za predviđanje responsivnosti subjekta na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD44; i b) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku sa referentnim nivoom biomarkera; gde je sniženi nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta u poređenju sa referentnim nivoom biomarkera u korelaciji sa povišenom responsivnošću subjekta na tretman.

[0153] Na primer, postupci za predviđanje responsivnosti subjekta na lečenje bolesti, poremećaja ili stanja pomoću jedinjenja za lečenje, obuhvataju: a) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu je biomarker CD44; b) određivanje nivoa biomarkera u kontrolnom uzorku; i c) poređenje nivoa biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku; gde je sniženi nivo biomarkera u biološkom uzorku dobijenom od subjekta u poređenju sa nivoom biomarkera u korelaciji sa povišenom responsivnošću subjekta na tretman.

[0154] Na primer, postupci za praćenje efikasnosti lečenja bolesti, poremećaja ili stanja kod subjekta lečenog jedinjenjem za lečenje, obuhvataju: a) dobijanje prvog biološkog uzorka od subjekta; b) određivanje nivoa biomarkera u prvom biološkom uzorku, pri čemu je biomarker CD44, CD83 ili njihova kombinacija; c) primenu jedinjenja za lečenje kod subjekta; d) dobijanje drugog biološkog uzorka od subjekta; e) određivanje nivoa biomarkera u drugom biološkom uzorku; i f) poređenje nivoa biomarkera u prvom i drugom biološkom uzorku; gde je subjekt responsivan na lečenje ukoliko je nivo biomarkera u drugom biološkom uzorku dobijenom od

1

subjekta izmenjen u poređenju sa nivoom biomarkera u prvom biološkom uzorku dobijenom od subjekta.

[0155] Na primer, postupci za praćenje efikasnosti lečenja bolesti, poremećaja ili stanja kod subjekta lečenog jedinjenjem za lečenje, obuhvataju: a) dobijanje prvog biološkog uzorka od subjekta; b) određivanje nivoa biomarkera u prvom biološkom uzorku, pri čemu je biomarker CD83; c) primenu jedinjenja za lečenje kod subjekta; d) dobijanje drugog biološkog uzorka od subjekta; e) određivanje nivoa biomarkera u drugom biološkom uzorku; i f) poređenje nivoa biomarkera u prvom i drugom biološkom uzorku; gde je subjekt responsivan na lečenje ukoliko je nivo biomarkera u drugom biološkom uzorku dobijenom od subjekta viši od nivoa biomarkera u prvom biološkom uzorku dobijenom od subjekta

[0156] Na primer, postupci za praćenje efikasnosti lečenja bolesti, poremećaja ili stanja kod subjekta lečenog jedinjenjem za lečenje, obuhvataju: a) dobijanje prvog biološkog uzorka od subjekta; b) određivanje nivoa biomarkera u prvom biološkom uzorku, pri čemu je biomarker CD44; c) primenu jedinjenja za lečenje kod subjekta; d) dobijanje drugog biološkog uzorka od subjekta; e) određivanje nivoa biomarkera u drugom biološkom uzorku; i f) poređenje nivoa biomarkera u prvom i drugom biološkom uzorku; gde je subjekt responsivan na lečenje ukoliko je nivo biomarkera u drugom biološkom uzorku dobijenom od subjekta viši od nivoa biomarkera u prvom biološkom uzorku dobijenom od subjekta.

[0157] Na primer, postupci za praćenje mere u kojoj se subjekat pridržava lečenja bolesti, poremećaja ili stanja jedinjenjem za lečenje, obuhvataju: a) dobijanje biološkog uzorka od subjekta; b) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku, pri čemu je biomarker CD44, CD83 ili njihova kombinacija; i c) poređenje nivoa biomarkera sa nivoom biomarkera u kontrolnom netretiranom uzorku dobijenom od subjekta; gde promena nivoa biomarkera u biološkom uzorku, u poređenju sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku ukazuje na meru u kojoj se subjekat pridržava lečenja.

[0158] Na primer, postupci za praćenje mere u kojoj se subjekat pridržava lečenja bolesti, poremećaja ili stanja jedinjenjem za lečenje, obuhvataju: a) dobijanje biološkog uzorka od subjekta; b) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku, pri čemu je biomarker CD83; i c) poređenje nivoa biomarkera sa nivoom biomarkera u kontrolnom netretiranom uzorku dobijenom od subjekta; gde povišeni nivo biomarkera u biološkom uzorku, u poređenju sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku ukazuje na meru u kojoj se subjekat pridržava lečenja.

[0159] Na primer, postupci za praćenje mere u kojoj se subjekat pridržava lečenja bolesti, poremećaja ili stanja jedinjenjem za lečenje, obuhvataju: a) dobijanje biološkog uzorka od subjekta; b) određivanje nivoa biomarkera u biološkom uzorku, pri čemu je biomarker CD44; i c) poređenje nivoa biomarkera sa nivoom biomarkera u kontrolnom netretiranom uzorku

2

dobijenom od subjekta; gde sniženi nivo biomarkera u biološkom uzorku, u poređenju sa nivoom biomarkera u kontrolnom uzorku ukazuje na meru u kojoj se subjekat pridržava lečenja.

[0160] Na primer, jedinjenje za lečenje predstavlja imunomodulatorno jedinjenje. U nekim primerima izvođenja jedinjenje za lečenje je 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion hidrohlorid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemske smeše. U jednom primeru izvođenja, jedinjenje je (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-piperidin-2,6-dion, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, ili hidrat.

5.7 FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE I OBLICI DOZE

[0161] Farmaceutske kompozicije mogu da se koriste u pripremi pojedinačnih, jediničnih oblika doze. Ovde opisane farmaceutske kompozicije i oblici doze sadrže ovde obezbeđeno jedinjenje, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat, hidrat, stereoizomer, racemat, klatrat ili prolek. Farmaceutske kompozicije i oblici doze mogu dodatno da sadrže jedan ili više ekscipijenasa.

[0162] Ovde opisane farmaceutske kompozicije i oblici doze takođe mogu da sadrže jedan ili više dodatnih aktivnih sastojaka. Primeri izbornih drugih, ili dodatnih, aktivnih sastojaka su prikazani prethodno u tekstu.

[0163] Ovde opisani pojedinačni oblici doze pogodni su za oralnu, mukoznu (npr., nazalnu, sublingvalnu, vaginalnu, bukalnu ili rektalnu), parenteralnu (npr., subkutanu, intravensku, bolusnom injekcijom, intramuskularnu ili intraarterijsku), topikalnu (npr., kapi za oči ili druge oftalmološke preparacije), transdermalnu ili transkutanu primenu kod pacijenta. Primeri oblika doze uključuju, ali nisu ograničeni na: tablete; kaplete; kapsule, kao što su meke elastične želatinske kapsule; pilule; pastile; lozenge; disperzije; supozitorije; praškove; aerosoli (npr., sprejevi za nos ili inhalatori); gelove; tečne oblike doze pogodne za oralnu ili mukoznu primenu kod pacijenta, uključujući suspenzije (npr., vodene ili nevodene tečne suspenzije, ulje-u-vodi emulzije, ili voda-u-ulju tečne emulzije), rastvore i eliksire; tečne oblike doze pogodne za parenteralnu primenu kod pacijenta; kapi za oči ili druge oftalmološke preparacije pogodne za topikalnu primenu; i sterilne čvrste supstance (npr., kristalne ili amorfne čvrste supstance) koje mogu da se rekonstituišu kako bi obezbedile tečne oblike doze pogodne za parenteralnu primenu kod pacijenta.

[0164] Sastav, oblik i vrsta oblika doze uobičajeno će varirati u zavisnosti od njihove upotrebe. Na primer, oblik doze koji se koristi u akutnom lečenju bolesti može da sadrži veće količine jednog ili više od aktivnih sastojaka koje sadrži, nego oblik doze koji se koristi u hroničnom lečenju iste bolesti. Slično tome, parenteralni oblik doze može da sadrži manje količine jednog ili više od aktivnih sastojaka koje sadrži, nego oralni oblik doze koji se koristi za lečenje iste bolesti. Ovi i drugi načini na koje će specifični oblici doze koji se koriste zavisiti jedni od drugih, biće lako uočljivi stručnjacima u oblasti. Videti, npr., Remington's Farmaceutical Sciences, 20<th>ed., Mack Publishing, Easton PA (2000).

[0165] Na primer, farmaceutske kompozicije i oblici doze sadrže jedan ili više ekscipijenasa. Pogodni ekscipijensi su dobro poznati stručnjacima u oblasti farmacije, i ovde su obezbeđeni neograničavajući primeri pogodnih ekscipijenasa. Da li je neki konkretni ekscipijens pogodan za inkorporaciju u farmaceutsku kompoziciju ili oblik doze, zavisi od niza različitih faktora dobro poznatih u oblasti, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, način na koji će oblik doze biti primenjen kod pacijenta. Na primer, oralni oblici doze kao što su tablete mogu da sadrže ekscipijense koji nisu pogodni za upotrebu u parenteralnim oblicima doze. Pogodnost određenog ekscipijensa takođe može da zavisi od specifičnih aktivnih sastojaka u obliku doze. Na primer, određeni ekscipijensi kao što je laktoza, ili izloženost vodi, mogu da ubrzaju raspadanje nekih aktivnih sastojaka. Aktivni sastojci koji sadrže primarne ili sekundarne amine naročito su skloni takvom ubrzanom raspadanju. Shodno tome, opisane su farmaceutske kompozicije i oblici doze koji sadrže malo, ili uopšte ne sadrže, laktozu i druge mono- ili di-saharide. Kako se ovde koristi, izraz “ bez laktoze” označava da količina prisutne laktoze, ukoliko je uopšte ima, nije dovoljna da suštinski poveća stopu degradacije aktivnog sastojka.

[0166] Kompozicije bez laktoze mogu da sadrže ekscipijense koji su dobro poznati u oblasti i čiji je spisak naveden, na primer, u farmakopeji U.S. Pharmacopeia (USP) 25-NF20 (2002). U principu, kompozicije bez laktoze sadrže aktivne sastojke, vezujuće sredstvo/punilac, i lubrikant u farmaceutski kompatibilnim i farmaceutski prihvatljivim količinama. Na primer, oblici doze bez laktoze sadrže aktivne sastojke, mikrokristalnu celulozu, preželatinizirani skrob i magnezijum stearat.

[0167] Ovde su takođe opisane anhidrovane farmaceutske kompozicije i oblici doze koji sadrže aktivne sastojke, s obzirom na to da voda može da olakšava degradaciju nekih jedinjenja. Na primer, dodavanje vode (npr., 5%) široko je prihvaćeno u oblasti farmacije kao determinanata simulacije dugotrajnog skladištenja, kako bi se odredile karakteristike kao što je rok trajanja ili stabilnost formulacija tokom vremena. Videti, npr., Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp. 379-80. Ustvari, voda i toplota ubrzavaju raspadanje nekih jedinjenja. Tako efekat vode na formulaciju može da bude veoma značajan pošto se vlaga i/ili vlažnost često susreću tokom proizvodnje, rukovanja, pakovanja, skladištenja, transporta i upotrebe formulacija.

[0168] Anhidrovane farmaceutske kompozicije i oblici doze mogu da se pripremaju upotrebom anhidrovanih sastojaka ili sastojaka sa niskim sadržajem vlage i u uslovima niske vlage ili niske vlažnosti. Farmaceutske kompozicije i oblici doze koji sadrže laktozu i najmanje jedan aktivni

4

sastojak koji sadrži primarni ili sekundarni amin, anhidrovane su ukoliko se očekuje značajniji kontakt sa vlagom i/ili vlažnošću tokom proizvodnje, pakovanja i/ili skladištenja.

[0169] Potrebno je da se anhidrovana farmaceutska kompozicija priprema i skladišti na takav način da se njena anhidrovana priroda održi. U skladu s tim, anhidrovane kompozicije se pakuju pomoću materijala koji su poznati po tome što sprečavaju izlaganje vodi tako da mogu da budu uključeni u pogodno formulisane kitove. Primeri pogodnih pakovanja uključuju, ali nisu ograničeni na, hermetički zatvorene folije, plastiku, kontejnere za jedinične doze (npr., vajle), blister pakovanja i strip pakovanja.

[0170] Takođe su opisane farmaceutske kompozicije i oblici doze koji sadrže jedno ili više jedinjenja koja smanjuju brzinu kojom će se aktivni sastojak raspadati. Ovakva jedinjenja, koja se ovde označavaju kao “stabilizatori” uključuju, ali nisu ograničena na, antioksidanse kao što su askorbinska kiselina, pH puferi ili soni puferi.

[0171] Kao i količine i vrste ekscipijenasa, i količine i specifične vrste aktivnih sastojaka u obliku doze mogu da se razlikuju u zavisnosti od faktora kao što su, ali ne i ograničeno na, rutu kojom se primenjuju kod pacijenata. Na primer, oblici doze sadrže ovde obezbeđeno jedinjenje u količini od oko 0.10 do oko 500 mg. Na primer, oblici doze sadrže ovde obezbeđeno jedinjenje u količini od oko 0.1, 1, 2, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ili 500 mg.

[0172] Na primer, oblici doze sadrže drugi aktivni sastojak u količini od 1 do oko 1000 mg, od oko 5 do oko 500 mg, od oko 10 do oko 350 mg, ili od oko 50 do oko 200 mg. Naravno, specifična količina drugog aktivnog sredstva zavisiće od specifičnog sredstva koje se koristi, bolesti ili poremećaja koji se leče ili prate, i količine(a) ovde obezbeđenog jedinjenja, i bilo kojih izbornih dodatnih aktivnih sredstava koja se paralelno primenjuju kod pacijenta.

5.7.1 Oralni oblici doze

[0173] Farmaceutske kompozicije koje su pogodne za oralnu primenu mogu da budu obezbeđeni u vidu diskretnih oblika doze, kao što su, ali ne i ograničeno na, tablete (npr., tablete za žvakanje), kapleti, kapsule i tečnosti (npr., aromatizovani sirupi). Ovakvi oblici doze sadrže unapred definisane količine aktivnih sastojaka i mogu da se pripremaju farmaceutskim ostupcima koji su dobro poznati stručnjacima u oblasti. Videti uopšteno, Remington's Farmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000).

[0174] Ovde opisani oralni oblici doze pripremaju se kombinovanjem aktivnih sastojaka u tesnoj smeši sa najmanje jednim ekscipijensom u skladu sa konvencionalnim sastojcima farmaceutske sinteze. Ekscipijensi mogu da imaju niz različitih oblika u zavisnosti od oblika preparacije koji je poželjan za primenu. Na primer, ekscipijensi pogodni za upotrebu u oralnim tečnim ili aerosolnim oblicima doze uključuju, ali nisu ograničen na, vodu, glikole, ulja, alkohole, arome, konzervanse i boje. Primeri ekscipijenasa pogodnih za upotrebu u čvrstim oralnim oblicima doze (npr., praškovi, tablete, kapsule i kapleti) uključuju, ali nisu ograničeni na, skrobove, šećere, mikrokristalnu celulozu, razblaživače, sredstva za granulaciju, lubrikante, sredstva za vezivanje i sredstva za raspadanje.

[0175] Na primer, oralni oblici doze su tablete ili kapsule, u kom slučaju se koriste čvrsti ekscipijensi. Na primer, tablete mogu da se oblažu standardnim vodenim ili nevodenim tehnikama. Ovakvi oblici doze mogu da se pripremaju farmaceutskim postupcima. U principu, farmaceutske kompozicije i oblici doze se pripremaju uniformnim i tesnim mešanjem aktivnih sastojaka sa tečnim nosačima, fino usitnjenim čvrstim nosačima, ili i jednim i drugim, a zatim, oblikovanjem proizvoda, ukoliko je neophodno, u željeni pojavni oblik.

[0176] Na primer, tableta može da se priprema komprimovanjem ili kalupljenjem. Komprimovane tablete mogu da se pripremaju komprimovanjem, u pogodnoj mašini, aktivnih sastojaka u slobodno-tekućem obliku kao što su praškovi ili granule, izborno pomešani sa ekscipijensom. Kalupljene tablete mogu da se prave kalupljenjem, u pogodnoj mašini, smeše jedinjenja u prahu ovlaženog inertnim tečnim razblaživačem.

[0177] Primeri ekscipijenasa koji mogu da se koriste u ovde opisanim oralnim oblicima doze, uključuju, ali nisu ograničen na, sredstva za vezivanje, punioce, sredstva za raspadanje i lubrikante. Sredstva za vezivanje, pogodna za upotrebu u farmaceutskim kompozicijma i oblicima doze uključuju, ali nisu ograničena na, kukuruzni skrob, krompirov skrob, ili druge skrobove, želatin, prirodne i sintetičke gume kao što su akacija, natrijum alginat, alginska kiselina, drugi alginati, tragakant u prahu, guar guma, celuloza i njeni derivati (npr., etil celuloza, celuloza acetat, karboksimetil celuloza kalcijum, natrijum karboksimetil celuloza), polivinil pirolidon, metil celuloza, preželatinizirani skrob, hidroksipropil metil celuloza, (npr., br. 2208, 2906, 2910), mikrokristalna celuloza, i njihove smeše.

[0178] Pogodni oblici mikrokristalne celuloze uključuju, ali nisu ograničen na, materijale koji se prodaju kao AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103 AVICEL RC-581, AVICEL-PH-105 (koji su dostupni od firmi FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA), i njihove smeše. Specifično vezujuće sredstvo je smeša mikrokristalne celuloza i natrijum karboksimetil celuloze koja se prodaje pod imenom AVICEL RC-581. Pogodni anhidrovani ili ekscipijensi niske vlažnosti ili aditivi uključuju proizvode AVICEL-PH-103™ i Starch 1500 LM.

[0179] Primeri punilaca pogodnih za upotrebu u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama i oblicima doze uključuju, ali nisu ograničen na, talk, kalcijum karbonat (npr., granule ili prah), mikrokristalnu celulozu, celulozu u prahu, dekstrate, kaolin, manitol, silicilnu kisleinu, sorbitol, skrob, preželatinizirani skrob i njihove smeše. Vezujuće sredstvo ili punilac u farmaceutskim kompozicijama prisutan je sa od oko 50 do oko 99 težinskih procenata farmaceutske kompozicije ili oblika doze.

[0180] U kompozicijama mogu da se koriste sredstva za raspadanje kako bi se obezbedile tablete koje se raspadaju kada su izložene vodenom okruženju. Tablete koje sadrže suviše sredstva za raspadanje mogu da se raspadaju tokom skladištenja, dok one koje sadrže premalo mogu da se ne raspadaju željenom brzinom ili u željenim uslovima. Dakle, za formiranje čvrstih oralnih oblika doze može da se koristi dovoljna količina sredstva za raspadanje koja nije ni prevelika ni premala, kako ne bi na štetan način menjala oslobađanje aktivnih sastojaka. Količina upotrebljenog sredstva za raspadanje varira u zavisnosti od vrste formulacije, i lako će je razlučiti stručnjaci u oblasti. Na primer, farmaceutske kompozicije sadrže od oko 0.5 do oko 15 težinskih procenata sredstva za raspadanje, ili od oko 1 do oko 5 težinskih procenata sredstva za raspadanje.

[0181] Sredstva za raspadanje koja mogu da se koriste u farmaceutskim kompozicijama i oblicima doze uključuju, ali nisu ograničeni na, agar-agar, alginsku kiselinu, kalcijum karbonat, mikrokristalnu celulozu, kroskarmelozu natrijum, krospovidon, polakrilin kalijum, natrijum skrob glikolat, skrob krompira ili tapioke, druge skrobove, preželatinizirani skrob, druge skrobove, gline, druge algine, druge celuloze, gume i njihove smeše.

[0182] Lubrikanti koji mogu da se koriste u farmaceutskim kompozicijama i oblicima doze uključuju, ali nisu ograničeni na, kalcijum stearat, magnezijum stearat, mineralno ulje, belo mineralno ulje, glicerin, sorbitol, manitol, polietilen glikol, druge glikole, stearinsku kiselinu, natrijum lauril sulfat, talk, hidrogenizovano biljno ulje (npr., ulje kikirikija ulje, ulje semena pamuka, suncokretovo ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje), cink stearat, etil oleat, etil laureat, agar, i njihove smeše. Dodatni lubrikanti uključuju, na primer, siloidni silika gel (AEROSIL200, proizvodi ga W.R. Grace Co. iz Baltimora, MD), koagulisani aerosol sintetičkog silicijum dioksida (prodaje ga Degussa Co. iz Plana, TX), CAB-O-SIL (proizvod pirogenog silicijum dioksida koga prodaje Cabot Co. iz Bostona, MA), i njihove smeše. Ukoliko se uopšte koriste, lubrikanti mogu da se koriste u količini od manje od oko 1 težinskog procenta farmaceutske kompozicije ili oblika doze u koji su inkorporirani.

[0183] Na primer, čvrsti oralni oblik doze sadrži ovde obezbeđeno jedinjenje, anhidrovanu laktozu, mikrokristalnu celulozu, polivinilpirolidon, stearinsku kiselinu, koloidni anhidrovani silicijum dioksid i želatin.

5.7.2 Oblici doze sa kontrolisanim oslobađanjem

[0184] Aktivni sastojci kao što su ovde obezbeđena jedinjenja mogu da se primenjuju putem kontrolisanog oslobađanja ili pomoću uređaja za isporučivanje koji su dobro poznati stručnjacima u oblasti. Primeri uključuju, ali nisu ograničen na one koji su opisani u SAD patentima br.: 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; i 4,008,719; 5,674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,639,480; 5,733,566; 5,739,108; 5,891,474; 5,922,356; 5,972,891; 5,980,945; 5,993,855; 6,045,830; 6,087,324; 6,113,943; 6,197,350; 6,248,363; 6,264,970; 6,267,981; 6,376,461; 6,419,961; 6,589,548; 6,613,358; 6,699,500. Ovakvi oblici doze mogu da se koriste kako bi obezbedili sporo ili kontrolisano oslobađanje jednog ili više aktivnih sastojaka upotrebom, na primer, hidropropilmetil celuloze, drugih polimernih nosača, gelova, permeabilnih membrana, osmotskih sistema, višeslojnih obloga, mikročestica, lipozoma, mikrosfera, ili njihovih kombinacija, kako bi se obezbedio željeni profil oslobađanja u različitim proporcijama. Pogodne formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, poznate stručnjacima u oblasti, uključujući one koje su ovde opisane, mogu lako da se odaberu za upotrebu sa ovde obezbeđenim aktivnim sastojcima. Dakle, opisane kompozicije obuhvataju jedinične oblike doze pogodne za oralnu primenu kao što su, ali ne i ograničeno na, tablete, kapsule, gel-kapsule i kaplete koji su prilagođeni za kontrolisano oslobađanje.

[0185] Svi farmaceutski proizvodi sa kontrolisanim oslobađanjem imaju zajednički cilj da se poboljša lečenje lekovima u odnosu na ono koje se postiže njihovim parnjacima koji nemaju kontrolu. Idealno, karakteristika upotrebe optimalno dizajnirane preparacije sa kontrolisanim oslobađanjem u medicinskom tretmanu, je to da se minimalna količina leka koristi kako bi se neko stanje izlečilo ili kontrolisalo u minimalnoj količini vremena. Prednosti formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem uključuju produženu aktivnost leka, smanjenu učestalost doziranja i povećano pridržavanje od strane subjekta. Pored toga, formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem mogu da se koriste kako bi se uticalo na vreme pojave delovanja ili na druge karakteristike, kao što su nivoi leka u krvi, i na taj način i na pojavu sporednih (npr., štetnih) efekata.

[0186] Najveći broj formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem je dizajniran tako da inicijalno oslobodi neku količinu leka (aktivnog sastojka) koja momentalno proizvodi željeni terapeutski efekat, i postepeno i kontinuirano oslobađa druge količine leka kako bi se održavao ovaj nivo terapeutskog ili profilaktičkog efekta tokom produženog vremenskog perioda. Kako bi se ovaj konstantan nivo leka održavao u telu, lek mora da se oslobađa iz oblika doze brzinom koja će nadomestiti količinu leka koja se metaboliše i izlučuje iz tela. Kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka može da se stimuliše različitim uslovima uključujući, ali ne i ograničeno na, pH, temperaturu, enzime, vodu ili druga fiziološka stanja ili jedinjenja.

[0187] Na primer, lek može da se primenjuje upotrebom intravenske infuzije, implantabilne osmotske pumpe, transdermalnog flastera, lipozoma, ili drugih načina primene. U jednom primeru izvođenja, može da se koristi pumpa (videti, Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.

14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med.321:574 (1989)). Na primer, mogu da se koriste polimerni materijali. Na primer, sistem za kontrolisano oslobađanje može da se postavi u subjekta na pogodnom mestu koje određuje osoba koja zahvat obavlja, tj., usled čega je neophodan samo deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, Medical Applications of Kontrolaled Release, vol. 2, pp.115-138 (1984)). Drugi sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem razmatraju se u revijskom članku autora Langera (Science 249:1527-1533 (1990)). Aktivni sastojak može da bude dispergovan u čvrstom unutrašnjem nosaču, npr., polimetilmetakrilatu, polibutilmetakrilatu, plastificiranom ili neplastificiranom polivinilhloridu, plastificiranom najlonu, plastificiranom polietilentereftalatu, prirodnoj gumi, poliizoprenu, poliizobutilenu, polibutadienu, polietilenu, etilen-vinil acetatnim kopolimerima, silikonskim gumama, polidimetil siloksanima, silicijum-ugljeničnim polimerima, hidrofilnim polimerima kao što su hidrogelovi estara akrilne i metakriline kiseline, kolagen, unakrsno povezani polivinilalkohol i unakrsno povezani delimično hidrolizovani polivinil acetat, koji je okružen spoljašnjom polimernom membranom, npr., polietilenom, polipropilenom, etilen/propilenskim kopolimerima, etilen/etil akrilatnim kopolimerima, etilen/vinilacetatnim kopolimerima, silikonskim gumama, polidimetil siloksanima, neoprenskom gumom, hlorisanim polietilenom, polivinilhloridom, kopolimerima vinilhlorida sa vinil acetatom, viniliden hloridom, etilenom i propilenom, jonomernim polietilen tereftalatom, butil gumama epihlorohidrinskih guma, etilen/vinil alkoholnim kopolimerima, etilen/vinil acetat/vinil alkoholnim terpolimerima i etilen/viniloksietanol kopolimerima, koji su nerastvorni u telesnim tečnostima. Aktivni sastojak zatim difunduje kroz spoljašnju polimernu membranu u koraku u kome se kontroliše brzina oslobađanja. Procenat aktivnog sastojka u takvoj parenteralnoj kompoziciji u velikoj meri zavisi od njegove specifične prirode, kao i od potreba subjekta.

5.7.3 Parenteralni oblici doze

[0188] Parenteralni oblici doze mogu da se primenjuju kod pacijenata različitim rutama, uključujući, ali ne i ograničeno na, subkutanu, intravensku (uključujući bolusnu injekciju), intramuskularnu i intraarterijsku. Na primer, primena parenteralnog oblika doze zaobilazi prirodne mehanizme odbrane pacijenata od kontaminirajućih agenasa, tako da su u ovim primerima izvođenja parenteralni oblici doze sterilni ili u stanju da mogu da se sterilišu pre primene kod pacijenta. Primeri parenteralnih oblika doze uključuju, ali nisu ograničeni na, rastvore spremne za injeciranje, suve proizvode spremne za rastvaranje ili suspendovanje u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu za injeciranje, suspenzije spremne za injeciranje, i emulzije.

[0189] Pogodni vehikulumi koji mogu da se koriste da bi se obezbedili parenteralni oblici doze, dobro su poznati stručnjacima u oblasti. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na: vodu za injekcije USP; vodene vehikulume kao što je, ali ne i ograničeno na, injekcija natrijum hlorida, Ringerova injekcija, injekcija dekstroze, injekcija dekstroze i natrijum hlorida i laktatna Ringerova injekcija; vehikulume koji se mešaju sa vodom kao što su, ali ne i ograničeno na, etil alkohol, polietilen glikol i polipropilen glikol; i nevodene vehikulume kao što su, ali ne i ograničeno na, kukuruzno ulje, ulje semena pamuka, ulje kikirikija, susamovo ulje, etil oleat, izopropil miristat i benzil benzoat.

[0190] Jedinjenja koja povećavaju rastvorljivost jednog ili više ovde opisanih aktivnih sastojaka mogu takođe da budu inkorporirana u parenteralne oblike doze. Na primer, ciklodekstrin i njegovi derivati mogu da se koriste kako bi se povećala rastvorljivost ovde obezbeđenog jedinjenja. Videti, npr., SAD patent br.5,134,127.

5.7.4 Topikalni i mukozni oblici doze

[0191] Ovde opisani topikalni i mukozni oblici doze uključuju, ali nisu ograničen na, sprejeve, aerosole, rastvore, emulzije, suspenzije, kapi za oči ili druge oftalmološke preparacije, ili druge oblike poznate stručnjaku u oblasti. Videti, npr., Remington's Farmaceutical Sciences, 16<th>, 18<th>i 20<th>eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 i 2000); i Introduction to Farmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985). Oblici doze pogodni za lečenje mukoznog tkiva u usnoj šupljini mogu da budu formulisani kao tečnosti za ispiranje usta ili kao oralni gelovi.

[0192] Pogodni ekscipijensi (npr., nosači i razblaživači) i drugi materijali koji mogu da se koriste kako bi se obezbedili topikalni i mukozni oblici doze koji su ovde obuhvaćeni dobro su poznati stručnjacima u oblasti farmacije, i zavise od konkretnog tkiva na koje će farmaceutska kompozicija ili oblik doze biti primenjeni. Na primer, ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, aceton, etanol, etilen glikol, propilen glikol, butan-1,3-diol, izopropil miristat, izopropil palmitat, mineralna ulja, i njihove smeše, za obrazovanje rastvora, emulzija ili gelova, koji su netoksični i farmaceutski prihvatljivi. Ovlaživači ili humektanti takođe mogu da se dodaju u farmaceutske kompozicije i oblike doze. Primeri dodatnih sastojaka su dobro poznati u oblasti. Videti, npr., Remington's Farmaceutical Sciences, 16<th>,18<th>i 20<th>eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 i 2000).

[0193] pH vrednost farmaceutske kompozicije ili oblika doze takođe može da bude podešena tako da poboljšava dostavljanje jednog ili više aktivnih sastojaka. Takođe, polarnost rastvornog

4

nosača, njegova jonska snaga ili toničnost mogu da se podese tako da poboljšavaju dostavljanje. Jedinjenja kao što su stearati takođe mogu da se dodaju u farmaceutske kompozicije ili oblike doze da bi izmenili hidrofilnost ili lipofilnost jednog ili više aktivnih sastojaka, u cilju poboljšanja dostavljanja. Na primer, stearati mogu da služe kao lipidni vehikulum za formulaciju, kao emulgator ili surfaktant, ili kao sredstvo za poboljšavanje dostavljanja ili poboljšavanje prodiranja. Na primer, soli, solvati, hidrati, prolekovi, klatrati ili stereoizomeri aktivnih sastojka mogu da se koriste kako bi se dodatno podesila svojstva dobijene kompozicije.

5.7.5 KITOVI

[0194] Ovde obezbeđeni aktivni sastojci ne primenjuju se kod pacijenta u isto vreme ili istom rutom primene. Ovde su takođe opisani kitovi koji mogu da pojednostave primenu odgovarajućih količina aktivnih sastojaka.

[0195] Na primer, kit sadrži oblik doze ovde obezbeđenog jedinjenja. Kitovi mogu još da sadrže dodatne aktivne sastojke kao što su druga protiv-zapaljenska, imunomodulatorna ili imunosupresivna jedinjenja, ili njihovu kombinaciju. Primeri dodatnih aktivnih sastojaka uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji su ovde prikazani.

[0196] Na primer, kitovi mogu dodtno da sadrže uređaje koji se koriste da se aktivni sastojci primene. Primeri ovakvih uređaja uključuju, ali nisu ograničeni na, špriceve, kese za infuziju, flastere i inhalatore.

[0197] Kitovi dalje mogu da sadrže ćelije ili krv za transplantaciju, kao i farmaceutski prihvatljive vehikulume koji mogu da se koriste kako bi se primenio jedan ili više aktivnih sastojaka. Na primer, ako je obezbeđen aktivni sastojak u čvrstom obliku, koji mora da se rekonstituiše za parenteralnu primenu, kit može da sadrži hermetički zatvoren spremnik sa pogodnim vehikulumom u kome aktivni sastojak može da bude rastvoren kako bi se obrazovao sterilan rastvor bez čestica koji je pogodan za parenteralnu primenu. Primeri farmaceutski prihvatljivih vehikuluma uključuju, ali nisu ograničeni na: vodu za injekcije USP; vodene vehikulume kao što je, ali ne i ograničeno na, injekcija natrijum hlorida, Ringerova injekcija, injekcija dekstroze, injekcija dekstroze i natrijum hlorida i laktatna Ringerova injekcija; vehikulumi koji se mešaju sa vodom kao što su, ali ne i ograničeno na, etil alkohol, polietilen glikol i polipropilen glikol; i nevodeni vehikulumi kao što su, ali ne i ograničeno na, kukuruzno ulje, ulje semena pamuka, ulje kikirikija, susamovo ulje, etil oleat, izopropil miristat i benzil benzoat.

6. PRIMERI

[0198] Sledeći primeri predstavljeni su kao ilustracija, a ne kao ograničenje. U primerima, testirano jedinjenje se odnosi na (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-dion.

6.1 PRIMER 1: PRIPREMA (S)-3-[4-(4-MORFOLIN-4-ILMETILBENZILOKSI)-1-OKSO-1,3-DIHIDRO-IZOINDO-2-IL]PIPERIDIN-2,6-DION HIDROHLORIDA (Referentni primer)

[0201] 3-hidroksi-2-metilbenzoeva kiselina (105 g, 690 mmol) je dodata u MeOH (800 mL) u balon sa zaobljenim dnom od 2L i sa tri grlića, snabdeven kondenzatorom, termometrom i magnetnim štapićem, nakon čega je dodat MeOH (250ml). H2SO4(10 mL, 180 mmol) je dodata u prethodno navedeni rastvor. Reakciona smeša je mešana na 62°C tokom 17 sati. Rastvarač je uklonjen u vakuumu. Ostatak (200 mL) je polako dodavan u vodu (600 mL) na sobnoj temperaturi i obrazovana je bela čvrsta supstanca. Suspenzija je mešana u ledenom kupatilu tokom 30 minuta i filtrirana. Čvrsta supstanca je oprana vodom (5 x 250 mL) i osušena kako bi dala metil estar 3-hidroksi-2-metil-benzoeve kiseline u vidu bele čvrste supstance (100g, prinos 87%). Jedinjenje je korišćeno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja: LCMS MH = 167;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 2.28 (s, 3H, CH3), 3.80 (s, 3H, CH3), 6.96 - 7.03 (m, 1H, Ar), 7.09 (t, J = 7.8 Hz, 1H, Ar), 7.14 - 7.24 (m, 1H, Ar), 9.71 (s, 1H, OH).

6.1.2 Metil estar 3-(terc-butil-dimetil-silaniloksi)-2-metil-benzoeve kiseline

[0202]

[0203] U balon sa zaobljenim dnom od 1L i sa tri grlića, snabdeven magnetnim štapićem i termometrom dodati su DMF (300 mL), metil 3-hidroksi-2-metilbenzoat (90 g, 542 mmol) i imidazol (92 g, 1,354 mmol). TBDMS-Cl (90 g, 596 mmol) je dodat u prethodno navedeni rastvor u porcijama, kako bi se kontrolisalo da li je unutrašnja temperatura između 15-19°C, tokom 20 minuta, i nakon dodavanja, unutrašnja temperatura je pala ispod 1 °C. Vodeno kupatilo je uklonjeno i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Reakciona smeša je dodata u ledenu vodu (500 mL), i dobijeni rastvor je podeljen u dve porcije (700 mL x 2). Svaka porcija je ekstrahovana pomoću EtOAc (700 mL). Svaki organski sloj je opran hladnom vodom (350 mL) i fiziološkim rastvorom (350 mL). Organski slojevi su kombinovani i osušeni pomoću MgSO4. Kombinovani organski sloj je koncentrovan kako bi dao metil estar 3-(tercbutil-dimetil-silaniloksi)-2-metil-benzoeve kiseline u vidu svetlo smeđeg ulja (160 g, sirovi prinos 100%). Jedinjenje je korišćeno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja: LCMS MH = 281;<1>H NMR (DMSO-d6) δ -0.21 (s, 6H, CH3, CH3), 0.73 - 0.84 (m, 9H, CH3, CH3, CH3), 2.10 (s, 3H, CH3), 3.60 (s, 3H, CH3), 6.82 (dd, 1H, Ar), 6.97 (t, J = 7.9 Hz, 1H, Ar), 7.13 (dd, J = 1.1, 7.7 Hz, 1H, Ar).

6.1.3 Metil estar 2-bromometil-3-(terc-butil-dimetil-silaniloksi)-benzoeve kiseline

[0205] NBS (49.8 g, 280 mmol) je dodat u metil 3-(terc-butil dimetilsililoksi)-2-metilbenzoat (78.4 g, 280 mmol) in metil acetatu (500 mL) na sobnoj temperaturi kako bi dao suspenziju narandžaste boje. Dobijena reakciona smepa je zagrevana u uljanom kupatilu na 40°C i osvetljena žutom sijalicom u refluksu od 300 wt tokom 4 sata. Reakciona smeša je ohlađena i oprana rastvorom Na2SO3(2 x 600 mL, 50% koncentracije zasićenja), vodom (500 mL) i

4

fiziološkim rastvorom (600 mL). Organski sloj je osušen pomoću MgSO4i obezbojen ugljem. Organski sloj je koncentrovan kako bi dao metil estar 2-bromometil-3-(terc-butil-dimetilsilaniloksi)-benzoeve kiseline u vidu svetlo smeđeg ulja (96 g, sirovi prinos 91%). Jedinjenje je korišćeno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja: LCMS M-Br = 279;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 0.05 - 0.11 (m, 6H, CH3, CH3), 0.82 (s, 9H, CH3, CH3, CH3), 3.65 (s, 3H, CH3), 4.74 (s, 2H, CH2), 6.94 (dd, J = 1.3, 8.1 Hz, 1H, Ar), 7.10 - 7.20 (m, 1H, Ar), 7.21 - 7.29 (m, 1H, Ar).

6.1.4 Metil estar 4-karbamoil-buterne kiseline

[0207] U rastvor metil 2-(bromometil)-3-(terc-butildimetilsililoksi)benzoata (137.5 g, 325 mmol) u acetonitrilu (1100 mL), koji se mešao u balonu od 2L sa okruglim dnom, dodat je metil 4,5-diamino-5-oksopentanoat hidrohlorid (70.4 g, 358 mmol). U suspenziju je dodat DIPEA (119 ml, 683 mmol) kroz levak za dodavanje, tokom 10 minuta i suspenzija je mešana 1 sat na sobnoj temperaturi, pre nego što je smeša zagrevana u uljanom kupatilu na 40°C tokom 23 sata. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu. Ostatak je mešan u etru (600 mL), i došlo je do taloženja bele čvrste supstance iz rastvora. Smeša je filtrirana i čvrsta supstanca je oprana etrom (400 mL). Filtrat je opran pomoću HCl (1N, 200 mL), NaHCO3(sat. 200 mL) i fiziološkog rastvora (250 mL). Vodeni kiseli sloj i bazni sloj su odvojeno sačuvani. Zatim je čvrsta supstanca dodatno oprana etrom (250 mL) i tečnost je oprana prethodno navedenim kiselim rastvorom i baynim rastvorom. Dva organska sloja su kombinovana i koncentrovana u vakuumu kako bi dali metil estar 4-[4-(terc-butil-dimetil-silaniloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-4-karbamoilbuterne kiseline u vidu smeđeg ulja (152g, sirovi prinos 115%, 77% čistoća određena pomoću H NMR). Jedinjenje je korišćeno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja LCMS MH = 407.

6.1.5 Metil estar 4-karbamoil-4-(4-hidroksi-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il)-buterne kiseline

[0209] U hladni rastvor metil 5-amino-4-(4-(terc-butildimetilsililoksi)-1-oksoizoindolin-2-il)-5-oksopentanoata (152 g, 288 mmol) u DMF (500 mL) i vodi (55 mL), koji se mešao, dodavan je K2CO3(19.89 g, 144 mmol) u porcijama, tokom 5 minuta. Dobijena reakciona smeša je mešana 40 minuta na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je hlađena u ledenom kupatilu. U smešu je polako dodavan HCl (12M, 23.99 ml, 288 mmol). Nakon dodavanja, u smešu je dodat acetonitril (280 mL) i čvrsta supstanca je precipitirala iz rastvora. Smeša je mešana 10 minuta na sobnoj temperaturi i filtrirana. Čvrsta supstanca je oprana acetonitrilom (50 mL x 4). Filtrat je koncentrovan u visokom vakuumu kako bi dao žuto ulje (168 g). Ulje je rastvoreno u acetonitrilu (600 mL) i mešano 10 minuta na sobnoj temperaturi. Smeša je filtrirana i čvrsta supstanca je oprana acetonitrilom (25 mL x 2). Filtrat je koncentrovan u visokom vakuumu kako bi dao žuto ulje (169g), koje je dodato u smešu vode (1200 mL) i etra (1000 mL). Smeša je mešana 3 minuta i slojevi su se odvojili. Vodeni rastvor je koncentrovan u visokom vakuumu i ostatak je mešan u acetonitrilu (160 mL) te se posle prekonoćnog mešanja, obrazovala bela čvrsta supstanca. Smeša je filtrirana kako bi dala metil estar 4-karbamoil-4-(4-hidroksi-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il)-buterne kiseline u vidu bele čvrste supstance (46 g, prinos 54%). Filtrat je koncentrovan i i ostatak je dalje kristalisan u acetonitrilu (60 mL) kako bi dao dodatni metil estar 4-karbamoil-4-(4-hidroksi-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il)-buterne kiseline u vidu bele čvrste supstance (11.7 g, prinos 14%). Filtrat je koncentrovan i ostatak je prečišćen ISCO hromatografijom kako bi dao metil estar 4-karbamoil-4-(4-hidroksi-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il)-buterne kiseline u vidu bele čvrste supstance (13.2 g, prinos 15%). Ukupno je dobijeno 70.9 g proizvoda u prinosu od 83%: LCMS MH = 293;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 1.95 - 2.34 (m, 4H, CH2, CH2), 3.51 (s, 3H, CH3), 4.32 (d, J = 17.6 Hz, 1H, CHH), 4.49 (d, J = 17.4 Hz, 1H, CHH), 4.73 (dd, J = 4.7, 10.2 Hz, 1H, CHH), 6.99 (dd, J = 0.8, 7.9 Hz, 1H, Ar), 7.10 - 7.23 (m, 2H, Ar, NHH), 7.25 - 7.38 (m, 1H, Ar), 7.58 (s, 1H, NHH), 10.04 (s, 1H, OH).

6.1.6 3-(4-((4-(morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-dion

4

[0211] Korak 1: U rastvor 3-(4-hidroksi-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il)-piperidin-2,6-diona (2.5g, 8.56 mmol) u THF (60 mL) dodat je trifenil fosfin (na polimernoj podlozi 1.6mmol/g, 12 g, 18.8 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Diizopropil azodikarboksilat (3.96 mL, 18.8 mmol) je dodat na 0°C, i smeša je mešana na 0°C tokom 30 minuta. (4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-metanol (2.62 g,12.4 mmol) je dodat na 0°C, i smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i preko noći je mešana na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je filtrirana, i filtrat je koncentrovan. Dobijeno ulje je prečišćeno na koloni sa silika gelom, ispiranoj metilen hloridom i metanolom (gradijent, proizvod je dobijen na 6% metanola) kako bi dao metil estar 4-karbamoil-4-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-buterne kiseline (2.2 g, prinos 54%). Jedinjenje je korišćeno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

[0212] Korak 2: U rastvor metil estra 4-karbamoil-4-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindol-2-il]-buterne kiseline (2.2g, 4.57 mmol) u THF (50 mL), dodat je kalijum terc-butoksid (0.51 g, 4.57 mmol) na 0°C. Smeša je mešana na 0°C tokom 10 minuta i reakcija je zaustavljena pomoću 1N HCl (5 mL, 5mmol) a nakon toga i zasićenim NaHCO3(25 mL). Smeša je ekstrahovana pomoću EtOAc (2 X 50 mL). Organski sloj je opran vodom (30 mL), fiziološkim rastvorom (30 mL), osušen preko MgSO4i koncentrovan. Dobijenoj čvrstoj supstanci je uz mešanje dodat EtOAc (10 mL) a nakon toga i heksan (10 mL). Suspenzija je filtrirana kako bi dala 3-(4-((4-(morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-dion u vidu bele čvrste supstance (1.5g, prinos 73%). HPLC: kolona Symmetry C18, proizvođača Waters, 5µm, 3.9 x 150 mm, 1 mL/min, 240 nm, gradijent do 95/5 acetonitril/0.1% H3PO4za 5 min,: tR= 4.78 min (97.5%); mp: 210-212 °C;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 1.86 - 2.09 (m, 1H, CHH), 2.29 - 2.38 (m, 4H, CH2,CH2), 2.44 (dd, J = 4.3, 13.0 Hz, 1H, CHH), 2.53 - 2.64 (m, 1H, CHH), 2.82 - 2.99 (m, 1H, CHH), 3.46 (s, 2H, CH2), 3.52 - 3.61 (m, 4H, CH2,CH2), 4.18 - 4.51 (m, 2H, CH2), 5.11 (dd, J = 5.0, 13.3 Hz, 1H, NCH), 5.22 (s, 2H, CH2), 7.27 - 7.38 (m, 5H, Ar), 7.40 -7.53 (m, 3H, Ar), 10.98 (s, 1H, NH)<13>C NMR (DMSO-d6) δ 22.36, 31.21, 45.09, 51.58, 53.14, 62.10, 66.17, 69.41, 114.97, 115.23, 127.64, 128.99, 129.81, 129.95, 133.31, 135.29, 137.68, 153.50, 168.01, 170.98, 172.83; LCMS: 465; anal. izr. C25H27N3O5+ 0.86 H2O: C, 64.58; H, 6.23; N, 9.04; nađeno: C, 64.77; H, 6.24; N, 8.88.

[0213] (S)-3-(4-((4-(morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-dion i (R)-3-(4-((4-(morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-dion pripremljeni su od 3-(4-((4-(morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-diona putem hiralne separacije.

4

6.2 PRIMER 2: EFEKAT NA EKSPRESIJU TRANSKRIPCIONIH FAKTORA U MODELU DIFERENCIJACIJE PRIMARNIH HUMANIH B ĆELIJA

[0214] U ovom primeru, dat je efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona (testirano jedinjenje) na ekspresiju transkripcionih faktora koji kontrolišu diferencijaciju plazma ćelija, i proizvodnju imunoglobulina, upotrebom in vitro sistema ćelijske kulture za diferencijaciju humanih B-ćelija.

[0215] U ovom primeru su korišćene sledeće skraćenice:

[0216] 50 ml leukocitno-trombocitnog sloja zdravih davalaca dobijen je od Centra za krv u Nju Džerziju. Uzorci SLE PBMC ćelija nabavljeni su od kompanije Conversant Bio (Huntsville, Alabama 35806).

[0217] U ovoj studiji su korišćeni sledeći reagensi za ćelijsku kulturu.

4

[0218] Sledeći reagensi su korišćeni za analizu na protočnom citometru.

[0219] Sledeći genski prajmeri su korišćeni za RT-PCR:

6.2.1 Prečišćavanje hPBMC ćelija

[0220] Pedeset ml humanog leukocitno-trombocitnog sloja je alikvotirano u dve konusne epruvete od 50 ml, po 25 ml u svaku, i u svaku konusnu epruvetu je dodato 25 ml sterilnog HBSS. Epruvete su pažljivo promešane okretanjem naopako. Petnaest ml fikola Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare; kat. br.17-1440-02) na sobnoj temperaturi, alikvotirano je u četiri konusne epruvete od 50 ml. Zatim je 25 ml smeše leukocitno-trombocitni sloj/HBSS pažljivo i polako naslojeno na fikol. Uzorci su centrifugirani na 450 rpm tokom 35 minuta. Vršni sloj, koji sadrži

4

plazmu odpipetiran je i odbačen. Međufaza koja sadrži mononuklearne ćelije prebačena je u dve konusne epruvete od 50 ml. Obe konusne epruvete su napunjene do pune zapremine od 50 ml sa HBSS i centrifugirane 10 minuta na 1200 rpm. Ćelije su ponovo oprane pomoću HBSS i centrifugirane 10 min na 1000 rpm. Ćelijski pelet je resuspendovan sa 20 mL B ćelijskog medijuma (Iscoves 10% PFBS, 1% P/S, i 5 µg/mL humanog insulina) i ćelije su izbrojane na brojaču ćelija.

6.2.2 Obogaćivanje B ćelija CD19+

[0221] Prečišćene PBMC su izbrojane i alikvotirano je po 2x10<8>ćelija po epruveti. Ćelije su centrifugirane na 1200 rpm tokom 5 minuta i zatim su supernatanti odbačeni. Ćelije su resuspendovane u 4 mL pufera Robosep Buffer (StemCell Technologies kataloški br. 20104) u polistirenske epruvete sa okruglim dnom od 14 mL (BD kataloški br.352057) i dobro promešane. Zatim je dodato 200 µL EasySep koktela za obogaćivanje humanih B ćelija (StemCell Technologies kataloški br. 19054). Uzorci su vorteksovani i inkubirani 10 minuta na sobnoj temperaturi. Sledeće je u epruvetu dodato 300 µL EasySep magnetnih čestica (vorteksovanih) (Stemcell Technologies kataloški br.19054). Uzorci su vorteksovani i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Nakon inkubacije od 5 minuta, 5 mL Robosep pufera je dodato u epruvetu i dobro izmešano pipetiranjem gore-dole. Epruveta je odmah postavljena u srebrni magnet (StemCell Technologies kataloški br.19054) i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Nakon inkubacije, u jednom pokretu je potrebno okrenuti magnet i epruvetu naopako i odliti željenu frakciju u konusnu epruvetu od 50 mL. Ove procedure su ponovljene za preostale PBMC ćelije (po jednom davaocu) i kombinovane. Kombinovana frakcija je centrifugirana na 1200 rpm tokom 5 minuta i zatim su supernatanti odbačeni i ćelije su resuspendovane u 5 mL B-ćelijskog medijuma. Izolovane CD 19+ ćelije su izbrojane na brojaču ćelija.

6.2.3 Test diferencijacije B ćelija

[0222] Korak 1- aktivacija B ćelija - dan 0 do dan 4: Pripremiti svež koktel B ćelija dodavanjem 50 µg/mL humanog transferina u B-ćelijski medijum. (Iscoves medijum 10% PFBS, 1% P/S, i 5 µg/mL humanog insulina). Filtrirati potrebnu zapreminu medijuma neophodnu za eksperiment kroz filter od 0.22 µM. U ćelije dodati koktel za diferencijaciju B ćelija (finalna koncentracija): rekombinantni humani IL-2 (20U/mL), IL-10 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL), CD40 ligand/TNFSF5/ histidinom obeležen (50 ng/mL), polihistidinsko mišije IgG1 antitelo (5 µg/mL), i ODN 2006- humani TLR9 ligand (10 µg/mL). Pet mililitara (1x10<5>/ml) CD19+ B ćelija je dodato u svaki bunar ploče sa 6 bunara sa ravnim dnom (finalni broj ćelija =

4

5x10<5>/bunaru). Pet µL (1x) ± jedinjenje/DMSO je dodato u svaki test bunar (finalno 0.1% DMSO) i inkubirano 4 dana na 37°C.

[0223] Korak 2 - Formiranje plazmablasta - dan 4 do dan 7: Ćelije su sakupljen i izbrojane na brojaču ćelija; alikvot za protočnu analizu je uklonjen, a preostale ćelije su oprane sa PBS. Pripremiti svež koktel za B ćelije dodavanjem 1 µg/ml humanog transferina u B-ćelijski medijum. (medijum Iscoves 10% PFBS, 1% P/S, i 5 µg/mL humanog insulina). Filtrirati potrebnu zapreminu medijuma neophodnu za eksperiment kroz filter od 0.22 µM. U ćelije dodati koktel za diferencijaciju B ćelija (finalna koncentracija): rekombinantni humani IL-2 (20U/mL), IL-10 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL), IL-6 (50ng/mL). Dodati svež koktel za B ćelije i prebaciti ćelije natrag u originalne bunare, te dopuniti zapreminu ponovo do 5 mL. Pet µL (1x) ± jedinjenje/DMSO dodato je u svaki test bunar (finalno 0.1% DMSO) i inkubirano 4 dana na 37°C.

[0224] Na dan 7, ćelije su sakupljene i izbrojane na brojaču ćelija. Ćelije su zatim podeljene u cilju protočne analize, a preostale ćelije su lizirane pomoću RLT pufera i uskladištene na -80°C u cilju ekstrakcije RNK i genske ekspresije. Supernatanti su alikvotirani i zamrznuti na -20°C za imunoglobulinske testove.

6.2.4 Priprema stok rastvora i razblaženja testiranih jedinjenja

[0225] Testirana jedinjenja su odmerena i rastvorena u sterilnom 100% DMSO (dimetil sulfoksidu; Research Organics, Cleveland, OH) kako bi se napravio stok rastvor od 40 mM. Razblaženja 40 mM stoka su korišćena u testu kako bi se dobile finalne koncentracije testiranog jedinjenja na bazi eksperimentalnog dizajna.

6.2.5 Ekstrakcija RNK i genska ekspresija

[0226] Diferencirane B ćelije (videti odeljke [00226]-[00227]) sakupljene su u cilju pripremanja ukupne ribonukleinske kiseline (RNK) pomoću instrumenta za ekstrakciju RNK Qiacube (Qiagen, Valencia, CA), koristeći QIAGEN RNeasy kitove sa mini kolonama za centrifugiranje. Prečišćena RNK je reverzno transkribovana u cDNK pomoću termičkog ciklera [MJ Research; Inc., St. Bruno, Quebec, Kanada) koristeći kit sa reverznom transkriptazom (Applied Biosystems). Test genske ekspresije je izveden upotrebom 7500 RT-PCR sistema (Applied Biosystems), u triplikatu. Kontrola u vidu testa za gensku ekspresiju gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze je sprovedena za svaki uzorak i korišćena je kao kontrola za normalizaciju. Za svaki gen, uzorci u okviru svakog eksperimenta su normalizovani u odnosu na tretman sa 0.1% DMSO, samo za tu konkretnu vremensku tačku.

[0227] Supernatanti (iz odeljka [00228]) su sakupljeni i u njima je analizirana proizvodnja IgG i IgM ELISA testom (ZeptoMetrix Corp. Buffalo, NY).

6.2.6 Fenotipizacija ćelija

[0228] Diferencirane B ćelije (videti odeljke [00226]-[00227]) su sakupljene, izbrojane, i alikvotirane na oko 1x10<6>ćelija, ili manje, po epruveti od 4 mL. Ćelije su oprane 1X puferom za bojenje. Ćelije su zatim blokirane pomoću 10% humanog seruma/PBS tokom 20-30 minuta. Nakon blokiranja, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 1200 rpm i supernatanti su odbačeni. U 100 µL preostalog pufera, dodato je po 20 µL različitih BD Pharmigen antitela za protočnu citometriju u skladu sa eksperimentalnim dizajnom. Ćelije su obojene tokom 20-30 minuta na 4°C. Ćelije su zatim oprane 2X puferom za bojenje i supernatanti su odbačeni. Dalje, u epruvete je dodato 500 µL pufera za bojenje ili PBS. Uzorci su odmah analizirani ili stavljeni na 4°C preko noći. Ćelije su obojene mišijim anti-humanim CD20 i CD38, CD19 i CD27, ili respektivnim kontrolama za izotipove. Svi uzorci su analizirani putem protočnog citometra FACSCanto, softvera za analizu FACSDiva (BD Bioscience), i softvera za analizu FlowJo.

6.2.7 Analiza ćelijske vijabilnosti

[0229] Da bi se odredio broj živih ćelija, B ćelije (videti odeljke [00226]-[00227]) su obojene 0.4% tripan plavim i žive ćelije su izbrojane na automatizovanom brojaču ćelija Countess (Invitrogen), u duplikatima uzoraka.

[0230] Podaci su prikazani na grafikonu koristeći softver GraphPad Prism 5.0. IC50vrednosti su izračunavane koristeći nelinearnu regresiju, gde je sigmoidni dozni odgovor bio ograničen odozgo sa 100% i odozdo sa 0% omogućajajući varijalbilni nagib. Rezultati za testirana jedinjenja u Ig testovima bili su izraženi kao procenat inibicije u odnosu na vrednosti za DMSO kontrolu.

[0231] Testirano jedinjenje je na dozno zavisan način smanjilo procenat CD20-CD38+ plazmablasta, i povećalo procenat CD20+CD38- aktiviranih B ćelija. Populacija plazmablasta (kvadrant 1) je iznosila 30.4% u DMSO kontroli na dan 7, i testirano jedinjenje je smanjilo populaciju na 27.3% pri 2 nM, 2.1% pri 20 nM i 0.4% pri 200nM (SL. 1). Testirano jedinjenje smanjilo je vijabilnost B ćelija tokom prva 4 dana gajenja (SL.2). Efekat testiranog jedinjenja na ekspresiju transkripcionih faktora B i plazma ćelija prikazan je na SL. 3. Efekat testiranog jedinjenja na IgG proizvodnju u kulturama plazmablasta prikazan je na SL.4.

[0232] Testirano jedinjenje je na dozno zavisan način znčajno inhibiralo ekspresiju transkripcionih faktora plazma ćelija IRF4, BLIMP1 i XBP1. Testirano jedinjenje pojačalo je B

1

ćelijski transcripcioni faktor PAX5. Efekat testiranog jedinjenje ekspresiju transkripcionih faktora B i plazma ćelija prikazan je na SL.5A i 5B.

[0233] Testirano jedinjenje, pomalidomid i lenalidomid inhibiraju proizvodnju IgG sa IC50vrednošću od 0.0018 µM, 0.049 µM, i 0.32 µM, redom. Podaci su pokazali da je testirano jedinjenje 27 puta potentnije nego pomalidomid u inhibiranju proizvodnje IgG tokom diferencijacije plazmablasta. Efekat testiranog jedinjenja na IgG proizvodnju u kulturama B ćelija na dane 4, 7 i 10 prikazan je na SL. 6. Efekat testiranog jedinjenja, samog i u kombinaciji sa prednizolonom, na proizvodnju IgG u in vitro diferenciranim plazmablastima/plazma ćelijama prikazan je na SL. 7. Efekat testiranog jedinjenja na ekspresiju CD20/CD38 tokom diferencijacije B ćelija na dan 7 prikazan je na SL. 8. Efekat testiranog jedinjenja na vijabilnost ćelija tokom diferencijacije plazmablasta prikazan je na SL.9.

[0234] U mononuklearnoj ćeliji izolovanoj iz periferne krvi pacijenata sa sistemskim eritemskim lupusom (SLE), testirano jedinjenje je inhibiralo proizvodnju IgG i IgM sa IC50vrednostima od 3.2 nM i 0.9 nM, redom. Ovi nalazi pokazali su da testirano jedinjenje ima potencijal da inhibira diferencijaciju B ćelija u liniju plazma ćelija, i ukazali na to da testirano jedinjenje može da bude korisno u lečenju autoimunskih poremećaja kao što je SLE, koji se odlikuju prekomernom proizvodnjom autoantitela. Efekat testiranog jedinjenja na diferencijaciju i funkcionisanje B ćelija u PBMC ćelijama SLE pacijenta, prikazani su na SL. 10. Efekat testiranog jedinjenja na proizvodnju IgG i IgM u normalnim i PBMC ćelijama SLE pacijenata prikazan je u tabeli 1.

[0235] SL.11A i 11B prikazuju efekat testiranog jedinjenja na proizvodnju humanog IgG i IgM, redom, u B-ćelijskim kulturama na dan 7.

2

Tabela 1. Potentnost inhibicije proizvodnje imunoglobulina IgG i IgM u normalnim i SLE PBMC ćelijama

6.3 PRIMER 3: TESTIRANJE DIFERENCIJACIJE B ĆELIJA UPOTREBOM PROTOČNE CITOMETRIJE I LASERSKE SKENIRAJUĆE CITOMETRIJE

[0236] Materijali za ćelijsku kulturu: Obogaćene normalne B ćelije i mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) pacijenta sa SLE, gajene su u in vitro sistemu za diferencijaciju B ćelija sa IMDM medijumom (Invitrogen) i 10% FCS, suplementiranim humanim transferinom i humanim insulinom (Sigma) plus koktelom citokina. Testirano jedinjenje je dodato u kulturu na dan 0 i dan 4.

[0237] Protokol za diferencijaciju B ćelija: Obogaćene B ćelije su izolovane iz svežeg leukocitno-trombocitnog sloja (jedinice obogaćene leukocitima) centrifugiranjem u gradijentu gustine, pomoću fikola Ficoll-Hypaque, i nakon toga inkubacijom sa EasySep kitom za obogaćivanje humanih B ćelija putem negativne selekcije (Stem cell technologies). Ukratko, 2 x 10<8>/ml PBMC ćelija je pomešano sa 4 ml Robosep pufera i prebečeno u polistirenske epruvete od 14 mL, sa okruglim dnom. Koktel za obogaćivanje humanih B ćelija EasySep (200 µL) dodat je po epruveti, vorteksovan i inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Magnetne čestice EasySep su dodate (300 µL per tube) i vortksovane i inkubirane 5 minuta na sobnoj temperaturi. Robosep pufer (5 mL) je dodat u svaku epruvetu i dobro promešan pipetiranjem gore-dole. Epruvete su postavljene u srebrni magnet i inkubirane 5 minuta na sobnoj temperaturi. Magnet i epruvete su podignute i jednim kontinuiranim pokretom okrenute naopako, uz odlivanje željene frakcije u konusne epruvete od 50 mL. Ćelije su centrifugirane 5 minuta na 1200 rpm. Supernatant je odliven i dodato je 5 mL svežeg B ćelijskog medijuma. Nakon što su ćelije prebrojane, alikvot je uklonjen za FACS analizu i preostale ćelije su korišćene za gajenje u kulturi. CD19+ B ćelije su izolovane do čistoće od ∼95% što je određeno protočnom citometrijom. Prečišćene B ćelije su zasejane u gustini od 1 x 10<5>ćelija/ml u sterilnu ploču sa 6 bunara, u 5ml po bunaru. Sve ćelije su gajene u IMDM medijumu (Invitrogen) i 10% FCS, suplementiranom humanim transferinom i humanim insulinom (Sigma). Aktivacija B-ćelija, stvaranje PB i PC, su izvedeni na bazi modifikovanog in vitro sistema za diferencijaciju B ćelija u plazma ćelije. Svi rekombinantni humani citokini IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-15, INF-α, i CD40L i anti-polihistidinsko mAb dodati su u naznačenim koracima gajenja. Različite koncentracije testiranog jedinjenja (2, 20 i 200 nM) dodate su u kulturu na dan 0 i dan 4. Na dan 4, sve ćelije se skupljaju zajedno za jedan tretman, ćelije, remove ćelije se uklanjaju za FACS analizu i citospin preparaciju. Preostale ćelije se zasejavaju pri gustini od 2.5 x 10<5>ćelija/ml u sterilne ploče sa 6 bunara, u 5ml po bunaru. SLE PBMC ćelije su gajene 7 dana pod uslovima koji pospešuju diferencijaciju plazma ćelija u normalne B ćelije.

[0238] Imunofenotipizacija za analizu protočnom citometrijom: Ćelije su obojene upotrebom višebojne direktne imunofluorescentne boje za analizu protočnom citometrijom. Površinsko bojenje je izvedeno pre fiksiranja i permeabilizacije ćelija. Ćelije (50 µl; 1 x 10<6>ćelija/ml u puferu za ispiranje, 2% FBS sa 0.1% NaN3 u PBS) su korišćene za svako bojenje. Ćelije su obojene pomoću mAb za kontrolu izotipa (1 µg/10<6>ćelija) i višebojno FITC-konjugovano anti-CD20 mAb i PE- konjugovano anti-CD38 mAb, ili PerCP-Cy5.5 konjugovano anti-CD44 mAb, PE- konjugovano anti-CD83 mAb korišćena su za aktivirane B ćelije (CD20+CD38- ćelije) dana 4, kao i za PB dana 4 i dana 7 (CD20-CD38+), i druga bojenja, i analizirana protočnom citometrijom po uputstvima proizvođača. Intracelularno bojenje proteina transkripcionih faktora (BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX-5 i XBP-1) i IgJ sprovedeno je u skladu sa preporukama proizvođača. Analize na protočnom citometru su izvedene instrumentom FACSCanto uz upotrebu FACSDiva 6 (BD Biosciences). Za analizu podataka, korišćen je softver Flowjo (Tree Star).

[0239] Priprema citospina od jednoćelijske suspenzije i imunofluorescentno bojenje za iCyte: Pripremljena je suspenzija ćelija sa ne više od 0.5 x 10<6>ćelija/ml u PBS puferu sa 2% FBS. Najviše do 200 µl ove suspenzije je sipano u svaku kivetu i kivete su oborene 3 minuta na 800 rpm. Kiveta i papir su pažljivo razdvojene tako da se ne ošteti sveži citospin i nastavljeno je ili odmah sa fiksacijom, ili sa sušenjem. Nefiksirani citospinovi su čuvani maksimalno 2 dana na sobnoj temperaturi. Ćelije na pločicama su fiksirane rastućim koncentracijama EtOH i ostavljene da se osuše pre bojenja. Nakon blokiranja nespecifičnog vezivanja normalnim serumom (iz iste vrste kao i sekundarno antitelo), preseci su inkubirani sa smešom sledećih monoklonskih antitela u vlažnoj komori u hladnoj sobi, preko noći: (i) anti-humani CD38 kao ćelijski marker plazmablasta, i (ii) anti-BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 i XBP-1 za proteine transkripcionih faktora. Nakon ispiranja, mikroskopske pločice su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku sa smešom sekundarnih antitela koja su ogajena u različitim vrstama (sa dva različita fluorohroma, tj., sa Alexa Fluor-488 i Alexa Fluor-633). Mikroskopske pločice su zatim isprane u PBS, kontrstno obojene bojom DAPI tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, prekrivene pokrovnim pločicama sa pokrovnim medijumom koji sprečava gubljenje fluorescencije, i zalepljene lakom za nokte. Mikroskopske pločice su čuvane u tami na 4 °C. Kako bi se isključili

4

lažno pozitivni rezultati proizvedeni usled nespecifičnog vezivanja sekundarnog antitela, sva tkiva su tretirana na isti način, sa puferom umesto primarnog antitela. Boja dobijena bojenjem antitela je posmatrana i količina je analizirana u presecima tkiva, upotrebom iCyte.

[0240] Snimanje slika laserskim skenirajućim citometrom i kvantitativna analiza fluorescencije: Dvostruko imunofluorescentno bojenje je izvedeno na ćelijama koje su citospinovane na mikroskopske pločice (Cytospin 4, Thermo scientific), na osnovu standardne IHC metode. Snimanje slika i kvantitativna analiza fluorescencije izvedeni su upotrebom laserske skenirajuće citometrije (iCys kvantitativna vizuelna citometrija, CompuCyte). Postavljena su dva filtera (jedan za 488 i drugi filter za 405/633). Skeniranje niske rezolucije je korišćeno za mozaično skeniranje, a skeniranje visoke rezolucije za skeniranje regiona i analizu. Ukratko, mikroskopska pločica je stavljena na mikroskopsko postolje LSC i odabran je region za skeniranje. LSC je koristio argonski laser koji radi na 5 mW. Mikroskopska pločica je skenirana pomoću 20X objektiva. Ćelije su identifikovane i odabrane zaokruživanjem plave fluorescencije i po minimalnoj veličini ćelije, kao što je određeno DAPI bojenjem. Prag za detekciju ćelija podešen je da odabira pojedinačne ćelije na osnovu prednjeg ugla rasipanja svetlosti prikazane na tačkastom dijagramu oblasti sa ćelijama nasuprot integralu prednjeg rasipanja. Događaji rasipanja laserske svetlosti su snimljeni i korišćeni da se zaokruže pojedinačne ćelije u okviru prikaza skeniranih podataka. Diskriminacija zaokruživanjem je podešena iz nukleusnog dela skeniranih ćelija tako da je oko 67% pikselacije ukupnog rasipanja svetlosti zaokruženo. Zeleni i daleki crveni PMT-detektori napona su tako podešeni da se tokom skeniranja ne dostiže više od 75% maksimalne saturacije maksimalnih piksela u respektivnim poljima. Pošto je ustanovljena oblast skeniranja, mikroskopska pločica je analizirana pomoću 40X objektiva. Minimalno 6 oblasti skeniranja je ispitano za svaku mikroskopsku pločicu. Galerija ćelija je kreirana relokacijom ćelija od svakog od glavnih pikova u histogramu integrisane fluorescencije u dalekoj crvenoj oblasti. Morfološka kompozicija relociranih ćelija je ispitana u cilju kontrole kvaliteta. Podaci mogu da se analiziraju ili u integrisanom fluorescentnom modu ili u linearnom modu maksimalnih piksela. Različite populacije ćelija u LSC skeniranju ocenjene su kao procenti i MFI, i kvantitativno upoređeni sa DMSO kontrolama.

[0241] Analiza podataka: Površinski i intracelularni molekuli su protočnom citometrijom analizirani na instrumentu FACSCanto. Analiza podataka je obavljena softverom Flowjo. Vrsta obojenost antitela je uočena i količina u presecima tkiva je analizirana koristeći iCyte. Za različite populacije ćelija u FCM i LSC skeniranju skorovi su određeni u vidu procenata i MFI, i putem kvantitativnog poređenja sa DMSO kontrolama. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SEM. Svi podaci su predstavljeni na grafikonu upotrebom softvera GraphPad Prism 6.1 (GraphPad Software; San Diego, CA). Statistička analiza je izvedena upotrebom jednostrane ANOVA analize (Dunett-ov test višestrukog poređenja), i uparenog studentovog t test. P vrednosti manje od ili jednake 0.05 smatrane su značajnim.

[0242] B ćelije su gajene upotrebom modifikovanog in vitro sistema za diferencijaciju B ćelija u plazma ćelije, kao što je prethodno u tekstu opisano. Višebojna FITC-konjugovana antitela anti-CD20 mAb i PE-konjugovana antitela anti-CD38 mAb korišćena su za aktivirane B ćelije (CD20+CD38- ćelije) na dan 4 i plazmablaste na dan 7 (PB) (CD20-CD38+). Podaci iz 3 odvojena eksperimenta, reprezentativni za 3 davaoca, prikazani su u tabeli 2. Rezultati su pokazali da je testirano jedinjenje imalo značajan efekat na diferencijaciju B ćelija u liniju plazmablasta/plazma ćelija. Povećalo je broj aktiviranih B ćelije i smanjilo plazmablaste, smanjujući takođe vijabilnost ćelija tokom vremena (SL. 12A i 12B). Aktivirane B ćelije (CD20+CD38- ćelije) tretirane testiranim jedinjenjem (20 nM) nisu se značajno promenile između dana 4: (57.9% ± 11.5%) i dana 7 (50.5% ± 8.6%), ali je testirano jedinjenje značajno povećalo aktivirane B ćelije ako se uporedi sa vehikulum (DMSO) kontrolom na dan 4 (42.1 % ± 1.5%, p < 0.05) i na dan 7 (12.5% ± 5.7%, p < 0.05). U međuvremenu, testirano jedinjenje je značajno smanjilo plazmablaste/plazma ćelije (CD20-CD38+) na dan 4 (4.8 % ± 2.3%) i na dan 7 (9.7% ± 5.4%) u poređenju sa DMSO kontrolom (dan 4, 25.9 % ± 2.4% p < 0.05; i na dan 7, 54.8% ± 5.0%, p < 0.001). Osim toga, testirano jedinjenje na dozno zavisan način iscrpelo populaciju ćelija velikih dimenzija (gejt p2) u testu diferencijacije normalnih B ćelija (SL. 13). Procenat ćelija velikih dimenzija na dan 4 tretmana testiranim jedinjenjem iznosio je 31.2%, 23.1% i 20.4% za tretmane sa 2 nM, 20 nM i 200 nM, redom. Procenat ćelija velikih dimenzija na dan 7 tretmana testiranim jedinjenjem iznosio je 34.9%, 19.9% i 11.94% za tretmane sa 2 nM, 20 nM i 200 nM, redom. Poređenjem sa DMSO kontrolom, broj je bio na 35.5% i 34.9% na dan 4 i dan 7, redom.

Tabela 2. Testirano jedinjenje inhibira diferencijaciju plazmablasta

[0243] Uticaj testiranog jedinjenja na ekspresiju faktora transkripcije B ćelija i plazma ćelija (BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 i XBP-1) je procenjen metodom protočne citometrije. B ćelije su gajene kako je u tekstu prethodno opisano, a ćelije su sakupljene na dan 4, dan 7 radi imunofluorescentnog bojenja. Ćelije su najpre obojene za CD20 i CD38, a nakon permeabilizacije ćelija, obojene za BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 i XBP-1, i zatim analizirane by gating on whole limfociti. Podaci iz 3 eksperimenta reprezentativni za sva 3, prikazani su na SL. 14. Rezultati su pokazali da je testirano jedinjenje (20 nM) dovelo do pomaka u ekspresiji transkripcionih faktora u plazmablastima/plazma ćelijama. Značajno je smanjilo ekspresiju IRF-4 (p < 0.5), BLIMP-1 (p < 0.05) i XBP-1 (p < 0.05) na dan 4, ali je značajno povećalo BCL-6 (p < 0.05) na dan 7.

[0244] Laserska skenirajuća citometrija (iCyte) korišćena je za kvantitativnu analizu za potvrđivanje prethodno opisanih rezultata protočne citometrije. B ćelije normalnih davalaca i PBMC od SLE pacijenata uzgajane su kao što je opisano u prethodnoj metodi. Ćelije su sakupljene na dan 4 i da 7 da bi se postavile na mikroskopske pločice pomoću citospina, a zatim je usledila dvostruko imunofluorescentno bojenje kao što je opisano u Metodama. CD38 (zeleno) eksprimiraju plazmablasti/ plazma ćelije, dok je faktor transkripcije (crveno) BCL-6, IRF-4, BLIMP-1, PAX5 ili XBP-1 bio kolokalizovan u citoplazmi ili jedru. Jedro je bilo kontrastno obojeno bojom DAPI (plavo). U normalnim uzorcima B ćelija od dana 7, u poređenju sa DMSO kontrolom, ispitivano jedinjenje (20 nM) značajno je povećalo ekspresiju BCL-6 (slika 15A, p <0,01), a smanjilo IRF-4 (slika 15B, p <0,001) i BLIMP-1 (slika 15C, p <0,01) u celoj populaciji limfocita, i značajno povećalo ekspresija BCL-6 (p <0,05), smanjilo IRF-4 (p <0,001), BLIMP-1 (p <0,001) i PAX-5 (slika 15D, p <0,05) u CD38+ plazmablastima/plazma ćelijama. U obe ćelijske populacije nije bilo promene XBP-1 (SL. 15E). U PBMC ćelijama SLE pacijenta testirana su tri transkripciona faktora: BCL-6, IRF-4 i BLIMP-1. Podaci su pokazali da je ispitivano jedinjenje imalo sličnu aktivnost kod ovih faktora transkripcije kao i kod zdravih ćelija donora. Testirano jedinjenje je na dozno zavisan način značajno povećalo ekspresiju BCL-6 i inhibiralo ekspresiju IRF-4 i BLIMP-1 u CD38+ plazmablastima/plazma ćelijama dobijenim od PBMC ćelija SLE pacijenata tokom diferencijacije, na dan 4 i dan 7 (slika 16).

[0245] Koristeći isti in vitro sistem B-ćelijske diferencijacije, aktivnost testiranog jedinjenja na ekspresiju CD44 i CD83 u diferencijaciji B ćelija je dodatno istražena. Višebojno FITC-konjugovano ntitelo anti-CD20 mAb, PerCP Cy5.5-konjugovano antitelo anti-CD44 mAb i PE-konjugovano antitelo anti-CD83 mAb koriste se za ćelije na dan 4 i dan 7. Efekat testiranog jedinjenja ocenjen je iz 3 odvojena eksperimenta, reprezentativna za 3 donora. Podaci su pokazali da je testirano jedinjenje na dozno zavisan način značajno smanjilo srednji intenzitet fluorescencije (MFI) CD44 (SL.17, p <0,01) u uzorcima B-ćelijske diferencijacije na dan 7, koje je uzrokovano iscrpljivanjem ćelija CD20<hi>/CD44<hi>(SL. 18). Procenat CD20<hi>/CD44<hi>ćelija na dan 7 tretmana testiranim jedinjenjem koncentracije 2 nM, 20 nM i 200 nM je iznosio 18,4%, 10,1% i 6,6%, ponavljeno, u poređenju sa DMSO kontrolom od 22,2%. Iscrpljivanje CD44+ ćelija može da smanji adheziju leukocita. Testirano jedinjenje je takođe značajno povećalo ukupnu CD83+ ćelijsku populaciju i pojačalo ekspresiju CD83 (SL. 19). Procenat CD83+ ćelija na dan 4 tretmana testiranim jedinjenjem koncentracije 2 nM, 20 nM i 200 nM bio je 24,1% ± 2,1%, 40,2% ± 3,6%, 49,5% ± 4,4% i 18,4%. Procenat CD83+ ćelija na dan 7 tretmana testiranim jedinjenjem sa 2 nM, 20 nM i 200 nM bio je 16,3% ± 3,3%, 36,1% ± 3,4% i 51,9% ± 0,5%, u poređenju sa DMSO na 13,4% ± 2,4% i 12,9% ± 3,3 u danu 4 i danu 7.

[0246] Visok nivo kspresija IgJ lanca kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom (RA) predviđa nedostatak reakcije na rituksimab. Da bi se procenilo da li testirano jedinjenje ima bilo kakvu aktivnost na proizvodnju IgJ, ćelije su takođe korišćene za unutarćelijsko bojenje IgJ. Rezultati dobijeni od tri davaoca pokazali su da testirano jedinjenje dozno-zavisno i značajno smanjuje ekspresiju lanca Ig J u ćelijskim kulturama B-ćelijske diferencijacije na dan 4. Ne samo da je smanjilo broj ćelija pozitivnih na IgJ (dan 4, 20 nM na 8.4% ± 1.5%, 200 nM na 5.4% ± 1.8%; dan 7, 20 nM na 13.2% ± 2.3% i 200 nM na 7.2% ± 1,3, redom, u poređenju sa DMSO kontrolom na 13,1% ± 1,5% i 14,4% ± 4,3 u danu 4 i danu 7, redom), ali je takođe smanjio MFI od IgJ u pozitivnim ćelijama (SL. 20). Smanjena proizvodnja IgJ i IgG, IgM može da bude potencijalni marker odgovora na testirano jedinjenje kod bolesti poput RA.

6.4 PRIMER 4: EFEKAT TESTIRANOG JEDINJENJA NA PROIZVODNJU CITOKINA I HEMOKINA U HUMANIM T ĆELIJAMA KOJE SU STIMULISANE ANTI-HUMANIM CD3

[0247] Ovaj primer prikazuje efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona, (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona i 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju citokina i hemokina u humanim T ćelijama koje su stimulisane anti-humanim CD3, koristeći Luminex tehnologiju multipleksiranja.

[0248] Korišćene su sledeće skraćenice:

Skraćenica Objašnjenje ili definicija

IL interleukin

G-CSF faktor stimulacije kolonija granulocita

GM-CSF faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga

IFN-γ interferon gama

TNF-α faktor tumorske nekroze-alfa

RANTES regulisan po aktivaciji, eksprimiran i sekretovan od strane normalnih T ćelija

[0249] U ovoj studiji su korišćeni sledeći materijali:

RPMI-1640 medijum suplementiran sa 10% FBS, 100 jedinica/mL penicilina, 100 mg/mL streptomicina i 2 mM L-glutamina (Life Technologies)

Koktel za obogaćivanje humanih T ćelija RosetteSep® (StemCell, kat. br.15061) Luminex 12-ostruki kit za humane citokine i hemokine (Millipore, kat. br. MPXHCYTO-60K-12)

Luminex IS100 instrument (Millipore)

Anti-humano CD3 antitelo, OKT3 klon (eBioscience, kat. br.16-0037-85)

[0250] Testirana jedinjenja su pripremljena u vidu stok rastvora sa 4 mM u DMSO. T ćelije su izolovane negativnom selekcijom iz leukocitno-trombocitnog sloja koristeći RosetteSep® koktel za obogaćivanje T ćelija, u skladu sa procedurama proizvođača.

[0251] Sve ploče sa 96 bunarčića su prvobitno obložene sa 3 µg/mL anti-humanog CD3 antitela u 100 µL 1X PBS tokom 4 sata na 37°C. Ploče su isprane 3 puta sa medijumom RPMI-1640 Complete Media pre testiranja T ćelija. T ćelije su zatim zasejane u ploče obložene sa anti-CD3 pri gustini od 2.5 x 10<5>ćelija/bunarčiću u 180 µL medijuma RPMI-1640 Complete Media. Ćelije su tretirane sa po 20 µL 10X titriranih testiranih jedinjenja pri koncentracijama od 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, i 0.00001 µM, u duplikatu. Finalne koncentracije DMSO su iznosile 0.25%. Ploče su inkubirane tokom 48 sati na 37°C, sa 5% CO2. Nakon 48 sati, supernatanti su sakupljeni i testirani pomoću multipleksirane citometrijske matrice sa zrncima (CBA), za sledeće citokine/hemokine: IL-2, IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17A, GM-CSF, G-CSF, IFN-γ, TNF-α, i RANTES. CBA ploče su analizirane na instrumentu Luminex IS100.

[0252] Podaci dobijeni od svakog davaoca predstavljeni su na grafiku pomoću softvera GraphPad Prism 5.0 i izraženi su kao srednja vrednost u pg/mL ± SEM i kao % DMSO kontrole ± SEM.

[0253] Testirana jedinjenja pokazala su imunomodulatornu aktivnost u anti-CD3 stimulisanim primarnim humanim T ćelijama, menjajući proizvodnju nekoliko citokina i hemokina. Osnovni nivoi citokina i hemokina koje su proizvele stimulisane humane T ćelije inkubirane sa vehikulumom, predstavljeni su u tabeli 3 koja sledi.

Tabela 3: Osnovni nivoi citokina i hemokina

[0254] Testirana jedinjenja pojačala su proizvodnju IL-2, IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, RANTES i TNF-α u stimulisanim humanim T ćelijama. Pojačanje proizvodnje testiranim jedinjenjem bilo je u velikoj meri zavisno od koncentracije za većinu citokina i hemokina, osim za IL-10 i IL-5. Testirana jedinjenja pojačala su proizvodnju IL-10 na nižim koncentracijama ali su na višim koncentracijama inhibirala pojačanje proizvodnje IL-10. Testirana jedinjenja pojačala su proizvodnju IL-5 prvenstveno na samo jednoj koncentraciji u okviru opsega koncentracija koje su pojačale proizvodnju drugih citokina. Relativno male količine IL-2, IL-3, IL-5 i IL-17A su proizvedene u kontrolnim ćelijama u poređenju sa drugim citokinima i hemokinima (tabela 1). Testirano jedinjenje nije mnogo promenilo proizvodnju IL-17A. U stimulisanim humanim T ćelijama nisu proizvedene merljive količine GCSF i IL-15. Efekat 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen kao apsolutna proizvedena količina i kao procenat kontrolnih ćelija sa vehikulumom obezbeđen je na SL. 21 i 22, redom. Efekat (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen kao apsolutna proizvedena količina i kao procenat kontrolnih ćelija sa vehikulumom, obezbeđen je na SL. 23 i 24, redom. Efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona na proizvodnju citokina i hemokina u anti-CD3-stimulisanim humanim T ćelijama, izražen kao apsolutna proizvedena količina i kao procenat kontrolnih ćelija sa vehikulumom, obezbeđen je na SL. 25 i 26, redom. Isprekidana linija označava nivo ekvivalentan dvostrukoj osnovnoj proizvodnji (EC200) na SL.

22, 24 i 26.

6.5 PRIMER 5: ANTIZAPALJENSKA AKTIVNOST

[0255] Antizapaljenska aktivnosti 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindol-2-il]-piperidin-2,6-diona, (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindol-2-il]-piperidin-2,6-diona i (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidroizoindo-2-il]piperidin-2,6-diona proučavane su u mononuklearnim ćelijama humane periferne krvi (hPBMC). Luminex tehnologija je korišćena za određivanje inhibitorne (povećane) koncentracije, IC50za jedinjenja za istovremeno profiliranje proupalnih citokina/hemokina IL-10 (protivupalni citokin) iz PBMC ćelija zdravih davalaca stimulisanih pomoću LPS.

[0256] 50 ml leukocitno-trombocitnog sloja dobijenog od zdravih davalaca nabavljen je od Centra za krv u Nju Džerziju (East Orange, Nju Džerzi). Lipopolisaharidi (iz soja) (kat. br. L-1887) su kupljeni od kompanije Sigma. Milliplex kitovi sa zrncima za koja su vezana antitela, za Luminex xMAP tehnologiju, kupljeni su od kompanije Millipore (Billerica, Massachusetts) i i kombinovani u format za multipleksiranje pre testa.

6.5.1 Prečišćavanje mononuklearnih ćelija iz humane periferne krvi

[0257] 50 ml humanog leukocitno-trombocitnog sloja alikvotirano je, po 25 ml u svaku od dve konusne epruvete od 50 ml, i u njih je dodato 25 ml sterilnog HBSS. Epruvete su pažljivo izmešane okretanjem naopako. Petnaest ml fikola Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare (lokacija); kat. br.17-1440-02) na sobnoj temperaturi, alikvotirano je u 4 konusne epruvete od 50 ml. Zatim je 25 ml smeše leukocitno-trombocitnog sloja /HBSS pažljivo i polako naslojeno na fikol. Uzorci su centrifugirani 35 minuta na 450 rpm. Vršni sloj koji sadrži plazmu odpipetiran je i odbačen. Međufaza koja sadrži mononuklearne ćelije prebačena je u dve konusne epruvete od 50 ml. Obe konusne epruvete su napunjene do ukupne zapremine od 50 ml sa HBSS i centrifugirane 10 min na 1200 rpm. Ćelije su ponovo oprane u HBSS i oborene10 minuta na 1000 rpm. Ćelijski pelet je resuspendovan sa 20 ml RPMI kompletnog medijuma (RPMI/5% humani serumi/1x pen/strep/glut) i ćelije su izbrojane.

6.5.2 Tretman humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi

[0258] Jedna stotina µl (2x10<6>/ml) hPBMC ćelija je dodata u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom (finalni broj ćelija = 2x10<5>/bunarčiću) i inkubirana 1 sat na 37 °C. Dvadeset µl (10x) jedinjenja je dodato u svaki bunarčić sa testiranim jedinjenjem i dvadeset µl medijuma koji sadrži 2.5% DMSO je dodato u svaki kontrolni bunarčić ([DMSO]finalno=0.25%) i ploča je inkubirana 1 sat na 37 °C. Ćelije su zatim stimulisane sa 80 µl 2.5 ng/ml LPS ([LPS]finalno=1 ng/ml) i inkubirane 18 sati na 37 °C.

1

[0259] 50 µl supernatanta iz svakog bunarčića je prebačeno u 3 nove ploče od 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i sačuvano na -20 °C za Luminex analizu. Za svaki uzorak su izvedeni duplikati.

6.5.3 Luminex analiza

[0260] Prisustvo citokina je analizirano u uzorcima supernatanta u multipeks formatu u skladu sa uputstvima proizvođača (Millipore, Billerica, Ma 01821), upotrebom instrumenta Luminex IS100. Analize IL-12 i GM-CSF su obavljene u dupleksnom formatu upotrebom čistih supernatanata, dok su svi drugi citokini analizirani u multipleks formatu upotrebom supernatanta razblaženih u odnosu 1:20. Analiza podataka je izvedena upotrebom softvera Upstate Beadview. IC50vrednosti su izračunate nelinearnom regresijom, sigmoidni dozni odgovor, uz ograničenje gornje vrednosti na 100% i donje na 0%, što je omogućilo varijabilni nagib. EC50vrednosti su su se bazirale na gornjem ogranučenju sigmoidnih krivih koje je jednako 246.9%, što predstavlja prosek pojačanja IL-10 do koga dovodi pomalidomid (kontrola) pri 10 µM i donjeg ograničenja na 100%. IC50vrednosti su izvedene pomoću GraphPad Prism v5.00. Vrednosti podataka predstavljaju srednju vrednost SEM (standardna greška srednje vrednosti) od n (broj eksperimenata u duplikatu).

[0261] Kao što pokazuju podaci u tabeli 4 koja sledi, kao i SL. 27, 29 i 31, testirana jedinjenja imaju različite potencije inhibicije višestrukih ispitivanih citokina, npr., IL-6, IL-8, IL-1β, GM-CSF, MDC, MIP-1α, MIP-1β i TNF-α, uopšteno. Ova jedinjenja su takođe pojačala proizvodnju IL-10, MCP-1 i RANTES sa različitim potencijama, kao što je obezbeđeno u tabeli 5 i na SL.28, 30 i 32.

Tabela 4: Kratak pregled profila inhibicije citokina testiranim jedinjenjima

Tabela 5: Kratak pregled profila inhibicije citokina – Srednja vrednost % kontrole pri koncentraciji od 0.1 µM

2

6.6 PRIMER 6: EFEKAT NA FUNKCIJU HUMANIH ĆELIJA PRIRODNIH UBICA (NK) KAO ODGOVOR NA IGG/RITUKSIMAB

[0262] U ovom primeru je proučavan kapacitet testiranog jedinjenja da pojača funkciju humanih NK ćelija u odgovor na IgG/rituksimab. Imunomodulatorna aktivnost testiranog jedinjenja poređena je pomoću dva testa funkcije ćelija prirodnih ubica (NK), (1) proizvodnje interferonagama (IFN-γ), indukovane pomoću IgG i IL-2.

[0263] Materijali korišćeni u studiji i njihovi izvori su obezbeđeni u tekstu koji sledi:

Leukocitno-trombocitni sloj dobijen od zdravih dobrovoljaca (Centar za krv u Nju Džerziju) Fikol Ficoll-Hypaque Plus (Fisher Scientific Co LLC, PA, kat. br.17144002)

RPMI-1640 medijum suplementiran sa 10% FBS (fetalni goveđi serum), 100 jedinica/mL penicilina, 100 mg/mL streptomicina i 2 mM L-glutamina (Invitrogen, kat. br.21870-076) RPMI-1640 medijum (bez boje fenol crveno) suplemetiran sa 10% FBS, 100 jedinica/mL penicilina, 100 mg/mL streptomicina i 2 mM L-glutamina (Invitrogen, kat. br.11835-030) Rituksimab (Rituksan, Roche, Inc.) (kat. br. DIN 02241927, br. lota B50177)

Humani AB+ serum (Gemini Bio Products, CA, Kat. br.100-512)

Kit neradioaktivnog testa citotoksičnosti CytoTox 96 (Promega, WI, kat. br. G1780) RosetteSep koktel za obogaćivanje humanih NK ćelija (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, kat. br.15065)

APC konjugovan sa mišijim anti-humanim CD56+ (BD Biosciences, CA, kat. br.555518) Humani imunoglobulin G iz seruma (IgG) (Sigma, St. Louis, MO; kat. br.12511-10MG) Humani rekombinantni IL-2 (R&D Systems, MN, kat. br.202-IL-050/CF)

ELISA kit za humani IFN-gama (ThermoFisher, kat. br. PIEHIFNG5)

[0264] Korišćene su sledeće ćelijske linije:

Difuzni limfom krupnih B ćelija sličan aktiviranim B ćelijama (ABC-DLBCL): Riva ćelije (NCI, MD)

Difuzni limfom krupnih B ćelija sličan B ćelijama germinalnog centra (GCB-DLBCL): WSU-DLCL2 (Celgene Signal, CA)

Faraž (ATCC, VA)

Folikularni limfom: DoHH2 (DSMZ, Nemačka)

Burkitov limfom (BL): Raji (ATCC, VA).

[0265] NK ćelije dobijene od zdravih davalaca izolovane su iz leukocitno-trombocitnog sloja krvi negativnom selekcijom, koristeći RosetteSep koktel za obogaćivanje NK ćelija (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) pre centrifugiranja u gradijentu gustine sa fikolom Ficoll-Hypaque (Fisher Scientific Co LLC, PA), prateći uputstva proizvođača. CD56+ NK ćelije su izolovane do čistoće od ∼85%, što je utvrđeno protočnom citometrijom (BD Biosciences, CA).

6.6.1 Test za interferon-gama (IFN-gama) indukovan u NK ćelijama pomoću IgG [0266] Ploče od devedeset i šest bunarčića sa ravnim dnom, obložene su sa 100 µg/mL humanog IgG (Sigma) preko noći na 4°C. Sledećeg dana je IgG koji se nije vezao ispran pomoću hladnog 1X PBS. NK ćelije su zatim zasejane u ploče sa 96 bunarčiča obložene sa IgG pri gustini od 2 x 10<5>ćelija po bunarčiću u 180 µL RPMI-1640 medijuma i dodato je 10 ng/mL rhIL-2 (R & D Systems, MN). Testirana jedinjenja su dodata u zapremini od 20 µL DMSO. Finalne koncentracije testiranih jedinjenja su iznosile 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 ili 10 µM. Finalne koncentracije DMSO su iznosile 0.25%. Nakon 48 sati, supernatanti su sakupljeni i ELISA testom je analizirana proizvodnja IFN-γ u njima.

[0267] Podaci korišćeni da se utvrdi sposobnost testiranih jedinjenja da pojačaju proizvodnju IFN-γ u NK ćelijam, kao odgovor na stimulaciju imobilisanim IgG i rhIL-2 za svakog davaoca su analizirani pomoću softvera GraphPad Prism v5.0. Podaci su predstavljeni na dva načina, (1) kao apsolutna količina proizvedenog IFN-γ (pg/mL ± SEM) i (2) kao procenat količine IFN-γ proizvedenog u prisustvu 1 µM pomalidomida. EC50vredbost predstavlja koncentraciju testiranog jedinjenja koja obezbeđuje polovinu maksimalne proizvodnje IFN-γ, gde je maksimalna proizvodnja definisana kao IFN-γ koji se proizvede u prisustvu 1 µM pomalidomida. EC50vrednosti su izračunavane koristeći nelinearnu regresiju, gde sigmoidna kriva zavisnosti odgovora od doze koja ograničava gornji deo na 100% i donji deo na 0% omogućava varijabilni nagib.

Tabela 6

[0268] Testirana jedinjenja intenzivirala su proizvodnju IFN-γ u NK ćelijama na dozno zavisan način u odgovor na stimulaciju imobilisanim IgG i IL-2. Rezultati za racemat, R-enantiomer i S-enantiomer su obezbeđeni na SL. 33-35 (izraženi kao pg/mL proizvedenog IFN-γ), redom. SL.

36-38 obezbeđuju rezultate izražene u vidu procenta povećanja proizvedenog IFN-γ u odnosu na

4

IFN-γ proizveden u prisustvu pomalidomida pri 1 µM za racemat, R-enantiomer i S-enantiomer, redom. Svaka vrednost prikazana na graficima na SL. 33-38 predstavlja srednju vrednost od 12-14 određivanja ± SEM.

6.7 PRIMER 7: PROLIFERACIJA HUMANIH VASKULARNIH ENDOTELNIH ĆELIJA, TESTOVI OBRAZOVANJA CEVI, MIGRACIJE I INVAZIJE

[0269] U ovom primeru, racemat se odnosi na 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion, R-enantiomer se odnosi na (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion i S-enantiomer se odnosi na (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion.

[0270] Test proliferacije na humanim vaskularnim endotelnim ćelijama pupčane vrpce: Za sve testove proliferacije, humane vaskularne endotelne ćelije pupčane vrpce su otopljene i gajene u EGM2 medijumu do pasaža 3 do 6. Humane umbilikalne vaskularne endotelne ćelije su tripsinizovane, oprane sa 20% FBS/M199 medijuma i zasejane sa istim medijumom pri gustini od 10<4>ćelija/100 µL po bunarčiću u ploče za ćelijsku kulturu od 96 bunarčića. Ploče su inkubirane preko noći na 37 °C kako bi se ćelijama omogućilo da se zalepe. Ćelije su zatim izgladnjavane u 1% FBS/M199 medijumu tokom 18 sati, nakon što su oprane istim medijumom 3 puta u cilju optimizacije koncentracije faktora rasta u HUVEC testu proliferacije, 100 µL/bunarčiću 2X serijski razblaženih faktora rasta, počevši od 100 ng/mL, dodavano je u HUVEC ćelije u duplikatu, na 72 sata i na 37 °C u vlažnom inkubatoru za ćelijsku kulturu sa 5% CO2. U cilju analize testiranih jedinjenja, od 10 mM stoka su napravljena serijska razblaženja testiranih jedinjenja u 0.4% DMSO/1% FBS/M199 medijumu u duplikatu. Pedeset mikrolitara po bunarčiću serijski razblaženih testiranih jedinjenja (10, 1.0, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 µM) dodato je u ćelije na 1 do 2 sata na 37 °C. Finalna koncentracija DMSO u ćelijama je 0.1%. Zatim je 50 µL od 4X finalne koncentracije odnosnih faktora rasta dodato u svaki bunarčić u duplikatu, na 72 sata i na 37 °C, u vlažnom inkubatoru za ćelijsku kulturu sa 5% CO2. Inkorporacija timidina je merena tako što je u svaki bunarčić dodat jedan mikrokiri 3H-timidina (Amersham) u 20 µL medijuma i inkubiran na 37 °C u vlažnom inkubatoru za ćelijsku kulturu sa 5% CO2, tokom 5 do 6 sati. Ćelije su zatim tripsinizovane i sakupljene na UniFilter GF/C filter ploče (Perkin Elmer) pomoću sakupljača ćelija (Tomtec). Pošto su ploče osušene na vazduhu, dodato je 20 µL/bunarćiću reagensa Microscint 20 (Packard) i zatim su ploče analizirane u instrumentu TopCount NXT (Packard). Svaki bunarčić je brojan tokom jednog minuta. Eksperimenti su izvedeni u duplikatu za svakog od 3 davaoca.

[0271] Test obrazovanja cevi na humanim vaskularnim endotelnim ćelijama pupčane vrpce: Jedinjenja su testirana u testu obrazovanja cevi, indukovanog faktorom rasta, na HUVEC ćelijama. Ploče za obrazovanje cevi su inkubirane 30 minuta na 37 °C kako bi matrigel polimerisao. HUVEC ćelije su izgladnjivane u bazalnom EBM2 medijumu sa 0.1% BSA tokom 5 sati, nakon ispiranja istim medijumom 3 puta. Ćelije su tripsinizovane i centrifugirane. Zatim je 25 µL 4X serijski razblaženih jedinjenja (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 µM) dodato u duplikatu sa 50 µL 2 x 10<4>ćelija/bunarčiću na ploče za obrazovanje cevi obložene matrigelom. Pedeset µL 4X VEGF (finalna koncentracija = 25 ng/mL) ili bFGF (finalna koncentracija = 10 ng/mL) dodato je pločama. Ćelije su zatim inkubirane preko noći (∼18 sati) na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Mreže cevi su obojene kalceinom AM pri koncentraciji od 4 µg/µL u 2% FBS/HBSS tokom 30 minuta i slike su napravljene pomoću fluorescentne mikroskopije. Površina cevi i dužina cevi su kvantifikovane pomoću softverskog programa za obrazovanje cevi MetaMorph.

[0272] Test invazije humanih vaskularnih endotelnih ćelija pupčane vrpce: U testu invazije HUVEC ćelija, koncentracija humanog fibronektina je optimizovana tako da obezbedi strukturu proteina pogodnu za vezivanje adherentnih ćelija za membranu i omogući slobodnu migraciju u odgovor na angiogeni stimulus (npr.. VEGF, bFGF ili HGF) u donjoj komori inserirane ploče. HUVEC ćelije su izgladnjivane u EBM2 medijumu sa 0.1% BSA tokom 6 sati, nakon ispiranja istim medijumom 3 puta. Ćelije su zatim tripsinizovane i centrifugirane da bi se uklonio zaostali tripsin. Zatim je u gornju komoru BD Falcon ploča sa 24 i 96 bunarčića sa insertima dodato ∼0.5 do 1 x 10<6>ćelija u 125 µL/bunarčiću i 125 µL 8X serijski razblaženih jedinjenja (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 µM) u duplikatu i inkubirano tokom ∼1 do 2 sata. (Ploče sadrže fluorescentni blok, mikroporoznu [veličina pore 3.0 µm] PET membranu koja je ravnomerno obložena humanim fibronektinom.) Sedam stotina pedeset mikrolitara 1.33 X stok rastvora VEGF (finalne koncentracije od 25 ng/mL), bFGF (finalne koncentracije od 10 ng/mL), ili HGF (finalne koncentracije od 25 ng/mL) dodato je zatim u donju komoru. Ćelije su inkubirane tokom 22 ± 1 sata na 37 °C. Ćelije koje su migrirale, obojene su pomoću kalceina AM u koncentraciji od 4 µg/mL, u HBSS koji sadrži 2% FBS, koristeći 500 µL/bunarčiću u pločama od 24 bunarčića i 200 µL/ bunarčiću u pločama od 96 bunarčića. Ploče su inkubirane 90 minuta na 37 °C i očitane na fluorescentnom čitaču za mikrotitar ploče.

[0273] Procentualna inhibicija proliferacije ćelija, obrazovanja cevi, migracije i invazije izračunata je oduzimanjem rezultata za nestimulisanu DMSO kontrolu od rezultata za testirane uzorke, računanjem srednje vrednosti ponovaka i normalizacijom prema DMSO kontroli (0% inhibicije) stimulisanoj faktorom rasta. IC50vrednosti su izračunavane upotrebom softvera GraphPad Prism 5.0.

[0274] Rezultati testa proliferacije humanih vaskularnih endotelnih ćelija pupčane vrpce: Rezultati iz studije optimizacije faktora rasta pokazali su da su optimalne concentracijeVEGF, bFGF i HGF za indukciju proliferacije iznosili 25, 10, i 25 ng/mL redom. Testirana jedinjenja su ispitivana sa optimizovanim koncentracijama faktora rasta i rezultati su pokazali da racemat, S-enantiomer i R-enantiomer nisu inhibirali proliferaciju HUVEC ćelija indukovanu sa VEGF, bFGF ili HGF (SL.39). Međutim postojalo je značajno pojačanje proliferacije uočeno u HUVEC ćelijama indukovanim sa VEGF i HGF, usled delovanja S-enantiomera (tretirane sa VEGF: 1 -10 µM; tretirane sa HGF: 0.1 - 1 µM). Postojalo je takođe značajno pojačanje uočeno u HUVEC ćelijama tretiranim sa bFGF, usled delovanja racemata (0.01 - 1 µM) i R-enantiomera (0.1 - 1 µM). Kratak pregled IC50vrednosti je dat u tabeli 7.

Tabela 7. Kratak pregled IC50vrednosti iz studija proliferacije humanih vaskularnih endotelnih ćelija pupčane vrpce, indukovanih faktorom rasta

[0275] Rezultati testa obrazovanja cevi na humanim vaskularnim endotelnim ćelijama pupčane vrpce: testirana jedinjenja prikazala su trend ka inhibiciji obrazovanja cevi od HUVEC ćelija, indukovanih sa VEGF, kako u smislu dužine cevi, tako i površine cevi (SL. 40). Sva jedinjenja prikazala su dozno zavisan efekat na obrazovanja cevi od HUVEC ćelija, indukovanih sa VEGF. R-enantiomer pokazao je značajnu inhibiciju (p < 0.05 nasuprot stimulisane DMSO kontrole) površine i dužine cevi pri 10 µM. Za jedinjenja je takođe postojao trend da inhibiraju obrazovanje cevi od HUVEC ćelija indukovanih sa bFGF, kako u smislu dužine cevi, tako i površine cevi (SL.40), premda je ovaj efekat bio manje izražen nego efekti na obrazovanja cevi od HUVEC ćelija, indukovanih sa VEGF.

[0276] Rezultati testa invazije humanih vaskularnih endotelnih ćelija pupčane vrpce: 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion, (R)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion i (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion značajno su inhibirali invaziju HUVEC ćelija, indukovanih sa VEGF, bFGF i HGF na dozno zavisan način (SL. 41). Jedinjenja su bila potentnija protiv invazije HUVEC ćelija indukovanih sa VEGF i bFGF nego protiv invazije HUVEC ćelija indukovanih sa HGF (tabela 8). IC50vrednost za inhibiciju invazije HUVEC ćelija indukovanih sa VEGF testiranim jedinjenjima je bila < 0.3 nM. IC50vrednosti racemata (0.4 nM) i S-enantiomera (< 0.1 nM) bile su više od 10 puta potentnije od R-enantiomera (13 nM) (tabela 8).

Tabela 8. Kratak pregled efekata testiranih jedinjenja na invaziju humanih vaskularnih endotelnih ćelija pupčane vrpce indukovanu faktorima rasta

6.8 PRIMER 8: STUDIJA NA MIŠIJEM MODELU LUPUSA/FIBROZE

[0277] U ovom primeru je senzitivnost (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona testirana u dva mišija soja sklona lupusu: MRL/MpJ-Faslpr/J mišijem modelu sistemskog eritemskog lupusa i NZBWF1/J mišijem modelu sistemskog eritemskog lupusa. Testirano jedinjenje je u oba modela primenjeno pri koncentraciji od 30 mg/kg.

[0278] U MRL/MpJ-Faslpr/J mišijem modelu sistemskog eritemskog lupusa, B ćelije periferne krvi nisu pokazale promenu u nedelji 4. B ćelije slezine su pokazale porast od 37%, a nivo autoantitela protiv dvolančane DNK pokazao je 25% smanjenja u nedelji 4.

[0279] U NZBWF1/J mišijem modelu sistemskog eritemskog lupusa, B ćelije periferne krvi pokazale su 25% smanjenja u nedelji 4, B ćelije slezine nisu pokazale promenu, a nivo autoantitela protiv dvolančane DNK pokazao je 86% porasta u nedelji 4.

6.9 PRIMER 9: STUDIJA NA MIŠIJEM MODELU DERMALNE FIBROZE

[0280] U ovom primeru, (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion je testiran u modelu kožne fibroze indukovane bleomicinom, upotrebom kako profilaktičkog tako i terapeutskog režima doziranja. Bleomicin je prevaziđeno antikancersko terapeutsko sredstvo za koje je pokazano da izaziva fibrozu u plućima. U životinjskim modelima će slično dovesti do oštećenja i fibroze na mestu dostave.

[0281] U ovom primeru se koriste sledeće skraćenice:

[0282] U ovoj studiji su korišćeni DBA/2 miševi. U studiji je za svaku grupu po tretmanu korišćeno osam životinja. Miševi su čuvani u vivarijumu u standardnim uslovima, a hrana i voda su im stalno bile dostupne.

[0283] Vehikulum, 0.5% karboksimetil celuloza (CMC)/0.25% Tween 80, pripremljen je u destilovanoj H2O i rastvoren preko noći na magnetnoj mešalici (dodato je 0.5g CMC; Sigma #C9481) i 0.25ml Tween 80 (Sigma #P8074) u 99.75 ml kako bi se napravilo ukupno 100 ml 0.5% CMC/0.25% Tween 80).

[0284] Testirano jedinjenje u prahu je odmereno i svakodnevno sveže suspendovano u vehikulumu 0.5% CMC/0.25% Tween 80, kako bi se izbegla hidroliza leka u vodenom medijumu. Jedinjenje je suspendovano, ne rastvoreno, u ovom vehikulumu. Formulacija je homogenizovana pomoću teflonskog avana sa tučkom (Potter-Elvehjem homogenizer) uz pomoć tkivnog homogenizera sa motorom kompanije Eberbach. Koncentracija stoka leka koji je svakodnevno korišćen u ovim studijama iznosila je 3 mg/ml.

[0285] Bleomicin je nabavljen od apoteke Univerziteta u Erlangen-Nirmbergu i pripreman je svež jednom nedeljno. Kožna fibroza je indukovana u 6 meseci starim DBA miševima lokalnim intrakutanim injekcijama od 100 µl bleomicina rastvorenim u 0.9% NaCl, u koncentracijama od 0.5 mg/ml, svaki drugi dan, u definisanim oblastima od 1.5 cm<2>u gornjem delu leđa.

6.9.1 Dizajn studije

[0286] Mišiji model bleomicinom indukovane dermalne fibroze rasprostranjeno se koristi za procenu anti-fibroznih terapeutskih sredstava. U ovom modelu, lokalizovana dermalna fibroza se indukuje intradermalnim injekcijama bleomicina, svaki drugi dan, tokom 3 nedelje. Ovaj model liči na rane, zapaljenske stadijume SSc. Kako bi se ocenili potencijalni efekti na prevenciju fibroze, tretman je iniciran simultano sa prvom injekcijom bleomicina. Kako bi se proučavao efekat testiranog jedinjenja na prevenciju dermalne fibroze indukovane bleomicinom in vivo, tretmani su podeljeni u sledeće grupe:

• Kontrolna grupa: Intradermalna injekcija NaCl tokom 3 nedelje. Tretman se sastojao od primene vehikuluma (0.5% CMC/0.25% Tween 80).

• Grupa indukovana bleomicinom: Intradermalna injekcija bleomicina tokom tri nedelje.

Primena vehikuluma (0.5% CMC/0.25% Tween 80).

• Grupa testiranog jedinjenja: Intradermalna injekcija bleomicina tokom tri nedelje.

Testirano jedinjenje je primenjeno pri 30 mg/kg; PO, QD.

• Grupa pozitivne kontrole: Intradermalna injekcija bleomicina tokom tri nedelje. Injekcija imatiniba (50 mg/kg; IP, QD). Za imatinib mezilat je prethodno pokazano da ispoljava potentne anti-fibrozne efekte u dermalnoj fibrozi indukovanoj bleomicinom. Videti Akhmetshina A. et al., Arthritis Rheum 2009; 60(1):219-224.

[0287] Kako bi se ocenila regresija fibroze, korišćen je modifikovani model dermalne fibroze indukovane bleomicinom. Miševi su inicijalno tretirani bleomicinom kako bi se indukovala robusna kožna fibroza. Jedna grupa je dobijala tretman testiranim jedinjenjem, dok se tretman bleomicinom nastavio dodatne tri nedelje. Ishod ove grupe je poređen sa miševima koji su tretirani bleomicinom tokom šest nedelja (prevencija dalje progresije) i sa miševima koji su tretirani bleomicinom tokom tri nedelje, a nakon toga sa NaCl dodatne tri nedelje (indukcija regresije). U studiji regresije su korišćene sledeće grupe:

• Kontrolna grupa: Intradermalna injekcija NaCl tokom šest nedelja. Kontrolni tretman se sastojao od primene vehikuluma.

• Netretirana grupa indukovana bleomicinom 1 (regresija): Intradermalna injekcija bleomicina tokom tri nedelje, a nakon toga NaCl još tri nedelje. Tretman se sastojao od primene vehikuluma. Netretirana grupa indukovana bleomicinom 2 (prevencija progresije): Intradermalna injekcija tokom šest nedelja. Tretman se sastojao od primene vehikuluma.

• Grupa testiranog jedinjenja: Intradermalna injekcija bleomicina tokom šest nedelja.

Testirano jedinjenje je primenjeno pri 30 mg/kg; PO, QD.

• Grupa pozitivne kontrole: Intradermalna injekcija bleomicina tokom šest nedelja.

Injekcija imatiniba (50 mg/kg; IP, QD)

6.9.2 Eksperimentalna procedura

[0288] Dermalna debljina je određena hematoksilinom i eozinom, a aktivirani fibroblasti upotrebom imunohistohemije za alfa aktin glatkih mišića (α-SMA). Dermalna debljina, određena pomoću modifikovanog skora kože po Rodnanu, trenutno je najčešći primarni ishod u kliničkim ispitivanjima anti-fibroznih sredstava na ljudima u SSc. Preseci kože su obojeni hematoksilinom/eozinom radi bolje vizuelizacije strukture tkiva. Dermalna debljina je analizirana pomoću mikroskopa Nikon Eclipse 80i (Nikon, Badhoevedorp, Nizozemska) merenjem maksimalnog rastojanja između epidermalno-dermalne veze i veze između dermisa i potkožnog masnog tkiva za 4 različita preseka kože kod svakog miša. Ocenjivanje su sprovela 2 različita ispitivača.

[0289] Za kvantitativno određivanje miofibroblasta, preseci kože su deparafinisani i inkubirani 60 minuta sa 5% goveđim serumskim albuminom. Ćelije pozitivne za α-SMA detektovane su inkubacijom sa monoklonskim anti-α-SMA antitelima (klon 1A4; Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemačka) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi nakon koje je sledila inkubacija od 10 minuta sa 3% vodonik peroksidom. Kozija anti-zečija antitela obeležena peroksidazom rena (Dako, Hamburg, Nemačka) korišćena su kao sekundarna antitela. Ekspresija α-SMA vizuelizovana je pomoću 3,3-diaminobenzidin tetrahidrohlorida (Sigma-Aldrich). Monoklonska mišija IgG antitela (Calbiochem, San Diego, CA) korišćena su kao kontrole.

[0290] Pored toga, količina kolagena u koži u predelu lezija biće izmerena pomoću testa za kolagen SirCol; RNK i plazma svih miševa sačuvane su za dodatne analize.

[0291] Testirano jedinjenje značajno smanjuje dermalnu debljinu kože u predelu lezija u mišijem modelu bleomicinske dermalne fibroze. Testirano jedinjenje pri koncentraciji od 30 mg/kg; PO, QD značajno je sprečilo dermalno zadebljavanje za približno 25 ± 0.49 % (p < 0.001, SL.42).

[0292] Reprezentativne fotomikrografije preseka kože obojenih hematoksilinom i eozinom prikazane su na SL. 43. Dermalna debljina je procenjena merenjem maksimalnog rastojanja između epidermalno-dermalne veze i veze između dermisa i potkožnog masnog tkiva. Linija povučena između tačaka u kojima su ostvarene veze pokazuje relativnu debljinu u tretiranim grupama.

[0293] Kako bi se odredio efekat tretmana na aktivaciju fibroblasta, α-SMA miofibroblasti su izbrojani u presecima kože u oblasti lezija. Kao što je prikazano na SL. 44, testirano jedinjenje pri koncentraciji od 30 mg/kg; PO, QD, smanjilo je broj miofibroblasta za 24 ± 0.09 % (p < 0.05). Imatinib je pri koncentraciji od 50 mg/kg smanjio dermalno zadebljanje za 60 ± 0.34 % (p < 0.0001) i broj miofibroblasta za 81 ± 0.11% (p < 0.0001).

6.9.3 Efekat na regresiju dermalne fibroze indukovane bleomicinom

[0294] Inhibitorni efekti testiranog jedinjenja na progresiju fibroze takođe su potvrđeni u modifikovanom bleomicinskom modelu dizajniranom u cilju ispitivanja potencijalne regresije fibroze. Kao što je prikazano na SL. 45, testirano jedinjenje pri 30 mg/kg; PO, QD, nije imalo efekta na dermalno zadebljavanje u modelu regresije. SL. 46 prikazuje fotomikrografije reprezentativnih preseka kože obojenih hematoksilinom i eozinom. Dermalna debljina je procenjena merenjem maksimalnog rastojanja između epidermalno-dermalne veze i veze između dermisa i potkožnog masnog tkiva. Linija povučena između tačaka u kojima su ostvarene veze pokazuje relativnu debljinu u tretiranim grupama. SL. 47 pokazuje da testirano jedinjenje nije imalo efekta na brojeve miofibroblasta. Imatinib pri koncentraciji od 50 mg/kg smanjio je dermalnu debljina indukovanu bleomicinom za 50 ± 0.3 % (p < 0.0001) i brojeve miofibroblasta za 78 ± 0.15 % (p < 0.0001).

6.10 PRIMER 10: EFEKTI U MIŠIJEM MODELU TSK-1

1

[0295] Antifibrozni efekti (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona testirani su u modelu miša mišije zategnute kože-1 (Tsk-1).

[0296] Najpre su takođe ispitani inhibitorni efekti jedinjenja na fibrozu u mišijem modelu zategnute kože Tsk-1. Kao što je prikazano na slici 48, jedinjenje je pri koncentraciji od 30 mg/kg smanjilo hipodermalno zadebljavanje za 45% (p ≤ 0.001), u poređenju sa smanjenjem od 58% sa imatinibom pri 50 mg/kg (p ≤ 0.001). Povišeni sadržaj kolagena u koži, meren preko nivoa hidroksiprolina, bio je smanjen 38% jedinjenjem, i 67% imatinibom (p ≤ 0.001).

[0297] Sledeće je, u cilju ispitivanja efekta jedinjenja na prekomernu ekspresiju gena TGF-β signalnog puta u Tsk-1 mišijoj koži, qRT-PCR upotrebljen kako bi se izmerili nivoi mRNK za šest gena: CTGF, PAI-1, COL1A1, α-aktin glatkih mišić (ALFA SMA), oligomerni protein hrskavice 1 (COMP) i TGFB1. Prekomerna ekspresija je definisana kao višak nivoa mRNK koji se zapažaju u Tsk-1 mišijoj koži u poređenju sa normalnom pa/pa mišijom kožom. Od ovih šest gena, samo četiri (CTGF, PAI-1, COL1A1, i TGFB1) su bila eksprimirana u značajno višem nivou u Tsk-1 u poređenju sa normalnim pa/pa miševima. Jedinjenje (30 mg/kg) je značajno smanjilo prekomernu ekspresiju CTGF i COL1A1 za 79% (p < 0.001) i 129% (p < 0.001), redom (slika 49). Prekomerna ekspresija PAI-1 i TGFB1 gena nije bila inhibirana jedinjenjem. Ovi rezultati su pokazali da jedinjenje može da smanji kožnu fibrozu blokiranjem prekomerne ekspresije nekih profibroznih gena u okviru TGF-β signalnog puta.

[0298] Kako bi se dodatno ispitao efekat jedinjenja na ekspresiju fibroznih gena normalnih ćelija (NL) i ćelija sistemske skleroze (SSc), praćene su sledeće procedure:

Ćelijske kulture: Fibroblasti normalne humane kože i sklerotične kože gajeni su u DMEM medijumu koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Ćelije su održavane u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2, i 95% vazduha, na 37 °C. Nakon što je dostignuta konfluentnost, ćelije su sakupljane pomoću 0.05% tripsina i ponovo zasejavane. Ćelije su korišćene u 3. - 5 pasažu.

Dizajn eksperimenta: Ćelije su gajene do konfluentnosti od 70-80% i prebačene u stanje mirovanja smanjenjem koncentrcije seruma na 0.4% preko noći. testirani su efekti jedinjenja na fibrozne efekte TGFβ i na ekspresiju fibroznih gena u NL i SSc.

Efekti ekspresije fibroznih gena na indukciju putem TGFβ: NL fibroblasti su pripremno tretirani 30 minuta jedinjenjem, nakon čega je dodat TGF-β1 kako bi se posmatrali efekti jedinjenja na ekspresiju fibroznih gena, indukovanu putem TGFβ.

Efekti jedinjenja na SSc-FB: SSc fibrobasts were treated with the jedinjenjem u različitim koncentracijama i 24 sata kasnije, real-time PCR metodom, određeni su nivoi genske ekspresije kolagena 1A1 (COL1), α-aktina glatkih mišića (α-SMA), fibronektina (FN),

2

matriksne metalopeptidaze 1 (MMP1), inhivitora aktivatora plazminogena (PAI), i DNK (citozin-5-)-metiltransferaze 1(Dnmt1).

Kvantitativni real-time PCR: Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija upotrebom kita RNeasy. Koncentracija RNK je izmerena i 1ug RNK je reverzno transkribovan u cDNK upotrebom kita RT-First strand. cDNK je zatim amplifikovana upotrebom respektivnih prajmera i master smeše za PCR, Power SYBR Green. Amplikon (150-200bp) je detektovan sistemom za real-time PCR ABI 7500. Svi ciljni geni normalizovani su prema GAPDH i izračunati su relativni nivoi promene. Svaki uzorak je procenjen u triplikatu.

[0299] Kao što je prikazano na slici 50, jedinjenje je na dozno zavisan način snizilo ekspresiju mRNK za COL1, aSMA i FN u SSc fibroblastima. Slično tome, ekspresija PAI (Slika 51) i Dnmt1 (slika 52) takođe je na dozno zavisan način bila snižena pomoću jedinjenja u SSc fibroblastima. Kao što je takođe prikazano na slici 51, ekspresija MMP-1 je na dozno zavisan način bila povišena pomoću jedinjenja u SSc fibroblastima. Rezultati pokazuju da jedinjenje potentno reguliše ključne faktore fibroze, pokazujući efikasnost jedinjenja u lečenju SSc.

[0300] Osim toga, ispitivani su nivoi cereblona u normalnim i SSc fibroblastima i tkivima kože. Kao što je prikazano na slikama 53 i 54, povišeni nivoi cereblona u poređenju sa normalnim tkivima uočeni su kako u SSc fibroblastima, tako i u tkivima kože. Ovo ukazuje na to da je u SSc umešan povišen nivo cereblona.

6.11 PRIMER 11: CEREBLON KAO CILJNI MOLEKUL ZA B ĆELIJSKU DISKRAZIJU

[0301] Profilisan je efekat (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-diona (“jedinjenje IA”) na vezivanje CRBN, ubikvitinaciju i ćelijsku proliferaciju. CRBN je komponenta E3 ubikvitin ligaznog kompleksa uključujući CUL4A, DDB1 i ROC-1 i otkriveno je da predstavlja ciljni molekul za vezivanje talidomida, lenalidomida i pomalidomida.

[0302] Studije vezivanja za CRBN sprovedene su upotrebom zrnaca sa konjugovanim analogom talidomida, u kompetitivnom testu. Endogeni CRBN iz humanih ćelija U266 multiplog mijeloma (“MM”) meren je tako što su ćelijski ekstrakti inkubirani sa varirajućim koncentracijama ili jedinjenja IA ili pomalidomida u funkciji pozitivne kontrole. Afinitetna zrnca kuplovana sa kiselim analogom talidomida inkubirana su sa ekstraktima U266 i, nakon intenzivnog ispiranja zrnaca, vezani proteini su eluirani. Vezivanje CRBN za afinitetna zrnca kuplovana sa talidomidom utvrđeno je kvantitativnim određivanjem CRBN imunoblota.

[0303] Ubikvitinacija CRBN merena je u HEK293T ćelije, koje su transfektovane pomoću CRBN konstrukta koji je na amino kraju obeležen His-biotinom, zatim preinkubirane sa jedinjenjima tokom jednog sata, a nakon toga tretirane inhibitorom proteazoma MG132 (kako bi se zaustavila degradacija ubikvitiranih proteina). Ćelije su lizirane i obrađene kako bi se merila ubikvitinacija CRBN putem SDS-PAGE i imunoblot analize, upotrebom anti-ubikvitinskog antitela. Studije ćelijske proliferacije su sprovedena u lenalidomid-senzitivnim i refraktornim ćelijama multiplog mijeloma. Lenalidomid-rezistentne ili senzitivne H929 MM ćelijske linije tretirane su jedinjenjem IA 5 dana, a zatim su proliferacija i vijabilnost ćelija ocenjene pomoću bojenja 7-aminoaktinomicinom D (“7-ADD”). Kostimulacija T-ćelija je merena u prečišćenim primarnim humanim T ćelijama koje su stimulisane upotrebom imobilisanog anti-CD3 antitela u ćelijskoj kulturi tokom 2 dana, i sekrecija citokina je merena ELISA testom.

[0304] Proizvodnja imunoglobulina M i G (“IgG i IgM”) merena je iz mononuklearnih ćelija periferne krvi normalnih davalaca gajenjem kulture u prisustvu faktora diferencijacije B ćelija, rekombinantnog humanog IL-2 (20U/mL), IL-10 (50ng/mL), IL-15 (10ng/mL), His-obeleženog CD40 liganda (50ng/mL), polihistidinskog mišijeg IgG1 antitela (5µg/mL), i liganda ODN 2006-humanog TLR9 (10µg/mL) tokom 4 dana, a zatim sa IL-2, IL-10, IL-15 i IL-6 (50ng/mL) dodatna 3 dana. IgM i IgG su mereni ELISA testom.

[0305] U studijama kompetitivnog vezivanja CRBN, preinkubacija sa pomalidomidom pri koncentraciji od 3uM dovela je do približno 50% manje CRBN vezanog za afinitetna zrnca, dok je jedinjenje IA pri koncentraciji od 0.1µM dovelo do sličnog vezivanja CRBN. Studije ubikvitinacije CRBN u transfektovanim HEK293T ćelijama dovelo je do sledećih potencija: jedinjenje IA IC50=0.19µM; lenalidomid IC50=12.9µM; i pomalidomid IC50=21.6µM. IC50vrednosti za inhibiciju proliferacije jedinjenjem IA pomerile su se od 0.01µM u parentalnoj H929 ćelijskoj liniji i 0.04µM u subklonu tretiranom sa DMSO do 0.51-1.58µM u subklonovima rezistentnim na lenalidomid.

[0306] 50% smanjenja u ćelijskom ciklusu (S-fazi) bilo je očigledno nakon 24 sata tretmana H929 ćelija jedinjenjem IA. Posle 48 sati, jedinjenje IA smanjilo je ekspresiju survivina i proteina retinoblastoma (“pRB”) i povećalo ekspresiju ciklin-zavisnog kinaznog inhibitora p27. Jedinjenje IA kostimulisalo je proizvodnju IL-2 u T ćelijama sa EC50od približno 0.29nM, u poređenju sa 10nM za pomalidomid. Jedinjenje IA inhibiralo je proizvodnju IgM i IgG sa IC50od 0.35 i 2.1nM, redom, u poređenju sa 17nM i 63nM za pomalidomid.

[0307] Rezultati pokazuju da se jedinjenje IA vezuje za CRBN sa približno 30 puta višim afinitetom nego pomalidomid i inhibira ubikvitinaciju CRBN u ovom sistemu sa približno 110 puta većom potencijom nego pomalidomid. Jedinjenje IA je približno 34 puta potentnije od pomalidomida za kostimulaciju proizvodnje IL-2 u T ćelijama i 30 do 48 puta potentnije od pomalidomida za inhibiciju proizvodnje imunoglobulina.

4

6.12 PRIMER 12: INHIBICIJA DIFERENCIJACIJE B ĆELIJA U LINIJU PLAZMABLASTA I PLAZMA ĆELIJA

[0308] Efekti ciljanog vezivanja za cereblon (“CRBN”) na diferencijaciju B ćelija u ćelijske linije plazmablasta i plazma ćelija, in vitro model diferencijacije primarnih humanih B ćelija je razvijen.

[0309] CD19+ humane B ćelije periferne krvi, dobijene od normalnih davalaca, ili ukupne mononuklearne ćelije periferne krvi, PBMC ćelije, pacijenata sa sistemskim eritemskim lupusom (“SLE”), gajene su u prisustvu interleukina IL-10, IL15, TLR9 agonista i CD40L, tokom 4 dana, a zatim IL-2, IL-6, IL-10 i IL-15 tokom još 3 dana. Ćelije su brojane, vijabilnost ocenjena i ekspresija CD20, CD38, CD44 i CD83 merena pomoću protočne citometrije. Plazmablastne linije IRF-4, BLIMP-1, XBP-1 i IgJ, i markeri germinativnog centra, PAX-5 i BCL-6 mereni su pomoću qRT-PCR. Ekspresija intracelularnih proteina je merena laserskom skenirajućom citometrijom. Sekretovani imunoglobulini IgG i IgM mereni su ELISA testom.

[0310] U kulturama normalnih B ćelija, (S)-3-(4-((4-morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-dion (“jedinjenje I-S”) je smanjio procenat ukupnog broja vijabilnih ćelija u ovim kulturama nakon 4 dana na 69.6% (P≤0.05) ili 35.8% kontrole (P≤0.001) pri 20nM ili 200nM jedinjenje I-S, redom. Jedinjenje I-S smanjilo je procenat vijabilnih CD20-CD38+ plazmablasta na dan 7 od 30.4% u kontrolnim kulturama, na dozno-zavisan način, na 27.3%, 2.1% i 0.4% pri 2nM, 20nM i 200nM, redom. Na dan 7, qRT-PCR analiza je pokazala da je jedinjenje I-S (20nM) snizilo gensku ekspresiju faktora plazmablastne linije, IRF-4, BLIMP-1, XBP-1 i IgJ na 20.5%, 14.3%, 15.1% i 31.5% kontrole, redom (P≤0.001).

[0311] Intacelularnom protočnom citometrijom je pokazano da je jedinjenje I-S (20nM) značajno smanjilo ekspresiju proteina IRF-4 (P<0.5), BLIMP-1 (P<0.05) i XBP-1 (P<0.05) na dan 4, ali je značajno je povećalo ekspresiju proteina BCL-6 (P<0.05) na dan 7. Laserskom skenirajućom citometrijom na dan 7, jedinjenje I-S (20nM) smanjilo je intracelularnu proteinsku ekspresiju IRF-4 (P≤0.001) i BLIMP-1 (P≤0.001) kod CD38+ plazmablasta, i povećalo eskpresiju BCL-6 (P≤0.05) (n=3). Jedinjenje I-S inhibiralo je proizvodnju sekretovanog IgG sa IC50= 1.8nM (n=3).

[0312] U PBMC ćelijama SLE pacijenata, jedinjenje I-S (20nM) imalo je slične efekte kao i u normalnim B ćelijama, smanjujući gensku ekspresiju BLIMP-1, XBP-1 i IgJ na 52.8%, 49.2% i 13.6% kontrole, redom (P≤0.001) (n=3). Jedinjenje I-S (20nM) značajno je smanjilo intracelularnu proteinsku ekspresiju BLIMP-1 (P≤0.01) i IRF-4 (P≤0.001) kod CD38+ plazmablasta, i povećalo BCL-6 (P≤0.05) (n=3). Jedinjenje I-S inhibiralo je proizvodnju sekretovanog IgM i IgG u PBMC ćelijama SLE pacijenata sa IC50vrednostima od 0.9nM i 3.2nM, redom (n=3).

[0313] Ovi rezultati pokazuju da ciljano delovanje na koreceptorni supstrat E3 ubikvitin ligaznog kompleksa, CRBN, imunomodulatornim jedinjenjem malog molekula kao što je jedinjenje I-S, dovodi do potentne inhibicije diferencijacije B ćelija u plazmablastnu liniju, kao što je pokazano smanjenjem procenta vijabilnih CD38+ ćelija, smanjenjem ekspresije gena i proteina BLIMP-1, XBP-1, IRF-4 i IgJ i inhibicijom proizvodnje sekretovanih imunoglobulina. Ovi podaci ukazuju da je kompleks CUL4-CRBN uključen u diferencijaciju B ćelija u liniju plazma ćelija.

[0314] Obim predmetnog pronalaska ne bi trebalo da bude ograničen specifičnim primerima izvođenja koji su ovde opisani. I zaista, različite modifikacije pronalaska, uz modifikacije koje su opisane, postaće očigledne stručnjacima u oblasti, na osnovu prethodno datog opisa i pratećih slika. Ovakve modifikacije treba da spadaju u obim pridruženih patentnih zahteva.

�

Claims (14)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje za upotrebu u postupku lečenja, prevencije ili praćenja imunske bolesti ili zapaljenske bolesti, naznačeno time što postupak sadrži primenu, kod pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine navedenog jedinjenja, i gde jedinjenje predstavlja jedinjenje formule I

   ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat, hidrat, stereoizomer, tautomer ili racemsku smešu, i pri čemu je bolest lupus, skleroderma, lupus pernio, sarkoidoza, Sjegrenov sindrom, ANCA pozitivan vaskulitis, anti-fosfolipidni sindrom ili mijastenija gravis.
2. 2. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je bolest sistemski eritemski lupus, kožni eritemski lupus, skleroderma, lupus pernio, sarkoidoza ili Sjegrenov sindrom.
3. 3. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je bolest sistemski eritemski lupus.
4. 4. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je sistemski eritemski lupus težak sistemski eritemski lupus.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je bolest kožni eritemski lupus.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je bolest skleroderma. 2
7. 7. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time što je skleroderma lokalizovana, sistemska, ograničena ili difuzna skleroderma.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što sistemska skleroderma sadrži CREST sindrom.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je bolest Sjegrenov sindrom.
10. 10. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačeno time što je jedinjenje (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion, formule IA

    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, hidrat, ili tautomer.
11. 11. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačeno time što je jedinjenje (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion.
12. 12. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačeno time što je jedinjenje (S)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenziloksi)-1-okso-1,3-dihidro-izoindo-2-il]piperidin-2,6-dion hidrohlorid.
13. 13. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time što postupak dodatno sadrži primenu drugog aktivnog sredstva, koje predstavlja antizapaljensko ili imunomodulatorno jedinjenje.
14. 14. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, naznačeno time što efikasna količina navedenog jedinjenja iznosi oko 0.005 mg/kg do oko 10 mg/kg telesne težine pacijenta. 4