PT984023E - Molécula da superfície celular que medeia a adesão celular e a transmissão de sinal - Google Patents

Description

Descrição "Molécula da superfície celular que medeia a adesão celular e a transmissão de sinal A presente invenção diz respeito a covas moléculas da superfície celular dos seres humanos, a polipéptidos e aos seus fragmentos que constituem as moléculas, a genes codificadores dos polipéptidos e dos seus fragmentos, diz respeito aos vectores que compreendem os genes, a transf orrnantes em que os vectores são introduzidos, anticorpos que possuem reactividade em relação aos polipéptidos ou moléculas da superfície celular compreendendo os polipéptidos e os seus fragmentos. d invenção diz também respeito a composições compreendendo os anticorpos e aos seus usos e a células que produzem o anticorpo.

Um organismo vivo de um mamífero possui sistemas de resposta imunitários que excluem microrganismos patogénicos (virus, bactérias, parasitas, etc.) ou corpos estranhos que invadem o organismo vivo (seguidamente ambos são designados como "antigenios"). Um deles é chamado sistema de resposta imunitária natural e o outro sistema de resposta imunitária adquirida. 0 primeiro i um mecanismo de exclusão que compreende a fagocitose por fagócitos (leucócitos polimorfonucleares, monócitos, macrófagos etc.), ataque por células assassinas naturais (NK -em inglês, natural kíller cells) , e reconhecimento não específico, tal como opscnização de antigenios por complementos. 0 último, sistema de resposta imunitária adquirida, é um mecanismo de exclusão pelos líníócítos (princípalmente,

antíqénio f linfócitos activados) Células B que adquiriram especificidade para o antigénio atacam o antigénio que existe fora das células através da produção de anticorpos específicos para o antigénio. As células T que adquiriram especificidade para o antigénio (nomeadamente, células 1; activadas) são classificadas em cálcios 1' au>;:ili.arfíí5 e células T citotóxícas í liniódi ioó cítotóxiccs, CTL, do inglês cytotoxic lymphocyte). As células auxiliares T regulam a diferenciação de células B e a produção de anticorpos, e destroem o antigénio cooperando com os fagócitos. Os últimos, os atacam as células infectadas com vírus etc. por elas próprias (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Bío Science Term Library, Immuníty", Yodosha, pag. 14-17 (1995)·,

Esta aquisição de especificidade do antigénio pelas células T (nomeadamente activação das células T) é iniciada através do reconhecimento do antigénio apresentado pelas células que apresentam antigénios (APC, do inglês antigen-presenting cells) pelas células T, tais como macrófagos, células B, ou células dendríticas. As células que apresentam antigénios processam os antigénios incorporados deste modo e apresentam estes antigénios processados ligando-os ao maior complexo de histocompatibilidade (MHC, do inglês major histocompatibility complex). As células T recebem o sinal primário para activação das células (ou aquisição de especificidade), através do reconhecimento dos antigénios processados apresentados por células que apresentam antigénios, através de um complexo entre o receptor das células T (TcR do inglês T cell receptor) e antigénio C03 que existe â superfície da membrana celular (complexo TcR/CD3).

Contudo, o sinal primário mediado pelo complexo TcR/CD3 sózi riho não pode activar as células T suficientemente e conduz a urra não resposta ou anergia clonal, de modo que as célula® não ροή#;®; reagir com qualquer estímulo recebido r :r 1 crSCrmuC':.·::·., A autocrina ou ínterleucína i (11,—2) é necessária para as células T serem ^otivadas, para serem diferenciadas em clones de células T especificas do antigénio, e serem proliferadas. Na anergia clonal células T estão inactivadas devido a não existir produção de IL-2 e divisão celular. Nomeadamente, a activação de células T acompanhada pela produção de citocinas, tais como IL-2 necessita de um sinal secundário seguido pelo primeiro sinal através do complexo TcR/CD3. A este sinal seccndário é chamado sinal coestimulatório. As células T recebem este sinal secundário e transmitem-no para as células interagindo com moléculas (adesão celular) diferentes de em células que apresentam um antigénio através de moléculas diferentes do complexo TcR/CD3 a superfície da célula T. Este sinal secundário evita a anergia da célula (anergia clonal) e activa as células.

Apesar de parte do mecanismo da transmissão do sinal secundário entre células que apresentam o antigénio e linfócitos tais como células T não ter sido ainda esclarecido em detalhe, os estudos revelaram até agora que um factor importante para a transmissão do sinal secundário é a interacção de CD28 (também referida como Tp44, T44, ou antigénio 9,3) que é uma molécula da superfície celular expressa principalmente em células T e células do timo, com CD80 (também designado como B7-1, B7, BB1, ou que é uma molécula da superfície celular expressa em células que apresentam antigénios (macrófagos, monócitos, células dendríticas, etc.; e com CD86 (também referida como 97-2 ou E3 0};, que é também uma molécula da superfície celular em células que apresentam antigénios (nomeadamente, adesão celular, através da ligação entre estas moléculas). MÁm disso, foi elucidado experimentalmente que a interacção com o antigénio 4 associado ao línfócito T c;:c:òil cuco (CTLA-4, dm inglês cytolytic T lymphocyte iusaccgiutgd antigen 4), cuja expressão se pensa que é reforçada dependendo do sinal secundário, com o CD8Q {B7-1) e CD86 (B7-2) (noir.eadamente, adesão celular, através da ligação entre estas moléculas) também desempenha um papel importante na regulação da activação de células T pelo sinal secundário. Por outras palavras, a regulação da activação das células T, através da transmissão do sinal secundário, envolve pelo menos a interacção entre C028 e CD80/CD86, o reforço da expressão de CTLA-4, que se pensa que depende da interacção, e da interacção entre CTLA-4 e C!.t·· C /CDt t,

Sabe-se que o C028 é uma molécula co-estimuladora que transmite o sinal secundário (sinal de co-estimulação) necessário para a activação de células T e para evitar a anergia. O sinal secundário transmitido através da iigsçâo desta molécula a moléculas de co-estimulação, CDSO (B7-1) e C086 (B7-2), em células que apresentam antigénios (adesão celular através da ligação entre estas moléculas) estabiliza o mARN das citocinas do tipo Thl e promove consequentemente a produção de células T de uma grande quantidade de citocinas do tipo Th-1, tais como 11-2, IFNy, e TNFa. A expressão de CTLA-4 è induzida pelo sinal primário induzido transmitido através de TcR/CD3, e a expressão i também reforçada pelo sinal secundário transmitido pela ligação entre CD28 e CD80. Foi revelado φΤί' o CTLA-4 recebe estes sinais para funcionar para inibir a função da célula T, o que é o oposto a activação das células T pelo sinal secundário transmitido por CD28. 0 C028 humano e o CTLA-4 são glicoproteinas do tipo I, cujos pesos moleculares são de 44 KD e 41 a 43 kD, respectivamente. Ambos possuem um domínio do tipo imunoglobulina, pertencem à superfamília da imunoglobulina, e possuem ambos a função de coiécoi de adesão celular e fcççiçnçís como uma molécula de u de sinal. O C328 humano forma um homodimero com uma ligação díssulfureto, enquanto que o CTLA-4 existe como um Tanto os genes CD2S e CTLA-4 estão localizados no "2g33" no cromossoma humano e "1C" no cromossoma do rato, e são constituídos por (4) exões. O CD28 humano e o CTLA-4 são ttòiip&íéZ&B por 220 e 223 aminoácídos, respectivamente, incluindo as sequências leader, e homclogia entre aminoácídos e entre 20 a 30%. Os iigandos para CD28 e CSLA-4 são CD80 (37-1) e CD86 (B7-2) em seres humanos e ratinhos. 3 L - possui uma afinidade de cerca de 20 vezes mais elevada para ambos os Iigandos que o CD28. Foi esclarecido que as estruturas das sequências de aminoácídos "MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)" conservada na espécie animal é importante para a ligação de CD28 e GTLA-4 a CD80 (B7-1). Foi também reportado, que quando o CD28 é estimulado, a cinase P13 (fosfoinositideo 3 cinase, PI3K -do inglês, phosphoinositide 3 kinase) se associa com o resíduo de tirosina fosforílado numa sequência parcial "YMNM (Tyr-Met-Asn-Met)" de CD28 e esse CD28 desempenha um papel importante na transmissão intracelular do sinal, através dessa estrutura "YxxM". Além disso, foi reportado que o CTLA-4 possui também uma sequência representada por "YVKM (Tyr-Val-Lys-Met)" na sua região eítoplásmíca, e que após ter sido estimulado, o SYP associa-se com esta sequência. O CD28 é expresso especificamente em timócitos em células periféricas sanguíneas T, e o CTLA-4 é expresso especificamente em células T activadas (Cell Engineering: SUPPLEMENT, "Handbook of Adhesion Molecule", Shujunsha, pág. 93-102 (1994); ibid. Pág. 120-136; Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "BIO SCIENCE Term Library, Immunity", Yodosha, pág. 94-98 (1995); Experimental Medicine: SUPPLEMENT, »WtÚ SCIENCE Term Library, Intracellular Signal Transduction", Yodosha, pág. 58-59 (1997); Nihon Rinsho, vol. 55, N° 6, pág. 215-220 (1997)1.

Na regalapgp da re;r; L · da célula T (a ar e inibição da função das células f|., a importância das interacções entre múltiplas moléculas tais como moléculas co-estimuladoras (CD28, CD80 (B7-1), C086 (B7-2), etc.) e CTLA-4, que coopera com êXm foi assim reconhecida (por outras palavras a adesão celular através da ligação entre estas moléculas), e isto chamou a atenção para a relação entre estas moléculas e doenças, e para o tratamento de doenças através da reguiação da função destas moléculas.

Como descrito acima, apesar de um organismo vivo activar o seu sistema de resposta imunitária contra antigénios que são corpos estranhos em relação ao (próprio) organismo vivo possui também tolerância imunológica de modo a não apresentar nenhuma resposta imunitária contra o seu próprio componente (autoantigénio). Se a tolerância imunológica falhar por qualquer razão, ocorre a resposta imunitária para o autoantigénio, células T reactivas para o auto-antigénio são induzidas através do mesmo mecanismo como mencionado acima para cair num estado anormal de imunidade, provocando várias doenças autoimunitárias.

Por outras palavras, uma vez que as células que apresentam antigknios não estimuladas (APC) em tecidos normais não expressam moléculas co-estimuladoras quando o sistema imunitário de um organismo vivo está normal, as células T estão num estado de não resposta para manter a tolerância imunológica mesmo que existam células T autoantigénio -reactivas que reagem com o autoantigénio. Sugeriu-se que num estado anormal de imunidade mais células T autoantigénio- reactivas são activadas devido a um excesso anormal e expressão continua de moléculas co-estimuladoras para provocarem deste modo doenças auuoimunitárias. A partir destes pontos de vista foram feitas recentemente muitas tentativas para tratar vátias: doenças modulando a transmissão de sinais co- estimuladores, por exemplo a transmissão de sinal mencionada acima entre CD28/CTLA-4 e como proposto.

Observou-se que o CD80, uma molécula cc-estimulaàora como ligando de CD2S e CTLA-4 é expressa de uma forma anormal nas células que apresentam antigénio no nidus da doença autoimunitária, tal como a artrite reumatoide, esclerose múltipla, tiroidite autoimunitária, dermatite alérgica do tipo de contacto, e dermatose crónica inflamatória, tal como lichen planus e psoríase. A partir de uma tal observação foram feitas muitas tentativas para tratar várias doenças autoimunitárias modulando a função de CD80.

Foi proposto o bloqueio da função de CD80, através de métodos que utilizam um anticorpo contra CD8G, proteína solubilizada de CD28 que é um ligando de CD80, e proteína solubilizada de CTLA-4 que e também um ligando de CD80. Particularmente, baseado no facto que a afinidade de ligação de CTLA-4 para CDSO á mais elevada 20 ou mais vezes do que a do CD28, tentativas terapêuticas utilizando "CTLA-4 solubilizado", especificamente a proteína de fusão (CTLA-4-IgFc) compreendendo o domínio extracelular de "CTLA-4" e a região Fc da imunoglobulina humana IgGl, foram efectuadas num modelo animal e em ensaios clínicos (Nihon Rinsho, vol. 55, N° 6, pág. 215-220 (1997)) .

Como apresentado nos pontos 1 a 5 abaixo, foram reportados os efeitos terapêuticos de CTLA-4-IgFc em modelos animais de doenças autoimunitárias. i. Num ratinho F1, que é um modelo para o lupus sistémico eritmatose (SLE, do inglês systemic lupus erythematosus), a produção de autoanticorpos e o inicio da nefrite do lupus foram suprimidos pél& de CTLA:'· 4 - τρ'Ρο antes do v:p:drie dos pilibéiAdM; e as condições patológicas foram melhoradas por administração do fármaco, mesmo após o início dos sintomas (Science, Vol. 125, pág. 1225-1227 (1994)). 2. Na encefalomíelite alérgica experimental (EAE, do inglês allergic encephalomyelitis) que é um modelo da esclerose múitipia (MS), foi evitado o início dos sintomas, através da administração de curto prazo de CTLA-4-IgFc imediatamente após imunização (J. Clin. Invest., Vol. 95, pág. 083-2789 (1995)) . 5. Num ratinho NOD (diabético não obeso, do inglês non-ohese diabetes mouse) que é um modelo da diabetes mellitus dependente da insulina (IDDM), a taxa de inicio foi notoriamente diminuída através da administração de CTLA-4-IgFc ao ratinho fêmea com 2 a 3 semanas de idade durante 2 semanas (J. Exp. Med., vol. 181, pág. 1145-1155 (1995)). 4. Na nefrite do rato por imunidade da membrana basal do glomérulo renal, modelo da nefrite de Goodpasture, a melhoria dos sintomas foi melhorada pela administração de CTLA-4-IgFc (Eur. J. Immunol., vol. 24, N° 6, pág. 124 9 — 1254 (1994)). 5. Na artrite do tipo II induzida pelo colageneo (CIA do inglês collagen-induced arthritis) utilizando um ratinho DBA/1 que é um modelo para a artrite reumatoide humana, o início da artrite foi suprimido pela administração do fármaco de teste na altura da imunização e a produção de autoanticorpos (IgGl e IgG2) contra o colagéneo foi inibida (Eur. J. Immunol., vol. 26, pág. 2320-2328 (1996)) .

Os resultados das experiências como mencionado anteriormente não esclareceram ainda sístí detalhe o mecanismo de activação de cálpltt T por ínteracção entre acll s carie s de co-estimulação e as moléculas relacionadas (por ou r: s palavras, a adesão celular, através da ligação entre estas moléculas). Podem estar envolvidas neste mecanismo outras moléculas desconhecidas.

Descrição Detalhada da Invenção

Produtos farmacêuticos úteis para evitar várias doenças, tais corno as doenças autcimunitárias acima mencionadas, doenças alérgicas, e doenças inflamatórias podem ser desenvolvidos se o mecanismo de activação dos linfócitos, tais como células T por adesão celular através da ligação entre moléculas envolvidas na transmissão do sinal secundário essencial para a activação dos linfócitos tais como as células T mencionadas acima e o mecanismo da regulação da função do linfócito se encontrarem clarificados e se moléculas conhecidas e desconhecidas capazes de mediar a adesão celular envolvidas no mecanismo e na transmissão de sinais forem identificadas e caracterizadas.

Um objectivo da presente invenção consiste na identificação de novas moléculas da superfície celular que possuem ambas as funções de mediar a adesão celular e a transmissão de sinal, e em clarificar as suas características estruturais e biológicas. Outro objectivo da presente invenção consiste em fornecer produtos farmacêuticos úteis para tratar ou evitar várias doenças autoimunitárias e doenças inflamatórias utilizando as novas moléculas ou anticorpos contra as moléculas.

Para identificar tais moléculas úteis, os presentes inventores focalizaram-se no facto de que linfócitos tais como as eélrdat T desempenham um papel importante nas doenças autoimunitárias e doenças alérgicas, e no facto de que a adddho celular é essencial para a i.fariimiishíso do sinal secundário (sinal co-estímulatório) a partir das células que apresentam antigéni os para os linfócitos, e planearam isolar e identificar moléculas da superfície celular que são expressas especificamente em células linfóciticas e que medeiam a adesão celular.

Os presentes inventores obtiveram anticorpos monoclonais contra várias moléculas da superfície celular expressas sobre a superfície das células linfóciticas imunizando animais contra as células linfóciticas, e isolaram e identificaram as moléculas desejadas da superfície celular que medeiam a adesão celular utilizando anticorpos monoclonais obtidos deste modo. Os métodos utilizados são descritos em detalhe abaixo.

Os presentes inventores administraram primeiro a linha celular linfócitica de rato como um antigénio a ratinhos e prepararam vários anticorpos monoclonais. Depois, os anticorpos monoclonais obtidos foram feitos reagir com células linfóciticas do rato utilizadas como um antigénio e foi testado o efeito dos anticorpos monoclonais dados as células. Como resultado verificou-se que um dos anticorpos monoclonais se aglutinava fortemente às células linfóciticas do rato (este anticorpo monoclonal foi designado como "anticorpo JTT-l") .

Além disso, verificou-se que um outro dos anticorpos monoclonais inibia fortemente a aglutinação das células linfóciticas do rato induzida pelo "anticorpo JTT-l" (este anticorpo monoclonal foi designado como "anticorpo JTT.2").

Uma vez que a aglutinação de células linfóciticas de rato pelo "anticorpo "JTT-l" não foi inibida pelos anticorpos contra a molécula-1 de adesão intercelular VWJkU-l) ou antigénio-1 associado à função linfócitica (LFA-1, do inglês lymphocyte function- associated antigen-1';} que são as moléculas conhecidas mais representativas da adesão celular expressas sobre as célyl-sai 03 presentes inventores pensaram qçç esta aglutinação foi provocada pela de adesão desconhecidas adesão celular através de ftu;iúc:.d::;r que medeiam a adesão celuiar. ^SÍ&ííh.l'Ss! da superfície celular (designadas por ^antígénio JTT-i e "antígénio JTT.2) reconhecidas por estes dois anticorpos monoclonois foram então identificadas, isoladas, e caracterizadas.

Primeiro a análise dos padrões de expressão de "antígénio JTT-i" e "antígénio JTT.2" em várias células foi efectuada por citometria de fluxo baseada na técnica de anticorpos fluorescentes utilizando o "anticorpo JTT-1" e o «anticorpo JTT-2". Enquanto que ambos os antigéníos "JTT-1" e "JTT.2" foram fortemente expressos em células linfoblásticas activadas (células linfoblásticas T activadas, células B linfoblásticas activadas, etc.), activadas pela estimulação dos timócitos e células de baço com Concanavalina A (ConA), um mitogénio, em particular, nas células linfoblásticas activadas a expressão foi dificilmente encontrada em células de baço que não foram de todo estimuladas ( nesta memória descritiva estas células são às vezes designadas como "linfócitos em repouso"). Os padrões de expressão das moléculas reconhecidas por cada "anticorpo JTT-1" e "JTT-2" foram quase os mesmos.

Utilizando uma coluna de afinidade preparada ligando um "anticorpo JTT-1" a adsorventes, as moléculas retidas pelo "anticorpo JTi-J-f, nomeadamente os "antigéníos JTT-1" foram purificadas a partir da mistura de moléculas da superfície ceiular solúveis preparada a partir das células linfóciticas dos rates acima descritas. Os pesos moleculares destes "antigéníos JTT-1" purificados foram analisados por ímunoprecipitação utilizando o "anticorpo ,s f.- e o "anticorpo JTT-2" e por SDS-PAGE. Gomo resultado verificou-se que as moléculas imunoprecipitadas por cada ”SJJJrm:;'::'po οΤΐ'-ύο' a "a:;;a .<-1 a-m: fors;·': as mesmas e que cada molécula era um homodímero p^ãã-úl^Éú diferentes cadeias de açúcar. Especificamente, quando as cadeias de açúcar não ligadas não são digeridas, as moléculas foram identificadas com uma molécula com cerca de 47 kD em condições não redutoras, e como duas moléculas com cerca de 24 kD e cerca de 28 kD em condições redutoras; quando cadeias de açúcar N-ligadas foram digeridas, as moléculas foram identificadas como uma molécula com cerca de 36 kD em condições não redutoras e como uma molécula com cerca de 20 kD em condições redutoras. A adesão de timócitos de rato a placa revestida com o "antigénio JTT-1" purificado foi então analisada. Como resultado os timócitos aderiram significativamente a placa (nomeadamente ao "antigénio JTT-1") apenas na presença do "anticorpo JTT-1" e a adesão foi significativamente inibida na cc-presença do "anticorpo JTT-2", indicando que o "antigénio JTT-1" foi a molécula da superfície celular que medeia a adesão celular. A seguir os presentes inventores clonaram os genes codificadores do "antigénio JTT-1" do rato, dos seres humanos, do ratinho e analisaram as suas estruturas.

Primeiro o cADN que codifica para o "antigénio JTT-1 de rato" de cadeia completa foi isolado a partir da biblioteca de cADN criada a partir de linfoblastos derivados de baço de rato estimulado com ConA através do método de clonagem de expressão utilizando o método de prospecção utilizando o "anticorpo JTT-1" e um gene de rato completamente novo foi isolado e identificado, através da determinação da sua sequência nucleótidíca, através do método do dídesóxi. O cADN que codifica para o "antigénio humano JTT-1" foi também isolado a partir da biblioteca de cADN criada a partir de linfoblastos sanguíneos periféricos hmhehSA esrimulados com ConA por níbridização em placa rooo" obtido deste modo como uma sonda e um gene numa no completamente novo foi isolado e identificado determinando a sua sequência nucleótidica pelo itilsdí:· do didesóxi. De forma semelhante, o cADN que codifica para o "antigénio de ratinho JTT-1" de comprimento completo foi isolado a partir da biblioteca de cADN criada a partir de linfoblastos derivados de baço de ratinho estimulado com ConA e um gene de ratinho completamente novo foi isclado e identificado determinando a sua sequência nucleótidica através do método do didesóxi. Além disso, o cADN que codifica para variante de união (em inglês splicing) alternativa do "antigénio JTT-1 de rato" de comprimento completo mencionada acima foi isolada de forma semelhante a partir da biblioteca de cADN criada a partir da linha celular do timoma de rato e foi isolado um outro gene de rato completamente novo e identificado determinando a sua sequência nucleótidica pelo método do didesóxi.

Constatou-se que o "antigénio JTT-1" é uma proteína transmembranar (molécula da superfície celular) composta por uma sequência de sinal, uma região extracelular possuindo oin] local/locais de glicosilação, uma região transmembranar, e uma região intracelular, através de uma análise gráfica de hidropatia da sequência de aminoácidos codificada pelo cADN isolado a partir do " antigénio JTT-1 humano". A pesquisa de homologia com moléculas conhecidas revelou que os "antigénios JTT-1" do rato, dos seres humanos e do ratinho, não possuíam uma homclogia significativa com qualquer uma das moléculas conhecidas incluindo moléculas de adesão celular, indicando que são novas moléculas da superfície celular que medeiam a adesão celular.

Como resultado da pesquisa de motivos baseada na

ojquértAia do “arrt/rjéJio humano JTT-1" verificou-se que o JTT-1 humano" possuía uma semelhança dsirutuxM com o mencionado uma molécula da superfície celular dos linfócitos, tais como células T que transmitem um sinal co-esimulatório importante para a activação de células T através de adesão celular, e com 'tCTLo-ô'> uma molécula da superfície celular scbre linfócitos, tais como as células T que regulam as funções de linfócitos activados, tais como células T activadas cooperando com o sinal. A semelhança estrutural é a seguinte: 20 ou mais resíduos de aminoácídos incluindo resíduos de cisteína são altamente conservados, A sequência de repetição da prolina "Pro-Pro- Pro (PPP)" é essencial como a região de fixação do ligando, é conservada na região extracelular. A sequência "Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM) " (Xaa e x representa qualquer aminoácído), sequência essencial como a região de transmissão do sinal é conservada na região citoplasmática. 0 locus do gene codificador do "antigénio JTT-1 do ratinho" no cromossoma do ratinho foi constatado ser o "1C3" que é a mesma localização do que a do ratinho "CD28" e "CTLA-4" utilizando o método de hibridização in situ de fluorescência (FISH, do inglês fluorescence in situ hybridization). A seguir, a eficácia da terapia das doenças autoimunitárias e doenças alérgicas através da regulação da função do "antigénio JTT-1" foi examinada em experiências em que o "anticorpo JTT-2" acima mencionado foi administrado a ratos modelo para a encefalomieiite alérgica u·. ; mor:ro ffiM, do inglês, experimental allergie encephalomyelitis) e nefríte da membrana basal do gl/ooirolo (GBM, do inglês çlomerulus basement membrane). Foi verificado que estados patológicos foram significativamente suprimidos em ambos os modelos animais de doença, e que as doenças autoimunitárias ou alérgicas podem ser tratadas regulando as funções do "antigénio JTT-I".

Foi também constatado que o anticorpo monoclonal contra o "antigénio humano JTT-L" proliferou significativamente linfócitos sanguíneos periféricos humanos, e que a proliferação foi ainda reforçada na co-presença de um anticorpo monoclonal contra CD3 constituindo um complexo TcR/CD3 em células T, que recebem o sinal primário essencial para a activação de células T das células que apresentam antigénios, indicando que o "antigénio JTT-1" era uma molécula da superfície celular envolvida na transmissão do sinal para os linfócitos.

Além disso os presentes inventores conseguiram produzir um polipéptido de fusão compreendendo a região extracelular do "antigénio JTT-1 humano e a região Fc da imunoglobuiina humana. 0 polipéptido de fusão e útil como produto famacêutico para tratar doenças autoimunitárias, doenças alérgicas, e doenças inflamatórias regulando as funções do "antigénio JTT-1" e/ ou do seu ligando.

Além disso, os presentes inventores conseguiram preparar um ratinho transgénico no qual um gene codificador do "antigénio JTT-1" de outra espécie animal foi introduzida. 0 ratinho transgénico é útil para analisar funções detalhadas ao "antigénio JTT-I" e para desenvolver produtos farmacêuticos para tratar doenças doenças alérgicas, e doenças 3s inventores também produziram um ratinho desactivado (em inglês knockout) que c gene endógeno codificador do "antigénio JTT-1 de ratinho" se encontrava desactivado. Este ratinho desactivado é também útil para o objectivo mencionado anteriormente. A presente invenção diz respeito a Π) uma molécula de ácido nucleico seleccionada a partir o grupo qu» consiste em: (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica para um polipéptido constituído pela sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID N° 2; (b) molécula de ácido nucleico que consiste na sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID N° 1; (c) molécula de ácido nucleico que consiste na sequência nucleótidica de 26 a 625 da SEQ ID N° 3: (d) molécula de ácido nucleico que codifica para um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos de 1 a 140 da SEQ ID N° 2.

Diz ainda respeito a (2) molécula de ácido nucleico de !)'., que é um cADN. (3) um gene compreendendo o ácido nucleico de (1) ou (2) . (4) um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de (1) ou (2) ou do gene da reivindicação 3. (5) uma célula recombinante em que o vector de (4) foi introduzido. íSú aéili:!ê recombinante de (5) que é identificada pelo número de depósito internacional N° FYRM BP- (7) um polípéptido que consiste na sequência de aminoácidos indicada na ÇEQ ID N° 2. anticorpo especifico do polípéptido de (7) em que o dito anticorpo é o anticorpo seleccionado a partir do grupo que consiste ao anticorpo de rato, anticorpo de cobaia, anticorpo de coelho, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo humano. (9) o anticorpo de (8), em que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal, ou uma porção do anticorpo monoclonal, em que a porção é seleccionada a partir do grupo que consiste em F (abf)2, Fab' e Fab. (10) composição farmacêutica compreendendo o anticorpo (8) ou (9) ou uma porção ao anticorpo monoclonal como definido em (9) e um veículo farrnaceuticamente aceitável. (11) uso do anticorpo de (8) ou (9) ou uma porção do anticorpo monoclonal como definido em (9) para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar doenças inflamatórias, ou para prevenir os sintomas da dita doença e (12) uma célula produtora de anticorpo que produz o anticorpo monoclonal de (9). O presente documento descreve polipéptidos, genes, anticorpos, vectores, transfcrmantes, composições farmacêuticas, ratinhos transgénicos, ratinhos desactivados etc. que são relevantes para um novo "antigénio JTT-l" ds: mamífero isolado e identificado como acima mencionado. Especificamente encontram-se aqui daaorie.c nas pontos Qs e (36) . (1) um polipéptido que constitui uma molécula da superfície celular que possui as características abaixo,

Uu a dita molécula da superfície celular é expressa em pelo menos timócitos e células linfoblásticas estimuladas por rnítogéni os, (b) e um anticorpo reactivo para a dita molécula da superfície celular induz a adesão entre células linfoblásticas estimuladas por mitogénios, loi um anticorpo reactivo para a dita molécula da superfície celular induz a proliferação de linfócitos sanguíneos periféricos na presença de um anticorpo contra CD3, i<.1! a dita molécula da superfície celular possui uma sequência parcial de aminoácidos representada por Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe na região extracelular, e ísif a dita molécula da superfície celular possui uma sequência de aminoácidos parciais representada por Tyr-Met-Phe-Met na sua região citoplasmática. (2) o polipéptido de (1) compreendendo a sequência de aminoácidos da ÇEQ ID N° 2: ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2: em que um ou vários aminoácidos encontram-se substituídos, suprimidos, ou foram adicionados. (3) o polipéptido de (1) que é codificado pelo ADN que hibridiza com um ADN que possui a sequência nucleótidíca da SEQ ID 1 em condições severas. (4) o polipéptido de (1) compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui 60% ou mais de homologia com uma atquânaia de aminoácidos do SEQ ID N° 2. (5) o pclipeptido de acordo com qualquer um dos pontos (1) a (4) em que a dita molécula da superfície celular e derivada dos seres humanos. (6) um gene que codifica para o polipéptido de acordo com qualquer urra das reivindicações (I) a (5) . (7) gene de acordo com o ponto (6) em que o dito gene é um cADN. (8) gene de acordo com o ponto (7) em que o dito cADN possui uma sequência nucleótidica da SEQ ID N°:l. (9) o gene de acordo com o ponto (7) em que o dito cADN compreende uma sequência nucleótidica que corresponde aos resíduos nucleótidicos 26 a 625 da SEQ ID N° 3, aos resíduos nucleótidicos 35 a 637 da SEQ ID N° 4, aos resíduos nucleótidicos 1 a 603 da SEQ ID Nc 5, ou aos resíduos nucleótidicos 35 a 685 da SEQ ID N° b. (10) um vector compreendendo o gene de qualquer um dos pontos (6) a (9) . (11) um transformante em que o vector de (10) foi introduzido. (12) Um transformante identificado por um número de depósito internacional N° FERM BP-5725. (13) um fragmento de polipéptido compreendendo uma região extracelular do polipéptido de qualquer um dos pontos (1) a (5 ). (14) O fragmento de polipéptido de acordo com o ponto

(13) em que o dito polipéptido e derivado dos seres humanos que possuí a sequência de aminoácidos da SEQ ID 2, (15) Gene que codifica para o fragmento de polipéptido de (13) ou (14) . (16) titicmud π de homodímero compreendendo dois fragmentos de polipéptidos em que cada um fragmentos compreende uma região extracelular do polipéptido de acordo com qualquer um. dos pontos (1) a (5) e os dois ditos fragmentos de polipéptidos em ponte através ligações de dissulfureto entre eles. (17) Molécula de homodímero de acordo com o ponto (16) em que o dito polipéptido é um ptldpoplÍP:· derivado dos seres humanos possuindo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2. (18) Uma composição farmacêutica compreendendo o fragmento de polipéptido de (14) ou a molécula de homodímero de acordo com o ponto (17), ou ambas, e um veículo farmaceuticamente aceitável. (19) Um polipéptido de fusão compreendendo uma região extracelular do polipéptido de acordo com qualquer um dos pontos (1) a (5) e uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana (Ig), ou uma porção da região constante. (20) O polipéptido de fusão de (19) em que a imunoglobulina e IgG. (21) O polipéptido de fusão de acordo com o ponto (19) em que a porção da região constante compreende uma região conectora, um domínio C2, um domínio C3 de IgG. (22) O polipéptido de fusão de acordo com qualquer dos pontos (19) a (21) em que o dito polipéptido ê um polipéptido derivado dos seres humanos possuindo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°2. (23) uma molécula de homodímero compreendendo dois polipéptidos de fusão de acordo com qualquer um dos pontos (19) a (22) em que os dois polipéptidos estão ligados em ponte ua ao outro através de ligações de dissulfureto. (24) Uma molécula de homodímero compreendendo dois polipéptido::;!: de fusão de acordo com o pondo (22) em que os dois polipéptidos estão ligados em ponte um ao outro através de Μρ^ρΡύύ de dissulfureto. (25) Uma composição farmacêutica compreendendo ou o polipéptido de fusão de acordo com o ponto (22) ou a molécula de homodímero de acordo com o ponto (24), ou ambos, e um veiculo farmaceuticamente aceitável. (26) Composição farmacêutica de acordo com o ponto (25) em que a dita composição farmacêutica e utilizada para tratar doenças autoimunitárias ou doenças alérgicas, ou para evitar os sintomas da dita doença. (27) Um anticorpo ou uma sua porção reactiva para o polipéptido de acordo com qualquer um dos pontos (1) a (5), para o fragmento de polipéptido de (13) ou (14), ou para a molécula da superfície celular compreendendo o dito polipéptido. (28) 0 anticorpo de acordo com o pcnto (27) ou uma sua porção em que o dito anticorpo e um anticorpo monoclonal. (29) Um anticorpo monoclonal ou uma sua porção reactiva em relação ao polipéptido que possui uma sequência de aminoácido da SEQ ID N° 2, o fragmento do polipéptido (14),, ou a molécula da superfície celular derivada dos seres humanos compreendendo o dito polipéptido. (39) Um anticorpo mcnoclonal ou uma sua porção reactiva para o polipéptido de acordo com qualquer um dos pontos (1) a (5) ou para molécula da superfície celular compreendendo o dito polipéptido, em que o efeito do dito anticorpo monoclonal em células linfoblásti cas estimuladas por oi to-.:1/:.- cx é substancialmente o mesmo que o efeito do anticorpo mcnoclonal produzido por um hibridoma identificado por um número de úrioisi/to internacional N° FERM BP-57C7 em células linfoblásticas do rato estimuladas por mitogénios. (31) Um anticorpo monoclonal ou uma sua porção reactiva ao polipéptido de acordo com qualquer um dcs pontos (1) a (5) ou para a molécula da superfície celular compreendendo o dito polipéptido, em que c efeito do dito anticorpo monoclonal em células linfoblásticas estimuladas por mítogénios é substancialmente o mesmo que o efeito de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma identificado por um número de depósito internacional N° FERM BP-5708 em células linfoblásticas do rato estimuladas por mítogénios. (32) Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal de acordo com o ponto (29) ou uma sua porção e um veículo facmaceuticamente aceitável. (33) A composição farmacêutica de acordo com o ponto (32) em que a dita composição farmacêutica é utilizada para tratar doenças autoimunitárias ou alérgicas, ou para evitar o sintoma da dita doença. (34) Um hibridoma que produz o anticorpo monoclonal de qualquer um dos pontos (28) a (31). (35) Um ratinho transgénico em que um gene que codifica para o polipéptido de (1) que e um gene derivado dos seres humanos compreendendo uma sequência nucleótidica da SEQ ID N°:l ou um gene derivado do rato compreendendo uma sequência nucleótidica correspondendo aos resíduos nucleótidicos 35 a 637 da SEQ Π N° 4, que se encontra integrada no gene endógeno. (36) Um ratinho desactivado em que o seu gene endógeno que codifica para o polipéptido do ratinho de acordo com a r;?··.:. ·: ooc--'o ça·:.· 1 compreendendo a sequência de codificada pelo gene da SEQ 1D K°:5 é desactivado de modo que o dito polipéptido de ratinho não seja produzido,

Como descrito acima, a molécula da superfície celular da presente invenção ("antígénio JTT-1) encontra-se envolvido na adesão celular, transmissão de sinal para iinfócitos, tais como células T, e regulação da função de iinfócitos activados. 0 conhecimento geral de células linfocíticas, moléculas de adesão, e a relação entre elas e doenças são descritos abaixo apenas para compreensão geral destes acontecimentos biológicos, mas o conhecimento geral seguinte não é para interpretar a presente invenção de forma limitativa.

Os Iinfócitos são classificados grosseiramente em dois tipos, células T e células 3. Após diferenciação a partir de células estaminais multipotentes da medula óssea em células estaminais linfóides, algumas delas fluem para o sangue para atingir o timos. Os Iinfócitos diferenciados e maturados no timo, que são designados por células T (células T derivadas do timo), entram novamente no sangue e circulam, através de todo o corpo. As células T maduras possuem uma molécula chamada CD? a sua superfície. A existência da molécula CD3 é um marcador para determinar se as células são células T maduras ou não. CD3 é um marcador das células T convincentes. Além disso, as células T expressam CD4 ou CD8. As células T são classificadas em células auxiliares T (células Th, do inglês helper T cells) que assistem na produção de anticorpos pelos Iinfócitos B, células T citotóxicas (células Tc, CTL) ou células assassinas T que estão ligadas a células alvo para as

destruir directamente, células T supressoras que suprimem a de anticorpos pelos Iinfócitos B, e células T efectoras que secretam efectoras, tais corno as

liêAgtt s para provocar alergia atrasada. As células B derivam das células estaminais linfóides didddtooPi mdst e maturadas na medula óssea. As células B são células precursoras que produzem anticorpos, uma vez que produzem anticorpos com um estimulo apropriado. As células B possuem rtruioaLoiò.; 1 lido sobre a sua superfície celular, que foram produzidas numa célula. Tais imunoqlobulinas funcionam como receptores para antigénios. Células E maduras possuem ambas IgM e IgD à sua superfície. Se as células B são diferenciadas com estimulação do antigénio e sinais de células T, a produção de IgM aumenta e as regiões de ligação da sua membrana celular do terminal C são alteradas para serem secretadas. Com uma estimulação suficiente, não só se alteram as imunoglobulinas de superfície para IgG, IgE, e IgA, mas também, são secretadas as imunoglcbulinas de cada classe. A imunoglobulina â superfície da célula B é muitas vezes representada como slg, abreviatura de Ig de superfície (do inglês surface Ig), ou mlg, abreviatura de Ig de membrana (do inglês membrane Ig) . Todas as Igs a superfície da mesma célula B possuem os mesmos locais de ligação de antigénio.

Existem linfócitos denominados linfócitos granulares grandes (LGL, do inglês large granular lymphocytes), ou células nulas, que não são células T nem células B. Estas células podem destruir células tumorais e células infectadas com vírus sem pre-estimulação com antigénio, o que é comparável com o caso das células T citotóxicas. Por isso, elas são chamadas células assassinas naturais (células NK, do inglês natural killer).

Entre as células T mencionadas acima, as células T CD4-positivas secretam varias citocinas, expressam de novo receptares para estas citocinas, aumentam o seu próprio tamanho, iniciam a divisão celular, e proliferam, quando reagem com antigénios apresentados pelas células que apresentam Antes dessas reacções ao nível c complexo dos antigénicos sobre células

que apresentam antigénios e moléculas de classe II MHC

ligam-se ao receptor do antigénio da célula T correspondente (TCR, do inglês T cell antigen receptor). Isto provoca várias alterações bioquímicas nas células, e o sinal é transmitido para os núcleos para iniciar a transcrição de ADNs específicos e para produzir as proteínas respectivas. Como resultado são geradas reacções ao nível da célula. Por exemplo, células infectadas com um virus produzem proteínas virais e são degradadas em péptidos por proteossomas no citoplasma. Uma parte do péptido entre no retículo endoplásinico através de TAP, forma um complexo estável com as moléculas de classe i MHC acabadas de serem produzidas, e transfere-se para a superfície celular. O péptido transferido para a superfície celular é reconhecido especificamente pelas células T CD8 positivas, mas as células T ainda não podem destruir as células infectadas nesta fase. Estas células T reagidas com o antigénio expressam o receptor IL-2 (IL-2R), são diferenciadas em CTL de citotoxicidade celular por acção do IL-2, e destroem as suas células alvo para as matar da próxima vez que encontram o mesmo péptido antigénico/ complexo de classe I MHC. As citocinas necessárias para a diferenciação em CTL não são apenas IL-2, mas também IFNy ou outras citocinas que se pensa que possuem acções semelhantes. Assim, os linfócitos secretados pelas células T são necessários para a diferenciação em CTL. As linfocinas são produzidas como resultado do facto das células Thl CD4-positivas (células T CD4-positivas que secretam IL-2 ou IFNy) reconhecerem que os péptidos antigénicos derivados do mesmo vírus com moléculas de classe II. Nalguns casos sem o auxilio das células T CD-4 positivas, células T CCE positivas reagem com Míitigêniès e produzem IL-2 e outras citocinas. Quando as cêlút&s T CD8- positivas são diferenciadas em CTL, os grânulos aumentam no citoplasma. Estes grânulos várias proteínas de elevado peso molecular, representadas pela perforina. A perforina assemelha-se a um complexo de ataque da membrana (MAC, do inglês membrane attack complex) composto do quinto ao nono componente do complemento, e faz orifícios na membrana celular das células alvo. Além disso, os grânulos compreendem proteases de serina, LT, proteoglicano, etc. Hlé.s disso, se as células CD8 positivas diferenciadas em CTL recebem estimulação pelo anigénio, elas também secretam linfocinas, tais como IFNy, LT, TNF, ou IL-2. Além disso, as células T apresentam o fenómeno de transformação blastica, quando reagem com hemaglutinina (fitohemaglutinina, PHA) ou ConA.

As células T maduras não estimuladas de todo são chamadas células T em repouso, e possuem um menor tamanho celular e tempos de vida mais curtos, de alguns dias. Quando recebem estimulação, as células aumentam como já acima mencionado e estão aptas· para reagir com vários tipos de simulação. Tais células T são designadas por células T activadas. Uma parte das células T activadas tornam-se células de memória T que provocam a irnunoreacção secundária se receberem a mesma estimulação antígénica. Pensa-se que as células T de memória são mantidas em circulação à volta do corpo durante alguns anos ou décadas.

As células B que não são de todo estimuladas são chamadas células B em repouso, tal como no caso das células T e células B em proliferação estimuladas com antigénios multivalentes ou CD40L são designadas por células 3 activadas. Uma vez que células B em repouso não possuem moléculas de co-estimulação, que estimulam células T com sinais através de TCR, tais como B7-1 ÍCD80) ou B7-2 que apresentam antigénios as células T em repouso, pensa-se que estimulem unicamente TCR ss que são incapazes de expressarem ligandos CD40 (CD40L) o:;: produzir linfocinas. For isso, pensa-si que células T auxiliares estimuladas com o antigenio apresentados por células que apresentam o antigénio reagem com o antigénio apresentado pelas células B em repouso. Nomeadamente, se um antigénio invadir, primeiro, as células dendriticas (células que possuem prapémçóeà: dendriticas extremas) que expressam moléculas B7 ou macrófagos activados devido à reacção com microrganismos apresentam o antigénio e estimulam as células T auxiliares em repouso para as activar de modo a expressarem CD40L. As células auxiliares T ligam-se depois as células B em repouso que apresentam o mesmo antigénio e estimulam o seu CD40. Quando as células B são activadas por estimulação com antigénios multivalentes ou CD4QL, eles também expressam molécuias B7, activam células auxiliares T estimulando C.D28 a sua superfície com TCR, e permitem que as células auxiliares T expressem CD40L ou produzam linfocinas. As células B que apresentam alterações, tais como expansão do tamanho celular com estimulação mas não apresentam secreção de anticorpo são designadas como células B activadas. Se as células B maturadas deste modo encontrarem antigénios, a produção de IgM aumenta conjuntamente com a estimulação de células T e as moléculas de IgM produzidas deste modo são secretadas mudando de tipo membrana para tipo secretor. Além disso eles produzem anticorpos isotipicos diferentes de IgM, tal como IgG sobre os factores humorais das células T. Isto é chamado troca de isotipo ou troca de classe. Os anticorpos que secretam as células B são designados por células que secretam anticorpos. Parte delas tornam-se células características morfologicamente e é chamada uma célula do plasma (Knowledge of Immunology, Ohmsha, (1996)).

Acidentalmente em várias reacções do sistema imunitário, a subpopulação de glóbulos brancos sanguíneos, nomeadamente iínf&oit&i I, linfócitos B, NK, neutrófilos, etc. aprfrequentemente ãinàtsóííiss diferentes umas das outras. Mesmo os mesmos linfócitos como mencionado acima apresentam dinâmicas diferentes uns dos outros dependendo se as células estão activadas, ou em repouso. Estes factos implicar, a existência ou um mecanismo de reconhecimento especifica da subpopulação dos glóbulos brancos sanguíneos e ainda, um mecanismo de reconhecimento específico ao estado das células, e em particular, moléculas de adesão celular (proteínas de adesão celular) .

Moléculas de adesão celular, ou proteínas de adesão celular são em geral as moléculas que fazem aderir as células umas às outras no desenvolvimento e diferenciação dos indivíduos ou na migração das células para o local e sabe-se que são moléculas essenciais para os contactos orgânicos e funcionais num organismo vivo.

As moléculas de adesão celular são classificadas grosseiramente a partir das suas características estruturais em cinco (5) famílias, a superfamília da imunoglobulina, família da integrina, família da selectina, família da caderina, e família de CD44. As moléculas de adesão que pertencem a superfamília da imunoglobulina são caracterizadas pela existência de domínios semelhantes a loops repetidos formados por ligações dissulfureto. São exemplos, a molécula-1 de adesão intercelular "ICAM-1" e molécula-1 de adesão celular vascular "VCAM-1". Além disso, as moléculas de adesão que pertencem a família da integrina são caracterizadas por uma estrutura heterodimérica α/β. Exemplos são o antigénio-1 a 6 muito tardios, o "VLA-1 a 6, o \ 1 associado com a função linfocítica '''ifá.-.:'% "Mac-1", e As moléculas que pertencem à família da selectina possuem um domínio semelhante à lectina, um domínio semelhante EGF, e um domínio complementar nesta ordem a partir do terminal N. Exemplos são o "E-selectina" e '‘P-seiectina". Exemplos da família da caderina são "E- caderina", "N-caderina", e "P-cadeina", e um exemplo da família CD44 é "CD44".

Sabe-se que a função especifica destas moléculas de adesão é a adesão de glóbulos brancos a células vasculares endoteliais ou de linfócítos a células que apresentam antigénios. A. partir de vários estudos recentes foi gradualmente revelado que as moléculas de adesão estão envolvidas não apenas nestas funções, mas também em virias doenças.

Em particular, há muitos relatórios sobre doenças e expressão anormal de moléculas de adesão. A titulo de exemplo, na artrite reumatoide (AR), a expressão de "Mac-1" e "pl50/95" foi divulgada como estando reforçada nos sinoviócitos da AR (Allen, C. Et al., Arthritis Rheum., vol. 32, pág. 947 (1989)). Foi também divulgado que várias células expressam "ICAM-1" fortemente e ectopicamente na membrana sinovial da AR (Hale, L. et al., Arthritis Rheum., vol. 32, pág. 22 (1989)). Um outro relatório sugeriu que "ELAM-1" também estava envolvido na adesão de neutrófilos a células vasculares endoteliais e que a expressão em excesso destas moléculas estava envolvida na infiltração de neutrófilos (especialmente, para o fluido sinovial), o que e observado no fluido sinovial na AR (Laffon, A et al., Arthritis Rheum., vol. 32, pág. 386 (1989)) . Foi divulgada uma expressão forte de "CD44" em células endoteliais vasrulares e de sinoviócitos do tipo A na membrana sinovial da AR. (Heynes, B. et al., Arthritis Rheum., vcl. 34, pág. 1434 (1991)).

Existem relatórios sobre as relações entre o lupas sistémico eritematoso (LSS) e a expressão anormal das moléculas de adesão. Por exemplo, a capacidade de adesão dos linfócítos T às células endoteliais vasculares de foi reportada como sendo mais baixa em doentes coít LSE, comparada com os voluntários saudáveis. Nos linfócítos periféricos dos doentes de LSE, as moléculas de aaesão "ICAHA1"., e " IFA-i" foram fortemente expressas (Haskard, D. O al., Rheumatol. Int., vol.9, pág.33 (1989) ΐ .

Nas ddaacçaa autoimunitárias da tiroide, foi reportado qui? c "ICAM-1" foi expresso quando as células foliculares da tiroide foram estimuladas com interferáo-γ, interleucina-1, e factor da necrose tumoral e que a do agrupamento de células foliculares e células mononucleares foi inibida pelo anticorpo anti-"ICAM-l" (Weetman, A P. et al., Eur. J. Immunol., vol. 20, pág. 271 (1990) ) .

Na hepatite pensa-se que as possibilidades de adesão entre hepatócitos e células inflamatórias aumenta, uma vez que existem duas vias de adesão "ICAM-1" e "LFA-3" e "LFA-l" e "CD2", para deste modo promover a apresentação de antigenios e a activação de células inflamatórias. Em particular, na hepatite B, as moléculas de "LFA-3" são fortemente expressas em hepatócitos, em que os vírus se encontram em proliferação activa e "ICAM-1" correlaciona-se bem com o grau de hepatite. Isto implica assim que "LFA-3" está envolvido na exclusão de vírus e ":'Κ'ΑΜ™1ν:ί promove que as células T apresentem antigénios e regulem a reacção inflamatória. Nos hepatócitos "ICAM-1" negativos e hepatócitos positivos a antígénios-HBc, infecção por vírus crónica, pode ocorrer uma resposta imunitária devido a interacção entre linfócitos e hepatócitos. Foi também reportado que o "ICAM-1" do soro em doença crónica do fígado pode correlacionar-se com o grau de danos dos hepatócitos, porque as concentrações do !—\ O > T do vorv em doentes com hepatite aguda, hepatite crónica activa, e doentes com cirrose do fígado eram mais elevadvi dó que em voluntários saudáveis e em doentes com hepatite persistente crónica, e a era elevada no caço de hepatite activa histologicamente progressiva (Mod. Phys., vol. 15, N°1, pág. 73-76 (1995)).

Num modelo animal de arteriosclerose, foi observada a adesão e invasão de monócitos e linfócitos no endotélio vascular em fases muito iniciais do inicio da doença. Pensa-se assim que a interacção destes hemócitos com endotélio e o primeiro passo do inicio da arteriosclerose. Vários relatórios mostram a expressão de moléculas de adesão no nidus actual da arterosclerose incluindo a expressão de "ICAM-1" no nidus da arteriosclerose humana (Poston, R. N. et al., àm, J. Pathol., vol. 140, pág. 665 (1992)) e a expressão de "VCAM-1" no nidus da arteriosclerose de um coelho com hiperclolesterolemia (Cybulsky, Μ. I. & Gimbrone, Μ. A Jr., Science, vol. 251, pág. 788 (1991)). Um relatório recente revelou que a expressão de "VCAM-1" foi observada no nidus da arteriosclerose humana, e em particular, uma forte expressão nas células dos músculos macios que migram para a intima e em monócitos/ macrófagos. Alem disso, a expressão de "MCP-1" foi reforçada no coelho e no nidus da arteriosclerose humana, sugerindo que "MCP-1" promove a formação do nidus da arteriosclerose, através da migração de monócitos/ macrófagos (Current Therapy, vol. 12, n° 8 pág. 1485-1488 (1994) ) .

Foi também reportada a relação entre metástese do tumor e anormalidade da molécula de adesão. Por exemplo, a E-caderina diminuiu as células cancerosas apresentou uma forte capacidade de invasão, mas a capacidaae de invasão foi inibida introduzindo o cADN de E-caderina em células cancerosas, e a capacidade de invasão foi recuperada quando o anti-soro de E-caderina foi adicionado às células. Isto sugere a relação estreita entre a diminuição da expressão de E-caderina e a capacidade de invasão das células tumorais (Frixen, U.H. et al., vol. 113, pág. (1991)). Nos casos clínicos acíuais, a relação entre a diminuição da expressão de E-caderina e metástese é apontada em vários tipos de cancro, tal como o hepatoma, cancro do esófago, cancro gástrico, e cancro da mama. Foi reportado que as moléculas de "VLA-4" um ligando para v<W;Ai:i····· 11% foram fortemente expressas no melanoma metastáticc, cancro gástrico, e cancro da mama, sugerindo que esta molécula poderia ser utilizada para a implantação de células endoteliais vasculares na metátese. Além disso, baseado em experiências que utilizam várias linhas celulares tumorais, foi reportado que o cancro epitelial, tal como o cancro gástrico, cancro do intestino grosso, cancro do pulmão, hepatoma, ou cancro pancreático aderiu a células endoteliais vasculares através de E-selectina (Takada, A et al., Câncer Res., vol. 53, pág. 354 (1993)).

Por outro lado, foi seguida a estratégia terapêutica para tratar doenças visando estas moléculas de adesão. Por exemplo, foi reportado que o anticorpo "ICAM-1" anti-rato inibiu fortemente a reacção inflamatória no modelo da artrite do rato autoimune. Foi também divulgado que a administração do anticorpo anti-"ICAM-l" inibiu o inicio da artrite na sinovite adjuvante num dos modelos animas da AR (Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, vol. 14, N° 6, pág. 571-577 (1991)). Foi ainda reportado que a formação de metástese do tumor inoculado foi notoriamente inibida se uma grande quantidade de péptidos que possuem uma sequência REG, que é uma sequência de aminoácidos numa matriz de proteína extracelular reconhecida e ligada por algumas integrinas, fcr administrada a um ratinho com cancro da vesícula biliar, e que no sistema in vitro os péptidos RGD e o anticorpo ite subunidade anti-βΐ inibiu o movimento e infiltração de células tumorais (Yamada, K. M. et al., Câncer Res., pág. 4485, (1990)

Seguidamente a presente invenção é descrita em detalhe clarificando os significados dos termos utilizados na presente memória descritiva e os métodos gerais de produção ae polipéptidos, polipéptidos de fusão, genes, anticorpos, ratinhos transgénicos, e ratinhos desactivados da presente invenção. Contudo, e desnecessário dizer que o significado dos termos não são para ser interpretados de forma limitativa pela definição aqui fornecida. "Mitogénío" quando aqui utilizado é chamado factor mitogénico e significa uma substância que induz a divisão celular. Sob o ponto de vista irnunológico significa uma substância que induz a blastogenese de linfócitos de uma forma policlonal e induzindo a divisão celular. São exemplo lectinas tal como PHA e PWM, concanavalina A (ConA), lipopolissacáridos, estreptolisina S, e anticorpo anti-linfócito. Sabe-se que a Concanavalina A e PHA actuam apenas em linfócitos T, e que os lipopolissacarideos actuam apenas nos linfócitos B, e que PWM actua em ambos os linfócitos. 0 termo "células linfoblásticas" quando aqui utilizado é chamado linfócito grande, linfoblasto, ou imunoblasto, e significa um linfócito que pertence a um grande linfócito entre linfócitos que existem nos tecidos linfoides (nódulo linfático, baço, timo, medula óssea, dueto linfático, amígdala, etc.) e sangue. 0 termo "linfócito activado" aqui utilizado significa, por exemplo um linfócito mencionado abaixo, mas não se encontra limitado a ele. Por exemplo, o termo significa um linfócito activado por alguma estimulação. Como mencionado acima, os linfócitos são classificados em células I, células B e células assassinas naturais. As células T são classificadas em CD4 positivas e células CD8 pK&itivzii, Por isso, os actívadcs" da presente iérvAnmdc incluem principalmente células T activada:, células $ activadas, e células assassinas naturais activadas, e células T activadas incluem células CD4~ positivas activas e células CD8 positivas activadas.

Por reacção com antigénios apresentados pelas células que apresentam antigénios, células CC4 positivas secretam várias citocinas, receptores expressos recentemente para estas citocinas, aumentam o seu próprio tamanno, iniciam a divisão celular, proliferam e são activados. Células T CD4-positivas incluem aquelas num tal estado. Células CD8 positivas expressam IL-2R quando reagem com antigénios. Quando o IL-2 actua no IL-2R, as células são diferenciadas em CTL, que possui citotoxicidade celular. O CTL destrói as suas células alvo e mata-as quando encontram o mesmo péptido antigénico/ complexo MHC de classe I. Quando as células T CD8 positivas são diferenciadas em CTL, os grânulos aumentam no citoplasma. Estes .grânulos compreendem varias proteínas de elevado peso molecular, representadas por perforina. A perforina assemelha-se ao MAC constituído pelo quinto ao nono componente do complemente e efectua orifícios na membrana celular das células alvo. Os grânulos também compreendem proteases de serina, LT, e proteoglicano. Se as células GD8-positivas receberem estimulação por antigénio e se diferenciam em GTL, elas também secretam linfocinas tais como IFNy, LT, TNF, ou IL-2. Células T CD8-positivas incluem aquelas num tal estado.

As células T apresentam o fenómeno de formação de blastos quando reagem com hemaglutinina (fitohemaglutinina, PHA) ou Concanavalina A (ConA). Células T activadas incluem aquelas num tal estado.

As ciluiss E expressam moléculas B7, activam células auxiliares T, através de estimulação de CD28 á sua com TCR, permitem às células auxiliares T expressarem CD40L ou produzirem linfocinas. Quando as células recebem estímulos, elas modificam-se para expandir o seu tamanho celular ou para proliferar. As células B activadas incluem as células num tal estado. Na presente invenção, células B activadas incluem aquelas que secretsm anticorpos (células que secretam anticorpos e células do plasma). Células assassinas naturais activadas significam aquelas que apresentam acção citotóxica em células tumorais ou células infectadas com vírus como mencionado acima. Na presente invenção, os linfócito activados incluem células de timus estimuladas pela Concanavalina A (ConA).

A "célula linfoblástica activada" aqui utilizada inclui um "linfoblasto" activado que e gerado quando o linfoblasto mencionado acima é estimulado com "mítogénio" mencionado acima, tal como Concanavalina A 0 termo "linfócito em repouso" aqui utilizado significa em alguns casos um linfócito não activado, que não recebeu a estimulação para activar as células, em contraste com um linfócito activado mencionado acima. 0 "gene" da presente invenção inclui um ADN genómico ou um cADN. A substância "derivada dos seres humanos" da presente invenção inclui substância naturais isoladas a partir de um componente do corpo humano (orgão, tecido, célula, fluido corporal, etc.) e uma substância recombinante produzida por tecnologia de ADN recombinante. Quando a substância e uma proteína ou polipéptido, a substância inclui uma proteína artificial e polipéptido possuindo uma sequência de amínoácídos em que um ou vários aminoácidos são substituídos, suprimidos ou adicionados. A "molécula da superfície celular" da presente invenção é a derivada de seres humanos. polipéptido que possui uma sequência de amincácidos que possui 60% ou mais de homologia com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 2; polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2 ou uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (nomeadamente, um polipéptido que constitui um "antigénio JTT-1 humano" e seu derivado); um polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleótidica correspondendo aos resíduos nucleotidicos 26 a 625 da SEQ ID N°:3 ou uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de ãminoácidos (nomeadamente, um polipéptido que constitui um "antigénio JTT-1 humano" e seu derivado); um polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleótidica correspondendo aos resíduos nucleotidicos 35 a 637 da SEQ ID N°:4 ou uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (nomeadamente, um polipéptido que constitui um "antigénio JTT-1 de rato" e seu derivado); um polipéptido que possui uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência nucleótidica correspondendo aos resíduos nucleotidicos 1 a 603 da SEQ ID N°:5 ou ene de ar ninoácídos substancialnent .e a mesma que a sequêncí< a de aminoác: idos (nomeadamente, um pcllpit que const: i tui um "antigénio JTT-1 de ratinho" e seu derivado); Π polipéptido que possui uma sequência de aminoacidos codificada por uma sequência nucleótidíca que corresponde aos resíduos nucleótidos 35 a 685 da SEQ ID N°:6 ou uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (nomeadamente, um polipéptido que constitui " um mutante do antigénio JTT-1 do rato" e seu derivado); e li} polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos codificada por um ADN codificado por um polipéptido que constitui a molécula da superfície celular da presente invenção, em que o ADN é introduzido no transformante identificado por um número de depósito internacional N° FERM BP-5725 ou, possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (nomeadamente um polipéptido que constitui um "antigénio humano JTT-1" e seu derivado).

Exemplos de "condições severas" são os seguintes. Quando se utiliza uma sonda com 50 ou mais nucleótidos e a híbrídização e efectuada em 0,9% NaCl, o padrão de temperatura em que ocorre 50% de dissociação TM e calculado utilizando a fórmula seguinte e a temperatura para hibridização pode ser determinada de acordo com a fórmula seguinte.

Tm= SS/SFC /- 0,41 x (G+C) % - 500/n - 0,61 x (formamida) % (n significa o de ggaleótidai da sonda).

Temperatura = Tm -25°C

Além disso, quando uma sonda com 100 ou mais mvrleétidóí; (G+C'' 40 a 50%) é utilizada deverá ser considerado que dm varia como (1) e (2) mencionado abaixo. (1) Tm desce cerca da 1°C por cada 1% de erros de emparelhamento (2) Tm desce cerca de 0,6 a 0,7°C por cada 1% de formamida.

Neste contexto, as condições de temperatura para a combinação de cadeias completamente complementares podem ser colocadas como se segue. (Aj 65 a 75°C (formamida não é adicionada) (B) 35 a 45°C (na presença de 50% de formamida)

As condições de temperatura para a combinação de cadeias complementares incompletas podem ser colocadas como se segue. (A) 45 a 55°C (formamida não é adicionada) (B) 35 a 42°C (na presença de 30% de formamida)

As condições de temperatura quando uma sonda com 23 ou menos nucleótidos é utilizada pode ser 37°C ou pode ser calculada utilizando a fórmula seguinte.

Temperatura= 2°C x (o número de A+T) + 4::C x (o número de C+G)-5°C.

Nesta memória descritiva "possuir substancialmente a mesma sequência de aminoácidos" significa incluir um polipeptido que possui uma sequência de aminoacidos em que aminoácidos múltiplos, preferencialmente 1 a 10 aminoácidos, em particular preferencialmente i a 5 Md nickcliipáí na sequência de aminoácidos apresentada na Listagem de Sequências encontram-se substituídos, suprimidos, e/ ou modificados, e um polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos em que aminoácidos múltiplos, preferencialmente i a 10 aminoácidos, particularmente preferido 1 a 5 aminoacidos são adicionados a sequência de aminoácidos apresentada na Listagem de Sequências desde que o polipéptido possua substancialmente as mesmas propriedades biológicas que o polipéptido que possui a sequência de aminoácidos apresentada na Listagem de Sequências. Uma tal substituição, supressão ou inserção de aminoácidos pode ser efectuada pelo método habitual (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992); e etc.). Exemplos destes métodos são a mutagknese dirigida de oligonucleótidos sintkticos (método " gapped duplex" '), mutagénese por pontos, em que uma mutação pontual é introduzida aleatoriamente, através do tratamento com nitrito ou sulfito, o método em que um mutante de supressão é preparado com uma enzima Bal31 e semelhantes, mutagénese de cassette, método de varrimento de ligante (em inglês Pinker scanning method), método do erro de incorporação, método de erro de emparelhamento de iniciador, método da síntese de segmento de ADN, etc. II mutagénese dirigida para oligonucleótidos sintéticos (método "gapped duplex) pode ser por exemplo, efectuado c&mo se segue. A região desejada para ser mutagenizada é clonada num vector fago M13 ροΰΰκ,ΙηίΜ uma mutação amber para preparar o ADN do fago de cadeia simples. Depois o RF I ADN do vector M13 sem a mutaçào amber e linearizado pelo tratamento da enzima de restrição, o ADN é misturado com o ADN do fago de cadeia simples mencionado acima, desnaturado, e emparelhado formando deste modo o "ADN gapped duplex". Um oligonucleótido sintético em que as mutações são introduzidas é hibridizado com o ADN "gapped duplex" e os ADN de cadeia dupla circular fechada são preparados através de reacções com polimerase de ADN e ligase de ADN. Células de E. coli mutS, deficientes na actividaae de reparação de erros de emparelhamento são transfectadas com este ADN. Células de E. coli sem actividade de supressão são infectadas com os fagos crescidos, e apenas os fagos sem mutação amber são pesquisados. 0 método através do qual uma mutação pontual é introduzida com nitrilos utiliza, por exemplo os princípios mencionados a seguir. Se o ADN for tratado com nitrito, as bases são desaminadas para alterar a adenina em hipoxantina, cítosina em uracilo, e guanina em xantina. Se ADN desaminado e introduzido em células, "A:T" e "G:C" são substituídas com "G:C" e "A:T", respectivamente, porque a hipoxantina, uracilo e xantina formam um par de bases com cítosina, adenina, e timina, respectivamente, porque a hipoxantina, uracilo, e xantina formam um par de bases com cítosina, adenina, e timina, respectivamente na replicação de ADN. Actualmente, fragmentos de ADN de cadeia simples tratados com nitrilo são hibridizados com "ADN gapped duplex", e depois as estirpes mutantes são separadas manipulando-as do mesmo modo que na mutagénese dirigida dos olígonucleótidos sintéticos (método gapped duplex). São utilizados tripletcs alfabéticos ou eÔdifM de uma letra para representar aminoácidos na presente especificação ou figuras significando os aminoácidos que se (Ala/A) alanina, (Val/V) valina seguem. (Gly/G) glícina, (Leu/L) leucina, (Ile/T) isoleucina, (Ser/S) serina, (Thr/T) treonína, ácido aspártico, 1 u ) ácido (Asn/N) asparagina, (Gln/Q) glutamina, (Lys/K) lisina, (Arg/R) arginina, (Cys/C) cisteína, metionina, (Phe/F) fenilalanina, (Tyr/Y) tirosina, (Trp/W) triptofano, (His/H) histidina, (Pro/P) prolina. 0 "polipéptido" que constitui a "molécula da superfície celular" acima mencionada como descrito nesta memória descritiva é uma proteína transmembranar que penetra a membrana celular, e a "molécula da superfície celular" é composta por um ou dois destes polipéptidos transmembranares.

Uma "proteína transmembranar" significa uma proteína que se liga a membranas através da região hidrofóbica do péptido penetrando na dupla camada lipídica da membrana uma ou várias vezes e cuja estrutura ê como um todo composta por três regiões principais, isto é a região extracelular, região transmembranar, e região citoplasmática, como observado em muitos receptores ou moléculas da superfície celular. Uma tal proteína transmembranar constitui cada receptor ou molécula da superfície celular na forma de um monómero, homodímero, heterodímero ou oligómero com outra(s) cadeia (s) possuindo a mesma ou diferente sequência de aminoácidos. C "fragmento polipeptidico" aqui descrito é um fragmento do "polipéptido" acima definido da presente invenção, e preferencialmente a região extracelular do polipéptido. Um de cinco aminoácidos, se desejado, podem ser adicionados ao terminal Iti e/ ou ao terminal C desta região.

Uma região "extracelular" significa aqui a estrutura completa ou uma porção da estrutura parcial (região parcial) da estrutura completa da proteína transmembranar acima mencionada em que a estrutura parcial existe fora da membrana. Por outras palavras, significa a região completa ou uma pc-rção da região da proteína transmembranar excepto a região incorporada na membrana (região transmembranar) e â região que existe no citoplasma a seguir à região transmembranar (região citoplásmica). 0 termo "a região constante, ou uma porção da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana ug) quando aqui utilizado significa a região constante ou a região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina derivada dos seres humanos (cadeia H, do inglês heavy chain), ou uma porção delas. A imunoglobulina pode ser qualquer imunoglobulina pertencente a qualquer classe e qualquer subclasse. Especificamente, exemplos de imunoglobulina são IgG (IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4), IgM, IgA (IgAl e IgA2), IgD, e IgE. Preferencialmente, a imunoglobulina e IgG (IgGl, IgG2, IgG3,. ou IgG4), ou IgM. Exemplos de imunoglobulinas particularmente preferidas da presente invenção são aquelas que pertencem a IgG derivada dos seres humanos (IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4). A imunoglobulina possui uma unidade estrutural na forma de Y em que quatro cadeias compostas por duas cadeias homólogas leves (cadeias L, do inglês iight chains) e duas cadeias pesadas homólogas (cadeias H) encontram-se ligadas através de ligações dissulfureto (ligações S-S). A cadeia leve É composta pela região variável da ceia leve (VL) e pela região constante da cadeia leve (CL). A cadeia pesada é composta pela região variável da cadeia pesada (VH) e pela região constante da cadeia pesada (CH). A região constante da cadeia pesada é composta por alguns domínios que possuem as sequências de aminoácidos inerentes de cada classe (IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE) e cada subclasse (IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4, IgAl, e rgã2.'| , A cadeia pesada de IgG (IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4) e composta pelo domínio de VH, CHI, região conectora, domínio CH2, e domínio CE3 por esta ordem a partir do terminal N. D- forma semelhante, a cadeia pesada de IgGl é composta por VH, domínio região conectora, domínio C"f]2, e domínio Cyi3 por esta ordem a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgG2 é composta por VH, domínio Cy2l, região conectora, domínio Cy22 e domínio Cy23, nesta ordem a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgG3 ê composta por VH, domínio 073!, região conectora, domínio vyyC, e domínio Cy33 nesta ordem a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgG4 e composta por VH, domínio região conectora, domínio domínio Cy42, e domínio Cy43 nesta ordem a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgA é composta por VH, domínio Cal, região conectora, domínio Ca2, e domínio Ca3 por esta ordem a partir do terminal N.

De forma semelhante a cadeia de IgAl é composta por VH, domínio Cal, região conectora, domínio Cai2, e domínio Cai3 por esta ordem a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgA2 e composta por VH, domínio Ca2l, região conectora, domínio Ca22, e domínio Ca23 por esta ordem a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgD é composta por VH, domínio Côl, região conectora, domínio Cô2, e domínio C63 por esta ordem a partir do terminal N. A cadeia pesada ae IgM ê composta por VH, domínio Cpl, domínio Cp2, domínio 0μ3 e domínio 0μ4 por esta ordem a partir do terminal N e não possuem nenhuma região conectora, tal como observado em IgG, IgA e IgD. A cadeia pesada de IgE ê composta por VH, domínio C%1,· thyititio Cs2, domínio Cs3 e domínio Cs4 por o ordem a partir do terminal N e não possuem nenhuma região conectora, tal como observado em IgG, IgA e IgD.

Se por exemple, IgG for tratado com papaina, è cindida no lado dc terminal 1$ leve para além das ligações dissuifureto que existem na região conectora mm que as ligações dissuifureto ligam as duas cadeias pesadas para gerar dois Fab homólogos, em que um fragmento de cadeia pesada composto por VH e CHI ú ligado com uma cadeia ieve através de uma ligação dissuifureto, e um Fc, em que dois fragmentos da cadeia pesada homólogos compostos pela região Conectora, domínio CH2, e domínio CH3 estão ligados através de ligações dissuifureto (ver "Immunology Ilustrated", origina da 2a ed. Nankodo, pág. 65-75 (1992); e "Focus of Newest Medicai Science 'Recognition Mechanism of Iramune System'", Nankodo, pág. 4-7 (1991); etc.).

Nomeadamente, "uma porção de uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina" como aqui descrito significa uma porção de uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina que possui as características estruturais mencionadas acima, e preferencialmente, e a região constante sem o domínio Cl, ou a região Fc. Especificamente, exemplos são a região composta pela região conectora, domínio C2, e domínio C3 de cada IgG, IgA, e IgD e são a região composta pelo domínio C2, domínio C3, e domínio C4 de cada IgM e IgE. Um exemplo particularmente preferido e a região Fc de IgGl derivado do ser humano. 0 "polipéptído de fusão" aqui descrito i composto pela região extracelular do "polipéptído" que constitui a "molécula de superfície aqui descrita" e uma "região constante ou uma porção de uma região constante da cadeia pesada da i&tindgl humana (Ig)". Preferencialmente é um polipéptído de fusão composto por uma região extracelular de um; polipéptído aqui descrito e uma porção de uma região constante da cadeia pesada da IgG humana, e particularmente preferido, e um peptido de fusão composto por uma região extracelular de um polipeptido aqui descrito e uma região (Fc) composta por uma região conectora, om domínio CH2, e domínio CH3 da cadeia pesada de IgG humano. Alem disso IgGl é preferido entre os IgG. Adicionalmente, um polipéptido derivado de um ser humano, ratinho, ou rato (preferencialmente, do ser humano) é preferível como o polipéptido aqui descrito. 0 polipéptido de fusão aqui descrito possui a vantagem de o polipéptido de fusão poder ser purificado de uma forma extremamente fácil utilizando cromatografia de afinidade em coluna utilizando a propriedade da proteína A que se liga especificamente ao fragmento de imunoglobulina porque o polipéptido de fusão possui uma porção de uma região constante (por exemplo Fc) de uma imunoglobulina tal como IgG como mencionado acima como parceiro de fusão. Além disso, uma vez que vários anticorpos contra o Fc de várias imunoglobulinas se encontram disponíveis, pode ser realizado facilmente um irnunoensaio para os polipéptidos de fusão com anticorpos contra o Fc. 0 polipeptido da presente invenção, fragmentos de polipétidos e polipéptidos de fusão como aqui descritos podem ser produzidos não apenas com tecnologia de ADN recombinante como mencionado abaixo, mas também através de um método bem conhecido no estado da técnica, tal como um método de síntese química e um método de cultura de células, ou um seu método modificado. 0 polipéptido da invenção consiste na sequência de aminoácidos, tal como apresentada na SEQ ID N°.2. 0 "gene compreende" um ADN que codifica para 0 polipéptido acima mencionado ou um fragmento de polipéptido, e inclui qualquer gene que possui uma sequência nuc) Leótídica que codifica para um polipéptido ou para um fragmento de polipéptido descrito acima ccmo descrito a seguir. (1) polipéptido codificado por um ADN que hibridiza com um ADN que compreende uma sequência nucieotidica da SEQ ID N°:l em condições severas; (2) polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos que possui 60% ou mais de homologia com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:2; (3) polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2 ou uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (nomeadamente, um polipéptido que constitui um "antigénio JTT-1 humano" e seu derivado); (4) polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos codificada uma sequência nucieotidica correspondendo aos resíduos nucleotidicos 26 a 625 da SEQ ID N°:3 ou uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (nomeadamente, um polipéptido que constitui um "antigénio JTT-1 humano" e seu derivado); (5) um polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos codificada assa sequência nucieotidica correspondendo aos resíduos nucleotidicos 35 a 637 da SEQ ID N°:4 ou uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (nomeadamente, ism polipéptido que constitui um "antigénio JTT-1 de rato" e seu derivado); 16j um polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleótidica correspondendo aos resíduos nucleotidicos 1 a 603 da SEQ ID N°:5 ou uma sequência de aminoácidos substzncialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (ncmeadamente, um polipéptido que constitui um "antigénio JTT-1 de ratinho" e seu derivado); (7) polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleótidica que corresponde aos resíduos nucleotidicos 35 a 685 da SEQ ID N°:6 ou uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos (nomeadamente, um polipéptido que constitui " um mutante do antigénio JTT-1 do rato" e seu derivado); e (8) polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos codificada por um ADN codificado por um polipéptido que constitui a molécula da superfície celular da presente invenção, em que o ADN e introduzido no transformante identificado por um número de depósito internacional N° FERM BP-5725 ou, que possui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma que a dita sequência de aminoácidos (nomeadamente um polipéptido que constitui um "antigénio humano JTT-1" e seu derivado).

Nesta memória descritiva "substancialmente a mesma sequência de aminoácidos" significa o definido acima.

Exemplos específicos do gene da presente invenção sãs geres que compreendem uma molécula de ácido nucleico como mencionado abaixo. sequência (I) Um s;:Dai que consiste na

nucleótidica da 'SEQ ID N°: I

Um ADN que consiste na sequência nucleótidica desde os resíduos nucleotidicos 26-625 da SEQ ID N°:3;

Um ADN que codifica para u::s polipéptido que constitui uma molécula da superfície celular áà presente invenção, em que o ACN é introduzido num transformante identificado por um número internacional de depósito N° FERM RP-5'725 . 0 ADN que codifica para uma porção da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina que faz parte de um polipéptido de fusão descrito acima, pode ser cADN ou ADN genómíco constituído por intrões entre cada exão (o ADN que codifica por exemplo para o domínio CHI, região conectora, domínio CH2, domínio CH3, domínio CH4 etc.)· 0 ADN da presente invenção inclui qualquer ADN constituído por quaisquer codões desde que os codões codifiquem para os mesmos aminoácidos. 0 ADN da presente invenção pode ser um ADN obtido por qualquer método. Por exemplo, o ADN inclui ADN complementar (cADN) preparado a partir de mARN, o ADN preparado a partir de ADN genómíco, ADN preparado por síntese química, ADN obtido por amplificação por PCR (do inglês polimerase Chain reaction) com ARN ou ADN como estrutura de base, e ADN construído através de uma combinação conveniente destes métodos. 0 ADN que codifica para o polipéptido da presente invenção pode ser obtido, através dos métodos usuais, tal como um método para clonar cADN a partir de mARN que codifica para o polipéptido da presente invenção, um método para isoiar o ADN genómíco e para depois efectuar a sua cisão, síntese química etc. (1) 0 cADN pode ser clonado a partir de mARN que codifica para o polipéptido da presente invenção, através por exemplo, do método descrito abaixo.

Primeiro, o 0¾ que codifica para uma molécula da superfície celular (polipéptido) da presente invenção é preparado a partir de tecidos ou ctlaltò (por exemple, células de timo ou células linfoblásticas derivadas de baço estimuladas com ConA) que expressa e produz uma molécula da superfície celular (polipéptido) da presente invenção. 0 mARN pode ser preparado isolando o ARN total através de um método conhecido, tal como o método da quanidina tiocianato (Chirqwin, J. M. Et al., Biochemistry, vol. 18, p5294, 1979), método do fenol a quente, ou método AGPC, e sujeitando-o a uma cromatografia de afinidade utilizando celulose oligo-dT ou Sefarose poli-U.

Depois com o obtido como estrutura base, é sintetizado cADN, por exemplo, através de um método bem conhecido utilizando transcriptase reversa, tal como o método de Okayama et al. (Mol. Cell. Biol. Vol. 2, pág. 161 (1982); ibid. vol.3, pág. 280 (1983)) ou o método de Hoffman et al. (Gene vol. 25, pág. 263 (1983)), e converte-I.o em cADN de cadeia dupla. E preparada uma biblioteca de cADN transformando E. coli com vectores plasmídicos, vectores de fagos, ou vectores de cosmídeos possuindo este cADN ou por transfecção de E, coli após embalamento in vitro.

Os vectores plasmídicos utilizados nesta invenção não são limitados desde que sejam replicados e mantidos em hospedeiros. Pode ser utilizado qualquer vector de fagos que possam ser replicados em hospedeiros. Exemplos de vectores de clonagem habitualmente utilizados são pMElítB, λΖΑΡΙΙ , pUC19, ÀgtlO, Xgtll etc. Quando o vector é aplicado ao rastreio ímunológíco como mencionado abaixo, o vttttr que possui um promotor que pode exprimir um gene que codifica para o polipéptido da presente invenção num hospedeiro é preferencialmente utilizado. 0 cADN pode ser inserido num plasmideo, por exemplo através do método de Maniatis et al. (Molecular Cloning A Laboratory HtPvtlí segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.53, 1989). 0 cADN pode ser inserido num vector fagc, através por exemplo do método de Hyunh et al. (ACM cloning, a practical approach, vol. I, pág.49 (1985)· . Estes métodos podem simplesmente ser efectuados utilizando um kit de clonagem disponível comercialmente (por exemplo um produto de Takara Shuzo). O vector de plasmideo recombinante ou de fago assim obtido é introduzido em células hospedeiras apropriadas, tal como um procarionte (por exemplo, E. coli: XLIBlue MRF', DH5a, HB101, ÍClíiêl/v3f etc.) .

Exemplos de um método para introduzir um plasmideo num hospedeiro é o método do cloreto de cálcio, método do cloreto de cálcio/ cloreto de rubídio descrito em Molecular Cloning A Laboratory Manual, (segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.74, (1989)), e método de electroporação. Vectores fagos podem ser introduzidos em células hospedeiras, através por exemplo de um método em que os ADN do fago são introduzidos em hospedeiros feitos crescer após empacotamento in vitro. O empacotamento in vitro pode ser efectuado facilmente com um kit de empacotamento in vitro disponível comercialmente (por exemplo, um produto da Stratagene ou da Ãmersham). 0 cADN que codifica para o polipéptido da presente iriviiipívio pode ser isolado a partir da biblioteca de cADN preparada de acordo com o método mencionado acima smfci&snsfó métodos gerais de rastreío de cADN.

Por um clone compreendendo o cADN desejado pode ser rastreado por um método de hibridízação de colónias conhecido (Crunstein et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 72, pag. 3961 (1975)) ou método de hibridização de placa (Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 2'*101* (1989)) utilizando oligonucieótidos sintetizados quimicamente marcados com i2P como sondas, que correspondem à sequência de aminoâcidos do polipéptido da presente invenção. Alternativamente, um clone que possui um fragmento de ADN que codifica para uma região especifica no polipéptido da presente invenção pode ser rastreado, através da amplificação da região por PCR com iniciadores de PCR sintéticos.

Quando é usada uma biblioteca da cADN preparada utilizando um vector de expressão de cADN (por exemplo, um vector fago λΖΑΡΙΙ), o clone desejado pode ser rastreado pela reacção antigénio- anticorpo utilizando um anticorpo contra o polipéptido da presente invenção. Um método de rastreio que utiliza um método de PCR é utilizado preferencialmente quando muitos clones são sujeitos a rastreio. A sequência nucleotidica do ADN obtido deste modo pode ser determinada pelo método de Maxam-Gilbert (Maxam et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 74, pág. 560 (1977)), ou pelo método de terminação de cadeia do didesoxinucleótido sintético utilizando o fago M13 (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 74, pág. 5463-5467 (1977)). Todo ou uma parte do gene que codifica para um polipéptido da presente invenção pode ser obtida cortando o clone obtido ccmo mencionado acima com enzimas de restrição etc. (2) O ADN que codifica para o polipéptido da presente invenção pode ser isolado a partir do AGN genómico derivado das células que expressam o polipéptido da presente invenção como mencionado anteriormente, através dos métodos

Tais células sãc solubilizadas preferencialmente por SDÇ ou proteinase K, e os ADNs são desprcteinizados, através de extracção repetida com fenol. Os ARNs são digeridos preferencialmente com ribonuclease. Os ADN obtidos são digeridos parcialmente com enzimas de restrição apropriadas, e os fragmento de ADN obtidos são amplificados com o fago ou cosmideo apropriado para gerar una biblioteca. Depois os clones que possuem a sequência desejada são detectados, por exemplo, utilizando sondas de MM marcadas com radioactividade, e o gene completo ou uma porção que codifica para o polipeptido da presente invenção é obtido a partir dos clones por corte com enzima de restrição etc. 0 cADN que codifica para um polipéptido derivado dos seres humanos pode ser obtido como se segue. Após ter sido preparada uma biblioteca de cosmideo na qual ADN genómico humano (ADN cromossómico) é introduzido e preparado ("Laboratory Manual: Human Genome Mapping", editora Maruzen), clones positivos compreendendo o ADN da região de codificação da proteína desejada são obtidos através de pesquisa da biblioteca de cosmídeos. Depois, a biblioteca de cADN mencionada acima é pesquisada com o ADN codificador cortado do clone positivo como uma sonda para preparar o cADN humano. (3) O ADN da presente invenção pode ser sintetizado quimicamente através do método usual, baseado na sequência nucleótidíca da SEQ ID N°:l, ou 3. A presente invenção aiz também respeito a um vector recombinante compreendendo o ADN que codifica para o polipeptido mencionado acima da presente invenção. 0 vector recombinante da presente invenção não se encontra Limitado desde que possa ser replicado e mantido ou se possa replicar autonomamente em vários hospedeiros procariontes e/ ou eucariontes. 0 vector da presente invençáo inclui vectores plasrnídicos e vectores de fagos. 0 vector recombinante pode ser facilmente preparado ligando o que codifica para o polipéptido da presente invenção com um vector para recombinação disponível no estado da técnica (ADN plasmidico e ADN bacteriófago), através do método usual.

Exemplos de vectores específicos para recombinação utilizados são plasmídeos derivados de E. coli tais como pBR322, pBR325, pUC12, pUCl3, e pUC19, plasmídeos derivados de leveduras tais como pSH19 e pSH15, e plasmídeos derivados de Bacillus subtilis, tais como pUBUO, pTP5, e pC194. Exemplos de fagos são bacteriófagos tais como o fago h e um vírus de um animal ou de um insecto (pVLl393, invitrogen) tal como um retrovírus, um vírus de vaccinia, e um vírus de polihedrose nuclear.

Um vector de expressão é Útil para expressar o ADN que codifica para os polipéptidos da presente invenção e para produzir o polipéptido da presente invenção. 0 vector de expressão não se encontra limitado desde que expresse o gene que codifica para o polipéptido da presente invenção em várias células hospedeiras procarióticas e/ ou eucarióticas e que produza esta proteína. Exemplos são pEFneo (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol.91, pág. 158-162 (1994)), pEF-BOS (Nucieic Acids Res. Vol. 18, p. 5322 (lAéO/íí pME18S (Experimental Medicine: ÇUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992)), pMAL C2, etc.

Quando são utilizadas células de leveduras, células animais, ou células de ínsectos como células hospedeiras, um vector de expressão é constituído geralmente por pelo pççttêç um promotor, um codão de iniciação, o ADN que codifica para o polipéptido da presente invenção, e um utiddo de terminação. Quando as h&tti tilç; em particular E. coli são utilizadas como células hospedeiras, um vector de expressão é constituído geralmente por pelo menos, uma região promotora/ operadora, um codão de iniciação, o ADN que codifica para o polipéptido da presente invenção, e um codão de terminação. Também pode compreender o ADN que codifica para um péptido de sinalização, sequência de ampiificação, região não traduzida 5'- e 3' do gene que codifica para o polipéptido da presente invenção, junções de união, local de poliadenilação, região do marcador seleccionável e replicão. O vector de expressão pode também conter se necessário, um gene para amplificação (marcador) que é geralmente utilizado.

Uma região promotora/ operadora para expressar o polipéptido da presente invenção em bactérias compreende um promotor, um operador, e uma sequência Shine-Dalgarno (SD) (por exemplo, AAGG) . Por exemplo, quando o hospedeiro é Escherichia, compreende preferencialmente um promotor Trp, ias promotor lac, um promotor recA, um promotor λΡΕ, um promotor Ipp, um promotor tac ou semelhantes. Exemplos de um promotor para expressar o polipéptido da presente invenção em leveduras são os promotores PH05, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH, etc. Quando o hospedeiro é Bacillus, são exemplos de promotores o promotor SL01, promotor SP02, promotor penP etc. Quando o hospedeiro é uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamífero, são exemplos de promotores, o promotor derivado de SV40, promotor de retrovírus, promotor de choque por calor, promotor EF, etc. e preferencialmente SV-40, SRa, e o derivado de retrovírus. De facto, o promotor não se encontra limitado aos exemplos acima. Mém disso, c utilização de um amplificador é eficaz paro a expressão. por

Um codão de iniciaçáo preferido é, • ·:,οΐ·:: de metionina (A7G) . 0 codão de terminação nabitualmente utilizado (por exemplo, TAG, TGA, TAA, etc.) é ilustrado como um codão ae terminação.

Terninadores naturais ou sintéticos geralmente utilizados são usados como uma região de terminação.

Um replicão significa um ADN capaz de replicar a sequência completa de ADN em células hospedeiras, e inclui um plasrnideo natural, um plasmideo modificado artificial (um fragmento de ADN preparado a partir de um plasmideo natural), um plasmideo sintético, e etc. Exemplos de plasmídeos preferidos são pBR322 ou os seus derivados artificiais (o fragmento de ADN obtido através do tratamento de pBR322 com enzimas de restrição apropriadas) para E. coii, plasmideo 2 μ de leveduras ou ADN cromossómico para leveduras, e pEFneo, pME!8S, pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149, etc. para células de mamíferos.

Também pode ser utilizada uma sequência de amplificação, um local de poliadenilação, e junção de uniões que são geralmente usados no estado da técnica, tais como os derivados de SV40.

Um marcador seleccionável geralmente empregue pode ser utilizado de acordo com o método usual. Exemplos são genes resistentes aos antibióticos, tais como tetraciclina, neomicina, ampicilina, ou canamicina, e gene de timidina cinase.

Exemplos de um gene para amplificação genética é o çene da díhidrofolato redutase (DHFR), gene da timidina cinase, gene da resistência á neomicina, gene da giutamato síntase, gene da adencsína desaminase, gene da ornitina descarcoxilase, gene d,s higromicina-B-fosfotransferase, gene do aspartato de transcarbamiiase, eic. 0 vector de expressão da presente pode ser preparado ligando-se de forma contínua e circular pelo menos o promotor acima mencionado, codão de iniciação, ADN que codifica para o polipéptido da presente invenção, codão de terminação, e região de terminação a um replicão apropriado. Se desejado, fragmentos de ADN apropriados exemplo, agentes de ligação, locais de restriçãc gerados com outra enzima de restrição), podem ser utilizados pelo método usual, tal como diçestão com uma enzima de restrição ou ligação utilizando ligase de ADN T4.

Os transformantes da presente invenção podem ser preparados introduzindo um vector de expressão mencionado acima nas células hospedeiras.

Os transformantes da presente invenção não estão limitados desde que sejam compatíveis com um vector de expressão mencionado acima e podem ser transformados. São exemplos várias células, tais como células naturais, ou células recombinantes estabelecidas artificialmente utilizadas geralmente no campo técnico da presente invenção (por exemplo, bactérias (Escherichia e Bacillus), leveduras (Saccharomyces, Pichia, etc.), células animais, ou células de insectos. São preferencialmente utilizadas células de E. coli ou animais. Exemplos específicos são E. coli (DHSa, XLIBlue MRF', TB1, HB101, etc.), células derivadas do ratinho (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3, etc.), células derivadas de rato, células derivadas de hamster (BHK, CH0-K1, CHO, etc.), células derivados do macaco (COSI, COSI, CQS7, CV1, Velo, etc.), e células derivadas dos seres humanos (HEK293, Hela, células derivadas de fibroblastcs diploides, mieloma, Namalwa, etc.).

Um vector de expressão pode ser introduzido ít(transducuado) ; em células hospedeiras, através de métodos canhecidcs. A transformação pode ser efectuada, por exemplo de acordo com o método de Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 69, pág. 2110 (1972)), método do protoplasto :ífc.U Gen. Genet., vol. 168, pág. 111 £Ι5ΓΗ^·> -t ou método competente, (J. Mol. Bicl., vol. 56, pág. 209 (1971)), quando os hospedeiros são bactérias ?I> ç&Lí, Bacillus subtilis etc.), c método de Hinnen et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 75, pág. 1927 (1978)), ou o método do lítio :;J:. Bacteriol., vol. 153, p.163 (1983)) quando o hóspede é Saccharomyces cerevisiae, método de Gradam (Virology, vol. 52, pág. 456 (1973)) quando os hospedeiros são células animais, e o método de Summers et al. (Mol. Cell. Biol., vol 3, pag. 2156-2165 (1983)) quando os hospedeiros são células de insectos. O polipéptido da presente invenção pode ser produzido cultivando os transformantes ( seguidamente este termo inclui transductantes) compreendendo um vector de expressão preparado como mencionado acima no meio nutriente. O meio nutriente compreende preferencialmente uma fonte de carbono, uma fonte de azoto inorgânico, ou uma fonte de azoto orgânico necessária para o crescimento de células hospedeiras (transformantes). Exemplos de fontes de carbono são glucose, dextrano, amido solúvel, e sacarose, e exemplos de fontes inorgânicas ou orgânicas de azoto são sais de amónio, nitratos, aminoácidos, licor de maceração do milho, peptona, caseína, extracto de carne, bolo de soja, e extracto de batata. Se desejado, podem compreender outros nutrientes (por exemplo um sal inorgânico (por exemplo, clcreto de cálcio, dihidrogenofosfato de sódio, e cloreto de magnésio), vitaminas, antibióticos (por exempio, tetraciclina, neomicina, ampicilína, canamicina, etc.). A cultura e efectuada per um métoao conhecido do estado da técnica. Condições de cultura tais como tôMavtíttttt f ον do meio, e tempo de cultura são seleccionados de forma apropriada de modo que o polipéptido aa presente invenção seja produzido em excesso.

Os meios específicos e condições de cultura utilizados dependentes das células hospedeiias são ilustrados abaixo, mas não se encontram Limitados apenas a estes.

Quando os hospedeiros são bactérias, actinomicetes, leveduras, filamentos, fungos, é adequado meio líquido compreendendo a fonte de nutrientes mencionada acima. São utilizados preferencialmente meios com pH 5 a 8.

Quando a célula hospedeira é E. coli, exemplos de meios preferidos são meios LB, e meios M9) (Miller et al. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 431 (1972)). Utilizando estes meios, a cultura pode ser efectuada geralmente a 14 a 43°C durante cerca de 3 a 24 horas com arejamento e agitação se necessário.

Quando o hospedeiro e Bacillus, a cultura pode ser efectuada geralmente de 30 a 40°C durante cerca de 16 a 96 horas com arejamento e agitação se necessário.

Quando o hospedeiro e a levedura, exemplos de meios são o meio mínimo de Burkholder (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 77, pág. 4505 (1980)). O pH do meio e preferencialmente 5 a 8. A cultura pode ser efectuada geralmente de 20 a 35°C durante cerca de 14 a 144 horas com arejamento e agitação se necessário.

Quando o hospedeiro é uma célula animal, exemplos de meios são MEM contendo cerca de 5 a 20% de soro fetal de bovino (Science, vol. 122, pág. 501 (1952)), meio DMEM (Virology, vol. 8, pág. 396 (1959)), miú RPMI1640 (J. Pm,

Med. Assoe., vol. 199, p. .519 (1967)) , e meio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., w;í 73, pág. 1 (1950)). 0 pH do meio i preferencialmente cerca de 6 a 8. A cultura pode ser efectuada geralmente a cerca de 30 a 40°C durante cerca de 15 a 72 horas ccm arejamento e agitação se necessário. USA, vol. 82, pág. 8404

Quando o hospedeiro é uma célula de insecto, um exemplo de meio é meio de Grace contendo soro fetal às bovino (Proc. Natl. Acad. Sei. (1985)) . 0 seu ρΗ é preferencialmente cerca de 5 a S. A cultura pode ser efectuada geralmente a cerca de 20 a 40°C durante 15 a 100 horas com arejamento e agitação se necessário. A cultura de transformanf.es como mencionado acima, em particular de células animais pode expressar em excesso o polipéptido da presente invenção a superfície das células. 0 polipéptido aqui descrito pode ser produzido como um fragmento de polipéptido solúvel, tal como um fragmento da região extracelular preparando os transformantes como mencionado acima utilizando o ADN que codifica para a região extracelular, ou para cada domínio e por cultivo dos transformantes para permitir que eles secretem o polipéptido solúvel no sobrenadante da cultura. Além disso, um polipéptido de fusão aqui descrito pode ser preparado de forma semelhante.

Nomeadamente um filtrado da cultura (sobrenadante) é obtido através dum método, tal como filtração ou centrifugação da cultura obtida, e o polipéptido da presente invenção, fragmento de polipéptido de acordo com o aqui descrito é purificado e isolado a partir do filtrado da cultura, através do método usual geralmente utilizado para purificar e isolar uma proteína natural ou sintética.

Exemplos do método de isolamento e purificação são um método que utiliza a solubilidade, tal como "salting out", e método de precipitação com solvente, um método que utiliza a diferença em peso molecular, tal como a diálise, ultrafiltração, filtração por gel, electroforese em gel de dodecil- sulfato m sódio- poliacrilamida, um método de utiliza cargas, tal como cromatografia de permuta iónica e cçpmfsdraflç de um método que utiliza afinidade, tal como cromatografia de afinidade, um método que ati U-M a diferença em hidrofobicidade, tal como cromatografia liquida de alua eficiência de fase reversa, um método que utiliza a diferença no ponto isoeléctrico, tal a focagem isoeléctriva.

Quando o polipéptido da presente invenção ou um fragmento ae polipéptido aqui descrito existe no períplasma 00 citoplasma de transformantes cultivados, primeiro os corpos fúngicos ou células são recolhidos, através do método usual, tal como filtração ou centrifugação e é suspenso no tampão adequado. Após a parede celular «/ ou membrana celular das células etc. terem sido destruídas por -,-:¾ método tal como lise com ultra-sons, lisozíma, e congelamento- aescongelamento, a fracção da membrana que compreende o polipéptido da presente invenção é obtida por um método, tal como centrifugação ou filtração. A fracção da membrana e solubilizada com um detergente, tal como Triton-X100 para obter o extracto em bruto. Finalmente, o polipéptido ou o fragmento de polipéptido é isolado e purificado a partir do extracto em bruto, através dos métodos usuais, tal como ilustrado acima. 0 "ratinho transgénico" è um ratinho transgenico em que o ADN (cADN ou ADN genómico) preparado como mencionado acima que codifica para o polipéptido descrito acima derivado de animais excepto do ratinho (polipéptido não próprio) foi integrado no local endógeno do ratinho. 0 ratinho transgénico expressa o polipéptido não próprio e secreta o polipéptido para o seu corpo. 0 ratinho transgénico pode ser preparado de acordo com o método geralmente utilizado para produzir um animal transgénico ímt por exemplo "Newest Manual of idcldsíO Cell Experiment", editora LIC, Capitulo 7, pág 361-408, (1990)).

Especificamente, por exemplo para células estaminais embrionárias (células ES, do inglês embrionary stem cells) obtidas a partir de blastocistos de ratinho normal são transformados com Uít vector de expressão em que o gene que codifica para o poidptpt 1 d-o derivado de seres humanos da presente invenção (i. e. "antigenio humano JTT-1" foi inserido operacicnalmente). Células ES em que o gene que codifica para o polipéptido derivado do ser humano da presente invenção foi integrado no gene endógeno são pesquisados pelo método habitual. Depois as células ES pesquisadas são microinjectadas num ovo fertilizado obtido a põrtir de outro ratinho normal (blastócito) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 77, N° 12, pág. 7380-7384 (1980); patente norte americana n° 4,873,191). O blastócito á transplantado para o útero de outro ratinho normal como mãe adoptiva. Depois os ratinhos fundadores (ratinhos de progenitura) nascem do ratinho mãe adoptiva. Cruzando os ratinhos fundadores com os ratinhos normais, são obtidos ratinhos transgenicos heterogenicos. Cruzando os ratinhos transgénicos heterogénicos uns com os outros são obtidos ratinhos transgénicos homogenicos de acordo com as leis de Mendel. "Ratinho desactivado -em inglês ratinho knocked out" e um ratinho em que o gene endógeno que codifica para o polipéptido derivado do ratinho como aqui descrito (i.e "antigénio do ratinho JTT-1") foi anulado (desactivado). Pode ser preparado, por exemplo, através do método de selecção positivo- negativo em que e aplicada uma recombinação homóloga (patente norte americana n° 5,464,764; n° 5,487,992; n° 5,627,059; Proc. Natl. Acad. Sei. USA vol. 86, pág. 8932-8935 (1989); Nature, vol. 342, pág. 435-438 (1989); etc.). O "anticorpo" da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal (antisoro) ou um anticorpo monoclonal, e preferencialmente um anticorpo monoclonal.

Especificamente é um anticorpo iiMbltivsí (contra, quo se liga a) ao polipéptido mencionado acima da presente invenção ou fragmentos polipéptidicos aqui descritos. 0 anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo natural obtido por imunização de mamíferos tais como rato, cobaias e coelhos com o antigénio, obtido a partir de células (células naturais, linhas celulares, células tumorais, etc.) que expressam "moléculas da superfície celular" da presente invenção, obtido a partir de transformantes que expressam em excesso o polipéptido ou moléculas humanas da superfície celular a sua superfície preparados utilizando tecnologia de ADN recombinante ou "fragmentos de polipéptidos" ou "polipéptidos de fusão" como aqui descrito. 0 anticorpo da presente invenção também inclui anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados (anticorpos enxertados com CDR) que podem ser produzidos por tecnologia de ADN recombinante, e anticorpos humanos que podem ser produzidos utilizando animais transgénicos produtores de anticorpos humanos. 0 anticorpo monoclonal inclui aqueles que possuem qualquer um isotipo de IgG, IgM, IgA, IgD, ou IgE. São preferidos IgG ou IgM. 0 anticorpo policlonal (antisoro) ou anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser produzido, através de métodos conhecidos. Nomeadamente, um mamífero, preferencialmente um rato, uma cobaia, ou coelho imunizado por exemplo com um antigénio mencionado acima com adjuvante de Freund se necessário. 0 anticorpo policlonal pode ser obtido através do antisoro obtido a partir do animal imunizado deste modo. Adicionalmente, os anticorpos monoclonais são produzidos como se segue. Os hibridomas são preparados a partir das células que produzem anticorpos obtidcs a partir do animai imunizado deste modo e de células do mieloma que não são capazes de produzir autoanticorpos. Os hibridomas são clonados, e os clones que produzem os anticorpos monoclonais que apresentam afinidade especifica para o antigénio utilizado para imunizar o animal são pesquisados.

Especificamente, o anticorpo monoclonal pode ser prodczido como se segue. As imunizações são efectuadas ínjectando ou implantando uma ou várias vezes o antigénio como especificado acima como um imunoçénio, se necessário com adjuvante de Freund, por via subcutânea, por via intramuscular, por via intravenosa, através da pata, ou por via intraperitoneal, num mamífero não humano, especificamente num rato, cobaia, ou coelho, preferencialmente um rato (incluindo um animal transgénico gerado de modo a produzir anticorpos derivado de outro animal, tal como o ratinho transgénico que produz anticorpo humano mencionado abaixo). Geralmente as imunizações são efectuadas uma a quatro vezes cada um a quatorze dias após a primeira imunização. Células produtoras de anticorpos são obtidas a partir do mamífero imunizado deste modo em cerca de um a cinco dias após a última imunização. A frequência e intervalo de imunizações pode ser disposto adequadamente dependendo da propriedade do imunogénio utilizado. Hibridomas que secretam um anticorpo monoclonal podem ser preparados pelo método de Koehler e Milstein (Nature, vol. 256, pág, 495-497 (1975)) e através do seu método modificado. Nomeadamente, os hibridomas são preparados fundindo células produtoras de anticorpos contidas num baço, num nódulo linfático, na medula óssea, ou amígdala obtido a partir do mamífero não humano, imunizado como mencionado acima, preferencialmente um baço, com míelomas sem a capacidade produtora de autoanticorpos, que são derivados de um mamífero, tal como um rato, uma cobaia, ou ser humano, ou mais preferencialmente, um rato ou ser humano.

Por exemplo, um mieloma derivado de ratinho Cã/KÇÓ·-AG8.653 (653), P3/NSI/l-Ag4-l (NÇ-Ib FÔÇMi-âfS .UI (iΚΠ> f SP2/0-Ag-14 (Sp2/0, Sp2), PAI, FO, ou BWS147, mieloma derivado do rato 210RCY3-Ag.2.3 ., ou mieloma derivado dos seres humanos GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11, ou CEM-TI5 pode ser utilizado como um mieloma usado para a fush-o celular.

Clones de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais podem ser pesquisados cultivando hibridomas, por exemplo em placas de microtitulação e medindo a reactividade do sobrenadante da cultura no poço em que é observado o crescimento do hibridoma para o imunogénio utilizado na imunização mencionada acima, por exemplo, através do imunoenssaio tal como RIA e ELISA.

Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos a partir de hibridomas cultivando os hibridomas in vitro ou in vivo tal como no fluido ascitico de um rato, cobaia, ou coelho, preferencialmente um rato e isolando os anticorpos do sobrenadante da cultura resultante, ou do fluido ascitico de um mamífero. O cultivo de hibridomas in vitro pode ser efectuado dependendo da propriedade das células a serem cultivadas, do objectivo do estudo de teste, e das varias condições do método de cultura, através da utilização de meios nutrientes conhecidos ou qualquer meio nutriente derivado de meio basal conhecido para o crescimento, mantendo e armazenando os hibridomas para produzir anticorpos monoclonais no sobrenadante da cultura.

Exemplos de meios basais são meios de baixa concentração de cálcio tal como meio de Ham'F12, meio MCDB153, ou meio MEM de baixa concentração de cálcio, e meios de elevada concentração de çáloiíS,. tal como o meio MCDB104; meio meio D....MEM, meio RPMI1640, meio ASF104, ou meio RC. 0 meio basal pode conter, por exemplo, soro, hormonas, cítocinas, e/ou várias substâncias orgânicas ou inorgânicas dependendo do objectivo.

Anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados a partir do sobrenadante da cultura ou do fluido ascitico mencionado acima, através de precipitação com sulfato de amónio saturado, método de precipitação da euglobulina, método do ácido caproico, método do ácido caprílico, cromatografia de permuta iónica (DEAE ou DE52), cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de imunoglobulina ou coluna de proteína A

Exemplos preferenciais de anticorpos monoclonais da presente invenção são os seguintes. (i) Um anticorpo especifico para o polipéptido que consiste na sequência de arninoácidos indicada na SEQ ID N° 2, em que o dito anticorpo é o anticorpo seleccionado a partir do grupo que consiste no anticorpo do rato, anticorpo da cobaia, anticorpo de coelho, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo humano, íl; Anticorpo de acordo com o ponto (1) em que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal ou uma porção do anticorpo monoclonal, em que a porção é seleccionada a partir do grupo que consiste em F(ab')2, Fab' e Fab. í3i Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de (1) ou (2) ou uma porção do anticorpo monoclonal como definido em (2), e um veículo farmaceuticamente aceitável. aqui ainda descritos os anticorpos monoclonais seguintes.

Um anticorpo mnoclonal reactivo a um polipéptido que possui uma sequência de arninoácidos da SEQ ID N° 2, um fragmento de polipéptido derivado do polipéptido, ou de uma molécula da superfície celular derivada dos seres humanos composta pelo polipéptido; Um anticorpo mcnoclonal reactivo a um polipéptido da presente invenção, um fragmento de polipéptido derivado do polipéptido, ou uma molécula da superfície celular composta pelo polipéptido, em que o efeito do anticorpo mnoclonal em células linfoblásticas estimuladas pelo mitogénio é substancialmente o mesmo que o efeito de um anticorpo monoclonal produzido por um hibrídoma identificado por um número de depósito internacional N ° FERM EP-5707 em células linfoblásticas de rato estimuladas por mitogénio; e

Um anticorpo monoclonal reactivo a um polipéptido da presente invenção, um fragmento de polipéptido derivado do polipéptido, ou uma molécula da superfície celular composta pelo polipéptido, em que o efeito do anticorpo monoclonal em células linfoblásticas de rato estimuladas por mitogénio é substancialmente o mesmo que o de um anticorpo monoclonal produzido por um hibrídoma identificado por um número de depósito internacional N° FERM BP-5708 em células linfoblásticas de rato estimuladas por mitogénio.

Além disso, o anticorpo monoclonal aqui descrito, inclui o produzido pelo hibrídoma identificado por um número de depósito internacional N° FERMI BP-5707 ou Rb1 0 "anticorpo monoclonal quimérico" da presente invenção e um anticorpo monoclonal preparado per engenharia genética, e significa especificamente um anticorpo quimérico tal como um anticorpo quimérico ratinho/ humano, cujas regiões . . derivam de uma imunoglobulina de um. mamífero não humano (ratinho, rato, hamster, etc.) e cujas regiões constantes são derivadas da imunoglobulina humana. A região constante derivada da imunoglobulina humana possui a sequência de aminoácidos inerente em cada isótopo tal como IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, e IgE. A região constante do anticorpo monoclonal quimérico recombinante da presente invenção pode ser o da imunoglobulina humana que pertence a qualquer isotipo. Preferencialmente e a região constante da IgG humana. 0 anticorpo monoclonal quimérico da presente invenção pode ser produzido, por exemplo como se segue. E desnecessário mencionar que o método de produção não se encontra limitado a este.

Um anticorpo monoclonal quimérico de ratinho/ humano pode ser preparado tendo como base Experimental Medicine: SUPPLEMENT, Vol. 1.6, N° 10 (1988); e o pedido de patente japonesa examinado publicado (JP-B) N° Hei 3-73280. Nomeadamente pode ser preparado inserindo operacionalmente o gene CH (gene C que codifica para a região constante da caaeia H) obtido a partir do ADN que codifica para a imunvylobulina a jusante dos genes VH activos (gene VDJ que sofreu um rearranjo que codifica para a região variável da cadeia 1Π obtido a partir do ACN que codifica para um anticorpo monoclonal de ratinho isolado a partir do hibridoma que produz o anticorpo monoclonal de ratinho, e o gene CL i gene C que codifica para a região constante L) obtido a partir do Mi; v codifica para a imunoglobulina humana a jusante dos genes VL activos (gene VJ submetido a um rearranjo que codifica para a região variável da cadeia L) obtido a partir do ADN que codifica para o anticorpo monoclonal de ratinho isolado a partir do hibridoma, nos mesmos ou diferentes vectores para serem expressos, seguindo-se a transformação de células hospedeiras com o vector de expressão, e depois cultivando os transformantes.

Especificamente os ADN são primeiro extraídos de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais de ratinho, através do método usual, são digeridos com os enzimas de restrição adequados (por exemplo, EcoRI e HindIII), são sujeitos a electroforese (utilizando por exemplo, 0,7% de gel de agarose), e são analisados por transferência de Southern. Após um gel sujeito a electrof orese ter sido corado, por exemplo com brometo de etídio e fotografado, o gel é fornecido com posições marcadas, lavado duas vezes com água, e impregnado em HC1 0,25 M durante 15 minutos. Depois o gel é impregnado com uma solução de NaOH a 0,4 N durante 10 minutos com uma agitação suave. Os ADNs são transferidos para um filtro durante 4 horas, através do método habitual. 0 filtro e recuperado e lavado duas vezes com 2xSSC. Após o filtro ter sido suficientemente seco, é aquecido a 75°C durante 3 horas. Após o aquecimento, o filtro e tratado com 0,1 xSSC/0,1% SDS a 65°C durante 30 minutos. Depois é impregnado em 3 x SSC/0,1% SDS. O filtro obtido e tratado com uma solução de pré-hibridização num saco plástico a 65°C durante 3 a 4 horas. A seguir adiciona-se uma sonda de ADN marcada com ;r e solução de hibridízação ao saco e feitos reagir a 65°C durante cerca de 12 horas. Após a hibridização, o filtro é lavado sob urra concentração adequada de sal, temperatura reaccíonal, e tempo (por exemplo, 2 x SSC-0,1% de SDS, temperatura ambiente, 10 minutos). O filtro é colocado num saco de plástico com um pouco de 2 x SSC, e sujeito a autoradiografia após o saco ser selado. 0 gene VDJ sujeito a rearranjo e o gene VJ que codifica para a cadeia H e cadeia i de um anticorpo mcnoclonal de ratinho são identificados por trasnferência de Southern mencionada acima. A região que compreende o fragmento de ADN identificado é fraccionaao por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose e inserido num vector fago (por exemplo, Charon 4A, Charon 28, λΕΜΒ1<3, etc. E. coli (for example, I.E392, NM539, etc.), é transformada com o vector fagc para gerar uma biblioteca genómica. A biblioteca genómica é pesquisada por hibridização em placa, tal como o método de Benton-Davis (Science, vol. 196, pág. 180-182 (1977 )) utilizando sondas adequadas (cadeia d do gene J, cadeia L (k) do gene J, etc.) para obter os clones positivos que compreendem o gene VDJ submetido a rearranjo, ou gene VJ. Elaborando o mapa de restrição e determinando a sequência nucleótidica dos clones obtidos, e confirmado que os genes que compreendem o desejado gene VH(VDJ) sujeito a rearranjo, ou gene VL (VJ) são obtidos São separados o gene humano CH e o gene humano CL para quimerização. Por exemplo, quando um anticorpo quimérico com IgGl humano é produzido, são isolados os genes Cyl, como um gene CH e o gene Ck como um gene CL. Os genes podem ser isolados a partir da biblioteca genómica humana com o gene de ratinho Cyl e o gene de ratinho Ck, correspondendo ao gene humano Cyl e ao gene humano Ck, respectivamente, como sondas aproveitando a vantagem da homologia elevada entre as sequências nucleótidicas do gene da imunoglubulina de ratinho e a do gene humano de imunoglobulina.

Específicamente, os fragmentos de ADN compreendendo c gene Ck e uma região de reforço são isoladas a partir da biblioteca genómica humana K Charon êà HaelII-Aiui (Celi. Vol. 15, pág. 1157-1174) (1978) por exemplo com ura Ι-αχίβίΜίΖΟ do clone Igl46 de 3 kb HindIII-BamHI (Froc.

Nati. Acad. Sei. USA, vol.75, pág. 4709-4713 (1978)) e um fragmento de EcoRI de 6,8 kb do clone MEP10 (Froc. Natl. Acad. Sei. USA, vol.78, pág. 474-478 (1981)) como sondas. Além disso, por exemplo, após o ADN do hepatócito fetal humano ser digerido com HindIII e fraccionado por electroforese em gel de agarose, um fragmento de 5,9 kb à inserido em h788 e depois o gene Cyl é isolado com as sondas mencionadas acima.

Utilizando o gene VH do ratinho, o gene VL do ratinho, o gene CH humano, e o gene CL humano obtidos deste modo e considerando a região promotora e a região de amplificação, o gene CH humano é inserido a jusante do gene VH do ratinho e o gene CL humano é inserido a jusante do gene VL do ratinho num vector de expressão tal como pSV2gpt ou pSV2neo com enzimas de restrição adequadas e ligase de ADN, através do método usual. Neste- caso, genes quiméricos do gene VH de ratinho/ gene CH humano e gene de ratinho VL/ gene CL humano pode ser inserido respectivamente no mesmo vector de expressão ou em vectores de expressão diferentes.

Vector(es) de expressão com inserção de genes quiméricos preparado(s) deste modo são introduzidos em mielomas que não produzem anticorpos, por exemplo, células P3X63.Ag8.653, ou células SP210, através do método de fusão de protoplasto, o método de DEAE-dextrano, o método de fosfato de cálcio, ou método de electroporação. Os transformantes são pesquisados por cultura em meios contendo um fármaco correspondente ao gene de resistência ao fármaco inserido no vector de expressão e, depois são obtidas as células que produzem os anticorpos monoclonais quiméricos.

Os anticorpos monoclonais quiméricos desejados são obtidos a partir do sobrenadante da cultura ou de células que produzem anticorpos pesquisadas deste modo. Ο " anticorpo monoclonal humanizado (anticorpo enxertado com CDR}" da presente invenção e um anticorpo monoclonal preparado por engenharia genética e significa especificamente um anticorpo monoclonal humanizado em que uma põtçic: ou as regiões completas determinantes da complementaridade da região hipervariável são derivadas o partir das regiões que determinam a complementaridade da região hipervariável de um anticorpo monoclonal de um mamífero não humano (ratinho, rato, hamster, etc.) as regiões de estrutura da região variávei são determinadas a partir das regiões de estrutura da região variável da imunoglobulina humana e a região constante deriva da região constante da imunoglobulina.

As regiões que determinam a complementaridade da região hipervariável existe na região hipervariável na região variável de um anticorpo e significa três regiões que se ligam directamente e de modo complementar a um antigénio (resíduos determinantes da complementaridade, CDR1, CDR2, e CDR3). As regiões de estrutura da região variável significam quatro regiões comparativamente conservadas que se situam a montante, a jusante ou entre as três regiões determinantes da complementaridade (região de estrutura, FR1, FR2, FR3, e FR4) .

Por outras palavras, um anticorpo monoclonal humanizado significa que na região completa excepto uma poryão ou todas as regiões que determinam a complementaridade da região hipervariável de um anticorpo monoclnnal de mamífero não humano foram substituídas pelas suas regiões correspondentes derivadas da imunoglobulina humana. A região constante derivada da imunoglobulina humana possui a sequência de aminoácidos inerente em cada ísotipo tal como IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD, e

IgE. A região constante de um anticorpo monoclonal humanizado na presente invenção pode ser a da imuncglobulina humana que pertence a qualquer isotipo. Preferencialmente ê a região constante de da IgG Kccosna. As regiões de estrutura da região constante derivadas da imuncglobulina humana não se encontram particularmente limitadas. 0 anticorpo monoclonal humanizado da presente invenção pode ser produzido, por exemplo como se segue. Não é necessário dizer que se encontra limitado a este.

Por exemplo, um anticorpo monoclonal humanizado recombinante derivado do anticorpo monoclonal de ratinho pode ser preparado por engenharia genética, no que diz respeito ao pedido de patente japonesa não examinado (JP-WA) N° Hei 4-506458 e pedido de patente japonesa não examinado (JP-A) N° Sho 62-296890. Nomeadamente pelo menos uma cadeia H do gene CDR de ratinho e pelo menos uma cadeia L do gene CDR de ratinho correspondendo a cadeia H do gene CDR de ratinho são isoladas dos hibridomas que produzem anticorpo monoclonal de ratinho, e cadeia H do gene humano que codifica para as regiões completas com excepção da cadeia H do CDR correspondendo a cadeia H do CDR de ratinho mencionada acima e cadeia L do gene humano que codifica para a região completa com excepção da cadeia L do CDR humano que corresponde a cadeia L do CDR de ratinho mencionada acima são isoladas a partir dos genes de imunoglobulina humana. genes A cadeia H do(s) gene(s) CDR de ratinho e a cadeia H do(s) gene(s) humano isolados deste modo são inseridos operacionalmente num outro vmiWt. apropriado de modo a poderem ser expressos. De forma semelhante, a cadeia L dc(s) gene (s) CDR de ratinho e a cadeia L do (s) humanos são inseridas operacionalmente num vector adequado de modo a poderem ser expressos. Alternativamente, a cadeia H DDhíb gene (s) CCR de ratinho/' cadeia D ms(s) humanos e cadeia L do(s) gene(s) CCR de ratinho/' cadeia L do(s) genes humanos podem ser inseridas operacionalmente no mesmo vector de expressão de modo a poderem ser expressas. As :: é i o la O hospedeiras são transformadas com o vector do expressão preparado deste modo para obter transformardes que proauzem anticorpo monoclonal humanizado. Cultivando os transformantes, o anticorpo monoclonal humanizado desejado é obtido a partir do sobrenadante da cultura. 0 "anticorpo monoclonal humano" da presente invenção é a imunoglobulina em que as regiões completas compreendendo a região variável e constante da cadeia H, e a região variável e constante da cadeia L que constitui a imunoglobulina são derivadas do gene que codifica para a imunoglobulina humana. 0 anticorpo humano pode ser produzido do mesmo modo que o método de produção dos anticorpos policlonais ou monoclonais mencionados acima imunizando com um antigénio, um animal transgénico em que por exemplo pelo menos o(s) gene(s) de imunoglobulina foram integrados no local de um mamífero não humano, tal como o ratinho, através do método usual.

Por exemplo um ratinho transgénico que produz anticorpos humanos é preparado através dos métodos descritos em Nature Genetics, vol. 7, pág. 13-21 (1994);

Nature Genetics, vol. 15 pág. 146-156 (1997); JP-WA N°s Hei 4-504365 e Hei 7-509137; Nikkei Science, N° 6, pág. 40-50 (1995); publicação da patente internacional N° WQ94/25585; Nature, vol, 368, pág. 856-859 (1994 ); e JP-WA rh" Hei 6- 500233.

Além disso, pode também ser apiicâda a técnica recentemente desenvolvida para produzir uma proteína derivada dos seres humanos a partir do leite de uma vaca ttanôqênio.:·;: ou porco (Nikkei Science, pág. 78-84 (Abril, a ^porção de um anticorpo" utilizado na presente invenção significa uma região parcial do anticorpc monoclonal como mencionada acima, e especifieamente, significa F (ab' } 2f Fab', uu Fab (Exp. Opin. Ther. Patents, vci. 6, N° 5, pág. 441 -456 (1996)} . "F(ab'i2" e "Fab" podem ser produzidas tratando a imunogiobulina (anticorpo monoclonal) com uma protease, tal como pepsina e papaina, e significa um fragmento de anticorpo gerado pela digestão da imunogiobulina próximas das ligações dissulfureto que existem entre as regiões conectoras em cada uma das duas regiões H. Por exemplo, a papaina vai cindir a IgG a montante das ligações dissulfureto que existem entre as regiões conectoras de cada uma das duas cadeias H para gerar dois fragmentos de anticorpo homólogos em que uma cadeia L composta por VL (região variável da cadeia L) e CL ( região constante da cadeia L), e um fragmento da cadeia H composto por ¥11 (região variável da cadeia H) e CHyl (região yl na região constante da cadeia H) estão ligadas nas suas regiões C terminais através de uma ligação dissulfureto. Cada um dos dois fragmentos de anticorpos homólogos é chamado Fab'. A pepsina também cinde a IgG a jusante das ligações dissulfureto existentes entre as regiões conectoras em cada uma das duas cadeias H para gerar um fragmento de anticorpo ligeiramente maior do que o fragmento em que os dois Fab' mencionados acima estão ligados à região conectora. Este fragmento de anticorpo é chamado Ε!(αό')2. A "composição farmacêutica" da presente invenção compreende o "anticorpo", ou "porção de um anticorpo", e um veiculo farmaceutieamente aceitável. iJm "veículo farmaceuticamente aceitável” inclui um excipiente, um diluente, sm agente de expansão, um agente de decomposição, estabilizador, um conservante, tampão, um emulsionante, um aromático, um cereute, um eduicurante, um agente para aumento de viscosidade, um aromatízante, um agente para aumentar a solubilidade, ou outros aditivos. A utilização de um ou vários de tais texto ú lcç; f uma composição farmacêutica pode ser formulada em comprimidos, pílulas, pós grânulos, injecções, soiuções, f trocíscos, elixires, suspensões, emulsões ou xaropes. A composição farmacêutica pode ser administrada por via oral ou parenterica. Outras formas para administração parentérica incluem uma solução para aplicação externa, supositórios para administração rectal, e por via do pessário, prescritas, através do método habitual que compreende um ou mais princípios activos. A dosagem pode variar dependendo da idade, sexo, peso, e sintoma de um doente, efeito do tratamento, via de administração, período de tratamento, ou do tipo de princípio activo (polípéptido ou anticorpo mencionado acima) contido na composição farmacêutica. Geralmente a composição farmacêutica pode ser administrada a um adulto numa dose de 10 pg a 1000 mg (ou 10 pg a 500 mg) por administração. Dependendo das várias condições, uma dosagem inferior a mencionada acima pode ser suficiente em alguns casos, e uma dosagem superior a mencionada acima pode ser necessárias noutros casos.

Em particular, a injecção pode ser produzida dissolvendo ou suspendendo o anticorpo num veiculo não tóxico, farmacêuticamente aceitável tal como soro fisiológico, ou água destilada disponível comercialmente para injecção ajustando a concentração para 0,1 pg de anticorpo/ml de veículo a 10 mg de $MÍC^WQfBl de veículo. A injecção produzida deste modo pode ser administrada a um doente humano cem necessidade de tratamento numa dose de 1 pg a 100 mg/kg de peso corporal, preferencialmente 50 μα a

Exemplos do via de administração são vias de administração medicinalmente adequadas, tal como injecção intravenosa, injecção subcutânea, injecção intradérmica, injecção intramuscular, ou injecção íntraperitoneal, preferencialmente injecção intravenosa. A injecção pode também sei preparada num diluente não aquoso (por exemplo, propíleno glicol, polietileno glícol, óleo vegetal, tal como azeite, e álcool, tal como etanol), suspensão, ou ernulsão. A injecção pode ser esterilizada por filtração com um filtro não penetrado por bactérias, misturando bacteriocidas, ou por irradiação. R injecção pode ser produzida na forma que é preparada para usar. Nomeadamente, pode ser seca por congelação para dar uma composição sólida estéril, e pode ser dissolvida em água destilada estéril ou em outro solvente para injecção antes do uso. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser aplicada para tratar ou evitar várias doenças inflamatórias provocadas pela activação dos linfócitos tais como células T e a regulação de funções de linfócitos activados. Exemplos de doenças são a dermatose crónica inflamatória, tal como o lichen planus. 0 efeito terapêutico da composição farmacêutica da presente invenção para sintomas de várias doenças pode ser testado através do método usual administrando-a a um modelo animal conhecido da doença.

Exemplos do modelo incluem (1) um ratinho (NZB/NZW)EI, um modelo humano para o lupus sistémico eritematoso (S1E do inglês systemic lupus erythematosus) (Science. Vol. 125, pág. 1225-1227 (1334)1, (2) encefalomiel íte alérgica (EAE), um modelo para a esclerose múltipla (MS, do inglês 4. Clin. Invest., vol. 35, pág. 2783-2789 (1995)}, pj um ratinho NOD (diabético não obeso) do non-obese diabetes; um modelo para diabetes mellitus dependente da insulina (TDDM, do inglês insulin dependent diabetes mellitus) (J. Exp. Med., vcl. 181, pág. 1145-1155 (1995)), (4)modelo da nefrite do rato por imuniaade da membrana basal do glomérulo renal, modelo de Gocdpasture da nefrite (Eur. J. Immunol., vol. 24, N° 6, pág. 1(111-1115 llMltlU e (5) um ratinho DBA/1, urn modelo para a artrite reumatoide humana (Eur. J. Immunol., vol. 26, pág. 2320-2328 (1996)(.

Breve Descrição das Figuras A figura 1 representa micrografias que mostram o estado de agregação de células FTL435 induzidas pelo "anticorpo JTT--1" e o estado de inibição da agregação celular pelo "anticorpo JTT,2". A subfigura (a) apresenta o estado das células na ausência de qualquer hibridoma do sobrenadante, a subfigura (b) apresenta o estado de agregação celular induzido pelo "anticorpo ufl(-~l"'l a subfigura (c) apresenta o estado de agregação celular na presença de "anticorpo anti-ICAM-1" conjuntamente com o "anticorpo e a subfigura (d) apresenta o estado de agregação celular na presença do "anticorpo JTT-2" conjuntamente com o "anticorpo JTT-1". A figura 2 representa micrografias que mostram o estado de agregação de células FTL435 e linfoblastos de rato activados induzidos pelo "anticorpo JTT-1" e o estado de inibição da agregação celular pelo "anticorpo JTT.2". A subfigura (a) apresenta o estado das células FTL435 na ausência de qualquer anticorpo, a subfigura (b) apresenta o estado das células FTL435 na presença de PKA, a subfigura (c) apresenta o estado das células FTL435 na presença de J?T'!"< a subfigura (d) apresenta o estado de agregação das células FTL435 greae&píi: do anticorpo anti-LFA-1 conjuntamente com o "anticorpo a subfigura :-:0 apresenta o estado das vêTilisd FTL4 35 na presença de anticorpo ãnti~COX$ conjuntamente com "anticorpo JTT-1", a subfigura (f) apresenta o estado das células FTL435 na presença de anticorpo anti-ICAM-1 conjuntamente com «anticorpo JTT-1", a subfigura (g) apresenta o estado de linfoblastos activados na ausência de qualquer anticorpo, a subfigura (h) apresenta o estado de linfoblastos activados na presença de PMA, a subfigura (i) apresenta o estado de linfoblastos activados na presença de "anticorpo JTT-1", a subfigura (j) apresenta o estado de linfoblastos activados na presença de anticorpo anti-LFA-1 conjuntamente com "anticorpo JTT-i", a subfigura (k) apresenta o estado de linfoblastos activados na presença de anticorpo antí-CD18 conjuntamente com "anticorpo e a subfigura (1) apresenta o estado de linfoblastos activados na presença de anticorpo anti-ICAM-1 conjuntamente com "anticorpo JTT-1". A figura 3 apresenta o estado de expressão do "antigénio JTT-1" e "antigénio JTT-2" em várias células medidas com um citómetro de fluxo. A figura 4 apresenta o estado de expressão do "antigénio JTT-1" em várias células linfocíticas medidas com um citometro de fluxo. A figura 5 é uma fotografia que apresenta o electroforegrama do "antigénio-JTT-1" analisado por SDS-PAGE. A figura 6 é constituída por micrografias que apresentam o estado de adesão de timócitos de rato na placa de microtitulação revestida com "antigénio JTT-i" purificado em que a adesão é induzida na presença de "anticorpo JTT-1", e os estado de inibição da adesão celular pelo "anticorpo JTT-2". A subfigura (a) apresenta o estado de adesão de células I placa que não foi revestida com "antigénio JTf-l", subfigura (b) apresenta c estado de adosÃO· de células à pigcs que foi revestida com "antigénio na ausência de qualquer anticorpo, a subfigura (c) apresenta o estado de adesão de células a placa revestida com "antigénio JTT-1" na presença de fragmentos Fab do "anticorpo e a subfigura feb apresenta o estado de adesão das eétaiss à placa revestida com o "antigénio JTT-1" na presença de JTT-2" conjuntamente com os fragmentos Fab de "anticorpo JTT-1". A figura 7 apresenta o número relativo de células tímocíticas que aderem a placa revestida com "antigénio JTT-1" purificado medido em termos de intensidade de fluorescência. "Ag(-)" representa o número relativo de células na placa que não foi revestida com "antigénio JTT-1", "Ag(+)" representa o número relativo de células na placa que foi revestida com "antigénio JTT-1" na ausência de qualquer anticorpo, "Ag(+)+JTT-l Fab" apresenta o número relativo de células na placa que foi revestida com "antigénio JTT-1" na presença de fragmentos Fab do "anticorpo JTT-1, e "Ag(+)+JTT-l Fab + JTT-2" apresenta o número relativo de células na placa que foi revestida com "antigénio JTT-1" na presença de "anticorpo JTT-2" conjuntamente com os fragmentos Fab do "anticorpo JTT-I. A figura 8 apresenta o estado de expressão do "antigénio JTT-1 do rato" e do "antigénio JTT-2 do rato" em células COS transformadas com cADN que codifica para o "antigénio do rato JTT-1" com um citómetro de fluxo. A figura 9 apresenta as caracteristicas estruturais da sequência de aminoácidos de "antigénis o JTT-1" revelado por análise gráfica de hidropati La. A finura 10 apresenta a homologia entre sequências de do ser humano, rato, e "antigénio JTT-1" de Jf d itinho e mutante de "antigénio JTT-1" de rato. figura 11 apresenta a homologia entre sequências de aminoácidos e de conservação de motivos em JTT-I humano", molécula CD28 humana", e "molécula CTLA-4 humana". A figura 12 apresenta ae forma esquemática a estrutura secundária da proteína e a sua similaridade entre o «antigénio Puma;:': :.· lud ···}/', a "molécula humana dali", e a «molécula CTLA-4 humana". A figura 13 apresenta de forma esquemática a estrutura do ADN genómico que codifica para o "antigénio JTT~I de ratinho". A figura 14 apresenta a diferença entre sequências de aminoácidos entre "antigénio JTT-i de rato", e o seu mutante alternativo por união. A figura 15 apresenta o grau de crescimento dos linfócitos periféricos sanguíneos humanos induzidos pelo anticorpo monoclonal contra o "antigénio JTT-1 humano", em que o grau de crescimento foi obtido através da incorporação de [:H] timidina. A ordenada apresenta a quantidade incorporada (dpm) de timidina nas células. A figura 16 apresenta o efeito terapêutico do anticorpo rnonoclonal contra o "antigénio JTT-1" na encefalomielite alérgica experimental (EAE) num modelo de doença em rato.

A ordenada apresenta o grau de sintomas da doença, e a abcissa apresenta os dias após imunização para indução de eAE A figura 17 apresenta o efeito terapêutico do anticorpo rnonoclonal contra o "antigénio JTT-1" na glomeruionefrite num modelo de doença em rato. A ordenada apresenta a quantidade de excreção urinária de proteínas e a abcissa representa o tempo (semana) após imunização para a indução de glomerulonefrite. A Figura 18 apresenta um histograma de colunas na pauifidupád do poiipéptido de fusão r a região extracelular do "antigénio JTT-1 ae rato" e o IgFe (rJTT-1-IgFc) numa coluna de Sepharose com proteína A A figura 19 representa uma fotografia que apresenta o electroforegrama de analisado por SDS-PAGE. A Figura 20 apresenta um histograma de colunas na purificação do polipéptido de fusão entre a região extracelular do "antigénio JTT-1 humano" e o IgFc (hJTT-1-IgFc) humano numa coluna de Sepharose com proteína A A figura 21 representa uma fotografia que apresenta o electioforegrama de dEdiõc: analisado por SDS-PAGE. A figura 22 apresenta esquematicamente a estrutura da transferência do gene (vector dirigido para o alvo) utilizado na preparação de um ratinho transgénico no qual o cADN que codifica para o "antigénio JTT-1 de rato" foi introduzido.

Melhor Forma de Implementação da Invenção A presente invenção é descrita em mais detalhe fazendo referência aos exemplos abaixo, mas não são limitativos do âmbito da invenção.

Exemplo 1 Preparação de anticorpos rnonoclonais

Anticorpos que produzem hibridomas foram preparados de acordo com o método de Kohler et al. (Omori et al., Blood, vol. 81, pág. 101-111 , e foram preparados anticorpos rnonoclonais de acordo com o método de Kannagí et ai. (Handbook of Experimental lidirmaihjy, vol. 4, 117.21- 117.21 Π,οίΐπ .

Primeiro, células FTL435 da linha celular do tímoma do rato foram administradas como um antigénio de imunização a ratinhos BALB/c nas suas patas numa quantidade ae 10'

14, e 28 aias. A de 0, células/ ratinho em mistura do antigenio ©sm o adjuvante completo de Freund foi administrado apenas na primeira imunização. Dois dias após a última imunização, os nódulos Linfáticos dos ratinhos foram retirados e fundido com células do mieioma do ratinho PAI (JCR N° B0113; Stocker, J. W. et ai., Res. Dísclosure, vol. 217, páy. 155 (1982)) através do método habitual para obter muitos hibridomas que produzem anticorpos monoclonais.

Exemplo 2 Pesquisa de hibridomas e caracterização de anticorpos monoclonais

Os hibridomas preparados no Exemplo 1 foram rastreados através da análise do efeito dos anticorpos produzidos no sobrenadante da cultura dos hibridomas em células FTL435, que foram utilizadas como imunogénio. Foi feita a sementeira de células FTL435 (5 .xlCr células/ml, 0,1 ml) em cada poço de uma placa tituladora de 96 poços e cultivados a 37°C durante uma hora na presença do sobrenadante da cultura de cada hibridoma (10 pg/ml cada). Os resultados obtidos para clones de hibridomas "JTT-1" e "JTT-2" são apresentados na Figura 1 e Figura 2.

Foi revelado que um anticorpo monoclonal produzido pelo clone do hibridoma "JTT-1" ("anticorpo JTT-1") aglutinou fortemente as células FTL435 (Figura 1 (b) e Figura 2 (c) } e que a adição de "anticorpo JTT-2" inibe fortemente a agregação em células FTL435 induzidas por RR-titMiavíló com o "anticorpo JTT-1" (Figura 1 ( d. Os ensaios em que não foi adicionado sobrenadante do hibridoma foram utilizados como controlos (Figura 1 (a) e Figura 2 (a) ) .

Para determinar se a agregação de oèlulds FTL435 i «iògzidii: osutitústlíSíptt! com o ^·;οΊΛνύο<>ΡΜ foi provocada pela adesão celular entre a moléeula-1 de adesão

«elula-r (ICAM-1) e antiçenio-1 associado a função do linfócito (LFA-i, do inglês lymphocyte function- associated antigen-i), que ê representativo de um circuito conhecido cit adesão celular, células FTL435 foram cultivadas a 37°C durante uma hora na presença de anticorpo IMS? antí-rato LJLL (10 pçr IgGl) ou anticorpo anti-rato LFA-i (10 pg/ml; IgG2a) conjuntamente com "anticorpo JTT-1". A agregação de células FTL435 por estimulação com "anticorpo JTT-1" não foi inibida nem pelo anticorpo anti-ICAM-1 nem pelo anticorpo anti-LFA-1 í anticorpo anti-ICAM-1, Figura 1 (c figura 2 (f) ; anticorpo anti-LFA-1, Figura 2 (d) j .

De modo a continuar a analisar a capacidade de aglutinação celular do "anticorpo JiLc-lJq a capacidade de aglutinar células linfoblásticas de rato activadas por estimulação com concanavalina A foi analisada da mesma maneira que mencionado acima. Os resultados são apresentados na Figura 2.

De forma semelhante ao efeito nas células FTL435, a agregação das células linfoblásticas activadas foi induzida por estimulação com "anticorpo JTT-1" (Figura 2 (i)). A agregação das células linfoblásticas activadas por estimulação com o "anticorpo JTT-1" foi na maior parte das vezes inibida pelo anticorpo anti-LFA-1 (Figura 2 {j) ) e anticorpo anti-ICAM-1 (Figura 2 (1)\ . (Contudo, ocorreu agregação parcial).

Como se depreende do ensaio de controlo (Figura 2 (g):), em que não foi adicionado nenhum anticorpo, linfócítos S€t:ivá<;.Lís tais como os linfoblastos activados não apresentaram agregação, através de adesão celular, a não ser que tivessem recebido estimulação com acetato d« mirístato de έοι&αΐ (PMA, do inglês phorbol myristate (Figura 2 fã LFA-1 j (Figura 2 thn do com "anticorpo ídd). Por isso o facto de que o anticorpo ant.i-LFA-1 inibiu parcialmente a agregação celular por estimulação com "anticorpo JTT-1" indica que LFA-i em células linfoblástícas activadas foi activada por estimulação com "anticorpo JTT-1". Isto também indica que amílbcdid.:?; reconhecidas pelo «anticorpo JTT-1" ósiJo envolvidas nalguma transmissão de sinal.

Foram depositados cicnes dos hibridomas "anticorpo JTT-1'·- e "anticorpo JLT-2" sob o Tratado de Budapeste com autoridade depositaria internacional, National Institute of

Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial

Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (1-1-3, Higashi, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japan) desde 11 de Outubro de 1996 com números de depósito internacionais N° FERM BP-5707 e FERM BP-5708, respectivamente. A análise em que se utilizou o kit de identificação do isotipo do anticorpo utilizando um anticorpo monocional de ratinho (da Amersham) determinou que o isotipo de anticorpos monoclonais produzidos a partir de cada hibridoma (anticorpo JTT-1 e anticorpo JTT-2) eram ambos igci.

Exemplo 3 Reactividade do "anticorpo JTT-1" e "anticorpo JTT-2" para várias células

Para analisar o padrão de expressão de moléculas reconhecidas pelo "anticorpo JTT-1" e pelo "anticorpo JTT- 2" em vâtlms células, foram examinadas as reactividades dos anticorpos vís várias células. Moléculas reconhecidas pelo «anticorpo ou pele "anticorpo JTT-2" são designadas pçt O iÇ' OU « V V gp Ο Λ. f jTT - Ç ’V , rato Wistar som 5 a 10 semanas de idade (150 a 250 g; f ó por anestesia com éter dietílico. Foi retirado o timo e o baço do seu peito e respectivamente por celíotomia, e homogeneizado para preparar uma suspensão celular.

As ôêlulas resultantes do baço foram cultivadas em meio - - - contendo 2 μρ/ΓίΙ. de concanavalina A e 10% de FCS a 37°C durante 3 dias para preparar linfoblastos activados.

Foram feitas reagir células FTL435, timócitos, células de baço, e linfoblastos activados (cada com 5 x 10£ células) com "anticorpo JTT-i" e "anticorpo JTT-2" e depois com IgG anti-ratinho marcado com FITC (Cappel) . Foi medida a intensidade de fluorescência das células coradas com um citómetro de fluxo EPICS-Elite.

Os resultados são apresentados na Figura 3. Nas células FTL435, foi observada a expressão forte de cada "antigénio JTT-1" e "antigénio JTT-2". Enquanto que os antigénios foram expressos em timócitos, eles foram apenas expressos em pequena quantidade em células de baço. Contudo em linfoblastos activados obtidos por estimulação de células de baço com concanavalina A o "antigénio JTT-1" e o "antigénio JTT-2" foram fortemente expressos. Além disso, em cada tipo de células o padrão de expressão do "antigénio JTT-1" e do "antigénio JTT-2" coincidiram um com o outro. Estes resultados indicaram que o "antigénio JTT-1" e o "antigénio JTT-2" são as mesmas moléculas.

Exemplo 4 Reactívidade do "anticorpo JTT-1" para várias céluias linfocítícas

Para analisar o padrão de expressão de : dois ("anticorpo JTT-1") reconhecidas pelo "anticorpo JTT-1" em várias células linfociticas, tfti analisada a reactívidade do "òsí. lo orgn JfT-T·* para os nódulcs linfáticos,

linfoblastos T derivados de baço, e linfoblastos E derivados do baço de dois tipos de ratos (rato Wistar e rato F344) .

Um rato Wistar com 5 a 10 semanas de idade e um rato de 150 a 250 g) foram mortos por anestesia com çmer dietílico. Foi retirado o timo e o baço de cada rato por celiotomia, e homogeneizado para preparar uma suspensão celular A suspensão de células resultante do baço foi cultivada em meio RPMI1640 contendo 2 pg/ml de concanavalina A (ConA) e 10% de FCS a 37°C durante 3 dias. Linfoblastos activados T e linfoblastos activados B foram obtidos a partir de cada rato após 1 dia e 3 dias de incubação. Alem disso, foram utilizados como controlos foram adicionados os linfoblastos T derivados do baço e linfoblastos B obtidos antes das células dos nódulos linfáticos e ConA terem sido adicionadas.

Cada grupo de células (cada com 5 x 1D" células) foram feitos reagir com anticorpo de células T anti- ratinho marcado com biotina ou anticorpo de célula B anti-ratinho marcado com biotina (10 μg/ml, Seikagaku Corporation), e posteriormente com estreptavidina marcada com ficoeritrina. As células foram feitas reagir com 10 μρ/πύ de "anticorpo JTT-1" marcado com FITC. A intensidade da fluorescência das células coradas foi medida com citómetro de fluxo EPICS-Elite.

Os resultados são apresentados na Figura 4. Tanto nos linfoblastos T activados e nos linfoblastos B activados do rato Wistar e do rato L344 a expressão forte do "antigénio rçcu.. *·>· foi observada a partir do dia 1 de activação com estimulação por ConA. Mém disso, o padrão de expressão de JTT-1" em cada tipo de células obindilhbs quase de forma perfeita um com o outra.

Exemplo 5 Caracterização do "antigénio JTT-1" e ao "antigénio JTT-2" por imunoprecipitação 0 "antigénio .y caracterizados por e v.antjgéni. o iTT--/· imunoprecipitação utilizando foram células FTL435.

Preparação de moléculas da superfície celular solúveis biotiniladas

As células FTL435 foram lavadas com PBS, suspensas em soro fisiológico contendo 100 pg/itil de NHS-biotina e HEPES 0,1 M (pH 8,0) para ajustar 1 x 1S:' e incubadas a temperatura ambiente durante 40 minutos. As células foram lavadas três vezes com PBS, foi adicionado tampão de lise (NP-40 . Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) NaCl 0,15 M) para ajustar 5 x 10' células/ml, e a mistura foi deixada reagir a 4°C durante 30 minutos para lisar as células. O iisado das células obtido foi centrifugado, e o sobrenadante que compreende as moléculas da superfície celular solúveis biotiniladas foi armazenado a -80°C.

(2) Imunoprecipitação e análise por SDS-PAGE A amostra purificada do "anticorpo JTT-1" foi purificado pelo método nabitual a partir do sobrenadante da cultura do clcne "JTT-1" do hibridoma preparado no Exemplo i foi misturado com esferas de proteína G- sefarose para ajustar para 2 mg/ml, e deixoti-se reagir a 4°C durante uma hora para ligar o anticorpo com as esferas. Depois das esferas terem sido lavadas, foi adicionado 500 μΐ de lisadc de cèldlM ;pfL4 35 a 10 μΐ aas esferas, e a mistura foi deixada a reagir a i:;C á&Mnte. 2 horas. Após as esferas terem sido lavadas três vezes cssrs tampão de lise, 50 μΐ de tampão de glicanase (tampão de fosfato de sódio (pH7,0) contendo 0,15% de SDS) foi adicionado às esferas, e a mistura foi fervida para eluir as moléculas ligadas retidas pelas esferas ligadas ao anticorpo. Adicionou-se 1,25% de NP-40 e 20 U/ml de N-glícanase a uma IxscçIíj da amostra dlluldâ deste modo, e a mistura foi deixada reagir de cm· dia para o outro para digerir cadeias de açúcar N-ligadas.

Um volume igual de tampão de amostra (Enprotech) para SDS-PAGE foi adicionado a 5 μΐ da amostra eiuída na presença, ou na ausência de 2-mercaptoetanol, e a mistura foi fervida. Após a electroforese, o gel foi transferido para uma membrana PVDF. A membrana foi bloqueada com 3% de BSA-PBÇ e foi feita reagir com estreptavidina marcada com peroxidase para detectar moléculas da superfície celular biotiniladas retidas pelo "anticorpo JTT-1" com o sistema ECL (da Amersham) como descrito no manual.

Os resultados sáo apresentados na Figura 5. A molécula reconhecida pelo "anticorpo JTT-1" em células FTL435 ("antigénio JTT-1" ) apresentou um peso molecular de cerca de 47 kD sob condições não redutoras p* \w na Figura 5) e cerca de 24 kD e 28 kD sob condições redutoras (" (i)" na Figura 5). Gomo resultado da digestão de cadeias de açúcar N-ligadas ("+N-gly" na Figura 5), o "antigénio JTT-1" convergiu numa banda única de 36 kD em condições não redutoras e cerca de 20 kD sob condições redutoras. Estes resultados sugerem que o "antigénio JTT-1" forma um dímero em que as mesmas proteínas nucleares pcssuem diferentes vadeias de açúcar. Foram obtidos exactamente os mesmos resultados na experiência efectuada como mencionado acima 11 ic ímdicí :¾ ^anticorpo ITT . Considerando estes o resultados conjuntamente com o» resultados do Exemplo 3 e Exemplo 7 abaixo, pensou-se que o "anrígénio JTT-1" CTmiécslc reconhecida pelo ''anticorpo JTT-1" j «antigénio JTT-2" (raolécuia reconhecida pelo "anticorpo JTT-2" são idênticos.

Exemplo 6 Expetiétsla de adesão dos timócitos de rato ao "antigénio JTT-1" e analise do aminoácido N-terminai

Os exemplos seguintes foram efectuados para analisar se a molécula que o "anticorpo JTT-1" reconhece (antigénio JTT-1) funciona como uma molécula de adesão. Foi também efectuada a análise do aminoácido N-terminal. (1) Preparação da coluna de afinidade para o "anticorpo JTT-1" A amostra purificada (2 mg em 2 ml) do "anticorpo JTT-i" purificado pelo método usual a partir do sobrenadante da cultura do clone do hibridoma "JTT-1" preparado no Exemplo 1 foi misturado com 1 ml de proteína G - resina de Sefarose e a mistura foi deixada a reagir a 4°C durante uma hora. A resina foi lavada três vezes com trietanolamina 200 mM (pH 8,2). A resina foi incubada em trietanolamina (pH 8,2) contendo 10 mM de pimelimidato dimetílico (DMP) a temperatura ambiente durante uma hora para ligar covalentemente o "anticorpo JTT-1" a resina. (líj Flirif ,:l¢:1)5.piSíí dp Jsi:t igdçid.p JTv--1 Células FTL435 foram cultivadas em meio Ε·ΜΙ1·β40 contendo 10% de FCS. As células foram recolhidas por centrifugação para obter um agregado e lavadas com PBS três vezes . 0 Ittjspáí) de li se (NP-40 11, Tris-HCl 10 mM -pH 7,4) NaCl ( 15 M) foi itdiltiJhi j:;·;: ao agregado lavado para ajustar para 5 x 107 vêhúmfnl e a mistura foi deixada reagir a 4°C durante 30 ?sií: abSTí pura lísar as células. O lisado aas células obtido foi centrifugado, e o sobrenadante que contém as moléculas da superfície celular solúveis foi armazenado a -80°C. O iísado (400 mlj foi carregado numa coluna de afinidade para 0 " anti cc rpc JTT-1" . Após a coluna ter si Lavada com 50 ml do ta sinpão de 1 .ise e 20 ml de PBÇ, JTT _1 " _L foi 6 - Luído com tampão de glícina 0,2 (pH 2/81. Tampão Tris 1 M foi adicionado ao "antigénio JTT-l" e eluído deste modo para neutralização. O "antigénio JTT-I" obtido foi armazenado a -80°C. (3) Determinação da sequência de aminoácidos N-terminal

Após o "antigénio JTT-1" purificado ter sido sujeito a ÇDS-PAGE, a sequência de aminoácidos N-terminal foi determinada, através do método habitual. O resultado revelou que o "antigénio JTT-1" continha um sequência de âminoacidos Glu-Leu-Asn-Asp-Leu-Ala-Asn-His-Arg. (4) Experiência de adesão

Um rato Wistar com 5 a 10 semanas de idade (150 a 250 g) foi morto por anestesia com dietilico. O timo retirado do seu peito por celiotomia e nomogeneizado para preparar uma suspensão de timócito. Foi adicionado a suspensão ester tetraacetóximetilico de 2',7'- bis(carboxíetilo)carboxífluoresceína (BCECF-ΛΜ; Molecular Probes) e a mistura foi incubada a 37cC durante 30 minutos para marcar timócitos com fluorescência. As células foram lavadas com PBS e suspensas em meio RPMI 1640 contendo 10% se FC3 para sbis&t&b 2 x 10;í células/ml. O 'is tlrkíê ele JTT-1" purificado obtido em (2) foi revestido nmm placa EbiSA de 96 $ numa concentração de de um dia para o outro. Depois da placa ser 10 lavada com PBS foi adicionado á placa 200 μΐ/ poço de PBS contendo 3% de BSA, e o bloqueio foi efectuado durante 2 horas. Após a placa ter sido lavada com PBS a cada poço foi adicionado (1) apenas timócitos marcados com fluorescência (2 x líV' células/mi) (2) timócitos marcados com fluorescência (mesma concentração) e fragmentos Fab de s-,anticorpo JTT-1" preparados através do método usual (5 ptt/vil} , ou (3) timócitos marcados com fluorescência (mesma concentração) e fragmentos Fab de "anticorpo JTT-1" (mesma concentração), e "anticorpo JTT-2" (10 pg/ml) e os poços foram cultivados a 37°C durante uma hora. De modo a remover células não ligadas cada poço foi lavado uma vez com meio RPMI1640 contendo 10% de FCS. Cada poço Mi observado com um microscópio de luz. Seguidamente foi adicionado a cada poço 100 μΐ de NP-40 a 0,1%, e as células que aderiram a placa foram lisadas. Foi contado o número relativo de células que aderiram a cada poço medindo a intensidade da fluorescência a 538 nm (excitação a 485 nm) com um flurómetro de microplaca Fluoroscan II Microplate (Flow Laboratories). O ensaio em que uma placa não foi revestida com "antigenio JTT-1" purificado foi utilizado como controlo.

Os resultados da observação ao microscópio óptico são apresentados na Figura 6.

Os timócitos aderiram significativamente ao "antigénio JTT-1" purificado apenas na presença de fragmentos de Lab de "anticorpo JTT-1" (Figura 6 (c )). A adesão foi significativamente inibida pelo "anticorpo JTT-2" (Figura 6 A Figura Ί apresenta o número rei o rd ····:::· de células timociticas que ao "antigénio JTT-1" éc< revestimento de cabe poço em termos da intensidade de fluorescência. A partir destes resultados foi revelado que o "V:.v cén; /: Αττ··· Γ" funciona como uma molécula de adesão.

Exemplo 7 Clonagerr de que codifica para ui "anticorpo JTT-1" de rato

1. preparação da biblioteca de cADN

1— (1) Extracção de pr.it. IV: 'ARN de linfoblastos de rato estimulados com ConA

Linfoblastos estimulados com ConA (Blastos ConA) derivados do baço de rato (cerca de 1 x 10D células/ml) foram centrifugadas (2,000xg) a 4°C durante 5 minutos. As células precipitadas foram suspensas em ISOGEN (Nippon Gene) e extraídas com clorofórmio com agitação para recolher o sobrenadante. Após a adição de isopropanol ao sobrenadante obtido, a mistura foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 10 minutos e centrifugada a 12,000 x g a 4°C durante 10 minutos para precipitar o ARN. O ARN precipitado foi lavado com etanol e dissolvido em tampão TE. O polt W foi purificado a partir do ARN total obtido deste modo com "kit de purificação de mARN" (Pharmacia).

1-í 2) preparação de cADN

Com 5 pq de í £&j preparado acima cc-mo estrutura de base, o cADN foi sintetizado com "Time Saver cADN Synthesis Kit -kit de síntese de poupança de tempo" (da Pharmacia) . utilizado "Oliço dT primer - iniciador olígo dT" bis

Pitard? tiSM possuindo c local Nsíi para aumentar a eficiência da pesquisa. Foi adicionado o adaptador EcoRI, e a digestão com Noti foi efectuada para obcer cADN com umoireceionalidade. Foi entáo efectuado o fraccionamento por tamanho com a coluna rotativa (da Pharmacia). 1—(3) Inserção num vector 0 cADN obtido possuindo terminais EcoRI e Notl foram ligados com pME18S (Hara, T. & Miyajima, A, EMBO J., vol. ±i, pág. 1875-1884 (1992)) digerido com EcoRI e Notl. Foi utilizado o "ADN, ligation kit- Kit de ligação de ADN" da (Takara Shuzo) para a ligação. As células E. coli DHõ (Toyobo) foram transformadas com o produto da reacção assim obtido. Os transformantes foram cultivados até o valor da D.O (a 600 nm) ter atingido 0,6 e ter sido recolhido para recuperar os ADNs plasmidicos com uma biblioteca. Foi utilizado para a purificação do ADN plasmídico QUIAGEN-Tip (QUIAGEN).

2. Pesquisa da biblioteca de cADN A pesquisa foi efectuada de acordo com o método de prospecção (Seed, E?, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 84, pág. 3365-3369 (1987)).

2 — (1) Transferência genética para as células COS

A biblioteca obtida desta forma foi introduzida em células C037 por electrcporaçáo (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 85, pág. 2288-2292). Os transformantes foram cultivados durante 60 horas após a introdução, o sobrenadante foi e o agregado foi iavado ccss PBS três vezes. Após ter sido tratade com LBS (contendo 0,5 mH de EDTA) a 37°C durante 30 minutos, as células foram removidas por pipetagem. Apenas as células vivas foram então recolhidas com "Lympbprep" (NYCOMED). 2-(2) Concentração das células que expressam os genes por prospecção

As células vivas obtidas acima foram suspensas em PBS (contendo 5% de FCÇ e 0,5 rrM de EDTA) . A suspensão celular foi transferida para um prato de cultura revestido com "anticorpo JTT-1" e incubado à temperatura ambiente durante 3 horas. Seguidamente as células que não se ligaram a placa de cultura foram removidas e o prato de cultura foi lavado com PBS três vezes, os plasmideos de ADNs foram recolhidos a partir das células que se ligam ao prato de cultura através do método de Hirt (Hirt, B., J. Mol. Biol., vol. 26, pag. 365 — 369) as E. coli DH10B (GIBCO BRL)forsm transformadas com o plasmideo de ADN obtido deste modo. Os ADN de plasmideo foram amplificados e purificados com os transformantes como mencionado acima no ponto - 3 Os procedimentos mencionados nos pontos (1) e (2) foram então repetidos duas vezes. 2 —(3) Isolamento do clone positivo

Após a terceira prospecção, células de E. coli DH10B foram cultivadas de um dia para o outro em placas DB contendo ampicilina para obter colónias. Foram cultivadas colónias resistentes a vinte fármacos, foram recolhidos os ADNs de plasmideos através do método miniprep alcalino (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spríng Harbor, Nova Iorque), e o ADN inserido foi analisado. Electroforese em gel de agarose que o clone que possui cADN íts cerca de G,. d kb (designado por "Ι132Ά7") tatrot concentrado. Ο "Τ132Α7" foi expresso de forma transiente em cálul.as CGS7 novamente com o me ítode descrito em 1 Depois, células em que se introduziu "T132A7" terem sido feitas reagir com "anticorpo JTT ou com "anticorpo JTT-2" e depois marcadas com IgG 3.n L í-ratinho marcado com FILC (Cappel , a intensidade da ) .& das células coradas foi medida com o citómetro de fluxo EPICS-ELITE (Coulter). O "anticorpo JTT-1" e o "anticorpo JTT-2" reconheceram fortemente o produto genético "T132A7". Os resultados são apresentados na Figura 8. 3. Determinação da sequência nucleotidica e da sequência de aminoacidos A sequência nucleotidica do clone "T132A7" foi determinada pelo método do didesoxi com "Auto Read Sequencing Kit- kit de sequenciação de autoieitura" da (Pharmacia) e "A L. F. DNA Sequencer- sequenciador de ADN A L. F." (da Pharmacia). Alem disso, a sequência de aminoácidos deduzida do " antigénio JTT-1 de rato" codificado pela sequência nucleótidica foi analisada com o software genético "GENEWORKS" (IntelliGenetics) . A sequência nucleótidica e a sequência de aminoácidos deduzida foram apresentadas na SEQ ID N° 4. A sequência de aminoácidos (composta por 200 resíduos de aminoacidos) deduzida a partir do gene clonado compreende a mesma sequência de aminoacidos que a sequência de aminoácidos N terminal determinada no Exemplo 6-(3). Considerando que as células em que foi introduzido o clone "T132A7" reagem forteraente com o "anticorpo JTT-i" pode-se concluir que o clone "T132A7" compreende o cADN eme codifica pSitss o ''shLlípmies CTIml tis empom 4. Análise por computador

Análise por hidropatia da estrutura primária da sequência de aminoácidos deduzida para o JTT-i" foi efectuada de acordo com o método de Kite e Doolittle (Kite, J. & Doolittle, R. F., J. Mol. Biol., vol. 157, pág. 105-132 (1982)) (Figura 9). Os resultados revelaram que o .'.antigénio JTT-1" é uma proteína transmembranar possuindo uma sequência de sinalização no terminal N. Além disso, os resultados da análise de motivos revelou que o "antigénio JTT-1" possui locais de ligação constituídos por duas cadeias de açúcar ligadas por Asn no domínio extracelular, e dois locais de fosforilação de caseína cinase e um local de fosforilação da proteína cinase C no domínio citoplasmático. Na Figura 9 "CHO" significa local de ligação de cadeia de açúcar N ligada; "P", significa local de fosforilação; "CKII" significa caseína cinase IT, e PKC, significa proteína cinase C.

Exemplo 8 Clonagem de cADN que codifica para o "antigénio humano JTT-1" 1. Preparação de uma sonda O cADN sd*; cerca de 0,9 kb) que codifica para o "anticorpo JTT-1" foi gerado por digestão do clone "Τ132Ά7" obtido no Exemplo 7 com enzimas de restrição EcoRI e Notl, e separado por electroforese em gel de agarose. Os fragmentos de ADN separados foram purificados com "QUIAEX gel extraction kit- kit de extracção com gel da QUIAEX" ida $”£:&GE'Sí f e &s fragmentes de ACN obtidos foram marcados cora 32P utilizando "ready-To-Go DNA labellíng r kit de marcação de ADN prento a andar" Ãdl Pharmacia) . Estes ú®. ADN eu: rcírcsE foram iklllit&kiàs como ser-das para hmbridização em placa.

2. Preparação de uma biblioteca de cADN

r-i _ Extracçãc de poli Pb} +ARN 0 f<oll i:k) foi extraído com linfoblastos estimulados com ConA (blastos ConA) derivados de sangue periférico bAíMas) do mesmo modo que no Exemplo 7-1-(1).

2-12) preparação de cADN

Com 5 μς de poli(A)rARN preparado como estrutura de base, os cADNs foram sintetizados com "iniciador oligo dT" (da Pharmacia) e "Time Saver cDNA Synthesis Kit" (da

Pharmacia) . Foi então adicionado o adaptador EcoRI, e foi realizada o fraccionamento por tamanho com a coluna rotativa (da Pharmacia). 2-(3)- Inserção num vector e embalamento

Os cADNs obtidos deste modo possuindo terminais EcoRI foram ligados com o vector "λΖΑΡΙΙ" (da Stratagene) digerido com EcoRI. O "ENA Ligation Kit" (da Takara Shuzo) foi utilizado para a ligação. Depois de ter sido efectuada a embalagem in vitro do AI )N ligado com "GIGA PACK 11 GOL D" (da Strata igene), células E. coli XLIBlue MRF' Stratagene) foram transfectadas com a partícula obtida do fago pâ jT3 gerar uma biblioteca ae cADN composta por placa compreendendo c fago reccmbínante

3. Pesquisa da biblioteca de cADN A biblioteca de cADN foi pesquisada pelo método de hibridização em plaque (Maniatis ID et ai. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cola Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque) com "Rapid hybridization buffer -tampão de hibridização rápida" (da Amersham). Primeiro, o biblioteca de cADN obtida deste modo (lxlO4) foi aplicada em placas de agar e as réplicas foram produzidas com "Hybond-N nylon membrane" -membrana de nylon Hybond (da Amersham) . A hibridização em placa foi efectuada em "Rapid hybridization buffer" (da Amersham) utilizando as réplicas e a sonda marcada com preparadas no Exemplo 8-1. 0 primeiro e segundo rastreio foi efectuado para obter oito clones positivos. Foram isoladas placas únicas de cada clone e sujeitas a um corte in vivo de acordo com o manual (Stratagene) e sete clones positivos foram recolhidos como plasrnídeo de ADN. 4. Determinação da sequência nucleótidica a

As sequências nucleotidicas dos sete clones foram determinadas pelo método do didesoxi com "Auto Read Sequencing Kit" (da Amersham) e "A L. F. DNA Sequencer" (da Pharmacia). Os setes clones compreendem a mesma sequência nucleótidica. Verificou-se que o clone "pBSh41" codifica para o comprimento completo do "antigenio humano JTT-1". A sequência de cADN correspondente à grelha de leitura aberta (ORF do inglês open reading frame) do "antigénio humano JTT-1" é apresentada na SEQ ID Nc:i, a sequência completa da sequência de aminoácídos deduzida para o Dsht 1 ;-JéRio JTT-1 humano" á apresentada na SEQ ID N° 2, e a sequência nucleótidica compreendendo as sequências 5' e 3' e apresentada na SEQ ID N°;3 (ORF corresponde soo resíduos 26 a 625). Emende-se que a «equitóia nucleótidica contida no cloosí ccòiíic.u para o "antigénio JTT-1 hiDPDcDb ç sequência de aminoácidos (composta por 199 resíduos de amínoácidos) deduzida a partir da sequência nucleótidica apresenta uma homologia significativa com a sequência de amínoácidos do "antigénio JTT-1 do rato" (Figura 10). Como indicado na Figura 10, a homologia entre as sequências de amínoácido do "antigénio JTT-1" humana e do rato e de 60% ou mais. E. coli DH10B (GIBCO BRL) foi transformada com o clone "pBSh41" foi depositada sob o Tratado de Budapeste com autoridade depositária internacional, National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) desde 25 de Outubro de 1996 (com um número de depósito internacional N° FERM BP-5725). 5. Características estruturais e função biológica do "antigénio JTT-1"

Os resultados da escolha de motivos para a sequência Je aminoácidos deduzida para o "antigénio JTT-1 humano" em proteínas humanas conhecidas revelou que o "antigénio JTT-1 humano possui uma semelhança estrutural com "CD28" e "CTLA-ítíf'y proteínas humanas derivadas da membrana celular que pertencem â superfamília das imunoglobuiinas, mencionadas em detalhe acima (Figuras 11 e 12). Como mencionado acima, "CD28 e CTLA-4" são moléculas extremamente importantes que regulam a sctijtiíuçép e inibição de células T no sistema imunitário. 1. 20 uu mais resíduos de aminoácídos incluindo resíduos de císteína são altamente conservados. 2. A sequência repetitiva da prclina w ÊTo-rYh-Pro (PPP)" é conservada, que ê essencial como a região de ligação do ligando em oDíi e YTLA-4. 3. A sequência "Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM)" (Xaa e x representa qualquer aminoácidoj essencial como região de transmissão de sinal em CD28 e CTLA-4 é conservada na região citoplasmática. A partir do facto que a mesma estrutura com a

estrutura específica de "CD28" e "CTLA-4" que desempenha um papel importante na regulação da activação das células T que são os actores principais no mecanismo imunitário, infere-se que o "antigénio JTT-1" da presente invenção desempenha um papel importante, como aquelas moléculas, na regulação da activação de linfócitos como as células T que são actores principais na resposta imunitária.

Exemplo 9 Clonaqem de cADN que codifica para "o antigénio JTT-1 de ratinho" 1. preparação de uma sonda O cADN (cerca de 0,S kb) que codifica para um "antigénio do rato" foi obtido digerindo o clone clonado no Exemplo 7, com enzimas de restrição iõsEI e

Notl, e foram separados por electroforese em gel de agarose. Os fragmentos de MM separados deste modo foram separadas com "ΟΠΙΑΕΧ gei extraction kit"- kit de extracção de gel QEXAtEí· (da QTlJ.ÇíIí:} * e os fragmentos de ADN foram iorlcTdos com 32P utilizando 'vkh:ma-TV--T a· ···:': =.:··· DNA ; .:hc : λ ·./ - kit para :;:acaça·.::: de A íh pronto a ctllittt (da

Pharmacia). Estes fragmentos de ADN marcados foram utilizados somo sondas para híbridízaçâo em placa.

2. Preparação de uma biblioteca de cADN 2-i:U dxbrrrçhz d* c':o.r í/d '21.2

Os poli rà) 'Adis foram extraídos a partir de

Linfoblastos estimulados com ConA derivados de baço de ratinho (cerca de I x 12" células/mi) de acordo com o Exemplo 7-1-(li*

2-(2) Preparação de uma biblioteca de cADN

Com 5 mg de poli. yi}preparados como acima indicado como estrutura de base foram sintetizados cADNs com iniciador oligo dT (da Pharmacia) e "Time Saver cADN

Synthesis kit"- kit de síntese de ADN com poupança de tempo (da Pharmacia). Após o adaptador EcoRI ter sido adicionado ao cADN, foi efectuado um fraccionamento por tamanho com uma coluna rotativa (da Pharmacia). 2-(3)- Inserção de cADN num vector e embalagem O cADN obtido deste modo possuindo terminais EcoRI foi ligado com o vector ΙΖΆΡΙΙ (da Statagene) digerido com EcoRI. Foi utilizado para a ligação "DNA Ligation Kit"-kit de ligação de ADN (da Takara Shuzc) . Após ter sido

efectuado o embalamento ín vitro do ADN Ligado com GIGA PACK II GOL D (da Stratagene) , células de E. coli 2 rlll. :.:.e MRF' (da Stratagene) foram transfectadas com a partléi.;!. $ de fago obtida deste mocio para gerar ume biblioteca de cMM composta por placa compreendendo o fago <

3. Pesquisa de uma biblioteca de cADN A pesquisa foi efectuada, do método de hibridização per placa (Maniatis, T. et ai. (Molecular Cloning A Laboratory Cold Sprinq Harbor Laboratory, Cííld Spring Harbor, Nova Iorque) utilizando tampão de hibridização rápido "Rapid" (da Amersham). A biblioteca de cADN (IxlO4) acima obtida foi aplicada em placas de agar e a réplica foi produzida utilizando membrana de nylon Hybond (da Amersham). A hibridização em placa foi efectuada em tampão de hibridização rápida (da Amersham) utilizando as réplicas e a sonda marcada com JZP preparada no Exemplo 9-1. 0 primeiro e os segundos rastreios foram efectuados para obter cinco clones positivos. Após o isolamento de uma placa Unica de cada clone, foi efectuada um corte in vivo de acordo com o manual de instruções (da Stratagene) e cinco clones positivos foram recolhidos como ADN de plasmideo. 4. Determinação da sequência de nucleótidos

As sequências nucleótidicas de cada um dos cinco clones foi determinada pelo método do didesóxi com "Auto Read Sequencing Kit" (da Pharmacia= e "A L.F. DNA Squencer" (da Pharmacia). Os quatro dos cinco clones compreendem a mesma sequência nucleótidica. A sequência nucleótidica de cADN que codifica para o "antigénio JTT-i de ratinho" de comprimento completo e a sequência de arninoácidos deduzida são indicadas na SEQ ID N°: 5.

Como se entende a partir da Figura 10, "o antigénio JTT-1 de ratinho" ê cõ:®|A:a:Cí; por 200 resíduos de arninoácidos, ·. ctiso · ds rAtirA h homologi a entre sequências de de ''iftttÀaéidi.ti; JTT-1" de ratinho, raro e humana é significativa (em 50% ou ma i s) . 5. Análise do iocal do gene do "antigénio JTf-A; de ratinho" O local do gene que codifica para o "antigénio JTT-1 de ratinho" foi analisado por um método de hibridização in situ por fluorescência. O cADN obtido deste modo que codifica "para o antigénio JTT-1 de ratinho" foi marcado com para preparar sondas de hibridização através do método habitual. Ufilizando estas sondas, foi pesquisada a biblioteca de cADN genómico 129SVJ do ratinho (da Stratagene) para obter clones do ADN genómico do ratinho compreendendo os exóes que codificam para o "antigénio JTT-1 de ratinho". A estrutura do ADN genómico e apresentada esquematicamente na Figura 13.

Os clones de ADN genómicos acima obtidos foram marcados com digoxigenin dUTP por um método de marcação interna "nick translation" para preparar sondas. As sondas marcadas foram ligadas a ADN cindido de ratinho e foram hibridizadas com cromossomas da metafase normai derivados de fibroblastos embriónicos de ratinho na solução contendo 50% de formaldeido, 10% de sulfato de dextrano, e 2x SSC. Após uma lamela de vidro para hibridização ter sido incubada em anticorpo anti-digoxigenina marcado com fluorescência foi detectado um sinal de hibridização especifico contrastando com DAPI. No primeiro teste, a parte mais próxima do cromossoma maior que se pensava ser o cromossoma 1, avaliando a partir do tamanho do AGN e da feâtós emergida, foi marcado especificamente. Com base nesta informação, o clone de ADN genómico acima descrita foi co-hib£líl:i:ili:h:l<s com sondas especificas da região centrómera do cromossoma 1. Corno resultado, a região centrómera do cromossoma 1 e as regiões perto delas encontravam-se especificamente marcadas. Foram analisadas dez amostras do cromossoma 1 apresentando a hibridização específica e revelou-se que o clone de ADN genómico mencionado acima encontrava-se localizado na posição de 33% da distância desde a fronteira entre a heterocromatina e a eucromatína em relação ao telómero do cromossoma 1, nomeadamente da mesma banda *103" do local dos geneç "CD28" e "CTLA-4" do ratinho. Como foram analisadas 30 células de metafase, foi observada uma marcação especifica na dita posição em 79 células.

Estes resultados e os resultados obtidos no Exemplo 8 indicam que a semelhança estrutural do "antigénio JTT-1" em relação a "CD28" e "CTLA-4" sugerem que o "antigénio JTT-I;"f tal coo "CD28" e "CTLA-4" é uma molécula importante envolvida na regulação da transmissão do sinal de co-estimulação e/ ou activação de linfócitos.

Exemplo 10 Clonagem de cADN que codifica para um mutante do "antigénio JTT-1 de rato"

Um outro cADN que e pensado codificar para uma variante alternativa de união do "antigénio JTT-I de rato" clonado no Exemplo 7 foi clonado como se segue. 1. Preparação de uma sonda O cADN (cerca de 0,9 kb) que codifica para o "antigénio tlf-l de rato" foi obtido digerindo o clone ^0132¾^% obtido no Exemplo 7, com enzimas de restrição EcoRI e Notl, e foram separados por electroforese em gel de agarose. Os ftapittitos de ADN separados foram purificados com "QUIAEX gel txtrucflov kit de extracçãc de gel QUIAEX, (da QUIAGEN), e os fragmentos de ADN obtidos foram marcados com utilizando "Ready-To-Go- DNA labelling kit" - kit para marcação de ADN pronto a utilizar (da Pharmacia). Estes fragmentos Ce Aid marcados foram utilizados como sondas para hibridização em placa.

2. Preparação de uma biblioteca ae cADN 2 — (1) Extracção de poli (A)+ARN

Como no Exemplo 7-1-(1) foi extraído poli(A)+ARN a partir da linha celular FTL435 do timoma do rato (cerca de 1 x 106 células/ml).

2-(2) Preparação de uma biblioteca de cADN

Com 5 mg de poli(A)+ARN preparado como acima indicado como estrutura de base foram sintetizados cADNs com iniciador oligo dT (da Pharmacia) e "Time Saver CADN Synthesis kit"- kit de síntese de ADN com poupança de tempo (da Pharmacia). Após 0 adaptador de EcoRI ter sido adicionado ao cADN, foi efectuado um fraccionamento por tamanho com uma coluna rotativa (da Pharmacia). 2-(3)-Inserção de cADN num vector e embalagem 0 cADN obtido deste modo possuindo terminais EcoRI foi ligado com o vector IZAPII (da Statagene) digerido com EcoRI. Foi utilizado para a ligação "DNA Ligation Kit"-kit de liítsçlo de ADN (da Takara Shuzo) . Após ter sido efectuado o embalamento in vitro do ADN ligado cem GIGA PACK II GOL D (da Stratagene), células de E. colí X.L1B iúe MRE' foram t&stófddtidAS com a partícula de fago obtidas deste modo para gerar uma biblioteca de cADN composta por olaca compreendendo o fago '

3. Pesquisa de uma biblioteca de cADN A pesquisa foi efectuada, através do método de hibridização por placa (Maniatis, T. et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spríng Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, Neva iorque) utilizando tampão de hibridização rápido "Rapid" (da Amersham). A biblioteca de cADN (IxlO4) preparada âck&à foi aplicada em placas de agar e a réplica foi produzida utilizando membrana de nylon Hybond (da Amershom). A hibridização em placa foi efectuada em tampão de hibridização rápida, "Rapid"(da Amersham) utilizando as réplicas e a sonda marcada com preparada no Exemplo ΙΟΙ. 0 primeiro e os segundos rastreios foram efectuados para obter dois clones positivos. Após o isolamento de uma placa única de cada clone, foi efectuada um corte in vivo de acordo com o manual de instruções (da Stratagene) e dois clones positivos foram recolhidos como ADN de plasmideo. 4. Determinação da sequência de nucleótidos

As sequências nucleótidicas de cada um dos dois clones foi determinada pelo método do didesóxi com "Auto Read Sequencing Kit" (da Pharmacia) e "A L.F. DNA Squencer" (da Pharmacia). Os dois clones compreendem a mesma sequência nucleótidica. A sequência nucleótidica de cADN que codifica para o "antigénio JTT-1 de rato" de comprimento completo obtido e a sequência de aminoácidos deduzida são indicadas ria SEQ ID N°: 6. A sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: 6) deduzida a partir da sequência de cADN foi comparada com a de aminoácidos (SEQ ID tf: 4) deduzida a partir da sequência de cADN obtida que codifica para o JTT-1 de clonado no Exemplo 7 (Figura 14) . Como indicado na Figura 14, a sequência de aminoácidos codificada pelo cADN clonado neste teste foi completamente a mesma que a codificada pelo cADN que codifica para o i a···: i ·· JTT-I de rato" obtido no Exemplo 7, com excepção de que (1) três resíduos de aminoácídos contíguos do terminal C ·Νο:.···12; r-Cor i alteram-se para Thr-Ala-Pro, e que (2) subsequente a Thr-Ala-Pro são adicionados 16 resíduos de aminoácidos contíguos (Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Arg- Gly-Glu-Hi s-Ser-Ser-Cys-Gln-Asp-Arg-Asn). Istc indica que o cADN clonado neste teste codifica para a variante de união alternativa do "antigénio JTT-1 de rato" obtida no Exemplo

Exemplo 11 Preparação de células que expressam o "antigénio JTT-1 humano" recombinante 0 clone do plasmídeo pBShll obtido no Exemplo 8 foi digerido com um enzima de restrição EcoRI, e foi cortado um fragmento de ADN compreendendo o cADN que codifica para o "antigénio JTT-1 humano" de comprimento completo. Este fragmento de ADN foi inserido com um kit de ligação de ADN (da Takara Shuzo) num plasmídeo pEFneo (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 91, pág. 158-162 (1994)) tratado com o mesmo enzima de restrição EcoRI para preparar o vector de expressão. Células CH0-K1 (ATCC:CCL-61) foram transformadas com o vector por electroporação. Cultivando as células em meio RPMI1640 contendo 0,8 mg/ml de Geneticina (GIBCO BRL) e soro fetal de vitela a 10% durante cerca de duas semanas, foram seleccionados transformantes resistentes a Geneticina. A expressão do "antigénio JTT-1 humano" recombinante foi confirmado por transferência de Northern, através do sábado usual.

Exemplo 12 de anticorpos monoclonais contra o JTT-1 humano"

Os transformantes que expressam "antígénio JTT-1 humano" recombinante preparado no Exemplo 11 foram homogeneizados e ultracentrifugados (100,000 x g) . O agregado contendo a fracção da membrana celular foi colhida e suspenso em PBS. A suspensão resultante compreendendo a fracção da membrana celular foi Injectada na pata de um ratinho BALB/c com adjuvante completo de Freund para a primeira imunização (dia 0). O antigenio da fracção da membrana celular foi ainda administrado à sua pata a intervalos de 7, 14, e 28 dias. Dois diâs depois da última imunização foram retiradas as células do nódulo linfático. As células do nódulo linfático e células do mieloma do rato PAI (JCR N° B0113; Res. Disclosure, vol. 217, pag. 155 (1982) foram misturadas numa razão de 5:1, e fundidas utilizando polietilenoglicol 4000 (da GIBCO) como um agente de fusão para preparar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais. Os hibridomas foram pesquisados por cultura em HAT contendo ASF104 (Ajinomoto) suplementado com 10% de soro fetal de vitela e aminopepterina. O sobrenadante de cultura de cada hibridoma foi feito reagir com os transformantes que expressam o "antígénio JTT-1 humano" recombinante preparados no Exemplo 11, e a intensidade de fluorescência das células coradas pela reacção das células com IgG antí-ratinho marcado com FITC (Cappel) foi medida com um citómetro de fluxo EPICS-ELITE para confirmar a reactividade do anticorpo monoclonal gerado em cada sobrenadante de cultura do wi;·éigèulé JTT-1 humano". Foi confirmado que foram obtidos 10 ou mais tipos de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais reactivos ao "antígénio

Cada οΐο dos dois tipos (designados clcne SM.2 e SG430) entre estes hibridomas (106 a 107 células/0,5 ml/ ratinho) foi injectado rnxms ratinho ICR nu/nu Ifêzsi&ã de 7-8 semanas) por via intraperitoneai. Após 10 a 20 dias foi efectuada celiotomia dos ratinhos sob anestesia, e os dois tipos de anticorpos monoclonsís (SA12 e SG430) reactivos ao ^antigénio JTT-1 humano" foram preparados numa grande quantidade a partir do fluido ascético extraído através do Lísiihck; usual.

Exemplo 13 Efeito dos anticorpos monoclonais contra o ^antigénio JTT-1 humano" em linfócitos do sangue humano periférico

Tal como mencionado no Exemplo 8, pensa-se que o "antigénio JTT-1 " pode estar envolvido na regulação da activação de linfócitos na reacção imunitária, tal como "CD28" e "CTLA-4". Para provar isto, o efeito dos anticorpos monoclonais contra o "antigénio JTT-1 humano" em linfócitos humanos foi analisado a luz do crescimento celular, como uma indicação. A cada um dos 96 poços da placa de microtitulação foi adicionado (1) ou SA12 ou SG430 (1 μg/ ml), o anticorpo monoclonal contra o "antigénio JTT-1 humano" preparado no Exemplo 12, ou (2) uma mistura de anticorpo monoclonal SAL2 ou SG430 (1 yg/ ml), com um anticorpo monoclonal antí~CD3, OKT-3 {lμg/mi, da Orthodiagnostic Systems), que é utilizado para adicionar o sinal primário na activação dos linfócitos. A placa foi incubada a 37°C durante 1 hora para revestir cada poço com o anticorpo. Após a placa ter sido lavada com meio RPMI1640, foram adicionados linfócitos normais do sangue periférico humano (1x105 dé.I,sil&§/tó| e incubados em meio RPMI164 0 contendo 101 de soro fetal de vitela durante 3 dias. Se necessário, foi adicionado 1 np/ml de forfaol acetato * foi então 5 foram aororooisbn a cada poço j nj mt-ivircrruií ov, í μοιό'ηνοοοο: , e a. placa foi incubada a 37°C durante 6 horas. As célula recolhidas, e a quantidade de i':Hj timidina incorporada no foi medida com um contador de cintilação (Beckman) . 0 ensaio sem qualquer anticorpo foi utilizado como controlo. Os resultados são indicados na Figura 15.

No ensaio utilizando as placas revestidas zom. mMlíntot: dos anticorpos monoclonais SA12 ou SG430, o número de linfócitos aumentou 10 vezes quando comparado com o controlo. Na co-presença de 0KT3* o número de linfócitos aumentou cerca de 100 vezes quando o anticorpo monoclonsl $.hl2 ou SG430 foi utilizado.

Estes resultados indicam que o "antigénio JTT-1" funciona na regulação da activação dos linfócitos. O facto do crescimento celular ter aumentado por ter sido utilizado conjuntamente com GKT3 indica que o "antigénio JTT-1" está envolvido no sinal de co-estimulação tal como "CD26" e "CTLA-4".

Exemplo 14 Efeito do "anticorpo JTT-2" na encefalomielite alérgica experimental (EAE)

Como mencionado acima em detalhe têm sido feitas recentemente muitas tentativas para tratar as várias doenças autoimunitárias (artrite reumatoide, esclerose múltipla, tiroidite autoimunitária, dermatite alérgica de contacto, dermatose inflamatória crónica, tal como lichen planus, lupus sistémico eritematoso, diabetes mellitus dependente da insulina, pscríase, etc.), através da imm-WiMUãú entre CD28/CTLA-4 e vDíiy/GM€, O efeito foi já confirmado em vários modelos animais de doenças autoimunitárias {(1) um modelo para o lupas sistémico eritematoso (SLE), (2) encefalomielí~e alérgica experimental (EAE), um modelo de esclerose CMitíplà (MS) (3) um modelo para a diabetes mellitus dependente da insulina (IDDM), {4} modelo da nefrite de Goodpasture, e (5) artrite reumatoide humana).

Para determinar se um "antigénio JTT-i" da presente invenção é uma molécula envolvida na activação ou inibição de linfócitos tal como "CD28" e "CTLÃ-4", foram produzidos ratos modelos para a encefalomielite alérgica experimental (EAE), um modelo para a esclerose múltipla (MS) e o efeito do anticorpo monoclonal do titulo no "antigénio JTT-1" no modelo foi analisado.

Uma emulsão para ser utilizada como imunogenio foi preparada misturando homogeneizado cerebroespinal de cobaia de Hartley (800 mg/ml de soro fisiológico) com a mesma quantidade de adjuvante completo de Freund. A imunização foi efectuada injectando por via intradérmica a emulsão nas patas direitas e esquerdas de 15 ratos de Lewis (fêmeas, 6 semanas de idade) numa quantidade de 0,25 ml por pata. A administração (imunização) foi ajustada de modo que as dosagens do homogeneizado preparado serem de 200 mg por rato. Esta imunização induz encefalomielite alérgica experimental (EAE).

Os ratos imunizados deste modo foram divididos em três grupos de cinco ratos cada, e qualquer um de (1) a (3) abaixo foi injectado por via intravenosa em ratinhos de cada grupo imediatamente após imunização (dia 0), e 3, 6, 9 e 12 dias após a imunização. (1) Anticorpo monoclonal "anticorpo JTT-2" contra "antigénio JTT-1 de rato" preparado no Exemplo 2 (dosagem: 2 mg/ml de PBS, 5 mg/kg) (2) Prednisolona, agente esteroide (dosagem: 4 mg/ml de PBS, 10 mg/kg) (3; Anticorpo de ucmiJxolí; não reactivo a "antigénio JTT-1 de rato" (dosagem: 2 % . " de PES, 5 mg/kg)

Os sintomas foram observados ao Longo do tempo após a imunização. Após o inicio de EAE ter sido encontrado o grau dos sintomas foi estimado por olaooifiooçlo dos sintomas baseada nos critérios seguintes. (pontuação 1) desaparecimento da tensão de uma cauda (pontuação 2) arrastamento das pernas traseiras e ligeira paralisia, (pontuação3) arrastamento das pernas traseiras e paralisia grave, (pontuação 4) paralisia completa ao corpo, ou morte

Os resultados são apresentados na Figura 16. No grupo em que o anticorpo de controlo foi administrado o sintoma da EAE atingiu o máximo (classificação máxima) no dia 11 a 15 depois da imunização, e depois recuperou gradualmente. Em contraste, no grupo em que se administrou o "anticorpo "JTT-2", o sintoma de EAE no dia 11 após a imunização foi significativamente inibido. Este efeito inibitório foi significativamente mais elevado do que no grupo em que se administrou prednisolona.

Estes resultados indicam que o "antigénio JTT-1" e uma molécula que funciona na indução da resposta imunitária, tal como a activação linfocítica induzida por antigénios estranhos, e que a regulação da função do "antigénio JTT-1" ou dos seus ligandos pode inibir os sintomas de várias doenças autoimunitárias.

Exemplo 15 Efeito co "anticorpo JTT-2" nâ glomérulonefrite

Para o mesmo fim que no Exemplo 14, foram produzidos ratsss do ccKãílo da nefríte da membrana basal do glomérulo do inglês e foi nno : ; -mu·:,, o efeito do anticorpo monoclonal do titulo no "antigénío JTT-

Depois da membrana basal do glomérulo de buvino (Shígei Medicai Institute) ter sido digerida com colagenase foi diluída com sorc fisiológico para 200 μq/τcιi, a diluição foi misturada com adjuvante completo de Freund para preparar uma emulsão para ser utilizada como ímunogénio. A imunização foi efectuada injectando por via íntradérmíca a emulsão em ambas as palmas das patas traseiras de 48 ratos wister kyoto (com cerca de 200 g) sob anestesia numa quantidade de cerca de 0,2 ml por pata (dosagem: cerca de 15 μς) . Esta imunização induz a nefrite da membrana basal do glomérulo.

Os ratos imunizados foram divididos em oito grupos de seis ratos cada, e qualquer um de (1) a (3) abaixo foi injectado em ratos de cada grupo imediatamente após a imunização (dia 0), e três vezes por semana durante 5 semanas consecutivas. (1) Anticorpo monoclonal "JTT-2" contra "antigénio JTT-1 de rato" preparado no Exemplo 2 (dosagem: 3 mg/kg (2 ml PHS/kg), injecção intravenosa) (2) Prednisolona, agente esteroide, como controlo positivo (suspenso em 0,5% de carboximetilcelulose (CMC)) (dosagem: 3 mg/kg (5 ml/kg)), administração oral) í3) 0,51 CMC como controlo negativo (dosagem: 5 ml/kg), administração oral)

Após a administração de -m subçtracto de teste, foi a/ç oralmente a cada rato forçadamente água esterilizada (25 isi/kgi, e a urina de cada rato foi recolhida durante 3 horas que tinha sido mantido numa gaiola metabólica sem comer e beber. Depois do volume da urina recolhida ter sido medido, a concentração da proteína urinária foi medida utilizando Toneín W-rl 1 (Otuka) , e a excreção urinária de proteína em cinco horas foi calculada (unidade: mg proteína/ 5 horas). A colheita urinária acima mencionada e medição da proteína urinaria foi efectuada da mesma maneira a 1,2,3, e 4 semanas após a imunização (dia 0) .

Os resultados são apresentados na Figura 17. Comparada com o grupo de controlo, a excreção urinaria de proteína 6s três semanas após imunização foi reduzida significativamente no grupo a que foi administrado "anticorpo-JTT-2".

Estes resultados indicam que o "antigénio JTT-1" é uma molécula que induz uma resposta imunitária, tal como a activação dos linfócitos induzida pela imunização por antigénios estranhos, e que a regulação da função do antigénio '!/% ou dos seus ligandos pode inibir os sintomas de várias doenças autoimunitárias.

Exemplo 16 Preparação da proteína de fusão entre o "antigénio JTT-1" e IgFc

Como mencionado nos Exemplos 8, e 13 a 15, pensa-se que o "antigénio JTT-1" da presente invenção e uma molécula tal como "CD28" e "CTLA-4" envolvida na estimulação do sinal de co-estimulação envolvido na regulação da activação dos linfócitos. Além disso, como mencionado no Exemplo 14, uma proteína de fusão /ΙΤΙΑ.»m-lacrto composta pelo domínio extracelular de "CTLA-4" e a região Fc da imunoglobulina humana IgGl foram reportadas como possuindo efeitos idita/i! Isticòs em várias autoimunitárias. Neste exemplo, uma proteína de fusão composta pela região extracelular do "antigénio alt i. e IgGFc humano foi preparada como se segue de modo a poder examinar-se se o antigénio JTT-1 solúvel, tal como o CTLA-4-IgFc, poderia ser aplicado à terapia de várias doenças autoimunitári as. (1) Preparação da proteína de ioaãr entre "o antigénio JTT-1 de rato" e IgGl-Fc humano (rJTT-1-IgFc)

Para amplificar o cADN que codifica para a região extracelular do "antigénio JTT-1 de rato" por PCR, foram desenhados e sintetizados o iniciador 5' possuindo um local de restrição Xhol (5'-CTGCTCGAGATGAAGCCCTACTTCTCG-3', SEQ ID N°:7) e o iniciador 3' possuindo um local de restrição BamHI ', SEQ ID N° 8) nos seus terminais. Utilizando o cione de cADN "T132A7" obtido no Exemplo 7 que codifica para o "antigénio de rato JTT-1" de cadeia completa como uma estrutura de base foi efectuada PCR com os iniciadores para preparar o cADN compreendendo o cADN que codifica para a região extracelular do "antigénio de rato JTT-1" possuindo locais de restrição Xhol e BamHI em ambos os terminais. Os produtos PCR obtidos deste modo foram digeridos com Xhol e BamHI e separados por electroforese em gel de agarose para isolar uma banda de cerca de 450 pb prevista ser o fragmento de cADN que codifica para a região extracelular desejada. O fragmento de cADN isolado foi subclonado em pBluescript II SK(+) (da Stratagene) e cindido com Xhol e BamHI. A analise da sequência com um sequenciador de ADN automatizado de fluorescência (da Applies Biosvstems) revelou que o fragmento de cADN compreende a região que codifica para a sequência de aminoácidos correspondente aos resíduos de aminoácidos 1 a 141 dc "antigénio de rato v··::·····;>·, ·:·«ί· I :·;· >.V Tf': M J: ; â ) :·. .; .;.· · .v\w;·χ... u·..:·.· <:·:·. ·; ' 9 Písí; oufío lado, o ADN que codifica para o ro ao IgGl de fusão humana como parcei cortado e possui fragmento de cerca de 1,3 kb BamHI-Xbal de ADN por digestão do plasmídeo (ver Cells, vol. 61, pág. 1303-1313 (1990)), preparado por B. Seed et al. (Massachusetts General Hospital)) com BamHI e Xbal. Este fragmento compreende os exões que codificam para a região conectora do IgGl humano, dg: d, e Cpillv O fragmento Xhol-BamHI que codifica para a região extracelular do "antigénio de rato e fragmento

BamHT-Xbal compreendendo exões que codificam para o Fc do IgGl humano ("IgFc"), ambos preparados como acima mencionado, foram subclonados em pBluescript II SK(+) (da Stratagene) cindido com Xhol e Xbal.

Depois o plasmídeo foi digerido com Xhol e Xbal, e um fragmento de cerca de 1,8 kb compreendendo o ADN de fusão que compreende a região extracelular do "antigénio de rato JTT-1" e o IgFc humano foi cortado. O fragmento do ADN de fusão foi inserido em locais Xhol e Xbal do vector de expressão pMEl8S (Medicai Immunology, vol. 20, N° 1, pág. 27-32 (1990); Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering", Yodosha, pág. 101-107 (1992)) com ligase T4 de ADN para construir o plasmídeo prJTT-l-IgFc. Células HEK293 foram cultivadas subconfluentemente como uma monocamada em meio DMEM contendo 10% de soro fetal de vitela e ampícilina foram transformados com prJTT-l-IgFc por electroporação para obter transformantes.

Os transformantes foram cultivados em meio isento de soro ASF-104 durante 72 horas para expressar rJTT-l-IgFc.

Utilizando uma coluna de afinidade de Sefarose de proteína G (da Pharmacia),rJTT-l-IgFc foi purificado da maneira descrita a seguir. 0 sobrenacante obtido por centrifugação do meio de cultura mencionado acima foi carregado na coluna de afinidade de Sefa rose e proteína a V-U previamente equilibrada com do de 1 o. Após a coluna ter sido lavada com tampão de ligação, a ®Idí.çío foi efectuada com tampão de eluição, O eiuato foi recolhido e diaiizado contra tampão fosfato mudando a solução externa duas vezes ou mais para obter rJTT-l-IgFc. 0 resultado da cromatografia de afinidade é apresentado na Figura 18, e o resultado do SDS-PAGE do rJTT-l-IgFc obtido deste modo é apresentado na Figura 19. (2) Preparação da proteína de fusão entre "antigénio JTT-1 humano" e IgGl-Fc humano (hJTT-l-IgFc) 0 HJTT-l-IgLc foi preparado como mencionado acima em íls f excepto para o cADN utilizado como estrutura de base e iniciadores para PCR. Neste teste, 0 clone "pBSh41" compreendendo o cADN que codifica para 0 " antigénio JTT-1 humano" de cadeia completa preparado no Exemplo 8 foi utilizado como estrutura de base, e 5’- TAACTGTTTCTCGAGÃACATGAAGTCAGGC-3' (SEQ ID N°: 9) e 5’- ATCCTATGGGTAACGGATC CTTCAGCTGGC-3' (SEQ ID O \—1 o 2 f oram utilizados como iniciadores. 0 resultado da cromatografia de afinidade è apresentado na Figura 20, e o resultado de SDS-PAGE do hJTT-l-IgFc obtido deste modo na Figura 21.

Exemplo 17. Preparação de um ratinho transgénico em que o cADN que codifica para o "antigénio JTT-1 humano" foi integrado O ' ' que codifica para o "antigénio JTT-1 de rato" de comprimento completo obtido no Exemplo 7 foi inserido no rsctóc: ae expressão pCACSlo (Gene, vol . 108, pág. 193-250 (1991)) possuindo promotor de actina $ de galinha utilizando e "DNA Blunting Kit" (da Takara) para obter prJTT-1. Para preparar um ratinho transgénico, prJTT-1 foi linearizado, através de tratamento com enzima de restrição.

Um ratinho fêmea ICR possuindo uma tampa vaginal, obtida através do cruzamento de um rãtinho branco ICR ÍNihon LSC) com um ratinho macho branco vasoligado ICR (Níhon SLC) Foi utilizada como mãe adoptiva. Foi preparado um ratinho para se obter ovos fertilizados para introduzir "antigénio JTT-1 de rato" por cruzamento de um ratinho fêmea BDF-1 (Nihon SLC) que foi feito superovular através da administração de PEAMEX (5 unidades, Sankyo Zokij e Pregnil (5 unidades, Organon) com ?rr macho BDF-I (Nihon SLC) . Após o cruzamento o oviduto foi retirado do ratinho BDF-1, e apenas foram obtidos ovos fertilizados por tratamento com hialuronidase e armazenados num meio. 0 gene de "antigénio JTT-1 de rato" foi introduzido no ovo fertilizado por microscopia utilizando um manipulador de acordo com o método usual. 0 ovo fertilizado foi fixo por uma agulha de retenção. Uma solução contendo o gene linearizado mencionado acima que codifica para o "antigénio JTT-1 de rato" que foi diluído com tampão de Tris-EDTA, foi microinjectado num pronúcleo macho dos ovos fertilizados com uma agulha de introdução de ADN a TPCh

Após a introdução genética, apenas os ovos fertilizados que mantêm o estado normal foram seleccionados, e depois, o ovo fertilizado seleccionado deste modo em que o "antigénio JTT-1 de rato" tinham sido introduzidos na fímbria do ovário no ovário de uma mãe adoptiva (ratinho ICR brancc) . A cauda de um ratinho de progenitura (ratinho fundador) nascido a partir da mãe adoptiva foi cortada e o gene genómico foi recolhido. Foi confirmado por PCR que o aene do CTT-1 de rato*· foi integrado no genoma do ratinho, Depois o ratinho transgénico heterozigótico que "antigénio JTT-1 de rato" em grande quantidade foi preparado através do cruzamento deste ratinho fundador com um ratinho normal. Ratinhos homozigóticos transgénicos podem ser preparados, através do cruzamento de ratinhos heterozígóticos uns com os outros. A covistriiitSo mícroinj ectada cor&pxseAd&hdg o gene de .-.antigénio JTT-l de rato" é apresentada esquematicamente na

Figura 22.

Exemplo 18 Preparação de um ratinho desactivado, cujo gene endógeno que codifica para o "antigénio JTT-l de ratinho" foi desactivadc (1) Construção de um vector dirigido a um alvo

Um vector para desactivar (expressão inglesa "knocking out") o gene endógeno que codifica para o "antigénio JTT-l de ratinho", através de recombinação homóloga (Nikkei Science, pág. 52-62 Maio de 1994) foi preparada como se segue. 0 fragmento Pstl-HindlII ("ADN homólogo (1)") obtido por digestão do clone de ADN genómico compreendendo a região que codifica para o "antigénio JTT-l humano" clonado no Exemplo 9-5 com Pstl e HindIII foi subclonado em pGEM-3 (Eomega). Então o pGEM-3 foi linearizado com Xhol e o gene da resistência à neomicina ("neo") foi cortado a partir do pMCl-nec-polyA (da Stratagene), através de tratamento com Xhol e Sall foi inserido a montante do "ADN homólogo" (1) ligando-os. 0 clone de ADN genómico de ratinho acima mencionado foi digerido com Xhol e Notl para cortar um gene de cerca de kb ("ADN homólogo (2) localizado a montante do "ADN homólogo (1)" acima mencionado.

Separadamente o pGEM-3 acima mencionado em que o "ADN r.eo-homólogo ΓΠ " tinha sido Inserido foi digerido com Xhol e HindIII para o nÓM; neo-homólogo (1)". 0 "ADN neo- homólogo (2)" e o "ADN neo-homólogo (i)" obtidos deste modo foram subclonados em pSEAP-2-C0NT (Clontech) linearizado com Notl e dindiiiL.

Após a digestão e linearização do plasmídeo obtido em qm o "homólogo ¢2)- neo-homólogo (1)" tinha sido inserido a jusante do "ADN homólogo (1)" com Nrul, gene da timidina cinase ("TK") obtido digerindo pMCI-TK (da Stratagene) com Pvuil foi inserido a jusante do "ADN homólogo (1)" para obter um vector dirigido para um alvo, em que o "ADN homólogo (2)- neo-homólogo (1)" foi inserido.

(2) Introdução do vector dirigido para o alvo em células ES Células estaminais embrionárias de ratinho (Nature, vol. 362, pág. 255-258 (1993); Nature, vol. 326, pág. 292-295 (1987) cultivadas em meio DMEM contendo 15% de soro fetal de bovino foram tratadas com tripsina para se transformarem em células únicas, e as células foram lavadas três vezes seguindo-se a adição de tampão fosfato para ajustar a 1 x 10' células/ml. Foi adicionado a suspensão celular o vector dirigido para o alvo mencionado acima (25 μg por 1 ml de suspensão celular), e foi aplicado um pulso eléctrico uma vez nas condições de 350 V/cm (25 μΕ). A seguir, 1 x 107 de células ES foram aplicadas num prato de 10 cm e foram cultivadas em meio de manutenção durante um dia, e o meio foi trocado por meio de selecção (contendo 250 μς/ιηΐ de G4] 8 e 2 μΜ de ganciclovir) . As céiulas foram cultivadas sendo o meio trocado cada dois dias. No décimo dia após a introdução do vector dirigido ao alvo, por microscopia com uma ;:vi crtíplpets· t foram obtidos 57 3 clones de células ES resistentes à neomícina. Cada um dos clones de células ES obtidos deste modo foram cultivados independentemente nxm prato do 24 poços revescido com células Feeder cara obter 768 réplicas do células ES resistentes d neomícina. (3) Pesquisa de células ES inactivadas

Foi confirmado por PCR se o gene endógeno que codifica para o "antigénio JTT-1 de ratinho" se encontrava destruído através de recombinação homóloga em células ES resistentes a neomicina.

Para o PCR, (1) foram desenhados e sintetizados iniciadores baseados na sequência do gene resistente a neomicina acima mencionado (,,v,h®Co; Vé* - seq id n°; 11; e

(2) foram utilizados iniciadores desenhados e sintetizados baseados na sequência do acima mencionado "ADN homólogo" (1) (5'- CATTCAAGTTTCAG -GGAACTAGTCCATGCGTTTC- 3?, SEQ ID N° : 12) .

Cada ADN genómico foi extraído de cada célula ES resistente a neomicina, e os PCRs foram efectuados utilizando os iniciadores com o ADN genómico como estrutura base. Um ciclo de reacção PCR foi efectuado a 94°C durante 3 minutos, 30 ciclos de reacção a 94°C durante 1 minuto, a 60°C durante 1 minuto, e a 72°C durante 3,5 minutos, e um ciclo de reacção a 72°C durante 10 minutos, e os produtos resultantes foram armazenados a 4°C. Quando um fragmento de menos do que 4 kb foi amplificado por este PCR poude ser verificado que o gene endógeno que codifica para o "antigénio JTT-1 de ratinho" tinha sido destruído (desactivado), através da recombinação homóloga no clone da célula ES.

Foi obtido um produto PCR desejado a partir de três ciones das 768 células ES testadas. Transferências de Southern genómicas foram efectuadas para estes três ciones para a continuação da pesquisa e confirmação. Após o ADN ter sido extraído dos três ciones e digerido com enzima do restrição iâísUI·# os produtos digeridos tocdm: submetidos a electrof orese em gel de agarose. Os ADNs resultantes foram transferidos para uma membrana de nylon, e a hibridização foi efectuada com uma sonda preparada a partir da sequência de ADN genómico cornpreenaendo "JTT-1 de ratinho". A sonda foi desenhada com bsse na sequência fora do local em que ocorreu a recombinação homóloga que permite distinguir em tamanho o genoma do tipo mutante do genoma do tipo normal.

Como resultado, foram observadas duas bandas correspondendo ao tipo mutante e ao tipo normal num dos três clones. Este clone da célula ES foi utilizado na preparação de um ratinho desactivado descrito abaixo. (4) Preparação de um ratinho desactivado

As células ES acima obtidas (15 células ES por blastócito) cujo gene endógeno que codifica para um "antigénio JTT-1 de ratinho" foi desactivado através de recombinação homóloga foram microinjectados em blastócitos que foram obtidos por cruzamento de um ratinho fêmea C57BL6 (Nihon Charles River) com um macho. Imediatamente após a microinjecção, os blastócitos (cerca de 10 blastócitos por cada lado do útero) foram transplantados para o útero de uma mãe adoptiva ratinho ICR (CLEA Japão) , que era um ratinho com 2,5 dias a partir de um tratamento de pseudogravidez. Como resultado, foram obtidos 33 ratinhos de progenitura no total e 18 foram os ratinhos quiméricos desejados. Onze (11) dos ratinhos quiméricos eram ratinhos quiméricos em que a contribuição para a cor do pelo era de 80% ou mais.

Os o' :· quiméricos obtidos deste modo foram então cruzados com ratinhos normais CSWM para obter ratinhos ãgsmtl;· cuja cor era derivada do gene da cor do Pfid das ES.

Exemplo 19 Preparação da composição farmacêutica compreendendo o anticorpo

Cada um dos anticorpos mcnoclonais (50-150 pg/ml), "anticorpo JTT-I" e "anticorpo JTT-2" contra "antigénio JTT-1 de rato" preparado no Exemplo 1, e anticorpos monoclonais, "SAI2" e "SG430" contra "antigénio humano JTT-preparado no Exemplo 12, foi adicionado a água destilada injectável (10 ml) para preparar a injecção.

Aplicabilidade Industrial

Novas moléculas da superfície celular (chamadas "antigénio JTT-1") descritas nesta memória descritiva e derivadas de mamíferos tais como seres humanos, ratinhos, e ratos são caracterizadas como se segue. (1) "antigénio JTT-1" possuía a semelhança seguinte com "CD28", uma molécula da superfície celular em linfócitos tais como células T que transmitem um sinal de co-estimulação importante para a activação de células T, através de adesão celular, e CTLA-4, uma molécula da superfície celular de linfócitos tais como células T que regulam a função dos linfócitos activados, tais como células T activadas cooperando com o sinal. (i) 20 ou mais resíduos de aminoácidos incluindo tealdiítAí de cisteína são altamente conservados; (ii) A sequência de repetição da prolina "Pro-Pro-Pro (PPP)" é essencial coroe c região de tixagtq do ligando, é conservada na regiãc extracelular. (iíí) A sequência (YxxM)" (Xaa e x representa qualquer amínoácido), sequência essencial como a região de transmissão do sinal é conservada na região cítoplasmátíca; e (iv) o iccus do gene que codifica para o "antigénio JTT-1 de ratinho" sobre o cromossoma do ratinho e AlCS*»· tal como (2) o "antigénio JTT-1" pode mediar a adesão celular de timócitos, linfoblastos estimulados com mitcgénio tal como ConA, timomas, tal como "CD28" e "CTLA-4" que medeia a adesão celular. (3) o "antigénio JTT-1" é fortemente expresso, pelo menos em timócitos, células linfoblasticas estimuladas com mitogenio tal como ConA (células linfoblasticas T activadas e células de linfoblastos B activados, etc, etc.), linfócitos sanguíneos periféricos, e timomas. (4) o anticorpo contra o "antigénio JTT-1" prolifera significativamente linfócitos sanguíneos periféricos humanos, e a proliferação e mais reforçada na presença de um anticorpo monoclonal contra CD3 constituindo o complexo TcR/CD3 em células T que recebem o sinal primário essencial para activação das células T a partir de células que apresentam antigénios. (5) a administração do anticorpo contra o "antigénio JTT-1" inibe significativamente os sintomas da encefalomielite alérgica (EAE). (6) a administração do anticorpo contra o "antigénio JTT-1" a um rato modelo para a nefrite da membrana basal do glORíéij;li; (GBM) inibe significativamente os sintomas desta doença. 0 aof 1 oir; r tiípoi descrito & son-n "ç.ili5·' s vGl'i.A-· nA apesar de ser uma molécula que transmite o sinal secundário (sinal de co-estimul ação) essencial para a de linfócitos tais como as células T, e regulando a função dos

Linfócitos activados tais como as células T activadas cooperando com o sinal.

Por isso, os polipéptidus da presente invenção que constituem as tais moléculas de superfície 1:.,:¾.¾ ca o, o seu fragmento polipéptidico e seus fragmentos de polipéptidos, e seus anticorpos como aqui descrito podem disponibilizar fármacos extremamente úteis para a terapia ou prevenção de várias doenças inflamatórias, especificamente, dermatose infiamaiória crónica tal como lichen planus, provocada pela activação de linfócitos tais como células T e a anormalidade na regulação de funções de linfócitos.

De forma semelhante, os genes que codificam para os polipéptidos da presente invenção ou para fragmentos polipéptidicos como aqui descritos podem ser utilizados não só na terapia génica de várias doenças como mencionado acima, mas também na preparação de fármacos antisentido.

Entre os anticorpos da presente invenção, os anticorpos monoclonais humanos e as suas composições farmacêuticas aumentaram dramaticamente o valor farmacêutico de fármacos de anticorpos porque não possuem antigenicidade contra os seres humanos, o que tem sido um problema grave (efeito secundário) de fármacos de anticorpos contendo anticorpos derivados de mamíferos não humanos, tais como anticorpos derivados de ratinhos.

Os genes (ADN), polipéptidos e anticorpos da presente invenção e os fxagmentos polipéptidicos como aqui descritos são úteis não só como fármacos, mas também como reagentes para pesquisar moléculas (ligandos) que interactuam com as moléculas da superfície celular aqui descritas, clarifica ndo a função do Ligando, e para desenvolver fármacos díreccíonados para os ligandos. Além disso, o ratinho tiiíftsçúdiçd aqui descrito é extremame nte útil não só cc-.m o um modelo a nimal para estudar a função fisiológica do y..... ,.;ΐ, , .... : ., j TT-1" que á uma molécula da superfície celular aqui descrita, mas também como um instrumento para pesquisar vários fármacos (compostos de baixo peso molecular, anticorpos, substâncias anti-sentido, polipéptidos etc.) possuindo actividade que regula a furíbàs (a inibição, súpfeésà©., activação, estimulação, etc.) do "antigénio JTT-1". Especificamente, tais substâncias teste podem ser administradas ao ratinho transgenico para medir e analisar vários parâmetros fisiológicos, biológicos, ou farmacológicos gerados no ratinho, avaliando deste modo a actividade das substâncias teste administradas.

Além disso, o ratinho desactivado aqui descrito pode clarificar a função das moléculas da superfície celular aqui descritas analisando as características do ratinho sob vários pontos de vista (fisiológico, biológico, farmacológico, e pontos de vista genéticos).

Listagem das Sequências (1) Nome do requerente: JAPAN TABACCO INC. (2) Título da invenção: Molécula da superfície celular que medeia a adesão celular e a transmissão de sinal

(3) Número de referência: J1-802PCT (4) Número do pedido: (5) Data de depósito: (6) País em que a prioridade do pedido foi registada e número do pedido:

Japão, N° Hei 9-062290

Japão, pedido de patente japonesa registado em 26 de Fevereiro de 1998 (número de referência, J1-802DP1) (7) Data da prioridade: 27 de Fevereiro de 1997 (8) Número de sequências :12 SEQ ID N°: 1: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 600 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: cADN a inARN FONTE ORIGINAL: ORGANISMO: Homo sapiens hl

NOME/CHAVE: CDS LOCALIZAÇÃO: 1..600 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:l AIG MG TCÁ G6C CTC TGG TAT TTC TTT CTC Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu

1 5 1G TTC TGC m CGC ATT Má GST TIA ACA GGA Phe Cys Leu Arg Ile Lys Vai Leu Thr Gly 15 20 m ATC MT GGT TCT fIC MT TAT GAG AT0 Gin Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Gin Met 25 30

Iff ATA TTT CAC MS GGA GGT « CM |ff

Pbe íle Phe Bis Asn Gly Oly Vai Gin íle 35 40 m TSC AM TAT CCT GAC âlf GTC CAG CM kn Sm Lys Tyr Pro Asp iie Vai lis Gin 45 50 TTT m AT6 CAG TTG SM AM GGG GGG CAA Pàe Lys Met Gin Leu Leu lys Gly Gly Gin 55 60 m CTC TGC láT CTC ACT MS ACA AM GGA íle Leu Cys Ásp Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 70 AGT GGA MC ACA GTG TCC AI" MG AGT CTG Ser Gly Âsa Thr Vai Ser He Lys Ser Leti 75 80 AM TTC TSÇ CAT TCT CAG TTA TCC MC MC Lys Phe Cys Bis Ser Gin Leu Ser Asn Asn 85 90 AGT GTC TCT TTT TTT CTA TÁC MC TTG GAC Ser Vá l®r Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp 95 m

CAT TCT CAT GCC MC TAT TAC TTC TGC MC lis Ser ik Ala Mn l|? Tyr Phe Cys Asa 105 Ui CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT Ά

Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys 115 120

GTA ACT CTT ACA GGA GGA TAT TTG CAT ATT ml flr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu flls Ile 125 130 m m tca cm ctt τατ tsc cag ctg m

Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin teu Lys 135 140

TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC W

Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Má Ala Phe 145 150 GTT 6TA 6TC TGC Iff TT6 GOA TGC ATA CTT Vai Vai Vai Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu 155 160 ATT TGT TGG CTT ACA AAA AAG MG TAT TCA Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser 165 170 TCC AGT GTG CAC GAC CCT MC GGT GM TAC Ser Ser Vai His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr 175 Í80 ATG TTC ATG AGA M GTG MC ACA GCC AAA Met Phe Met Árg Ala Vai Asn Thr Ala Lys 185 190 AM TCT AGA CTC ACA GAT GTG ACC CTA TM Lys Ser Arg Leu Thr Asp Vai Thr Leu 195 SEQ ID N°: 2: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 199 TIPO DA SEQUÊNCIA: arninoácido TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína FONTE ORIGINAL: ORGANISMO: Home sapiens DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ÇEQ ID N°:2

Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe leu 1- 5 10

Phe Cys Leu Arg íle Lys Vai Leu Thr Gly 15 20

Gli Ile Asd Gly Ser Ala Asm lyr Glu let 25 30

Phe Ile Phe Eis Asn Gly Gly Vai Gk Ile 35 40

Leu Oys Lys lyr Pro Âsp Ile %I Gk Gk 45 50

Phe Lys Met Ui Leu Lei Lys Gly Gly Gin 55 60 íle Leu Cys Ãsp Lei lir Lys Thr Lys Gly 65 70

Ser Gly Âsn Thr Vai Ser IJe Lys Ser Leu 75 80

Lys Phe Cys lis I«r 61b Leu Ser Asn Asa 85 90

Ser Vai Ser Phe Phe Lai -Tyr Âsn Leu Asp 95 100 Hís Ser His Alá ása Tfr Tyr Phe Cys Âsn 105 110

Leu Ser lie Phe Âsp Pro Pro Pro Phe Lys 115 120

Vai Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His íle 125 130

Tyr Glu Sar Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys 135 140

Phe Irp Leu Pro lie Gly Cys Aia Ala !%s 145 150

Vai Vai Vai Cys íle Leu Gly Cys íle Leu 155 160

Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser 165 iao

Ser Ser Vai iis Asp Pro Asi Gly Glu Tyr 175 180

Met Phe Met Árg Ala Vai Âsn Thr Ala Lys 185 190

Lys Sêr Arg Im Thr Âsp Vai fàr im COMPRIMENTO O® SEQUÊNCIA: 2610 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA; outros ácidos nucleicos { cADN contendo iõCtiêTKOMiís 3'- e 5'- não traduzidas) FONTE ORIGINAL: ORGANISMO: Homo sapiens

NOME/CHAVE: CDS LOCALIZAÇÃO: 26..625 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ LD N°:3

GGÁCTSTTÀÂ CfffTOW CAAAC atg mg tca ggc ctc tgg tat ttc ttt ctc

Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu 5 10

TTC TGC TTC 0i€ ATT ÂAÂ 5TT TTA ACA GGA

Phe Cys Leu Arg !k Lys Yal Leu Thr Gly 15 20

GAA ATC AAT GGT TCT GCC MT TAT GAG ATG

Glu íle Asn Gly Ser Ála Asi Tyr Glu Met 25 30

ITT ATA TTT CAC MC GGA GGT GTA CM ATT

Phe Ile Phe His Asn Gly Gly Vai Gin Ile 35 40

TTA TGC AM TAT CCT GAC ATT GTC CAG CM

Leu Cys Lys Tyr pro M.P lie Vai Gin Gin 45 50

TTT AM ATG CAG TTG CTG AM GGG GGG CM

Phe Lys Met Gin Leu Leu Lys Gly Gly Gin 55 60 ATA CTC TGC SAf CTC ACT MG ACA MÃ GGA Ile Leu Cys Âsp Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 76 AGT GGA MC ACA GTG TCC ATT MG AGT CTG Ser Gly Asn Ur M Ser Ile Lys Ser Leu TC 80 Mà TTC ICC m TCT CAG TTA TCC MC MC Lys Phe Cys lis Str Gin Leu Ser Asn àm 85 90 AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC MC TTG GAC Ser Vai Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp 95 100 CAI TCT CAT GCC MC TÁT TAC TI€ TGC MC Ut

His l§r His Ala Asn Tyr ffr Phe Çfs Asn 105 110

CTA TCÁ ATT ITT GAT CCT CCT CCT TTT AM M

Leu Ser f k? Phe Asp Pro Pro Pro Phe iys 115 120 GTA ACT CTT ACA SGA GCA TAT TTG CAT ATT m ?st Thr tó Thr Sly Gly íff Leu Bis Ile 125 130 TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG MG 441

Tyr Glu Ser Gin Lai Cys Cys Gin Leu Lys 135 140 TTG Ϊ8Β TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 4?l

Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys âl& Ala Phe 145 150 GTT GTA GTC I0C ATS TTG GGA TGC ATA CTT 104

Vai Yal Vai Cys Ile Leu Gly Cys lie Leu 155 160

ATT TGT T6G CTT ACA AM MG MG TAT TCA

Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser 165 170

TCC AGT GTG CAC GAC CCT MC GGT CM TAC S|S

Ser Ser Vai Bis Âsp Pro Asn Gly Glu Tyr 175 180 ATG TTC ÂTG AGA GCA GTG AAC ACA GCC AM 58$

Met Phe Met Árg Ala Vai Asn Thr âlã Lys 185 190 MA TCT Â6A CTC ACA GAT GTG ACC CTA TM m

Lys Ser Arg Les Tlr Asp Vai Ur Leu 195 TATG0MCTC TGGCACCCAG GCATGAAGCA CSTIGGCGAG TTTTCCTCM lf| mmmm mgattctct tatttccggg âwiâ gtctgactta m mimia tcttctgctg mmtm cmtcigsm gmtgactgt itMTOif «Ml TTGGTACTGC CGAGTCCTCT m «.mmmas Acranoc ààmmt mmâmm mmmm m GTGCTCACT5 GGAGTGGAAT CCCTGTCTCC ACATCTGCTC CTAOCAGTGC 925

ATCAGCCAGT Mâ$MâSL MfMAM iáAMTOT l?I AGGGGTACTG eeiwm ferni» Aà’mmmu, mmm

ummm CTATCATACT ÀSTCAAGGGA áTgfWÍS CCCCAGTTGA TTTTCTTTTT CTCTCAAIAG

5CAAÂTGÁGC ACCTCTTCTT GATGCTTCAA mmsiA CCATTTTACC MMATACTI AGAGCTATGT

AGCCM5GÁC CAGCATCTGT 1025 TCTGTAGGGE AGCTGGiGCT CATACTCAGT miáâim 1075 \ $ .>:*s>íx?x;s <<λρ ÍSlà A I :¾ fs. ^ .¾¾^ I X ΔΟ

mmmm CTACATGACT CTÍACATTCT ÂCTCTCCTTC 1175 ATGCTTTCTT 1225 GCTTGACAGC 1275 TTCCTCTGCT 1325 ícmatmí mmtm mmm mmmêk mmmk im ÍMAâffCAT AATGAATATA ITTGCCTÂTÂ TTCTCCCTAC ΜΜΑΜΪΪ 1425 IflCttOâGA AAGACATGTT CTTTTCTCAA ÂTTCAGTTAA AATGGTTTAC 1475 TTTGMáâl TTAGTG6TAG GAAACATTGC CCGGAATT8A AAGCAAATTT 1525 mmmm mmrm mmmm mimàrn 1575 álMMM ΒΙΙΒΤΓίϊ TGTAGATCAT ATTAAAATTG CMAOMMT ;.j3 m%m.m gggccagcat tctcatgggg tmamm tattcattta 1075 GCCTGAAÂGC TGCAGTTACT ÂTAGGTTGCT GTCAGACTAT ÀGCCATGGTG 1725 CCTCTGGGCT TGACÁGGTCA ÂMTGGTCCC CÀTCAGCCTG GAGCAGCCCT 1775 CCAGACCTGG GTGGAATTCC AGGGTTGAGA iáW» ®l« 1825 CACTAGGTAT TCTTGCTCCC AGAGGCTGAA GTCACCCT5G GAATCACAGT 1875 GGTCTACCTG CATTCATAAT TCCAGGATCT GTGAAGAGCA CATATGTGTC 1925 ÁGGGCACAAT TCCCTCICAT âAMáC:CACA CAGCCTGGAA ATTGGCCCTG 1975 GCCCTTCAAG ATAGCCTTCT TTAGAAÍATG ATTTGGCTAG AUfittfCft 2025 AAATATGTGG AATATGATTA TTCTTÁGCTG IMtffiTft ItmCffDCT 2075 stctgcatgc tmmw tmmm aatgtcsatg mmun 2125 TGTAACTTTA GGTAAACTGG GàTBft m TAGTTTAACA TTTTGTAACT 2175 GT6TGCTTA? MttèMf fGAGACCCGA lâTOIfá »» 2225 fálWm AGCATGTSTA ATGCTGGATG PlMfTE AGTACWTMC 2275 IflKffS AATCTÀGTAT GGTGTTCTGT !M«à efTIláSAM 2325 CTSACTGGCT a« 6TTCCCTGAG Τ&ΤΜ&Λ GTTTCTGTGÍ 2375 f!666fifS6S GTATSGGGAG ArGGTGGCCC ACCIGGCCTG 2425 GTTGTCCAAG CTGTGCCTCG ACACATCCTC ATCCCAAGCA 7GGGACACCT 2475

Biiáíiâir mmmkc immm mMmm mm mmíãm mmkm mrnmk: mmm mmm mm tàkMiám amrnmh mxkwk a bam 2010 COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 2072 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: linear TIPO D:-: MOLÉCULA: outros ácidos nucleicos { cADN contendo sequências 3'- e 5'- não traduzidas) FONTE ORIGINAL: ORGANISMO: Rattus

NOME/CHAVE: CDS LOCALIZAÇÃO: 35..637 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4 CTGGÀGGGGÂ AGÀGTGCAGC TGTTCCTGGC ÂGAC ATG AAG CCC TÁC TTC TCG TGC GTC fff GTC Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Yal Phe Ya! i 5 10 TTC T6C TTC CTÂ ATC AM CTT TTÂ ACA GGÃ

Phe Cys Phe Leu íle Lys Leu Leu Thr Gly 15 20

m CTC MT 6AC TTC GCC MT CAC AG6 ATG

Glu Leu Ásn Asp Leu Ala Asn His Ârg Met 25 30 TTT TCG TTT CAC 6AT GOA GGT 6TA CAG ATI Phe Ser Phe His Ásp Gly Gly Yal Gin Ile 35 40 TCT TGT MC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG Ser Cys Asn Tyr Pro Glu Thr Yal Gin Gin 45 50 TTÁ AAA ATG CAG TO TTC AM GÁC AGA GM Leu Lys Met Gin Leu Phe Lys Ásp âff Glu 55 60 GTC CTC T6C 8AC CTC ACC MG ACC MG GGA Vai Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 70

AGC GGA MC ACÈ 6TG TCC ATC MG Ml CCG

Ser Sly Asa Thr Vai Ser lie Lys Asn Pro 75 80

ATS TCC m CCA TÀI CAG £11 TCC MC MC

Met Ser Cys Pro 1iy? Gin Leu Ser tea Asn 85 90

AST GTC TCT ITT ffC CIA GAC MC GCA GAC

Ser Vai Ser Phe Phe Leu Asp te! Mi Asp 95 100 A6C TCC CAG GGC ASC TAC TTT ΠΑ TGC A6C Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Phe Leu Cys Ser 105 110

CTG TCG ATT TTC GAC CCA CGC CCT TTT CM

Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin 115 120 SM ÁAG MC SIT At? GGA GGA TAT HG CF? Glu Lys Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu Leu 125 130

ATT TAT GM TCC CAG CTT TGT T5C CAG CTG

Ile Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu 135 140

MG CTT TGG TTA CCC GTA GGG TGT GCA GCT

Lys Leu Trp Leu Pro Vai Gly Cys Ála Ala 145 150

Tf? GTG GCA GCG CTC CTT TTT GGA TGC ATA

Phe Vai Ála Ála tei Leu Phe Gly Cys 11® 155 160 TTT ÀTC GTC TGG TTR GCA AM MG MG Mi Phe Ile Vai Trp Phe Aia lys Lys Lys Tyr 165 170 AGA TCC AGT GTG CAC GAC CCT MT AGC m Arg Ser Ser Vai His Asp Pro Asa Ser Glu 175 180 T†AT6 TTC ATG GCG GCA GTC Mi ACA MC Tyr let fte Met Ála Ala fel Asn ftr Asn 185 190 m km icc ága ctt gca iit m acc tca f tf μ q ta tf v.' b μ t- ; ;:. í>^v \%\ ;λ·λ μ μ ο< Η «« V.V· μ g μ ^•..·€ '·νϊ ώ 'i'j μc ti a με /" /;> ';: μ ο μ g ^ μ. μ μ L' «Λ ί·' μ r; Í? ^.w V·./ μ !,;" ‘/' Vn ι < μ μ ί'ν μ ^ μ as ‘ΧΛ W US μ· % \ν«Α Ά H q VYl V\0 h w tf w! ív' tf ν i >v. \V'. 2 Α,ν - ,.\v w, V ·.' 'ΐ! μ \ν; ί,!ϊ b A".S ^- iv' b μ % •Λ^ fw 5 ,«‘í tf tf «K; 'fll b a' tf k w Sv" S ^ ύ V,' a: M < A\J tf' tfv b μ-tf tf μ tf ν/ 4ν' .w\ .y. ^ ί1" μ àí & Q μ ''tf .W I^.V ,^· >: O q í'· tf, tf 5 q tf tf· q c '..) < tf q \> q [.Wl í J Uí £v υ μ tf ... Jl í >>' q „ "' ?" b tf >>'): '»:? tf, Í£ *è !» k £'" h· μ (w, !. J y-.v ..μ λ ·. μ

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FONTE ORIGINAL: GRGANISMO: Mus

NOME/CHAVE: CDS LOCALIZAÇÃO: 1...603 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°;5 ATS AAG CCG TAC TTC SGC CAT ÇTC TTT GTC iét Lys Pro Tyr Phe Cys His Vai Phe Vai 1-5 10

TO m TTC CTA ATC AGA CTT ΓΤΑ ACA GGA

Phe Cys Phe Leu lie Arg Leu Leu Thr Gly 15 20 GAA ATC AAT GGC TCG GCC GAT CAT A6G ATG Glu Ile Asn Gly Ser Ma Asp His Arg Met 25 30 TTT TCA. TTT CAC AAT GGA GGT GTA CAG ATT Phe Ser Phe Bis Asn Gly Gly Vai Gin Ile 35 40 TCT TGT AAA TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Vai Gin Gin 45 50 TTA AM ATG CGA TTG TTC AGA GAG AGA GAA Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu 55 60 GTC CTC TGC GAA CTC KL AAG ACC AAG GGA la! Leu Cys Glu Leu Tar Lys Thr Lys Gly 65 70 AGC GGA MT GCG GTG TCC ATC MG MT CCA Ser Gly Asn Ala Vai Ser íle Lys km Pro 75 80 ATG CTC TGT CTA TAT CAT CTG TCA MC AAC Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn 85 90 AGC GTC TCT TTT TTC CTA MC MC CCA GAC Ser Vai Ser Phe Phe Leu àls Ase Pr o Àsp 95 100 AGC TCC CAS GGA AGC TAT TAC TTC TGC AGC Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser 105 110 CTG TCC ATT TTT GAC CCA CCT CCT TTT CM Leu Ser Ile Phe Âsp Pro Pro Pro Phe Gin í ^ £ 1 ΟΠ

ϊ, 1 L· U GM AGG MC CTT AGI GGA GGA TAT TTG CAT Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu lis 925 130 ATT TAT 6ΑΑ TCC CAG CTC TGC TGC CAG CTG Ile Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu 135 140 MG CTC TGG CTA CCC GTA GGG TTG CCA GCT lys Leu Trp Leu Pro %I Gly Leu Pro Ala 145 150 TTC GTT GTG GTA CTC CTT TTT GGA TGC ATA Phe Vai Vai Vai Leu Leu Phe Gly Cys Ile 155 160 CTT ATC ATC TGG Hf ÍCA MA AAS AÁA TAC Leu Ile Ile Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr !§S 170 GGA TCC AGT GTG CAT GAC CCT MT AGT 6M Gly Ser Ser Vai lis Asp Pro Asb Ser Glu 175 180

TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC MC ACA MC

Tyr Met Phe Met Ala Ala Vai Asn Thr âss 185 430

Mâ MG TCT AGA CTT GCA GGT GTG ACC TCA

Lys Lys Ser Arg Leu Ai a Gly Vai Thr Ser 195 200

TAA SEQ ID N°: 6: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 836 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: outros áoi/úfôu nucleicos i cADN contendo sequências 3'- e 5'- não traduzidas) FONTE ORIGINAL: ORGANISMO: Rattus

NOME/CHAVE: CDS

LOCALIZAÇÃO: 35..685 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6 CTGGAGGGGá AGAGTGCâGC IGTTCCTGGC ÂGAC ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC 6TC TTT GTC Met Lys Pro tf? Pile Ser Cys Vai Phe Vai 1 5 10 m m ttc cta aic ma ctt tta aca gga

Phe Cys Phe Leu He Lys Leu Leu The Gly 15 20 m CTC MT GAC TT6 GCC MT CAC AGG ATG Glu Leu Àsn Âsp Leu Ala Asn His ârg Met 25 30 TTT TCG TTT CAC GAT GGA GGT GTA CAG ATT Phe Ser Phe His Âsp Gly Gly Vai Gin He 35 40 TCT TGT MC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG Ser Cys Âst Tyr Pro Glu Thr Vai Gin Gin 45 50 m âáá átg CAG m ttc ma gac aga gm

Leu Lys Met Gin Leu Phe Lys Asp krg Glu 55 60

GTC CTC I6C GAC CTC ACC MG ACC MG GGA M teu Cys Asp Leu Thr lys Thr lys Gly 65 70

ÂGC GGA MC ACC GTG ICC ATC MG ÂAT CCG

Ser Gly Asi Thr Vai Ser íle Lys Asn Pro 195 200 CTT AGG GCT TTG GG5 AGA GGA GAA CAC TCT SI4.

Leu Arg Ala Leu Gly Arg Oly GIu Hís Ser 205 210 TOA TGT CAA GAC CGG AAT TM 685

Ser Cys Gin Asp Arg Ásn 215 735 785 835 836

TTTGTTTATT TCTATTTTAA AAGAAAGACA STTTTTCCCC TAAAGATAÀT

TTTTGTATTT TTATGTGAAA GTCTGAATCT TCATTTTAAC TCGACTTATA IACTCTGTGG TATÀTXMM âfMIffffG TGAMMâM àMmmá SEQ ID N°: 7: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 27 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: outros ácidos nucleicos (ADN sintético) NOME/CHAVE: ligação do iniciador LOCALIZAÇÃO: 1..27

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E

DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:7 CTGCTCGAGA TGAAGCCCTA CTTCTCG SEQ ID N°: 8: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 32 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: outros ácidos nucleicos (ADN sintético) NOME/CHAVE: ligação do iniciador

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E

DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:8 ACCCTACGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC AA SEQ ID Nc: 9: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 30 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPGLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (ADN sintético) • "'T j"1·'

Dia: NOME/CHAVE: ligação do iniciador LOCALIZAÇÃO: 1,,30

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E

DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:9 TAACTGTTTC TCGAGAACAT GAAGTCAGGC SEQ ID N°: 10: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 30 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: Linear TIPC DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (ADN sintético) NOME/CHAVE: ligação do iniciador

LOCALIZAÇÃO: i..30 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E

DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:10 ATCCTATGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC SEQ ID N°: 11: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 35 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (ADN sintético) ϋΜΜΊ&¥·1%$ I.CA; NOME/CHAVE: ligação do iniciador LOCALIZAÇÃO: 1,,35

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: E

DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:ll CGTGATATTG CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGC SEQ ID N°: 12: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 34 TIPO DA SEQUÊNCIA: ácido nucleico TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (ADN sintéticc/ ;:íD <5. LOCAL ILAÇMA 1, < 34 AÈfooo de ii:s3'i:o;riímçÃOí e

DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:12 CATTCAAGTT TCAGGGAACT AGTCCATGCG TTTC

Listagem das Sequências <110> JAPAN TOBACCO INC. adesao <I3:0> Molécula da superfície celular que medeia celular e a transmissão de sinal o Ãu).;y Ç v.-ÇiÀCEuÇ: •Αρ’ v : > 1&-S- ÍAÀ-;1 ΐ ::^>L--í-ígv4? A-ÃfcvP ;Eí^^ÃÃ.Ç:;;ÇÃ:·· v O iV;:··· ·;>

Patentln Ver. 2.1 <2ι0> 1 02 O 600 o; o una •0.23? Homo saoiens Oí ? K SSL •LÍL- ÍÍJ. 0¾¾

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,:,8¾ PRT <213a nomo sapiens ;®ií Lys Ser Gly Leu Trp Tyr ?he 1 3 V·»; Lstí Salp 1.4.. ,;íí â.st Oiç 20

Phe His Asn Gly õ.íy Vai g;.., j;& 35 ' 40

Slís Gin Phe Lys Ssí. Gin Leu Leu 50 55

Leu Thx Lys Thr Lys Gly Ser Gly 65 70

Lys Phe Cys His Ser Gin Leu Ser 85

Tvr Asn Leu Asp »is Ser Sis Ala 100 lie Phe Asp Pro ãts Pr* Phe Lys 115 120

Eis Ile Tyr Glu Ser Gin Leu Cys 130 L35

Gly Cys Ala Ala Phe Vai Vai 145 150

Ile iSys Trp Leu Thr Lys Lys Lys 165

Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg 180

Asif Leu Thr Asp »1 Thr Leu 135 sCsíi Leu Phe Cys Leu Ars lie Lys ’ 0 15 1 v; ii.fi Í:.'í": TCí' Glt KSfc PÁS 1¾ 23 30

List Cys Lys Tyr Pro Ile Vai 5

Lys Gly Gly Gin Ile ::.·«« Cys 60

Asn Thr Vai Ser Ile Lys ;íí:.í 75 80

Asn Asn Ser Vai Ser Phe Phe ΐ·*ο 90 95 A.sn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser 105 1Í0

Vai Thr Leu Thr Gly Gly Tyr I.su i 2 5

Cys Gin teu Lys Phe Trp Leu gyy 140

Vai Cys Ile Sm Gly Cys Lsss

155 ISS

Tyr Ser Ser Ser Vs; His Asp Pro 170 175

Ala Vai Asn Thr Ala Lys Lys Ser .a: 5 190

2> DNA 3> Homo sapiens

U CDS (26) .(625) 52 ggsctgttaa ctgtttctgc caaac atg aag tca ggc ctc tgq tat ttc ttt

Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe i 5 ccc ttc tgc ttg c.qc att aaa gtt tta aca qga gaa ate aat ggt tet 100

Leu Phe Cys Leu Ara Ile Lys Ihu Leu Thr Gly Giu Ile A.sn Gly Ser 40 15 2C 25 CCC : aat . tat gâg atg ttt ate ttt cac : aac : çga ggt . gta . cas : att tta 148 Ala Λ5Π . Tyr Glu Het Phe : Ile Phe : HÍS Asm 1 Gly • Gly Vsl . GIr 1 Ile s Leu 30 35 4C •tgc aaa tat cct gac att. gtc cag caa ttt aaa atg cag ttg ' 224 "i t t Cys Tyr Pro Asp Ile Vai Gin Gin Phe Lys Wet Gin I.eu Leu Lys x3 50 55 Ο'ΐίν <3gg caa aia ctc tgc gat ctc act aag aca gga agt VvA aac 24 4 Gly Gin Ile Leu Cys X ••'U· Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly As n 60 65 10 gcg tcc a 11 aag g aaa ttc tgc cat tet tta tcc aac 252 \v.« .1 %&-z. Ile Lys :VÍ Lys Phe Cys His Ser Gin 'ivÇlv 75 80 85 •v-ÕC age QZC ict ttt ttc cta tzc aac ttg gac cat cct cac CCC aac 34 0 íias‘£ •isr Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp His .>·:>·- Kis Pi la Asn 30 45 100 105 ,,,, tac ttc tqc aac cza act Ctt cct ccc cct ttt ccâ gta 388 ?èv.5* Tyr Phe Cys ?.sn lAU Ser Phe Asp ;T5 Pro -'·?·· Phe Lys Vcv l 110 115 120 set ctt ãC3 qga cga tat ttg cat att tet u t c tca Cac Ctt tgt . : ·$. Thr Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile Tyr Glu S er Gin Cys 125 130 ;JS «Xh? C--r<T IV .1.¾ ly ttc í fíès tta ccc ata gga tgt gea gee ttt gtt gts gtc icx-í .1:¾¾ Lys Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys w : ·ν· Ala Phe Vai Vai Vai 140 145 150 tgc â"Ct ttg gga tgc ata ctt att tat tgg Ctt aca aaa aag 3£Çf tat 532 Cys Ile Leu Gly Cvs Tle Leu λ .4, £ Cys Trp Thr Sys Lys Lys Tyr 155 160 165 tca tcc aqt gtg cac gac cct aac ggt gaa tac atg ttc atg - aça 0 "3 580 :i*r Ser Vai Asp Pro Ssn Gly Glu Tyr Phe ! Met ; iiiti , Aia 170 17 S 180 185 ãòc í;; aca 1 gee ; aaa aaa tet aga ctc aca gat . gtg , 3CC i cta taa 625 «S·, Mas l'iir Ala Lys Lys Ser Thr Asp Vai Thr Leu 190 ' Í95 tatggaactc 'JhSttíhhgtV: tggcacccaq gcatgaagca cgttggccag ttttcctcaa cttçaaçtgc 685 iiSvSíKjSíssy fitiipirtt-a ssLasas&ee. 1151.353:¾¾¾ yis

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cgagtcctct caaaacaaac accctcttgc aaccagcttt ggagaaagcc ®SS cagctcctgt gtgctcactç ggagtggaat ccctgtctcc acatctgctc ctagcagtqc 925 atcagccagt aaaacaaaca catttacaag aaaaatgttt taaagatgcc aggggtactg 985 aatctgcaaa gcaaatgagc agccaaggac ccgcatttca ctatcataçt 1045 acctcttctt tctgtagggr tgagaattcc tcttttaatc agtcaaggga gatgcttcaa 1105 agctggrgct attttattte tgagatgttg atgtgaactg tacattagta cataetcagt 1165 actctccttc aatfçefgaa rr«çr aagactttag atgctttctt 1225 gtgccctcaa ttttcttCtt aaaaatactt ctãcatgact gcttgacagc ccaacagcca 1285 ctctcaatag cgagctatgr cttacattct ttcctctgct çctcaataçt tttatatatc 1345 tatgeataca tatatacaca catatgtaca satgaatata tttgcctata 1405 ttctccctac aagaatattt ttgctccaça aagacatgtt cttttctcaa attcagttaa 1465 aatggtttac tttgttcaag ttagtggtag gaaacattgc ccggaattga aagcaaattt 1525 awwttattat cctattttct accattatct afcgttttcat çgtgcfcatta attacaaott 1585 s.ts tgtagatcat attaaaattg caaacaaaat catctttaat ggçccagcat 1645 tctcstgggç tagagcaçaa tatfccattta çcctgaaagc tgcagítact ataggttgct 1705 gtcagactat acccatçgtg cctctgggct tgacsggtca aaatgatccc catcagçctg 176S gagcagccct ccaçecctgg ctggsattcc agggttgaga gactcccctg agccagaggc 1825 cactaggtat tcttgctccc açsggctgaa gtcaccctgg çaatcacagt ggtctaectg 1885 cattcataat tccaggatct gtgaagagca catatçtgtc agggcãcaat tccctctcat 1945 aaaaaccaca cagcctggaa gcccttcaag »t»gcçsfc*«s$ ttagaatatg 2005 atttggctag aaagattctt aaatatçtgg aatatçrtta ttcttâgctg gaatattttc 2065 tctacttcct çtctgcatgc ccaaggcttc tgaagcagcc aatgtcçatç caacaacatt 2725 tgtaacttta ggtaaactgg gattatgttg tagtttaaca ttttgtaact gtgtgcttat 2185 agtttacaag tgagacccga tatgtcatta tgcatactta tattatctta agcatgfcgta 2245 atçctggatg tgtacagtac agtacwtãac ttgtaatttg aatctagtat ggtgttctgt 2305 cttggacaac ctgactggct gttccctgag ttgtttgcag 2365 gtttctgtgt gtggggtggg gtatggggag gagaaocttc atggtggccc acctggcctg 2425 gttgtocaag ctgtgcctcg acacatcctc atcccaagca tgggacacct caagatgaat 2485 aataattcac aaaatttetg tgaaatcaaa tccagtttta agaggagcca cttatcaaag 2545 agattttaac agtagtaaga aggcaaagaa fcaaacatttg atattcagca actgaaaaaa 2605 2610 aaaaa <2Ί1>2072

*2Í2> DNA <213> Ratíus norveglcus ctggaoagga agagtgcagc tgttcctggc agac atg aag ccc tac ttc tcg tgc 55

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Gly Tyr Phe Leu Cys Ser Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe 105 110 115 caa gaa aag aac ctt agt gga gga tat ttg ctt att èat çaa tcc cag 439 1¾¾ Glu Lys Asn Leu Ser Gly Gly Tyr 6*8 Leu Ile Tyr Glu Ser Glu 120 i25 130 135 ctt tgt tgc cag ctg aag ctt tgg tta ccc gta ggg tgt gea gct ttt 487

Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu Pro Vsl. Gly Cys Ala Ala Phe 140 145 150 gtg gea gcg ctc ctt ttt gga tgc ata ttt ate gtc tgg ttt gea aaa 535 Mí» ÃJi Leu Leu Phe Gly Cys Ile Phe Ile Vai Trp Phe Ala Lys 155 160 165 aag aag tac aga tcc agt gtg cac gac cct aat age gag tac atg ttc 583

Lys Lys Tyr Arg Ser Ser Vai Bis Asp Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe 770 175 180 atg gcg gea gtc aac aca aac aaa aag tcc aga ctt gea ggt atg acc 533

Met Ala Vai Asn Thr Asn Lys Lys §»>.' Arg Lfcss Ml Gly Met Thr 185 190 195 tea taa tctggaacac gggaacccat ggaggaacta cactgtctag ttcccctgaa Ser 687 acttgaatgg agaaagtctt gaccacaggg cattctgactt gattaactac 747 tgatacctcc tttlgqkgtt ttgtttgtct ggatcagtga ctatcagtca ctcggaattfc 807 cagcagactg ccctgggttt gctgagtcct tttaaggcaa accccttctt atagaagacc 867 eggctcatat gtattcaaca aacagacctc âctgggatac aatcccctct ttctacor-4-gcttctagct atçcaccggc cagcaagaca aacatatctc cagcattttt acaaaaatgc 9S7 cagggtatga atctgfcaaag tacacaggca gccattgacc accgtctgtc ctcçtttttt 1047 cagattctat ttttttccet egagatcagc attccttcta gaatcagaca gtagaggçaç 1107 atgcttcact acagaagctc ttatgtttct gagatgttga tgaattcatg etttagtacc 1167 accatgttct ctaacaaCtt ctatattcca gctgatcact gcfctcagggc ttagatgcct 1227 gcttttgcct tcaagtctcc ccttaaagat actcccacag gtctacttgg tggcctgcag ccactctgaa tagçaagctt «gtsMíSdt ttcccccctc tgctgctcsa aaaasaaaat 1347 tagtagatat gattttccca tattctccct gccaaagtaa ttttttccag caaagacatc 1407 taaattcaçt taatatggtt tactgtgttg atattagtgg cagtaaacat ttctcagaat 1467 1SS7 tattactcac aagtttaçct «s.SSttfetfc&t gcatcatatt aaagtcgcaa gcaagcagag 1587 ttaatgggca aacattctcc tgaattgtct atttagcccg 164 7 aaaaetgcaç tttctgtggg tggctgccag actacsgccg cgctttgctc cggetttgac 1707 aggttgaaat agyccccatg agwactccaç actgtgctgg agtcccaaag 1767 ttaggagggc S»Ss®SíSt tctttaggat cfcaggaaraa 1827 ttacagaggg gcoaagacag agttccctcc cctagaaact gtgeagcctg gaaqtcagcc 1887 ctggcacttt aagatagcct tctktagaac atgapttagt tggtagtatt ctgacçtgta 1947 aacagcctat kgttgctcgg ctttctccac ttccctgtct gcatgcetaa 2007 gacttctaga gcagccaacg tatatgcaec attaaagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2067 2072 aaaaa

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<221S’ CDS (35)..(685) «403;* S ctggagggga agagtgcagc tost.íftS-ç-ggs agac atg aag ccc tac ttc tcgr tgc 55

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Homo sapiens í'4;S3> 2

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<210> 3 <211> 2610 DNA c213> Homo sapiens <22Q>

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Lisboa, 9 de Julho de 2007

Claims (11)

1. Reivindicações 1. Molécula de ácido nucleico seleccionada a partir do grupo que consiste em: Pp! m ácido nucleico que codifica para um polipéptido constituído pela sequência ae aminoácidos indicada na SEQ ID Nc: 2; (b) molécula de ácido nucleico constituída pela sequência de nucleótidos como indicada na SEQ ID N° 1; (c) molécula de ácido nucleico constituída pela sequência nucleótidica de 26 a 625 da SEQ ID N°:3; e (d) molécula de ácido nucleico que codifica para um polipéptido constituído pela sequência de aminoácidos de 1 a 140 da SEQ ID N°:2.
2. 2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por ser cADN.
3. 3. Gene compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
4. 4. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou o gene da reivindicação 3.
5. 5. Célula recombinante compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 4.
6. 6. Célula recombinante que e identificada pelo ηύ&Μτο ã& depósito internacional N° FERM BP-3725. sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID N0:2.
7. 8. Anticorpo específico para o polipéptido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o dito anticorpo ser o anticorpo seleccionado a partir do grupo constituído por anticorpo de rato, anticorpo de cobaia, anticorpo de coelho, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo humano.
8. 9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo monoclonal, ou uma parte do anticorpo monoclonal, em que a parte é seleccionada a partir do grupo constituído por F(ab')2, Fab' e Fab.
9. 10. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com a reivindicação 8 ou 9 ou uma porção do anticorpo monoclonal como definido na reivindicação 9, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
10. 11. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 8 ou 9 ou de uma porção do anticorpo monoclonal como definido na reivindicação 9 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar doenças inflamatórias, ou para evitar os sintomas da dita doença.
11. 12. Célula produtora de anticorpos que produz o anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 9. Lisboa, 9 de Julho de 2007