WO1998038216A1 - Molecule de surface cellulaire induisant l'adhesion cellulaire et la transmission de signaux - Google Patents

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Takuya Tamatani
Katsunari Tezuka
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Definitions

  • the present invention relates to a novel mammalian cell surface molecule, a polypeptide constituting the molecule and a fragment thereof, a fusion polypeptide composed of the polypeptide fragment and an immunoglobulin fragment, the polypeptide and the fragment encoding the same.
  • a gene a vector containing the gene, a transformant into which the vector has been introduced, the polypeptide or an antibody having the reactivity of a cell surface molecule composed of the polypeptide, and a hybrid producing the antibody.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the polypeptide fragment or the fusion polypeptide, a pharmaceutical composition comprising the antibody, a transgenic mouse, and a knockout mouse.
  • Mammalian organisms have an immune response system that attempts to eliminate pathogenic microorganisms (viruses, bacteria, parasites, etc.) and foreign foreign substances (hereinafter collectively referred to as “antigens”) that have entered the body.
  • One is called the innate immune response system and the other is called the adaptive immune response system.
  • the former are phagocytosed by phagocytes (polymorphonuclear leukocytes, monocytes, macrophages, etc.), attacked by natural killer cells (NK), and non-specific, such as opsonization of antigen by complement. This is an exclusion mechanism based on recognition.
  • lymphocytes mainly T cells and B cells
  • B cells that have acquired antigen specificity attack the extracellular antigen by producing an antibody specific to the antigen.
  • CTL cytotoxic lymphocytes
  • the latter attacks cells infected with viruses by themselves (Experimental Medicine (separate volume) ⁇ "Bio Science Terminology Library I [Immunology]", Yodosha, p.14-17, 1995).
  • T cells recognize antigens presented by antigen-presenting cells (APCs) such as macrophages, B cells or dendritic cells.
  • APCs antigen-presenting cells
  • MHC major histocompatibility complex
  • T cells recognize the processed antigen presented by antigen presenting cells through a complex of T cell receptor (TcR) on the cell membrane surface and CD3 antigen (TcR / CD3 complex). Receive the first signal for cell activation (acquisition of specificity).
  • the first signal through the TcR / CD3 complex does not only result in insufficient activation of T cells but also an unresponsiveness (unresponsiveness) that does not respond to any subsequent stimuli.
  • Autoleukin (autocrine) of interleukin-12 (IL-2) is required to activate T cells and differentiate and proliferate into antigen-specific T cell clones.
  • IL-2 production and cell division do not occur, and T cells are inactivated. That is, activation of T cells with the production of a site kinase such as IL-2 requires a second signal following the first signal via the TcR / CD3 complex. This second signal is called the costimulatory signal.
  • T cells respond to this second signal by interacting (cell-cell adhesion) with a different molecule from MHC on antigen-presenting cells through a molecule different from the TcR / CD3 complex on the T cell surface. Receiving and transmitting into cells. This second signal causes the cell Cell paralysis is avoided and cells are activated.
  • a cell surface molecule expressed on CD28 also known as Tp44, ⁇ 44, or 9.3 antigen
  • CD80 also known as B7-l, ⁇ 7, ⁇ 1, or B7 / BB1
  • CD86 also known as ⁇ 7-2 or ⁇ 70
  • the control of the activation of ⁇ cells by the second signal includes the expression of CTLA-4 (Cytolytic T lymphocyte associated antigen 4), which is considered to increase its expression depending on the second signal. )
  • CTLA-4 Cytolytic T lymphocyte associated antigen 4
  • CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2) also play an important role in cell-cell adhesion through binding between their molecules.
  • the regulation of T cell activation by the transmission of the second signal includes at least the interaction between CD28 and CD80 / CD86, the enhancement of CTLA-4 expression which is considered to depend on the interaction, and It has been shown that the interaction between CTLA-4 and CD80 / CD86 is involved.
  • CD28 has been shown to be a costimulator element that transmits a second signal (costimulatory 'signal) required for activation of this T cell and avoidance of xanadi.
  • the second signal transmitted by the T cell stabilizes the mRNA for Thl-type cytokines, resulting in the production of large amounts of Thl-type cytokines such as IL-2, IFNy, and TNF from T cells. Prompt.
  • CTLA-4 has been shown to respond to these signals and act to suppress T cell function as opposed to T cell activation by a second signal entering from CD28
  • Human CD28 and CTLA-4 are type I glycoproteins with molecular weights of 44 kD and 41-43 kD, respectively. Both have a single immunoglobulin-like domain, belong to the immunoglobulin-perfume family, and have both functions as an intercellular adhesion molecule and a signal transduction molecule into cells.
  • CD28 forms a homodimer through dizulphide binding
  • CTLA-4 exists as a monomer.
  • the positions of the genes for CD28 and CTLA-4 on the chromosome are both "2q33" in humans and “1C” in mice, and both consist of four exons.
  • Human CD28 and CTLA-4 are composed of 22 and 23 amino acids, respectively, including the leader sequence, and their amino acid homology is about 20 to 30%.
  • the ligands for CD28 and CTLA-4 have been shown to be CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2) in humans and mice.
  • CTLA-4 has a higher affinity for both ligands than CD28, with a difference of about 20-fold.
  • MYP PPY Metal-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr
  • PI3K phosphoinositide 3 kinase
  • CD28 plays an important role in intracellular signal transmission through this “YxxM” structure.
  • CTLA4 also has the sequence represented by “YxxM”, that is, “YVKM (Tyr-Val-Lys-Met)”, and SYP associates with this sequence after stimulation. It has been shown.
  • costimulators such as CD28, CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2) in controlling T cell function (T cell activation and function suppression) and cooperating CTLA-4 etc.
  • costimulators such as CD28, CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2)
  • T cell function T cell activation and function suppression
  • cooperating CTLA-4 etc.
  • the importance of interactions between multiple molecules in other words, cell-cell adhesion through bonding between those molecules
  • Attempts to treat diseases by controlling the functions of these molecules have also attracted attention.
  • a living body activates the acquired immune response system against antigens that are foreign to the living body (self), but does not show an immune response against its own biological component (self antigen). Have tolerance. However, when immune tolerance breaks down for some reason, an immune response to self-antigen occurs, and self-antigen-reactive T cells are induced by the same mechanism as described above, resulting in an immune abnormality and various autoimmune diseases. You.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, autoimmune thyroiditis, allergic contact dermatitis, and chronic inflammatory skin diseases such as lichen planus and psoriasis
  • antigen-presenting cells in the focus of the disease Abnormal expression of CD80, a costimulatory molecule as a ligand for CD28 and CTLA-4, has been confirmed, and attempts to treat various autoimmune diseases in particular by suppressing the function of CD80 have been made. Much has been done.
  • CTLA-4 As a method for blocking the function of CD80, a method using an antibody against CD80, a solubilized protein of CD28 which is a ligand of CD80, or a solubilized protein of CTLA-4 which is also a ligand of CD80 has been studied.
  • the solubilized CTLA-4 which is based on the fact that the binding affinity of CTLA-4 to CD80 is at least 20 times higher than that of CD28, specifically the extracellular domain of CTLA-4 and human immunity
  • Therapeutic trials using fusion proteins (CTLA-4-IgFc) consisting of the Fc region of globulin IgGl have been conducted in animal models and clinical trials (Japanese clinical study, Vol. 55, No. 6, No. 215). -220 pages, 1997).
  • CTLA-4-IgFc fusion proteins consisting of the Fc region of globulin IgGl
  • mice a model of human systemic lupus erythematosus (SLE), suppression of autoantibody production and onset of lupus nephritis by pre-symptomatic administration; Improvement of disease condition was observed (Science, Vol. 125, p. 1225-1227, 1994) o
  • EAE allergic encephalomyelitis
  • MS multiple sclerosis
  • NOD non-obese diabetes
  • IDDM insulin-dependent diabetes mellitus
  • lymphocytes such as T cells
  • lymphocyte activation by cell-cell adhesion through intermolecular binding that is involved in the transmission of a second signal essential for activation of lymphocytes such as T cells as described above.
  • the elucidation of the mechanism of function control, and the identification and characterization of known or unknown molecules that have both the ability to mediate intercellular adhesion and the ability to transmit signals involved in that mechanism have been described earlier.
  • it is possible to develop and provide a drug useful in the treatment or prevention of various diseases such as various autoimmune diseases, allergic diseases, and inflammatory diseases.
  • an object of the present invention is to identify a novel cell surface molecule having both functions of mediating cell-cell adhesion and signaling, and to clarify its structural and biological properties. And Furthermore, another object of the present invention is to provide a medicament useful for treating or preventing various autoimmune diseases and inflammatory diseases by using the novel molecule or an antibody against the molecule.
  • lymphocytes such as T cells play an important role in autoimmune diseases, Focusing on the fact that cell-cell adhesion is essential for signal transduction of the second signal (costi-mellitus signal) from cells into lymphocytes, it is specifically expressed in lymphocyte cells, In addition, the present inventors considered isolating and identifying a cell surface molecule having a function of mediating cell-cell adhesion.
  • monoclonal antibodies against various cell surface molecules expressed on the surface of the lymphocyte cells are obtained by immunizing the lymphoid cells themselves, and cell-cell adhesion is obtained using the obtained monoclonal antibodies.
  • the present inventors first administered a rat lymphocytic cell line as an immunogen to mice to produce various monoclonal antibodies.
  • the obtained monoclonal antibody was allowed to act on rat lymphoid cells used as an immunogen, and the effect of the monoclonal antibody on the cells was examined.
  • this monoclonal antibody had the property of strongly aggregating the rat lymphoid cells (this monoclonal antibody was named "JTT.l antibody”). Furthermore, in the same manner, among the prepared monoclonal antibodies, a monoclonal antibody that strongly inhibits the aggregation of rat lymphoid cells induced by the “JTT.l antibody” was found (this monoclonal antibody was referred to as “JTT.2 Antibody ").
  • JTT-1 antibody an affinity column prepared by adsorbing "JTT-1 antibody” on the adsorbent
  • the mixture of soluble cell surface molecules prepared from the rat lymphoid cells was used to obtain the "JTT-1 antibody”.
  • the molecule to be trapped, ie, “JTT-1 antigen” was purified.
  • the molecular weight of this purified “JTT-1 antigen” was analyzed by immunoprecipitation using “JTT-1 antibody” and “JTT-2 antibody” and SDS-PAGE.
  • the molecules immunoprecipitated by each of the “JTT-1 antibody” and “JTT-2 antibody” are the same molecules, and the molecules are homodimers having different sugar chain modifications. I found it.
  • the N-glycan when the N-glycan is not digested, it is identified as one molecule of about 47 kD in non-reduction, and as two molecules of about 24 kD and about 28 kD in reduction.
  • the chain When the chain was digested, it was identified as one molecule of about 36 kD in non-reduction and as one molecule of about 20 kD in reduction.
  • a cDNA library of lymphoblasts derived from rat spleen that had been intensified by ConA ij was expressed by the expression cloning method using the panning method using the “JTT.l antibody”.
  • plaque hybridization using a cDNA encoding the obtained "rat JTT.1 antigen” as a probe a cDNA library of human peripheral blood lymphoblasts stimulated with ConA was used to obtain "human JTT.1 antigen”.
  • “human JTT-1 antigen” was found to activate T cells through cell-cell adhesion as described in detail above.
  • Important costimulatory signals “CD28”, a cell surface molecule of lymphocytes such as T cells that transmit signals, and T cells that control the function of activated lymphocytes such as activated T cells in conjunction with these signals It was found to have the following structural similarity to “CTLA-4”, a cell surface molecule of lymphocytes.
  • the position of the gene encoding the mouse JTT-1 antigen on the mouse chromosome was analyzed using the fluorescence in situ hybridization (FISH) method. It was found that the position was "1C3", the same as the positions of "CD28” and "CTLA-4".
  • JTT-2 antibody was used in the experimental allergic unilateral cerebrospinal cord.
  • An experiment was performed in which the drug was administered to a model rat of nephritis (EAE) and glomerular basement membrane (GBM) nephritis.
  • EAE nephritis
  • GBM glomerular basement membrane
  • a monoclonal antibody against the “human JTT-1 antigen” significantly proliferates human peripheral blood lymphocytes, and the proliferation receives the first signal from an antigen presenting cell, which is essential for T cell activation.
  • TcR / CD3 complex on T cells It was discovered that higher proliferation was observed when a monoclonal antibody against the antibody coexisted, and the "JTT-1 antigen” was found to be a cell surface molecule involved in signal transduction to lymphocytes.
  • JTT-1 antigen By analyzing the detailed functions of the "JTT-1 antigen", it is useful to develop "JTT-antigens" of other animal species useful for developing pharmaceuticals for the treatment of autoimmune diseases, allergic diseases and inflammatory diseases.
  • the present invention provides a polypeptide, a gene, an antibody, a vector, a transformant, a pharmaceutical composition, a polypeptide related to the novel mammalian “JTT-1 antigen” isolated and identified as described above,
  • the present invention relates to a transgenic mouse, a knockout mouse, and the like. Specifically, the present invention relates to the inventions described in the following (1) to (36).
  • a polypeptide constituting a cell surface molecule having the following characteristics:
  • an antibody reactive with the cell surface molecule induces proliferation of peripheral blood lymphocytes in the presence of an antibody reactive with CD3;
  • polypeptide It has a partial amino acid sequence represented by Tyr-Met-Phe-Met in the intracellular region.
  • the polypeptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been substituted, deleted or added.
  • the polypeptide according to the above (1) which is characterized in that:
  • polypeptide according to (1) wherein the polypeptide is encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. .
  • polypeptide according to (1) wherein the polypeptide has an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the cDNA comprises a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 26 to 625 of SEQ ID NO: 3, a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 35 to 637 of SEQ ID NO: 4, a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 603 of SEQ ID NO: 5
  • the gene according to the above (7) which comprises a sequence or any one of the nucleotide sequences of base numbers 35 to 685 of SEQ ID NO: 6.
  • a homodimer molecule formed by binding a polypeptide fragment comprising the extracellular region of the polypeptide according to any one of (1) to (5) by a disulfide bond.
  • a pharmaceutical composition comprising one or both of the polypeptide fragment according to (14) or the homodimer according to (17), and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a fusion polypeptide comprising the extracellular region of the polypeptide according to any of (1) to (5) and a constant region or a part of a constant region of a heavy chain of human immunoglobulin (Ig). Beptide.
  • a pharmaceutical composition comprising any one or both of the fusion polypeptide according to (22) or the homodimer molecule according to (24) and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the effect on mitogen-stimulated lymphoblast cells shows the effect of monoclonal antibodies produced by the hybridoma identified by International Accession No.FERM BP-5707 on mitogen-stimulated lymphoblast cells. And a monoclonal antibody or a portion thereof which is substantially the same.
  • the effect of the monoclonal antibody on lymphoblast cells stimulated with mitogen was stimulated with mitogen by a monoclonal antibody produced by a hybridoma identified by International Accession No.FERM BP-5708.
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody or a part thereof according to the above (29) and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a gene encoding the polypeptide of (1) which is derived from a human containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
  • a transgenic mouse characterized in that a rat-derived gene containing the nucleotide sequence to be inserted is incorporated into an endogenous mouse gene.
  • polypeptide according to (1) which is a polypeptide derived from a mouse having an amino acid sequence encoded by the gene represented by SEQ ID NO: 5, so that the polypeptide is not produced.
  • a knockout mouse wherein the endogenous gene of the encoding mouse is inactivated.
  • the cell surface molecule of the present invention (that is, the “JTT-1 antigen”) is used for cell-cell adhesion through the molecule, signal transmission to lymphocytes such as T cells, and the function of activated lymphocytes. It has aspects that play a role in control. Therefore, general knowledge of lymphoid cells, intercellular adhesion molecules, and their relationship to disease is described below for the sole purpose of providing a general understanding of such biological events. Therefore, the general findings described below are not intended to limit the present invention. Lymphocytes are roughly divided into two types, T cells and B cells. Bone marrow pluripotent stem cells When lymphoid stem cells are differentiated from, some of them get into the thymus through the bloodstream.
  • T cells Lymphocytes differentiated and matured in the thymus are called T cells (Thymus-derived cells: T cells) and enter the blood again and travel throughout the body.
  • T cells Lymphocytes differentiated and matured in the thymus are called T cells (Thymus-derived cells: T cells) and enter the blood again and travel throughout the body.
  • Mature T cells have a molecule called CD3 on their surface, and the presence of this molecule is a marker for distinguishing whether the cell is a mature T cell.
  • CD3 is a powerful T cell marker.
  • T cells express CD4 or CD8.
  • T cells are also helper T cells (Th cells: helper T cells) that assist B-lymphocyte antibody production, and cytotoxic T cells (Tc cells: cytotoxic T cells: CTL) that attach to and destroy target cells directly ) Or killer T cells, subcellular T cells that suppress B-lymphocyte antibody production, and effector T cells that secrete effect substances such as lymphokines and cause delayed allergy.
  • Th cells helper T cells
  • Tc cells cytotoxic T cells: CTL
  • killer T cells subcellular T cells that suppress B-lymphocyte antibody production
  • effector T cells that secrete effect substances such as lymphokines and cause delayed allergy.
  • B cells are directly differentiated and matured in bone marrow.
  • B cells are cells that will produce antibodies when appropriately stimulated, and are precursor cells for producing antibodies.
  • immunoglobulins synthesized in B cells which function as antigen receptors.
  • Mature B cells have both IgM and IgD on the surface, and when stimulated by antigen and differentiated by signals from T cells, IgM production is increased and the C-terminal cell membrane junction is altered and secreted. . With sufficient stimulation, the surface immunoglobulin also changes to IgG, IgE, and IgA, and secretes each class of immunoglobulin.
  • Immunoglobulins on the surface of B cells are sometimes called slg for surface Ig, or mlg for cell membrane Ig. All Igs on the surface of one B cell have the same antigen binding site.
  • Lymphocytes that are neither T cells nor B cells are called LGL (laege granular lymphocute) or null cells. These cells have the ability to damage tumor cells and virus-infected cells, but unlike cytotoxic T cells, they do not need to be primed in advance. Therefore, it is also called natural killer cell (NK cell: natural killer cell).
  • NK cell natural killer cell
  • T cell antigen receptor TCR
  • TCR tumor cell antigen receptor
  • various biochemical changes occur in the cell, and a signal is transmitted to the nucleus, transcription of a specific DNA starts, and the respective proteins are synthesized.
  • cell-level responses can be seen.
  • CD8-positive T cells for example, considering a cell infected with a certain virus, the infected cell synthesizes a viral protein, and the protein is degraded by cytoplasmic proteasomes, and some peptides are converted to TAP.
  • IL-2R IL-2 receptor
  • CD4 + Thl cells CD4 + T cells secreting IL-2, IFNa, etc.
  • CD8-positive T cells may produce IL-2 and others in response to antigens.
  • MAC membrane attack complex
  • T cells contains serine protease LLT, proteoglycan, and so on. When differentiated into CTL and stimulated with antigen, they also secrete lymphokines such as IFN, LT, TNF and IL-2. In addition, T cells respond to pan-haemagglutinin (plant agglutinin, PHA) ⁇ concanapalin A (Con A) and show blast formation. Mature T cells that have not been stimulated yet are called resting T cells, and have a small cell size and a short life span of several days. When stimulated, the cells grow larger, as already mentioned, and become more responsive to various stimuli. Such T cells are called activated T cells. Some activated T cells become memory T cells, which, when subjected to the same antigenic stimulation, will result in a secondary immune response. It is said that memory T cells have been circulating in the body for several years and for decades.
  • B cells that have not been stimulated yet are called resting B cells, just like T cells, and proliferated when stimulated with a multivalent antigen or CD40L. Such B cells are called activated B cells.
  • Resting phase B cells have no costimulatory molecules (molecules that stimulate T cells together with TCR-mediated signals) such as B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86). It is said that even if an antigen is provided, it cannot stimulate the TCR to express CD40 ligand (CD40L) or produce lymphokine. Therefore, it is thought that activated T helper cells stimulated by other antigen-providing cells and activated respond to the antigen presentation of quiescent B cells.
  • dendritic cells expressing B7 molecules activated in response to microorganisms present the antigen. It is thought that they stimulate quiescent helper T cells, activate them by expressing CD40L, and then stimulate CD40 by binding to quiescent B cells that present the same antigen.
  • B cells Once activated by stimulation with a multivalent antigen or CD40L, B cells also express B7 molecules, stimulate CD28 on the surface together with TCR, activate their helper T cells, and express CD40L.
  • Rin Focaine can be produced.
  • B cells that have undergone a change such as the cells becoming larger due to stimulation but show little antibody secretion are called activated B cells.
  • T cell stimulation stimulates the production of IgM, and the produced IgM changes from membrane to secretory and becomes secreted.
  • humoral factors from T cells cause IgM to produce antibodies of other isotypes, such as IgG. This is called an isotype switch or a class switch.
  • B cells that have secreted antibodies have come to be called antibody-secreting cells, and some have become morphologically distinct, and are called plasma cells (plasma cells). Knowledge of immunology, Ohmsha (1996)).
  • the subpopulations of leukocytes ie, T lymphocytes, B lymphocytes, NK, neutrophils, etc.
  • the same lymphocyte shows different dynamics depending on the state of the cell, that is, whether the cell is activated or in the stationary phase.
  • Cell adhesion molecules are molecules that have the function of adhering cells to each other during the development and differentiation of an individual or during migration of cells to a local area. It is known to be an essential molecule for proper and functional communication.
  • Cell adhesion molecules are broadly classified into five groups based on their structural characteristics: immunoglobulin-per-family, integrin family-one, secretin family, cadherin family-one, and CD44 family.
  • Adhesion molecules belonging to the immunoglobulin super family are characterized by repeating loop-like domains formed by disulfide bonds, and are characterized by "ICAM-1” (intercellular adhesion molecule-1) s Molecules such as "VCAM-1" (vascular cell adhesion molecule-1) are known.
  • Adhesion molecules belonging to the integrin family are characterized by a heterodimeric structure, such as "VLA-1-6" (very late antigen-1-6) and "LFA-1" (lymphocyte function-associated).
  • N-force doherin and P-force doherin are known, and “CD44” is known in the CD44 family.
  • adhesion molecules such as adhesion of leukocytes to vascular endothelial cells and adhesion of lymphocytes to antigen presenting cells. It has gradually become clear that it is also related to various diseases.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • adhesion molecules For example, in SLE patients, the ability of T lymphocytes to adhere to cultured vascular endothelial cells Has been reported to be lower than in healthy individuals.
  • IFA-1 enhance "ICAM-1,”"VLA-4,” and "IFA-1" (Haskard, DO et al, Rheumatol. Int, 9, 33 (1989).
  • the adhesion between hepatocytes and inflammatory cells is "ICAM-1", "LFA-3” and "LFA-1".
  • Serum ⁇ ICAM-1 '' concentration in patients with acute hepatitis, chronic active hepatitis, and cirrhosis is higher than in healthy and chronic persistent hepatitis patients, and high values are found in histologically advanced patients among active hepatitis patients Therefore, it has been reported that serum CAM-1 in chronic liver disease correlates with the degree of hepatocyte damage (Mod. Phys. 15, (1), 73-76 (1995)).
  • VCAM-1 is also expressed in human atherosclerotic lesions, and its expression is particularly strong in smooth muscle cells and monocytes / macrophages that have migrated to the intima. It has been reported that it was accepted. Increased expression of “MCP-1” has been observed in rabbit and human atherosclerotic lesions, suggesting that “MCP-1” promotes the formation of atherosclerotic lesions through migration of monocytes / macrophages. (Current Terabi, 12, (8), 1485-1488 (1994)).
  • cancer metastasis there is a report on the relationship between cancer metastasis and abnormal adhesion molecules.
  • cancer cells with reduced E-cadherin are highly invasive, but the introduction of E-cadherin cDNA suppresses the invasiveness, and the addition of E-cadherin antiserum restores the invasiveness.
  • reduced expression of E-force doherin is closely associated with invasiveness of cancer cells (Frixen, UH, et al. 113, 173 (1991)).
  • various cancers such as liver cancer, esophagus cancer, stomach cancer and breast cancer have a relationship between reduced E-cadherin expression and metastasis.
  • VLA-4 a ligand of VCAM-1
  • VLA-4 a ligand of VCAM-1
  • epithelial cancers such as gastric cancer, colon cancer, lung cancer, liver cancer, and ⁇ cancer adhere to vascular endothelial cells via E-selectin (Takada , A., et al. Cancer Res., 53, 354 (1993)).
  • mitogen is also called a mitogen and refers to a substance that induces cell division. Immunologically, it refers to antigen-specific (polyclonal) lymphocyte blasts that induce lymphocyte division. Examples include lectins such as PHA and PM, concanavalin A (Concanaval in A; ConA), lipopolysaccharide, streptolysin S, and anti-lymphocyte antibody. Concanapalin A and PHA are known to act only on T lymphocytes, lipopolysaccharide acts only on B lymphocytes, and PWM is known to act on both lymphocytes.
  • lymphoblasts is also called large lymphocytes, lymphoblasts or immunoblasts, and refers to lymphoid tissues (lymph node, spleen, thymus, bone marrow, lymph) (Such as ducts and tonsils) and lymphocytes that exist in blood and belong to large lymphocytes.
  • activated lymphocytes means, for example, but not limited to, the following lymphocytes.
  • lymphocytes activated by some kind of stimulus.
  • lymphocytes are classified into T cells, B cells, and natural killer cells, and T cells can be further classified into CD4-positive cells and CD8-positive cells. Therefore, the “activated lymphocytes” of the present invention mainly include activated T cells, activated B cells, and activated natural killer cells, and Activated T cells include activated CD4-positive cells and activated CD8-positive cells.
  • CD4 positive ⁇ cells When CD4 positive ⁇ cells respond to the antigen presented by the antigen-providing cells, they secrete a variety of cytokines, newly express receptors for those cytokines, and the cells themselves grow larger. It begins to divide, proliferate and become activated. Activated CD4-positive ⁇ cells refer to CD4-positive ⁇ cells in such a state.
  • CD8-positive ⁇ cells express IL-2R in response to antigen, differentiate into cytotoxic CTL when acted on by IL-2, and then meet the same antigen peptide / MHC class I complex When they do, they will destroy and kill their target cells.
  • CD8-positive ⁇ cells differentiate into CTL, granules increase in the cytoplasm. These granules contain various macromolecular proteins, of which perforin is a representative. Perforin is similar to AC, composed of components 5-9 of complement, and has the effect of puncturing the cell membrane of target cells. It also contains serine protease II LT and proteoglycan. When differentiated into CTL and stimulated with antigen, they also secrete lymphokines such as IFN, LT, TNF or IL-2.
  • Activated CD8 + T cells refer to CD8 + T cells in such a state.
  • T cells respond to pan-haemagglutinin (plant agglutinin, PHA) ⁇ concanapalin A (Con A) and show a blast formation phenomenon. T cells in such a state are also included in activated T cells.
  • B cells express the B7 molecule, stimulate CD28 on the surface together with the TCR to activate their helper T cells, express CD40L, produce lymphokines, and become larger when stimulated. Changes such as proliferation are observed.
  • Activated B cells refer to B cells in such a state.
  • activated B cells antibody-secreting cells
  • plasma cells l is also included in activated B cells.
  • Activated natural killer cells refer to natural killer cells that have a damaging effect on tumor cells and virus-infected cells as described above.
  • thymocytes stimulated with concanavalin A are also included in the activated lymphocytes.
  • the "lymphoblast” as described above is a lymphoblast activated by stimulation with the "mitogen” such as concanapalin A. Includes sphere.
  • the “gene” in the present invention includes genomic DNA and cDNA.
  • derived from a human refers to a natural substance isolated from a biological component (an organ, a tissue, a cell, a body fluid, or the like) of the human, or a recombinant substance produced using a genetic recombination technique.
  • a biological component an organ, a tissue, a cell, a body fluid, or the like
  • a recombinant substance produced using a genetic recombination technique When the substance is a protein or polypeptide, artificial proteins and polypeptides having an amino acid sequence in which one or several amino acid sequences in those amino acid sequences have been substituted, deleted or added are included. Peptides are included.
  • the “cell surface molecule” of the present invention is a cell surface molecule derived from mammals such as human, rat, mouse, guinea pig and rabbit, and preferably a cell surface molecule derived from human, rat or mouse. And more preferably a human-derived cell surface molecule.
  • the “cell surface molecule” of the present invention is specifically a cell surface molecule having at least the following properties.
  • an antibody reactive with the cell surface molecule induces proliferation of peripheral blood lymphocytes in the presence of an antibody reactive with CD3;
  • (e) It has a partial amino acid sequence represented by Tyr-Met-Phe-Met in the intracellular region.
  • a preferred embodiment is a cell surface molecule composed of the “polypeptide” of the present invention described below.
  • polypeptide of the present invention is a polypeptide constituting the above “cell surface molecule” of the present invention, and specific examples thereof include the following.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence ie, a polypeptide comprising a "human JTT-1 antigen” and its derivative
  • polypeptide having an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of base numbers 35 to 637 of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence ie, “rat A polypeptide constituting the “JTT-1 antigen” and derivatives thereof.
  • the “stringent conditions” include, for example, the following conditions.
  • a guideline for the temperature (Tm) at which 50% of dissociation occurs is obtained from the following formula, and the hybridization is determined.
  • the temperature of the chillon can be set as shown in the following formula.
  • Tm 82.3 ° C + 0.41x (G + C)% —500 / n—0.61X (formamide)%
  • Tm changes as shown in (1) and (2) below.
  • Tm decreases by 0.6 to 0.7 ° C.
  • the temperature conditions in the case of a combination of perfectly complementary strands can be as follows.
  • the temperature condition in the case of a combination of incomplete complementary strands can be as follows.
  • “having substantially the same amino acid sequence” means that the amino acid sequence in the amino acid sequence has substantially the same biological properties as the polypeptide having the amino acid sequence described in the sequence listing.
  • Such amino acid substitutions, deletions, or insertions can be made according to a conventional method (eg, Experimental Medical Supplement “Genetic Engineering Handbook” (1992)).
  • a synthetic oligonucleotide-directed mutagenesis method for example, a synthetic oligonucleotide-directed mutagenesis method (gapped duplex), a method of randomly introducing point mutations by nitrite or sulfurous acid treatment, a method of producing deletion mutants using Bal31 enzyme, etc., a cassette mutation method , Linker scanning method, misincorporation method, mismatch primer method, DNA segment synthesis method, and the like.
  • the synthetic oligonucleotide-directed mutagenesis (gapped duplex) method can be performed, for example, as follows. A region desired to be mutagenized is cloned into an M13 phage vector having an amber mutation to prepare single-stranded phage DNA. RFIDNA of the M13 vector having no amber mutation is linearized by treatment with a restriction enzyme, mixed with the above single-stranded phage DNA, denatured, and annealed to form “gapped duplex DNA”. A synthetic oligonucleotide having a mutation introduced therein is hybridized, and a closed circular double-stranded DNA is obtained by a reaction between DNA polymerase and DNA ligase.
  • This DNA is transfected into an Escherichia coli band tS strain deficient in mismatch modification ability, and the grown phage is infected with Escherichia coli having no sublesser function, and only the phage having no amber mutation Select
  • the method of introducing a point mutation by nitrous acid uses the following principle, for example. Use.
  • DNA is treated with nitrite, the base is deaminated, adenine becomes hypoxanthine, cytosine becomes peracil, and guanine becomes xanthine.
  • hypoxanthine and cytosine form hypoxanthine and adenine and xanthine form a base pair with thymine at the time of DNA replication, so that "A: T" becomes "G: (;” Substitute “G: (:) for“ A: T.
  • the single-stranded DNA fragment treated with nitrite is hybridized to rgapped duplex DNA, and
  • the mutant strain may be isolated by the same operation as in the case of the gapped duplex method, and the three letters or one letter of the alphabet used to denote amino acids in the present specification or the drawings are as follows. Means the amino acid shown.
  • polypeptide constituting the “cell surface molecule” of the present invention described above is a cell transmembrane protein that penetrates a cell membrane, and the “cell surface molecule” is constituted by one or two of the cell membrane penetrating polypeptides. You.
  • transmembrane protein refers to a protein that is linked to the membrane by a hydrophobic peptide domain that penetrates the lipid bilayer once or several times, as found in many receptors and cell membrane surface molecules. It refers to a protein having a structure composed of three main regions: an extracellular region, a transmembrane region, and a cytoplasmic region as a whole.
  • transmembrane proteins can be homodimers, heterodimers, or as monomers, or with another chain having the same amino acid sequence or a chain having a different amino acid sequence, respectively. It forms each receptor and cell surface molecule by being formed as a mouth dimer (or heterodimer) or an oligomer (origomer).
  • polypeptide fragment of the present invention is a polypeptide fragment of the “polypeptide” of the present invention as defined above, and is preferably an extracellular region of the polypeptide.
  • the region may have 1 to 5 amino acids added to its N-terminus and / or C-terminus as desired.
  • extracellular region refers to all or one of the partial structures (partial regions) existing on the outer side of the membrane to which the membrane protein is linked, of the entire structure of the cell membrane transmembrane protein as described above. In other words, all or part of the region other than the region taken up in the membrane (transmembrane region) and the region present in the cytoplasm following the region in the membrane (intracellular region) Means
  • the constant region or part of the constant region of the heavy chain of human immunoglobulin refers to the constant region of the heavy chain (Heavy Chain, H chain) of human immunoglobulin as described above.
  • the immunoglobulin may be of any class and subclass, specifically, IgG (IgGl, IgG2, IgG3 and IgG4), IgM, IgA. (IgA1 and IgA2), IgD and IgE.
  • IgG IgGl, IgG2s IgG3 or IgG4
  • a particularly preferred example in the present invention is an immunoglobulin belonging to human-derived IgG (IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4).
  • Immunoglobulins are composed of four homologous light chains (Light chains, L chains) and two homologous heavy chains (Heavy chains, H chains) linked by disulfide bonds (SS bonds). It has a letter-shaped structural unit.
  • the light chain is composed of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL).
  • Heavy chains are comprised of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH).
  • the heavy chain constant region, class (I gG, I gM, I gA, IgD and I gE) subclasses as well (I gGl, I gG2 s I gG3, I gG4, I gAl and I gA 2) each specific to each It is composed of several domains having an amino acid sequence.
  • the heavy chain of IgG (IgG I IgG2, IgG3 and IgG4) is composed of VH, CHI domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain in order from the N-terminus.
  • the heavy chain of similarly I GGL is this order from N terminus, VH, CYi l domain, hinge area, and a Cy! 2 domain, and C 7 l 3 domain.
  • the heavy chain of I gG2 are in this order from N terminus, VH, C ⁇ 2 1 domain, hinge region, and a C ⁇ 2 2 domain, and C ⁇ 2 3 domain.
  • the heavy chain of IgG3 is this order from N terminus, VH, C ⁇ 3 1 domain, hinge region, Ru consists Cy 3 2 domain, and 3 3 domain.
  • the heavy chain of I GG4 are in this order from N terminus, VH, C ⁇ 4 1 domain, hinge region, and a Cr 4 2 domain, and C ⁇ 4 3 domain.
  • the IgA heavy chain is composed of VH, C1 domain, hinge region, C2 domain and C3 domain in order from the N-terminus.
  • the heavy chain of IgAl is composed of VH, Cc ⁇ l domain, hinge region, Cc2 domain and Cc3 domain in order from the N-terminus.
  • the heavy chain of I GA2 are in this order from N terminus, VH, C monument 2 1 domain, hinge region, and a C monument 2 2 domain, and C monument 2 3 domain.
  • the heavy chain of IgD is composed of VH, C (51 domains, hinge region, 2 domains, and C33 domain in order from the N-terminus.
  • the heavy chain of IgM is composed of, in order from the N-terminus, VH, Cl domain, domain, C ⁇ 3 domain and C4 domain, and does not have a hinge region as found in IgG, 18 and 10. .
  • the heavy chain of IgE is composed of VH, Cell domain, Ce2 domain, Cp3 domain and Cp4 domain in order from the N-terminus, and is composed of IgG, 18 and 1 ⁇ 0. It does not have a hinge region as seen.
  • IgG when IgG is treated with papain, it is cleaved slightly at the N-terminal side of the disulfide bond present in the hinge region connecting the two heavy chains to VH and CH1.
  • a heavy chain fragment and a light chain are linked by a disulfide bond
  • two homologous Fab fragments consisting of a hinge region, CH2 domain, and CH3 domain are linked by a disulfide bond.
  • a part of the constant region of the heavy chain of immunoglobulin in the present invention means a part of the constant region of the heavy chain of immunoglobulin having the structural characteristics as described above, It is a constant region or Fc region lacking one domain.
  • each hinge region a region consisting of a C2 domain and a C3 domain is mentioned, and in the case of IgM or IgE, each C2 Domain, a C3 domain and a C4 domain.
  • Particularly preferred examples include the Fc region of human IgG1.
  • the “fusion polypeptide” of the present invention refers to the extracellular region of the “polypeptide” constituting the “cell surface molecule” of the present invention and “human immunoglobulin (Ig)” as defined above. Or a part of the constant region of the heavy chain of the present invention. " It is preferably a fusion polypeptide of the extracellular region of the polypeptide of the present invention and a part of the constant region of the heavy chain of human IgG, and particularly preferably the extracellular region of the polypeptide of the present invention and human I It is a fusion polypeptide with the region (Fc) consisting of the hinge region, the CH2 domain and the CH3 domain of the heavy chain of gG. Note that IgG is preferably IgGl.
  • the polypeptide of the present invention is preferably a polypeptide derived from human, mouse or rat (preferably human).
  • the fusion polypeptide of the present invention is used for the constant region of immunoglobulin such as IgG as described above. Since a portion of the region (for example, F c) is used as a fusion partner, the fusion can be performed by using affinity-column chromatography using the property of protein A, which specifically binds to the immunoglobulin fragment. It has the advantage that the polypeptide can be purified very easily. Furthermore, since various antibodies against Fc of various immunoglobulins are provided, the immunopolyassay of the fusion polypeptide can be easily performed using an antibody against Fc.
  • immunoglobulin such as IgG as described above. Since a portion of the region (for example, F c) is used as a fusion partner, the fusion can be performed by using affinity-column chromatography using the property of protein A, which specifically binds to the immunoglobulin fragment. It has the advantage that the polypeptide can be purified very easily. Furthermore, since various antibodies against Fc of various immunoglobulin
  • polypeptides, polypeptide fragments and fusion polypeptides of the present invention can be obtained by a known method known in the technical field such as a chemical synthesis method, a cell culture method, or the like, in addition to a genetic recombination technique described later. It can be produced by appropriately using the modification method.
  • the “gene” of the present invention is a gene consisting of DNA encoding the above-described polypeptide or polypeptide fragment of the present invention, and has any nucleotide sequence capable of encoding the polypeptide or polypeptide fragment of the present invention. And genes having the same.
  • a specific embodiment is a gene encoding the following polypeptide or a polypeptide fragment thereof.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence ie, a polypeptide comprising a "human JTT-1 antigen” and its derivative
  • amino acid encoded by the nucleotide sequence of nucleotides 35 to 637 of SEQ ID NO: 4 A polypeptide having an amino acid sequence or an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence (that is, a polypeptide constituting the “rat JTT-1 antigen” and derivatives thereof).
  • More specific embodiments include the following DNAs or fragments thereof.
  • a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and a DNA that hybridizes to the DNA under stringent conditions.
  • a DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 4 and nucleotides 35 to 637.
  • (6) a DNA comprising the nucleotide sequence of any of nucleotides 1 to 603 of SEQ ID NO: 5.
  • a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 from nucleotides 35 to 685.
  • the DNA encoding a part of the constant region of the heavy chain of immunoglobulin, which is a part of the fusion polypeptide in the present invention may be cDNA, It may be a genomic DNA containing an intron between each exon (eg, DNA encoding the CHI domain, hinge region, CH2 domain, CH3 domain, CH4 domain, etc.).
  • DNAs composed of any codons that encode the same amino acid are included.
  • the DNA of the present invention may be obtained by any method.
  • complementary DNA cDNA prepared from mRNA
  • DNA prepared from genomic DNA DNA obtained by chemical synthesis
  • DNAs that are constructed by appropriately combining the above cDNA
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention can be prepared by a method of cloning cDNA from mRNA of the polypeptide of the present invention, a method of isolating and splicing genomic DNA, or a chemical synthesis according to a conventional method. It can be obtained by a method or the like.
  • the following method is exemplified as a method for cloning cDNA from mRNA of the polypeptide of the present invention.
  • mRNA encoding the polypeptide of the present invention is prepared from a tissue or cell that expresses and produces the cell surface molecule (polypeptide) of the present invention (for example, thymocytes or ConA-stimulated spleen-derived lymphoblast cells).
  • mRNA was prepared by a known method such as the guanidine thiosinate method (Chirgwin JM et al, Biochemistry, Vol. 18, p. 5294, 1979), the hot phenol method or the AGPC method. It can be performed by subjecting the total RNA to affinity chromatography using oligo (dT) cellulose or poly-U-Sepharose.
  • the obtained mRNA is used as type ⁇ , and a known method such as, for example, using reverse transcriptase, for example, the method of Okayama et al. (Mol. Cell. Biol., Vol. 2, p. 161, 1982 and the same magazine, Vol. 3, pp. 280, 1983 and the method of Hoffman et al. (Gene, Vol. 25, 263) Page, 1983), and convert cDNA into double-stranded cDNA.
  • a cDNA library is prepared by incorporating this cDNA into a plasmid vector, phage vector or cosmid vector and transforming Escherichia coli or, after in vitro packaging, transfecting Escherichia coli (transfecting). I do.
  • the plasmid vector used here is not particularly limited as long as it can be replicated and maintained in the host, and the phage vector used can be any vector that can be propagated in the host.
  • Examples of commonly used cleaning vectors include pME18S, ⁇ (1ZAPI I), pUC19, et gtlO, and human gtll.
  • the vector be a vector having a promoter capable of expressing the gene encoding the polypeptide of the present invention in the host.
  • Methods for incorporating cDNA into plasmid include, for example, the method of Maniais is et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition); And the method described in Cold Spring Harbor Laboratory, page 1.53, 1989.
  • a method for incorporating cDNA into a phage vector the method of Hyunh et al. (DNA Cloning, a practical approach), Vol. 1, p. 49, p. 85 years).
  • a commercially available cleaning kit for example, Takara Shuzo
  • the recombinant plasmid phage vector thus obtained is introduced into an appropriate host such as a prokaryotic cell (for example, E.c01 ⁇ : XLlBlue MRF ⁇ DH5, HB101 or MC1061 / P3). .
  • a prokaryotic cell for example, E.c01 ⁇ : XLlBlue MRF ⁇ DH5, HB101 or MC1061 / P3
  • Methods for introducing a plasmid into a host include (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition), Cold Spring Harbor, and Laboratory (Cold Spring Harbor). Laboratory), page 1.74, 1989), the calcium chloride method, the calcium chloride / rubidium chloride method, the electro-volatilization method, and the like.
  • Examples of a method for introducing a phage vector into a host include a method in which phage DNA is packaged in an in vitro manner, and then introduced into a grown host. In vitro packaging can be easily performed by using a commercially available in vitro packaging kit (for example, product of Stratra Gene, Amersham, etc.).
  • the method of isolating the cDNA encoding the polypeptide of the present invention from the cDNA library prepared by the above method can be performed by combining general cDNA screening methods.
  • oligonucleotide which is considered to correspond to the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention
  • labeling the oligonucleotide with 32 P to form a probe a known colony hybridization method ( Crunstein et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Nat 1. Acid. Sci. USA), Vol. 72, pp. 3961, 1975) or the plaque hive U.
  • a method for screening a clone containing a cDNA of interest, a PCR primer examples include a method of amplifying a specific region of a peptide by a PCR method and selecting a clone having a DNA fragment encoding the region.
  • a cDNA library prepared using a vector capable of expressing cDNA for example, human ZAPII phage vector 1
  • an antigen-antibody reaction using an antibody reactive with the polypeptide of the present invention may be used.
  • the target clone can be selected using.
  • the nucleotide sequence of DNA obtained in this manner is based on the Maxam-Gilbert method (Maxam Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 74, p. 560, 1977) or a method for terminating dideoxynucleotide synthesis using phage M13 (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 74, Vol. 546
  • the gene encoding the polypeptide of the present invention can be obtained by cutting out all or a part of the clone obtained as described above using a restriction enzyme or the like.
  • the cells are preferably lysed using SDS or proteinase K, and the extraction with phenol is repeated to deproteinize DNA.
  • the RNA is preferably digested with ribonuclease.
  • the obtained DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme, and the obtained DNA fragment is amplified with an appropriate phage or cosmid to prepare a library.
  • a clone having the target sequence is detected by, for example, a method using a radiolabeled DNA probe, and all or a part of the gene encoding the polypeptide of the present invention from the clone is subjected to restriction enzyme or the like. To get the clipping.
  • cDNA encoding human-derived polypeptide In order to obtain cDNA encoding human-derived polypeptide, a cosmid dry slurry into which human genomic DNA (chromosomal DNA) has been introduced is further prepared ("Labor Manual Human Genome Mapping", Maruzen Publishing). By screening a Kosumi Dry Rally, a positive clone containing DNA of the coding region of the target protein is obtained, and the above-mentioned cDNA library is screened using the coding DNA cut out from the positive clone as a probe. Can also be prepared.
  • the DNA of the present invention can be produced by chemical synthesis according to a conventional method based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 4.5 or 6. Further, the present invention encodes the above-mentioned cell surface molecule (polypeptide) of the present invention. It relates to a recombinant vector containing DNA.
  • the recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate and maintain or proliferate in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells, and includes a plasmid vector and a phage vector. Is done.
  • the recombinant vector can be conveniently obtained by ligating a DNA encoding the polypeptide of the present invention to a recombinant vector (plasmid DNA and bacterial phage DNA) available in the art in a conventional manner. Can be prepared.
  • a recombinant vector plasmid DNA and bacterial phage DNA
  • the recombinant vector used include plasmids derived from Escherichia coli, such as pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, and pUC19, and plasmids derived from yeast, such as pSH19 and pSH15, and plasmids derived from Bacillus subtilis.
  • pUB110, pTP5, pC194 and the like are exemplified.
  • the phage include bacterium phage such as human phage, and animal and insect viruses (pVL1393, manufactured by Invitrogen) such as retrovirus, hexini
  • Expression vectors are useful for expressing DNA encoding the polypeptide of the present invention to produce the polypeptide of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it expresses the gene encoding the polypeptide of the present invention in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells and has a function of producing these proteins. Not done. For example, pEFneo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 158-162, 1994), pEF-BOS (Nucleic Acid Research, 18, 5322, 1990), pME18S (Experimental Medicine Supplement “Genetic Engineering Handbook”, 1992) or pMAL C2.
  • the expression vector When a bacterium, particularly Escherichia coli, is used as a host cell, the expression vector generally includes at least a promoter / operator region, an initiation codon, a DNA encoding the polypeptide of the present invention, a stop codon, and an enzyme. It consists of an overnight area and replicable units.
  • the expression vector When using yeast, animal cells or insect cells as hosts, the expression vector is low. It is preferable to contain at least one start codon, a DNA encoding the polypeptide of the present invention, and a stop codon.
  • DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, untranslated regions at the 5 and 3 sides of the gene encoding the polypeptide of the present invention, a splicing junction, a polyadenylation site, and a selection marker It may include an area or a copyable unit. Further, it may contain a gene amplification gene (marker 1) which is usually used for the purpose.
  • the promoter / operator overnight region for expressing the polypeptide of the present invention in bacteria includes a promoter, an operator and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (for example, AAGG).
  • SD Shine-Dalgarno
  • promoters for expressing the polypeptide of the present invention in yeast include PH05 Promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter, and when the host is Bacillus, SL01 Promo One, SP02 Promoter, penP Promo One, and the like.
  • the host is a eukaryotic cell such as a mammalian cell
  • examples thereof include an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a heat shock promoter, and an EF promoter.
  • it is SV-40, SR or retrovirus.
  • the use of enhansa is also an effective method for expression.
  • Suitable initiation codons include methionine codon (ATG).
  • Examples of the stop codon include commonly used stop codons (eg, TAG, TGAs TAA, etc.).
  • evening / mine / night area a commonly used natural or synthetic evening / mine scene can be used.
  • a replicable unit is the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell.
  • Suitable plasmids include the plasmid pBR322 in E. coli or an artificially modified product thereof (a DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme), and the yeast 2 ⁇ plasmid or the yeast in yeast.
  • yeast chromosomal DNA examples include yeast chromosomal DNA, and mammalian cells include plasmids pEFneo, pME18S, pRSVneo ATCC 37198, plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224, and plasmid pSV2neo ATCC 37149.
  • polyadenylation site and splicing junction site those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, for example, can be used.
  • commonly used ones can be used by a conventional method.
  • examples thereof include an antibiotic resistance gene such as tetracycline, neomycin, ambicilin, and kanamycin, and a thymidine kinase gene.
  • Gene amplification genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene, the thymidine kinase gene, the neomycin resistance gene, the glutamate synthase gene, the adenosine deminase gene, the orditin decarboxylase gene, and the human gene. Examples include the glomycin-B-phosphotransferase gene and the aspartate trans-rubamylase gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • thymidine kinase gene the neomycin resistance gene
  • glutamate synthase gene the glutamate synthase gene
  • the adenosine deminase gene the orditin decarboxylase gene
  • human gene examples include the glomycin-B-phosphotransferase gene and the aspartate trans-rubamylase gene.
  • the expression vector of the present invention comprises at least the following promoter, initiation codon, DNA (gene) encoding the polypeptide of the present invention, termination codon, and evening mine—appropriate continuous and circular appropriate replication. It can be prepared by linking to possible units. At this time, if necessary, an appropriate DNA fragment (for example, a linker, another restriction site, etc.) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase.
  • the transformed cell of the present invention is obtained by introducing the above-described expression vector into a host cell. Can be prepared.
  • the host cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is compatible with the above-described expression vector and can be transformed.Natural cells or artificially established cells usually used in the technical field of the present invention are used. And various cells such as recombinant cells (eg, bacteria (genus Escherichia, genus Bacillus), yeasts (genus Saccharomyces, genus Pichia), animal cells or insect cells).
  • recombinant cells eg, bacteria (genus Escherichia, genus Bacillus), yeasts (genus Saccharomyces, genus Pichia), animal cells or insect cells).
  • Escherichia coli or animal cells are preferred. Specifically, Escherichia coli (DH5 cells, XLlBlue MRF ⁇ TB1, HB101, etc.), mouse-derived cells (COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1) Or NI H3 T3, etc.), Rat-derived cells, Hamus Yuichi-derived cells (BHK, CH0-K1, and CHO, etc.), Monkey-derived cells (COS1, COS3, COS7, CV1, and Ve1o, etc.) And human-derived cells (HEK293, Hela, cells derived from diploid fibroblasts, myeloma cells, Namalwa, etc.).
  • Escherichia coli DH5 cells, XLlBlue MRF ⁇ TB1, HB101, etc.
  • mouse-derived cells COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1) Or NI H3 T3, etc.
  • Rat-derived cells Hamus Yuichi-derived cells (BHK,
  • Introduction (transformation (transfection)) of an expression vector into a host cell can be performed by a conventionally known method.
  • insects In the case of cells, for example, by the method of Summers et al. (Mol. Cell. Biol., Vol. 3, pp. 2156-2165, 1983). Zorekatachi You can change the quality.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by culturing a transformed cell containing the expression vector prepared as described above (hereinafter, used to encompass a transfectant) in a nutrient medium. .
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant).
  • carbon sources include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose.
  • inorganic or organic nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn starch, peptone, casein, and the like. Examples include meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • other nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride)
  • vitamins antibiotics (eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.) are included. May be.
  • the culturing is performed by a method known in the art. Culture conditions, for example, temperature, pH of the medium, and culture time are appropriately selected so that the polypeptide of the present invention is produced in large quantities.
  • a liquid medium containing the above-mentioned nutrient is suitable.
  • the medium has a pH of 5 to 8.
  • preferred mediums include LB medium and M9 medium (Miller, et al., Exp. Mol. Genet Cold Spring Harbor Laboratory ⁇ p. 431, 1972). Is exemplified. In such a case, the culture can be carried out usually at 14 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours with aeration and stirring as necessary.
  • the reaction can be carried out usually at 30 to 40 ° C. for about 16 to 96 hours with aeration and stirring as necessary.
  • the medium includes, for example, Burkholder minimum culture (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 4505, 1980), and the pH is 5 to It is desirable to be 8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum (Science, Vol. 122, p.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring can be carried out.
  • the polypeptide of the present invention enables high expression of a target molecule on the cell surface by culturing the above-mentioned transformed cells, particularly animal cells.
  • the transformant when the polypeptide of the present invention is produced as a soluble polypeptide fragment such as an extracellular region fragment, the transformant is transformed as described above using the DNA encoding the extracellular region or each domain. It can be prepared by culturing the exogenous transformant and secreting it into the culture supernatant. Further, the fusion polypeptide of the present invention can be produced in the same manner.
  • a culture filtrate (supernatant) is obtained from the obtained culture by a method such as filtration or centrifugation, and the present invention is subjected to a conventional method generally used for purifying and isolating a natural or synthetic protein from the culture filtrate. Purification of the polypeptide or polypeptide fragment of Isolate.
  • isolation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, and methods using molecular weight differences such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Ion-exchange chromatography a method that uses charge such as hydroxyapatite chromatography, a method that uses specific affinity such as affinity chromatography, and a method that uses differences in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method utilizing isoelectric point difference such as isoelectric focusing.
  • the culture is subjected to a conventional method such as filtration or centrifugation to separate the cells or cells.
  • the cells are collected and suspended in an appropriate buffer, and the cell walls and / or cell membranes of the cells and the like are disrupted by, for example, ultrasonic lysozyme and freeze-thawing, followed by centrifugation or filtration.
  • a membrane fraction containing the peptide is obtained.
  • the membrane fraction is solubilized using a surfactant such as Triton-X100 to obtain a crude solution. Then, the crude solution can be isolated and purified by using a conventional method as exemplified above.
  • the “transgenic mouse” in the present invention is a DNA (cDNA or genomic D) encoding a polypeptide (non-self polypeptide) of an animal species other than the mouse of the present invention, which can be prepared according to the method described above.
  • NA is a transgenic mouse integrated into the endogenous locus of the mouse, and the transgenic mouse expresses and secretes the non-self polypeptide in the body.
  • the transgenic mouse can be prepared by a conventional method commonly used in the production of transgenic animals (for example, the latest manual for animal cell experiments, L. A.I.-Sci., Chapter 7, Chapters 361-1 to 4). (See p. 08, 1990).
  • an embryonic stem cell obtained from a normal mouse blastcyst (blastcyst) can be used, for example, to express a human-derived polypeptide of the present invention (ie, “human JTT- Transformation is carried out using an expression vector into which a gene encoding 1) has been inserted.
  • ES cells in which the gene encoding the human-derived polypeptide of the present invention has been integrated on an endogenous gene are selected by a conventional method.
  • the selected ES cells are microinjected into fertilized eggs (pulmonary blastocysts) obtained from another normal mouse (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, No. 12, pp. 7380-7384). , 1980; U.S. Pat. No. 4,873,191).
  • the blastocyst is transplanted into the uterus of another normal mouse as a foster mother.
  • a founder mouse (child mouse) is born from the foster parent mouse.
  • a heterotransgenic mouse is obtained by crossing the founder mouse with a normal mouse. By crossing the heterogeneic transgenic mice, homogenic transgenic mice can be obtained according to Mendel's law.
  • the “knockout mouse” of the present invention is a mouse in which an endogenous gene encoding a mouse-derived polypeptide of the present invention (that is, “mouse JTT-1 antigen”) has been knocked out (inactivated).
  • Natl. Acad. US Pat. Nos. 5,464,764, 5,487,992, 5,627,059, and Proc. Natl. Acad.). USA, Vol. 86, 8932-89 35, 1989, Nature, Vol. 342, 435-438, 1989).
  • the “antibody” in the present invention means a polyclonal antibody (antiserum) or a monoclonal antibody, and is preferably a monoclonal antibody.
  • the “antibody” of the present invention includes cells expressing the “cell surface molecule” of the present invention (natural cells, cell lines, tumor cells, etc.), polypeptides of the present invention produced using genetic recombination techniques. Or a transformant in which a cell surface molecule is highly expressed on the cell surface, or Using the "polypeptide fragment" or "fusion polypeptide” of the present invention as an antigen, a natural antibody obtained by immunizing a mammal such as a mouse, a rat, a hamster, a guinea pig, or a heron, and a gene recombination technique. Also included are chimeric antibodies and humanized antibodies (CDR-grafted antibodies) that can be produced using such antibodies, and human antibodies that can be produced using transgenic animals that produce human antibodies.
  • CDR-grafted antibodies chimeric antibodies and humanized antibodies
  • a monoclonal antibody having any isotype such as IgG, IgM, IgAsIgD, or IgE is also included. Preferably, it is IgG or IgM.
  • the polyclonal antibody (antiserum) or monoclonal antibody referred to in the present invention can be produced by an existing general production method. That is, for example, a mammal, preferably a mouse, a rat, a hamus, a guinea pig, a penguin, a cat, and the like, as described above, together with Freund's adjuvant if necessary. It immunizes dogs, bushes, goats, peas or peas, more preferably mice, rats, hamsters, guinea pigs or peas.
  • the polyclonal antibody can be obtained from serum obtained from the immunized animal.
  • monoclonal antibodies are prepared by preparing hybridomas from the antibody-producing cells obtained from the immunized animal and myeloma cells (myeloma cells) having no autoantibody-producing ability, cloning the hybridomas, and immunizing mammals. It is produced by selecting a clone that produces a monoclonal antibody exhibiting a specific affinity for the antigen used in step (a).
  • the monoclonal antibody can be specifically produced as follows. That is, the antigen as described above is used as an immunogen, and the immunogen is used together with Freund's adjuvant, if necessary, together with a non-human mammal, specifically, mouse, rat, or hams.
  • a guinea pig or a heron, preferably a mouse, a rat, or a hams (a transgenic animal produced to produce an antibody derived from another animal such as a human antibody-producing transgenic mouse described below). Immunization by subcutaneous, intramuscular, intravenous, intravenous, footpad, or intraperitoneal injections by one or several injections or transplantation.
  • immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 14 days after the first immunization, and antibody producing cells are obtained from the immunized mammal about 1 to 5 days after the final immunization.
  • the number of immunizations and the time interval can be appropriately changed depending on the nature of the immunogen used.
  • the preparation of a hybridoma secreting a monoclonal antibody was carried out according to the method of Keraichi and Mirsch Yuin et al. (Nature, Vol. 256, pp. 495-497, 1979). And a modification method equivalent thereto.
  • antibody-producing cells preferably contained in spleen, lymph node, bone marrow, tonsil, etc., preferably spleen, obtained from a non-human mammal immunized as described above, and preferably mouse, rat, guinea pig, hamus It is prepared by cell fusion with a mammal such as a heron or a human, more preferably a mouse, a rat or a human, which has no ability to produce autoantibodies.
  • a mammal such as a heron or a human, more preferably a mouse, a rat or a human, which has no ability to produce autoantibodies.
  • myeloma cells used for cell fusion include mouse-derived myeloma cells P3 / X63-AG8.653 (653), P3 / NSI / l-Ag4-l (NS-1), P3 / X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2 / 0-Agl4 (Sp2 / 0, Sp2), PAI, FO or BW5147, Rye-derived micelle 210RCY3-Ag.2.3 .
  • Human-derived myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-A2, UC729-6, CEM-AGR D1R11 or CEM-T15 can be used.
  • hybridoma clones producing monoclonal antibodies was performed by culturing hybridomas, for example, in microplates, and immunizing the culture supernatants of the wells in which proliferation had been observed in the immunization described above.
  • the reactivity with the antigen can be determined by, for example, measuring an enzyme immunoassay such as RIA or ELISA.
  • the production of monoclonal antibodies from Hypri-doma is carried out in vitro, or in vivo, for example in mice, rats, guinea pigs, hamsters or egrets, preferably in mice or rats, more preferably in ascites of mice. It can be carried out by isolating from the obtained culture supernatant or ascites of a mammal.
  • hybridomas When culturing in vitro, hybridomas are grown, maintained, and stored according to various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and research, and the culture method, and the monoclonal antibody is produced in the culture supernatant. It can be carried out using any known nutrient medium or any nutrient medium derived and prepared from a known basal medium.
  • Examples of the basic medium include a low calcium medium such as Ham, F12 medium, MCDB 153 medium or low calcium MEM medium and MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI 1640 medium, ASF104 medium.
  • a medium or a high calcium medium such as an RD medium can be used.
  • the basic medium can contain, for example, serum, hormones, site-in, and / or various inorganic or organic substances depending on the purpose.
  • Monoclonal antibodies can be isolated and purified by purifying the culture supernatant or ascites described above with saturated ammonium sulfate, globulin precipitation, forceproic acid, forceprillic acid, ion exchange chromatography (DEAE or DE52). ) And affinity column chromatography such as an anti-immunoglobulin column or a protein A column.
  • Preferred examples of the monoclonal antibody of the present invention include the following monoclonal antibodies.
  • polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 a polypeptide fragment derived from the polypeptide, or a monoclonal reactive with a human-derived cell surface molecule composed of the polypeptide antibody.
  • the effect on mitogen-stimulated lymphoblast cells shows the effect of the monoclonal antibody produced by the hybridoma identified by International Deposit No. FERM BP-5708 on mitogen-stimulated rat lymphoblast cells.
  • the monoclonal antibodies of the present invention also include monoclonal antibodies produced by hybridomas identified by International Accession Nos. FERM BP-5707 and FERM BP-5708, respectively.
  • the “chimeric monoclonal antibody” of the present invention is a monoclonal antibody produced by genetic engineering, and specifically, the variable region thereof is a non-human mammal (mouse, rat, Hamus Yuichi, etc.). It means a chimeric monoclonal antibody such as a mouse / human chimeric monoclonal antibody, which is a variable region derived from munoglobulin and whose constant region is derived from human immunoglobulin.
  • the constant region derived from human immunoglobulin, I g G (IgGl, IgG2 , IgG3 5 IgG4), I g M, I g A, has the amino acid sequence inherent in each isotype such as I g D and I g E,
  • the constant region of the recombinant chimeric monoclonal antibody in the present invention may be a human immunoglobulin constant region belonging to any isotype. Preferably, it is a human IgG constant region.
  • the chimeric monoclonal antibody in the present invention can be produced, for example, as follows. However, it is needless to say that the present invention is not limited to such a manufacturing method.
  • a mouse / human chimeric monoclonal antibody can be prepared with reference to Experimental Medicine (Extra Issue), Vol. 1.6, No. 10, 1988, and Japanese Patent Publication No. 3-73280. That is, an active VH gene (rearranged VDJ gene encoding an H chain variable region) obtained from DNA encoding a mouse monoclonal antibody isolated from a hybridoma producing a mouse monoclonal antibody. Downstream, a CH gene (C gene encoding the H chain constant region) obtained from DNA encoding human immunoglobulin and an active gene obtained from DNA encoding a mouse monoclonal antibody isolated from the hybridoma were used.
  • VL gene rearranged VDJ gene encoding an H chain variable region
  • the CL gene (C gene encoding the L chain constant region) obtained from DNA encoding human immunoglobulin downstream of (the rearranged VJ gene encoding the L chain variable region) can be expressed respectively. And inserted into one or separate expression vectors, transforming host cells with the expression vectors, and culturing the transformed cells.
  • DNA is extracted from a mouse monoclonal antibody-producing hybrid by a conventional method, and the DNA is digested with an appropriate restriction enzyme (eg, EcoRI, HindIII, etc.) and subjected to electrophoresis. (Eg using 0.7% agarose gel) and perform Southern blotting.
  • the electrophoresed gel is stained with, for example, an ethidium die, and after taking a photograph, the marker is positioned and the gel is washed twice with water and immersed in a 0.25M HC1 solution for 15 minutes. Then immerse in 0.4N NaOH solution for 10 minutes while gently shaking. Transfer to Phil Yuichi by the usual method. After 4 hours, collect Phil Yuichi and wash twice with 2XSSC.
  • an appropriate restriction enzyme eg, EcoRI, HindIII, etc.
  • the fill After drying the fill, dry (75 ° C, 3 hours). After completion of the pacing, the fill is put in a 0.1 XS SC / 0.1% SDS solution and treated at 65 ° C for 30 minutes. Then soak in 3xS SC / 0.1% SDS solution. The obtained filter is put in a plastic bag together with the pre-hybridization solution and treated at 65 ° C for 3 to 4 hours.
  • the probe DNA labeled with 32 P and the hybridization solution were added thereto. And react at 65 ° C for about 12 hours. After hybridization, wash the filter under appropriate salt concentration, reaction temperature and time (eg, 2 XSSC-0.1% SDS solution, room temperature, 10 minutes). Place the filter in a plastic bag, add a small amount of 2XSSC, seal, and perform autoradiography.
  • appropriate salt concentration, reaction temperature and time eg, 2 XSSC-0.1% SDS solution, room temperature, 10 minutes.
  • the rearranged VDJ gene and VJ gene encoding the H chain and L chain of the mouse monoclonal antibody, respectively, are identified by the Southern blot method described above.
  • the region containing the identified DNA fragment is fractionated by sucrose density gradient centrifugation, incorporated into a phage vector (eg, Charon 4A, Charon 28, ⁇ L 3 human EMBL4, etc.), and E. coli (eg, , LE392, NM539, etc.) to create a genomic library.
  • a phage vector eg, Charon 4A, Charon 28, ⁇ L 3 human EMBL4, etc.
  • E. coli eg, , LE392, NM539, etc.
  • the genomic library can be used, for example, by the Benton-Davis method (Science, Vol. 196, No. 180- (P.
  • plaque hybridization is performed to obtain positive clones each containing the rearranged VDJ gene or VJ gene.
  • a restriction enzyme map of the obtained clone is prepared, its nucleotide sequence is determined, and it is confirmed that the desired rearranged gene containing the VH (VDJ) gene or VL (VJ) gene has been obtained.
  • the human CH gene and human CL gene used for chimerization are isolated separately.
  • the C1 gene, which is a CH gene, and the C gene, which is a CL gene are isolated.
  • These genes utilize the high homology of the nucleotide sequences of the mouse immunoglobulin gene and the human immunoglobulin gene to probe the mouse Ca1 gene and mouse C gene corresponding to the human ca1 gene and human CAT gene as probes. Can be obtained by isolation from a human genome library.
  • human Ca1 gene is obtained, for example, by cutting human fetal hepatocyte DNA with Hindlll, fractionating by agarose gel electrophoresis, inserting a 5.9 kb band into 788, and using the probe described above. To isolate.
  • a human CH gene is placed downstream of the mouse VH gene while taking into account the promoter region and enhancer region.
  • the human CL gene is placed downstream of the mouse VL gene using an appropriate restriction enzyme and DNA ligase, for example, in an expression vector such as pSV2gpt or pSV2ne0 according to a conventional method. Incorporate.
  • the chimeric gene of mouse VH gene / human CH gene and mouse VL gene / human CL gene may be simultaneously placed in one expression vector, or each may be placed in a separate expression vector. Can also.
  • the chimeric gene insertion and expression vector prepared in this way can be used for protoplast fusion, DE AE-dextran method, and calcium phosphate in myeloma cells that do not produce antibodies themselves, such as P3X63'Ag8'653 cells or SP210 cells. It is introduced by the method or electroporation.
  • the transformed cells are selected by culturing in a drug-containing medium corresponding to the drug resistance gene introduced into the expression vector to obtain the desired chimeric monoclonal antibody-producing cells.
  • the desired chimeric monoclonal antibody is obtained from the culture supernatant of the antibody-producing cells thus selected.
  • the “human monoclonal antibody (CDR-grafted antibody)” in the present invention is A monoclonal antibody produced by an elementary engineering method. Specifically, part or all of the complementarity-determining region of the hypervariable region is a non-human mammal (mouse, rat, Hamichi, etc.) Is the complementarity determining region of the hypervariable region derived from the monoclonal antibody described above, the framework region of the variable region is the framework region of the variable region derived from human immunoglobulin, and the constant region is the constant region derived from human immunoglobulin. Means a humanized monoclonal antibody.
  • the complementarity-determining regions of the hypervariable region are three regions that are present in the hypervariable region in the variable region of the antibody and that directly bind to the antigen in a complementary manner (Complementarity-determining residue; CDRU CDR2, CDR 3), and the framework region of the variable region refers to four relatively conserved regions (Framework; FR1, FR2, FR3, FR4) intervening before and after the three complementarity determining regions. .
  • it means a monoclonal antibody in which all but a part or all of the complementarity determining region of the hypervariable region of a monoclonal antibody derived from a non-human mammal has been replaced by the corresponding region of human immunoglobulin.
  • the constant region derived from human immunoglobulin has a unique amino acid sequence depending on isotypes such as IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD and IgE.
  • the constant region of the monoclonal antibody may be a human immunoglobulin constant region belonging to any isotype. Preferably, it is the constant region of human IgG.
  • the framework region of the variable region derived from human immunoglobulin is not limited.
  • the humanized monoclonal antibody in the present invention can be produced, for example, as follows. However, it is needless to say that the present invention is not limited to such a manufacturing method.
  • a recombinant humanized monoclonal antibody derived from a mouse monoclonal antibody can be produced by genetic engineering with reference to Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-506458 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-296890. That is, mouse monoclonal Isolating at least one mouse H chain CDR gene and at least one mouse L chain CDR gene corresponding to the mouse H chain CDR gene from the hybridoma producing the body; A human H chain gene encoding the entire region other than the corresponding human H chain CDR and a human L chain gene encoding the entire region other than the human L chain CDR corresponding to the pre-mouse L chain CDR are isolated.
  • the isolated mouse H chain CDR gene and human H chain gene are introduced into an appropriate expression vector so that they can be expressed, and the mouse L chain CDR gene and the human L chain gene can be expressed similarly.
  • the mouse H chain CDR gene / human H chain gene and the mouse L chain CDR gene / human L chain gene can be introduced into the same expression vector so that they can be expressed.
  • human monoclonal antibody in the present invention means that all regions including the variable region of the H chain and the constant region of the H chain, and the variable region of the L chain and the constant region of the L chain that constitute immunoglobulin are human immunoglobulins. Is an immunoglobulin derived from the gene encoding
  • Human antibodies can be obtained by immunizing a transgenic animal produced by integrating at least a human immunoglobulin gene into a locus of a non-human mammal such as a mouse with an antigen according to a conventional method. It can be produced in the same manner as in the method for producing a polyclonal antibody or a monoclonal antibody described above.
  • transgenic mice that produce human antibodies are described in Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Gazette; JP-T-Hei 7-509137 Gazette; Nikkei Science, June, No. 40-No. 50, 1990, International Application Publication WO94 / 25585, Nature, Vol. 368, p. 856-859, 1994; and Tokuhyo 6-50023 It can be produced according to the method described in Japanese Patent Publication No. 3 (JP-A) No. 3 and the like.
  • part of an antibody in the present invention means a region corresponding to a part of the monoclonal antibody as described above, and specifically, F (ab,) 2 , Fab ′, Fab, Fv (variable fragmentant). of antibody), sFv, dsFv (disulphide stabilised Fv) or dAb (single domain antibody) etc.
  • F (ab,) 2 Fab ′, Fab, Fv (variable fragmentant). of antibody
  • sFv, dsFv disulphide stabilised Fv
  • dAb single domain antibody
  • F (ab ′) 2 ” and “Fab,” are produced by treating an immunoglobulin (monoclonal antibody) with pepsin or papain, which is a protease, in the hinge region.
  • pepsin or papain which is a protease
  • IgG is treated with papain, it is cleaved upstream of the disulfide bond existing between the two heavy chains in the hinge region and consists of VL (light chain variable region) and CL (light chain constant region).
  • composition refers to the “polypeptide i, “Homodimer molecule”, “polypeptide fragment” or “fusion polypeptide” composed of the polypeptide, “homodimer molecule”, “antibody” or “part of antibody” composed of the fusion polypeptide And a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, coloring agents, sweeteners, thickeners. And flavoring agents, solubilizing agents or other additives.
  • tablets, pills, powders, granules, injections, liquids, capsules, troches, elixirs, suspensions, emulsions or syrups can be used.
  • a composition can be prepared.
  • These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.
  • Other forms for parenteral administration include topical solutions containing one or more active substances, formulated in a conventional manner, suppositories and bessaries for enteral administration.
  • the dosage varies depending on the age, sex, weight and condition of the patient, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of active ingredient (such as the polypeptide or antibody) contained in the pharmaceutical composition.
  • the dose can range from 10 g to 100 mg (or 10 g to 500 mg) per dose per adult. However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be necessary.
  • 0.1 ⁇ antibody / 111 1 carrier to 1 O mg antibody / ml carrier in a non-toxic pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection. It can be produced by dissolving or suspending to a concentration of 2.
  • the injections thus produced can be administered to human patients in need of treatment at a rate of 1 g to 100 mg / kg body weight per dose, preferably 50 mg / kg. It can be administered once to several times a day at a rate of 55 O mg.
  • the form of administration may be intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection or Can be exemplified by medically appropriate administration forms such as intraperitoneal injection. Preferably, it is an intravenous injection.
  • Injectables may also be prepared as non-aqueous diluents (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.), suspensions and emulsions. Can also.
  • non-aqueous diluents eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.
  • injections can be sterilized by sterile filtration through a bacterial retention filter, blended with a bactericide, or irradiated.
  • Injectables can be manufactured in the form of ready-to-use preparations. That is, it can be used as a sterile solid composition by freeze-drying or the like, dissolved in sterile distilled water for injection or another solvent before use.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is applicable to the treatment and prevention of various autoimmune diseases, allergic diseases or inflammatory diseases caused by activation of lymphocytes such as T cells and abnormal control of activated lymphocyte functions. Is possible.
  • the diseases include rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, autoimmune thyroiditis, allergic contact dermatitis, lichen planus, a chronic inflammatory skin disease, systemic lupus erythematosus, insulin-dependent diabetes mellitus and psoriasis And the like.
  • the therapeutic effect of the pharmaceutical composition of the present invention for various disease symptoms can be tested and examined by administering to a known disease model animal according to a conventional method.
  • a model of human systemic lupus erythematosus (SLE) (NZB / NZW) F1 mouse (Science, Vol. 125, p. 1225-1227, 1994)
  • MS multiple sclerosis
  • EAE allergic encephalomyelitis
  • 3 NOD non-o bese
  • IDM insulin-dependent diabetes mellitus
  • FIG. 1 is a micrograph showing the state of cell aggregation of FTL435 cells induced by “JTT.l antibody” and the state of inhibition of the cell aggregation by “JTT.2 antibody”.
  • the diagram (a) shows the state of cells without adding any hybridoma supernatant
  • the diagram (b) shows the state of cell aggregation by the “JTT-1 antibody”
  • the diagram (c) shows The figure shows the state of cell aggregation when “anti-ICAM-1 antibody” was added together with “JTT-1 antibody”.
  • the figure (d) shows the results when “JTT-2 antibody” was added together with “JTT-1 antibody”. The state of cell aggregation is shown.
  • FIG. 2 is a micrograph showing the state of cell aggregation of FTL435 cells and rat activated lymphoblasts induced by “JTT.l antibody” and the state of inhibition of the cell aggregation by “JTT.2 antibody”. .
  • (A) shows the state of the FTL435 cells without any antibody
  • (b) shows the state of the FTL435 cells with PMA
  • (c) shows the state of the cells.
  • the state of FTL435 cells when "JTT-1 antibody” was added is shown.
  • the diagram (d) shows the state of FTL435 cells when "anti-LFA-1 antibody” was added together with "JTT-1 antibody”.
  • (E) shows the state of FTL435 cells when the anti-CD18 antibody was added together with the “JTT-1 antibody”
  • (f) shows the anti-ICAM-1 antibody together with the “JTT-1 antibody”.
  • the FTL435 cells show the condition of the cells when the antibody was added.
  • the fraction (g) shows the condition of the activated lymphoblasts without any antibody, and the fraction (h) shows the PMA.
  • the cell status of activated lymphoblasts when added is shown.
  • Separate figure (i) shows the cell status of activated lymphoblasts when JTT-1 antibody was added.
  • (J) shows the state of activated lymphoblasts when the anti-LFA-1 antibody was added together with the "JTT-1 antibody”, and (k) shows the state with the "JTT-1 antibody”.
  • the cell status of activated lymphoblasts when anti-CD18 antibody was added is shown.
  • the diagram (1) shows activated lymphoblasts when anti-ICAM-1 antibody was added together with "JTT-1 antibody”.
  • 3 shows the state of the cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the state of expression of “JTT.l antigen” and “JTT.2 antigen” in various cells measured using a flow cytometer.
  • FIG. 4 is a view showing the state of expression of “JTT.l antigen” in various lymphoid cells measured using a flow cytometer.
  • FIG. 5 is a photograph showing an electrophoretic image of “JTT.l antigen” analyzed by electrophoresis on SDS-PAGE.
  • Fig. 6 shows the state of adhesion of rat thymocytes to the microplate coated with purified "JTT.l antigen” induced in the presence of "JTT.l antibody”, and the cell adhesion by "JTT.2 antibody”.
  • 4 is a photomicrograph showing the state of inhibition of the present invention.
  • Diagram (a) shows the state of cell adhesion to a plate not coated with "JTT-1 antigen", and diagram (b) shows "JTT-1 antigen” without any antibody added.
  • the state of adhesion of cells to the plate coated with “JTT-1 antigen” is shown in Fig. 3 (c) when the Fab fragment of “JTT-1 antibody” was added.
  • the cell adhesion state is shown, and the diagram (d) shows the plate on which the “JTT-1 antigen” was added when the “JTT-2 antibody” was added together with the “JTT-1 antibody” Fab fragment.
  • 3 shows the state of cell adhesion.
  • FIG. 7 is a diagram showing relative cell numbers based on the fluorescence intensity of thymocytes adhered to a plate coated with purified “JTT.l antigen”.
  • a (-) indicates the relative cell count on a plate not coated with “JTT-1 antigen”
  • Ag (+) + JTT.l Fab indicates the JTT-1 antigen when Fab fragment of JTT-1 antibody was added.
  • the relative cell counts on the plate are shown, and “Ag (+) + JTT.l Fab + JTT.2” indicates the case where “JTT-2 antibody” was added together with the “JTT-1 antibody” Fab fragment.
  • the relative cell number in the plate coated with “JTT-1 antigen” is shown.
  • FIG. 8 shows the code for “rat JTT-1 antigen” measured using flow cytometry.
  • FIG. 2 is a view showing the expression states of “rat JTT-1 antigen” and “rat JTT-2 antigen” in COS cells transformed with the cDNA to be transformed.
  • FIG. 9 is a diagram showing the structural characteristics of the amino acid sequence of “JTT.l antigen” as determined by hydropathic blot analysis.
  • FIG. 10 is a diagram showing the homology of the amino acid sequences of human, rat, and mouse “JTT.l antigen” and “rat JTT-1 antigen” mutants.
  • FIG. 11 is a diagram showing the amino acid sequence homology in the amino acid sequences of “human JTT-1 antigen”, “human CD28 molecule” and “human CTLA-4 molecule” and the conservation of motifs.
  • FIG. 12 is a diagram schematically showing the protein secondary structures of “human JTT-1 antigen”, “human CD28 molecule” and “human CTLA-4 molecule” and their similarities.
  • FIG. 13 is a diagram schematically showing the structure of genomic DNA encoding “mouse JTT-1 antigen”.
  • FIG. 14 is a diagram showing the differences in the amino acid sequences of “rat JTT-1 antigen” and its all-naturally-splicing variants.
  • FIG. 15 is a graph showing the degree of proliferation of human peripheral blood lymphocytes induced by a monoclonal antibody against “human JTT-1 antigen” measured by a [ 3 H] thymidine incorporation test.
  • the vertical axis indicates the incorporation amount (dpm) of [ 3 H] thymidine into cells.
  • FIG. 16 shows the therapeutic effect of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in a disease model rat using a monoclonal antibody against “JTT-1 antigen”.
  • the vertical axis shows the degree of scoring disease symptoms, and the horizontal axis shows the number of days elapsed after immunization immunization for EAE induction.
  • FIG. 17 is a view showing the therapeutic effect of a monoclonal antibody against “JTT-1 antigen” on glomerulonephritis in a disease model rat.
  • the vertical axis shows urinary protein excretion, and the horizontal axis shows the value after immunization for inducing glomerulonephritis. Indicates the elapsed time (week) of.
  • FIG. 18 is a diagram showing a column histogram in the purification of a fusion polypeptide (rJTT-; 1-IgFc) between the extracellular region of “Rat JTT-1 antigen” and human IgFc using a protein A sepharose column. .
  • FIG. 19 is a photograph showing an electrophoresis image of rJTT-1-IgFc analyzed by electrophoresis by SDS-PAGE.
  • FIG. 20 is a diagram showing a column histogram in the purification of a fusion polypeptide of the extracellular region of “human JTT-1 antigen” and human IgFc (hJTT-1-IgFc) using a protein A sepharose column.
  • FIG. 21 is a photograph showing an electrophoretic image of hJTT-1-IgFc analyzed by electrophoresis by SDS-PAGE.
  • FIG. 22 is a diagram schematically showing the structure of a gene transfer vector for producing a transgenic mouse into which cDNA encoding “rat JTT-1 antigen” has been introduced.
  • the antibody-producing hybridomas described below were prepared with reference to the method of Kohler et al. (Bloods Vol. 81, pp. 101-111, 1993, Omori et al.). The method was carried out with reference to the method of Kanagi et al. (Handbook of Experimental I cafe unology, Vol. 4, 117.2, p. 117.21, 1986).
  • rat thymoma cell line FTL435 cells were used as an immunizing antigen, and the antigen was administered to BALB / c mice at intervals of 0 days (10 7 cells / animal), 7 days, 14 days and 28 days. A photo pad was administered. Only the first immunization was performed by mixing the antigen with Freund's complete adjuvant. Two days after the last immunization, the lymph nodes of the mouse were collected, By fusion with mouse myeoma cell line PAI (JCR NO.B0113; Res. Disclosure, Vol. 217, p. 155, 1982, Stocker, JW et al.) By conventional methods, a large number of monoclonal antibody-producing hybridomas were obtained. Was.
  • PAI mouse myeoma cell line PAI
  • Hybridomas were screened by analyzing the effect of the monoclonal antibodies produced in the culture supernatants of the various hybridomas and hybridomas prepared in Example 1 on FTL435 cells, which are immunogens.
  • FTL435 cells which are immunogens.
  • (A 5 x l0 6 cell / ml 0. 1ml) 96 -well microtiter FT L435 cells per Ueru the evening first plate seeded with the culture supernatant of each High Priestess dormer the (their respective 10 ⁇ G / ml)
  • the cells were cultured at 37 ° C for 1 hour.
  • Figures 1 and 2 show the results for the hybridoma "JTT-1" and the clone "JTT-2".
  • the monoclonal antibody (JTT-1 antibody j) produced by the hybridoma clone "JTT-1" was confirmed to have the effect of strongly aggregating FTL435 cells (Fig. L (b) and Fig. 2 (c On the other hand, it was confirmed that the addition of "JTT-2 antibody” together with "JTT-1 antibody” strongly suppressed aggregation of FTL435 cells induced by "JTT.1 antibody” stimulation (Fig. 1 (d )). In addition, a system to which neither hybridoma supernatant was added was used as a control (FIGS. 1 (a) and 2 (a)).
  • ICAM-1 Intercellular adhesion molecule-1
  • LFA-1 Lymphocyte function-associated antigen-1
  • activated lymphoblasts Similar to the effect on FTL435 cells, aggregation of activated lymphoblast cells was induced by stimulation with "JTT-1 antibody" (FIG. 2 (i)). However, for activated lymphoblast cells, most of the cell aggregation induced by “JTT-1 antibody” was stimulated by anti-LFA-1 antibody (Fig. 2 (j)) and anti-ICAM-1 antibody (Fig. 2 (1 )) (However, partial aggregation remained). As can be seen from the control system without any antibody (Fig. 2 (g)), activated lymphocytes such as activated lymphoblasts activate PMA (Phorbol myri state acetate: LFA-1). No aggregation by cell adhesion occurs unless it is stimulated by (Fig.
  • JTT-1 and JTT-2 are international depositary organizations that have been accredited under the Budapest Treaty on October 11, 1996. No. 3 was deposited internationally at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry of Japan ([JTT-1]: International Deposit Number FERM BP-5707, [JTT-2]: International Deposit Number FERM BP-5708 ) o
  • JTT-1 antibody and JTT-2 antibody are both determined to be IgGl.
  • mice Five to ten week old wisdom rats (150 to 250 g) were anesthetized and killed with a jetilether. The abdomen was opened by a surgical operation, and the thymus and spleen were excised from the chest and abdomen, respectively, and ground to prepare a cell suspension. Furthermore, activated lymphoblasts were prepared by culturing the spleen cells in RPMI 1640 medium containing concanapalin A (2 zg / ml) and 10% FCS at 37 ° C for 3 days.
  • FTL435 cells thymocytes, spleen cells and activated lymphoblasts ( 5 ⁇ 10 5 cells each) were reacted with “JT T.1 antibody” or “JTT.2 antibody”, followed by FITC-labeled anti-mouse IgG (Cappe 1). After the reaction, the fluorescence intensity of the stained cells was measured using an EPICS-Elite flow cytometer.
  • JTT-1 antigen recognized by “JTT.l antibody” in various lymphoid cells
  • the lymphocytes of two types of rats were analyzed.
  • the reactivity of the “JTT-1 antibody” to the nodal, spleen-derived T lymphoblasts, and spleen-derived B lymphoblasts was analyzed.
  • Wistar rats and F344 rats (150 to 250 g) at the age of 5 to 10 weeks were killed by anesthesia with Jetil ether.
  • Each rat was surgically laparotomized to remove lymph nodes and spleen, and ground to prepare a cell suspension.
  • the spleen cell preparation was incubated at 37 ° C in RPMI1640 medium containing Concanapalin A (ConA; 2 zg / ml) and 10% FCS. Cultured for days.
  • activated T lymphoblasts and activated B lymphoblasts were obtained after culturing for 1 day and after culturing for 3 days.
  • spleen-derived T lymphoblasts and B lymphoblasts obtained before adding lymph node cells and ConA (day 0) were used.
  • each cell (5 ⁇ 10 5 cells) with a biotin-labeled anti-rat T cell antibody or a biotin-labeled anti-rat B cell antibody (10 ig / ml, manufactured by Seikagaku Corporation), Reacted with labeled streptavidin. Then, the cells were reacted with FITC-labeled “JTT-1 antibody” (10 ⁇ g / ml), and the fluorescence intensity of the stained cells was measured using an EPICS-Elite flow cytometer.
  • Fig. 4 shows the results.
  • strong expression of “JTT.l antigen” was observed in activated T lymphoblasts and activated B lymphoblasts from day 1 of activation due to ConA ⁇ intense.
  • the expression pattern of “JTT.l antigen” in each cell type was almost the same.
  • the cells After washing the FTL435 cells with PBS, the cells are suspended in 0.1 M glucose-containing saline (PH8.0) containing 100 ⁇ g / ml NHS-Piotin to a concentration of lx10 7 cells / ml, and incubated at room temperature. The reaction was performed for 40 minutes. After washing the cells three times with PBS, add a solubilization buffer (l% NP-40, lOmMTris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCl) to a concentration of 5 x 10 7 cells / ml. C, reacted for 30 minutes to lyse the cells. The obtained cell lysate was centrifuged, and the centrifuged supernatant containing the biotinylated soluble cell surface molecule was stored at -80 ° C.
  • PH8.0 glucose-containing saline
  • solubilization buffer l% NP-40, lOmMTris-HCl (pH 7.4)
  • the purified sample of the purified “JTT.l antibody” was mixed with protein G-Sepharose beads at 2 mg / ml and reacted at 4 ° C for 1 hour to bind the antibody to the beads.
  • the beads were washed, 500 1 of biotinylated FTL435 cell lysate was added to 10 1 of the beads, and the mixture was reacted at 4 ° C for 2 hours.
  • the beads are washed three times with the solubilization buffer, and 50 ⁇ 1 of a glycanase buffer (a sodium phosphate buffer containing 0.15% SDS (pH 7.0)) is added and the mixture is boiled.
  • a glycanase buffer a sodium phosphate buffer containing 0.15% SDS (pH 7.0)
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE sample buffer (Enprotech)
  • Enprotech SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • eluted sample 51 in the presence or absence of 2-mercaptoethanol and boil.
  • PVDF membrane After blocking the transfer membrane with 3% BSA-PBS, and then reacting with peroxidase-labeled streptavidin, use E (System (Amersham)) as described in the instruction manual.
  • FIG. 5 shows the results.
  • the molecule (“JTT-1 antigen”) on FTL435 cells recognized by “JTT.l antibody” has a molecular weight of approximately 47 kD under non-reducing conditions (indicated by “(-)” in Fig. 5). It had a molecular weight of about 24 kD and about 28 kD under reduction (indicated by “” ”in FIG. 5).
  • N-type sugar chains indicated by “+ N-gly” in FIG. 5
  • JTT.l antigen converged to a single band of about 36 kD under non-reducing and about 20 kD under reducing. From the above results, it was presumed that “JTT.l antigen” has a different sugar chain modification and a core protein forms a dimer consisting of the same molecule. In addition, in the test performed in the same manner as described above using the “JTT.2 antibody”, exactly the same results were obtained. Considering this result and the results of Example 3 and Example 7 described later, “JTT.l antigen” (a molecule recognized by “JTT-1 antibody”) and “JTT.2 antigen” (“JTT-2 Molecules recognized by the “antibody” were considered to be identical molecules.
  • JTT.l antibody (“JTT-1 antigen”) has a function as an adhesion molecule.
  • N-terminal amino acid analysis was performed by TT.
  • FTL435 cells were cultured using RPMI1640 medium containing 10 FCS. The cells were collected by centrifugation, and the pellet was washed three times with PBS. Solubilization buffer-(l% NP-40, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCl) is added to the washed pellet at 5 x 10 7 cells / ml, and the mixture is added at 4 ° C for 30 minutes. The reaction was performed to lyse the cells. The obtained cell lysate was centrifuged, and the centrifuged supernatant containing soluble cell surface molecules was stored at -80 ° C.
  • the purified "JTT.l antigen" obtained in (2) was coated on a 96-well ELISA plate at 10 / l / well by 1 ⁇ . After washing the plate with PBS, 200 ⁇ l / well of PBS containing 3% BSA was added and blocking was performed for 2 hours. After playing Bok washing with PBS, each Ueru to 1 fluorescent-labeled thymocytes alone (2 x l0 7 cells / ml with O.
  • the fluorescence intensity at a wavelength of 538 nm was measured using a Fluoroscan II microplate Fluorome—Evening (manufactured by Flow Laboratories) to determine the fluorescence-labeled thymocytes bound to each well. The relative cell number was counted. A system not coated with purified “JTT-1 antigen” was used as a control.
  • Fig. 6 shows the results of optical microscope observation.
  • Thymocytes significantly adhered to the purified "JTT.l antigen” only in the presence of the Fab fragment of "JTT.l antibody” (Fig. 6 (c)). The adhesion was significantly inhibited by the “JTT.2 antibody” (FIG. 6 (d)).
  • FIG. 7 shows the result of measuring the relative cell number of thymocytes adhered to “JTT.l antigen” coated on each cell by fluorescence intensity. From the above results, it was confirmed that “JTT.l antigen” has a function as an adhesion molecule.
  • Con A-stimulated rat spleen-derived lymphoblasts (Con A blast) (approximately 1 x 10 6 cells / m 1) were centrifuged at 4 ° C for 5 minutes (2,000 xg), and the precipitated cells were washed with IS0GEN (Nipoponji). The suspension was extracted with a black-mouthed form, and the supernatant was recovered. After isopropanol was added to the obtained supernatant and allowed to stand at room temperature for 10 minutes, the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes at 12,000 ⁇ g to precipitate MA. The precipitated RNA was washed with ethanol and then dissolved in TE buffer. From the obtained total RNA, poly (A) + RNA was purified using “mRNA Purification Kit” (Pharmacia).
  • cDNA was synthesized using “Time Saver cDNA Synthesis Kitj (Pharmacia). To improve screening efficiency,“ oligo dT primer with Not I cleavage site ” (Pharmacia) was used. Next, EcoRI was added to the adapter and digested with Notl to obtain cDNA with unidirectionality. C The size was fractionated using a span column (Pharmacia).
  • the obtained cDNA having EcoR I and Not I ends was ligated to EcoR I and Not I treated vector-PME18S (Hara, T. and Miyajima, A. EMBOJ., 11, 1875-1884, 1992).
  • "DNA ligation Kitj manufactured by Takara Shuzo
  • E. coli DH5 manufactured by Toyobo
  • the OD value of the transformant 600 ⁇ m was used. After culturing until the value reached 0.6, plasmids were collected and the plasmid DNA containing the library 1 was recovered using a QUIAGEN-Tip (manufactured by QUIAGEN).
  • the obtained library was transfected into C0S7 cells by the electroporation method (Potter, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2288-2292).
  • the cells were cultured for 60 hours after the introduction, the supernatant was removed, and the cells were washed three times with PBS. Next, the cells were treated with PBS (0.5 mM EDTA) (37C, 30 minutes), and then the cells were detached by pipetting. Further, only live cells were collected using "Lymphprep" (manufactured by NYC0MED).
  • the obtained living cells were suspended in PBS (5% FCS, 0.5 mM EDTA).
  • the cell suspension was transferred to a culture dish coated with “JTT.1 antibody” and allowed to act at room temperature for 3 hours. Remove unbound cells from the culture dish, wash the culture dish three times with PBS, and recover plasmid DNA from cells bound to the culture dish by the Hirt method (Hirt, BJMol. Biol., 26.365-369). did.
  • E. coli DH10B (GIEBC0 BRL) was transformed using the obtained plasmid DNA. Plasmid DNA was amplified and purified using the transformant in the same manner as in the above (3). Using the obtained DNA, the operations described in (1) and (2) above were further repeated twice.
  • the transformed E. coli DH10B was cultured overnight on an LB plate containing ampicillin to obtain colonies. Cultivate 20 drug-resistant colonies and collect and insert plasmid MA by alkaline miniprep method (Maniatis, T. et al. Molecular Cloning; A Larolatory Mnual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) The inserted DNA (insert DNA) was analyzed. As a result of agarose gel electrophoresis, it was revealed that clones having a cDNA of about 0.9 kb (hereinafter, this clone is referred to as “T132A7”) were enriched.
  • T132A7 was once again transiently expressed in C0S7 cells.
  • the cells transfected with “T132A7” are reacted with “JTT.l antibody” or “JTT.2 antibody”.
  • JTT.l antibody or “JTT.2 antibody”.
  • FITC-labeled anti-mouse IgG manufactured by Cappel
  • the fluorescence intensity of the stained cells was measured using an EPICS-Elite flow cytometer (manufactured by Coulter).
  • “JT T.1 antibody” and “JTT.2 antibody” strongly recognized the “T132A7” gene product.
  • Figure 8 shows the results.
  • the nucleotide sequence of clone "T132A7” was determined by the dideoxy method using "Auto Read Sequencing Kit” (Pharmacia) and "ALFDNA sequencer ⁇ (Pharmacia).
  • the deduced amino acid sequence of “rat JTT.1 antigen” was analyzed using the gene analysis software “GENEWORKS” (manufactured by IntelliGenetics).
  • the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence (consisting of 200 amino acid residues) deduced from the cloned gene contains the same amino acid sequence as the N-terminal amino acid sequence determined in Example 6- (3).
  • the amino acid sequence (consisting of 200 amino acid residues) deduced from the cloned gene contains the same amino acid sequence as the N-terminal amino acid sequence determined in Example 6- (3).
  • JTT.l antigen The primary structure of the deduced amino acid sequence of “JTT.l antigen” was analyzed by hydropathy 'broth according to the method of Kite and Doolittle (Kite, J. & Doolittle, RFJ Mol. Biol. 157, 105-132, 1982). (Fig. 9). As a result, it was revealed that “JTT.l antigen” is a cell transmembrane protein having a signal sequence at the N-terminus. As a result of motif analysis, the extracellular domain of “JTT.l antigen” has two asparagine-linked sugar chain binding sites in the extracellular domain, and the intracellular domain has two It was clarified that it had a protein kinase C phosphorylation site at the force site. In FIG.
  • the clone "T132A7” obtained in Example 7 was digested with restriction enzymes EcoM and Notl, and about 0.9 kb of cDNA encoding "rat JTT.1 antigen” was cut out and separated by agarose gel electrophoresis.
  • the separated DNA fragment was purified using the "QUIAEX gel extraction kit” (quia TEN KK), and the resulting DNA fragments using "Ready-To- Go DNA labelling ki t" (Pharmacia Co., Ltd.) 3 2 Labeled with P. This labeled DNA fragment was used as a probe for black hybridization.
  • poly (A) + A was extracted from lymphocytes (ConA blast) derived from human peripheral blood stimulated with ConA.
  • the obtained cDNA having an EcoRI end was ligated to a vector treated with EcoRI— “ZAPII” (manufactured by Stratagene).
  • DNA ligation Kitj Teakara Shuzo
  • GIGA PACKII GOLDj (Strategene) "
  • E. coli XLlBlue MRF (Strategene) as a host, a cDNA library consisting of plaques containing recombinant phage was prepared.
  • the base sequences of the seven clones were analyzed by the dideoxy method using “Auto Read Sequencing”.
  • nucleotide sequence of the cDNA corresponding to the open reading frame (ORF) of “human JTT-1 antigen” is shown in SEQ ID NO: 1
  • the predicted full-length amino acid sequence of “human JTT.1 antigen” is shown in SEQ ID NO: 2
  • the nucleotide sequence containing the 5 'and 3' sequences is shown in SEQ ID NO: 3 (0RF is nucleotides 26 to 625).
  • nucleotide sequence contained in the clone encodes the full length of "human JTT-1 antigen” means that the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence (consisting of 199 amino acid residues) This is evident from the fact that it shows significant homology with the amino acid sequence of rat JTT.1 antigen j (Fig. 10). As shown in Fig. 10, The amino acid sequence homology of “JTT.l antigen” is S 0% or more.
  • E.coU.DHlOB (GIBCO BRL) transformed with the clone “pBSh41” was transferred to Tsukuba, Japan, an international depositary institution accredited under the Budapest Treaty on October 25, 1996. ⁇ East 1-3-1, No. 3 Deposited at the surgical institute (Deposit No .: FEM BP-5725).
  • the “JTT-1 antigen” of the present invention has the same structure as that of “CD28” and “CTLA-4”, which play an important role in controlling the activation of T cells, which is the main role of such an immune response. Because of its structure, the "JTT-1 antigen” of the present invention plays an important role in controlling the activation of lymphocytes such as T cells, which are the main components of the immune reaction, as well as those molecules. Presumed to be a molecule
  • the clone "T132A7” obtained in Example 7 was digested with restriction enzymes EcoRI and Notl, and about 0.9 kb of cDNA encoding "rat JTT.1 antigen” was cut out and separated by agarose gel electrophoresis.
  • the separated DNA fragment was purified using the "QUIAEX gel extraction kit” (quia TEN KK), and the resulting DM fragments using "Ready- To-Go DNA labelling ki tj (Pharmacia Co.) 3 2 P The labeled DNA fragment was used as a probe for plaque hybridization. 2.
  • cDNA was synthesized using oligo dT primer (Pharmacia) and "Time Saver cDNA Synthesis Kitj (Pharmacia)". After adding an EcoRI adapter, size fractionation was performed using a span column (Pharmacia).
  • the cDNA having the EcoRI end obtained as described above was ligated to EcoRI-treated vector 1ZAPI I (Stratagene).
  • the "DNA ligation Kit” (Takara Shuzo) was used for the ligation reaction.
  • the obtained phage particles are used to contain a recombinant phage using E coli XLlBlue MRF '(manufactured by Stra tagene) as a host.
  • a cDNA library consisting of plaques was prepared.
  • the screening was carried out according to the plastic hybridization method (Maniatis, T. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) using Rapid hybridization buffer (manufactured by Amersham).
  • cDNA libraries (1 ⁇ 10 4 ) was seeded on an agar plate, and a replica was prepared using Hybnd-N nylon menbrane (Amersham). Using 3 2 P-labeled probe prepared by replica ⁇ beauty the 9-1 were plaque hybrida I Ze one Chillon in Rapid hybridization buffer (A mersham Co.). Primary screening and secondary screening were performed to obtain 5 positive clones. Each black After isolation of the clone with a single plaque, the clone was subjected to in vivo excision according to the Stratagene Instruction Manual, and 5 clones were recovered as plasmid DNA.
  • the nucleotide sequence of each of the five clones was determined by the dideoxy method using the "Auto II ead Sequencing Kit” (Pharmacia) and the Factory A.L.F. thigh sequencerj (Pharmacia). Four of the five clones contained the same nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of cDNA encoding the full length of “mouse JTT-1 antigen” are shown in SEQ ID NO: 5.
  • mouse JTT-1 antigen is composed of 200 amino acid residues in the same manner as “rat JTT-1 antigen”. "-1 antigen” had significant amino acid sequence homology (over 60%) between each. 5. Analysis of chromosomal location of mouse JTT-1 antigen gene
  • the location of the gene encoding “mouse JTT-1 antigen” on the chromosome was analyzed by a fluorescence in situ hybridization method.
  • FIG. 13 schematically shows the structure of the genomic DNA.
  • the genomic DNA clone obtained above was labeled with digoxigenin dUTP by nick translation to obtain a probe. After the labeled probe was ligated with the fragmented mouse DNA, it was hybridized to a normal metaphase chromosome derived from mouse embryonic fibroblasts in a solution containing 50% formaldehyde, dextran sulfate 10 and 2 ⁇ SSC. I let it. The specific hybridization signal was detected by incubating the hybridization slide in a fluorescently labeled anti-digoxigenin antibody and then staining with DAPI. First trial In the experiment, specific labeling was performed in the vicinity of the largest chromosome, probably chromosome 1, based on the size of the DNA and the appearance of the band.
  • the genomic MA clone was co-hybridized with a probe specific to the centromere region of chromosome 1.
  • the centromere region of chromosome 1 and its neighboring regions were specifically labeled.
  • the genomic DNA clone was found to be 3 distances from the boundary between heterochromatin and euchromatin to the telomere of chromosome 1. It was revealed that the gene was located in the same band "1C3" as the 3% position, that is, the position on the chromosome of the mouse "CD28" and "CTLA-4" genes.
  • specific labeling was confirmed at this position in 79 cells.
  • the clone “T132A7” obtained in Example 7 was digested with restriction enzymes EcoM and Notl, and about 0.9 kb of cDNA encoding “rat JTT.1 antigen” was cut out and separated by agarose gel electrophoresis.
  • the separated DM fragment was purified using the "QUIAEX gel extraction kit” (quia TEN KK), and the resulting DNA fragments using "Ready-To-Go DNA labelling ki t " (Pharmacia Co., Ltd.) 3 2 Labeled with P. Plaque this labeled DNA fragment It was used as a probe for pre-digestion.
  • poly (A) + RM was extracted from a rat thymoma cell line FTL435 (about 1 ⁇ 10 6 cells / ml).
  • cDNA was synthesized using oligo dT primer (Pharmacia) and "Time Saver cDNA Synthesis Kitj (Pharmacia). After adding an EcoRI adapter to the sample, size fractionation was performed using a span column (Pharmacia).
  • the cDNA having the EcoRI end obtained as described above was ligated to EcoRI-treated vector -IZAPI I (Stratagene).
  • EcoRI-treated vector -IZAPI I (Stratagene).
  • a DM Ligation Kitj (Takara Shuzo) was used.
  • the obtained phage particles are used to construct a plaque containing recombinant phage using E coli XLlBlue MRF '(manufactured by Stratagene) as a host.
  • the cDNA library ( 4 lx lO) prepared as described above was spread on an agar plate, and a replica was prepared using Hybnd-N nylon menbrane (Amersham). Using 3 2 P-labeled probe prepared by the replica and the 10-1 were plaque hybrida I Ze one Chillon in Rapid hybridization buffer (Amersham Co.). Primary screen And positive screening were performed to obtain two positive clones. After each clone was isolated with a single plaque, it was subjected to in vivo excision according to the Stratagene Instruction Manual, and two clones were recovered as plasmid DNA.
  • the nucleotide sequence of each of the two clones was determined by the dideoxy method using the “Auto Read Sequencing Kitj (Pharmacia) 3 ⁇ 4t ALFDNA sequencer (Pharmacia). All the two clones had the same base.
  • the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the cDNA encoding the full length of the obtained “Latt JTT-1 antigen” are shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) deduced from the obtained cDNA sequence was replaced with the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) deduced from the cDNA sequence encoding the “rat JTT-1 antigen” cloned in Example 7. (Fig. 14).
  • the amino acid sequence encoded by the cDNA cloned in this test encodes the "lat JTT.1 antigen" obtained in Example 7.
  • the amino acid sequence encoded by the cDNA (1) the three consecutive amino acid sequences at the C-terminus (Met-Thr-Ser) are changed to Thr-Ala-Pro, and (2) the Thr-Ala-Pro Pro is followed by an additional 16 consecutive amino acid residues (Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Glu-His-Ser-Ser-Cys-Gln-Asp-Arg-Asn)
  • the amino acid sequences were identical except for the two differences. Therefore, it is considered that the cDNA cloned in the present test encodes an 'alternative splicing valiant' of 'rat JTT.1 antigen' obtained in Example 7. .
  • the plasmid clone pBSh41 obtained in Example 8 was digested with a restriction enzyme EcoRI to cut out a DNA fragment containing cDNA encoding the full length of “human JTT-1 antigen”.
  • Plasmid KpEFneo Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 158-162, 199 treated with the DNA fragment was also treated with the restriction enzyme EcoRI using a DNA ligase kit (Takara Shuzo).
  • the expression vector was prepared by inserting it into 4). The vector was used to transform CH0-K1 cells (ATCC: CCL-61) by electroporation.
  • Geneticin-resistant transformed cells were selected by culturing the cells for about 2 weeks in HPMI1640 medium containing Geneticin (0.8 mg / ml; manufactured by GIBCO BRL) and 10% fetal calf serum. c Expression of the recombinant "human JTT-1 Fanbara" was confirmed by Northern blotting using a conventional method.
  • Example 12 Preparation of monoclonal antibody against "human JTT.1 antigen"
  • the transformed cells expressing the recombinant "human JTT-1 antigen” prepared in Example 11 were homogenized and ultracentrifuged. (100,000 xg), and the centrifugation residue containing the cell membrane fraction was collected and suspended in PBS.
  • the obtained cell membrane fraction was initially immunized (day 0) by injecting it into the footpad of a BALB / c mouse together with complete Freund's adjuvant. Further, the cell membrane fraction antigen was administered into the footpad at intervals of 7 days, 14 days and 28 days. Two days after the last immunization, lymph node cells were collected.
  • lymph node cells and mouse myeloma cells PAI JCR NO. B0113; Res. Disclosure, Vol. 217, P. 155, 1982
  • polyethylene glycol 4000 manufactured by GIBC0
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma was prepared by cell fusion.
  • Hybridomas were selected by culturing in ASF104 medium (Ajinomoto) containing HAT containing 10% fetal bovine serum and aminopterin.
  • the reactivity of the monoclonal antibody produced in the culture supernatant of each hybridoma against "human JTT-1 antigen” was determined by using the recombinant "human JTT-1 antigen" prepared in Example 11 for each culture supernatant. After the reaction with the transformed cells expressing the expression, the fluorescence intensity of the cells stained by reacting with FITC-labeled anti-mouse IgG (Cappel) was measured by EPICS-ELIT E Flow Satome overnight. did. As a result, it was confirmed that 10 or more types of hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with “human JTT-1 antigen” were obtained.
  • Each of two of these hybridomas (designated clones SA12 and SG430, respectively) S a (1 0 6 to 1 0 7 /0.5ml/ mice) were injected intraperitoneally into ICR nu / nu mice (female, 7 to 8 weeks of age). Ten to twenty days later, the mice were laparotomized under anesthesia, and large amounts of two types of monoclonal antibodies (SA12 and SG430) reactive with “human JTT-1 antigen” were prepared from ascites fluid collected in a conventional manner.
  • JTT-1 antigen is considered to have a possibility of being involved in controlling the activation of lymphocyte cells in an immune reaction, like "CD28” and "CTLA-4".
  • an immune reaction like "CD28” and "CTLA-4”.
  • monoclonal antibodies against "human JTT-1 antigen” on human lymphocytes was analyzed using cell proliferation as an index.
  • lymphocytes When treated with either monoclonal antibody SA12 or SG430 alone, lymphocytes grew approximately 10-fold with either antibody compared to controls. In addition, when used in combination with 0KT3, either monoclonal antibody SA12 or SG430 was used. In some cases, lymphocytes grew about 100-fold.
  • JTT-1 antigen functions in controlling lymphocyte activation.
  • the cell proliferation rate was amplified in combination with 0KT3, indicating that "JTT-1 antigen” is responsible for the same costimulatory signal transmission as “CD28” and "CTLA-4". It is.
  • autoimmune diseases rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, autoimmune thyroid, etc.
  • signaling between CD28 / CTLA-4-CD80 / CD86.
  • Many attempts have been made to treat inflammation, allergic contact dermatitis, chronic inflammatory skin diseases such as lichen planus, systemic lupus erythematosus, insulin-dependent diabetes mellitus and psoriasis.
  • JTT-1 antigen of the present invention is a molecule involved in activating or suppressing lymphocytes such as “CD28” and “CTLA-4”, multiple sclerosis
  • EAE allergic encephalomyelitis
  • MS monoclonal antibody against “JTT-1 antigen” in the model was analyzed.
  • Hartley guinea pig cerebral spinal cord homogenate (800 mg / ml saline) was mixed with an equal volume of complete complete adjuvant to prepare an emulsion as an immunizing antigen.
  • the emulsion was immunized intradermally by injecting 0.25 ml each of the left and right toes of Lewis Rat (female, 6 weeks old, 15 animals). The administration was performed such that the dose of the homogenate was 200 mg per rat. This immunization can induce allergic encephalomyelitis (EAE).
  • the immunized rats were divided into 3 groups of 5 rats, and for each group, one of the following (1) to (3) was determined immediately after immunization (day 0) and 3 times from the immunization. Administered intravenously on the 6th, 9th and 12th days.
  • JTT-1 antigen is a molecule that functions in inducing immune responses including activation of lymphocytes induced by immunization with a foreign antigen.
  • a glomerular basement membrane (GBM) nephritis model rat was prepared, and the effect of a monoclonal antibody against “JTT-1 antigen” in the model was analyzed.
  • Immunized rats were divided into 8 groups of 6 rats, and for each group, one of the following (1) to (3) was used immediately after immunization (0) and then 3 times a week for 5 weeks It was administered over a period of time.
  • JTT-2 antibody against “rat JTT-1 antigen” prepared in Example 2 (dose: 3 mg / kg (2 ml PBS / kg), intravenous administration);
  • JTT-1 antigen is a molecule that functions in the induction of immune responses including activation of lymphocytes induced by immunization with a foreign antigen.
  • Example 16 Preparation of fusion protein of "JTT-1 antigen” and Ig Fc As described in Examples 8, 13 to 15, the "JTT-1 antigen” of the present invention is a costimulatory cell involved in controlling the activation of lymphocytes such as "CD28" and "CTLA-4".
  • a fusion protein consisting of the extracellular domain of “CTLA-4” and the Fc region of human immunoglobulin IgG1 (CTLA-4-IgFc) is useful for the treatment of various autoimmune diseases. It is reported to be effective.
  • CTLA-4-IgFc human immunoglobulin IgG1
  • the extracellular region of the ⁇ JTT-1 antigen '' was identified as human IgGFc to confirm the applicability of solubilized JTT-1 antigen similar to CTLA-4-IgFc to the treatment of various autoimmune diseases. was prepared as follows.
  • a cDNA encoding the full length of "rat JTT-1 antigen” was cloned using the primer "T132A7” as a ⁇ type, and PCR was carried out using the primer, with both Xhol and BamHI cleavage sites at both ends.
  • a cDNA containing a cDNA encoding the extracellular region of "rat JTT-1 antigen” was prepared.
  • the obtained PCR product was digested with Xhol and BamHI, and subjected to agarose gel electrophoresis, to isolate a cDNA fragment encoding the extracellular region of interest and a band having a size of about 450 bp, which is expected.
  • the isolated cDNA fragment was subcloned into a plasmid pBluescript I SK (+) (Stratagene) digested with Xhol and BamHI.
  • the cDNA fragment contained a region encoding the region from amino acid numbers 1 to 141 of “Rat JTT-1 antigen” (SEQ ID NO: 4).
  • DNA encoding Fc of human IgGl as a fusion partner is plasmid
  • the plasmid was digested with Xhol and Xbal to cut out a DNA fragment of about 1.8 kb containing a fusion DNA consisting of the extracellular region of “Rat JTT-1 antigen” and human IgFc.
  • T4 DNA ligase this fused DNA fragment was expressed in an expression vector pME18S (Medical Immunology, Vol. 20, No. l, p. 27-32, 1990, and Experimental Medicine (separate volume): Genetic Engineering Handbook ", Youtosha, p. 107, p. 107, 1992) inserted into the Xhol and Xbal sites, and the plasmid prJTT- ;! -IgFc was constructed.
  • HEK293 cells (ATCC CRL1573) monolayer cultured in subconfluent in DMEM medium containing 10% fetal calf serum and ambicilin by the electroporation method were transformed with Brasmid prJTT-1-IgFc. Transformed cells were obtained.
  • the transformed cells were cultured for 72 hours in serum-free ASF104 medium to express rJTT-1-IgFc.
  • rJTT-1-IgFc was purified using a Protein G Sepharose affinity column (Pharmacia) as follows.
  • the centrifuged supernatant obtained by centrifuging the culture supernatant was added to a Protein G Sepharose affinity column which had been equilibrated with a binding buffer in advance. Next, the column was washed with a binding buffer and then eluted with an elution buffer. The eluate was collected and dialyzed by exchanging the external solution with a phosphate buffer at least twice to obtain purified rJTT-1-IgFc.
  • the cDNA encoding the full length of the “rat JTT-1 antigen” obtained in Example 7 was expressed in pCAGGS (Gene, Vol. 108, p. 193) containing the chicken / actin promoter. -200, 1991) using a DNA end blunting kit (Yukara Co., Ltd.) to obtain plasmid prJTT-1.
  • prJTT-1 was treated with restriction enzymes to make it linear.
  • a plug obtained by crossing a white ICR mouse (female, Nippon SLC) and a vaccinated white ICR mouse (male, Nippon SLC) was used.
  • Female ICR mice were used.
  • mice for egg collection to obtain fertilized eggs for introducing the “rat JTT-1 antigen” gene were PEAMEX (5 units, manufactured by Sankyo Zoiki) and Pregnyl (5 units, manufactured by Organon).
  • BDF-1 mice female, manufactured by Nippon S.L.I.
  • BDF-1 mice female, manufactured by Nippon S.L.I.
  • BDF-1 mice male, manufactured by Nippon S.L.I.
  • BDF-1 mice male, manufactured by Nippon S.L.I.
  • the oviduct was excised from BDF-1 mouse (female), and only fertilized eggs were obtained by treatment with hyaluronidase and stored in the medium.
  • the introduction of the “rat JTT-1 antigen” gene into fertilized eggs is performed using a manipulator under a microscope. Was performed according to a conventional method.
  • the fertilized egg was fixed with a retaining needle, and a solution containing the linear gene encoding the ⁇ rat JTT-1 antigen '', diluted with Tris EDTA buffer at 37 ° C under a condition of 37 ° C, was injected using a DNA introduction needle.
  • the fertilized eggs were injected (microinjection) into the male pronucleus.
  • rat JTT-1 antigen The tail of a child mouse (founder) born from the foster parent was cut off and the genomic gene was recovered. PCR confirmed that the “rat JTT-1 antigen” gene had been introduced into the mouse genome. Then, it can be fabricated homomice by crossing of c the hetero mice each other to prepare a terrorist trans diethyl nick mice to high expression of "rat JTT-1 antigen" Ri by the thereby mating a Fuaunda first and normal mice .
  • Figure 22 shows a schematic diagram of the microinjected construct containing the “rat JTT-1 antigen” gene.
  • a Pstl-Hindlll fragment obtained by digesting a mouse genomic DNA clone containing a region encoding "mouse JTT-1 antigen" cloned in Examples 9-5 with Pstl and HindII It was subcloned into plasmid pGEM-3 (promega). Next, pGEM-3 is opened with Xhol, and the neomycin resistance gene (“neo”) cut out by treating plasmid pMC neo-polyA (manufactured by Stratagene) with Xhol and Sail is placed upstream of the “homologous DNA1”. Inserted and connected.
  • neo neomycin resistance gene
  • the mouse genomic DNA clone was digested with Xhol and Notl to cut out a gene of about 5.5 kb (“homologous DNA2”) located upstream from the above “homologous DNA1”.
  • pGEM-3 into which "neo-homologous DNA II” was inserted was digested with Xhol and Hindi II to cut out "neo-homologous DNA II”.
  • the obtained “homologous DNA2” and “neo-homologous DNA1” were subcloned into a plasmid pSEAP2-C0NT (Clontech) opened with Notl and Hindlll.
  • the obtained plasmid (having “homologous DNA2—neo—homologous DNA1” inserted) is digested and opened with Nrul downstream of “homologous DNA1”, and then plasmid pMC-TK (manufactured by Stratagene) ) was digested with PvuI I, and the thymidine kinase gene ("TK") was inserted downstream of "homologous DNA II” and ligated. Is inserted).
  • ES cells were seeded maintenance medium in the (10 cm), (containing G418 (250 ⁇ G / ml) and cancer Shikurobiru) selective medium medium was replaced. Thereafter, the medium was exchanged every two days and cultured. Evening—On day 10 after introduction of the targeting vector, 573 neomycin-resistant ES cell clones were obtained under a microscope using a microbit. The obtained ES cell clones were separately cultured in a 24-well plate on which Feeder cells were spread, thereby obtaining 768 replicas of neomycin-resistant ES cells.
  • the PCR includes (1) a primer designed and synthesized based on the sequence of the neomycin resistance gene (“neo") (5'-CGTGATATTGCTGMGAGCTTGGCGGCGMTGGGC-3, SEQ ID NO: 11)) and the "homologous DNA"
  • neo neomycin resistance gene
  • the PCR consists of one cycle of a reaction of 3 minutes at 94 ° C, 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 3 minutes and 30 seconds at 72 ° C. After one cycle of the reaction for 30 minutes at 72 and at 10 minutes at 72, the mixture was stored at 4 ° C.
  • a fragment of about 4 kb is amplified by this PCR, it is considered that the ES cell clone has disrupted (knocked out) the endogenous gene encoding “mouse JTT-1 antigen” by homologous recombination. I can judge.
  • the desired PCR product was obtained in 3 clones.
  • Genomic southern blotting was performed on these three clones, and further selected and confirmed.
  • the genomic DNA of the three clones was extracted, digested with a restriction enzyme BaiiiHI, and then electrophoresed on an agarose gel. This was transferred to a nylon membrane, and hybridization was performed using a probe prepared based on the genomic DNA sequence of “mouse JTT-1”.
  • the probe was designed based on the sequence outside the site where the homologous recombination occurs, so that the size of the mutant genome can be distinguished from that of the normal genome.
  • the endogenous gene encoding the “mouse JTT-1 antigen” obtained above was homologously recombined.
  • the inactivated (knock-out) ES cells were injected (microinjection) into blastocysts obtained by mating male and female C57BL6 mice (Charles River Japan) at a rate of 15 cells per embryo.
  • C57BL6 mice Male and female C57BL6 mice (Charles River Japan)
  • Immediately after the injection about 10 blastocysts per side of the uterus were implanted into the uterus of a foster parent ICR mouse (CLEA Japan) 2.5 days after the pseudopregnancy treatment.
  • CLMA Japan foster parent ICR mouse
  • the obtained chimeric mouse was bred with a normal C57BL6 mouse to obtain an agouti-colored mouse derived from a hair color gene derived from ES cells.
  • JTT-1 antigen The novel cell surface molecule (referred to as "JTT-1 antigen") derived from mammals such as human, mouse and rat provided by the present invention has the following characteristics.
  • CD28 which is a cell surface molecule of lymphocytes such as T cells that transmit costimulatory signals important for T cell activation through cell-cell adhesion, and activated T in conjunction with the signal It has the following similarities to “CTLA-4” which is a cell surface molecule of lymphocytes such as T cells that control the function of activated lymphocytes such as cells.
  • JTT-1 antigen is used for thymocytes, lymphoblasts and thymoma cells stimulated with mitogens such as ConA. Has the ability to mediate cell-cell adhesion.
  • lymphoblast cells activated T lymphoblasts and activated B lymphoblasts stimulated with mitogens such as ConA, peripheral blood lymphocytes and thymoma cells.
  • Antibodies directed against the “JTT-1 antigen” significantly proliferate human peripheral blood lymphocytes, and the proliferation is caused by the first signal from antigen-presenting cells essential for T cell activation. Higher proliferation is induced by the coexistence of a monoclonal antibody against CD3, which constitutes the TcR / CD3 complex on the receiving T cells.
  • the “JTT-1 antigen” of the present invention like the aforementioned “CD28” and “CTLA-4”, comprises a second signal (costimulatory) essential for activation of lymphocytes such as T cells. It is thought to be a molecule that transmits a tree signal) and controls the function of activated lymphocytes such as activated T cells in conjunction with the signal.
  • the polypeptide, polypeptide fragment, fusion polypeptide and antibody of the present invention that constitute such a cell surface molecule may cause abnormal activation of lymphocytes such as T cells and control of the functions of activated lymphocytes.
  • lymphocytes such as T cells
  • Various autoimmune diseases, allergic diseases or inflammatory diseases, specifically rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, self-immune thyroiditis, allergic contact dermatitis, chronic inflammatory skin diseases Treatment or prognosis of lichen planus, systemic lupus erythematosus, insulin-dependent diabetes mellitus and psoriasis It is possible to provide a drug that is extremely useful for prevention.
  • the gene encoding the polypeptide or the polypeptide fragment of the present invention not only enables gene therapy for the various diseases, but also can provide an antisense drug.
  • human monoclonal antibodies and pharmaceutical compositions thereof are the major problems (side effects) in the therapeutic use of antibody drugs composed of antibodies derived from non-human mammals such as mouse-derived antibodies. Since it has no antigenicity at all, it dramatically increases its value as a pharmaceutical product.
  • the gene (DNA), polypeptide, polypeptide fragment and antibody of the present invention are not only useful as pharmaceuticals, but also search for molecules (ligands) that interact with the cell surface molecule of the present invention, and the function of the ligand.
  • the present invention is useful as a reagent for elucidating the above and for developing a therapeutic agent targeting the ligand.
  • the transgenic mouse of the present invention is useful not only as a model animal for elucidating the physiological function of the cell surface molecule of the present invention, “JTT-1 antigen”, but also as a “JTT-1 antigen”. It is extremely useful as a tool for screening various drugs (such as low-molecular-weight compounds, antibodies, antisense, and polypeptides) that have the activity of controlling (inhibiting, suppressing, activating, stimulating, etc.) That is, such a test substance is administered to the transgenic mouse, and the physiological, biological or pharmacological parameters occurring in the living body of the mouse are measured and analyzed. It is possible to evaluate the activity of the test substance.
  • drugs such as low-molecular-weight compounds, antibodies, antisense, and polypeptides
  • the knockout mouse of the present invention is characterized by analyzing the characteristics of the mouse from various aspects (physiological, biological, pharmacological, pathological, genetic, etc.). It is possible to elucidate the function of surface molecules. Sequence listing
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 450 Phe Trp Leu Pro lie Gly Cys Ala Ala Phe
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Origin of other nucleic acids (cDNA containing 3 'and 5' terminal base sequence)
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Origin of other nucleic acids (cDNA containing 3 'and 5' terminal base sequence)
  • Organism name rat
  • TTCCCCTGA TTAAAATGTTAGCGGAC GGGACAT GAACTA CCCCCCGAGG
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name mouse
  • TCT TGT AAA TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 150 Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val Gin Gin
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Origin of other nucleic acids (cDNA containing 3 'and 5' terminal base sequence)
  • Organism name rat
  • AAA AAG TCC AGA CTT GCA GGT ACA GCA CCC 634 Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Thr Ala Pro
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)

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Description

細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
技術分野
本発明は、 哺乳動物の新規な細胞表面分子、 該分子を構成するポリペプチド及 びその断片、 該ポリぺプチド断片と免疫グロプリン断片からなる融合ポリぺプチ ド、 該ポリペプチド及び該断片をコードする遺伝子、 該遺伝子を含むベクター、 該ベクタ一が導入された形質転換体、 該ポリぺプチド若しくは該ポリぺプチドに より構成される細胞表面分子反応性を有する抗体、 該抗体を産生するハイプリ ド —マ、 該ポリぺプチド断片若しくは該融合ポリぺプチドを含んでなる医薬組成物、 該抗体を含有してなる医薬組成物、 トランスジエニックマウス、 並びにノックァ ゥトマウスに関する。 背景技術
哺乳動物の生体は、 体内に侵入した病原微生物 （ウィルス、 細菌、 寄生虫な ど） や外来異物など （以下、 併せて 「抗原」 と呼ぶ。 ) を排除しょうとする免疫 応答システムを有する。 その 1つは、 自然免疫応答システムと呼ばれ、 他の 1つ は獲得免疫応答システムと呼ばれるものである。 前者は、 食細胞 （多形核白血球、 単球、 マクロファ一ジなど） による貪食、 ナチュラルキラ一 （N K ) 細胞による 攻撃、 及び補体による抗原のォプソ二ン化などのような非特異的な認識による排 除機構である。 後者の獲得免疫応答システムは、 該抗原に対する特異性を獲得 (活性化） したリンパ球 （主に T細胞、 B細胞） による排除機構である。 抗原特 異性を獲得した B細胞は、 該抗原に特異的な抗体を産生することにより細胞外に 存在する該抗原を攻撃する。 抗原特異性を獲得 （活性化） した T細胞は、 ヘルパ 一 T細胞と細胞傷害性 T細胞 （cytotoxic T cell ; cytotoxic lymphocyte ; CT L) に分類され、 前者は B細胞の分化や抗体の産生を調節するとともに食細胞と協 同して該抗原を破壊する。 後者は、 自らウィルス感染細胞などを攻撃する （実験 医学 （別冊） · 「Bio Science用語ライブラリ一 [免疫] 」 、 羊土社、 p.14-17、 1995) 。
この T細胞による抗原特異性の獲得 （活性化） は、 T細胞が、 マクロファージ、 B細胞あるいは樹状細胞などの抗原提示細胞 （antigen- presenting cel ls: APC) により提示される抗原を認識することにより開始される。 抗原提示細胞は、 取り 込んだ抗原をプロセッシング （加工） し、 この加工された抗原を主要組織適合性 抗原複合体 （MHC) に結合させて抗原提示する。 T細胞は、 抗原提示細胞により提 示された該加工抗原を、 その細胞膜表面に有する T細胞受容体 （TcR) と C D 3抗 原との複合体 （TcR/CD3複合体） を通じて認識することで細胞の活性化 （特異性の 獲得） のための第 1のシグナルを受ける。
しかしながら、 この TcR/CD3複合体を介した第 1シグナルだけでは、 T細胞の十 分な活性化が起こらないだけでなく、 その後に受ける如何なる刺激に対しても反 応しなくなる不応答状態 （unresponsiveness) またはクローン麻痺 （clonal ane rgy) と呼ばれる状態に陥る。 T細胞が活性化され抗原特異的な T細胞クローンに 分化、 増殖するためにはインターロイキン一 2 ( IL-2) の自己分泌 （ォ一トクリ ン； autocrine) が必要であるが、 クロ一ン麻痺の状態では IL-2が産生及び細胞分 裂が起こらず、 T細胞が不活性化された状態となる。 即ち、 IL- 2などのサイ ト力 ィンの産生を伴う T細胞の活性化には、 TcR/CD3複合体を介した第 1シグナルに引 き続く第 2のシグナルを必要とする。 この第 2のシグナルはコスティミュレイ ト リ一シグナル (副刺激シグナル； costimulatory signal) と呼ばれる。
T細胞は、 T細胞表面上の TcR/CD3複合体とは別の分子を介して抗原提示細胞上 の MHCとは別の分子と相互作用 （細胞間接着） することによりこの第 2のシグナル を受けとり細胞内に伝達する。 この第 2のシグナルにより細胞のァナジ一 （クロ ーン麻痺） が回避されるとともに細胞が活性化される。
抗原提示細胞と T細胞等のリンパ球の間の第 2のシグナルの伝達のメカニズム については未だ詳細に解明されていない部分はあるものの、 これまでの研究から、 この第 2のシグナル伝達には、 主に T細胞及び胸腺細胞で発現する細胞表面分子 である CD28 (別名 ： Tp44、 Τ44、 又は 9.3抗原） と抗原提示細胞 （マクロファージ、 単球、 樹状細胞など） で発現する細胞表面分子である CD80 (別名： B7-l、 Β7、 ΒΒ 1、 または B7/BB1 ) 及び同じく抗原提示細胞状の細胞表面分子である CD86 (別名 ： Β7-2または Β70) との間の相互作用 （即ち、 それらの分子間の結合を介した細胞間 接着） が極めて重要であることが明らかにされている。 さらにこの第 2のシグナ ルによる Τ細胞の活性化の制御には、 該第 2のシグナルに依存してその発現が増 強されると考えられている CTLA-4 (Cytolytic T lymphocyte associated antige n 4) と該 CD80(B7-1 )及び CD86(B7- 2 )との間の相互作用 （即ち、 それらの分子間の 結合を介した細胞間接着） も重要な役割を担っていることが実験的に明らかにさ れてきている。 即ち、 この第 2のシグナルの伝達による T細胞の活性化の制御に は、 少なくとも CD28と CD80/CD86との間の相互作用、 該相互作用に依存すると考え られる CTLA-4の発現の増強、 並びに CTLA- 4と CD80/CD86との間の相互作用が包含さ れることが明らかにされてきている。
CD28は、 この T細胞の活性化とァナジ一の回避に必要な第 2のシグナル （コス ティミュレィ トリー ' シグナル） を伝達するコスティミュレイタ一分子であるこ とが明らかにされている。 この分子が抗原提示細胞上のコスティミュレイタ一分 子である CD80(B7- 1 )及び CD86( B7- 2 )と結合すること （換言すれば、 それらの分子 間の結合を介した細胞間接着） により伝達される第 2のシグナルは、 Thl型サイ ト 力インの mRNAを安定化させ、 その結果 T細胞からの IL- 2、 IFN y及び TNFひなどの Thl型サイ トカインを大量の産生を促す。 一方、 CTLA- 4は、 TcR/CD3を通じて入る 第 1シグナルにより発現が誘導されるとともに、 CD28と CD80との結合により入る 該第 2のシグナルによってもその発現が増強されることが知られている。 CTLA - 4 は、 それらのシグナルを受けて、 CD28より入る第 2ののシグナルによる T細胞の 活性化とは反対に T細胞機能に対して抑制的に働くことが明らかになってきてい る
ヒ卜の CD28及び CTLA-4は、 各々 44kD及び 41乃至 43kDの分子量を有する I型糖蛋 白質である。 ともに免疫グロブリン様ドメイン 1個を有し、 免疫グロプリンス一 パーフアミリーに属し、 細胞間接着分子としての機能と細胞内へのシグナル伝達 分子としての両方の機能を併せ持った分子である。
ヒト CD28はジズルフィ ド結合によりホモ二量体を形成し、 一方、 CTLA- 4は単量 体で存在することが示されている。 CD28及び CTLA- 4の遺伝子の染色体上に位置は、 ヒトにおいてはいずれも 「2 q 3 3」 、 またマウスにおいては 「 1 C」 であり、 いずれも 4つのェクソンからなる。 ヒトの CD28及び CTLA- 4は、 リーダー配列を含 め各々 2 2 0及び 2 2 3個のアミノ酸から構成され、 両者のアミノ酸相同性は 2 0乃至 3 0 %程度である。
CD28及び CTLA-4のリガンドは、 ヒト及びマウスにおいて CD80 (B7-1 ) 及び CD86 (B7-2) であることが解明されている。 CTLA- 4は、 いずれのリガンドに対しても CD28より親和性が高く、 その差は約 2 0倍である。 CD28及び CTLA-4の CD80 (B7- 1 ) への結合には、 動物種を超えて保存されているアミノ酸配列構造である 「MYP PPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr) 」 が重要であることが明らかにされている。 ま た、 CD28が刺激を受けると、 その細胞内の部分配列 「YMNM (Tyr-Met- Asn-Met) 」 内のリン酸化されたチロシン残基へ PI3キナーゼ （phosphoinositide 3 kinase, PI3K) が会合することが示され、 CD28はこの 「YxxM」 構造を介して細胞内シグナ ル伝達において重要な働きをしていることが示されてきている。 また、 CTLA4の細 胞内領域にも 「YxxM」 で表わされる配列、 即ち 「YVKM (Tyr-Val-Lys-Met) 」 を有 しており、 刺激を受けた後、 この配列に SYP が会合することが示されている。
CD28は、 胸腺細胞及び末梢血 T細胞に限局して発現し、 一方 CTLA-4は活性化 T 細胞に特異的に発現することがわかってきている （細胞工学 '別冊 「接着分子ハ ンドブック」 、 秀潤社発行、 第 93-102頁、 1994年； 同誌、 第 120- 136頁； 医学 ·別冊 「BI0 SCIENCE 用語ライブラリー ·免疫」 、 羊土社発行、 第 94-98頁、 1995年； 実験医学 ·別冊 「BI0 SCIENCE 用語ライブラリー ·細胞内シグナル伝 達」、 羊土社発行、 第 58-59頁、 1997年； 日本臨床、 第 55卷、 第 6号、 第 215-2 20頁、 1997年） 。
このようにして T細胞機能の制御 （T細胞の活性化及び機能抑制） におけるコ スティ ミュレイタ一分子 （CD28、 CD80 (B7-1) 及び CD86 (B7-2) など） 並び連動 する CTLA-4などの複数の分子の間の相互作用 （換言すれば、 それらの分子間の結 合を介した細胞間接着） の重要性が提唱されるようになり、 それらの分子と疾患 との関係の解明、 並びにそれらの分子の機能を制御することによる疾患の治療の 試みが注目されるようになってきている。
前述のように、 生体は、 生体 （自己） にとつて異物である抗原に対しては獲得 免疫応答システムを作動させるが、 自己の生体成分 （自己抗原） に対しては免疫 応答を示さない免疫寛容を有している。 しかしながら、 何らかの原因で免疫寛容 の破綻が起こると、 自己抗原に対する免疫応答が起こり前述と同様のメカニズム により自己抗原反応性 T細胞が誘導され免疫異常状態に陥り、 種々の自己免疫疾 患が惹起される。
即ち、 生体の免疫システムが正常な状態では、 正常組織の無刺激の抗原提示細 胞 （antigen presenting cell ; APC) はコスティミュレイ トリー分子を発現しな いため、 例え自己抗原に反応する自己抗原反応性 T細胞が存在していても、 T細 胞が不応答状態に陥っているため自己寛容が維持されているが、 免疫異常状態に おいては過剰または継続的なコスティミュレイ トリ一分子の発現以上により自己 抗原反応性 T細胞が活性化され自己免疫疾患が惹起されるという可能性が提示さ れている。
このような観点から近年、 コスティ ミュレィ トリーシグナルの伝達、 例えば前 述の CD28/CTLA-4-CD80/CD86の間のシグナル伝達を調節することにより種々の自己 免疫性疾患の治療の試みが多数なされてきている。
自己免疫性疾患である慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 自己免疫性甲状腺炎、 アレルギー性接触性皮膚炎、 慢性炎症性皮膚疾患である扁平苔癬、 及び乾癬など ではその病巣部の抗原提示細胞では CD28や CTLA- 4のリガンドとしてのコスティミ ュレイ トリ一分子である CD80が異常発現が確認されていることから、 特に CD80の 機能を抑制することによる該種々の自己免疫性疾患の治療の試みが多くなされて きている。
CD80の機能をブロックする方法としては、 CD80に対する抗体、 CD80のリガンド である CD28の可溶化蛋白、 あるいは同じく CD80のリガンドである CTLA- 4の可溶化 蛋白を用いる方法が検討されてきている。 中でも、 CTLA-4の CD80に対する結合親 和性が CD28のそれと比べ 2 0倍以上であることに基づく 「可溶化 CTLA- 4」 、 具体 的には 「CTLA- 4」 の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリン IgGlの F c領域とから なる融合タンパク （CTLA-4-IgFc) を用いた治療の試みが動物モデル並びに臨床試 験において行われている （日本臨床、 第 55卷、 第 6号、 第 215- 220頁、 1997年） 。 自己免疫疾患モデル動物での CTLA- 4- IgFcによる治療効果については下記①乃至 ⑤のような報告がなされている。
①ヒト全身性エリテマトーデス （SLE) のモデルである（NZB/NZW)F1マウスにお いては、 発症前投与で自己抗体産生の抑制及びループス腎炎の発症を抑制し、 ま た発症後の投与においても病態改善が認められた （Sc ience, Vol . 125, p. 1225-1 227, 1994) o
②多発性硬化症 （MS) のモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎 （EAE) にお いては、 免疫直後の短期投与により発病を阻止できた （J. Cl in. Invest. , Vol . 95， p.2783-2789, 1995) 。
③インスリン依存性糖尿病 （IDDM) モデルである NOD (non-obese diabetes) マ ゥスでは、 生後 2乃至 3週齢の雌に 2週間投与することにより発病率が著明に低 下した (J. Exp. Med. , Vol . 181 , p. 1145-1155, 1995)。 ④グッ ドパスチヤ一 （Goodpasture) の腎炎モデルである腎糸球体基底膜免疫に よるラット腎炎では、 投与により症状の改善が認められた （Eur. J. Immunol. , Vol.24, No, 6， p.1249-1254, 1994) 。
⑤ヒト慢性関節リゥマチモデルである DBA/1マウスを用いたタイプ I Iコラーゲン 誘導関節炎 （CIA) では、 免疫時の投与により関節炎の発症が抑制され、 コラーゲ ンに対する自己抗体 （IgGl及び IgG2) の産生が抑制された （Eur. J. Immunol. , Vol.26, p.2320-2328, 1996) 。
しかしながら、 上記のような治療の試みがなされる一方で、 コスティミュレィ 夕一分子及び関連する分子との間の相互作用 （換言すれば、 それらの分子間の結 合を介した細胞間接着） による T細胞の活性化のメカニズムの詳細な解明は未だ なされておらず、 またこのメカニズムには未だ同定されていない他の分子が関与 する可能性も残っている。 発明の開示
前述のような T細胞等のリンパ球の活性化に必須な第 2のシグナルの伝達に関 与する分子間の結合を介した細胞間接着による T細胞等のリンパ球の活性化及び リンパ球の機能の制御のメ力二ズムの解明、 並びにそのメカニズムに関与する細 胞間接着を媒介する能力とシグナルを伝達する能力を併せ持った既知または未知 の分子の同定及びその性状解析は、 先に述べたような種々の自己免疫疾患、 ァレ ルギー性疾患、 及び炎症性疾患等の種々の疾患の治療または予防において有用な 医薬品の開発し、 提供することを可能とする。
即ち、 本発明は、 そのような細胞間接着の媒介とシグナル伝達という両面の機 能を併せ持つた新規な細胞表面分子を同定するとともにその構造的及び生物学的 な性状を明らかにすることを課題とする。 さらに、 本発明は、 該新規な分子また は該分子に対する抗体等を用いることによる種々の自己免疫疾患や炎症性疾患の 治療または予防に有用な医薬品を提供することを課題とする。 そのような有用な分子を同定するために、 本発明者らは、 自己免疫疾患ゃァレ ルギ一疾患などにおいては T細胞等のリンパ球が重要な働きをしていること、 並 びに抗原提示細胞からの第 2のシグナル （コスティ ミュレィ トリ一シグナル） の リンパ球細胞内へのシグナル伝達には細胞間接着が必須であることに着目し、 リ ンパ球系の細胞に特異的に発現し、 且つ細胞間接着を媒介する機能を有する細胞 表面分子の単離及び同定を行うことを考えた。
その方法として、 まず、 リンパ球系細胞自体を免疫することにより該細胞の表 面に発現している種々の細胞表面分子に対するモノクローナル抗体を取得し、 得 られたモノクローナル抗体を用いて細胞間接着を媒介する機能を有する目的の細 胞表面分子を単離、 同定する手法を用いた。 以下、 その方法を具体的に説明する。 本発明者らは、 まず、 ラッ トのリンパ球系細胞株を免疫原としてマウスに投与 して、 種々のモノクロナ一ル抗体の作製した。 次いで、 得られたモノクロナール 抗体を、 免疫原として用いたラットリンパ球系細胞に作用させ、 該モノクロ一ナ ル抗体が該細胞に与える影響について検討した。 この結果、 得られたモノクロ一 ナル抗体の内の一つが該ラッ トリンパ球系細胞を強く凝集させる特性を有するこ とを見出した （このモノクローナル抗体を 「JTT. l抗体」 と命名した。 ） 。 さらに、 同様にして、 作製したモノクローナル抗体の中に、 該 「JTT. l抗体」 により誘導さ れるラットリンパ球系細胞の凝集を強く阻害するモノクローナル抗体を見出した (このモノクローナル抗体を 「JTT.2抗体」 と命名した。 ） 。
「JTT.l抗体」 によるラットリンパ球系細胞の凝集が、 該細胞に発現している既 知の最も代表的な細胞間接着分子である ICAM-1 ( Intercellular adhesion mole cule-1) や LFA— 1 (Lymphocyte function-associated ant ι gen- 1) (こ対する几体 (こ より阻害されなかったことから、 この凝集が細胞間接着媒介作用を有する未知の 接着分子を介した細胞間接着による凝集であると考えた。
次に、 この 2つのモノクローナル抗体により各々認識される細胞表面分子 （各 々 「JTT. l抗原」 及び 「JTT.2抗原」 と命名した。 ） の同定、 単離及び性状解析を 行った。
まず、 「JTT-1抗体」 及び 「JTT-2抗体」 を用いた蛍光抗体法に基づくフローサ ィ トメ トリ一により、 種々の細胞における 「JTT. l抗原」 及び 「JTT.2抗原」 の発 現パターンの解析を行った。 この結果、 「JTT. l抗原」 及び 「JTT.2抗原」 がとも に、 胸腺細胞及び脾臓細胞をマイ トジヱン （mitogen) であるコンカナパリン A (Concanavalin A; ConA) で刺激して活性化した活性化リンパ芽球細胞 （活性化 Tリンパ芽球細胞、 活性化 Bリンパ芽球細胞など） 、 特に該活性化リンパ芽球細 胞で強く発現が確認される一方で、 何らの刺激も加えていない脾臓細胞 （このよ うな細胞は、 本発明においては、 「静止期リンパ球」 と呼ばれる場合もある。 ） にはほとんど発現が見られないことを見出した。 また、 「JTT- 1抗体」 及び 「JTT - 2抗体」 の各々により確認される分子の発現パターンは、 ほぼ同一であることを 見出した。
次いで、 吸着剤に 「JTT- 1抗体」 を吸着させて作製したァフィ二ティーカラムを 用いて、 前記のラットリンパ球系細胞から調製した可溶性細胞表面分子の混合物 から該 「JTT-1抗体」 により トラップされる分子、 即ち 「JTT- 1抗原」 を精製した。 この精製 「JTT-1抗原」 の分子量を、 「JTT-1抗体」 及び 「JTT- 2抗体」 を用いた免 疫沈降法及び SDS-PAGEにより分析した。 その結果、 「JTT- 1抗体」 及び 「JTT- 2抗 体」 の各々により免疫沈降される分子が同一の分子であり、 また該分子は、 各々 異なる糖鎖修飾を有するホモダイマ一であることを見出した。 具体的には、 N型 糖鎖の消化処理を行わない場合には、 非還元化で約 47kDの 1分子として、 また還 元化で約 24kDと約 28kDの 2分子として同定され、 N型糖鎖の消化処理を行った場 合には、 非還元化で約 36kDの 1分子として、 また還元化で約 20kDの 1分子として 同定された。
次いで、 該精製 「JTT. l抗原」 をコーティングしたプレートへのラッ ト胸腺細胞 の接着の解析を行った。 この結果、 胸腺細胞が、 「JTT. l抗体」 存在下でのみ有意 にブレ一卜に接着 （即ち、 「JTT. l抗原」 に接着） し、 その接着は 「《11"[.2抗体| の共存下で有意に阻害されることを確認し、 「JTT. l抗原」 が実際に細胞間接着を 媒介する細胞表面分子であることを証明した。
次に、 本発明者らは、 ラット、 ヒト及びマウスの 「JTT. l抗原」 をコードする遺 伝子をクローニングし、 及びその構造の解析を行った。
具体的には、 まず、 「JTT. l抗体」 を用いたバニング （panning) 法を利用した 発現クロ一ニング法により、 ConA ij激したラッ ト脾臓由来リンパ芽球の cDNAライ ブラリーから、 「ラット JTT.1抗原」 の全長をコードする cDNAを単離することに成 功し、 ジデォキシ法によりその塩基配列を決定することにより、 全く新規なラッ 卜の遺伝子を単離、 同定した。 さらに得られた 「ラッ ト JTT.1抗原」 をコードする cDNAをプローブとしたプラークハイブリダィゼィーシヨンにより、 ConA刺激した ヒト末梢血リンパ芽球の cDNAライブラリーから、 「ヒト JTT.1抗原」 の全長をコー ドする cDNAを単離することに成功し、 ジデォキシ法によりその塩基配列を決定す ることにより、 全く新規なヒトの遺伝子を単離、 同定した。 同様にして、
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激したマウス脾臓由来リンパ芽球の cDNAライブラリーから、 「マウス JTT.1抗原」 の全長をコードする cDNAを単離することに成功し、 ジデォキシ法によりその塩基 配列を決定することにより、 全く新規なマウスの遺伝子を単離、 同定した。 さら に、 同様にしてラット胸腺腫細胞株の cDNAライブラリ一から、 前記の 「ラッ ト JT T.1抗原」 のオール夕ナティブスプライシング変異体 （alternative splicing va riant) の全長をコードする cDNAを単離することに成功し、 ジデォキシ法により その塩基配列を決定することにより、 全く新規な別のラットの遺伝子を単離、 同 定した。
単離された 「ヒト JTT-1抗原」 の cDNAによりコードされるアミノ酸配列のハイ ド 口パシープロッ ト解析から 「JTT. l抗原」 が、 シグナル配列、 糖鎖修飾部位を有す る細胞外領域、 膜貫通領域、 及び細胞内領域から構成される細胞膜貫通蛋白 （即 ち、 細胞表面分子） であることを見出した。 さらに、 既知分子とのホモロジー検 索の結果、 ラット、 ヒト及びマウスのいずれの 「JTT. l抗原」 も、 細胞間接着分子 を含めた既知のいかなる分子とも有意な相同性を有せず、 且つ細胞間接着媒介機 能を有する全く新規な細胞表面分子であることを見出した。
さらに、 「ヒト JTT- 1抗原」 のアミノ酸配列をもとにモチーフ検索を行った結果、 「ヒト JTT-1抗原」 は、 先に詳細に述べた細胞間接着を介して T細胞の活性化に重 要なコスティミュレイ トリーシグナル伝達する T細胞等のリンパ球の細胞表面分 子である 「CD28」 並びに該シグナルに連動して活性化 T細胞等の活性化リンパ球 の機能制御を行う T細胞等のリンパ球の細胞表面分子である 「CTLA- 4」 と下記の ような構造的類似性を有していることを見出した。
即ち、 ①システィン残基を含む 2 0以上のアミノ酸残基が良く保存されている。 ②リガンド結合領域として必須なプロリン残基の連続する配列 「ΡΓΟ-ΡΓΟ-ΡΓΟ ( Ρ ΡΡ ) 」 が細胞外領域に保存されている。 また、 ③シグナル伝達領域として必須な 配列 「Tyr- Xaa- Xaa- Met (YxxM) (Xaa及び xは任意のアミノ酸を意味する。 ） が細 胞内領域に保存されている。
次に、 蛍光インサイチュウハイブリダィゼ一シヨン （FISH) 法を用いて、 「マ ウス JTT- 1抗原」 をコードする遺伝子のマウス染色体上での位置を解析したところ、 その位置は、 マウスの 「CD28」 及び 「CTLA-4」 の位置と同じ、 「 1 C 3」 である ことを見出した。
次に、 「JTT- 1抗原」 の機能を制御することによる自己免疫疾患及びアレルギー 性疾患の治療の有効性を解析するために、 前述の 「JTT-2抗体」 を実験的アレルギ 一性脳脊髄炎 （E A E ) 及び糸球体基底膜 （GBM) 腎炎のモデルラッ 卜に投与する 実験を行った。 その結果、 いずれの疾患モデル動物においても、 病状の有意な抑 制が見られることを発見し、 「JTT- 1抗原」 の機能を制御することにより自己免疫 疾患やアレルギー性疾患の治療が可能であることを見出した。
さらに、 「ヒト JTT-1抗原」 に対するモノクローナル抗体が、 ヒト末梢血リンパ 球を有意に増殖させること、 またその増殖は、 T細胞の活性化に必須な抗原提示 細胞からの第 1のシグナルを受け取る T細胞上の TcR/CD3複合体を構成する CD3に 対するモノクローナル抗体を共存させることによりさらに高い増殖が見られるこ とを発見し、 「JTT-1抗原」 がリンパ球へのシグナル伝達に関与する細胞表面分子 であることを見出した。
さらに、 「JTT-1抗原」 及び/またはそのリガンドの機能を制御することによる 自己免疫疾患、 アレルギー性疾患または炎症性疾患の治療のための医薬品として 有用な、 「ヒト JTT- 1抗原」 の細胞外領域とヒト免疫グロブリンの F c領域からな る融合ポリべプチドを製造することに成功した。
さらに、 「JTT-1抗原」 の詳細な機能を解析し、 自己免疫疾患、 アレルギー性疾 患及び炎症性疾患の治療のための医薬品を開発するために有用な、 他の動物種の 「JTT-1抗原」 をコードする遺伝子が導入されたトランスジ: ϋニックマウス、 並び に 「マウス JTT- 1抗原」 をコードする内在性遺伝子が不活性化されたノックアウト マウスを作製することに成功した。
即ち、 本発明は、 上述のようにして単離、 同定された新規な哺乳動物の 「JTT- 1抗原」 に関係するポリペプチド、 遺伝子、 抗体、 ベクタ一、 形質転換体、 医薬組 成物、 トランスジエニックマウス、 及びノックアウトマウス等に関する。 具体的 には、 下記 （ 1 ) 乃至 （3 6 ) に記載される発明に関する。
( 1 ) 下記の特徴を有する細胞表面分子を構成するポリペプチド ：
( a ) 少なくとも胸腺細胞及びマイ トジェン （mitogen) で刺激したリンパ芽 球細胞で発現する ；
( b ) 該細胞表面分子に反応性を有する抗体は、 マイ トジェンで刺激したリ ンパ芽球細胞間の接着を誘導する ；
( c ) 該細胞表面分子に反応性を有する抗体は、 C D 3に反応性を有する抗 体との共存下で末梢血リンパ球の増殖を誘導する ；
( d ) 細胞外領域に Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Pheで表わされる部分ァミノ酸配列 を有する ；及び
( e ) 細胞内領域に Tyr-Met-Phe-Metで表わされる部分アミノ酸配列を有する。 (2) 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列、 または配列番号 2に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸において 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする前記 （ 1) に記 載のポリべプチド。
(3) 該ポリペプチドが、 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAにスト リンジェントな条件下でハイブリダィズする DN Aによりコードされることを特 徴とする前記 （ 1) に記載のポリペプチド。
(4) 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相 同性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする前記 （ 1) に記載のポリべ プチド。
(5) 該細胞表面分子が、 ヒト由来の細胞表面分子であることを特徴とする前 記 （ 1) 乃至前記 （4) のいずれかに記載のポリペプチド。
(6) 前記 （ 1) 乃至前記 （5) のいずれかに記載のポリペプチドをコードす る遺伝子。
(7) 該遺伝子が、 cDNAであることを特徴とする前記 （6) に記載の遺伝 子。
(8) 該 cDNAが、 配列番号 1に記載の塩基配列を有することを特徴とする 前記 （7) に記載の遺伝子。
(9) 該 cDNAが、 配列番号 3の塩基番号 26乃至 625に記載の塩基配列、 配列 番号 4の塩基番号 35乃至 637に記載の塩基配列、 配列番号 5の塩基番号 1乃至 603に 記載の塩基配列、 または配列番号 6の塩基番号 35乃至 685に記載の塩基配列のいず れかを含むことを特徴とする前記 （7) に記載の遺伝子。
( 10) 前記 （6) 乃至前記 （9) のいずれかに記載の遺伝子を含有するべク 夕一。
( 1 1) 前記 （ 10) に記載のベクタ一が導入された形質転換体。
( 12) 国際寄託番号 FERM BP-5725で識別される形質転換体。 ( 13 ) 前記 （ 1 ) 乃至前記 ( 5 ) のいずれかに記載のポリぺプチドの細胞外 領域からなるポリべプチド断片。
(14) 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するヒ ト由来のポリペプチドであることを特徴とする前記 （13) に記載のポリべプチ ド断片。
(15) 前記 （13) または前記 （14) に記載のポリペプチド断片をコード する遺伝子。
(16) 前記 （1) 乃至前記 （5) のいずれかに記載のポリペプチドの細胞外 領域からなるポリべプチド断片がジスルフィ ド結合により結合して形成されるホ モダイマー分子。
(17) 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するヒ 卜由来のポリペプチドであることを特徴とする前記 （ 16) に記載のホモダイマ —分子。
( 18 ) 前記 （ 14 ) に記載のポリぺプチド断片若しくは前記 （17) に記載 のホモダイマ一分子のいずれか一方または両方と薬学的に許容されうる担体を含 んでなる医薬組成物。
(19) 前記 （1) 乃至前記 （5) のいずれかに記載のポリペプチドの細胞外 領域とヒトの免疫グロブリン （I g) の重鎖の定常領域または定常領域の一部と からなる融合ポリべプチド。
(20) 免疫グロブリンが、 I gGであることを特徴とする前記 （19) に記 載の融合ポリべプチド。
( 21 ) 定常領域の一部が、 I gGのヒンジ領域、 C 2ドメイン及び C 3ドメ インからなることを特徴とする前記 （19) に記載の融合ポリペプチド。
(22) 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するヒ ト由来のポリペプチドであることを特徴とする前記 （19) 乃至前記 （21) の いずれかに記載の融合ポリぺプチド。 (23) 前記 （ 19) 乃至前記 （22) のいずれかに記載の融合ポリべプチド がジスルフィ ド結合により結合して形成されるホモダイマー分子。
(24) 前記 （22) に記載の融合ポリペプチドがジスルフィ ド結合により結 合して形成されるホモダイマ一分子。
(25) 前記 （22) に記載の融合ポリペプチド若しくは前記 （24) に記載 のホモダイマ一分子のいずれか一方または両方と薬学的に許容されうる担体を含 んでなる医薬組成物。
(26) 該医薬組成物が、 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療または 該疾患症状の抑制に用いられることを特徴とする前記 （25) に記載の医薬組成 物。
(27) 前記 （ 1) 乃至前記 （5) のいずれかに記載のポリペプチド、 前記
( 13) 若しくは前記 （ 14) に記載のポリペプチド断片または該ポリペプチド により構成される細胞表面分子に反応性を有する抗体またはその一部。
(28) 該抗体が、 モノクローナル抗体であることを特徴とする前記 （27) に記載の抗体またはその一部。
(29) 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 前記
( 14) に記載のポリべプチド断片または該ポリべプチドから構成されるヒト由 来の細胞表面分子に反応性を有するモノクローナル抗体またはその一部。
(30) 前記 （ 1) 乃至前記 （5) のいずれかに記載のポリペプチドまたは該 ポリべプチドにより構成される細胞表面分子に反応性を有するモノクロ一ナル抗 体であって、 該モノクローナル抗体のマイ トジェンで刺激したリンパ芽球細胞へ の作用が、 国際寄託番号 FERM BP- 5707で識別されるハイプリ ドーマが産生するモ ノクロ一ナル抗体がマイ トジェンで刺激したラヅ トリンパ芽球細胞に示す作用と 実質的に同一であるモノクローナル抗体またはその一部。
(31) 前記 （ 1) 乃至前記 （5) のいずれかに記載のポリペプチドまたは該 ポリべプチドにより構成される細胞表面分子に反応性を有するモノクローナル抗 体であって、 該モノクローナル抗体のマイ トジヱンで刺激したリンパ芽球細胞へ の作用が、 国際寄託番号 FERM BP-5708で識別されるハイプリ ドーマが産生するモ ノクロ一ナル抗体がマイ トジェンで刺激したラッ トリンパ芽球細胞に示す作用と 実質的に同一であるモノクローナル抗体またはその一部。
( 3 2 ) 前記 （2 9 ) に記載のモノクローナル抗体またはその一部と薬学的に 許容されうる担体を含んでなる医薬組成物。
( 3 3 ) 該医薬組成物が、 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療または 該疾患症状の抑制に用いられることを特徴とする前記 （3 2 ) に記載の医薬組成 物。
( 3 4 ) 前記 （2 8 ) 乃至前記 （3 1 ) のいずれかに記載のモノクローナル抗 体を産生するハイブリ ドーマ。
( 3 5 ) 前記 （ 1 ) に記載のポリペプチドをコードする遺伝子であって、 配列 番号 1に記載される塩基配列を含むヒ卜由来の遺伝子または配列番号 4の塩基番 号 35乃至 637に記載される塩基配列を含むラッ ト由来の遺伝子が、 マウスの内在性 遺伝子に組み込まれていることを特徴とするトランスジエニックマウス。
( 3 6 ) 前記 （ 1 ) に記載のポリペプチドであって配列番号 5に記載される遺 伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するマウス由来のポリべプチドが産生 されないように、 該ポリペプチドをコードするマウスの内在性遺伝子が不活性化 されていることを特徴とするノックァゥトマウス。
上述のように本発明の細胞表面分子 （即ち、 「JTT-1抗原」 ） は、 該分子を介し た細胞間接着、 並びに T細胞等のリンパ球へのシグナルの伝達及び活性化リンパ 球の機能制御において役割を担う側面を有する。 そこで、 そのような生物学的事 象の一般的理解に役立てるためのみの目的で、 リンパ球系細胞、 細胞間接着分子、 及びそれらと疾患との関係についての一般的知見を下記に記載する。 従って、 下 記に記載する一般的な知見は、 本発明を限定的に解釈するためのものではない。 リンパ球は、 大別して T細胞と B細胞の 2種類に分けられる。 骨髄の多能性幹細胞 からリンパ球系幹細胞が分化すると、 その一部は血流に乗って胸腺に到達する。 胸腺で分化成熟したリンパ球は T細胞 (Thymus-derived cell： T cell) と呼ばれ、 再び血中に入り全身を巡る。 成熟した T細胞は CD3と呼ばれる分子を表面に持って おり、 この分子を持つていることがその細胞が成熟 T細胞であるかどうかを区別す る目印になる。 CD3は有力な T細胞マーカ一である。 その他、 T細胞は CD4または CD 8などを発現している。 T細胞はさらに、 Bリンパ球の抗体産生を補助するヘルパー T細胞 （Th細胞： helper T cell) 、 標的細胞にとりついて直接にそれを破壊する 細胞障害性 T細胞 （Tc細胞： cytotoxic T cell： CTL) あるいはキラー T細胞、 Bリ ンパ球の抗体産生を抑制するサブレッサー T細胞、 リンフォカインなどの効果物質 を分泌して遅延型アレルギーを起こすエフヱクタ一 T細胞 （effector T cel l) な どがある。
リンパ球系幹細胞のうち骨髄の中でそのまま分化成熟するのが B細胞である。 B 細胞は、 適切な刺激があれば抗体を産生するようになる細胞で、 抗体産生前駆細 胞である。 表面には B細胞内で合成された免疫グロブリンがあり、 抗原レセプ夕一 として機能している。 成熟した B細胞の表面には IgMと IgDがともにあり、 抗原刺激 と T細胞からのシグナルで分化すると IgMの産生が増加し、 C末端部の細胞膜結合部 分が変わって分泌されるようになる。 十分な刺激があると表面の免疫グロプリン も IgGや IgE、 IgAに変化するとともに、 それぞれのクラスの免疫グロブリンを分泌 するようになる。 B細胞表面の免疫グロブリンは、 表面の Igということで slgとか、 細胞膜の Igということで mlgと表現されることもある。 一つの B細胞の表面にある Igはすべて同じ抗原結合部位を有する。
T細胞でもなく B細胞でもないリンパ球で、 LGL (laege granular lymphocute) あるいはヌルセル （null cell) と呼ばれるものがある。 この細胞には、 腫瘍細胞 やウィルス感染細胞の障害能力があるが、 細胞障害性 T細胞の場合と異なり、 あら かじめ抗原刺激をしておく必要がない。 そのためナチュラルキラ一細胞 （NK細胞 ： natural killer cell) ともいわれる。 上記の T細胞の内、 CD4陽性 Τ細胞は、 抗原提供細胞によって提示された抗原に反 応すると、 いろいろなサイ ト力インを分泌し、 それらのサイ ト力インに対するレ セプ夕一などが新たに発現し、 細胞自身も大きくなり、 分裂を始め、 増殖する。 このような細胞レベルの反応に先立って、 それぞれの Τ細胞に特有の抗原レセプ夕 ― (T cell antigen receptor： TCR) に抗原提供細胞上の抗原ペプチドと MHCクラ ス 11分子の複合体が結合し、 それによつて細胞内ではいろいろな生化学的変化が 生じて核内にシグナルが伝わり、 特定の DNAの転写が始まり、 それぞれのタンパク 質が合成される。 その結果として、 細胞レベルの反応が見られるようになるわけ である。 また、 CD8陽性 T細胞に関しては例えば、 あるウィルスに感染した細胞を 考えると、 この感染した細胞はウィルスタンパク質を合成し、 そのタンパク質が 細胞質内のプロテアゾームで分解され、 一部のぺプチドが TAPを経て小胞体内に入 り、 合成されたばかりの HCクラス I分子と安定した複合体を形成して細胞表面に でる。 これを特異的な CD8陽性 T細胞が認識するが、 この段階ではまだその細胞を 破壊することはない。 抗原に反応したこの T細胞は IL-2レセプ夕一 （IL- 2R) を発 現し、 それに IL-2が作用すると細胞障害活性を持つ CTLに分化し、 次に同じ抗原べ プチド /MHCクラス I複合体に出会った時にその標的細胞を破壊して殺すことにな る。 CTLへ分化するのに必要なサイ トカインは IL- 2ばかりでなく、 IFNァやその他 のサイ 卜力インにも類似の作用があるといわれる。 このように、 CTLへの分化には T細胞の分泌するリンフォカインが必要であるが、 それらのリンフォカインは CD4 陽性 Thl細胞 （IL- 2や IFNァなどを分泌する CD4陽性 T細胞） が同じウィルスに由来 する抗原のぺプチドをクラス I I分子とともに認識して産生している。 CD4陽性 T細 胞の助けがなくても、 CD8陽性 T細胞が抗原に反応して IL-2などを産生している場 合もある。 CD8陽性 T細胞が CTLに分化すると、 細胞質内に顆粒が増加してくる。 こ の顆粒のなかにはいろいろな高分子タンパク質が含まれており、 パ一フオリンは その代表である。 パーフォリンは補体の第 5-9成分で構成される膜侵襲複合体 （m embrane attack complex： MAC) によく似ており、 標的細胞の細胞膜に穴をあける 作用がある。 その他、 セリンプロテア一ゼゃ LT、 プロテオグリカン （proteoglyc an) なども含まれている。 また、 CTLに分化して抗原刺激を受けると IFNァ、 LT、 TNFあるいは IL- 2などのリンフォカインも分泌する。 また、 T細胞は汎血球凝集素 (植物凝集素、 PHA) ゃコンカナパリン A (Con A) に反応して芽球化現象を示す。 また、 まだ何も刺激を受けていない状態の成熟 T細胞は、 静止期 T細胞 （restin g T cell) と呼ばれ、 細胞の大きさが小さく、 寿命も数日で短い。 刺激を受ける と、 すでに述べたように細胞は大きくなり、 いろいろな刺激に対してさらに反応 しゃすくなる。 このような T細胞を活性化 T細胞 （activated T cel l) と呼ぶ。 一 部の活性化 T細胞は、 記憶 T細胞 （memory T cel l ) となり、 同じ抗原刺激を受ける と二次免疫反応をもたらすことになる。 記憶 T細胞は数年あるレ、は数十年も体内を 循環し続けるといわれている。
B細胞でまだ何も刺激を受けていない状態のものを、 T細胞の場合と同じように 静止期 B細胞 （resting B cell ) といい、 多価の抗原や CD40Lで刺激され、 増殖を 起こしたような B細胞を活性化 B細胞 （activated B cell ) という。 静止期 B細胞に は、 B7-1 (CD80) や B7-2 (CD86) のようなコスティミュレ一夕一分子 （TCRを介し たシグナルとともに T細胞を刺激する分子） がなく、 静止期 T細胞に抗原を提供し ても TCRを刺激するだけで、 CD40リガンド （CD40L) を発現させたり、 リンフォカ インを産生させたりすることができないといわれている。 そのため、 ほかの抗原 提供細胞によって抗原刺激され、 活性化されたヘルパー T細胞が静止期 B細胞の抗 原提示に反応するものと考えられている。 すなわち、 抗原が侵入してきた場合に は、 まず B7分子を発現している樹状細胞 （著しい樹状の突起を有する細胞） ゃ微 生物に反応して活性化されたマクロファージがその抗原を提示して、 休止期ヘル パ一T細胞を刺激し、 CD40Lを発現させるなど活性化してから、 同じ抗原を提示す る静止期 B細胞に結合してその CD40を刺激すると考えられている。 多価の抗原や C D40Lで刺激されて一度活性化されると、 B細胞も B7分子を発現し、 TCRとともに表 面の CD28を刺激してそのヘルパー T細胞を活性化し、 CD40Lを発現させたり、 リン フォカインを産生させたりすることができる。 また、 刺激を受けて細胞が大きく なるなどの変化は見られるものの、 抗体の分泌はほとんど見られない状態の B細胞 を活性化 B細胞 （activated B cell) という。 さらに成熟 B細胞になって抗原に出 会うと、 T細胞からの刺激も加わって IgMの産生が高まり、 産生する IgMが膜型から 分泌型に変わって分泌されるようになる。 さらに、 T細胞からの液性因子によって IgMから IgGなどのほかのアイソタイプの抗体を産生するようになる。 これをアイ ソタイプスィッチあるいはクラススィッチという。 抗体を分泌するようになった B細胞は抗体分泌細胞 （antibody- secreting cel l) と呼ばれるようになり、 一部 は形態学的にも特徴のある細胞となり、 形質細胞 （plasma cell) と呼ばれる （免 疫学の知識、 オーム社（1996 )) 。
ところで免疫系の様々な反応において、 白血球はそのサブポピュレーション、 即ち、 Tリンパ球、 Bリンパ球、 NK、 好中球などがそれぞれ異なった動態を示す場 合が多い。 また、 上記のように同じリンパ球であっても、 その細胞の状態、 即ち、 活性化しているか、 静止期にあるかにより、 それぞれ異なった動態を示す。 これ らの事実は、 白血球のサブポピュレーション特異的な認識機構、 さらには細胞の 状態に特異的な認識機構、 特に細胞接着分子 （細胞接着タンパク質） の存在を示 唆するものである。
細胞接着分子、 即ち、 細胞接着タンパク質は、 一般に、 個体の発生 ·分化の際 に、 あるいは細胞の局所への遊走の際に、 細胞同士を互いに接着させる機能を有 する分子であり、 生体の有機的かつ機能的な連絡にとつて必須の分子であること が知られている。
細胞接着分子は、 その構造的特徴から大きく免疫グロプリンス一パーファミリ ―、 インテグリンファミリ一、 セクレチンファミリー、 カドヘリンファミリ一、 CD44フアミリーの 5つに分類されている。 免疫グロプリンスーパ一フアミリーに属 する接着分子は、 ジスルフィ ド結合で形成されるループ様ドメインを繰り返し持 つことを特徴としており、 「ICAM-1」 ( intercellular adhesion molecule-1 ) s 「VCAM- 1」 （vascular cell adhesion molecule-1) などの分子が知られている。 また、 インテグリンファミ リ一に属する接着分子は、 ひ//?ヘテロダイマー構造を 特徴とし、 「VLA-1〜6」 （very late antigen- 1〜6) 、 「LFA- 1」 （lymphocyte function-associated antigen- 1) 、 「Mac-l」 、 「pl50/90」 などが知られている c セクレチンファミリ一に属する分子は、 N末端から順に、 レクチン様ドメイン、 E GF様ドメイン、 補体ドメインを有し、 「E-セレクチン」 ， 「P-セレクチン」 などが 知られている。 さらに、 カドヘリンファミリ一としては、 「E-カドヘリン」 、
「N -力ドヘリン」 、 「P -力ドヘリン」 が、 CD44ファミリ一には、 「CD44」 が知ら れている。
これら接着分子の具体的な機能としては、 白血球の血管内皮細胞への接着ゃリ ンパ球の抗原提示細胞への接着などが知られているが、 近年における様々な研究 から、 これらの機能のみならず種々の疾患にも関係していることが徐々に明らか となってきた。
特に、 疾患と接着分子の発現異常に関しては、 多くの報告がなされている。 例 えば、 慢性関節リウマチ （RA) については、 RA滑膜細胞において、 「Mac-l」 と
「pl50/95」 の両者の発現が増強していることが報告されている （Allen, C et al. Arthritis Rheum. , 32, 947( 1989)) 。 また、 M滑膜では、 様々な細胞が 「ICAM-1」 を強く、 かつ異所性に発現していることが報告されている （Hale，L. et al.Arthr itis Rheum. , 32, 22( 1989)) 。 さらに、 「ELAM- 1」 も好中球と血管内皮細胞の接着 に関与しており、 これら分子の過剰発現は、 RA関節液中に見られる好中球の浸潤
(特に関節液中への） に関与していることが示唆されている （Laffon，A. ,et al. Arthritis Rheum. , 32, 386( 1989)) 。 さらに、 「CD44」 も RA滑膜において、 血管内 皮細胞、 A型滑膜細胞に強く発現していることが報告されている （Heynes，B. et a 1. Arthritis Rheum. , 34, 1434( 1991 ) ) 。
また、 全身性エリデマトーデス （SLE) と接着分子の発現異常との関係について も例があり、 例えば、 SLE患者では Tリンパ球の培養血管内皮細胞に対する接着能 が健康人と比較すると低下していることが報告されている。 また、 SLE患者の抹消 リンパ球における接着分子の発現検討では、 「ICAM- 1」、 「VLA-4」、 「IFA-1」 の増強傾向が見られている (Haskard, D. O. et al， Rheumatol . Int, 9， 33 ( 19 89))。
自己免疫性甲状腺疾患については、 甲状腺濾胞細胞をイン夕一フヱロン-ァ、 ィ ン夕一ロイキン- 1、 腫瘍壊死因子で刺激すると 「ICAM-1」 が発現すること、 濾胞 細胞と単核細胞とのクラス夕一形成が、 抗「ICAM-1」 抗体により抑制されること が報告されている (Weetman,A.P. , et al .Eur. J. Immunol . ,20, 271( 1990) )。
肝炎では、 肝細胞と炎症細胞間の接着が 「ICAM- 1」 と 「LFA- 3」、 「LFA- 1」 と
「CD2」 という 2つの経路で行なわれることでその機会を増加させ、 抗原の提示や 炎症細胞の活性化が促進されると考えられている。 特に、 B型肝炎における検討で は 「LFA-3」 がウィルス増殖の盛んな肝細胞に強く発現し、 「ICAM-1」 が肝炎の程 度によく相関していることから、 「LFA-3」 がウィルスの排除に関与し、 また 「I CAM-1」 が T細胞への抗原提示を促進させ炎症反応を調節していることが示唆され ている。 「ICAM-1」 陰性で HBc抗原陽性の肝細胞の場合はリンパ球との細胞間相互 作用が起こらずウィルス感染の慢性化という一種の免疫不応答の状態が生じるの ではないかと考えられる。 急性肝炎や慢性活動性肝炎、 肝硬変患者の血清 「ICAM -1」 濃度が健常者や慢性持続性肝炎患者よりも高く、 また活動性肝炎患者のうち でも組織学的に進行した症例で高値を認めることから慢性肝疾患における血清 CAM- 1」 が肝細胞の障害の程度と相関するとの報告もなされている （Mod.Phys. 15, ( 1 ) , 73-76( 1995 ) ) 。
動脈硬化のモデル動物では、 その病変発症のごく初期において血管内皮への単 球やリンパ球の接着、 侵入が認められ、 これら血球細胞と内皮の相互作用が動脈 硬化発症の第一段階と考えられている。 また、 実際の動脈硬化巣における接着分 子の発現については、 種々の報告がなされている。 例えば、 ヒト動脈硬化巣にお ける r iCAM-lj の発現 (Poston RN, et al.Am J Patol , 140, 665( 1992)) や高コレ ステロール血症ゥサギの動脈硬化巣における 「VCAM-1」 の発現 （Cybulsky MI,Gi mbrone MA Jr. Science, 251, 788(1991)) について報告例がある。 さらに最近、 ヒ 卜の動脈硬化巣においても 「VCAM- 1」 が発現していることが観察されており、 そ の発現が特に内膜に遊走した平滑筋細胞と単球/マクロファ一ジに強く認められ たことが報告されている。 また、 ゥサギおよびヒト動脈硬化巣において 「MCP- 1」 の発現亢進が認められており、 「MCP-1」 が単球/マクロファージの遊走を介して 動脈硬化巣の形成を促進しているという示唆もある （カレントテラビ一， 12, (8)， 1485-1488(1994))。
さらに、 癌転移と接着分子異常の関係についても報告がある。 例えば、 E-カド ヘリンの低下した癌細胞は、 強い侵襲性を示すが、 これに E-カドヘリンの cDNAを 導入すると侵襲性が抑制され、 さらに、 E-カドヘリン抗血清を添加すると侵襲性 が回復することが見出されており、 E-力ドヘリンの発現低下と癌細胞の侵襲性の 密接な関連が示唆されている （Frixen，U.H.，et al.113, 173(1991)) 。 実際の臨床 例においても、 肝癌、 食道癌、 胃癌、 乳癌など種々の癌で E-カドヘリンの発現低 下と転移との関係が指摘されている。 また、 「VCAM-1」 のリガンドである 「VLA- 4」 は転移性メラノ一マ、 胃癌、 乳癌などで高発現することが報告されており、 こ れらが転移に際して血管内皮細胞への着床に利用される可能性が示唆されている。 また、 種々の癌細胞株を用いた実験から胃癌、 大腸癌、 肺癌、 肝癌、 脬癌などの 上皮性の癌は E-セレクチンを介して血管内皮細胞に接着するとの報告もなされて いる (Takada,A.,et al. Cancer Res. ,53,354(1993)) 。
一方、 これら接着分子を標的とした疾患治療の試みもなされている。 例えば、 抗ラット 「ICAM-1」 抗体がラッ ト自己免疫性関節炎モデルでの炎症反応を強く抑 えることが報告されている。 また、 RAの動物モデルの一つとされるアジュバンド 滑膜炎では、 抗 「ICAM- 1」 抗体を投与することにより、 関節炎の発症が抑制され ることが報告されている （日本臨床免疫学会誌、 14,(6)，571-577(1991)) 。 さら に、 一部のインテグリンが認識し結合する細胞外マトリックス蛋白上のアミノ酸 配列である REG配列のぺプチドを多量に胆癌マウスへ投与すると、 接種腫瘍の転移 形成が顕著に抑制され、 またインビトロの系では、 RGDペプチドや抗 ? 1サブュニ ット抗体が癌細胞の運動や浸潤を抑制することが報告されている （Yamada，K.M.， et al . Cancer Res, 50, 4485, ( 1990 ) ) 。
以下、 本発明で用いる語句の意味並びに本発明のポリペプチド、 融合ポリぺブ チド、 遺伝子、 抗体、 トランスジエニックマウス、 ノックアウトマウス等の一般 的製造方法を明らかにすることにより本発明を詳細に説明する。 しかしながら、 該用語の意味がそのような定義を以て限定的に解釈されるものではないことは言 うまでもない。
本発明における 「マイ トジェン」 とは、 分裂促進剤とも呼ばれ、 細胞分裂を誘 起する物質を指す。 免疫学的には、 抗原非特異的 （ポリクロ一ナル） にリンパ球 を幼弱化し分裂を誘起させるものを意味する。 例えば、 PHAや P Mなどのレクチン、 コンカナパリン A (Concanaval in A; ConA) 、 リポ多糖、 ス トレプトリシン S、 抗リンパ球抗体などが挙げられる。 コンカナパリン Aや PHAは、 Tリンパ球のみに 作用し、 リポ多糖は Bリンパ球のみに作用し、 PWMは両リンパ球に作用することが 知られている。
本願明細書中で用いられる 「リンパ芽球細胞」 なる用語は、 大リンパ球、 リン ホブラスト （l mphoblast) あるいは免疫芽細胞とも呼ばれ、 リンパ性組織 （リン パ節、 脾臓、 胸腺、 骨髄、 リンパ管、 扁桃腺など） や血液中に存在するリンパ球 の内の大リンパ球に属するリンパ球を指す。
本願明細書中で用いられる 「活性化リンパ球」 なる用語は、 例えば下記のよう なリンパ球を意味するがこの限りではない。 例えば、 何らかの刺激により活性化 されたリンパ球を指す。 前述のとおりリンパ球は、 T細胞、 B細胞、 およびナチュ ラルキラ一細胞に分類され、 さらに T細胞については CD4陽性細胞と CD8陽性細胞に 分類することができる。 従って、 本発明の 「活性化リンパ球」 には、 主に活性化 T細胞、 活性化 B細胞、 および活性化ナチュラルキラー細胞が含まれ、 さらに活性 化 T細胞には活性化 CD4陽性細胞と活性化 CD8陽性細胞が含まれる。
CD4陽性 Τ細胞は、 抗原提供細胞によって提示された抗原に反応すると、 いろい ろなサイ トカインを分泌し、 それらのサイ トカインに対するレセプ夕一などが新 たに発現し、 細胞自身も大きくなり、 分裂を始め、 増殖して活性化される。 活性 ィ匕 CD4陽性 Τ細胞とは、 このような状態の CD4陽性 Τ細胞を指す。
CD8陽性 Τ細胞は、 抗原に反応すると IL-2Rを発現し、 それに IL-2が作用すると細 胞障害性をもつ CTLに分化し、 次に同じ抗原べプチド /MHCクラス I複合体に出会つ た時にその標的細胞を破壊して殺すようになる。 CD8陽性 Τ細胞が CTLに分化すると、 細胞質内に顆粒が増加してくる。 この顆粒の中にはいろいろな高分子タンパク質 が含まれており、 パーフォリンはその代表である。 パーフォリンは補体の第 5-9成 分で構成される ACによく似ており、 標的細胞の細胞膜に穴をあける作用がある。 その他、 セリンプロテアーゼゃ LT、 プロテオグリカン （proteoglycan) なども含 まれている。 また、 CTLに分化して抗原刺激を受けると IFNァ、 LT、 TNFあるいは I L-2などのリンフォカインも分泌する。 活性化 CD8陽性 T細胞とは、 このような状態 の CD8陽性 T細胞を指す。
T細胞は汎血球凝集素 （植物凝集素、 PHA) ゃコンカナパリン A (Con A) に反応 して芽球化現象を示すが、 このような状態の T細胞も活性化 T細胞に含まれる。
B細胞では、 B7分子を発現し、 TCRとともに表面の CD28を刺激してそのヘルパー T細胞を活性化し、 CD40Lを発現させたり、 リンフォカインを産生したりし、 刺激 を受けて細胞が大きくなつたり、 増殖を起こすなどの変化が見られる。 活性化 B細 胞とは、 このような状態の B細胞を指し、 本発明においては、 抗体を分泌するよう になった B細胞 （抗体分泌細胞（antibody- secreting cel l )及び形質細胞 (plasma cel l )) も活性化 B細胞に含まれる。
活性化ナチュラルキラ一細胞とは、 前述のとおり腫瘍細胞やウィルス感染細胞 の障害作用を示すナチュラルキラー細胞を指す。 なお、 本発明においては、 コン カナバリン A (Con A) で刺激された胸腺細胞も活性化リンパ球に含まれる。 本発明において用いられる 「活性化リンパ芽球細胞」 には、 前記のような 「リ ンパ芽球」 が、 コンカナパリン Aのような前記 「マイ 卜ジェン」 で刺激を受けて 活性化されたリンパ芽球が含まれる。
本願明細書で場合によって用いられる 「静止期リンパ球」 なる用語は、 前述の 活性化リンパ球と対照的に、 細胞の活性化のための刺激を受けていない非活性化 状態のリンパ球を指す。
本発明における 「遺伝子」 には、 ゲノミック DNAおよび cDNAが含まれる。
本発明において 「ヒ卜由来」 とは、 ヒ卜の生体成分 （臓器、 組織、 細胞、 体液 など） から単離された天然の物質、 遺伝子組換え技術を用いて作製される組み換 え物質を含み、 また該物質がタンパク質あるいはポリべプチドである場合には、 それらのアミノ酸配列中のアミノ酸の 1もしくは数個のアミノ酸配列が置換、 欠失 もしくは付加したアミノ酸配列を有する人工のタンパク質及びポリべプチドも含 まれる。
本発明の 「細胞表面分子」 とは、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット及びゥサ ギなどの哺乳動物に由来する細胞表面分子であり、 好ましくはヒ卜、 ラットまた はマウスに由来する細胞表面分子であり、 より好ましくはヒト由来の細胞表面分 子である。
本発明の 「細胞表面分子」 は、 具体的には、 少なくとも下記の性質を有するこ とを特徴とする細胞表面分子である。
( a ) 少なくとも胸腺細胞及びマイ トジェン （mitogen) で刺激したリンパ芽球細 胞で発現する；
( b ) 該細胞表面分子に反応性を有する抗体は、 マイ トジヱンで刺激したリン パ芽球細胞間の接着を誘導する ；
( c ) 該細胞表面分子に反応性を有する抗体は、 C D 3に反応性を有する抗体 との共存下で末梢血リンパ球の増殖を誘導する ；
( d ) 細胞外領域に Phe-Asp- Pro-Pro-Pro-Pheで表わされる部分ァミノ酸配列を 有する ；及び
( e ) 細胞内領域に Tyr-Met-Phe-Metで表わされる部分アミノ酸配列を有する。 好ましい態様としては後述する本発明の 「ポリペプチド」 から構成される細胞 表面分子である。
本発明の 「ポリペプチド」 とは、 上記の本発明の 「細胞表面分子」 を構成する ポリぺプチドであり、 具体的には下記が挙げられる。
( 1 ) 配列番号 1に記載の塩基配列からなる D N Aにス卜リンジェン卜な条件下 でハイプリダイズする D N Aによりコードされるポリべプチド。
( 2 ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列を有するポリべプチド。
( 3 ) 配列番号 2に記載されるァミノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列を有するポリペプチド （即ち、 「ヒト JTT-1抗原」 を構成するポ リベプチド及びその誘導体） 。
( 4 ) 配列番号 3の塩基番号 26乃至 625に記載の塩基配列によりコードされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「ヒト JTT- 1抗原」 を構成するポリべプチド及びその誘導体） 。
( 5 ) 配列番号 4の塩基番号 35乃至 637に記載の塩基配列によりコードされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「ラット JTT-1抗原」 を構成するポリペプチド及びその誘導体） 。
( 6 ) 配列番号 5の塩基番号 1乃至 603に記載の塩基配列によりコ一ドされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「マウス JTT- 1抗原」 を構成するポリペプチド及びその誘導体） 。
( 7 ) 配列番号 6の塩基番号 35乃至 685に記載の塩基配列によりコ一ドされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「ラヅト JTT-1抗原の変異体」 を構成するポリペプチド及びその誘導 体） 。 (8) 国際寄託番号 FE BP- 5725識別される形質転換体に導入された本発明の細 胞表面分子を構成するポリべプチドをコードする DN Aによりコ一ドされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「ヒト JTT- 1抗原」 を構成するポリペプチド及びその誘導体） 。 ここで 「ストリンジ工ン卜な条件下」 としては、 例えば、 次のような条件を挙 げることができる。 例えば、 50塩基以上のプロ一ブを用い、 0.9%NaCl下でハ イブリダィゼ一シヨンを行う場合には、 、 50%の解離を生ずる温度 （Tm) の目 安を下記計算式から求め、 ハイブリダィゼ一シヨンの温度を下記計算式のように 設定することができる。
Tm = 82.3°C + 0.41x (G+C) %— 500/n— 0.61X (フオルムアミ ド） ％
(nはプローブの塩基数を示す。 ）
温度 = Tm— 25°C
また、 100塩基以上のプローブ （G+C=40〜50%の場合） を用いる場合には、 Tm が下記 （ 1 ) 及び （2) のように変化することを目安する。
( 1) 1%ミスマッチ毎に、 71!1が約1。。下がる。
(2) フオルムアミ ド 1%毎に、 Tmが 0.6〜0.7°C下がる。
従って、 完全相補鎖の組み合わせの場合の温度条件は下記のようにすることが できる。
(A) 65〜75°C (フオルムアミ ド無添加）
(B) 35〜45°C (50%フオルムアミ ド存在下）
また、 不完全相補鎖の組み合わせの場合の温度条件は下記のようにすることが できる。
(A) 45〜55°C (フオルムアミ ド無添加）
(B) 35〜42°C (30%フオルムアミ ド存在下）
また、 23塩基以下のプローブを用いる場合の温度条件は、 37°Cとすることも できるし、 また下記計算式を目安とすることもできる。 温度 = 2 °C x (A+Tの数） + 4 °C x (C+Gの数） — 5 °C
ここで 「実質的に同一のアミノ酸配列を有する」 とは、 配列表に記載されるァ ミノ酸配列を有するポリべプチドと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、 該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、 好ましくは 1乃至 1 0個のアミノ酸、 特 に好ましくは 1乃至 5個のァミノ酸が置換、 欠失及び/または修飾されているァ ミノ酸配列を有するポリペプチド、 並びに該アミノ酸配列に、 複数個のアミノ酸、 好ましくは 1乃至 1 0個のァミノ酸、 特に好ましくは 1乃至 5個のアミノ酸が付 加されたァミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含することを意味する。
そのようなアミノ酸の置換、 欠失、 または挿入は常法に従って行うことができ る （実験医学別冊 ' 「遺伝子工学ハンドブック」 （1992 )など） 。
例えば、 合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法 （gapped duplex) 法、 亜 硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、 Bal31酵 素等により欠失変異体を作製する方法、 カセッ ト変異法、 リンカ一スキャニング 法、 ミスインコーポレーション法、 ミスマッチプライマ一法、 DNAセグメント合成 法などを挙げることができる。
合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入 （gapped duplex) 法は、 例えば下記 のように行うことができる。 アンバー変異をもつ M13ファージベクターに変異誘起 を希望する領域をクローニングし、 一本鎖ファージ DNAを調製する。 アンバー変異 をもたない M13ベクターの RFIDNAを制限酵素処理により線状とし、 上記の一本鎖フ ァ一ジ DNAと混合して変性後、 ァニールさせ、 「gapped duplex DNA」 を形成させ る。 これに変異を導入した合成オリゴヌクレオチドをハイプリダイズさせ、 DNAポ リメラ一ゼと DNAリガーゼの反応により閉環状 2本鎖 DNAとする。 この DNAをミスマ ッチ修飾能が欠損している大腸菌匪 tS株にトランスフエクシヨンし、 増殖したフ ァ一ジをサブレッサ一機能のない大腸菌に感染させ、 アンバー変異を持たないフ ァ一ジだけを選択する。
また、 亜硝酸による点突然変異を導入する方法は、 例えば下記のような原理を 利用する。 DNAを亜硝酸処理すると塩基が脱ァミノ化されて、 アデニンはヒポキサ ンチンに、 シトシンはゥラシルに、 グァニンはキサンチンになる。 脱ァミノ化さ れた DNAを細胞に導入すると、 DNA複製時にヒポキサンチンはシトシンと、 ゥラシ ルはアデニンとキサンチンはチミンと塩基対を形成するため、 「A:T」 が 「G: (；」 へ、 「G: (：」 が 「A:T」 へと置換する。 実際には亜硝酸処理した一本鎖 DNA断片を rgapped duplex DNA」 にハイブリダイズさせ、 以下、 合成ォリゴヌクレオチド指 定突然変異導入 （gapped duplex) 法と同様に操作して変異株を分離すればよい。 なお、 本願明細書または図面においてアミノ酸を表記するために用いられるァ ルフアベッ 卜の三文字あるいは一文字は、 各々次に示すアミノ酸を意味する。
(Gly/G) グリシン、 （Ala/A) ァラニン、 （Val/V) バリン、 (Leu/L) ロイ シン、 （I le/I) イソロイシン、 （Ser/S) セリン、 （Thr/T) スレオニン、
(Asp/D) ァスパラギン酸、 （Glu/E) グルタミン酸、 （Asn/N) ァスパラギン、
(Glu/Q) グルタミン、 （Lys/K) リジン、 （ArgZR) アルギニン、 （Cys/C) システィン、 （Met/M) メチォニン、 （Phe/F) フヱニルァラニン、 （Tyr/^Y) チロシン、 （TrpZW) トリブトファン、 （His/H) ヒスチジン、 （Pro/P) プロ リン。
前述した本発明の 「細胞表面分子」 を構成する 「ポリペプチド」 は、 細胞膜を 貫通する細胞膜貫通蛋白であり、 この細胞膜貫通ポリペプチドの 1または 2によ り該 「細胞表面分子」 が構成される。
ここで 「細胞膜貫通蛋白」 とは、 多くの受容体あるいは細胞膜表面分子に見ら れるように、 膜の脂質二重層を 1回または数回貫通する疎水性べプチド領域によ り膜と連結し、 全体として細胞外領域 (extracellular region)、 膜貫通領域 (tra nsmembrane region)及び細胞質領域（cytoplasmic region)の 3つの主領域から構 成される構造をとる蛋白を指す。 さらにそのような膜貫通性蛋白は、 モノマー（m onomer) として、 または、 同一のアミノ酸配列を有するもう 1本の鎖あるいは異 なるアミノ酸配列を有する鎖とともにそれぞれホモダイマー（homodimer) 、 へテ 口ダイマー（heterodimer) あるいはォリゴマー（origomer)を形成して存在するこ とにより、 各々の受容体や細胞表面分子を構成する。
本発明の 「ポリペプチド断片」 とは、 前述に定義した本発明の 「ポリべプチ ド」 のポリペプチド断片であり、 好ましくは該ポリペプチドの細胞外領域である。 該領域は所望応じその N末端及び/または C末端に 1乃至 5のァミノ酸が付加さ れていてもよい。
ここで 「細胞外領域」 とは、 前述のような細胞膜膜貫通蛋白の全体構造のうち、 該膜蛋白が連結している膜の外界側に存在する部分構造 （部分領域） の全部また は一部を意味し、 換言すれば、 膜内に取り込まれている領域 （膜貫通領域） 及び 該膜内の領域に引き続いて細胞質内に存在する領域 （細胞内領域） 以外の領域の 全部または一部を意味する。
本発明における 「ヒトの免疫グロブリン （I g) の重鎖の定常領域または定常 領域の一部」 とは、 前述のようなヒト由来の免疫グロブリンの重鎖 （Heavy Chai n, H鎖） の 定常領域 （Constant region)、 F c領域またはそれらの一部を意味 する。 該免疫グロブリンは、 どのようなクラス及びサブクラスに属する免疫グロ ブリンであってもよく、 具体的には、 I gG (I gG l、 I gG2、 I gG3及 び I gG4) 、 I gM、 I gA ( I gA 1及び I gA2)、 I gD及び IgEを 挙げることができる。 好ましくは、 I gG (I gGl、 I gG2s I gG3若し くは I gG4) または I gMである。 本発明における特に好ましい例としては、 ヒ卜由来の I gG (I gGl、 I gG2、 I gG3若しくは I gG4) に属する 免疫グロプリンである。
免疫グロブリンは、 2つの相同な軽鎖 （Light Chain, L鎖） と 2つの相同な 重鎖 （Heavy Chain, H鎖） の 4つの鎖が、 ジスルフィ ド結合 （S— S結合） で 結合した Y字形の構造単位を有する。 軽鎖は、 軽鎖可変領域 （VL) 及び軽鎖定常 領域 （CL) から構成される。 重鎖は、 重鎖可変領域 （VH) と重鎖定常領域 （C H) から構成される。 重鎖定常領域は、 クラス （I gG、 I gM、 I gA、 IgD及び I gE) 並び にサブクラス （I gGl、 I gG2s I gG3、 I gG4、 I gAl及び I gA 2) 毎に各々固有のアミノ酸配列を有するいくつかのドメインから構成される。
I gG (I gG I I gG2, I gG3及び I gG4) の重鎖は、 N末端から 順に、 VH、 CHIドメイン、 ヒンジ領域、 CH2ドメイン及び CH3ドメインから 構成される。
同様に I gGlの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cyi l ドメイン、 ヒンジ領 域、 Cy!2ドメイン及び C7 l3ドメインから構成される。 I gG2の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cァ 21 ドメイン、 ヒンジ領域、 Cァ 22ドメイン及び C ァ 23ドメインから構成される。 IgG3の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cァ 31 ドメイン、 ヒンジ領域、 Cy32ドメイン及び 33ドメインから構成され る。 I gG4の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cァ 41ドメイン、 ヒンジ領域、 Cr42ドメイン及び Cァ 43ドメインから構成される。
I gAの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cひ 1ドメイン、 ヒンジ領域、 Cひ 2ドメイン及び Cひ 3ドメインから構成される。
同様に I gAlの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cc^l ドメイン、 ヒンジ領 域、 Cc 2ドメイン及び Cc 3ドメインから構成される。 I gA2の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cひ 21 ドメイン、 ヒンジ領域、 Cひ 22ドメイン及び C ひ 23ドメインから構成される。
I gDの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C(51ドメイン、 ヒンジ領域、 2ドメイン及び C 33ドメインから構成される。
I gMの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C lドメイン、 ドメイン、 C〃3ドメイン及び C 4ドメインから構成され、 I gG、 1 八及び1 0に 見られるようなヒンジ領域を有しない。
I gEの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Ce lドメイン、 Ce2ドメイン、 C £ 3ドメイン及び C £ 4ドメインから構成され、 I gG、 1 八及び1§0に 見られるようなヒンジ領域を有しない。
さらに、 I gGを例に挙げるならば、 I gGをパパインで処理すると、 2つの 重鎖を連結させているヒンジ領域中に存在するジスルフィ ド結合のやや N末端側 で切断されて、 VH及び CH1からなる重鎖断片と 1つの軽鎖がジスルフィ ド結合 で連結した 2つの相同な Fa b、 並びにヒンジ領域、 CH2ドメイン及び CH 3ド メインからなる 2つの相同な重鎖断片がジスルフィ ド結合で連結した 1つの F c を生ずる （以上、 「免疫学イラス トレイテッド」 、 原書第 2版、 第 65〜75頁、 1 992年、 南江堂発行、 及び 「最新医科学の焦点 「免疫系の認識機構」 」 、 第 4 〜7頁、 1991年、 南江堂発行など参照） 。
即ち、 本発明における 「免疫グロブリンの重鎖の定常領域の一部」 とは、 上述 のような構造的特徴を有する免疫グロプリンの重鎖の定常領域一部を意味し、 好 ましくは、 C 1ドメインを欠く定常領域または F c領域である。 具体的には、 I gG、 I gAまたは I gDの場合には、 各々のヒンジ領域、 C2ドメイン及び C 3ドメインからなる領域が挙げられ、 I gMまたは I gEの場合には、 各々の C 2ドメイン、 C3ドメイン及び C 4ドメインからなる領域が挙げられる。 とりわ け好ましい例としては、 ヒト由来の I gG 1の F c領域を挙げることができる。 本発明の 「融合ポリペプチド」 とは、 前記の定義されるとおりの本発明の 「細 胞表面分子」 を構成する 「ポリペプチド」 の細胞外領域と 「ヒ卜の免疫グロプリ ン （I g) の重鎖の定常領域または定常領域の一部」 とからなる融合ポリべプチ ドである。 好ましくは本発明のポリペプチドの細胞外領域とヒト I gGの重鎖の 定常領域の一部との融合ポリぺプチドであり、 特に好ましくは本発明のポリぺプ チドの細胞外領域とヒト I gGの重鎖のヒンジ領域、 CH2ドメイン及び CH3ド メインからなる領域 （F c) との融合ポリペプチドである。 なお、 I gGとして は、 I gGlが好ましい。 また、 本発明のポリペプチドとしては、 ヒト、 マウス またはラッ ト （好ましくはヒト） に由来するポリペプチドが好ましい。
本発明の融合ポリべプチドは、 前述のような I gG等の免疫グロリンの定常領 域の一部 （例えば、 F c ) を融合パートナーとして有することから、 該免疫グロ プリン断片に特異的に結合するというプロティン Aの性質を用いたァフィ二ティ —カラムクロマトグラフィーを用いることにより該融合ポリべプチドを極めて容 易に精製することが可能であるという点で利点を有する。 さらに、 種々の免疫グ ロブリンの F cに対する種々の抗体が提供されていることから、 該 F cに対する 抗体を用いて、 該融合ポリべプチドのィムノアッセィを簡便に行うことができる。 本発明のポリペプチド、 ポリペプチド断片及び融合ポリペプチドは、 後述する ような遺伝子組換え技術のほか、 化学的合成法、 細胞培養方法等のような当該技 術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることに より製造することができる。
本発明の 「遺伝子」 は、 前述の本発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片 をコードする D N Aからなる遺伝子であって、 本発明のポリべプチドまたはポリ ベプチド断片をコ一ドし得るいかなる塩基配列を有する遺伝子をも包含する。 具体的な態様としては、 下記ポリペプチドまたはそのポリペプチド断片をコ一 ドする遺伝子である。
( 1 ) 配列番号 1に記載の塩基配列からなる D N Aにストリンジェントな条件下 でハイプリダイズする D N Aによりコ一ドされるポリべプチド。
( 2 ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列を有するポリべプチド。
( 3 ) 配列番号 2に記載されるァミノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列を有するポリペプチド （即ち、 「ヒト JTT-1抗原」 を構成するポ リベプチド及びその誘導体） 。
( 4 ) 配列番号 3の塩基番号 26乃至 625に記載の塩基配列によりコ一ドされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「ヒト JTT-1抗原」 を構成するポリペプチド及びその誘導体） 。
( 5 ) 配列番号 4の塩基番号 35乃至 637に記載の塩基配列によりコードされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「ラット JTT-1抗原」 を構成するポリペプチド及びその誘導体） 。
(6) 配列番号 5の塩基番号 1乃至 603に記載の塩基配列によりコードされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「マウス JTT-1抗原」 を構成するポリペプチド及びその誘導体） 。
(7) 配列番号 6の塩基番号 35乃至 685に記載の塩基配列によりコ一ドされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「ラヅ ト JTT- 1抗原の変異体」 を構成するポリペプチド及びその誘導 体） 。
(8) 国際寄託番号 FERM BP-5725識別される形質転換体に導入された本発明の細 胞表面分子を構成するポリべプチドをコードする DN Aによりコードされるアミ ノ酸配列または該ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプ チド （即ち、 「ヒト JTT-1抗原」 を構成するポリべプチド及びその誘導体） 。 ここで 「実質的に同一のアミノ酸配列を有する」 とは、 前記に定義したような 意味を有する。
さらに具体的な態様としては、 下記 DNAまたはその断片が挙げられる。
( 1 ) 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNA、 並びに該 DNAにストリン ジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNA。
( 4 ) 配列番号 3の塩基番号 26乃至 625に記載の塩基配列を含む D N A。
( 5 ) 配列番号 4の塩基番号 35乃至 637に記載の塩基配列を含む DNA。
( 6 ) 配列番号 5の塩基番号 1乃至 603に記載の塩基配列を含む D NA。
( 7 ) 配列番号 6の塩基番号 35乃至 685に記載の塩基配列を含む D NA。
(8) 国際寄託番号 FERM BP- 5725識別される形質転換体に導入された本発明の細 胞表面分子を構成するポリペプチドをコードする D N A。
また、 本発明における融合ポリべプチドの一部である免疫グロプリンの重鎖の 定常領域の一部をコードする DNAとしては、 cDNAであっても良いし、 また 各ェクソン （例えば、 CHI ドメイン、 ヒンジ領域、 CH2ドメイン、 CH3ドメイ ン、 CH4ドメインなどをコードする DNA) の間にイントロンを含むようなゲノ ミヅク DN Aであっても良い。
本発明においては、 同一のアミノ酸をコードするコドンであればどのようなコ ドンから構成される DN Aを含む。
また、 本発明の DNAは、 いかなる方法で得られるものであってもよい。 例え ば mRNAから調製される相補 DNA (cDNA)、 ゲノム DNAから調製され る DNA、 化学合成によって得られる DNA、 RNAまたは DNAを錡型として P CR法で増幅させて得られる DN Aおよびこれらの方法を適当に組み合わせて 構築される DN Aをも全て包含するものである。
本発明のポリべプチドをコ一ドする DNAは、 常法に従って本発明のポリぺプ チドの mRNAから cDNAをクローン化する方法、 ゲノム DN Aを単離してス プライシング処理する方法、 化学合成する方法等により取得することができる。
( 1 ) 例えば、 本発明のポリぺプチドの mRNAから cDN Aをクローン化す る 方法としては、 以下の方法が例示される。
まず、 本発明の細胞表面分子 （ポリペプチド） を発現 ·産生する組織あるいは 細胞 （例えば、 胸腺細胞や ConA刺激した脾臓由来リンパ芽球細胞） から該本発明 のポリペプチドをコードする mRNAを調製する。 mRNAの調製は、 例えばグ ァニジンチオシァネート法 （Chirgwin J.M. et al, Biochemistry, Vol.18, p.5 294, 1979) 、 熱フヱノール法もしくは AGPC法等の公知の方法を用いて調製し た全 RNAをオリゴ （dT) セルロースやポリ U—セファロ一ス等によるァフィ 二テイクロマトグラフィ一にかけることによって行うことができる。
次いで得られた mRNAを踌型として、 例えば逆転写酵素を用いる等の公知の 方法、 例えばォカャマらの方法 （モレキュラーセルバイオロジー （Mol. Cell. Bio 1.) 、 第 2卷、 第 161頁、 1982年及び同誌 第 3卷、 第 280頁、 198 3年） やホフマン （Hoffman) らの方法 （ジーン （Gene) 、 第 25卷、 第 263 頁、 1 9 8 3年） 等により c D N A鎖を合成し、 c D N Aの二本鎖 c D N Aへの 変換を行う。 この c D N Aをプラスミ ドベクタ一、 ファージベクターまたはコス ミ ドベクタ—に組み込み、 大腸菌を形質転換して、 あるいはインビトロパッケ一 ジング後、 大腸菌に形質移入 （トランスフエクト） することにより c D NAライ ブラリーを作製する。
ここで用いられるプラスミ ドベクタ一としては、 宿主内で複製保持されるもの であれば特に制限されず、 また用いられるファージベクタ一としても宿主内で増 殖できるものであれば良い。 常法的に用いられるクロ一ニング用べクタ一として pME18S、 ΛΖΑΡΙ Ι ( 1ZAPI I) 、 pUC19、 え gtlO、 人 gtll等が例示される。 ただし、 後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、 宿主内で本発明のポリぺプチド をコードする遺伝子を発現させうるプロモー夕一を有したベクタ一であることが 好ましい。
プラスミ ドに c D N Aを組み込む方法としては、 例えばマニアテイス （Maniat is) らの方法 （モレキュラークロ一ニング、 ァ 'ラボラトリー ·マニュアル （Mo lecular Cloning, A Laboratory Manual , second edition) 、 コ——ノレドスプリン グハ一バーラボラトリー （Cold Spring Harbor Laboratory) 、 第 1.53頁、 1 9 8 9年） に記載の方法などが挙げられる。 また、 ファージベクタ一に c D N A を組み込む方法としては、 ヒユン （Hyunh) らの方法 （D N Aクロ一ニング、 プ ラクティカルアプローチ （DNA Cloning, a practical approach) 、 第 1卷、 第 49 頁、 1 9 8 5年） などが挙げられる。 簡便には、 市販のクロ一ニングキット （例 えば、 宝酒造製等） を用いることもできる。 このようにして得られる組換えブラ スミ ドゃファージベクタ一は、 原核細胞 （例えば、 E . c 0 1 ί ： XLlBlue MRF\ DH5ひ、 HB101または MC1061/P3等） 等の適当な宿主に導入する。
プラスミ ドを宿主に導入する方法としては、 （モレキュラークロ一ニング、 ァ • ラホフ 卜 リ一 · マ二ユアノレ (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, seco nd edition) 、 コールドスプリングハーバ一ラボラトリ一 （Cold Spring Harbor Laboratory) 、 第 1.74頁、 1989年） に記載の塩化カルシウム法または塩化 カルシウム/塩化ルビジウム法、 エレクトロボレ一シヨン法等が挙げられる。 ま た、 ファージベクタ一を宿主に導入する方法としてはファージ DNAをインビト 口パッケージングした後、 増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。 イン ビトロパッケージングは、 市販のインビトロパッケージングキヅト （例えば、 ス トラ夕ジーン製、 アマシャム製等） を用いることによって簡便に行うことができ る。
上記の方法によって作製された cDNAライブラリーから、 本発明のポリぺプ チドをコ一ドする cDNAを単離する方法は、 一般的な cDNAスクリーニング 法を組み合わせることによって行うことができる。
例えば、 別個に本発明のポリべプチドのアミノ酸配列に対応すると考えられる オリゴヌクレオチドを化学合成したのち、 これを32 Pでラベルしてプローブとな し、 公知のコロニーハイブリダィゼ一シヨン法 （クランシュ夕イン （Crunstein) ら 、 プロシーデイングスォブナショナルアカデミーォブサイエンス （Proc. Nat 1. Acid. Sci. USA) 、 第 72卷、 第 3961頁、 1975年） またはプラークハ イブ Uタイセ一シヨン法 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual , second e dition， Cold Spring Harbor Laboratory、 第 2.108頁、 1989年） により、 目的の c DNAを含有するクローンをスクリーニングする方法、 P CRプライマ 一を作製し本発明のポリぺプチドの特定領域を P C R法により増幅し、 該領域を コードする DN A断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。
また、 cDNAを発現しうるべクタ一 （例えば、 人 ZAPIIファージベクタ一） を 用いて作製した cDNAライブラリーを用いる場合には、 本発明のポリべプチド に反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、 目的のクローンを選択 することができる。 大量にクローンを処理する場合には、 PCR法を利用したス クリ一ニング法を用いることが好ましい。
この様にして得られた DN Aの塩基配列はマキサム ·ギルバート法 （マキサム (Maxam) ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 第 74卷、 第 560頁、 1977 年） あるいはファージ M 13を用いたジデォキシヌクレオチド合成鎖停止の方法 (サンガー （Sanger) ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 第 74卷、 第 546
3〜5467頁、 1977年） によって決定することができる。 本発明のポリべ プチドをコードする遺伝子は、 その全部または一部を上記のようにして得られる クローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
(2) また、 前述のような本発明のポリペプチドを発現する細胞に由来するゲ ノム DN Aから本発明のポリべプチドをコ一ドする DN Aを単離することによる 調製方法としては、 例えば以下の方法が例示される。
該細胞を好ましくは S D Sまたはプロテナ一ゼ K等を用いて溶解し、 フエノー ルによる抽出を反復して DN Aの脱蛋白質を行う。 RN Aを好ましくはリボヌク レアーゼにより消化する。 得られる D N Aを適当な制限酵素により部分消化し、 得られる DN A断片を適当なファージまたはコスミ ドで増幅しライブラリーを作 成する。 そして目的の配列を有するクローンを、 例えば放射性標識された DNA プローブを用いる方法等により検出し、 該クロ一ンから本発明のポリべプチドを コ一ドする遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
ヒト由来のポリべプチドをコ一ドする cDNAを取得する場合には、 さらにヒ トゲノム DNA (染色体 DNA) が導入されたコスミ ドライスラリーを作製 ( 「ラボマニュアルヒトゲノムマッピング」 、 丸善出版） し、 該コスミ ドライブ ラリーをスクリーニングすることにより、 目的タンパクのコ一ディング領域の D NAを含む陽性クローンを得、 該陽性クローンから切り出したコーディング DN Aをプローブとして用い、 前述の cDNAライブラリ一をスクリーニングするこ とにより調製することもできる。
(3) また、 化学的合成による本発明の DNAの製造は、 配列番号 1、 3、 4. 5または 6に記載される塩基配列をもとにして、 常法に従って行うことができる。 さらに本発明は、 上述の本発明の細胞表面分子 （ポリペプチド） をコードする D N Aを含有する組換えべクタ一に関する。 本発明の組換えべクタ一としては、 原核細胞及び/または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できる ものであれば特に制限されず、 プラスミ ドベクターおよびファージベクタ一が包 含される。
当該組換えべクタ一は、 簡便には当業界において入手可能な組換え用べクタ一 (プラスミ ド D N Aおよびバクテリアファージ D N A ) に本発明のポリペプチド をコードする D N Aを常法により連結することによって調製することができる。 用いられる組換え用べクタ一として具体的には、 大腸菌由来のプラスミ ドとして 例えば pBR322、 pBR325、 pUC12、 pUC13、 pUC19など、 酵母由来プラスミ ドとして例 えば pSH19、 pSH15など、 枯草菌由来プラスミ ドとして例えば pUB110、 pTP5、 pC19 4などが例示される。 また、 ファージとしては、 人ファージなどのパクテリ オフ ァージが、 さらにレトロウイルス、 ヮクシニヤウィルス、 核多角体ウィルスなど の動物や昆虫のウィルス （pVL1393、 インビトロゲン製） が例示される。
本発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aを発現させ本発明のポリべプチドを 生産させる目的においては、 発現ベクターが有用である。 発現べクタ一としては、 原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のポリべプチドを コードする遺伝子を発現し、 これら蛋白質を生産する機能を有するものであれば 特に制限されない。 例えば、 pEFneo (Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 91 , 158-16 2, 1994) 、 pEF-BOS (Nucleic Acid Research, 18， 5322, 1990)、 pME18S (実験 医学別冊 「遺伝子工学ハンドブック」 、 1 9 9 2年等） あるいは pMAL C2 等を挙 げることができる。
宿主細胞として細菌、 特に大腸菌を用いる場合、 一般に発現べクタ一は少なく ともプロモ一夕一/オペレータ一領域、 開始コドン、 本発明のポリペプチドをコ —ドする D N A、 終止コ ドン、 夕一ミネ一夕一領域および複製可能単位から構成 される。
宿主として酵母、 動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、 発現べク夕一は少な くともプロモ一夕一、 閧始コドン、 本発明のポリペプチドをコードする DNA、 終止コドンを含んでいることが好ましい。 またシグナルべプチドをコードする D NA、 ェンハンサ一配列、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の 5， 側お よび 3， 側の非翻訳領域、 スプライシング接合部、 ポリアデニレーシヨン部位、 選択マーカ一領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。 また、 目的に応 じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子 （マーカ一） を含んでいてもよい。
細菌中で本発明のポリべプチドを発現させるためのプロモ一夕一/ォペレ一夕 一領域は、 プロモーター、 オペレーターおよび Shine- Dalgarno(SD) 配列 （例え ば、 AAGGなど） を含むものである。 例えば宿主がェシヱリキア属菌の場合、 好適には T r pプロモ一夕一、 lacプロモ一夕一、 ： re c Aプロモ一夕一、 人 PLプロモー夕一、 lppプロモ一夕一、 t a cプロモ一夕一などを含むものが 例示される。 酵母中で本発明のポリべプチドを発現させるためのプロモーターと しては、 PH05プロモ一夕一、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 A DHプロモー夕一が挙げられ、 宿主がバチルス属菌の場合は、 SL01プロモ一 夕一、 SP02プロモーター、 p e nPプロモー夕一などが挙げられる。 また、 宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、 S V40由来のプロモーター、 レ トロウィルスのプロモーター、 ヒートショックプロモ一夕一、 EFプロモーター などが挙げられる。 好ましくは、 SV— 40、 SRひ、 レトロウイルスである。 しかし、 特にこれらに限定されるものではない。 また、 発現にはェンハンサ一の 利用も効果的な方法である。
好適な開始コドンとしては、 メチォニンコドン （ATG) が例示される。 終止コドンとしては、 常用の終止コドン （例えば、 TAG、 TGAs TAAな ど） が例示される。
夕一ミネ一夕一領域としては、 通常用いられる天然または合成の夕一ミネ一夕 —を用いることができる。
複製可能単位とは、 宿主細胞中でその全 DN A配列を複製することができる能 力をもつ DNAを言い、 天然のプラスミ ド、 人工的に修飾されたプラスミ ド （天 然のプラスミ ドから調製された DNAフラグメント） および合成プラスミ ド等が 含まれる。 好適なプラスミ ドとしては、 E. coli ではプラスミ ド pBR 322、 もしくはその人工的修飾物 （pBR 322を適当な制限酵素で処理して得られる DNAフラグメント） が、 酵母では酵母 2〃プラスミ ド、 もしくは酵母染色体 D NAが、 また哺乳動物細胞ではプラスミ ド pEFneo、 pME18S、 pRSVneo ATCC 37198、 プラスミ ド pSV2dhfr ATCC 37145、 プラスミ ド pdBPV- MMTneo ATCC 37224、 プラス ミ ド pSV2neo ATCC 37149等があげられる。
ェンハンサー配列、 ポリアデニレーシヨン部位およびスプライシング接合部位 については、 例えばそれぞれ SV40に由来するもの等、 当業者において通常使 用されるものを用いることができる。
選択マ一力一としては、 通常使用されるものを常法により用いることができる 例えばテトラサイクリン、 ネオマイシン、 アンビシリン、 またはカナマイシン等 の抗生物質耐性遺伝子等あるいはチミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
遺伝子増幅遺伝子としては、 ジヒドロ葉酸レダク夕一ゼ （DHFR) 遺伝子、 チミジンキナーゼ遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子、 グルタミン酸合成酵素遺伝 子、 アデノシンデァミナ一ゼ遺伝子、 オル二チンデカルボキシラ一ゼ遺伝子、 ヒ グロマイシン一 B—ホスホトランスフェラ一ゼ遺伝子、 ァスパルラート トランス 力ルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
本発明の発現ベクターは、 少なくとも、 上述のプロモー夕一、 開始コドン、 本 発明のポリペプチドをコードする DNA (遺伝子）、 終止コドンおよび夕一ミネ —夕一領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製 することができる。 またこの際、 所望により制限酵素での消化や T4DNAリガ —ゼを用いるライゲーシヨン等の常法により適当な DN Aフラグメント （例えば、 リンカ一、 他のリストリクシヨンサイ トなど） を用いることができる。
本発明の形質転換細胞は、 上述の発現べクタ一を宿主細胞に導入することによ り調製することができる。
本発明で用いられる宿主細胞としては、 前記の発現ベクターに適合し、 形質転 換されうるものであれば特に限定されず、 本発明の技術分野において通常使用さ れる天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞 （例えば、 細 菌 （ェシエリキア属菌、 バチルス属菌） 、 酵母 （サッカロマイセス属、 ピキア属 など） 、 動物細胞または昆虫細胞など） が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、 具体的には大腸菌 （DH5ひ、 XL lBlue MRF\ TB 1、 HB 101等） 、 マウス由来細胞 （COP、 L、 C 127、 S p 2/0、 NS— 1または N I H3 T3等） 、 ラッ ト由来細胞、 ハムス夕一由来 細胞 （BH K、 CH0-K1および CHO等） 、 サル由来細胞 （COS 1、 COS 3、 COS 7、 CV 1および Ve 1 o等） およびヒ卜由来細胞 （HEK293、 He la、 2倍体線維芽細胞に由来する細胞、 ミエローマ細胞および Nama lwa等） な どが例示される。
発現ベクターの宿主細胞への導入 （形質転換 （形質移入） ） は従来公知の方法 を用いて行うことができる。
例えば、 細菌 (E.coliヽ Bacillus subtil is等） の場合は、 例えば Cohenらの方 法 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 第 69卷、 第 2110頁、 1972年 ） 、 プロトプラスト法 （Mol. Gen. Genet.、 第 168巻、 第 111頁、 197 9 年） やコンビテント法 （ジャーナルォブモレキュラーバイオロジー （J. Mol. Bi ol.)、 第 56卷、 第 209頁、 1971年） によって、 Saccharomyces cerevis iaeの場合は、 例えばハイネン （Hinnen) らの方法 （Proc. Natl. Acad. Sci. US A.、 第 75巻、 第 1927頁、 1978年） やリチウム法 （J. Bacteriol.、 第 1 53卷、 第 163頁、 1983年） によって、 動物細胞の場合は、 例えばグラハ ム （Graham) の方法 （バイロロジ一 （Virology) 、 第 52卷、 第 456頁、 19 73年） 、 昆虫細胞の場合は、 例えばサマーズ （Summers) らの方法 （Mol. Cell. Biol., 第 3卷、 第 2156〜第 2165頁、 1983年） によってそれぞれ形 質転換することができる。
本発明のポリべプチドは、 上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換 細胞 （以下、 形質移入体を包含する意味で使用する。 ） を栄養培地で培養するこ とによって製造することができる。
栄養培地は、 宿主細胞 （形質転換体） の生育に必要な炭素源、 無機窒素源もし くは有機窒素源を含でいることが好ましい。 炭素源としては、 例えばグルコース、 デキス トラン、 可溶性デンプン、 ショ糖などが、 無機窒素源もしくは有機窒素源 としては、 例えばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 アミノ酸、 コーンスチ一プ ' リ 力一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などが例示さ れる。 また所望により他の栄養素 （例えば、 無機塩 （例えば塩化カルシウム、 リ ン酸ニ水素ナトリウム、 塩化マグネシウム） 、 ビタミン類、 抗生物質 （例えばテ トラサイクリン、 ネオマイシン、 アンピシリン、 カナマイシン等） など） を含ん でいてもよい。
培養は当業界において知られている方法により行われる。 培養条件、 例えば温 度、 培地の p Hおよび培養時間は、 本発明のポリペプチドが大量に生産されるよ うに適宜選択される。
なお、 下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示 するが、 何らこれらに限定されるものではない。
宿主が細菌、 放線菌、 酵母、 糸状菌である場合、 例えば上記栄養源を含有する 液体培地が適当である。 好ましくは、 p Hが 5〜 8である培地である。
宿主が E. coli の場合、 好ましい培地として L B培地、 M 9培地 （ミラー （Mi ller) ら、 Exp. Mol. Genetヽ Cold Spring Harbor Laboratory^ 第 4 3 1頁、 1 9 7 2年） 等が例示される。 かかる場合、 培養は、 必要により通気、 撹拌しなが ら、 通常 1 4〜4 3 °C、 約 3〜 2 4時間行うことができる。
宿主が Bacillus属菌の場合、 必要により通気、 撹拌をしながら、 通常 3 0〜4 0 °C、 約 1 6〜9 6時間行うことができる。 宿主が酵母である場合、 培地として、 例えば Burkholder最小培 （ボスチアン (Bostian)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 77卷、 第 4505頁、 198 0年） が挙げられ、 pHは 5〜8であることが望ましい。 培養は通常約 20〜3 5°Cで約 14〜144時間行なわれ、 必要により通気や撹拌を行うこともできる。 宿主が動物細胞の場合、 培地として例えば約 5〜20%の胎児牛血清を含む M EM培地 （サイエンス （Science)、 第 122卷、 第 501頁、 1952年） 、 D MEM培地 （バイロロジー （Virology) 、 第 8巻、 第 396頁、 1959 年） 、 RPM I 1640培地 （J. Am. Med. Assoc.、 第 199卷、 第 519頁、 196 7年） 、 199培地 （proc. Soc. Exp. Biol. Med.、 第 73卷、 第 1頁、 195 0年） 等を用いることができる。 培地の pHは約 6〜 8であるのが好ましく、 培 養は通常約 30〜40°Cで約 15〜72時間行なわれ、 必要により通気や撹拌を 行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、 例えば胎児牛血清を含む Grace's培地 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 82卷、 第 8404頁、 1985年） 等が挙げられ、 その p Hは約 5〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 20〜40°Cで 15〜 100時 間行なわれ、 必要により通気や撹拌を行うこともできる。
本発明のポリペプチドは、 上述のような形質転換細胞、 特に動物細胞を培養す ることにより、 その細胞表面に目的分子を高発現させることが可能である。
一方、 本発明のポリペプチドを、 細胞外領域断片のような可溶性ポリペプチド 断片として製造する場合には、 当該細胞外領域あるいは各ドメインをコードする DN Aを用いて上述のように形質転換体を調製し、 外形質転換体を培養すること により培養上清中に分泌させることにより製造することができる。 また、 本発明 の融合ポリペプチドについても同様にして作製することができる。
すなわち、 得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液 （上清） を得、 該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に 用いられる常法に従って該本発明のポリぺプチドまたはポリべプチド断片を精製、 単離する。
単離、 精製方法としては、 例えば塩析、 溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、 透析、 限外濾過、 ゲル濾過、 ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミ ドゲル 電気泳動など分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーゃヒド ロキシルァパタイ トクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、 ァフィニテ ィ一クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口 マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動などの等電点 の差を利用する方法などが挙げられる。
一方、 本発明のポリべプチドまたはポリべプチド断片が培養された形質転換体 のペリブラズムまたは細胞質内に存在する場合は、 培養物を濾過または遠心分離 などの常法に付して菌体あるいは細胞を集め、 適当な緩衝液に懸濁し、 例えば超 音波ゃリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁および/または細胞 膜を破壊した後、 遠心分離やろ過などの方法で本発明のポリべプチドを含有する 膜画分を得る。 該膜画分をトライ トン一 X 1 0 0等の界面活性剤を用いて可溶化 して粗溶液を得る。 そして、 当該粗溶液を先に例示したような常法を用いること により、 単離、 精製することができる。
本発明における 「トランスジエニックマウス」 は、 上述のような方法に従って 調製できる本発明のマウス以外の動物種のポリべプチド （非自己のポリべプチ ド） をコードする D N A ( c D N Aまたはゲノミック D NA ) がマウスの内在性 遺伝子座上にインテグレート （integrate) されているトラ ンスジエニックマウ スマウスであり、 該トランスジエニックマウスは、 体内に該非自己のポリべプチ ドを発現、 分泌する。
該トランスジエニックマウスは、 トランスジエニック動物の製造において通常 使用されるような常法 （例えば、 最新動物細胞実験マニュアル、 エル，アイ -シ —発行、 第 7章、 第 3 6 1〜第 4 0 8頁、 1 9 9 0年を参照） に従って作製する ことが可能である。 具体的には、 例えば、 正常マウス胚盤胞 （blastcyst) のか ら取得した胚性幹 細胞 （Embryonic Stem Cell, ES Cell) を、 例えば、 ヒト由来の本発明のポリべ プチド （即ち 「ヒト JTT-1抗原」 ） をコードする 遺伝子が発現可能なように挿入 された発現べクタ一で形質転換する。 該本発明のヒト由来のポリペプチドをコ一 ドする遺伝子が内在性遺伝子上にィンテグレートされた E S細胞を常法により選 別する。 次いで、 選別した E S細胞を、 別の正常マウスから取得した受精卵 （肺 盤胞） にマイクロインジェクションする （Proc. Natl . Acad. Sci . USA, Vol .77, No.12, pp.7380-7384, 1980；米国特許第 4, 873, 191号公報） 。 該胚盤胞を仮親と しての別の正常マウスの子宮に移植する。 そうして該仮親マウスから、 フアウン ダーマウス （子マウス） が生まれる。 該フアウンダーマウスを正常マウスと交配 させることによりヘテロトランスジエニックマウスを得る。 該ヘテロ （heteroge neic) トランスジエニックマウス同士を交配することにより、 メンデルの法則に 従って、 ホモ （homogeneic) トランスジエニックマウスが得られる。
本発明の 「ノックアウトマウス」 は、 マウス由来の本発明のポリペプチド （即 ち 「マウス JTT- 1抗原） をコードする内在性遺伝子がノックアウト （不活性化） さ れたマウスであり、 例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクシ ヨン法を用いて作製することができる （米国特許第 5,464, 764号公報、 同 5,487, 9 92号公報、 同 5，627, 059号公報、 Proc. Natl . Acad. Sci . USA, Vol .86, 8932-89 35, 1989、 Nature, Vol .342, 435-438, 1989など） 。
本発明における 「抗体」 とは、 ポリクロ一ナル抗体 （抗血清） あるいはモノク ローナル抗体を意味し、 好ましくはモノクローナル抗体である。
具体的には、 前述の本発明のポリべプチドまたはポリべプチド断片に反応性を 有する抗体である。
本発明の 「抗体」 は、 本発明の 「細胞表面分子」 を発現する細胞 （天然の細胞、 株化細胞、 腫瘍細胞など） 、 遺伝子組換技術を用いて作製される本発明のポリべ プチドまたは細胞表面分子をその細胞表面に高発現させた形質転換体、 あるいは 本発明の 「ポリペプチド断片」 若しくは 「融合ポリペプチド」 を抗原として、 該 抗原をマウス、 ラット、 ハムスター、 モルモッ トあるいはゥサギ等の哺乳動物に 免疫して得られる天然型抗体、 遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体 及びヒト型抗体 （CDR- grafted抗体） 、 並びにヒト抗体産生トランスジエニック動 物等を用いて製造され得るヒト抗体も包含する。
またモノクローナル抗体の場合には、 I g G、 I g M、 I g As I g Dあるい は I g E等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。 好ましくは、 I g Gまたは I g Mである。
本発明で言うポリクロ一ナル抗体 （抗血清） あるいはモノクローナル抗体は、 既存の一般的な製造方法によって製造することができる。 即ち、 例えば、 前述の ような抗原を、 必要に応じてフロイントアジュバント （Freund' s Adjuvant) とと もに、 哺乳動物、 好ましくは、 マウス、 ラット、 ハムス夕一、 モルモット、 ゥサ ギ、 ネコ、 ィヌ、 ブ夕、 ャギ、 ゥマあるいはゥシ、 より好ましくはマウス、 ラッ ト、 ハムスター、 モルモットまたはゥサギに免疫する。
ポリクロ一ナル抗体は、 該免疫感作動物から得た血清から取得することができ る。 またモノクローナル抗体は、 該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己 抗体産生能のない骨髄腫系細胞 （ミエローマ細胞） からハイプリ ドーマを調製し、 該ハイプリ ドーマをクローン化し、 哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的 親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製 造される。
モノクロ一ナル抗体は、 具体的には下記のようにして製造することができる。 即ち、 前述のような抗原を免疫原とし、 該免疫原を、 必要に応じてフロイントァ ジュバント （Freund' s Adjuvant) とともに、 非ヒト哺乳動物、 具体的 には、 マ ウス、 ラッ ト、 ハムス夕一、 モルモ ッ トあるいはゥサギ、 好ましくは マウス、 ラッ トあるいはハムス夕一 （後述するヒ卜抗体産生トランスジエニックマウスの ような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジエニック動物 を含む） の皮下内、 筋肉内、 静脈内、 フッ ドパッド内あるいは腹腔内に 1乃至数 回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。 通常、 初回免疫から 約 1乃至 1 4日毎に 1乃至 4回免疫を行って、 最終免疫より約 1乃至 5日後に免 疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。 免疫を施す回数及び時 間的インターバルは、 使用する免疫原の性質などにより、 適宜変更することがで きる。 モノクローナル抗体を分泌するハイプリ ドーマの調製は、 ケーラ一及び ミルシュ夕インらの方法 （ネィチヤ一 (Nature), 第 2 5 6卷、 第 4 9 5〜第 4 9 7頁、 1 9 7 5年） 及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。 即ち、 前述の如く免疫感作された非ヒト哺乳動物から取得される脾臓、 リンパ節、 骨髄 あるいは扁桃等、 好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、 好ましくはマウス、 ラット、 モルモット、 ハムス夕一、 ゥサギまたはヒト等の哺乳動物、 より好まし くはマウス、 ラッ トまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエ口一マ細胞との 細胞融合させることにより調製される。
細胞融合に用いられるミエ口一マ細胞としては、 例えばマウス由来ミエ口一マ P3/X63-AG8.653 ( 6 5 3 ) 、 P3/NSI/l-Ag4-l ( N S— 1 )、 P3/X63-Ag8.Ul ( P 3 U 1 )、 SP2/0-Agl4 ( S p 2 / 0 , S p 2 )、 PAI、 FOあるいは BW5147、 ラヅ 卜由来ミエ口一マ 210RCY3-Ag.2. 3.、 ヒト由来ミエローマ U- 266AR1、 GM1500-6TG- A卜 2、 UC729-6, CEM-AGR D1R11あるいは CEM-T15を使用することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリ ド—マクローンのスクリ—ニングは、 ハイプリ ドーマを、 例えばマイクロ夕イタ一プレート中で培養し、 増殖の見られ たゥエルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、 例え ば R I Aや E L I S A等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうこ とができる。
ハイプリ ドーマからのモノクローナル抗体の製造は、 ハイプリ ドーマをインビ トロ、 またはマウス、 ラット、 モルモット、 ハムスターまたはゥサギ等、 好まし くはマウスまたはラヅト、 より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、 得られた培養上清、 または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことがで きる。
インビトロで培養する場合には、 培養する細胞種の特性、 試験研究の目的及び 培養方法等の種々条件に合わせて、 ハイプリ ドーマを増殖、 維持及び保存させ、 培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養 培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施 することが可能である。
基本培地としては、 例えば、 Ham， F 12培地、 MCDB 153培地あるい は低カルシウム MEM培地等の低カルシウム培地及び M CD B 104培地、 ME M培地、 D— MEM培地、 RPMI 1640培地、 A S F 104培地あるいは R D培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、 該基本培地は、 目的に応じて、 例え ば血清、 ホルモン、 サイ ト力イン及び/または種々無機あるいは有機物質等を含 有することができる。
モノクローナル抗体の単離、 精製は、 上述の培養上清あるいは腹水を、 飽和硫 酸アンモニゥム、 ュ一グロブリン沈澱法、 力プロイン酸法、 力プリル酸法、 ィォ ン交換クロマトグラフィー （DEAEまたはDE 52等） 、 抗ィムノグロブリン カラムあるいはプロティン Aカラム等のァフィ二ティカラムクロマトグラフィー に供すること等により行うことができる。
本発明のモノクローナル抗体としては、 好ましくは下記のモノクローナル抗体 が挙げられる。
(1) 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 該ポリべ プチドに由来するポリべプチド断片または該ポリぺプチドから構成されるヒト由 来の細胞表面分子に反応性を有するモノクローナル抗体。
(2) 本発明のポリペプチド、 該ポリペプチドに由来するポリペプチド断片ま たは該ポリべプチドにより構成される細胞表面分子に反応性を有するモノクロ一 ナル抗体であって、 該モノクローナル抗体のマイ トジェン （mitogen) で刺激した リンパ芽球細胞への作用が、 国際寄託番号 FERM BP-5707で識別されるハイプリ ド —マが産生するモノクローナル抗体がマイ 卜ジヱンで刺激したラットリンパ芽球 細胞に示す作用と実質的に同一であるモノクローナル抗体。
( 3 ) 本発明のポリペプチド、 該ポリペプチドに由来するポリペプチド断片ま たは該ポリべプチドにより構成される細胞表面分子に反応性を有するモノクロ一 ナル抗体であって、 該モノクローナル抗体のマイ トジェン （mitogen) で刺激した リンパ芽球細胞への作用が、 国際寄託番号 FERM BP-5708で識別されるハイプリ ド 一マが産生するモノクローナル抗体がマイ トジェンで刺激したラットリンパ芽球 細胞に示す作用と実質的に同一であるモノクローナル抗体。
また、 本発明のモノクローナル抗体には、 国際寄託番号 FERM BP- 5707及び FE RM BP-5708で各々識別されるのハイプリ ド一マが産生するモノクロ一ナル抗体も 包含する。
本発明における 「キメラモノクローナル抗体」 は、 遺伝子工学的に作製される モノクローナル抗体であって、 具体的には、 その可変領域が、 非ヒト哺乳動物 (マウス、 ラッ ト、 ハムス夕一など） のィムノグロブリン由来の可変領域であり、 かつその定常領域がヒ卜ィムノグロプリン由来の定常領域であることを特徴とす るマウス/ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノクローナル抗体を意味 する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、 I g G ( IgGl, IgG2, IgG35 IgG4)、 I g M、 I g A、 I g D及び I g E等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸 配列を有するが、 本発明における組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はい ずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。 好ましくは、 ヒト I g Gの定常領域である。
本発明におけるキメラモノクローナル抗体は、 例えば以下のようにして製造す ることができる。 しかしながら、 そのような製造方法に限定されるものでないこ とは言うまでもない。 例えば、 マウス/ヒトキメラモノクローナル抗体は、 実験医学 （臨時増刊号） 、 第 1. 6卷、 第 10号、 1988年及び特公平 3— 73280号公報等を参照し ながら作製することができる。 即ち、 マウスモノクローナル抗体を産生するハイ プリ ドーマから単離した該マウスモノクローナル抗体をコ一ドする DNAから取 得した活性な VH遺伝子 （ H鎖可変領域をコードする再配列された V D J遺伝 子） の下流に、 ヒトイムノグロムリンをコードする DNAから取得した CH遺伝 子 （H鎖定常領域をコードする C遺伝子） を、 また該ハイプリ ドーマから単離し たマウスモノクローナル抗体をコードする DN Aから取得した活性な VL遺伝子
( L鎖可変領域をコードする再配列された V J遺伝子） の下流にヒ卜ィムノグロ ムリンをコードする DN Aから取得した CL遺伝子 （L鎖定常領域をコードする C 遺伝子） を、 各々発現可能なように配列して 1つ又は別々の発現べクタ一に挿入 し、 該発現べクタ一で宿主細胞を形質転換し、 該形質転換細胞を培養することに より作製することができる。
具体的には、 まず、 マウスモノクローナル抗体産生ハイブリ ド一マから常法に より DNAを抽出後、 該 DNAを適切な制限酵素 （例えば EcoRI、 Hind III等） を用いて消化し、 電気泳動に付して （例えば 0. 7%ァガロースゲル使 用） サザンブロット法を行う。 泳動したゲルを例えばェチジゥムブ口マイ ド等で 染色し、 写真撮影後、 マーカ一の位置を付し、 ゲルを 2回水洗し、 0. 25M HC 1溶液に 15分間浸す。 次いで、 0. 4Nの NaOH溶液に 10分間浸し、 その間緩やかに振盪する。 常法により、 フィル夕一に移し、 4時間後フィル夕一 を回収して 2XSSCで 2回洗浄する。 フィル夕一を十分乾燥した後、 ペイキン グ （75°C、 3時間） を行う。 ペイキング終了後に、 該フィル夕一を 0. 1 XS SC/0. 1%SDS溶液に入れ、 65°Cで 30分間処理する。 次いで、 3xS SC/0. 1%SDS溶液に浸す。 得られたフィルターをプレハイブリダィゼ一 シヨン液と共にビニール袋に入れ、 65°Cで 3〜4時間処理する。
次に、 この中に32 P標識したプロ一ブ D N A及びハイブリダイゼーション液を 入れ、 65°Cで 12時間程度反応させる。 ハイブリダィゼーシヨン終了後、 適切 な塩濃度、 反応温度および時間 （例えば、 2 X S S C— 0. 1 %SDS溶液、 室 温、 10分間） のもとで、 フィルターを洗う。 該フィルターをビニール袋に入れ、 2 X S S Cを少量加え、 密封し、 オートラジオグラフィ一を行う。
上記サザンブロヅト法により、 マウスモノクローナル抗体の H鎖及び L鎖を各 々コ一ドする再配列された VD J遺伝子及び V J遺伝子を同定する。 同定した D NA断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画し、 ファージベクター （例え ば、 Charon 4A、 Charon 28、 λΕΜΒ L 3 人 EMBL4等） に組み込み、 該 ファージベクタ—で大腸菌 （例えば、 LE392、 NM539等） を形質転換し、 ゲノム ライブラリ一を作製する。 そのゲノムライブラリ一を適当なプロ一ブ （H鎖 J遺 伝子、 L鎖 （ ） J遺伝子等） を用いて、 例えばベントンデイビス法 （サイェン ス（Science), 第 196巻、 第 1 80〜第 182頁、 1 977年） に従って、 プ ラークハイブリダィゼ一シヨンを行い、 再配列された V D J遺伝子あるいは V J 遺伝子を各々含むポジティブクローンを得る。 得られたクローンの制限酵素地図 を作製し、 塩基配列を決定し、 目的とする再配列された VH(VDJ)遺伝子あるいは VL(VJ)遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認する。
一方、 キメラ化に用いるヒト CH遺伝子及びヒト CL遺伝子を別に単離する。 例 えば、 ヒト I gGl とのキメラ抗体を作製する場合には、 CH遺伝子である Cァ 1 遺伝子と CL遺伝子である C 遺伝子を単離する。 これらの遺伝子はマウス免疫 グロプリン遺伝子とヒト免疫グロプリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用し てヒト〇ァ1遺伝子及びヒト C AT遺伝子に相当するマウス Cァ 1遺伝子及びマウス C 遺伝子をプローブとして用い、 ヒトゲノムライブラリーから単離することに よって得ることができる。
具体的には、 例えば、 クローン I g l 46 (プロシ一ディングスナショナルァ 力デミーォブサイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 第 75巻、 第 4709 〜第 47 13頁、 1978年） からの 3 kbの H i n d III— B amH I断片と クローン MEP 10 (プロシーディングスナショナルアカデミーォブサイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 第 78卷、 第 474〜第 478頁、 1981 年） からの 6. 8 kbの E c oR I断片をプローブとして用い、 ヒトのラムダ Ch aron 4Aの Ha e III— A 1 u Iゲノムライブラリー （セル（Cell)、 第 15卷、 第 1157〜第 1174頁、 1978年） 中から、 ヒト C 遺伝子を含み、 ェンハ ンサー領域を保持している DNA断片を単離する。 また、 ヒト Cァ 1遺伝子は、 例えばヒト胎児肝細胞 DNAを H i ndlllで切断し、 ァガロースゲル電気泳動 で分画した後、 5. 9 kbのバンドをえ 788に挿入し、 前記のプローブを用い て単離する。
このようにして単離されたマウス VH遺伝子とマウス VL遺伝子、 及びヒト CH 遺伝子とヒト CL遺伝子を用いて、 プロモーター領域及びェンハンサー領域など を考慮しながらマウス VH遺伝子の下流にヒ卜 CH遺伝子を、 またマウス VL遺伝 子の下流にヒト CL遺伝子を、 適切な制限酵素及び DN Aリガ一ゼを用いて、 例 えば p S V2 gp tあるいは p S V2 ne 0等の発現べクタ一に常法に従って組 み込む。 この際、 マウス VH遺伝子/ヒト CH遺伝子とマウス VL遺伝子/ヒト CL 遺伝子のキメラ遺伝子は、 一つの発現べクタ一に同時に配置されてもよいし、 各 々別個の発現べクタ一に配置することもできる。
このようにして作製したキメラ遺伝子挿入発現べクタ一を、 例えば P3X63'Ag8' 653細胞あるいは SP210細胞といった、 自らは抗体を産生していない骨髄腫細胞 にプロトプラスト融合法、 DE AE—デキストラン法、 リン酸カルシウム法ある いは電気穿孔法等により導入する。 形質転換細胞は、 発現ベクターに導入された 薬物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別し、 目的とするキ メラモノクロ一ナル抗体産生細胞を取得する。
このようにして選別された抗体産生細胞の培養上清中から目的のキメラモノク ローナル抗体を取得する。
本発明における 「ヒト型モノクローナル抗体 （CDR-grafted抗体） 」 は、 遺伝 子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、 具体的には、 その超可変領 域の相補性決定領域の一部または全部が非ヒト哺乳動物 （マウス、 ラッ卜、 ハム ス夕一など） のモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であ り、 その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域 であり、 かつその定常領域がヒ卜ィムノグロプリン由来の定常領域であることを 特徴とするヒト型モノクローナル抗体を意味する。
ここで、 超可変領域の相補性決定領域とは、 抗体の可変領域中の超可変領域に 存在し、 抗原と相補的に直接結合する部位である 3つの領域 （Complementarity - determining residue； C D R U CDR2、 CDR 3 ) を指し、 また可変領域 の枠組領域とは、 該 3つ相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された 4つ の領域 （Framework； FR 1、 FR2、 FR3、 FR4) を指す。
換言すれば、 非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体の超可変領域の相補性 決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、 ヒトイムノグロブリンの対応領 域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、 I gG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) 、 I gM、 I gA、 I gD及び I gE等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸 配列を有するが、 本発明におけるヒト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれ のアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。 好ま しくは、 ヒト I gGの定常領域である。 また、 ヒトイムノグロブリン由来の可変 領域の枠組領域についても限定されるものではない。
本発明におけるヒト型モノクローナル抗体は、 例えば以下のようにして製造す ることができる。 しかしながら、 そのような製造方法に限定されるものでないこ とは言うまでもない。
例えば、 マウスモノクローナル抗体に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体 は、 特表平 4— 506458号公報及び特開昭 62— 296890号公報等を参 照して、 遺伝子工学的に作製することができる。 即ち、 マウスモノクローナル抗 体を産生するハイプリ ドーマから、 少なくとも 1つのマウス H鎖 C D R遺伝子と 該マウス H鎖 C D R遺伝子に対応する少なくとも 1つのマウス L鎖 C D R遺伝子 を単離し、 またヒトイムノグロプリン遺伝子から前記マウス H鎖 C D Rに対応す るヒト H鎖 C D R以外の全領域をコードするヒト H鎖遺伝子と、 前マウス L鎖 C D Rに対応するヒト L鎖 C D R以外の全領域をコ一ドするヒト L鎖遺伝子を単離 する。
単離した該マウス H鎖 C D R遺伝子と該ヒト H鎖遺伝子を発現可能なように適 当な発現ベクターに導入し、 同様に該マウス L鎖 C D R遺伝子と該ヒト L鎖遺伝 子を発現可能なように適当なもう 1つの発現べクタ一に導入する。 または、 該マ ウス H鎖 C D R遺伝子/ヒト H鎖遺伝子とマウス L鎖 C D R遺伝子/ヒト L鎖遺 伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。 このよう にして作製された発現べクタ一で宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノ クロ一ナル抗体産生形質転換細胞を得、 該形質転換細胞を培養することにより培 養上清中から目的のヒト型モノクローナル抗体を得る。
本発明における 「ヒトモノクローナル抗体」 とは、 ィムノグロブリンを構成す る H鎖の可変領域及び H鎖の定常領域並びに L鎖の可変領域及び L鎖の定常領域 を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するィムノ グロブリンである。
ヒト抗体は、 常法に従って、 例えば、 少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子 をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたト ランスジエニック動物を、 抗原で免疫感作することにより、 前述したポリクロ一 ナル抗体あるいはモノク口一ナル抗体の作製法と同様にして製造することができ る。
例えば、 ヒト抗体を産生するトランスジエニックマウスは、 Nature Genetics, Vol.7, p. 13-21 , 1994； Nature Genetics, Vol .15, p. 146-156, 1997；特 表平 4-504365号公報；特表平 7-509137号公報； 日経サイエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年；国際出願公開 W O 9 4 / 2 5 5 8 5号公報； Nature, Vol. 368, p.856-859， 1994；及び特表平 6— 5 0 0 2 3 3号公報などに記載の方法に 従って作製することができる。
また、 昨今開発された技術であるトランスジエニックなゥシゃブ夕のミルク中 からヒト由来タンパクを製造方法を適用することも可能である （日系サイエンス、 1997年 4月号、 第 7 8頁乃至 8 4頁） 。
本発明における 「抗体の一部」 とは、 前述のようなモノクローナル抗体の一部 分の領域を意味し、 具体的には F(ab，）2 、 Fab'、 Fab、 F v (variable fragme nt of antibody) 、 s F v、 d s F v (disulphide stabilised Fv) あるい は d A b (single domain antibody) などを意味する （エキスパート 'オビ二 オン 'オン 'テラピューティック 'パテンッ（Exp. Op in. Ther. Patents), 第 6 卷， 第 5号， 第 441〜456頁， 1996年） 。
ここで、 「F(ab' ) 2」 及び 「Fab，」 とは、 ィムノグロブリン （モノクローナル 抗体） を、 蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することによ り製造され、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在するジスルフィ ド結合の前後で 消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。 例えば、 I g Gをパパイン で処理すると、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在するジスルフィ ド結合の上流 で切断されて VL ( L鎖可変領域） と CL ( L鎖定常領域） からなる L鎖、 及び V H ( H鎖可変領域） と CHァ 1 ( H鎖定常領域中のァ 1領域） とからなる H鎖フラグ メン卜が C末端領域でジスルフィ ド結合により結合した相同な 2つの抗体フラグ メントを製造することができる。 これら 2つの相同な抗体フラグメントを各々 Fa b'という。 また I g Gをペプシンで処理すると、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に 存在するジスルフィ ド結合の下流で切断されて前記 2つの Fab'がヒンジ領域でつ ながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。 この抗 体フラグメントを F(ab，）2という。
本発明の 「医薬組成物」 とは、 前記で定義される本発明の 「ポリペプチド i、 該ポリペプチドから構成される 「ホモダイマー分子」 、 「ポリペプチド断片」 ま たは 「融合ポリペプチド」 、 該融合ポリペプチドから構成される 「ホモダイマ一 分子」 、 「抗体」 または 「抗体の一部」 のいずれかと、 薬学的に許容され得る担 体とからなる医薬組成物である。
ここで 「薬学的に許容され得る担体」 とは、 賦形剤、 希釈剤、 増量剤、 崩壊剤、 安定剤、 保存剤、 緩衝剤、 乳化剤、 芳香剤、 着色剤、 甘味剤、 粘稠剤、 矯味剤、 溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。 そのような担体の一つ以上 を用いることにより、 錠剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 注射剤、 液剤、 カプセル剤、 トロー剤、 エリキシル剤、 懸濁剤、 乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成 物を調製することができる。 これらの医薬組成物は、 経口あるいは非経口的に投 与することができる。 非経口投与のためのその他の形態としては、 一つまたはそ れ以上の活性物質を含み、 常法により処方される外用液剤、 腸溶内投与のための 坐剤およびべッサリーなどが含まれる。
投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重及び症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間、 あるいは該医薬組成物に含有される活性成分 （前記ポリペプチドや抗体など） の 種類などにより異なるが、 通常成人一人当たり、 一回につき 10 gから lOOOmg (あ るいは 10 gから 500mg) の範囲で投与することができる。 しかしながら、 投与量 は種々の条件により変動するため、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、 また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
とりわけ注射剤の場合には、 例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等 の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に 0 . 1 §抗体/111 1担体〜 1 O m g 抗体/ m l担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造すること ができる。 このようにして製造された注射剤は、 処置を必要とするヒト患者に対 し、 1回の投与において 1 k g体重あたり、 1 g〜 1 0 O m gの割合で、 好ま しくは 5 0〃g〜5 O m gの割合で、 1日あたり 1回〜数回投与することができ る。 投与の形態としては、 静脈内注射、 皮下注射、 皮内注射、 筋肉内注射あるい は腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。 好ましくは静脈内注 射である。
また、 注射剤は、 場合により、 非水性の希釈剤 （例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 エタノールのようなアル コール類など） 、 懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
そのような注射剤の無菌化は、 バクテリア保留フィル夕一を通す濾過滅菌、 殺 菌剤の配合または照射により行うことができる。 注射剤は、 用時調製の形態とし て製造することができる。 即ち、 凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、 使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。 本発明の医薬組成物は、 T細胞等のリンパ球の活性化並びに活性化リンパ球の 機能制御の異常に起因する種々の自己免疫性疾患、 アレルギー性疾患または炎症 性疾患の治療及び予防に適用が可能である。 該疾患としては慢性関節リゥマチ、 多発性硬化症、 自己免疫性甲状腺炎、 アレルギー性接触性皮膚炎、 慢性炎症性皮 膚疾患である扁平苔癬、 全身性エリテマト一デス、 インスリン依存性糖尿病及び 乾癬などが挙げられる。
また、 本発明の医薬組成物の種々疾患症状の治療効果については、 常法に従つ て、 既知の疾患モデル動物に投与することにより試験、 検討することができる。 例えば、 ①ヒト全身性エリテマトーデス （SLE) のモデルである（NZB/NZW)F1マ ウス ( Science, Vol . 125 , p. 1225-1227, 1994) 、 ②多発性硬化症 (MS) としての 実験的アレルギー性脳脊髄炎 (EAE) のモデル (J. Cl in. Invest. , Vol .95 , p.2 783-2789, 1995) 、 ③インスリン依存性糖尿病 （IDDM) モデルである NOD (non-o bese diabetes) マウス (J. Exp. Med. , Vol . 181 , p. 1145-1155 , 1995) 、 ④グヅ ドパスチヤ一 （Goodpasture) の腎炎モデルである腎糸球体基底膜免疫によるラッ ト腎炎モデル (Eur. J. Immunol . , Vol .24, No.6, p. 1249-1254, 1994) 、 ⑤ヒト 慢性関節リウマチモデルである DBA/1マウス （Eur. J. Immunol . , Vol .26, p.232 0-2328, 1996) を用いることが可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 「JTT. l抗体」 により誘導される FTL435細胞の細胞凝集の状態、 並びに 「JTT.2抗体」 による該細胞凝集の阻害の状態を示す顕微鏡写真である。
分図 （a ) はいずれのハイプリ ドーマ上清も加えない場合の細胞の状態を示し、 分図 （b ) は 「JTT-1抗体」 による細胞凝集の状態を示し、 分図 （c ) は 「JTT - 1 抗体」 とともに 「抗 ICAM-1抗体」 を加えた場合の細胞凝集の状態を示し、 また分 図 （d ) は 「JTT- 1抗体」 とともに 「JTT- 2抗体」 を加えて場合の細胞凝集の状態 を示す。
図 2は、 「JTT. l抗体」 により誘導される FTL435細胞及びラット活性化リンパ芽 球の細胞凝集の状態、 並びに 「JTT.2抗体」 による該細胞凝集の阻害の状態を示す 顕微鏡写真である。
分図 （a ) はいずれの抗体も加えない場合の FTL435細胞の細胞の状態を示し、 分図 （b ) は PMAを加えた場合の FTL435細胞の細胞の状態を示し、 分図 （ c ) は 「JTT- 1抗体」 を加えた場合の FTL435細胞の細胞の状態を示し、 分図 （d ) は 「J TT-1抗体」 とともに抗 LFA-1抗体を加えた場合の FTL435細胞の細胞の状態を示し、 分図 （e ) は 「JTT-1抗体」 とともに抗 CD18抗体を加えた場合の FTL435細胞の細胞 の状態を示し、 分図 （f ) は 「JTT-1抗体」 とともに抗 ICAM- 1抗体を加えた場合の FTL435細胞の細胞の状態を示し、 分図 （g ) はいずれの抗体も加えない場合の活 性化リンパ芽球の細胞の状態を示し、 分図 （h ) は PMAを加えた場合の活性化リン パ芽球の細胞の状態を示し、 分図 （i ) は 「JTT- 1抗体」 を加えた場合の活性化リ ンパ芽球の細胞の状態を示し、 分図 （j ) は 「JTT- 1抗体」 とともに抗 LFA-1抗体 を加えた場合の活性化リンパ芽球の細胞の状態を示し、 分図 （k ) は 「JTT-1抗 体」 とともに抗 CD18抗体を加えた場合の活性化リンパ芽球の細胞の状態を示し、 また分図 （ 1 ) は 「JTT- 1抗体」 とともに抗 ICAM-1抗体を加えた場合の活性化リン パ芽球の細胞の状態を示す。 図 3は、 フローサイ トメ一夕—を用いて測定した各種細胞における 「JTT. l抗 原」 及び 「JTT.2抗原」 の発現の状態を示す図である。
図 4は、 フローサイ トメ一夕一を用いて測定した各種リンパ球系細胞における 「JTT. l抗原」 の発現の状態を示す図である。
図 5は、 SDS-PAGEによる電気泳動により解析した 「JTT. l抗原」 の電気泳動像を 示す写真である。
図 6は、 「JTT. l抗体」 の共存下で誘導される精製 「JTT. l抗原」 をコートした マイクロプレートへのラット胸腺細胞の接着の状態、 並びに 「JTT.2抗体」 による 該細胞接着の阻害の状態を示す顕微鏡写真である。
分図 （a ) は 「JTT-1抗原」 をコ一ティングしていないプレートへの細胞の接着 の状態を示し、 分図 （b ) はいずれの抗体も加えない場合の 「JTT- 1抗原」 をコ一 ティングしたプレートへの細胞の接着の状態を示し、 分図 （c ) は 「JTT-1抗体」 の Fab断片を加えた場合の 「JTT- 1抗原」 をコ一ティングしたプレートへの細胞の 接着の状態を示し、 また分図 （d ) は 「JTT- 1抗体」 の Fab断片とともに 「JTT- 2抗 体」 を加えた場合の 「JTT-1抗原」 をコ一ティングしたプレートへの細胞の接着の 状態を示す。
図 7は、 精製 「JTT. l抗原」 をコ一ティングしたプレートに接着した胸腺細胞の 蛍光強度に基づく相対細胞数を示す図である。
「A (-)」 は 「JTT- 1抗原」 をコ一ティングしていないプレートにおける相対細 胞数を示し、 「Ag( + )」 はいずれの抗体も加えない場合の 「JTT-1抗原」 をコ一テ ィングしたプレートにおける相対細胞数を示し、 「Ag( + )+JTT. l Fab」 は 「JTT - 1 抗体」 の Fab断片を加えた場合の 「JTT- 1抗原」 をコ一ティングしたプレートにお ける相対細胞数を示し、 また 「Ag(+)+JTT. l Fab+JTT.2」 は 「JTT- 1抗体」 の Fab断 片とともに 「JTT-2抗体」 を加えた場合の 「JTT- 1抗原」 をコーティングしたプレ ートにおける相対細胞数を示す。
図 8は、 フロ一サイ トメ一夕一を用いて測定した 「ラット JTT-1抗原」 をコード する cDNAで形質転換した COS細胞での 「ラット JTT-1抗原」 及び 「ラット JTT-2抗 原」 の発現状態を示す図である。
図 9は、 ハイ ドロパシーブロ ヅ ト解析による 「JTT. l抗原」 のアミノ酸配列の構 造的特徴を示す図である。
図 1 0は、 ヒト、 ラヅ ト、 及びマウスの 「JTT. l抗原」 並びに 「ラット JTT-1抗 原」 の変異体の各々のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
図 1 1は、 「ヒト JTT- 1抗原」 、 「ヒト CD28分子」 及び 「ヒト CTLA- 4分子」 のァ ミノ酸配列におけるアミノ酸配列相同性並びにモチーフの保存状態を示す図であ ο
図 1 2は、 「ヒト JTT- 1抗原」 、 「ヒト CD28分子」 及び 「ヒト CTLA-4分子」 の蛋 白二次構造及びその類似性を模式的に示す図である。
図 1 3は、 「マウス JTT- 1抗原」 をコードするゲノミック DNAの構造を模式的に 示す図である。
図 1 4は、 「ラット JTT-1抗原」 及びそのオール夕ナティブスプライシング変異 体の各々のアミノ酸配列の差異を示す図である。
図 1 5は、 [ 3 H ] チミジン取込み試験により測定した 「ヒト JTT-1抗原」 に対 するモノクローナル抗体により誘導されるヒト末梢血リンパ球の増殖の程度を示 す図である。
縦軸は、 細胞内への [ 3 H ] チミジンの取込み量 （dpm) を示す。
図 1 6は、 疾患モデルラッ卜における実験的アレルギー性脳脊髄炎 （E A E ) の 「JTT-1抗原」 に対するモノクローナル抗体による治療効果を示す図である。 縦軸はスコァ化した疾患症状の程度を示し、 また横軸は E A E誘導のための免 疫感作後の経過日数を示す。
図 1 7は、 疾患モデルラットにおける糸球体腎炎の 「JTT-1抗原」 に対するモノ クローナル抗体による治療効果を示す図である。
縦軸は尿中蛋白排泄量を示し、 また横軸は糸球体腎炎誘導のための免疫感作後 の経過時間 （週） を示す。
図 1 8は、 プロテイン Aセファロ一スカラムによる 「ラヅ ト JTT-1抗原」 の細胞 外領域とヒト IgFcとの融合ポリペプチド （rJTT-;l- IgFc) の精製におけるカラムヒ ストグラムを示す図である。
図 1 9は、 SDS-PAGEによる電気泳動により解析した rJTT- 1-IgFcの電気泳動像を 示す写真である。
図 2 0は、 プロテイン Aセファロ一スカラムによる 「ヒト JTT-1抗原」 の細胞外 領域とヒト IgFc (hJTT-1-IgFc) との融合ポリペプチドの精製におけるカラムヒス 卜グラムを示す図である。
図 2 1は、 SDS-PAGEによる電気泳動により解析した hJTT- 1- IgFcの電気泳動像を 示す写真である。
図 2 2は、 「ラヅト JTT- 1抗原」 をコードする cDNAを導入したトランスジェニッ クマウス作製のための遺伝子導入用ベクターの構造を模式的に示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
[実施例 1 ] モノク口一ナル抗体の調製
以下に述べる抗体産生ハイプリ ドーマの調製は、 ケ一ラー （Kohler) らの方法 (Bloods 第 81巻、 101-111ページ、 1993年、 大森ら） を参照しながら行い、 また、 モノクローナル抗体の調製は神奈木らの方法 （Handbook of Experimental I廳 un ology, 第 4卷、 117.2卜 117.21ページ、 1986年） を参照しながら行った。
まず、 ラット胸腺腫細胞株 FTL435細胞を免疫感作抗原として、 該抗原を BALB/c マウスに 0日目 （107細胞/匹） 、 7日目、 14日目および 28日目という間隔及び量で フヅトパッ ド投与した。 初回免疫のみ該抗原をフロイント完全アジュバントと混 和したものを投与した。 最後の免疫感作から 2日後に該マウスのリンパ節を採取し、 常法によりマウスミエ口—マ細胞 PAI (JCR NO.B0113; Res. Disclosure, Vol .21 7, p.155, 1982， Stocker, J.W. et al. ) と融合させ、 多数のモノクローナル抗体 産生ハイプリドーマを得た。
[実施例 2 ] ハイブリド一マのスクリーニング及びモノクローナル抗体の性 状解析
実施例 1で調製した各種ノ、イブリド一マの培養上清中に生成されたモノクロ一 ナル抗体の免疫原である FTL435細胞におよぼす効果を解析することによりハイブ リドーマをスクリ一ニングした。 96穴マイクロタイ夕一プレートの各ゥエルに FT L435細胞 （5 x l06cell/mlを 0. 1ml) を播種し、 各ハイプリドーマの培養上清 （そ れぞれ 10〃g/ml) を加え、 37°Cで 1時間培養した。 その内のハイプリ ドーマク口一 ン 「JTT-1」 及びクローン 「JTT-2」 についての結果を図 1及び図 2に示す。
ハイプリ ドーマクローン 「JTT-1」 が産生するモノクローナル抗体 ( 「JTT- 1抗 体 j ) は、 FTL435細胞を強く凝集させる作用を持つことが確認された （図 l(b)、 及び図 2(c)) 。 一方、 「JTT-1抗体」 とともに 「JTT-2抗体」 を加えることにより、 「JTT.1抗体」刺激による FTL435細胞の凝集が強く抑制されることが確認された (図 1(d)) 。 なお、 いずれのハイプリ ドーマ上清も加えない系を対照とした （図 1(a)及び図 2(a)) 。
この 「JTT-1抗体」刺激による FTL435細胞の凝集が、 代表的な既知の接着分子経 路である ICAM-1 ( Intercellular adhesion molecule - 1 ) と LFA-1 (Lymphocyte function-associated antigen-1) の間の細胞接着によるものか否かを確認するた め、 「JTT-1抗体」 ともに抗ラット ICAM- 1抗体 1A29 ( 10 zg/ml； IgGl) または抗ラ ヅト LFA-1抗体 ( lO zg/ml； IgG2a) を加えて 37。Cで 1時間培養した。
「JTT-1抗体」刺激による FTL435細胞の凝集は、 抗 ICAM- 1抗体及び抗 LFA-1抗体 のいずれによっても抑制されなかった （ [抗 ICAM-1抗体] ：図 1(c)及び図 2(f )、 及び [抗 LFA-1抗体] ：図 2(d)) 。
「JTT-1抗体 I の細胞凝集能に関するさらなる性状解析にために、 コンカナバリ ン Aで刺激して活性化したラッ卜活性化リンパ芽球細胞に対する凝集能を前述と 同様にして解析した。 結果を図 2に示す。
FTL435細胞に対する作用と同様に、 「JTT-1抗体」 の刺激により活性化リンパ芽 球細胞の凝集が誘導された （図 2( i ) ) 。 しかしながら、 活性化リンパ芽球細胞に 対しては、 「JTT-1抗体」 刺激による細胞凝集の多くは、 抗 LFA-1抗体 （図 2(j )) および抗 ICAM- 1抗体 （図 2( 1 ) ) により抑制された （但し、 部分的凝集が残った） 。 対照であるいずれの抗体も加えない系 （図 2(g )) から明らかなように、 活性化 リンパ芽球等の活性化リンパ球は、 PMA (Phorbol myri state acetate： LFA-1を活 性化させる機能を有する） （図 2(h) ) や 「JTT- 1抗体」 （図 2( i ) ) による刺激を受 けない限り何らの細胞接着による凝集は起こらない。 従って、 抗 LFA- 1抗体により 「JTT-1抗体」刺激による細胞凝集の部分的に抑制された事実は、 活性化リンパ芽 球細胞においては、 「JTT-1抗体」 の刺激により LFA-1が活性化されていることを 示すものである。 これは、 「JTT-1抗体」 により認識される分子が何らかのシグナ ルの伝達に関与する機能を有していることを示すものである。
なお、 ハイプリ ドーマクローン 「JTT-1」 及び 「JTT-2」 は、 1996年 10月 11日付 でブダぺスト条約の下で認定された国際寄託機関である日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号所在の日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄 託した （ [JTT- 1] ：国際寄託番号 FERM BP-5707、 [JTT-2] ：国際寄託番号 FERM BP-5708) o
マウスモノクローナル抗体アイソタイプ同定キット （Amersham社製） を用いた 解析により、 各々のハイプリ ド一マから産生させるモノクローナル抗体 （JTT-1抗 体及び JTT-2抗体） のアイソタイプはともに IgGlと決定された。
[実施例 3 ] 「JTT. l抗体」 及び「JTT.2抗体」 の各種細胞に対する反応性 各種細胞における 「JTT. l抗体」 及び「JTT. 2抗体」 の認識する分子の発現パ夕 —ンを解析する目的で、 各種細胞に対する該抗体の反応性を確認した。 なお、 「JTT-1抗体 I が認識する分子を 「JTT-1抗原」 と、 また 「JTT-2抗体」 が認識する 分子を 「JTT-2抗原」 と命名する。
5乃至 10週齢のウイス夕—ラヅ ト （150乃至 250g) をジェチルェ—テルにて麻酔 死させた。 外科的手術により開腹して胸部及び腹部から各々胸腺及び脾臓を摘出 し、 すりつぶして細胞浮遊液を調製した。 更に、 脾臓細胞をコンカナパリン A (2 zg/ml) 及び 10%FCSを含む RPMI 1640培地中で 37°Cで、 3日間培養することにより、 活性化リンパ芽球を調製した。
FTL435細胞、 胸腺細胞、 脾臓細胞及び活性化リンパ芽球 （各 5 X 105個） を 「JT T.1抗体」 または 「JTT.2抗体」 と反応させ、 次いで FITC標識抗マウス IgG (Cappe 1社製） 反応させた後、 染色された細胞の蛍光強度をエピックスエリート （EPICS -El ite) フローサイ トメ一夕一を用いて測定した。
結果を図 3に示す。 FTL435細胞では、 「JTT. l抗原」 及び 「JTT.2抗原」 の強い 発現がみられた。 胸腺細胞でも同分子の発現がみられたが、 脾臓細胞ではわずか にしか発現していなかった。 しかし、 脾臓細胞をコンカナパリン Aで刺激して得た 活性化リンパ芽球では、 「JTT. l抗原」 及び 「JTT.2抗原 j の強い発現がみられる ようになった。 また各々の細胞種において rjTT. l抗原」 及び 「JTT.2抗原」 の発 現パターンは、 一致していた。 この結果は 「JTT- 1抗原」 及び 「JTT- 2抗原」 が同 一の分子であることを示唆するものである。
[実施例 4 ] 「JTT. l抗体」 の種々リンパ系細胞に対する反応性
種々リンパ系細胞での 「JTT. l抗体」 の認識する分子 （ 「JTT- 1抗原」 ） の発現 パターンを解析する目的で、 2種類のラット （Wistarラヅ ト、 及び F344ラッ ト） のリンパ節、 脾臓由来 Tリンパ芽球、 及び脾臓由来 Bリンパ芽球に対する 「JTT- 1抗体」 の反応性を解析した。
5乃至 10週齢の Wistarラヅ ト及び F344ラヅ ト （150乃至 250g) をジェチルェ—テ ルにて麻酔死させた。 各々のラッ トを外科的手術により開腹してリンパ節及び脾 臓を摘出し、 すりつぶして細胞浮遊液を調製した。 更に、 脾臓の細胞調製物をコ ンカナパリン A (ConA； 2 zg/ml) 及び 10%FCSを含む RPMI1640培地中で 37°Cで、 3 日間培養した。 各々のラットについて、 1日間培養後及び 3日間培養後に、 活性 化 Tリンパ芽球、 及び活性化 Bリンパ芽球を取得した。 また、 対照として、 リン パ節細胞および ConAを加える前 （0日） に取得した脾臓由来 Tリンパ芽球、 及び Bリンパ芽球を用いた。
各々の細胞 （各 5 x 1 0 5個） を、 ピオチン標識抗ラッ ト T細胞抗体またはピオ チン標識抗ラット B細胞抗体 ( 10 ig/ml , 生化学工業製） と反応させた後、 ビコ エリスリン標識ストレプトアビジンと反応させた。 次いで、 FITC標識した 「JTT- 1抗体」 （10〃g/ml) と反応させ、 染色された細胞の蛍光強度をエピックスエリ一 ト （EPICS- Elite) フローサイ トメ一夕一を用いて測定した。
結果を図 4に示す。 Wistarラッ 卜及び F344ラッ 卜ともに、 活性化 Tリンパ芽球、 及び活性化 Bリンパ芽球のいずれにおいても ConA^激による活性化の 1日目から 「JTT. l抗原」 の強い発現がみられた。 また各々の細胞種における 「JTT. l抗原」 の発現パターンは、 ほぼ一致していた。
[実施例 5 ] 免疫沈降実験による 「JTT. l抗原」 及び 「JTT.2抗原」 の性状解 析
「JTT. l抗原」 及び 「JTT.2抗原」 の性状を解析する目的で、 FTL435細胞を用い て免疫沈降実験を行った。
( 1 ) ピオチン化可溶性細胞表面分子の調製
FTL435細胞を PBSで洗浄した後、 100〃g/mlの NHS -ピオチンを含む 0.1Mへぺス含 有生理食塩水 （PH8.0) に l x lO7細胞/ mlになるよう懸濁し、 室温で 40分間反応さ せた。 細胞を PBSで 3回洗浄した後、 可溶化バッファー （l%NP-40、 lOmMTris-HCl (pH7.4)、 0.15MNaCl) を 5 x 107cells/mlになるように添加し、 4。C、 30分間反応さ せ細胞を溶解した。 得られた細胞溶解物を遠心し、 ピオチン化可溶性細胞表面分 子を含む遠心上清を— 80°Cで保存した。
( 2 ) 免疫沈降及び SDS-PAGE解析
実施例 1で調製したハイプリ ドーマクローン 「JTT-1」 の培養上清から常法によ り精製した 「JTT. l抗体」 の精製標品を、 2mg/mlになるようにプロテイン G-セファ ロースビーズと混合し、 4°Cで 1時間反応させビーズに抗体を結合させた。 ビーズ を洗浄し、 10〃 1のビーズに対しビォチン化 FTL435細胞可溶化物を 500 1添加し、 4°Cで 2時間反応させた。 ビーズを可溶化バッファーで 3回洗浄し、 50〃1のグリカ ナーゼバッファー （0.15%SDS含有ナトリウムリン酸バッファ—（pH7.0)) を加え煮 沸することにより抗体結合ビーズにトラップされた結合分子を溶出させた。 溶出 サンプルの一部に 1.25%NP-40と N-グリカナーゼ （20U/ml) を添加し一晩反応させ、 N型糖鎖を消化した。
溶出サンプル 5 1に 2-メルカプトエタノール存在下あるいは非存在下で SDS-ポ リアクリルアミ ドゲル電気泳動 （SDS-PAGE) 用サンプルバヅファー （Enprotech社 製） を等量添加して煮沸し、 電気泳動後、 PVDF膜に転写した。 転写膜を 3% BSA- PBS でブロッキングを行い、 次いでペルォキシダーゼ標識ストレプトアビジンと 反応させた後、 使用説明書の記載に従い E( システム （Amersham社製） を用いて
「JTT-1抗体」 により トラップされたピオチン化可溶性細胞膜表面分子を検出した。 図 5に結果を示す。 「JTT. l抗体」 により認識される FTL435細胞上の分子 （ 「J TT-1抗原」 ） は、 非還元下 （図 5中に 「（- )」 で示した） で約 47kDの分子量を有し、 また還元下 （図 5中に 「 ）」 で示した） で約 24kDおよび約 28kDの分子量を有して いた。 また N型糖鎖を消化を行うことにより （図 5中に 「+N-gly」 で示した） 、
「JTT. l抗原」 は、 非還元下で約 36kD、 また還元下で約 20kDの 1本のバンドに収束 した。 以上の結果から、 「JTT. l抗原」 は、 糖鎖修飾が異なりコア蛋白が同一の分 子からなるダイマーを形成していると推定された。 なお、 「JTT.2抗体」 を用いて 上述と同様にして行った試験においても全く同様の結果が得られた。 この結果と 実施例 3及び後述の実施例 7の結果を考え合わせると、 「JTT. l抗原」 （ 「JTT-1 抗体」 により認識される分子） 及び 「JTT.2抗原」 （ 「JTT-2抗体」 により認識さ れる分子） は全く同一の分子であると考えられた。
[実施例 6 ] 精製 「JTT. l抗原」 に対するラット胸腺細胞の接着実験並びに N 末端アミノ酸解析
「JTT. l抗体」 が認識する分子 （ 「JTT- 1抗原」 ） が接着分子としての機能を有 しているか否かを解析するため以下の実験を行った。 また、 N末端アミノ酸解析 を TTつた。
( 1 ) 「JTT. l抗体」 ァフィ二ティ一カラムの調製
実施例 1で調製したハイプリ ドーマクローン 「JTT-1」 の培養上清から常法によ り精製した 「JTT. l抗体」 の精製標品 2mg(2ml )を lmlのプロテイン G-セファロ—ス 樹脂と混合し、 4 °Cで 1時間反応させた。 樹脂を 200mMのトリエタノールァミン (PH8.2) で 3回洗浄した。 さらに、 lOmMジメチルビメリミディ ト （DMP) を含む トリエタノールァミン （pH8.2) 中で室温下 1時間インキュベートすることにより、 樹脂に 「JTT. l抗体」 を共有結合させた。
( 2 ) 「JTT. l抗原」 の精製
FTL435細胞を 10 FCS含有 RPMI1640培地を用いて培養した。 細胞を遠心操作によ り回収し、 ペレットを PBSにて 3回洗浄した。 洗浄後のペレットに可溶化バッファ - ( l%NP-40、 10mMTris-HCl(pH7.4), 0. 15MNaCl ) を 5 x 107cells/mlになるように 添加し、 4°Cで 30分間反応させ細胞を溶解した。 得られた細胞溶解物を遠心し、 可 溶性細胞表面分子を含む遠心上清を - 80°Cで保存した。
可溶化物 400mlを 「JTT. l抗体」 ァフィ二ティーカラムに添加した。 カラムを可 溶化バッファー 50ml及び PBS20mlで洗浄した後、 0.2Mグリシンバッファ— （pH2. 8) で 「JTT-1抗原」 を溶出させた。 溶出した 「JTT- 1抗原」 に 1Mトリスバッファ一 を添加して中和した。 得られた 「JTT. l抗原」 は、 マイナス 80°Cで保存した。
( 3 ) N末端のアミノ酸配列の決定
得られた精製 「JTT-1抗原」 を、 SDS-PAGEで展開後、 常法により N末端のァミノ 酸配列を決定し、 Glu- Leu- Asn- Asp- Leu-Ala-Asn- His- Argのアミノ酸配列を含むこ とが明らかとなった。
( 4 ) 接着実験 5乃至 10週齢のウィスターラヅ ト （150乃至 250g) をジェチルェ—テルにて麻酔 死させた。 外科的手術により胸部を開腹して胸腺を摘出し、 すりつぶして胸腺細 胞浮遊液を調製した。 細胞浮遊液に、 2'，7' -ビス （カルボキシェチル） カルボキ シフルォレインテトラセトキシメチルエステル （BCECF-AM; Molecular Probes社 製） 10〃Mを添加し、 37°Cで 30分間培養することにより、 蛍光標識を行った。 細胞 を PBSで洗浄した後、 10 FCSを含む RPMI1640培地中に、 2 x 107cell/mlの濃度にな るように再浮遊させた。
96穴 ELISAプレートに、 （2) で得た精製 「JTT. l抗原」 を 10 / l/wellで 1晚コー ティングした。 プレートを PBSで洗浄した後、 3%BSAを含む PBSを 200〃l/well添加 し 2時間ブロッキングを行った。 プレー卜を PBSで洗浄した後、 各ゥエルに①蛍光 標識胸腺細胞 （2 x l07cells/mlを O. lml) のみ、 ②蛍光標識胸腺細胞 （同濃度） 及 び常法により調製した 「JTT. l抗体」 の Fab断片 （5〃g/ml) 、 並びに③蛍光標識胸 腺細胞 （同濃度） 、 該 「JTT. l抗体」 の Fab断片 （同濃度） 及び 「JTT.2抗体」 （1 0 /g/ml) を加え、 37°Cで 1時間培養した。 結合していない細胞を除去するために、 各ゥエルを 10%FCSを含む RPMI1640培地にて 1回洗浄した。 各ゥエルを光学顕微鏡 で観察した。 次いで、 各ゥヱルに 0.1%NP- 40溶液 100〃1を添加してプレートに結合 している細胞をで溶解した。 フルォロスキャン I Iマイクロプレート ·フルォロメ —夕— （Flow Laboratories社製） を用いて、 538nm (485nmで励起） の波長での蛍 光強度を測定することにより、 各ゥエルに結合した蛍光標識胸腺細胞の相対細胞 数を計数した。 なお、 精製 「JTT-1抗原」 をコーティングしない系を対照とした。 光学顕微鏡観察の結果を図 6に示す。
胸腺細胞は、 「JTT. l抗体」 の Fab断片存在下でのみ有意に精製 「JTT. l抗原」 に 接着した （図 6(c )) 。 またその接着は、 「JTT.2抗体」 により有意に阻害された (図 6(d)) 。
なお、 各ゥヱルにコーティングした 「JTT. l抗原」 に接着した胸腺細胞の相対細 胞数を蛍光強度により測定した結果を図 7に示した。 以上の結果により、 「JTT. l抗原」 は、 接着分子としての機能を有していること が確認された。
[実施例 7 ] ラット 「JTT. l抗原」 をコードする cDNAのクローニング
1 . cDNAライブラリ一の作製
1 - ( 1 ) ConA iJ激ラヅトリンパ芽球からの poly(A)+RNAの抽出
ConAで刺激したラット脾臓由来リンパ芽球 （Con A blast) (約 1 x 106cells/m 1) を 4 °Cで 5分間 （2，000 xg) 遠心して、 沈殿した細胞を IS0GEN (二ヅポンジ— ン社製） を用いて懸濁し、 クロ口ホルムで浸とう抽出して上清を回収した。 得ら れた上清にィソプロパノールを添加して室温で 10分間放置した後、 4°Cで 10分間、 12，000 xgにて遠心し、 MAを沈殿させた。 沈殿した RNAをエタノールで洗浄した後、 TE緩衝液に溶解した。 得られた全 RNAから、 「mRNA Purification Kit」 （Pharmac ia社製）を用いて poly(A)+RNAを精製した。
1 - ( 2 ) cDNAの調製
調製した poly(A)+RNA5 gを銃型とし、 「Time Saver cDNA Synthesis Kitj (Pharmacia社製） を用いて cDNAを合成した。 スクリーニングの効率を上げるため、 Not I切断部位を有する 「oligo dTプライマー」 （Pharmacia社製） を用いた。 次 いで EcoRIをアダプタ—付加し、 Notl消化を行い、 単一方向性を有する cDNAを得た c 更にスパンカラム （Pharmacia社製） を用いてサイズ分画を行った。
1 - ( 3 ) ベクタ—への組み込み
得られた EcoR Iおよび Not I末端を有する cDNAを、 EcoR Iおよび Not I処理したべク 夕- PME18S (Hara,T. and Miyajima,A. EMBOJ. , 11, 1875- 1884， 1992)に連結した。 連結反応には 「DNA ligation Kitj (宝酒造社製） を用いた。 得られた反応生成 物を用いて E. coli DH5(東洋紡社製）を形質転換した。 形質転換体は O.D.値 （600η m) が 0.6になるまで培養した後集菌し、 ライブラリ一を含むプラスミ ド DNAを回収 した。 プラスミ ド DNAの精製には QUIAGEN- Tip (QUIAGEN社製） を用いた。
2 . cDNAライブラリ一のスクリニ一ング スクリーニング法はバニング法 (Seed'B. et al. Pro Natl. Acad. Sci USA, 8 4, 3365-3369, 1987) に準じて行った。
2- ( 1) COS細胞への遺伝子導入
得られたライブラリ一をエレクトロボレ一シヨン法 （Potter, H.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2288-2292) により C0S7細胞に導入した。 導入後 60時 間培し、 上清を除去し PBSで 3回洗浄した。 次いで PBS (0.5mM EDTA) で処理 （37C、 30分） した後ピペッティング操作により細胞を剥がした。 さらに 「Lymphprep」 (NYC0MED社製）を用いて生細胞のみを回収した。
2- (2) バニングによる遺伝子発現細胞の濃縮
得られた生細胞を PBS (5%FCS、 0.5mM EDTA) に懸濁した。 細胞懸濁液を 「JTT. 1抗体」 をコートした培養皿に移し、 室温で 3時間作用させた。 培養皿への非結合 細胞を除去し、 培養皿を PBSで 3回洗浄した後、 培養皿に結合した細胞から Hirt法 (Hirt，B.J.Mol. Biol., 26.365-369)によりプラスミ ド DNAを回収した。 得られたプ ラスミ ド DNAを用いて E.coli DH10B(GIEBC0 BRL社製）を形質転換した。 形質転換体 を用いて前記卜（3)と同様にプラスミ ド DNAを増幅、 精製した。 得られた DNAを用い て、 前記（1)及び本 (2)に記載の操作を更に 2回繰り返し行った。
2- (3) ポジティブクローンの単離
3回目のバニング後、 形質転換した E.coli DH10Bをアンピシリン含有 LB plateで 終夜培養しコロニーを得た。 薬剤耐性コロニー 20個を培養しアルカリ · ミニプレ ヅプ法 (Maniatis,T.et al. Molecular Cloning;A Larolatory Mnual,Cold Sprin g Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) でプラスミ ド MAを回収し 挿入された DNA (インサート DNA) を解析した。 ァガロースゲル電気泳動の結果、 約 0.9kbの cDNAを有するクローン （以下、 このクローンを 「T132A7」 と称する） が 濃縮されていることが明らかとなった。
前記（1)に記載の方法を用いて、 「T132A7」 を再び C0S7細胞で一過性に発現させ た。 「T132A7」 導入細胞を、 「JTT.l抗体」 または 「JTT.2抗体」 と反応させ、 次 いで FITC標識抗マウス IgG (Cappel社製） 反応させた後、 染色された細胞の蛍光強 度を EPICS-Eliteフローサイ トメーター （Coulter社製） を用いて測定した。 「JT T.1抗体」 及び 「JTT.2抗体」 は 「T132A7」 遺伝子産物を強く認識していた。 結果 を図 8に示す。
3 . 塩基配列及びァミノ酸配列の決定
クローン 「T132A7」 の塩基配列を、 ジデォキシ法により 「Auto Read Sequenci ng Kit」 （Pharmacia社製） と 「A.L.F.DNA sequencer^ (Pharmacia社製） を用い て決定した。 また、 該塩基配列がコードする 「ラット JTT.1抗原」 の推定アミノ酸 配列を遺伝子解析ソフ ト 「GENEWORKS」 （IntelliGenetics社製） を用いて解析し た。 該塩基配列及び推定アミノ酸配列を、 配列番号 4に記載する。
クローニングした遺伝子から演繹されるァミノ酸配列 （ 2 0 0ァミノ酸残基か ら構成される） には、 実施例 6- ( 3)で決定した N末端アミノ酸配列と同一のァミノ 酸配列を含んでいた。 クローン 「T132A7」 導入細胞が、 「JTT-1抗体」 に強く反応 することを考え合わせると、 クロ一ン 「T132A7」 は 「ラット JTT.1抗原」 をコード する cDNAを含んでいると結論できる。
4 . コンピュータ一解析
「JTT. l抗原」 の推定アミノ酸配列の一次構造について、 Kiteと Doolittleの方 法 (Kite, J. &Doolittle, R. F. J. Mol. Biol . 157, 105-132, 1982) に従って ハイ ドロパシー ' ブロヅ 卜解析を行った （図 9 ) 。 その結果、 「JTT. l抗原」 は N 末端にシグナル配列を有する細胞膜貫通蛋白質であることが明らかとなった。 ま た、 モチーフ解析の結果、 「JTT. l抗原」 の細胞外ドメインに 2力所のァスパラギ ン結合型糖鎖結合部位を有し、 また細胞内ドメインに 2力所のカゼィンキナーゼ リン酸化部位並びに 1力所のプロティンキナーゼ Cリン酸化部位を有しているこ とが明らかとなった。 なお、 図 9中の 「CH0」 は N型糖鎖結合部位を示し、 「P」 は リン酸化部位を示し、 「CKI I」 はカゼインキナーゼ IIを示し、 「PKC」 はプロティ ンキナーゼ Cを示す。 [実施例 8 ] 「ヒト JTT. l抗原」 cDNAのクローニング
1 . プローブの作製
実施例 7で得たクローン 「T132A7」 を制限酵素 EcoMおよび Notlで消化して、 「ラッ ト JTT.1抗原」 をコードする cDNA約 0.9kbを切り出し、 ァガロースゲル電気 泳動により分離した。 分離した DNA断片を 「QUIAEX gel extraction kit」 （QUIA TEN社製） を用いて精製し、 得られた DNA断片を 「Ready-To- Go DNA labelling ki t」 （Pharmacia社製） を用いて3 2 Pで標識した。 この標識 DNA断片をブラ—クハイ ブリダィゼィ—シヨン用のプローブとして用いた。
2 . cDNAライブラリーの作製
2— ( 1 ) poly(A)+RNAの抽出
実施例 7-卜（1 )と同様にして、 ConAで刺激したヒト末梢血由来のリンパ芽球 （C on A blast) から poly(A)+ Aを抽出した。
2— （2 ) cDNAの調製
調製した poly(A)+RNA5〃gを鎵型とし、 「oligo dTプライマ一」 （Pharmacia社 製） と 「Time Saver cDNA Synthesis Kitj (Phramacia社製) を用いて cDNAを合 成した。 次いで、 EcoRIアダプターを付加した後、 スパンカラム （Pharamacia社 製） を用いてサイズ分画を行った。
2 - ( 3 ) ベクタ—への組み込み及びパッケージング
得られた EcoRI末端を有する cDNAを、 EcoRIで処理したベクタ— 「え ZAPII」 （S tratagene社製） に連結した。 連結反応には 「DNA ligation Kitj (宝酒造社製） を用いた。 これを 「GIGA PACK I I GOLDj (Strategene社製） を用いてインビトロ パッケージング （in vitro packaging) した後、 得られたファージ粒子を用いて、 E coli XLlBlue MRF， （Strategene社製） を宿主として組換えファージを含有する プラークからなる cDNAライブラリ一を作製した。
3 . cDNAライブラリ一のスクリ一ニング
スクリ—ニングは 「Rapid hybridization bufferj (Amersham社製） を用いた プラークハイブリダィゼ—シヨン法 （Maniatis，T. et al . Molecular Cloning:A L abolatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yo rk) に従い行った。 得られた cDNAライブラリー （l x lO4個） を寒天プレートにま き、 「Hybond-N nylon menbranej (Amersham社製） を用いてレプリカを作製した c レプリカと前記実施例 8-1で作製した3 2 P標識プローブを用い、 「Rapid hybridi zation buffer j (Amersham社製） 中でプラークハイブリダィゼィ—シヨンを行つ た。 1次スクリーニング及び 2次スクリーニングを行い、 8個のポジティブ 'ク ローンを得た。 各クローンをシングルプラークで単離後、 マニュアル （Stratege ne社） に従ってインビボェキサイシヨン （in vivo Excision) に供し、
7つのポジティブクローンをプラスミ ド DNAとして回収した。
4 . 塩基配列決定
7個のクローンの塩基配列を、 ジデォキシ法により、 「Auto Read Sequencing
Kit」 （Pharmacia社製） と 「A.L.F.DNA sequencer j (Pharmacia社製） を用いて 決定した。 7個のクローンはすべて同じ塩基配列を含んでいた。 このうちクロ— ン 「pBSh41」 は、 「ヒト JTT-1抗原」 の全長をコードしていることが確認された。
「ヒト JTT-1抗原」 の読取り枠 （open reading frame; 0RF) に対応する cDNAの塩 基配列を配列番号 1に、 また 「ヒト JTT.1抗原」 の推定全長アミノ酸配列を配列番 号 2、 また 5'及び 3'配列を含む塩基配列を配列番号 3 (0RFは、 塩基番号 26乃至 6 25) に示す。 該クローンに含まれる塩基配列が、 「ヒト JTT-1抗原」 の全長をコ一 ドするものであることは、 該塩基配列から演繹されるアミノ酸配列 （ 1 9 9アミ ノ酸残基から構成される） が、 「ラッ ト JTT.1抗原 j のアミノ酸配列と有意な相同 性を示すことから明らかである （図 1 0 ) 。 また、 図 1 0に示されるとおり、 ヒ ト及びラッ卜の 「JTT. l抗原」 のアミノ酸配列相同性は、 S 0 %以上である。
なお、 クローン 「pBSh41」 により形質転換した E.coU .DHlOB (GIBCO BRL社製） を、 1996年 10月 25日付でブダぺスト条約の下で認定された国際寄託機関である日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号所在の日本国通産省工業技術院生命工学技 術研究所に寄託した （寄託番号： FEM BP- 5725) 。
5 . 「JTT-1抗原」 の構造的特徴及び生物学的機能
演繹される 「ヒト JTT- 1抗原」 のアミノ酸配列について、 既知ヒトタンパクとの モチーフ検索を行った結果、 「ヒト JTT-1抗原 j は、 先に詳細に述べた免疫グロブ リンスーパ一フアミリーに属するヒト由来の細胞膜分子である 「CD28」及び「CT LA-4j と次の点で構造的類似性を有していることが確認された （図 1 1及び図 1 2 ) 。 前述したとおり、 「CD28」 及び「CTLA-4」 は、 T細胞の活性化及び抑制を 制御する免疫系において極めて重要な分子である。
即ち、 ①システィン残基を含む 2 0以上のアミノ酸残基が良く保存されている。 ②： CD28及び CTLA-4におけるリガンド結合領域として必須なプロリン残基の連続 する配列 「ΡΓΟ-ΡΓΟ-ΡΓΟ ( ΡΡΡ ) 」 が保存されている。 また、 ③：細胞内ドメイン に、 CD28及び CTLA-4におけるシグナル伝達領域として必須な配列 「Tyr-Xaa-Xaa- Met (YxxM) (Xaa及び xは任意のアミノ酸を意味する。 ） が保存されている。
本発明の 「JTT-1抗原」 は、 そのような免疫反応の主役である T細胞の活性化の 制御において重要な役割を担う 「CD28」 及び「CTLA- 4」 に特徴的な構造と同一の 構造を有することから、 本発明の 「JTT-1抗原」 は、 それらの分子と同様に免疫反 応の主体である T細胞をはじめとしたリンパ球の活性化の制御において重要な役 割も果たす分子であることが推測される
[実施例 9 ] 「マウス JTT-1抗原」 をコードする cDNAのクロ一ニング
1 . プローブの作製
実施例 7で得たクローン 「T132A7」 を制限酵素 EcoRIおよび Notlで消化して、 「ラット JTT. 1抗原」 をコードする cDNA約 0.9kbを切り出し、 ァガ口一スゲル電気 泳動により分離した。 分離した DNA断片を 「QUIAEX gel extraction kit」 （QUIA TEN社製） を用いて精製し、 得られた DM断片を 「Ready- To-Go DNA labelling ki tj (Pharmacia社製） を用いて3 2 Pで標識した。 この標識 DNA断片をプラークハイ プリダイゼィ一シヨン用のプローブとして用いた。 2 . cDNAライブラリ一の作製
2 - ( 1 ) poly (A)+MAの抽出
実施例 7-卜（1 )と同様にして、 ConAで刺激したマウス脾臓由来リンパ芽球 （約 1 l06cells/ml) からの poly (A)+RNAを抽出した。
2 - ( 2 ) cDNAライブラリ一の作製
前記で調製した poly (A)+RNA 5m を錡型とし、 oligo dT プライマ一 （Pharmac ia社製) 及び「Time Saver cDNA Synthesis Kitj (Pharmacia社製） を用いて cD NAを合成した。 該 cDNAに EcoRIアダプタ一付加した後、 スパンカラム （Pharmacia 社製） を用いてサイズ分画を行った。
2— （3 ) ベクタ一への組み込み及びパッケージング
前記で得られた EcoRI末端を有する cDNAを、 EcoRIで処理したベクター 1ZAPI I (Stratagene社製） に連結した。 連結反応には 「DNA ligation Kit」 （宝酒造社 製） を用いた。 これを GIGA PACK I I GOLD (Stratagene社製） を用いて in vitro packagingした後、 得られたファージ粒子を用いて、 E coli XLlBlue MRF' (Stra tagene社製） を宿主として組み換えファ一ジを含有するプラークからなる cDNAラ イブラリーを作製した。
3 . cDNAライブラリ一のスクリーニング
スクリーニングは Rapid hybridization buffer (Amersham社製） を用いたプラ —クハイブリダィゼ一シヨン法 （Maniatis, T. et al . Molecular Cloning: A L abolatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) に従い行った。
前記で得られた cDNAライブラリ一 （1 X 104個） を寒天プレートに播種し、 Hybo nd-N nylon menbrane (Amersham社製） を用いてレプリカを作製した。 レプリカ及 び前記 9-1で作製した3 2 P標識プローブを用い、 Rapid hybridization buffer (A mersham社製） 中でプラークハイブリダィゼ一シヨンを行った。 1次スクリ一ニン グ及び 2次スクリーニングを行い、 5個のポジティブ . クローンを得た。 各クロ ーンをシングルプラークで単離後、 Stratagene社 Instruction Manualに従って in vivo Excisionに供し、 5クローンを plasmid DNAとして回収した。
4 . 塩基配列決定
5個のクローンの各々について、 ジデォキシ （dideoxy) 法により、 「Auto II ead Sequencing Kit」 (Pharmacia社製) 及び 厂 A.L.F.腿 sequencerj (Pharma cia社製） を用いて塩基配列を決定した。 該 5クローン中の 4個のクローンはすべ て同じ塩基配列を含んでいた。 「マウス JTT- 1抗原」 の全長をコードする cDNAの塩 基配列及び推定ァミノ酸配列を配列番号 5に記載する。
図 1 0から明らかなように、 「マウス JTT- 1抗原」 は、 「ラヅ ト JTT-1抗原」 と 同様に 2 0 0アミノ酸残基から構成され、 またマウス、 ラット及びヒ トの 「JTT- 1抗原」 は、 各々の間で有意なアミノ酸配列相同性 （6 0 %以上） を有していた。 5 . 「マウス JTT-1抗原」 の遺伝子の染色体上の位置の解析
「マウス JTT- 1抗原」 をコードする遺伝子 の染色体上の位置を、 蛍光インサイ チュウ （in situ) ハイブリダィゼ一シヨン法により解析した。
得られた 「マウス JTT-1抗原」 をコードする cDNAを3 2 Pで標識して常法に従って ハイブリダィゼ一シヨン用プローブを作製した。 このプロ一ブを用いて、 129 SV J マウスゲノミツク DNAラィブラリ一 （STRATAGENE社製） をスクリーニングし、 「マウス JTT-1抗原」 をコードするェクソンを含むマウスゲノミック DNAクロ一ン を取得した。 該ゲノミック DNAの構造を模式的に示した図を図 1 3に示す。
前記で得たゲノミック DNAクロ一ンをニックトランスレーションにより、 ジゴキ シゲニン dUTP (digoxigenin dUTP) で標識しプローブとした。 該標識プローブを 分断したマウス DNAを結合させた後、 50%ホルムアルデヒド、 10 硫酸デキストラン 及び 2 x SSCを含む溶液中で、 マウス胚性線維芽細胞由来の正常な細胞分裂中期 (metaphase) 染色体にハイブリダィズさせた。 特異的ハイブリダィゼ一シヨンシ グナルは、 ハイブリダィゼ一シヨン用スライ ドを蛍光標識した抗ジゴキシゲニン 抗体中でインキュべ一卜した後、 DAPIで染色することにより検出した。 初回の試 験においては、 その DNAサイズ及び現れたバンドの状況から、 1番染色体と思われ る最も巨大な染色体の近傍部分に特異的標識がなされた。 この情報に基づき、 1 番染色体のセントロメァ領域に特異的なプローブとともに前記ゲノミック MAクロ —ンを共ハイブリダ一ゼーシヨンさせた。 この結果、 1番染色体のセントロメァ 領域とその近傍の領域が特異的に標識された。 特異的ハイプリダ一ゼ一シヨンが 見られた 1番染色体 （ 1 0サンプル） を解析した結果、 前記ゲノミック DNAクロ一 ンはヘテロクロマチンとユークロマチンとの境界から 1番染色体のテロメァまで の距離の 3 3 %の位置、 即ち、 マウス 「CD28」 及び 「CTLA-4」 の遺伝子の染色体 上の位置と同一のバンド 「 1 C 3」 に存在することが明らかとなった。 総計 8 0 個の細胞分裂中期の細胞について解析した結果、 7 9個の細胞で該位置に特異的 標識が確認された。
この結果と実施例 8で得られた結果、 即ち 「JTT-1抗原」 と 「CD28」 及び 「CTL A-4j との構造的類似性を考え合わせると、 「JTT- 1抗原」 が 「CD28」 や 「CTLA- 4」 と同様なコスティミュレィ トリーシグナルの伝達及び/またはリンパ球の活性 化の制御に関与する重要な分子であることが推察される。
[実施例 1 0 ] 「ラット JTT-1抗原」 の変異体をコードする cDNAのクロ一ニン グ
実施例 7でクロ一ニングした 「ラット JTT-1抗原」 のオール夕ナティブ 'スプラ イシング変異体 (alternative splicing variant) をコードするものと考えられ る他の 1つの cDNAを下記のようにクローニングした。
1 . プローブの作製
実施例 7で得たクローン 「T132A7」 を制限酵素 EcoMおよび Notlで消化して、 「ラット JTT.1抗原」 をコードする cDNA約 0.9kbを切り出し、 ァガロースゲル電気 泳動により分離した。 分離した DM断片を 「QUIAEX gel extraction kit」 （QUIA TEN社製） を用いて精製し、 得られた DNA断片を 「Ready-To-Go DNA labelling ki t」 （Pharmacia社製） を用いて3 2 Pで標識した。 この標識 DNA断片をプラークハイ プリダイゼィーシヨン用のプローブとして用いた。
2 . cDNAラィブラリ一の作製
2 - （ 1 ) oly (A)+ Aの抽出
実施例 7-卜（1)と同様にして、 ラット胸腺腫細胞株 FTL435 (約 1 x 106cells/ml) からの poly(A)+RMを抽出した。
2— ( 2 ) cDNAライブラリーの作製
前記のように調製した poly (A)+RNA 5m を錶型とし、 oligo dT プライマ一 （P harmacia社製） 及び 「Time Saver cDNA Synthesis Kitj (Pharmacia社製） を用 いて cDNAを合成した。 該 cDNAに EcoRIアダプタ一を付加した後、 スパンカラム （P harmacia社製） を用いてサイズ分画を行った。
2 - ( 3 ) ベクタ一への組み込み及びパッケージング
前述のようにして得られた EcoRI末端を有する cDNAを、 EcoRIで処理したベクタ -IZAPI I (Stratagene社製) に連結した。 連結反応には 厂 DM ligation Kitj (宝酒造社製） を用いた。 これを GIGA PACK I I GOLD (Stratagene社製） を用いて in vitro packagingした後、 得られたファ一ジ粒子をもちいて、 E coli XLlBlue MRF' (Stratagene社製） を宿主として組み換えファージを含有するプラークから なる cDNAライブラリーを作製した。
3 . cDNAライブラリ一のスクリーニング
スクリ一ニングは Rapid hybridization buffer (Amersham社製） を用いてブラ —クハイブリダィゼ一シヨン法 （Maniatis, T. et al . olecular Cloning: A L abolatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) に従い行った。
前記で調製したで cDNAライプラリー （l x lO4個） を寒天プレートにまき、 Hybo nd-N nylon menbrane (Amersham社製） を用いてレプリカを作製した。 該レプリカ 及び前記 10-1で作製した3 2 P標識プローブを用い、 Rapid hybridization buffer (Amersham社製） 中でプラークハイブリダィゼ一シヨンを行った。 1次スクリ一 ニング及び 2次スクリーニングを行い、 2個のポジティブ · クローンを得た。 各 クローンをシングルプラークで単離後、 Stratagene社 Instruction Manualに従つ て in vivo Excisionに供し、 2クロ一ンを plasmid DNAとして回収した。
4 . 塩基配列決定
2個のクローンの各々について、 ジデォキシ （dideoxy) 法により 「Auto Read Sequencing Kitj (Pharmacia社製) ¾t A.L.F.DNA sequencer (Pharmacia社 製） を用いて 塩基配列を決定した。 2個のクローンはすべて同じ塩基配列を含ん でいた。 得られた 「ラッ ト JTT- 1抗原」 の全長をコードする cDNAの塩基配列及び推 定ァミノ酸配列を配列番号 6に記載する。 得られた cDNA配列から演繹されるアミ ノ酸配列 （配列番号 6 ) を、 実施例 7でクローニングした 「ラヅト JTT- 1抗原」 を コードする cDNA配列から演繹されるァミノ酸配列 （配列番号 4 ) と比較した （図 1 4 ) 。 その結果、 図 1 4から明らかなように、 本試験でクロ一ニングされた cD NAによりコードされるアミノ酸配列は、 実施例 7で得られた 「ラッ ト JTT.1抗原」 をコ一ドする cDNAによりコ一ドされるアミノ酸配列と比べ、 ① C末端の 3つの連 続するアミノ酸配列 （Met-Thr- Ser) が Thr- Ala-Proに変化している点、 並びに② 該 Thr-Ala-Proに続いてさらに 1 6の連続するアミノ酸残基 （Leu-Arg-Ala-Leu - G ly-Arg-Gly-Glu-His-Ser-Ser-Cys-Gln-Asp-Arg-Asn) が延長されているという 2 つの相違点以外は、 全く同一のアミノ酸配列であった。 このことからの本試験で クロ一ニングされた cDNAは、 実施例 7で得られた 「ラット JTT.1抗原」 のオール夕 ナティブ 'スプライシング変異体 (alternative splicing valiant) をコードし ていると考えられる。
[実施例 1 1 ] 組換え 「ヒト JTT- 1抗原 j 発現細胞の調製
実施例 8で取得したプラスミ ドクローン pBSh41を、 制限酵素 EcoRIで消化して、 「ヒト JTT-1抗原」 の全長をコードする cDNAを含む DNA断片を切り出した。 この DN A断片を、 DNAライゲ一シヨンキッ ト （宝酒造社製） を用いて、 同じく制限酵素 Ec oRIで処理したプラスミ KpEFneo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91， 158-162, 199 4) に挿入し発現べクタ一を作製した。 エレクトロボレ一シヨンにより、 該ベクタ —で CH0- K1細胞 （ATCC : CCL-61) を形質転換した。 細胞を、 Geneticin (0.8 mg/ ml ; GIBCO BRL製） 及び 10%ゥシ胎児血清 （fetal calf serum) を含有する HPMI16 40培地中で約 2週間培養することにより、 Geneticin耐性形質転換細胞を選別した c 組換え 「ヒト JTT-1枋原」 の発現は、 常法によりノーザンプロティングにより確認 した。
[実施例 1 2 ] 「ヒト JTT.1抗原」 に対するモノクローナル抗体の調製 実施例 1 1で調製した組換え 「ヒ ト JTT-1抗原」 を発現する形質転換細胞を、 ホ モジナイズし、 超遠心分離 （100，000 x g ) して、 細胞膜画分を含む遠心残さを回 収し、 PBSに懸濁させた。 得られた細胞膜画分を、 完全フロインドアジュバントと ともに BALB/cマウスのフッドパッ ド内に注射することにより初回免疫 （0日） し た。 さらに該細胞膜画分抗原を 7日目、 14日目および 28日目という間隔でフッ トパ ッ ド内に投与した。 最後の免疫から 2日後にリンパ節細胞を採取した。 該リンパ 節細胞とマウスミエローマ細胞 PAI (JCR NO. B0113; Res. Disclosure, Vol .217, P.155, 1982) とを 5 ： 1で混合し、 融合剤としてポリエチレングリコール 4000 (GIBC0製） を用いて細胞融合させることによりモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを作製した。 ハイブリ ド一マの選択は、 1 0 %ゥシ胎児血清とアミノプテ リンを含有する H A T含有 ASF104培地 （味の素製） 中で培養することにより行つ た。 各々のハイプリ ドーマの培養上清中に生成されたモノクローナル抗体の 「ヒ ト JTT- 1抗原」 に対する反応性は、 各々の培養上清を実施例 1 1で調製した組換え 「ヒト JTT-1抗原」 を発現する形質転換細胞と反応させた後、 FITC標識抗マウス I gG (Cappel製） と反応させることにより染色された細胞の蛍光強度を EPICS-ELIT Eフローサトメ一夕一で測定することにより確認した。 この結果、 「ヒト JTT-1抗 原」 に反応性を有するモノクロ一ナル抗体を産生する 1 0種以上のハイプリ ドー マが得られたことが確認された。
これらのハイプリ ドーマの内の 2種類 （各々クローン SA12及び SG430命名） の各 々 （ 1 06乃至 1 07個 /0.5ml/マウス） を、 ICR nu/nuマウス （雌、 7乃至 8週 齢） の腹腔内に注射した。 10乃至 20日後、 マウスを麻酔下で開腹し、 常法に 従って採取した腹水から 「ヒト JTT-1抗原」 に反応性を有する 2種類のモノクロ一 ナル抗体 （SA12及び SG430) を大量調製した。
[実施例 13] 「ヒト JTT- 1抗原」 に対するモノクローナル抗体のヒト末梢血 リンパ球に対する効果
実施例 8で述べたとおり、 「JTT- 1抗原」 は 「CD28」 や 「CTLA- 4」 と同様に免疫 反応におけるリンパ球細胞の活性化の制御に関与する可能性を有すると考えられ る。 この可能性を実証するため、 「ヒト JTT-1抗原」 に対するモノクローナル抗体 のヒトリンパ球に対する効果を細胞の増殖を指標として解析した。
96穴マクロタイ夕一プレートの各ゥエルに①実施例 12で調製した 「ヒト JT T-1抗原」 に対するモノクローナル抗体 SA12若しくは SG430のいずれか一方 （ 1 g/ml) のみ、 または②モノクローナル抗体 SA12若しくは SG430のいずれか一方 （ 1 jug/ml) とリンパ球の活性化における第 1シグナル付与のための抗 CD3モノクロ一 ナル抗体 0KT-3 ( l〃g/ml、 ォ一ソ 'ダイァノスティック ' システムズ社製） との 混合溶液を加えて 37°Cで 1時間培養して各ゥエルを該抗体でコ一ティングした。 プレートを RPMI1640培地で洗浄した後、 各ゥヱルに正常ヒト末梢血リンパ球 （IX 105cells/well) を加え、 10%ゥシ胎児血清を含む RPMI1640培地中で 3日間培養し た。 必要に応じて PMA (phorbol myri state acetate： 1 ng/ml) を添加した。 次い で、 各ゥエルに [3H] チミジン （3.7〃kBq/ゥエル） を添加して、 37。Cで 6時 間培養した。 細胞を回収 （ハ ^スト） し、 DNA内に取り込まれた [3H] チミジ ンの量を液体シンチレ一シヨンカウンター （ベヅクマン製） を用いて測定した。 なお、 いずれの抗体も加えない培養系を対照とした。 結果を図 1 5に示した。 モノクローナル抗体 SA12または SG430のいずれかの単独で処理した場合には、 い ずれの抗体を用いた場合にも対照に比べリンパ球が約 1 0倍に増殖した。 さらに、 0KT3との併用め場合には、 モノクローナル抗体 SA12または SG430のいずれを用いた 場合にもリンパ球が約 1 0 0倍に増殖した。
この結果は、 「JTT- 1抗原」 が、 リンパ球の活性化の制御において機能すること を示すものである。 また、 0KT3との併用により細胞増殖率が増幅されたことから、 「JTT- 1抗原」 が 「CD28」 や 「CTLA- 4」 と同様のコスティミュレィ トリ一 ' シグナ ルの伝達を担うことを示すものである。
[実施例 1 4 ] 実験的アレルギー性脳脊髄炎 （EAE) に対する 「JTT- 2抗体」 の効果
先に詳細に述べたように、 近年、 CD28/CTLA- 4- CD80/CD86の間のシグナル伝達を 調節することにより種々の自己免疫性疾患 （慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 自己免疫性甲状腺炎、 アレルギー性接触性皮膚炎、 慢性炎症性皮膚疾患である扁 平苔癬、 全身性エリテマトーデス、 インスリン依存性糖尿病及び乾癬など） の治 療の試みが多数なされてきている。 既に、 種々の自己免疫疾患モデル動物 （①ヒ ト全身性エリテマト一デス （SLE) のモデル、 ②多発性硬化症 （MS) のモデルであ る実験的アレルギー性脳脊髄炎 （EAE) 、 ③インスリン依存性糖尿病 （IDDM) モデ ル、 ④グッドバスチヤ一 （Goodpasture) の腎炎モデル、 ⑤ヒト慢性関節リウマチ モデル） でその効果が確認されている。
本発明の 「JTT- 1抗原」 が 「CD28」 や 「CTLA- 4」 のようなリンパ球の活性化ある いはその抑制に関与する分子であるか否かを確認するため、 多発性硬化症 （MS) のモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎 （EAE) モデルラッ 卜を作製し、 該モ デルにおける 「JTT-1抗原」 に対するモノクローナル抗体の効果を解析した。
Hartleyモルモットの脳脊髄ホモジネート （800mg/ml生理食塩水） を等量のフロ ィンド完全アジュバントと混和して免疫感作抗原としてのェマルジヨンを調製し た。 該ェマルジヨンを、 ルイスラヅト （雌、 6週齢、 1 5匹） の左右の足趾に各 々0.25mlずつ皮内投与することにより免疫感作した。 なお、 該投与は、 該ホモジ ネートの投与量がラッ 卜 1匹あたり 200mgとなるように行った。 この免疫感作によ り、 アレルギー性脳脊髄炎 （EAE) を誘導させることができる。 免疫感作したラットを 5匹ずつの 3群に分け、 各群毎に、 次の①乃至③のいず れかを、 免疫感作直後 （0日） 並びに該免疫感作から 3曰目、 6曰目、 9曰目及 び 1 2日目に静 内投与した。
①実施例 2で作製した 「ラット JTT- 1抗原」 に対するモノクローナル抗体 「JTT -2抗体」 （投与量： 2mg/ml PBS, 5mg/kg) ；
②ステロイ ド剤プレドニゾロン （投与量： 4mg/ml PBS, 10mg/kg) ；及び
③ 「ラッ 卜 JTT-1抗原」 に反応しない対照抗体 （投与量： 2mg/ml PBS, 5mg/kg) c 免疫感作から経時的に症状を観察し、 EAE発症が認められた時点からその症状を 次の基準にてスコア化することにより症状の程度を評価した。
(スコア 1 ) 尾の緊張の消失；
(スコア 2 ) 後肢のひきずり、 及び軽度の麻痺；
(スコア 3 ) 後肢のひきずり、 及び重度の麻痺；及び
(スコア 4 ) 全身の麻痺または死亡。
結果を図 1 6に示す。 対照抗体を投与した群では、 免疫感作から 11乃至 15日目 に EAE症状がピーク （スコア最大） となり、 その後漸次回復した。 一方、 「JTT- 2 抗体」 投与群では、 感作後 11日目の EAE症状の発症が有意に抑制された。 この抑制 効果はプレドニゾロン投与群に比べ有意に高いものであった。
この結果は、 「JTT-1抗原」 は、 外来抗原による免疫感作により惹起されるリン パ球の活性化をはじめとした免疫応答の誘導において機能する分子であり、 「JT T-1抗原」 あるいはそのリガンドの機能を制御することにより種々の自己免疫疾患 の症状を抑制できることを示すものである。
[実施例 1 5 ] 糸球体腎炎に対する 「JTT- 2抗体」 の効果
実施例 1 4と同様の目的のために、 糸球体基底膜 （GBM) 腎炎モデルラッ 卜を作 製し、 該モデルにおける 「JTT- 1抗原」 に対するモノクローナル抗体の効果を解析 した。
コラゲナ一ゼにより消化したゥシ糸球体基底膜 （重井医学研究所製） を生理食 塩水で 200〃g/mlの濃度に希釈した後、 フロインド完全アジュバントと混和して免 疫感作抗原としてのェマルジヨンを調製した。 ェ一テル麻酔下で、 ウィスター ' キヨート系ラット （wister kyoto, 約 200 g , 48匹） の両後肢足底皮内に各々約 0. 2ml (抗原量：約 15〃g) ずつ投与することにより免疫感作した。 この免疫感作に より糸球体基底膜 （GBM) 腎炎が誘導される。
免疫感作したラットを 6匹ずつの 8群に分け、 各群毎に、 次の①乃至③のいず れかを、 免疫感作直後 （0曰） 並びにその後 1週間に 3回ずつ 5週間に渡り投与 した。
①実施例 2で作製した 「ラッ ト JTT-1抗原」 に対するモノクローナル抗体 「JTT -2抗体」 （投与量： 3mg/kg (2ml PBS/kg), 静脈内投与） ；
②陽性対照としてのステロイ ド剤プレドニゾロン （0.5% CMC (カルボキシメチ ルセルロース） 中に懸濁） （投与量： 3mg/kg (5ml/kg) , 経口投与） ；及び
③陰性対照としての 0.5 CMC (投与量： 5ml/kg， 経口投与） 。
被験物質の投与後、 各々のラッ 卜に滅菌水 （25ml/kg) を強制経口投与し、 1匹 ずつ代謝ケ一ジ内に入れ絶食絶水下で 5時間に渡り尿を採取した。 採取した尿の 量を測定後、 尿中蛋白濃度をトネイン TP- I I (大塚製薬製） を用いて測定し、 5時 間あたりの尿中蛋白排泄量 （単位： m蛋白 /5時間） を算出した。 前記尿採取並び に尿中蛋白量の測定は、 免疫感作 （0日目） から 1週間目、 2週間目、 3週間目 及び 4週間目の各時点で同様にして行った。
結果を図 1 7に示した。 対照群に比べ、 「JTT-2抗体」 投与群では、 免疫感作か ら 3週間目の尿中蛋白蛋白排泄量を有意に減少させた。
この結果は、 「JTT-1抗原」 は、 外来抗原による免疫感作により惹起されるリン パ球の活性化をはじめとした免疫応答の誘導において機能する分子であり、 「JT T - 1抗原」 あるいはそのリガンドの機能を制御することにより種々の自己免疫疾患 の症状を抑制できることを示すものである。
[実施例 1 6 ] 「JTT- 1抗原」 と I g F cとの融合蛋白の調製 実施例 8、 1 3乃至 1 5で述べたように、 本発明の 「JTT- 1抗原」 は、 「CD28」 や 「CTLA- 4」 のようなリンパ球の活性化の制御に係わるコスティミュレィ トリー
•シグナル伝達に関与する分子であると考えられる。 また、 実施例 1 4で述べた とおり、 「CTLA- 4」 の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリン IgGlの F c領域とか らなる融合タンパク （CTLA- 4- IgFc) は、 種々の自己免疫疾患の治療効果を有する ことが報告されている。 本実施例では、 CTLA-4- IgFcと同様の可溶化 JTT- 1抗原の 種々自己免疫疾患の治療への適用可能性を確認するため 「JTT-1抗原」 の細胞外領 域をヒト IgGFcとからなる融合蛋白を下記のように調製した。
( 1 ) 「ラット JTT-1抗原」 とヒト IgGl- Fcとの融合蛋白 （rJTT- 1- IgFc) の調製 「ラッ 卜 JTT- 1抗原」 の細胞外領域をコ一ドする cDNAを P C Rで増幅するために、 末端に Xhol切断部位を有する 5'ブラィマ一 （5' -CTGCTCGAGATGAAGCCCTACTTCTCG-3 '、 配列番号 7 ) 及び BajnHI切断部位を有する 3，プライマー （5， - ACCCTACGGGTAACG GATCCTTCAGCTGGCAA-3' 配列番号 8 ) を設計、 合成した。 実施例 7で取得した
「ラット JTT- 1抗原」 の全長をコードする cDNAをクローン 「T132A7」 を錡型として 該プライマ一を用いて P C Rを行い、 両端に Xhol及び BamHI切断部位を各々有する
「ラット JTT- 1抗原」 の細胞外領域をコードする cDNAを含む cDNAを調製した。 得ら れた P C R産物を Xhol及び BamHIで消化し、 ァガロースゲル電気泳動し、 目的の細 胞外領域をコードする cDNA断片と予測される約 450bpのサイズのバンドを単離した。 単離された cDNA断片を、 Xhol及び BamHIで切断したプラスミ ド pBluescript I I SK ( + ) (Stratagene製） 中にサブクローニングした。 自動蛍光 DNAシークェンサ一
(Appl ied Biosystems製) による配列解析により、 該 cDNA断片は、 「ラヅト JTT- 1 抗原」 （配列番号 4 ) のアミノ酸番号 1乃至 1 4 1迄の領域をコードする領域 を含むことを確認した。
一方、 融合パートナーとしてのヒト IgGlの F cをコードする DNAは、 プラスミ ド
(Cell , Vol .61 , p. 1303-1313 , 1990参照。 マサチューセッツ 'ゼネラル 'ホスビ タルのシード博士 （B. Seed) らにより作製） を、 BamHI及び Xbalで消化すること により BamHI- Xbal D N A断片 （約 1.3kb) として切り出した。 この断片には、 ヒト IgGlのヒンジ領域、 Cァ 1 2、 及び Cァ 1 3の各々コードするェクソンが含まれる。 前記のようにして作製した 「ラット JTT- 1抗原」 の細胞外領域をコードする Xho I - BajnHI断片、 及びヒト IgGlの Fc ( 「IgFc」 と略記する） をコードするェクソンを 含む BamHI-Xbal断片を、 Xhol及び Xbalで切断したプラスミ ド pBluescript I I SK (+ ) (Stratagene製） 中にサブクローニングした。
次いで、 該プラスミ ドを Xhol及び Xbalで消化し、 「ラヅト JTT- 1抗原」 の細胞外 領域とヒト IgFcとからなる融合 DNAを含む約 1.8kbの DNA断片を切りだした。 この融 合 DNA断片を、 T4 DNAリガ一ゼを用いて、 発現べクタ一 pME18S (Medical Immunol ogy, Vol .20, No. l , p.27-32, 1990、 及び実験医学 （別冊） ： 「遺伝子工学ハン ドブック」 、 羊土社、 第 10卜 107頁、 1992年） の Xhol及び Xbal部位に挿入し、 ブラ スミ ド prJTT-；！-IgFcを構築した。
エレクトロボレ一シヨン法により、 10%ゥシ胎児血清及びアンビシリンを含む D MEM培地中でサブコンフルェントに単層培養した HEK293細胞 （ATCC CRL1573) を、 ブラスミ ド prJTT-1-IgFcで形質転換し、 形質転換細胞を取得した。
形質転換細胞を、 無血清 ASF104培地中で 72時間培養することにより rJTT- 1- IgF cを発現させた。
rJTT- 1- IgFcは、 Protein G Sepharoseァフィ二ティ—カラム （Pharmacia製） を 用いて次のように精製した。
前記培養上清を遠心分離して得た遠心上清を、 予め結合緩衝液 （binding buff er) で平衡化した Protein G Sepharoseァフィ二ティ一カラムに加えた。 次いで、 カラムを結合緩衝液で洗浄した後、 溶出緩衝液 （elution buffer) で溶出させた。 溶出液を回収し、 リン酸緩衝液で 2回以上外液交換することにより透析し、 精製 rJTT- 1- IgFcを得た。
ァフィ二ティ一カラムクロマトグラフィーの結果を図 1 8に、 また得られた精 製 rJTT- 1- IgFcの SDS-PAGEの結果を図 1 9に示す。 ( 2 ) 「ヒト JTT-1抗原」 とヒト IgG卜 Fcとの融合蛋白 （hJTT-:l-IgFc) の調製
P C R用における铸型としての cDNA及びプライマ一を除いては、 前記 （ 1 ) と 同様にして調製した。 本試験では、 錡型としては、 実施例 8で作製した 「ヒト JT T-1抗原」 の全長をコードする cDNAを含むクロ一ン 「pBSh41」 を用い、 また 5，プライマ一としては 5， -TAACTGTTTCTCGAGAACATGAAGTCAGGC-3' (配列番号 9 ) を、 3'プライマ一としては 5， -ATCCTATGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGC-3' (配列番号 1 0 ) を用いた。
ァフィ二ティ一カラムクロマトグラフィ一の結果を図 2 0に、 また得られた精 製 hJTT-1- IgFcの SDS- PAGEの結果を図 2 1に示す。
[実施例 1 7 ] 「ラット JTT-1抗原」 をコードする cMA導入トランスジェニッ クマウスの作製
実施例 7で取得した 「ラット JTT-1抗原」 の全長をコードする c D N Aを、 ニヮ トリ/?ァクチンプロ一モ一夕一を有する発現べクタ一 pCAGGS ( Gene, Vol . 108, p. 193-200, 1991 ) に、 D N A末端平滑化キット （夕カラ社製） を用いて挿入し、 プラスミ ド prJTT- 1を得た。 トランスジエニックマウス作製のために、 prJTT- 1を 制限酵素処理して直鎖状にした。
仮親マウスには、 白色 I C Rマウス （雌、 日本エスエルシー社製） と精管結紮 した白色 I C Rマウス （雄、 日本エスエルシ一社製） とを交配して得られたブラ グ （または膣栓） を有する雌 I C Rマウスを用いた。 また、 「ラット JTT- 1抗原」 遺伝子を導入するための受精卵を得るための採卵用マウスは、 PEAMEX ( 5ュニッ ト、 三共ゾ一キ社製） 及びプレグニール （5ユニット、 オルガノン社製） を投与 することにより過剰排卵させた BDF-1マウス （雌、 日本エスエルシ一社製） を BDF - 1マウス （雄、 日本エスエルシ一社製） と交配させて作製した。 交配後、 BDF- 1マ ウス （雌） から卵管部を摘出し、 ヒアルロニダ一ゼ処理により受精卵のみを得、 培地中で保存した。
受精卵への 「ラット JTT- 1抗原」 遺伝子の導入は、 顕微鏡下でマニピュレータ一 を用いて常法により行った。 受精卵を保定針で固定し、 3 7 °C条件下、 トリス E D T A緩衝液で希釈した 「ラット JTT-1抗原」 をコードする前記直鎖状遺伝子を含 有する溶液を、 D N A導入針を用いて受精卵の雄性前核内に注入 （マイクロイン ジェクシヨン） した。
遺伝子導入後、 正常な状態を保持する受精卵のみを選別し、 仮親マウス （白色 I C Rマウス） の卵巣内にある卵管采に、 「ラット JTT-1抗原」 遺伝子導入受精卵 を挿入した。
仮親から生まれた子マウス （フアウンダー） の尾を切取りゲノム遺伝子を回収 し、 P C Rによりマウスゲノム内に 「ラット JTT- 1抗原」 遺伝子が導入されている ことを確認した。 次いで、 このフアウンダ一を正常マウスと交配させることによ り 「ラッ ト JTT-1抗原」 を高発現するへテロトランスジエニックマウスを作製した c 該ヘテロマウス同士を掛け合わせることによりホモマウスを作製できる。
マイクロインジェクションした 「ラッ ト JTT- 1抗原」 遺伝子を含むコンストラク トの模式図を図 2 2に示す。
[実施例 1 8 ] 「マウス JTT-1抗原」 をコードする内在性遺伝子を不活性化し たノックァゥトマウスの作製
( 1 ) 夕ーゲティングベクタ一の構築
「マウス JTT-1抗原」 をコードする内在性遺伝子を相同組換え （日経サイエンス、 1994年 5月号、 第 52- 62頁） により不活性化 （ノックアウト） するための夕一ゲテ ィングベクタ一を下記のようにして構築した。
実施例 9 — 5でクローニングした 「マウス JTT- 1抗原」 をコードする領域を含む マウスゲノミック DNAクローンを、 Pstl及び Hindl l lで消化して得た Pstl- Hindll l 断片 （ 「相同 DNA①」 ） を、 プラスミ ド pGEM- 3 (プロメガ製） にサブクローニング した。 次いで、 pGEM-3を Xholで開環し、 プラスミ ド pMC卜 neo- polyA (Stratagene 製） を Xhol及び Sailで処理して切り出したネオマイシン耐性遺伝子 （ 「neo」 ) を、 該 「相同 DNA①」 の上流に挿入、 連結した。 前記マウスゲノミック DNAクローンを Xhol及び Notlで消化して、 上述の 「相同 D NA①」 より上流に位置する約 5.5kbの遺伝子 （ 「相同 DNA②」 ) を切り出した。 一 方、 前述の 「neo—相同 DNA①」 を挿入した pGEM- 3を、 Xhol及び Hindi I Iで消化して 「neo—相同 DNA①」 を切り出した。 得られた 「相同 DNA②」 と 「neo—相同 DNA①」 を、 Notl及び Hindl l lで開環したプラスミ ド pSEAP2-C0NT (クローンテック製） に サブクローニングした。
得られたプラスミ ド （ 「相同 DNA②—neo—相同 DNA①」 が挿入されている） を、 Nrulを用いて 「相同 DNA①」 の下流で消化、 開環した後、 プラスミ ド pMC卜 TK (St ratagene製） を PvuI Iで消化して得たチミジンキナーゼ遺伝子 （ 「TK」 ） を、 「相 同 DNA①」 の下流に挿入、 連結し、 夕ーゲティングぺク夕一 （ 「相同 DNA②ー neo— 相同 DNA①ー TK」 が挿入されている） を得た。
( 2 ) 夕一ゲティングベクタ一の E S細胞への導入
15 ゥシ胎児血清を含有する DMEM培地中で培養したマウス胚性幹細胞 （ES細胞； embryonic stem cell) (Nature, Vol .362, p.255-258, 1993及び Nature, Vol.3 26， p.292-295， 1987) をトリプシンで処理して単一細胞とした後、 リン酸緩衝液 で 3回洗浄して細胞濃度を 1 X 1 0 7細胞/ mlに調製した。 細胞懸濁液 l mlあたり 25Aigの前記夕一ゲティングぺク夕一を加え、 350V/cm (25 zF) の条件下で電気パ ルスを 1回かけた。 次いで、 シャーレ （10cm) に 1 X 1 0 7細胞の ES細胞を播種し 維持培地中で 1日培養した後、 培地を選択培地 （G418(250〃g/ml )及び のガン シクロビルを含有する） に交換した。 以後 2日毎に培地交換を行い培養した。 夕 —ゲティングベクタ一導入から 1 0日目に、 マイクロビぺヅトを用いて、 顕微鏡 下で 573個のネオマイシン耐性 ES細胞クローンを取得した。 得られた E S細胞クロー ンを、 Feeder細胞を敷いた 24穴プレートで各々別々に培養することにより、 768個 のネオマイシン耐性 ES細胞のレプリカを取得した。
( 3 ) ノックアウト E S細胞のスクリーニング
得られたネオマイシン耐性 ES細胞の各々について、 相同組換えによる 「マウス JTT-1抗原」 をコードする内在性遺伝子の破壊 （ノックアウト） が起こっているか 否かを P CRにより確認した。
P CRには、 （ 1 ) 前記ネオマイシン耐性遺伝子 （ 「neo」 ) の配列に基づいて 設計、 合成したプライマ一 （5'-CGTGATATTGCTGMGAGCTTGGCGGCGMTGGGC-3，、 配列 番号 1 1 ) ) 及び②前記 「相同 DNA①」 の配列に基づいて設計、 合成したプライマ ― (5' -CATTCAAGTTTCAGGGAACTAGTCCATGCGTTTC-3' , 配列番号 1 2 ) を用いた。 各々のネオマイシン耐性 ES細胞について、 ゲノミヅク DNAを抽出し、 それらを铸 型とし、 該ブライマ一を用いて P CRを行った。 P CRは、 94°Cで 3分の反応 を 1サイクル、 9 4°〇で 1分、 6 0°Cで 1分及び 7 2°Cで 3分 3 0秒の 3つの反 応からなる反応を 3 0サイクル、 並びに 72 で 1 0分の反応を 1サイクル行つ た後、 4°Cで保存した。 この P CRにより約 4 kb弱のフラグメントが増幅され る場合には、 その E S細胞クローンでは相同組換えによる 「マウス JTT- 1抗原」 を コードする内在性遺伝子の破壊 （ノックアウト） が起こっていると判断できる。 その結果、 試験した 7 6 8個の ES細胞クローンのうち、 3クローンにおいて目 的の P CR産物が得られた。 これら 3クローンについてゲノミックサザンブロッ ティングを行い、 さらに選抜及び確認をした。 該 3クロ一ンのゲノミック DNAを抽 出し、 制限酵素 BaiiiHIで消化後、 ァガロースゲルで電気泳動を行った。 これをナイ ロンメンブランにトランスファ一し、 「マウス JTT- 1」 のゲノミック DNA配列によ り作製したプローブを用いて、 ハイブリダィゼ一シヨンを行った。 該プローブは、 相同組み換えが起こる部位より外側の配列であって、 変異型ゲノムと通常型ゲノ ムをサイズ的に見分けられるような部位の配列を基に設計した。
その結果、 3クローンの内の 1クローンで、 変異型と通常型の 2本のバンドが確 認された。 この ES細胞クローンを下記に述べるノックァゥトマウスの作製に用い た。
(4) ノックァゥ卜マウスの作製
前記で得た 「マウス JTT-1抗原」 をコードする内在性遺伝子が相同組換えにより 不活性化 （ノックアウト） された ES細胞を、 C57BL6マウス （日本チャールズリバ 一製） の雄雌を交配して得た胚盤胞に 1胚あたり 1 5個ずつ注入 （マイクロイン ジェクシヨン） した。 注入直後に、 偽妊娠処理してから 2.5日目の仮親 ICRマウス (日本クレア製） の子宮に子宮の片側あたり約 1 0個ずつの胚盤胞を移植した。 その結果、 合計 3 8匹の産児を得、 その内の 1 8匹が目的のキメラマウスでつた。 毛色への貢献度が 80%以上のキメラマウスは、 1 1匹であった。
次いで得られたキメラマウスを正常 C57BL6マウスと交配し、 ES細胞由来の毛色 遺伝子によるァグーチ （agouti) 色のマウスを得た。
[実施例 1 9 ] 抗体医薬組成物の調製
実施例 1で調製した 「ラヅト JTT- 1抗原」 に対するモノクローナル抗体 「JTT-1 抗体」 及び 「JTT-2抗体」 の各々、 並びに実施例 1 2で調製した 「ヒト JTT- 1抗 原」 に対するモノクローナル抗体 「SA12」 及び 「SG430」 の各々 （5 0〜 1 5 0 g/m l ) を注射用蒸留水 （ 1 0 m l ) に加え注射剤とした。 産業上の利用可能性
本発明により提供される、 ヒト、 マウス及びラッ トなどの哺乳動物由来の新規 な細胞表面分子 （ 「JTT-1抗原」 と呼ぶ） は下記のような特徴を有するものである c
( 1 ) T細胞の活性化に重要なコスティミュレィ トリ一シグナルを細胞間接着 を介して伝達する T細胞等のリンパ球の細胞表面分子である 「CD28」 並びに該シ グナルに連動して活性化 T細胞等の活性化リンパ球の機能制御を行う T細胞等の リンパ球の細胞表面分子である 「CTLA-4」 と下記のような類似性を有する。
①システィン残基を含む 2 0以上のァミノ酸残基が良く保存されている。
②リガンド結合領域として必須なプロリン残基の連続する配列 「Pro- Pro-Pro (PPP) 」 が細胞外領域に保存されている。
③シグナル伝達領域として必須な配列 「Tyr-Xaa- Xaa-Met (YxxM) (Xaa及び xは 任意のアミノ酸を意味する。 ） が細胞内領域に保存されている。 ④ 「マウス JTT-1抗原」 をコードする遺伝子のマウス染色体上での位置は、 マウ スの 「CD28」 及び 「CTLA-4」 の位置と同く、 「 1 C 3」 である。
( 2 ) 細胞間接着を媒介する機能を有する 「CD28」 及び 「CTLA-4」 と同様に、 「JTT-1抗原」 は胸腺細胞、 ConAなどのマイ トジェンで刺激したリンパ芽球及び胸 腺腫細胞の細胞間接着を媒介する能力を有する。
( 3 ) 少なくとも胸腺細胞、 ConAなどのマイ トジェンで刺激したリンパ芽球細胞 (活性化 Tリンパ芽球細胞や活性化 Bリンパ芽球細胞） 、 末梢血リンパ球及び胸 腺腫細胞で強く発現する。
( 4 ) 「JTT-1抗原」 に体する抗体は、 ヒト末梢血リンパ球を有意に増殖させ、 ま たその増殖は、 T細胞の活性化に必須な抗原提示細胞からの第 1のシグナルを受 け取る T細胞上の TcR/CD3複合体を構成する CD3に対するモノクローナル抗体を共 存させることによりさらに高い増殖を誘導する。
( 5 ) 「JTT-1抗原」 に体する抗体を、 実験的アレルギー性脳脊髄炎 （E A E ) に 投与することにより、 その病状が有意に抑制がされる。
( 6 ) 「JTT-1抗原」 に体する抗体を、 糸球体基底膜 （GBM) 腎炎のモデルラット に投与することにより、 その病状が有意に抑制がされる。
このような特徴から、 本発明の 「JTT- 1抗原」 は、 前記 「CD28」 や 「CTLA- 4」 と 同様に、 T細胞等のリンパ球の活性化に必須な第 2のシグナル （コスティミュレ ィ トリーシグナル） の伝達、 並びに該シグナルに連動して活性化 T細胞等の活性 化リンパ球の機能制御を行う分子であると考えられる。
従って、 そのような細胞表面分子を構成する本発明のポリペプチド、 ポリぺプ チド断片、 融合ポリベプチド及び抗体は、 T細胞等のリンパ球の活性化並びに活 性化リンパ球の機能制御の異常に起因する種々の自己免疫性疾患、 アレルギー性 疾患または炎症性疾患、 具体的には、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 自己免 疫性甲状腺炎、 アレルギー性接触性皮膚炎、 慢性炎症性皮膚疾患である扁平苔癬、 全身性エリテマト一デス、 ィンスリン依存性糖尿病及び乾癬などの治療または予 防に極めて有用な医薬品を提供することが可能である。
同様に、 本発明のポリべプチドあるいはポリべプチド断片をコ一ドする遺伝子 は、 該種々疾患の遺伝子治療を可能とするだけでなく、 アンチセンス医薬品を提 供することが可能である。
本発明の抗体の中でも、 ヒトモノクローナル抗体及びその医薬組成物は、 マウ ス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来の抗体からなる抗体医薬品の治療上の大き な問題点 （副作用） であったヒトに対する抗原性を全く有しないことから、 医薬 品としての価値を劇的に増大させるものである。
また、 本発明の遺伝子 （D N A ) 、 ポリペプチド、 ポリペプチド断片及び抗体 は、 医薬品として有用なだけでなく、 本発明の細胞表面分子と相互作用を有する 分子 （リガンド） の探索、 該リガンドの機能の解明、 並びに該リガンドをタ一ゲ ットとした治療薬を開発するための試薬として有用である。
また、 本発明のトランスジエニックマウスは、 本発明の細胞表面分子である 「JTT-1抗原」 の生理学的機能を解明するためのモデル動物として有用であるだけ でなく、 「JTT- 1抗原」 の機能を制御 （阻害、 抑制、 活性化、 刺激など） する活性 を有する種々の医薬 （低分子化合物、 抗体、 アンチセンス、 ポリペプチドなど） をスクリーニングするためのツールといして極めて有用である。 即ち、 そのよう な被験物質を該トランスジェニヅクマウスに投与し、 該マウスの生体に起こる種 々の生理学的、 生物学的あるいは薬理学的パラメ一夕一を測定、 解析することに より投与された被験物質の活性を評価することが可能である。
また、 本発明のノックアウトマウスは、 該マウスの特徴を種々の側面 （生理学 的、 生物学的、 薬理学的、 病理学的及び遺伝子的等の側面） から分析することに より、 本発明の細胞表面分子の機能を解明することを可能とする。 配列表
( 1 ) 出願人の氏名又は名称： 日本たばこ産業株式会社
(2) 発明の名称： 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
( 3 )整理番号： J 1一 802PCT
( 4 ) 出願番号：
(5) 出願日：
(6)優先権のもととなった出願をした国名及び出願の番号
日本国 平成 9年特許願第 062290号
日本国 平成 1 0年 2月 26曰提出の特許願 （整理番号 J1-802DP1)
(7) 優先曰： 平成 9年 2月 27曰
(8) 配列の数： 12 配列番号： 1
配列の長さ ： 600
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
起源
生物名： ヒ卜 (human)
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1 .. 600
特徴を決定した方法： E
配列：
ATG AAG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC 30
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu οοε OVO 3X1 OW DVI VXD XDX 010 XOV
06 S8
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01 S I 6
Z.£800/86df/XDd 9IZ8£/86 OAV Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp
95 100
CAT TCT CAT GCC AAC TAT TAC TTC TGC AAC 330 His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn
105 110
CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA 360 Leu Ser l ie Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys
115 120
GTA ACT CTT ACA GGA GGA TAT TTG CAT ATT 390 Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His l ie
125 130
TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG 420 Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys
135 140
TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 450 Phe Trp Leu Pro l ie Gly Cys Ala Ala Phe
145 150
GTT GTA GTC TGC ATT TTG GGA TGC ATA CTT 480 Val Val Val Cys l ie Leu Gly Cys l ie Leu
155 160
ATT TGT TGG CTT ACA AAA AAG AAG TAT TCA 510 l ie Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser
165 170
TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAC GGT GAA TAC 540 Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
175 180 ATG TTC ATG AGA GCA GTG AAC ACA GCC AAA 570 Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys
185 190
AAA TCT AGA CTC ACA GAT GTG ACC CTA TAA 600 Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195 配列番号： 2
配列の長さ ： 199
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名 ： ヒ卜 (human)
配列：
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu
1 5 10
Phe Cys Leu Arg lie Lys Val Leu Thr Gly
15 20
Glu l ie Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met
25 30
Phe He Phe His Asn Gly Gly Val Gin He
35 40
Leu Cys Lys Tyr Pro Asp l ie Val Gin Gin
45 50
Phe Lys Met Gin Leu Leu Lys Gly Gly Gin 55 60 lie Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70 Ser Gly Asn Thr Val Ser lie Lys Ser Leu
75 80 Lys Phe Cys His Ser Gin Leu Ser Asn Asn
85 90 Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp
95 100 His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn
105 110 Leu Ser lie Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys
115 120 Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His lie
125 130 Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys
135 140 Phe Trp Leu Pro lie Gly Cys Ala Ala Phe
145 150 Val Val Val Cys lie Leu Gly Cys lie Leu
155 160 lie Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser
165 170 Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
175 180 Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys 185 190
Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195 配列番号： 3
配列の長さ ： 2610
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （3'及び 5'末端塩基配列を含む cDNA) 起源
生物名： ヒ卜 (human)
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置：26 . . 625
特徴を決定した方法： E
配列：
GGACTGTTAA CTGTTTCTGG CAAAC 25 ATG AAG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC 55 Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu
5 10
TTC TGC TTG CGC ATT AAA GTT TTA ACA GGA 85 Phe Cys Leu Arg lie Lys Val Leu Thr Gly
15 20
GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG 115 Glu lie Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met
25 30 OJJ OJ(J OJJ dsy 9iid 9 i i jag na
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GTA ACT CTT ACA GGA GGA TAT TTG CAT ATT 415 Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His lie
125 130
TAT GAA TCA C CTT TGT TGC CAG CTG AAG 445 Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys
135 140
TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 475 Phe Trp Leu Pro l ie Gly Cys Ala Ala Phe
145 150
GTT GTA GTC TGC ATT TTG GGA TGC ATA CTT 505 Val Val Val Cys lie Leu Gly Cys l ie Leu
155 160
ATT TGT TGG CTT ACA AAA AAG AAG TAT TCA 535 l ie Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser
165 170
TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAC GGT GAA TAC 565 Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
175 180
ATG TTC ATG AGA GCA GTG AAC ACA GCC AAA 595 Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys
185 190
AAA TCT AGA CTC ACA GAT GTG ACC CTA TAA 625 Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
TATGGAACTC TGGCACCCAG GCATGAAGCA CGTTGGCCAG TTTTCCTCAA 675
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J-WED}J-V VSV GCCCTTCAAG ATAGCCTTCT TTAGAATATG ATTTGGCTAG AAAGATTCTT 2025 AAATATGTGG AATATGATTA TTCTTAGCTG GAATATTTTC TCTACTTCCT 2075 GTCTGCATGC CCAAGGCTTC TGAAGCAGCC AATGTCGATG CAACAACATT 2125 TGTAACTTTA GGTAAACTGG GATTATGTTG TAGTTTAACA TTTTGTAACT 2175 GTGTGCTTAT AGTTTACAAG TGAGACCCGA TATGTCATTA TGCATACTTA 2225 TATTATCTTA AGCATGTGTA ATGCTGGATG TGTACAGTAC AGTACWTAAC 2275 TTGTAATTTG AATCTAGTAT GGTGTTCTGT TTTCAGCTGA CTTGGACAAC 2325 CTGACTGGCT TTGCACAGGT GTTCCCTGAG TTGTTTGCAG GTTTCTGTGT 2375 GTGGGGTGGG GTATGGGGAG GAGAACCTTC ATGGTGGCCC ACCTGGCCTG 2425 GTTGTCCAAG CTGTGCCTCG ACACATCCTC ATCCCAAGCA TGGGACACCT 2475 CAAGATGAAT AATAATTCAC AAAATTTCTG TGAAATCAAA TCCAGTTTTA 2525 AGAGGAGCCA CTTATCAAAG AGATTTTAAC AGTAGTAAGA AGGCAAAGAA 2575 TAAACATTTG ATATTCAGCA ACTGAAAAAA AAAAA 2610 配列番号： 4
配列の長さ ： 2072
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （3'及び 5'末端塩基配列を含む cDNA) 起源
生物名：ラット （rat)
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置 : 35 . . 637
特徴を決定した方法： E
配列： CTGGAGGGGA AGAGTGCAGC TGTTCCTGGC AGAC 34 ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC GTC TTT GTC 64 Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Val Phe Val
1 5 10
TTC TGC TTC CTA ATC AAA CTT TTA ACA GGA 94 Phe Cys Phe Leu lie Lys Leu Leu Thr Gly
15 20
GAA CTC AAT GAC TTG GCC AAT CAC AGG ATG 124 Glu Leu Asn Asp Leu Ala Asn His Arg Met
25 30
TTT TCG TTT CAC GAT GGA GGT GTA CAG ATT 154 Phe Ser Phe His Asp Gly Gly Val Gin He
35 40
TCT TGT AAC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 184 Ser Cys Asn Tyr Pro Glu Thr Val Gin Gin
45 50
TTA AAA ATG CAG TTG TTC AAA GAC AGA GAA 214 Leu Lys Met Gin Leu Phe Lys Asp Arg Glu
55 60
GTC CTC TGC GAC CTC ACC AAG ACC AAG GGA 244 Val Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70
AGC GGA AAC ACC GTG TCC ATC AAG AAT CCG 274 Ser Gly Asn Thr Val Ser l ie Lys Asn Pro
75 80
ATG TCC TGT CCA TAT CAG CTG TCC AAC AAC 304 Β9Ϊ
J syCq sAq s^T ¾jy sin dJ工 ΐ¾Λ 9ii and OVI 9W DW爾 V09 XXX JoD OIV XXX 091 S9T
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配列の長さ ： 603
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
起源
生物名：マウス （mouse)
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1 . . 603
特徴を決定した方法： E
配列： ATG AAG CCG TAC TTC TGC CAT GTC TTT GTC 30 Met Lys Pro Tyr Phe Cys His Val Phe Val
1 5 10
TTC TGC TTC CTA ATC AGA CTT TTA ACA GGA 60 Phe Cys Phe Leu lie Arg Leu Leu Thr Gly
15 20
GAA ATC AAT GGC TCG GCC GAT CAT AGG ATG 90 Glu lie Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met
25 30
TTT TCA TTT CAC AAT GGA GGT GTA CAG ATT 120 Phe Ser Phe His Asn Gly Gly Val Gin lie
35 40
TCT TGT AAA TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 150 Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val Gin Gin
45 50
TTA AAA ATG CGA TTG TTC AGA GAG AGA GAA 180 Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu
55 60
GTC CTC TGC GAA CTC ACC AAG ACC AAG GGA 210 Val Leu Cys Glu Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70
AGC GGA AAT GCG GTG TCC ATC AAG AAT CCA 240 Ser Gly Asn Ala Val Ser l ie Lys Asn Pro
75 80
ATG CTC TGT CTA TAT CAT CTG TCA AAC AAC 270 Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn 85 90
AGC GTC TCT TTT TTC CTA AAC AAC CCA GAC 300 Ser Val Ser Phe Phe Leu Asn Asn Pro Asp
95 100
AGC TCC CAG GGA AGC TAT TAC TTC TGC AGC 330 Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser
105 110
CTG TCC ATT TTT GAC CCA CCT CCT TTT CAA 360 Leu Ser lie Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin
115 120
GAA AGG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CAT 390 Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu His
125 130
ATT TAT GAA TCC CAG CTC TGC TGC CAG CTG 420 He Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu
135 140
AAG CTC TGG CTA CCC GTA GGG TTG CCA GCT 450 Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Leu Pro Ala
145 150
TTC GTT GTG GTA CTC CTT TTT GGA TGC ATA 480 Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys lie
155 160
CTT ATC ATC TGG TTT TCA AAA AAG AAA TAC 510 Leu lie lie Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr
165 170
GGA TCC AGT GTG CAT GAC CCT AAT AGT GAA 540 Gly Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu
175 180
TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACA AAC 570 Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn
185 190
AAA AAG TCT AGA CTT GCA GGT GTG ACC TCA 600 Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser
195 200
TAA 603 配列番号： 6
配列の長さ ： 836
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （3'及び 5'末端塩基配列を含む cDNA) 起源
生物名：ラット （rat)
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置 : 35 . . 685
特徴を決定した方法： E
配列：
CTGGAGGGGA AGAGTGCAGC TGTTCCTGGC AGAC 34 ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC GTC TTT GTC 64 Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Val Phe Val
1 5 10 dsy ¾iv usy dsy Π9 3¾ 9qd J9S ΐ^Λ J9S
0V9 V33 OW 0V9 VIO t ku XXX 131 313 I9V 06 98
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L£8 0/S6dr/lDd 9USZ/S6 OAV Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn
185 190
AAA AAG TCC AGA CTT GCA GGT ACA GCA CCC 634 Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Thr Ala Pro
195 200
CTT AGG GCT TTG GGG AGA GGA GAA CAC TCT 664 Leu Arg Ala Leu Gly Arg Gly Glu His Ser
205 210
TCA TGT CAA GAC CGG AAT TAA 685 Ser Cys Gin Asp Arg Asn
215
TTTGTTTATT TCTATTTTAA AAGAAAGACA TTTTTTCCCC TAAAGATAAT 735 TTTTGTATTT TTATGTGAAA GTCTGAATCT TCATTTTAAC TCGACTTATA 785 TACTCTGTGG TATATTAAAA ATAATGTTTG TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA 835 A 836 配列番号： 7
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A )
配列の特徴
特徴を表す記号： primer bind
存在位置： 1 . . 27
特徴を決定した方法： E
配列： CTGCTCGAGA TGAAGCCCTA CTTCTCG 27 配列番号： 8
配列の長さ： 32
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列の特徴
特徴を表す記号： primer bind
存在位置： 1 . . 32
特徴を決定した方法： E
配列：
ACCCTACGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC AA 32 配列番号： 9
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列の特徴
特徴を表す記号： primer bind
存在位置： 1 . . 30
特徴を決定した方法： E
配列：
TAACTGTTTC TCGAGAACAT GAAGTCAGGC 30 配列番号： 10
配列の長さ： 30
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列の特徴
特徴を表す記号： primer bind
存在位置： 1 . . 30
特徴を決定した方法： E
配列：
ATCCTATGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC 30 配列番号： 11
配列の長さ ： 35
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列の特徴
特徴を表す記号： primer bind
存在位置： 1 . . 35
特徴を決定した方法： E
配列：
CGTGATATTG CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGC 35 配列番号： 12
配列の長さ ： 34 配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列の特徴
特徴を表す記号： primer bind
存在位置： 1 . . 34
特徴を決定した方法： E
配列：
CATTCAAGTT TCAGGGAACT AGTCCATGCG TTTC 34

Claims

請求の範囲
1. 下記の特徴を有する細胞表面分子を構成するポリペプチド ：
(a) 少なくとも胸腺細胞及びマイ トジヱン （mitogen) で刺激したリンパ芽球 細胞で発現する ；
(b) 該細胞表面分子に反応性を有する抗体は、 マイ トジェンで刺激したリン パ芽球細胞間の接着を誘導する ；
(c) 該細胞表面分子に反応性を有する抗体は、 CD 3に反応性を有する抗体 との共存下で末梢血リンパ球の増殖を誘導する ；
(d) 細胞外領域に Phe- Asp-Pro- Pro- Pro-Pheで表わされる部分アミノ酸配列を 有する ；及び
(e) 細胞内領域に Tyr-Met- Phe- Metで表わされる部分アミノ酸配列を有する。
2. 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列、 または配列番号 2に 記載のアミノ酸配列中のアミノ酸において 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠 失もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1に記載の ポリべプチド。
3. 該ポリペプチドが、 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAにストリン ジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされることを特徴と する請求項 1に記載のポリぺプチド。
4. 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性 を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1に記載のポリべプチド。
5. 該細胞表面分子が、 ヒト由来の細胞表面分子であることを特徴とする請求項 1乃至請求項 4のいずれかに記載のポリぺプチド。
6. 請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載のポリべプチドをコ一ドする遺伝子。
7. 該遺伝子が、 cDNAであることを特徴とする請求項 6に記載の遺伝子。
8. 該 cDNAが、 配列番号 1に記載の塩基配列を有することを特徴とする請求 項 7に記載の遺伝子。
9. 該 cDNAが、 配列番号 3の塩基番号 26乃至 625に記載の塩基配列、 配列番号 4の塩基番号 35乃至 637に記載の塩基配列、 配列番号 5の塩基番号 1乃至 603に記載 の塩基配列、 または配列番号 6の塩基番号 35乃至 685に記載の塩基配列のいずれか を含むことを特徴とする請求項 7に記載の遺伝子。
10. 請求項 6乃至請求項 9のいずれかに記載の遺伝子を含有するべクタ一。
11. 請求項 10に記載のベクターが導入された形質転換体。
12. 国際寄託番号 FERM BP- 5725で識別される形質転換体。
13. 請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載のポリペプチドの細胞外領域から なるポリべプチド断片。
14. 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するヒト由 来のポリベプチドであることを特徴とする請求項 13に記載のポリぺプチド断片。
15. 請求項 13または請求項 14に記載のポリペプチド断片をコードする遺伝 子。
16. 請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載のポリペプチドの細胞外領域から なるポリペプチド断片がジスルフィ ド結合により結合して形成されるホモダイマ —分子。
17. 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するヒト由 来のポリぺプチドであることを特徴とする請求項 16に記載のホモダイマ一分子。
18. 請求項 14に記載のポリペプチド断片若しくは請求項 17に記載のホモダ イマ一分子のいずれか一方または両方と薬学的に許容されうる担体を含んでなる 医薬組成物。
19. 請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載のポリペプチドの細胞外領域とヒ 卜の免疫グロブリン （I g) の重鎖の定常領域または定常領域の一部とからなる 融合ポリペプチド。
20. 免疫グロブリンが、 I gGであることを特徴とする請求項 19に記載の融 合ポリペプチド。
2 1 . 定常領域の一部が、 I g Gのヒンジ領域、 C 2 ドメイン及び C 3 ドメイン からなることを特徴とする請求項 1 9に記載の融合ポリぺプチド。
2 2 . 該ポリペプチドが、 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するヒト由 来のポリべプチドであることを特徴とする請求項 1 9乃至請求項 2 1のいずれか に記載の融合ポリべプチド。
2 3 . 請求項 1 9乃至請求項 2 2のいずれかに記載の融合ポリペプチドがジスル フィ ド結合により結合して形成されるホモダイマー分子。
2 4 . 請求項 2 2に記載の融合ポリペプチドがジスルフィ ド結合により結合して 形成されるホモダイマー分子。
2 5 . 請求項 2 2に記載の融合ポリペプチド若しくは請求項 2 4に記載のホモダ イマ一分子のいずれか一方または両方と薬学的に許容されうる担体を含んでなる 医薬組成物。
2 6 . 該医薬組成物が、 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療または該疾 患症状の抑制に用いられることを特徴とする請求項 2 5に記載の医薬組成物。
2 7 . 請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載のポリペプチド、 請求項 1 3若し くは請求項 1 4に記載のポリぺプチド断片または該ポリぺプチドにより構成され る細胞表面分子に反応性を有する抗体またはその一部。
2 8 . 該抗体が、 モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2 7に記載 の抗体またはその一部。
2 9 . 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 請求項 1 4 に記載のポリべプチド断片または該ポリべプチドから構成されるヒト由来の細胞 表面分子に反応性を有するモノクローナル抗体またはその一部。
3 0 . 請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載のポリぺプチドまたは該ポリぺプ チドにより構成される細胞表面分子に反応性を有するモノクローナル抗体であつ て、 該モノクローナル抗体のマイ トジェンで刺激したリンパ芽球細胞への作用が、 国際寄託番号 FERM BP-5707で識別されるハイプリ ドーマが産生するモノクロ一ナ ル抗体がマイ トジェンで刺激したラッ トリンパ芽球細胞に示す作用と実質的に同 一であるモノクローナル抗体またはその一部。
3 1 . 請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載のポリペプチドまたは該ポリぺプ チドにより構成される細胞表面分子に反応性を有するモノクローナル抗体であつ て、 該モノクローナル抗体のマイ トジェンで刺激したリンパ芽球細胞への作用が、 国際寄託番号 FERM BP-5708で識別されるハイプリ ドーマが産生するモノクロ一ナ ル抗体がマイ トジェンで刺激したラッ トリンパ芽球細胞に示す作用と実質的に同 一であるモノクローナル抗体またはその一部。
3 2 . 請求項 2 9に記載のモノクローナル抗体またはその一部と薬学的に許容さ れぅる担体を含んでなる医薬組成物。
3 3 . 該医薬組成物が、 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療または該疾 患症状の抑制に用いられることを特徴とする請求項 3 2に記載の医薬組成物。
3 4 . 請求項 2 8乃至請求項 3 1のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生 するハイブリ ドーマ。
3 5 . 請求項 1に記載のポリペプチドをコードする遺伝子であって、 配列番号 1 に記載される塩基配列を含むヒト由来の遺伝子または配列番号 4の塩基番号 35乃 至 637に記載される塩基配列を含むラッ ト由来の遺伝子が、 マウスの内在性遺伝子 に組み込まれていることを特徴とするトランスジエニックマウス。
3 6 . 請求項 1に記載のポリペプチドであって配列番号 5に記載される遺伝子に よりコードされるアミノ酸配列を有するマウス由来のポリべプチドが産生されな いように、 該ポリペプチドをコードするマウスの内在性遺伝子が不活性化されて いることを特徴とするノヅクアウトマウス。
PCT/JP1998/000837 1997-02-27 1998-02-27 Molecule de surface cellulaire induisant l'adhesion cellulaire et la transmission de signaux WO1998038216A1 (fr)

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